UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL DE Salmonella enterica

SOROVAR SCHWARZENGRUND EM EMBRIÕES E PINTOS DE

CORTE

Samantha Verdi Figueira

Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora Andrade

GOIÂNIA

2014

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SAMANTHA VERDI FIGUEIRA

INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL DE Salmonella enterica

SOROVAR SCHWARZENGRUND EM EMBRIÕES E PINTOS DE

CORTE

Dissertação apresentada para obtenção do

grau de Mestre em Ciência Animal junto à

Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás

Área de concentração:

Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de alimentos

Orientadora:

Prof. Dra. Maria Auxiliadora Andrade – EVZ/UFG

Comitê de Orientação:

Prof. Dra. Cíntia Silva Minafra e Rezende – EVZ/UFG

Prof. Dr. José Henrique Stringhini – EVZ/ UFG

GOIÂNIA

2014

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DEDICO

À minha família querida, minha mãe Maria

Ivany, ao meu irmão Theo e ao meu falecido

pai Wilson.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço sempre e diariamente a Deus pela vida, saúde e pelo

privilégio de fazer pós-graduação.

À minha família por todo amor, a minha mãe Maria Ivany sempre

compreensiva, dedicada, me apoiando em momentos de dificuldade e sendo meu

exemplo de luta, ao meu irmão Theo Verdi por ser seu orgulho e por acreditar em

mim, ao meu falecido pai Wilson, que sempre incentivou o estudo e a dedicação.

Obrigada por se alegrarem com as minhas vitórias e me acalentarem nas

derrotas, é por vocês e por causa de vocês que hoje posso viver essa felicidade.

À minha orientadora Maria Auxiliadora Andrade, por absolutamente

tudo, a disponibilidade, paciência, tolerância, broncas, carinho, vontade, amizade

e dedicação. Obrigada por ser meu exemplo e aceitar dividir comigo os

ensinamentos e a sabedoria da vida e da profissão. Sou grata também pela

oportunidade de me orientar no doutorado, desde a graduação contribuindo para

que eu realize os meus sonhos.

Aos meus co-orientadores Profª. Dra. Cíntia Silva Minafra e Rezende e

Prof. Dr. José Henrique Stringhini pela disponibilidade sempre que precisei e pela

possibilidade de concluir essa pesquisa.

Aos companheiros de pós-graduação em ciência e produção animal:

Aleane, Angélica, Denise, Francielle, Laura, Gustavo, Pollyana, Raiana e

especialmente a Thaís e ao Thiago, por toda a ajuda. Às minhas amigas que

foram fundamentais na execução do projeto, além de tornarem tudo mais divertido

Adriana, Ana Maria, Bárbara e Gisele e o seu marido Jardel.

Às queridas do laboratório de bacteriologia e do setor de Preventiva,

Aline, Camila, Cícera, Cínthia, Dunya, Maria Auxiliadora Leão (Dorinha), Nazaré e

ao senhor Antônio, pela disposição e ajuda.

Às minhas amigas que moram no meu coração, Emannuela e Tainá

que mesmo não contribuindo diretamente para a realização do mestrado,

merecem agradecimento, principalmente pela paciência, distração e carinho.

Aos professores que tive o privilégio de assistir as aulas durante a pós-

graduação, Adilson Donizeti Damasceno, Emmanuel Arnhold, José Henrique

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Stringhini, Luiz Augusto Batista Brito, Maria Clorinda Soares Fioravanti, Nadja

Susana Mogyca Leandro e Valéria Sá Jayme. Aos professores que foram

membros da banca dos meus seminários Cíntia Silva Minafra e Rezende, Edmar

Soares Nicolau, Guido Fontgallad Coelho Linhares e Luciana Batalha de Miranda,

obrigada por todos os ensinamentos de profissão, de conduta e de vida.

Ao diretor da Escola de Veterinária e Zootecnia, Marcos Barcellos

Café, que sempre foi mais do que um professor, um verdadeiro exemplo de

liderança, carisma, respeito, dedicação e cuidado com seus alunos, obrigada por

toda a ajuda.

À Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás,

que tem sido minha segunda casa, a primeira durante o experimento, desde 2007

e se Deus permitir pelos próximos três anos de doutorado. E ao CNPq pelo apoio

financeiro para a realização desse projeto devido à bolsa concedida.

Muito obrigada!

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“Esforça-te, e tem bom ânimo; não temas, nem te espantes, porque o SENHOR, teu Deus, é contigo, por onde quer que andares.”

Josué 1:9

“Há fronteiras nos jardins da razão.”

Chico Science

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RESUMO

O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de investigar a capacidade invasiva e a persistência da Salmonella Schwarzengrund em embriões e pintos de corte de um dia. Foram incubados, inteiramente ao acaso, 260 ovos férteis de frangos de corte em três incubadoras distintas. Com 19 dias de incubação fez-se a ovoscopia e, 40 ovos foram eliminados. O restante dos ovos foram distribuídos da seguinte maneira: 50 ovos foram inoculados com 0,2 mL de solução salina tamponada esterilizada 0,85% via câmara de ar, 50 ovos foram inoculados com 1,5 x 104 UFC/0,2mL de Salmonella Schwarzengrund na câmara de ar e 100 foram incubados sem nenhum inóculo, para posterior inoculação nos pintos de um dia. Após a eclosão, os pintos de um dia foram distribuídos igualmente em quatro tratamentos, assim discriminados: T1 - controle da ração - constituído de 30 pintos livres de Salmonella, e receberam ração inoculada com 0,1 mL solução salina tamponada a 0, 85% por g de ração; T2 – inoculado ração - constituído de 30 pintos oriundos da incubadora 1, receberam ração com 5,3 x 10 4/0,1mL/g de Salmonella Schwarzengrund em solução salina tamponada 0, 85% por grama de ração até o sétimo dia de vida; T3- pintos controle oriundos da inoculação via câmara de ar ainda embriões -30 pintos oriundos de embriões inoculados com 0,2 mL de solução salina 0,85% tamponada, esterilizada na câmara de ar; T4- pintos contaminados câmara de ar ainda embriões- 30 pintos oriundos de embriões inoculados com 1,5 x 104 UFC/0,2mL de Salmonella Schwarzengrund na câmara de ar. Salmonella Schwarzengrund foi capaz de causar a mortalidade embrionária, colonizar o intestino, influenciar negativamente o ganho de peso, determinar quadro septicêmico e entérico independente da via de inoculação. As aves apresentaram sinais clínicos como fezes aderidas à cloaca, diarreia, prostração, apetite diminuído, retardo no crescimento e sonolência. A contaminação determinou maior peso e comprimento do intestino e fígado com 25 dias. Conclui-se que Salmonella Schwarzengrund possui a capacidade invasiva e de persistência em aves oriundas da inoculação da câmera de ar e em pintos de um dia por ração contaminada.

Palavras chave: salmonelose, ovos férteis, ração, vias de transmissão

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ABSTRACT

The present study was developted with the main object to evaluate the invasive ability, persitence and behavior of Salmonella Schwarzengrund in embryos and broiler chicks with one day of birth. Initially, 260 fertile eggs from broiler chicken were incubated e randomly distributed onto three different incubators. In the nineteenth day post incubation, the eggs were submited to candling and at the time 40 eggs were eliminated. The remaining eggs were distrubuted and 50 eggs were inoculated with 0,2 mL of sterile buffered saline 0,85% trough the air chamber and 50 eggs were inoculated with 1,5 x 104 UFC/0,2mL of Salmonella Schwarzengrund trough the air chamber, 100 were incubated without treatment. After the eclosion, the one day-old chicks were equally distributed in four treatments, discriminated well below: T1 – feed control – 30 chicks from incubator number 1, and received 0,1 mL of sterile buffered saline 0,85% per g of feed; T2 – feed inoculated - 30 chicks from incubator number 1, received feed with 5,3 x 10 4/0,1mL/g of Salmonella Schwarzengrund in buffered saline 0,85% per g de of feed until the seventh day-old; T3- inoculated control trough air chamber -30 chicks from inoculated embryos with 0,2 mL of sterile buffered saline 0,85% trough the air chamber; T4- inoculated trough air chamber - 30 chicks from inoculated embryos with 1,5 x 104 UFC/0,2mL de Salmonella Schwarzengrund in the air chamber. Salmonella Schwarzengrund was able to cause embryo mortality, enteric colonization, negatively influenced the weight gain, septicemic and enteric signs, with no correlation between the inoculation way. The bidrs shown clinical signs seen as feces adered to cloaca,diarrhea, prostration, decreased appetite, growth retardation and sleepness. The contamination determined higher weight and length of intestinal and liver with 25 days.Therefore is conclude that Salmonella Schwarzengrund is able to invade and persist in organs of inoculated air chamber embryo and one day old chicks contaminated feed.

Key-words: feed, fertile eggs, salmonelosis, transmission paths

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SÚMARIO

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS.................................................................... 1

INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1

REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 5

CAPÍTULO 2- EFEITOS DA INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL DE Salmonella

SCHWARZENGRUND EM EMBRIÕES VIA CÂMARA DE AR E PINTOS DE UM DIA VIA

RAÇÃO ............................................................................................................................. 9

INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 9

MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................11

Local ................................................................................................................................11

Delineamento experimental .............................................................................................11

Preparação dos inóculos .................................................................................................12

Inoculação .......................................................................................................................12

Embriodiagnóstico ...........................................................................................................13

Manejo das aves ..............................................................................................................14

Cálculo do ganho de peso ...............................................................................................14

Avaliação clínica, anatomopatológica e mortalidade ........................................................15

Pesquisa de Salmonella Schwarzengrund .......................................................................15

a) Nos ovos e resíduos de incubação ..............................................................................15

b) No mecônio e suabes de cloaca ..................................................................................16

c) Nos órgãos ..................................................................................................................16

Biometria .........................................................................................................................17

Análises estatísticas ........................................................................................................17

RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................18

1 - Incubação ...................................................................................................................18

2- Mecônios e suabes de cloaca ......................................................................................19

3 - Ganho de peso ...........................................................................................................22

3 - Avaliação clínica, anatomopatológica e mortalidade ...................................................24

4- Biometria e pesquisa de Salmonella nos órgãos .........................................................30

CONCLUSÃO ..................................................................................................................36

REFERÊNCIAS ...............................................................................................................37

CAPÍTULO 3 - CONSIDERAÇÕES FINAIS .....................................................................45

ANEXO PARECER FAVORÁVEL COMITÊ DE ÉTICA ....................................................47

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS

INTRODUÇÃO

A produção de carne de frango, em 2013, foi de 12,30 milhões de

toneladas, com 68,4% destinado ao mercado interno e 31,6% ao mercado

externo, resultando em 3,918 milhões de toneladas de carne exportada,

caracterizando o País como maior exportador, na frente dos Estados Unidos e

União Européia. Em território nacional, Goiás é responsável por 5,58% das

exportações, segundo a Associação Brasileira de Proteína Animal, antiga

UBABEF (ABPA, 2014).

Salmonella sp. é um agente enteropatogênico de distribuição mundial

(BEAM et al., 2013). Responsável na avicultura industrial por perdas econômicas,

redução do desempenho zootécnico, mortalidade e comprometimento da saúde

animal (BARROW, 1999; SOARES, 2013). Também é considerada o agente

bacteriano de maior ocorrência nas doenças veiculadas por alimentos em todo o

mundo, por esta razão importante também para saúde pública (BORSOI et al.,

2011). Com as aves e os produtos de origem avícola, principalmente a carne de

frango e os ovos, frequentemente relacionados aos surtos de toxinfecção

alimentar (CDC, 2010).

Bactérias de gênero Salmonella, pertencem à família

Enterobacteriaceae e são caracterizadas como bacilos pequenos, Gram-

negativos, desprovidos de cápsula, aeróbios ou anaeróbios facultativos e não

formadoras de esporos. A maioria é móvel, apresenta flagelos peritríquios, com

exceções da Salmonella Gallinarum e Salmonella Pullorum, que são imóveis. A

temperatura ótima de crescimento entre 37ºC a 40ºC, mas crescem em variações

entre 5ºC a 45ºC, o pH varia entre 4 a 9, com pH 7 sendo o ideal para

crescimento (BERCHIERI JÚNIOR & FREITAS NETO, 2009).

O gênero Salmonella é composto por duas espécies, Salmonella

enterica e Salmonella bongori (BARROW et al., 2010). Com aproximadamente

2.610 sorovares já identificados (CDC, 2011). Baseados na tipagem dos

antígenos somáticos (O) presentes na parede celular, dos antígenos flagelares

2

(H) e dos antígenos capsulares (Vi) presentes no envelope celular, conforme a

classificação de Kaufmann-White (GUIBOURDENCHE et al., 2010). O Programa

Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) considera quatro sorovares para a

certificação sanitária, com o intuito de monitorar, através de sorologia e

bacteriologia, o status sanitário dos planteis de matrizes, regulamentando

algumas medidas, através da instrução normativa nº 78 de 03/11/2003 (BRASIL,

2003).

Entre os sorovares identificados, os mais isolados nas infecções

humanas são Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis (CDC, 2010).

Porém o surgimento de diferentes sorovares, tanto nos países desenvolvidos

quanto nos países em desenvolvimento, caracterizam um desafio a mais no

controle de salmonelose (TESSARI et al., 2012). Salmonella Schwarzengrund era

apontada como de baixa incidência até 2000, porém no ano de 2007 foi

considerada uma das causas mais frequentes entre as dez doenças de origem

alimentar no Japão (ASAI et al., 2009).

Salmonella sp. capaz de causar três tipos de portadores: 1) portador

ativo, que a bactéria se multiplica “in vivo”, e tem grande quantidade excretada

pelas fezes, contaminando o ambiente; 2) portador passivo, neles as bactérias

não se multiplicam, devido à imunidade do hospedeiro ou a não adaptação do

sorovar; 3) portador latente, a bactéria fica oculta intracelularmente e não é

detectado em exames laboratoriais, o portador não excreta o microrganismo

normalmente, mas este pode se tornar portador ativo (1) caso haja alguma

situação de estresse (TERZOLLO, 2011).

Para as aves, podem ser divididas em dois grupos em função da

patogênese no animal. No primeiro estão as bactérias capazes de produzir

doenças sistêmicas em aves e raramente estão envolvidas em toxinfecção

humana, como Salmonella Pullorum e Salmonella Gallinarum. E no segundo são

as que produzem toxinfecção humana, mas nas aves a doença só se manifesta

em determinadas condições, como Salmonella Typhimurium e Salmonella

Enteritidis, porém, a maioria dos sorovares causa colonização intestinal sem

determinar doença clínica (BARROW, 1999).

Podem compor a microbiota intestinal das aves, sem aparecimento de

sinais clínicos e sem nenhum efeito maléfico, mas quando em situação de

3

desequilíbrio podem levar a alterações intestinais e septicêmicas (ANDREATTI-

FILHO, 2007). A ausência de sintomas faz com que os animais portadores se

tornem importantes fatores epidemiológicos (TESSARI et al., 2012). O diagnóstico

de salmonelose realizado ainda na cadeia avícola possibilita a redução de casos

de infecção em humanos (RODRIGUES, 2011).

Salmonella Schwarzengrund apresenta ocorrência em diversos países,

tanto de amostras provenientes da cadeia avícola, quanto em casos de

salmonelose em humanos. No Japão, foi isolada em amostras fecais de frangos

de corte, entre 2007 e 2010 (LIMAWONGPRANEE et al., 1999; SASAKI et al.,

2012). E também em amostras fecais e na carne de frango (ASAI et al., 2009).

Em Taiwan a toxinfecção alimentar em humanos, foi associado ao consumo de

carne de frango, entre 2001 a 2006, com a maior prevalência no último ano

(LAUDERDALE et al., 2006; CHEN et al., 2010). Na Tailândia e na Dinamarca foi

isolada de humanos e de carne de frango (AARESTRUP et al., 2007). No Canadá

também houve a comprovação da toxinfecção alimentar desse sorovar (POPPE et

al., 1991).

Nos Estados Unidos, o sorovar foi o décimo mais frequentemente

isolado nas causas de salmonelose em humanos entre 1996 e 1999 (VUGIA et

al., 2004). Entre 1996 e1998, ocorreram surtos em duas casas de repouso e um

hospital em Oregon (OLSEN et al., 2001). Entre 2006 e 2008, foram confirmados

79 casos de salmonelose humana por Salmonella Schwarzengrund, devido à

contaminação de ração de cães e gatos (BEHRAVESH et al., 2010).

No Brasil, o mesmo já tem sido isolado e tipificado em algumas

pesquisas realizadas com amostras da cadeia avícola. Como em amostras de

suabes de arrasto em galpões de reprodutoras comerciais, entre 2006 e 2010, em

São Paulo (PASCHOAL CARDOSO et al., 2013). E em carcaças de frangos em

São Paulo, Manaus e na região central do Mato Grosso do Sul (SANTOS et al.,

2000; TIROLLI & COSTA, 2006; BONI et al., 2011). Em Goiás também foi isolado

em carcaças de frangos (MOREIRA et al., 2008), em aves sinantrópicas da região

metropolitana de Goiânia (HIDASI, 2013), em ração e matéria prima de ração

(MORAES, 2010) e também em ração retirada do comedouro de poedeiras e em

ovos comerciais (MORAES, 2014).

4

Como anteriormente citado há muitas fontes potenciais de introdução

de salmonela paratífica na cadeia avícola, que podem refletir na cadeia alimentar

do homem (GAST, 2008). As principais fontes de contaminação por Salmonella

sp. decorre da transmissão vertical por aquisição de aves infectadas pelas

matrizes, que podem ter o sistema reprodutor colonizado por diferentes sorovares

(GAST et al., 2004). A transmissão horizontal pode ocorrer por contaminação

cruzada no incubatório, com a entrada de ovos e pintos infectados nas

incubadoras e nascedouros, que devido às condições de temperatura e umidade

apresentam potencial proliferação da bactéria (COX et al., 2000). Também por

contaminação ambiental nos galpões de criação, com muitas fontes potencias,

entre elas as rações e suas matérias primas, principalmente de origem animal,

podem apresentar altas taxas de contaminação por Salmonella sp. (SILVA &

DUARTE, 2002).

Diante do exposto e considerando a circulação de Salmonella enterica

sorovar Schwarzengrund em diferentes categorias de amostras nesta região o

presente trabalho propôs investigar a capacidade de invasão in ovo simulando a

transmissão vertical pela inoculação na câmara de ar e a transmissão horizontal

por meio do consumo de ração contaminada em pintos de um dia.

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REFERÊNCIAS

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29. RODRIGUES, D.P. Perspectivas atuais e falhas no diagnóstico antigênico de Salmonella spp.: importância no reconhecimento dos sorovares circulantes, emergentes e exóticos. In: Anais... Simpósio Internacional sobre Salmonelose Aviária. Rio de Janeiro, 2011.

8

30. SANTOS, D. M. S., BERCHIERI JUNIOR, A. FERNANDES, S. A., TAVECHIO, A. T. AMARAL, L. A. Salmonella em carcaças de frango congeladas. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 20, n. 1, p. 39-42, 2000. 31. SASAKI, Y.; IKEDA, A.; ISHIKAWA, K.; MURAKAMI, M.; KUSUKAWA, M.; ASAI, T.; YAMADA, Y. Prevalence and antimicrobial susceptibility of Salmonella in Japanese broiler flocks. Epidemiology Infection, Cambridge, v. 140, p. 2074–2081, 2012. 32. SILVA, E. N.; DUARTE, A. Salmonella Enteritidis em aves: Restrospectiva no Brasil. Revista Brasileira de Ciência Avícola, Campinas, v. 4, n. 2, 2002. 33. SOARES, N. M. Controle de salmonela na produção de ovos comerciais. In: FACTA Curso impacto da Salmonella na avicultura. CD-ROM...: Campinas, 2013. 34. TERZOLO, H.R. Estudio bacteriológico de las salmmonelosis de las aves (S. pullorum, S. gallinarum, S. Enteritidis y S. Typhimurium) em La América Latina. In: Simpósio Internacional sobre Salmonelose Aviária, Rio de Janeiro. 2011. 35. TESSARI, E. N. C.; KANASHIRO, A. M. I.; STOPPA, G. F. Z.; LUCIANO, R. L.; DE CASTRO, A. G. M.; CARDOSO, A. L. P. S. Important aspects of Salmonella in the poultry industry and public health. In: Salmonella – A dangerous foodborne pathogens. Ed. Barakat S. M. Mahmoud, 2012. 36. TIROLLI, I. C. C., COSTA, C.A. Ocorrência de Salmonella spp. em carcaças de frango recém abatidas em feiras e mercados da cidade de Manaus-AM. Acta Amazônica, Manaus, v.36, n.2, p.205-208, 2006. 37. VUGIA, D. J., SAMUEL, M., FARLEY, M. M., MARCUS, R., SHIFERAW, B., SHALLOW, S., SMITH, K., ANGULO, F. J. Invasive Salmonella Infections in the United States, FoodNet, 1996–1999: Incidence, Serotype Distribution, and Outcome. Clinical Infectious Diseases, Chicago, v. 38, p. 149-156, 2004.

9

CAPÍTULO 2- EFEITOS DA INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL DE Salmonella

SCHWARZENGRUND EM EMBRIÕES VIA CÂMARA DE AR E PINTOS DE UM

DIA VIA RAÇÃO

INTRODUÇÃO

A presença de Salmonella sp. na cadeia avícola reveste-se de

importância como agente causador de doença em aves com consequências

econômicas e infecção para o homem, principalmente pelo consumo de carne de

frango e ovos contaminados (BORSOI et al., 2011).

A transmissão de Salmonella sp. acontece de diferentes formas,

portanto, sua epidemiologia é bastante complexa, e determinar a origem da

infecção e as formas de disseminação no plantel consiste em uma tarefa difícil

(HILTON & PENN, 1998). As principais fontes de contaminação em lotes avícolas

por Salmonella advêm da aquisição de reprodutoras infectadas, contaminação

cruzada no incubatório e contaminação ambiental na granja (GAST, 2008).

As matrizes podem ter o ovário e oviduto colonizados por diferentes

sorovares de salmonela paratífica, devido à capacidade invasiva que muitas

apresentam (KELLER, 1995; WILLIAMS et al. 1998; GAST et al., 2004).

Geralmente as reprodutoras são portadoras assintomáticas e podem transferir a

bactéria para sua a progênie, a qual pode se manter em toda a cadeia de

produção, configurando um problema de saúde pública (LOURENÇO, 2013).

Portanto, a presença dessa bactéria em ovos incubáveis é um dos pontos críticos

na contaminação de frangos de corte (COX et al., 2000).

Os ovos incubáveis podem se infectar de três formas distintas, até a

chegada no incubatório. A primeira via transovariana, em que o agente presente

no ovário é transferido durante a formação do ovo, no ovário. A segunda é a

transuterina, com a contaminação do epitélio do oviduto, o agente também é

incorporado com a formação do ovo. E a terceira, é a transmissão pós-postura,

com o ovo em contato com o meio ambiente (SONCINI & BITTENCOURT, 2003).

Já os pintos que não nasceram infectados podem se contaminar no

ambiente de criação por diferentes meios, a ração contaminada é a fonte mais

10

comum de introdução de novas sorovariedades da bactéria na produção animal

(OIE, 2010).

Geralmente a predominância dos sorovares é regional, porém o

comércio de animais e seus produtos e viagens internacionais, podem refletir em

mudanças dos sorovares e cepas específicas das regiões, sugerindo que as

distâncias já não significam isolamento (AARESTRUP et al., 2007). Identificar a

circulação de sorovares em uma região, caracteriza um desafio para estudiosos

(TESSARI et al., 2012) e também constitue uma ferramenta epidemiolôgica para

ser aplicada na área (SOLARI et al., 1997).

Dentre esses sorovares, destaca-se a Salmonella enterica sorovar

Schwarzengrund, como uma causa menos frequente nas infecções humanas,

quando comparada aos sorovares Salmonella Typhimurium e Salmonella

Enteritidis, mas que nos últimos estudos tem mostrado aumento na sua

ocorrência, com comprovada potencialidade de causar toxinfecção alimentar e

com o agravo de possuir a característica de multiresistência a antimicrobianos

(BANGTRAKULNONTH et al., 2004; VUGIA et al., 2004).

Muitas pesquisas apontam a presença da Salmonella Schwarzengrund

em diferentes etapas da cadeia avícola, como em conteúdo cecal e amostras

fecais de frangos de corte (LIMAWONGPRANEE et al., 1999; SASAKI et al.,

2012), toxinfecção alimentar causada pelo consumo de carne de frango (POPPE

et al., 1991; VUGIA et al., 2004; AARESTRUP et al., 2007; ASAI et al., 2009;

CHEN et al., 2010), suabe de arrasto em reprodutoras comerciais (PASCHOAL

CARDOSO et al., 2013) e em carcaça de frango (SANTOS et al., 2000; TIROLLI

& COSTA, 2006; BONI et al., 2011).

A circulação deste sorovar em aves sinantrópicas recolhidas de região

próxima a empresas avícolas (HIDASI, 2013), em ovos comerciais e também em

ração contaminada (MORAES, 2010; MORAES, 2014) e em carcaças de frangos

(MOREIRA et al., 2008) na região central do Brasil, além da ausência de dados

clínicos e de transmissão na literatura consultada, propôs-se este trabalho para

investigar a penetração e a habilidade da Salmonella enterica sorovar

Schwarzengrund de causar danos ao organismo da ave, simulando a via de

transmissão vertical através da inoculação na câmara de ar de ovos embrionados

e via horizontal por contaminação da ração de pintos de um dia.

11

MATERIAL E MÉTODOS

Local

O experimento foi conduzido no Laboratório de Bacteriologia e no

Núcleo Experimental de Doença de Aves do Setor de Preventiva, do

Departamento de Medicina Veterinária, Escola de Medicina Veterinária e

Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, com número de protocolo registro

CEUA/UFG 23/14 pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFG.

Delineamento experimental

Foram incubados 260 ovos férteis de frangos de corte da linhagem

Cobb, com sete dias de estocagem, provenientes de matrizes pesadas com idade

de 37 semanas, obtidos de um incubatório comercial.

Os ovos foram distribuídos inteiramente ao acaso em três incubadoras,

com temperatura de 37,5ºC, 60% de umidade e viragem automática a cada 120

minutos. Com 19 dias de incubação, foi realizada ovoscopia, e os ovos claros e

embriões mortos foram retirados. Fez-se nova distribuição dos ovos em três

incubadoras. Na incubadora 1 foram incubados 100 ovos embrionados sem

nenhum tratamento, na incubadora 2, 50 ovos embrionados os quais foram

inoculados com 0,2 mL de solução salina tamponada esterilizada 0,85% via

câmara de ar e na incubadora 3, 50 ovos que foram inoculados com 1,5 x 104

UFC/0,2mL de Salmonella Schwarzengrund na câmara de ar.

Após a eclosão, os pintos de um dia foram distribuídos igualmente, por

peso, em quatro tratamentos com seis parcelas contendo cinco aves cada,

totalizando 30 pintos por tratamento assim discriminados: T1 (controle da ração) -

constituído de 30 pintos oriundos da incubadora 1 (livre de Salmonella), e

receberam ração inoculada com 0,1 mL solução salina tamponada a 0, 85% por g

de ração; T2 (inoculado ração) - constituído de 30 pintos oriundos da incubadora

1 (livre de Salmonella), receberam ração com 5,3 x 10 4/0,1mL/g de Salmonella

Schwarzengrund em solução salina tamponada 0, 85% por grama de ração até o

12

sétimo dia de vida; T3 (controle inoculação via câmara de ar) -30 pintos oriundos

de embriões inoculados com 0,2 mL de solução salina 0,85% tamponada,

esterilizada na câmara de ar; T4 (inoculado câmara de ar) - 30 pintos oriundos de

embriões inoculados com 1,5 x 104 UFC/0,2mL de Salmonella Schwarzengrund

na câmara de ar.

Preparação dos inóculos

Salmonella enterica sorovar Schwarzengrund, proveniente de ovos

comerciais de galinhas de postura obtidos em granjas comerciais, tipificada pelo

laboratório FIOCRUZ - RJ e cedido pelo Laboratório de Bacteriologia da Escola

de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás.

A bactéria foi repicada em ágar verde brilhante para purificação e

incubada em temperatura de 37ºC por 24 horas. As unidades formadoras de

colônia (UFC) foram então suspensas em solução salina tamponada a 0,85% e

armazenada a 4ºC. A concentração foi ajustada com auxílio da escala Mac

Farland (FERNÁNDEZ et al., 2001) e confirmada por plaqueamento das diluições

seriadas em ágar MacConkey, com as placas incubadas em temperatura de 37ºC

por 24 horas e contagem das UFC da Salmonella Schwarzengrund, em que foi

obtida a diluição de 5,3 x 10² para inoculação em ração e 1,5 x 104 para

inoculação via câmara de ar.

Inoculação

Os ovos foram submetidos à ovoscopia com 19 dias de incubação,

para retirada dos ovos não embrionados e visualização e marcação da região da

câmara de ar para posterior inoculação no local correto do ovo. A inoculação nos

ovos embrionados foi realizada com material esterilizado e em câmara asséptica

com grau de segurança II (Figura 1).

13

FIGURA 1 – Ovoscopia realizada em todos os ovos com 19 dias de incubação, em que imagem A: mostra um ovo infértil, B: mostra um ovo fértil com a visualização da câmara de ar, C: mostra a marcação na casca dos ovos e D: mostra a inoculação dos ovos férteis.

Para inoculação os ovos embrionados foram perfurados com agulha

hipodérmica de medida 25 x 0,8mm, 50 ovos foram inoculados na câmara de ar

com 0,2 mL de solução salina tampona esterilizada 0,85% e outros 50 ovos foram

inoculados com 0,2 mL de solução 1,5 x 10⁴ UFC de Salmonella

Schwarzengrund. Imediatamente após a inoculação os orifícios foram vedados

com parafina esterilizada e incubados.

O inóculo para ração foi calculado de acordo com o consumo de cada

ave por sete dias, homogeneizado em saco estéril e distribuído igualmente entre

as parcelas. Em 4,5Kg de ração foram adicionados 450 mL de solução salina

tamponada contendo 5,3 x 102 UFC/0,1mL/g de Salmonella Schwarzengrund para

aves do T2. Na ração do grupo controle (T1) foi adicionada 450 mL de solução

salina tamponada 0,85% em 4,5Kg de ração.

Embriodiagnóstico

Ao término do processo de incubação, os ovos foram quebrados e

avaliados para determinar a fase de desenvolvimento embrionário que ocorreu a

morte. A eclodibilidade dos ovos férteis foi calculada pelo número de ovos

eclodidos divididos pelo número de ovos férteis e o resultado multiplicado por 100:

E=(NE/NF)x100, sendo E= eclodibilidade, NE= número de ovos eclodidos e NF=

número de ovos férteis incubados.

14

Manejo das aves

As aves dos grupos controle e inoculados foram mantidas por 25 dias

em alojamentos separados com ambiência semelhante. Foram criadas em

baterias de aço galvanizado com quatro andares, equipados com comedouros e

bebedouros do tipo lineares e bandeja para recolhimento de excretas, que eram

limpos duas vezes ao dia. Nos primeiros 14 dias, as baterias foram aquecidas

com lâmpadas incandescentes, com uma lâmpada por gaiola de 40W. As aves

tinham duas horas de escuro, e a qualidade do ar era mantida por meio de

exaustores.

No momento do alojamento as aves foram identificadas nos pés,

aleatoriamente, de acordo com o número das parcelas, para acompanhar

individualmente a excreção de Salmonella por suabe de cloaca. A marcação dos

pés com esparadrapo foi trocada de cinco em cinco dias, ou se necessário devido

o crescimento das aves, para evitar lesões ou desconforto.

As aves dos quatro tratamentos foram alimentadas com a mesma

ração, fornecida a vontade assim como a água, sem nenhum antimicrobiano

moderador de crescimento, durante os 25 dias de experimento, separadas de

acordo com a idade ração pré-inicial (1 a 7 dias), ração inicial (8 a 21 dias) e

ração de crescimento (22 a 25 dias) segundo as recomendações de ROSTAGNO

et al. (2011).

Cálculo do ganho de peso

As aves foram pesadas a cada cinco dias, com peso individual

possibilitado pela identificação nos pés, e somados para totalizar o peso da

parcela para posterior análise estatística. As aves que morreram foram pesadas

para o ajuste do consumo de ração. Para ganho de peso (GP): calculado pela

diferença entre o peso final e o peso inicial das aves somado ao peso da ave

morta da parcela e dividido pelo número médio de aves. GP: [(PF-PI) + Peso da

ave morta]/NMA.

15

Avaliação clínica, anatomopatológica e mortalidade

As aves foram avaliadas diariamente, os principais sinais clínicos foram

anotados em uma ficha própria, assim como a mortalidade. Foi realizada

necropsia em uma ave por parcela aos 10 e 25 dias de idade, totalizando 24 aves

que foram pesadas e eutanasiadas, as lesões macroscópicas anotadas, os

órgãos retirados, pesados e processados para pesquisa de Salmonella.

As aves que morreram durante o experimento foram pesadas e

necropsiadas, as lesões macroscópicas anotadas e os órgãos foram coletados

para análise bacteriológica.

Pesquisa de Salmonella Schwarzengrund

a) Nos ovos e resíduos de incubação

Foram amostrados cinco ovos antes de serem incubados para

pesquisa de Salmonella na casca, albúmen, gema e membrana da casca.

Inicialmente o albúmen foi retirado por meio de seringa, a gema então foi vertida

em placa de Petri esterilizada e a membrana da casca retirada cautelosamente

com pinças esterilizadas, sem contato com a parte exterior da casca e por fim a

casca, que foi macerada em outra placa esterilizada. Cada ovo então constituiu

quatro amostras, que foram colocadas em tubos contendo água peptonada 1% na

proporção de 1:10.

Após a retirada dos pintos e das incubadoras, foram realizadas

análises bacteriológicas dos resíduos de incubação, os quais eram constituídos

por resto de casca, penugens, sangue e conteúdo dos ovos, dos três tratamentos.

Em que foram retirados e pesados 25 gramas de resíduo de cada incubadora,

cada um para um tratamento, constituindo assim três amostras, que foram

colocados em solução de água peptonada 1% na proporção de 1:10 (Figura 2A).

16

b) No mecônio e suabes de cloaca

Antes dos pintos serem alojados foram colocados em caixas de

papelão revestidas por papel alumínio, para coleta do mecônio. As caixas foram

colocadas embaixo de lâmpadas incandescentes e respeitando a densidade de

pintos por caixa. Assim que os pintos foram alojados, foram realizados cinco

suabes de cada caixa, sendo duas por tratamento, totalizando então oito caixas,

os suabes foram colocados em um tubo de rosca contendo 10 mL de água

peptonada 1% (Figura 2B).

Posteriormente a cada cinco dias até os 25 dias de vida das aves

foram realizados suabes de cloaca individuais, cada suabe coletado foi colocado

em um tubo de rosca contendo 4,5 mL de água peptonada 1% (Figura 2C).

c) Nos órgãos

Aos 10 e 25 dias do experimento foram necropsiadas uma ave por

parcela e o baço, coração, fígado com vesícula biliar, resquício de saco da gema

(quando presente) e conteúdo do ceco com tonsila cecal foram processados,

individualmente. Cada órgão foi macerado em placas de Petri esterilizadas e

colocado aproximadamente um grama da amostra em tubos de rosca contendo

água peptonada 1% na proporção de 1:10.

As amostras foram processadas de acordo com a metodologia descrita

por GEORGIA POULTRY LABORATORY (1997), com modificações.

As amostras em água peptonada foram incubadas a 37ºC por 24h,

depois transferidos 1,0 mL dessa solução para 9,0 mL de caldo selenito cistina

(CS) e 0,1 mL para 10,0 mL de caldo Rappaport Vassiliadis e incubadas a 37ºC

por 24h. Em seguida, com auxílio de uma alça de níquel-cromo, alíquotas foram

plaqueadas por esgotamento em estrias, em duplicata para meios seletivos: ágar

verde brilhante e ágar Hektoen e incubados a 37ºC por 24h.

Foram então selecionadas de três a cinco UFC com características

morfológicas de Salmonella e transferidas para tubos contendo tríplice açúcar

ferro (TSI) e incubados a 37ºC por 24h, os. tubos de TSI com crescimento

sugestivo de Salmonella foram submetidos a testes bioquímicos para

comprovação, sendo estes: teste de urease, produção de indol, vermelho metila,

motilidade, descarboxilase de lisina, malonato e citrato de Simmons.

17

FIGURA 2 – Pesquisa de Salmonella Schwarzengrund em: A- resíduo de incubação, B- mecônio em caixa e C- suabe de cloaca dos pintos.

Biometria

Durante a necropsia, as aves assim como os órgãos antes de serem

devidamente separados para análises bacteriológicas foram pesados

assepticamente e individualmente, em balança de precisão (0,00g), o baço,

fígado, coração e o intestino que também foi medido com auxílio de fita métrica.

Para obtenção do peso relativo, o peso do órgão foi dividido pelo peso da ave e

multiplicado por 100.

- Peso relativo = Peso do órgão X 100

Peso da ave viva

Análises estatísticas

Os dados quantitativos de ganho de peso e biometria dos órgãos foram

submetidos à análise de variância e as médias comparadas com o teste de Tukey

a 5%. Os dados qualitativos de presença ou ausência de Salmonella nas

amostras citadas anteriormente por bacteriologia convencional, observação da

presença ou ausência de lesões macroscópicas e doença clínica, foram avaliados

por teste descritivo, de Kruskal-Wallis, utilizando o software R.

A B C

18

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1 - Incubação

Os ovos incubados apresentavam-se sem anomalias, sem trincas ou

sujos a inspeção visual. As amostras da casca, albúmen, gema e membrana da

casca dos ovos foram negativas para Salmonella sp. DI FÁBIO & MARTINS

(2013) assinalaram que o ovo embrionado é um material biológico, não estéril

sujeito a se infectar no trato reprodutor da ave (transmissão vertical) ou após a

ovoposição (transmissão horizontal) pelo contato da casca com os

microrganismos. Para garantir as condições experimentais foi realizado a

inspeção visual prévia assim como a pesquisa de Salmonella nos resíduos da

incubação os quais também foram negativos para Salmonella sp.

Com 19 dias de incubação à ovoscopia foram retirados 40 ovos que

eram inférteis ou apresentaram mortalidade embrionária, ao realizar o

embriodiagnóstico destes ovos verificou-se que a fertilidade foi de 92,3%

(240/260), 7,7% (20/260) dos ovos eram inférteis, 2,3% (6/260) tiveram

mortalidade embrionária precoce e 5,4% (14/260) tiveram mortalidade

intermediária. A fertilidade de 92,3% obtida neste estudo está de acordo com

PATRÍCIO (2013) que considera para lotes saudáveis a fertilidade de 75 a 97,5%.

Também a mortalidade precoce está dentro do esperado, no entanto a

intermediaria foi superior ao apontado por PLANO & DI MATTE (2013) os quais

relataram para mortalidade precoce de 2 a 4 %, e mortalidade intermediária de

0,5 a 0,7%. Esta diferença em relação à mortalidade intermediária pode ser

explicada pelo tipo de incubadora que possui sistema de incubação de estágio

único e regula a temperatura, umidade e ventilação (MOLENAAR et al., 2010).

Ao analisar a mortalidade embrionária ocorrida dos 19 aos 21 dias

obteve-se na incubadora 1: 23% de mortalidade (23/100) nos ovos sem nenhum

tratamento, na incubadora 2: 24% de mortalidade (12/50) dos embriões que foram

inoculados na câmara de ar com solução salina a 0,85% e na incubadora 3: 40%

de mortalidade (20/50) dos embriões que foram inoculados na câmara de ar com

Salmonella Schwarzengrund.

Observa-se que não houve diferença na taxa de mortalidade

embrionária dos ovos da incubadora 1 e 2, ou seja ovos sem tratamento e

19

inoculados na câmara de ar com solução salina. Este resultado pode ser

respaldados em LEITÃO et al. (2008) que não verificaram diferenças na

mortalidade de ovos íntegros, suplementados com água e com solução salina na

mesma via.

Por outro lado, os ovos inoculados com Salmonella Schwarzengrud

apresentaram mortalidade (p <0,05) superior, indicando que o patógeno foi capaz

de matar os embriões que receberam o inóculo na câmara de ar. Uma explicação

provável para este achado encontra-se nas afirmações de que as soluções

injetadas na câmara de ar são absorvidas pelo embrião quando começa a

bicagem interna (UNI & FERKET, 2003), que se inicia após o embrião consumir

todo o fluido amniótico (MORAN JR, 2007), e ocorre aproximadamente no 20º dia

de incubação (CESARIO, 2013).

2- Mecônios e suabes de cloaca

Os suabes de mecônios, dos quatro tratamentos, foram negativos, para

Salmonella. Esperava-se encontrar a bactéria no mecônio dos pintos oriundos dos

ovos inoculados na câmara de ar (T4). Este resultado negativo pode ser atribuído

a pequena quantidade do patógeno (TEMELLI et al., 2010).

Além disso, este resultado difere do observado por ANDRADE et al.

(2011) com inoculação na câmara de ar de ovos férteis de perus, os

pesquisadores demonstraram que a câmara de ar é um ambiente propício para o

estabelecimento e multiplicação da Salmonella Enteritidis, pois o patógeno migrou

para todos os componentes do ovo desde o primeiro dia de incubação.

A frequência dos suabes positivos para Salmonella está apresentada

na Tabela 1 e os resultados dos suabes cloacais individuais durante todo o

experimento das aves inoculadas (T2 e T4) estão demonstrados no Quadro 1.

Em nenhuma amostra dos tratamentos controle, durante todo o

experimento, foi isolada a bactéria inoculada. Os suabes cloacais das aves que

receberam a bactéria via câmara de ar e ração foram positivos o que sugere a

colonização intestinal por Salmonella. Observa-se que houve diferença (P<0,05)

entre a frequência para as idades de 5 e 10 dias, com maior isolamento de

Salmonella no tratamento contaminado via ração.

20

TABELA 1 – Frequência (%) de suabes de cloaca das aves dos quatro tratamentos com 5, 10, 15, 20 e 25 dias de idade.

Tratamento 5 Dias1 10 Dias 15 Dias 20 Dias 25 Dias T1 Controle_Ração 0 0 0 0 0 T2 Contaminado_Ração 33,3a 63,3a 41,7 50,0 58,3 T3 Controle_Câmara de ar 0 0 0 0 0 T4 Contaminado_Câmara de ar 20b 14,3b 70 40 60 Valor de P (X2) 0,0035 0,0002 0,0013 0,0015 0,0017 1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem pele teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade.

QUADRO 1 – Dinâmica da presença de Salmonella nos suabes de cloaca para 5, 10, 15, 20 e 25 dias do experimento, dos tratamentos T2 e T4.

T2 – Contaminação via ração T4 – Contaminação via câmara de ar

Pr Ave 5d 10d 15d 20d 25d 5d 10d 15d 20d 25d

1

1 - - - - - - - + + + 2 - - - - - - - - - + 3 - + R * * + - R * * 4 - + - + - M * * * * 5 - + + + + M * * * *

2

1 + + R * * - - + + + 2 - + + - + M * * * * 3 + + + - - M * * * * 4 - + - + - M * * * * 5 - - + - - M * * * *

3

1 - + + + + - + + - - 2 - + + - + - - R * * 3 - + - + + - - + + - 4 + - R * * M * * * * 5 - - + + + M * * * *

4

1 - + + - + - - + + + 2 - + - - + - - + - + 3 - + R * * + - R * * 4 - + - + + M * * * * 5 + - - + - M * * * *

5

1 - - - - + - - R * * 2 - + + + - + + - - - 3 - - - + + - - + - + 4 + - R * * M * * * * 5 + + + + + M * * * *

6

1 - - - - - - * * * * 2 - + - - - - - - - - 3 + - - - + M * * * * 4 + + - + + M * * * * 5 + + R * * M * * * *

Total (%)

9/30 33,3%

19/30 63,3%

10/24 41,7%

12/24 50%

14/24 58,3%

3/15 20%

2/14 14,3%

7/10 70%

4/10 40%

6/10 60%

Negativo (-), Positivo (+), Retirados do experimento para necropsia (R;r), mortalidade (M), * já retirado ou morto

Tanto as aves contaminadas via ração (T2) quanto nas aves

contaminadas no ovo (T4) observou-se resultados negativos nas amostras de

suabes cloacais (três no tratamento T2 e quatro no tratamento T4). Deve-se

21

considerar que as aves utilizadas são da mesma linhagem, provenientes das

mesmas matrizes e receberam o inóculo em idade e vias diferentes.

Provavelmente este resultado, a ausência de colonização verificada no mecônio

até os 21 dias se deve a imunidade inata dos indivíduos, pois segundo

KINGSLEY & BAUMLER (2000) a capacidade do sorovar de colonizar o trato

gastrointestinal também está relacionada com a imunidade inata.

Pode-se observar (Quadro 1) que as aves inoculadas com Salmonella

Schwarzengrund de ambos os tratamentos não excretaram a bactéria em todos

os dias avaliados. Esse patógeno possui a característica de ser excretado de

maneira intermitente e em pequenas quantidades pelas fezes, dificultando a

detecção nesse tipo de análise. Este resultado se respalda em ANDRADE et al.

(2008) que também observaram a excreção intermitente do patógeno.

Neste estudo, observou-se que excreção das aves inoculadas via

ração, mesmo após cessar a contaminação no sétimo dia com ração

contaminada, o número de aves infectadas aumentou entre o quinto e o décimo

dia e se manteve até 25 dias. Provavelmente a ração contaminada, assim como a

excreção do patógeno pelas aves infectadas aumentou a contaminação

ambiental. Confirmando que a ração é uma das principais fontes de disseminação

horizontal na cadeia avícola (SILVA et al., 2005).

Diferente de ANDRADE et al. (2008) que constataram redução da

colonização com o avanço na idade das aves, independente da via de inoculação

e linhagem estudada em pintos inoculados com Salmonella Enteritidis, o que pode

indicar comportamento diferente do sorovar Schwarzengrund.

Das aves positivas no tratamento contaminado no ovo (T4), apenas

3/15 (20%) foram positivas no primeiro suabe com cinco dias de experimento,

7/10 (70%) foram positivas a partir do dia 15, observou-se também que aves que

foram negativas nos dias 5 e 10 do experimento, a partir da terceira coleta (15

dias) apareceram como positivas. Assim, provavelmente as aves se infectaram a

partir da contaminação ambiental o que pode ser respaldo em KABIR (2010) que

os níveis de Salmonella podem aumentar devido ao aumento da sua excreção

pelas aves para o ambiente. A excreção do microrganismo pode diminuir de

acordo com a dose do desafio (PICKLER, 2011).

22

Os resultados de excreção fecal das aves oriundas dos pintos

inoculados in ovo apresentaram um número menor de aves positivas, isto pode

ser explicado pela alta mortalidade das aves que ocorreu na primeira semana, o

que segundo resultado de uma progênie de qualidade inferior, o que pode ser

respaldado em LOURENÇO (2013) em que a qualidade dos pintos, como o peso

inicial está relacionada à sua capacidade de crescimento, ganho de peso,

imunidade e qualidade do frango.

3 - Ganho de peso

Observa-se que o peso inicial foi influenciado negativamente pela via

de inoculação, com os pintos nascidos da inoculação na câmara de ar, pesando

menos que os nascidos de ovos íntegros (P<0,001). O grupo controle na câmara

de ar, mesmo com o peso inicial menor conseguiu se recuperar até a primeira

pesagem, porém no grupo contaminado essa influência negativa foi observada

até a pesagem com cinco dias de vida (P<0,05), influenciando também no ganho

de peso com cinco dias. Já com 10 dias o ganho de peso foi maior para o grupo

inoculado na câmara de ar, independente da contaminação (P<0,05). Porém a

partir de 15 dias o ganho de peso sofreu influência negativa (P<0,001) apenas

devido à contaminação, independente do tratamento (Tabelas 2 e 3).

TABELA 2– Peso inicial em gramas e ganho de peso em gramas das aves dos

quatro tratamentos nos dias 5, 10, 15, 20 e 25.

Ganho de Peso Via inoculação

Peso inicial (g) 5 10 15 20 25

Ração 43.42±0.08a

110.87±8.6a

151.84±16.5b

251.90±17.1

296.57±22.2

362.33±11.7

Câmara de Ar

41.50±0.11b

99.81±16.9b

172.02±11.0a

255.46±12.3

317.54±18.8

331.79±18.2

P > F <0,0001 0,0238 0,0015 0,8173 0,1624 0,1196 Bactéria

Controle 42.55±0.2

146.32±4.1a

205.83±3.6b

289.42±5.6ª

367.11±8.6ª

369.33±9.8a

Contaminado

42.37±0.35

64.36±6.5b

118.04±7.1ª

217.94±13.4b

247.00±11.9b

324.79±18.0b

P > F 0,1121 <0,0001 <0,0001 0,0001 <0,0001 0,0279 via*bactéria

P > F 0,0048 <0,0001 0,0018 0,7897 0,6812 0,0743 C.V. (%) 0,63 10,5 8,27 14,66 11,53 13,25 1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem pele teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade.

23

O menor peso dos pintos de um dia que foram inoculados na câmara

de ar pode ser respaldado por OHTA et al. (1999), LEITÃO et al. (2010) e

ANDRADE et al. (2011) que consideram a via de inoculação invasiva. Os pintos

inoculados apenas com solução salina conseguiram se recuperar, pois segundo

ZHAI et al. (2011) embriões são tolerantes aos desafios osmóticos impostos por

essa solução.

TABELA 3- Desdobramento estatístico do peso inicial em gramas, peso em g com

cinco dias de vida e ganho de peso médio em gramas com cinco dias das aves dos quatro tratamentos .

Peso inicial Controle Contaminado

Ração 43,33±0,32 aA 43,5±0,2 aA Câmara de ar 41,76±0,29 bA 41,23±0,23 bB

Peso final 5 dias Controle Contaminado

Ração 181,16±13,21 aA 127,4±5,7 aB Câmara de ar 196,56±9,97 aA 86,05±13,38 bB

GMP 5 Controle Contaminado

Ração 137,83±13,33 aA 83,9±5,73 aB Câmara de ar 154,8±10,06 aA 44,82±13,34 bB 1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem pele teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade.

Com 10 dias o ganho de peso maior para os pintos inoculados na

câmara de ar se deve ao que foi observado nos suabes de cloaca, vários pintos

do grupo inoculados na câmara de ar que sobreviveram não estavam infectados,

o que leva ao ganho de peso normal, sem influência do patógeno, ao contrário de

embriões infectados que originam aves com aspecto ruim, com o

desenvolvimento comprometido e morte nas primeiras semanas, assim como

observado por GAST (1994).

Para os dias posteriores (15, 20 e 25), os pintos estão infectados,

assim a influência negativa dos grupos contaminados, se deve provavelmente por

lesões ocorridas no trato gastrointestinal, em que as injúrias na mucosa intestinal

provocadas pelo desenvolvimento e agressão resultam em menor ganho de peso,

que pode ser respaldado por ROCHA et al. (2013). Além disso, infecções

intestinais podem levar a redução da absorção dos nutrientes e aumento do custo

energético com a renovação celular (BORSOI et al., 2011). No T4 (contaminado

24

via câmara de ar), algumas aves apresentaram o apetite diminuído, reduzindo o

consumo de ração, o que acarretou no menor desenvolvimento da ave devido à

ausência do alimento, fato também observado por CHAVES (2007) ao inocular

aves com Salmonella Enteritidis e submete-las a jejum.

Estudos têm mostrado que em infecções, mesmo que inaparentes em

diferentes tipos de linhagens de aves de produção, é possível observar menor

peso médio e ganho de peso nas aves infectadas (GORHAM et al., 1991;

DHILLON et al., 1999; SANTANA et al. 2012; ROCHA et al. 2013), ou retardo do

crescimento (DHILLON et al., 2001).

3 - Avaliação clínica, anatomopatológica e mortalidade

Os principais sinais clínicos apresentados foram fezes aderidas à

cloaca, diarreia, prostração, apetite diminuído, retardo no crescimento e

sonolência. No grupo T1 observou-se três aves (10%) com excretas aderidas à

cloaca, de maneira branda e uma ave apresentava retardo de crescimento (3,3%).

Nas aves inoculadas via ração T2 observou-se nove aves (30%) com excretas

aderidas à cloaca, de maneira mais acentuada, com quatro aves (13,3%)

apresentando diarréia e três aves (10%) apresentando retardo de crescimento,

observados principalmente nas duas primeiras semanas de vida.

No grupo T3, cinco aves (16,6%) apresentaram excretas aderidas à

cloaca, de maneira branda, sem apresentar nenhum outro sinal. Nas aves T4

observou-se 14 aves (46,7%) com excretas aderidas à cloaca, destas dez (33,3%)

apresentaram este sinal de maneira exacerbada e diarreia, sete (23,3%) aves

apresentaram prostração, cinco (16,7%) aves apresentaram anorexia, seis (20%)

aves apresentaram retardo no crescimento e nove (30%) aves apresentaram

sonolência (Figura 3). Nas aves oriundas da inoculação na câmara de ar, os

sinais clínicos mais pronunciados devido à infecção causada pela Salmonella

Schwarzengrund refletiram em aumento da mortalidade.

Assim foi possível observar diferença estatística (P<0,05) entre o

contaminado e controle na ração para fezes aderidas e diarreia. Para o grupo

contaminado via ração e controle oriundos da câmara de ar, houve diferença

estatística (P<0,05) para fezes aderidas, diarreia, prostração, retardo no

25

crescimento e sonolência. Entre os grupos contaminados na ração e na câmara

de ar, houve diferença (P<0,05) para diarreia, prostração, apetite diminuído e

sonolência (Tabela 4).

TABELA 4 – Frequência em % dos sinais clínicos apresentados na parcela, dos quatro tratamentos durante todo o experimento.

Tratamento

Fezes aderidas Diarreia

Prostração

Apetite diminuído

Retardo no crescimento

Sonolência

T1-Controle_ração 10c 0c 0b 0b 3,3bc 0b T2-Contaminado_ração 30ab 13,3b 0b 0b 10ab 0b

T3-Controle_câmara 16,7bc 0c 0b 0b 0c 0b T4-Contaminado_câmara de ar 46,7a 33,3a 23,3a 16,7a 20ab 30a

Valor de P (X2) 0,0006 0,0003 0,0004 0,0033 0,0153 <0,0001

1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem pele teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade.

FIGURA 3 – Sinais clínicos apresentados pelas aves do tratamento T4: A: Sinais de sonolência nas duas aves e retardo de crescimento. B: Fezes aderidas nas três aves da parcela.

Os sinais observados sugerem um quadro de infecção do trato

gastrointestinal e também septicemia, os quais foram mais evidentes de um a 15

dias de vida, o que também foi observado por PORTER-JR (1998).

Embora existam alguns sorotipos que podem causar infecção mais

limitada no hospedeiro natural (LORENZONI, 2010), a capacidade de promover

infecções sistêmicas ou localizadas depende do sorovar envolvido, da quantidade

26

do inóculo, dos genes de virulência e do estado imunológico do hospedeiro

(KINGSLEY & BAUMLER, 2000). Neste estudo evidenciou que Salmonella

Schwarzengrund possui a capacidade de promover infecções sistêmicas e

entéricas associadas ou somente entéricas.

Os sinais observados podem ser respaldados em BARROW (2000) o

qual relatou o aparecimento de acúmulo de alimentos e fluídos ao redor da cloaca

nas primeiras semanas de vida. Sonolência progressiva com os olhos fechados,

asas caídas e penas eriçadas, anorexia e emagrecimento são comuns em aves

infectadas com Salmonella, segundo GAST (2008). Também ANDRADE et al.

(2008) observou o aparecimento de incoordenação, asas caídas, penas

arrepiadas, sonolência, apatia, cloaca suja e tamponamento de cloaca.

Além dos sinais clínicos, também foi observado o aparecimento de

lesões macroscópicas nas aves dos quatro tratamentos. Com 10 dias de idade,

16,7% (1/6) pinto do grupo T1 (controle via ração) apresentou fígado pálido, do T2

(contaminado via ração) 33,3% (2/6) apresentaram baço diminuído, 16,7% (1/6)

bursa aumentada com petéquias discretas, 83,3% (5/6) fígado friável e congesto e

o 50% (3/6) ceco com rajas hemorrágicas, do T3 (controle câmara de ar) 50%

(3/6) apresentaram bursa aumentada, 33,3% (2/6) fígado friável, e 50% (3/6)

cecos com rajas hemorrágicas, do T4 (contaminado câmara de ar) 16,7% (1/6)

apresentou bursa hemorrágica e fígado friável e 33,3% (2/6) com resquício de

saco da gema caseificado.

Com 25 dias de idade, 33,3% (2/6) pintos do T1 (controle ração)

apresentaram cardiomegalia, 50% (3/6) esplenomegalia e 16,7% (1/6) com

resquício de saco da gema (resultado negativo para Salmonella), do T2

(contaminado ração) 33,3% (2/6) apresentaram cardiomegalia, 33,3% (2/6)

esplenomegalia e 100% (6/6) hepatomegalia com fígados friáveis, do T3 (controle

câmara de ar) 33,3% (2/6) apresentaram esplenomegalia e 100% (6/6)

hepatomegalia, com uma ave apresentando pontos necróticos discretos

(resultado negativo para Salmonella), do T4 (contaminado câmara de ar) 16,7%

(1/6) apresentou hepatomegalia, 33,3% (2/6) com resquício de saco da gema,

66,7% (4/6) esplenomegalia. A bursa e o ceco não apresentaram alterações.

A única diferença estatística observada foi na influência negativa da

Salmonella em causar resquício de saco da gema nas aves contaminadas pela

27

câmara de ar, com dez dias (P<0,05). Para os outros achados macroscópicos não

houve diferença estatística (P>0,05) entre os tratamentos controle e contaminado

(Tabela 5). O que é evidenciado também pelas mesmas alterações terem sido

encontradas em aves inoculadas e positivas para Salmonella, aves inoculadas e

negativas para o patógeno e em aves não inoculadas e negativas, evidenciando

assim que as lesões não foram causadas pela bactéria estudada.

TABELA 5 – Frequência em % das lesões macroscópicas observadas nos pintos dos quatro tratamentos com 10 e 25 dias.

As alterações observadas nesse estudo corroboram com as citadas em

literatura, em que as lesões macroscópicas de Salmonella não são

patognomônicas. No fígado podem ocorrer alterações congestas, segundo

BERCHIERI JÚNIOR & FREITAS NETO (2009), e no baço pode haver

esplenomegalia segundo DUNLAP et al. (1992) como observado nas aves

inoculados via ração.

10 dias

Tratamento Coração Baço Saco da gema

Bursa Fígado Ceco

T1-Controle_ração - 0 0b 0 16,7 0 T2-Contaminado_ração - 33,3 0b 33,3 83,3 50 T3-Controle_câmara de ar

- 0 0b 50 33,3 50

T4-Contaminado_câmara de ar

- 0 33,3a 16,7 16,7 0

Valor de P (X2) - 0,132 0,0238 0,2891 0,1026 0,0872 25 dias

Tratamento Coração Baço Saco da gema

Bursa Fígado Ceco

T1-Controle_ração 33,3 0 16,7 - 50 - T2-Contaminado_ração 33,3 33,3 0 - 100 - T3-Controle_câmara 0 33,3 0 - 100 - T4-Contaminado_câmara de ar

16,6 0 33,3 - 66,7 -

Valor de P (X2) 0,465 0,2035

0,2597 - 0,0882 -

1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem pele teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade.

28

As lesões macroscópicas encontradas neste estudo foram diferentes

das observadas por O’BRIEN (1988) e DHILLON et al. (1999) que detectaram

pericardite e perihepatite e por ANDRADE et al. (2008) observaram onfalite,

peritonite, pericardite, perihepatite e tiflite.

A infecção por Salmonella Schwarzengrund assemelha-se das

infecções por salmonelas paratíficas, pois nem todas as aves apresentaram sinais

clínicos e as lesões macroscópicas não tiveram diferença entre o controle e

contaminado, que segundo HOFER et al. (1997) geralmente são inaparentes.

Mesmo em inoculações experimentais com Salmonella Enteritidis, como realizada

por DHILLON et al. (2001) e ANDRADE et al. (2008) as aves apresentaram

infecção assintomática, ou discreta doença clínica, mesmo apresentando

considerável colonização intestinal. Estado portador inaparente e as dificuldades

técnicas para a detecção de Salmonella a campo tornam as aves uma fonte

contínua de contaminação ambiental e posteriormente de contaminação da

carcaça e dos produtos gerados (RODRIGUES, 2005).

O aparecimento de sinais clínicos mais pronunciados (Tabela 4) e

aumento na frequência nos resquício de saco da gema até 10 dias (Tabela 5)

refletiram no aumento da mortalidade das aves oriundas da inoculação de

Salmonella Schwarzengrund na câmara de ar. Mas também algumas aves que

morreram na primeira semana não apresentaram sinais clínicos ou lesões

macroscópicas, segundo GAST (2008) na infecção de aves recém eclodidas a

septicemia rápida, leva a alta mortalidade, sem aparecimento de lesões.

Para os tratamentos controles, no T1 (controle ração) houve dois

óbitos, sem aparecimento de sinais clínicos e com a bacteriologia negativa para

Salmonella, indicando que a mortalidade não foi causada pelo patógeno, para o

T3 (controle câmara de ar) não houve nenhuma mortalidade.

A mortalidade observada foi maior naquelas aves que receberam

inóculo via câmara de ar aos 19 dias de incubação (T4). Das 30 aves alojadas,

50% (15/30) morreram na primeira semana e 6,7% (1/15) morreu na segunda

semana, no total de 53,3% (16/30) até os 25 dias de vida do experimento. Por

outro lado, a inoculação via ração (T2) não determinou mortalidade, o que indica

que a via de inoculação influenciou a capacidade da Salmonella Schwarzengrund

de causar mortalidade.

29

Sete das 16 aves mortas do tratamento T4 (43,75%) foram positivas

para Salmonella, com diferentes porcentagens nos órgãos pesquisados (Figura 5)

comprovando a septicemia.

FIGURA 4 – Frequência em % de órgãos positivos para Salmonella das 16 aves encontradas mortas do tratamento contaminado via câmara de ar.

Ao exame clínico das aves que morreram nas duas primeiras semanas

verificou-se menor peso das aves quando comparado as outras aves do mesmo

tratamento. Algumas apresentavam sonolência, retardo do crescimento,

prostração e fezes aderidas à cloaca. No exame macroscópico apenas uma

apresentou esplenomegalia com pontos necróticos (Figura 5).

FIGURA 5 – Pinto do tratamento T4, com peso abaixo (3 dias de vida) e lesão macroscópica com esplenomegalia e pontos necróticos, a ave foi positiva para Salmonella apenas no baço.

A mortalidade observada no estudo nas duas primeira semanas

corrobora com DHILLON et al. (2001). Com o declínio da mortalidade associado à

idade em que a ave é inoculada, com maior suscetibilidade das aves mais jovens

(GORHAM et al., 1991) e ao avanço da idade da ave (DESMIDT et al., 1997).

Salmonella Schwarzengrund em contaminação natural determinou diarreia severa

42,86%

57,14%

71,43%

14,29%

42,86%

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

Coração Baço Fígado Ceco Saco da gema

Po

rcen

tag

em

de

órg

aãs p

osit

ivo

s

Órgãos positivos para Salmonella

Coração Baço Fígado Ceco Saco da gema

30

e enterite em perus com nove dias de idade, sendo observada uma elevada

mortalidade, principalmente nas três primeiras semanas (HENDERSON, 1952).

A esplenomegalia com focos necróticos observada na ave com

mortalidade na primeira semana, corrobora com o descrito por DUNLAP et al.

(1992) que também observou alteração no fígado de aves inoculadas com

Salmonella Typhimurium. Embora, MIGLINO et al. (2011) não tenham encontrado

alterações clínicas e lesões macroscópicas nas aves inoculadas com Salmonella

Minnessota nos primeiros dois dias.

A mortalidade é determinada por fatores do hospedeiro, como a idade

e imunidade e fatores patogênicos como dose bacteriana, a via de infecção,

sorovar e cepa, quanto mais invasiva mais grave será o quadro clínico (POPPE,

2000). Segundo VUGIA et al. (2004) Salmonella Schwarzengrund é um dos

sorovares capazes de causar salmonelose invasiva. Assim, como foi utilizado o

mesmo sorovar para os dois grupos inoculados, pode-se considerar que a

mortalidade foi determinada pela via de inoculação, pela dose inoculada e

também pela contaminação de forma contínua durante sete dias e em

quantidades menores nas aves inoculadas via ração, quando comparada a

inoculação única na câmara de ar.

4- Biometria e pesquisa de Salmonella nos órgãos

O peso das aves foi influenciado negativamente (P<0,001) pela

contaminação por Salmonella Schwarzengrund. Com 10 dias, o peso relativo do

baço não sofreu nenhuma influência, a contaminação não influenciou o peso

relativo do coração, mas a via de inoculação sim (P>0,05), com pesos maiores

para as aves inoculadas via câmara de ar, assim como o peso do intestino, porém

o peso maior foi para as aves inoculadas via ração. A contaminação influenciou

(P<0,01) o comprimento do intestino e também o peso relativo do fígado, com

pesos maiores nas aves contaminadas em comparação com as aves controles, o

peso do fígado também sofreu influência da via de inoculação (Tabela 6 e 7).

Com 25 dias, não houve diferença estatística para o peso relativo do

coração e do baço. E peso relativo do fígado (P>0,05) e peso e comprimento do

31

intestino (P>0,001), sofreram influência da contaminação, com pesos e

comprimento maiores nas aves inoculados do que nas aves controles (Tabela 6).

TABELA 6 – Valores médios dos pesos relativos (g/100g de peso vivo) dos órgãos (coração, baço, fígado, intestino) e comprimento do intestino das aves com 10 e 25 dias de vida.

10 dias

Via de contaminação Ave Coração Baço Fígado Comp_int Peso_int

Ração 0,31±0,03

0,61±0,02b 0,08±0,0

3,71±0,27ª

39,86±3,18

10,66±0,3a

Câmara de Ar 0,34±0,03

0,68±0,03a

0,09±0,01

3,2±0,15b

37,52±4,12

9,81±0,14b

P > F 0,5092 0,0477 0,8345 0,0104 0,9432 0,0313

Bactéria

Controle 0,39±0,01a

0,62±0,02

0,09±0,01

2,91±0,06b

29,72±0,9b

10,13±0,15

Contaminado 0,22±0,01b

0,67±0,04 0,08±0,0

4,16±0,21ª

49,69±3,5a

10,44±0,41

P > F <0,0001 0,0882 0,4434 <0,0001 <0,0001 0,6554

Via*bactéria P > F 0,4365 0,1599 0,0749 0,0032 0,8201 0,2192

C.V. (%) 9,28 12,28 9,6 10,34 20,95 8,46

25 dias

Via de contaminação Ave Coração Baço Fígado Comp_int Peso_int

Média

Ração

1,18±0,06

0,54±0,03 0,09±0,0

2,23±0,09

13,29±0,45

6,83±0,28

Câmara de Ar 1,17±0,07

0,52±0,03

0,08±0,01

2,24±0,09

13,09±0,48 6,8±0,2

P > F 0,7959 0,5352 0,7124 0,8745 0,6674 0,8869

Bactéria

Controle 1,36±0,04a

0,52±0,03

0,09±0,01

2,04±0,08b

12,04±0,3b

6,24±0,19b

Contaminado 1±0,04b 0,54±0,03

0,09±0,01

2,43±0,07ª

14,34±0,3a

7,39±0,16ª

P > F <0,0001 0,5352 1,000 0,0015 <0,0001 <0,0001

Via*bactéria P > F 0,2451 0,0729 1,000 0,2154 0,8018 0,051

C.V. (%) 11,04 18,33 25,68 11,43 8,51 8,31 1 Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não

diferem pelo teste Tukey 5%

32

No desdobramento das interações entre as vias de inoculação câmara

de ar e ração, o agente inoculado provocou uma diferença de peso relativo do

fígado (P<0,001), sendo maior na inoculação da ração do que da câmara de ar

(Tabela 7).

TABELA 7 – Desdobramento da biometria do peso relativo do fígado para as aves inoculadas via ração e via câmara de ar com 10 dias de idade.

Via de contaminação

Inoculação da bactéria Ração Câmara de ar

Controle 2,88±0,25 Aa 2,95±0,17Aa Contaminado 4,55± 0,44 Ab 3,57±0,53Bb 1 Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem pelo teste de Tukey 5%

O peso relativo do baço não ter sofrido influência da contaminação,

difere do observado por CHAVES (2007) e LEONÍDEO (2014), nestes estudos o

peso do baço foi maior nas aves inoculadas (P<0,05). CHAVES (2007) ainda

sugere que o aumento do órgão é em decorrência a resposta fisiológica normal da

ave frente a uma infecção bacteriana, por ser um órgão do sistema macrocítico-

fagocitário

O peso maior para o coração com 10 dias das aves inoculadas na

câmara de ar, independente da contaminação, pode ser respaldado pela

observação do maior ganho de peso dessas aves (Tabela 2). Pois com 25 dias

não houve diferente entre os tratamentos para esse órgão.

Peso do intestino não ter sido influenciado pela inoculação com 10 dias

também foi observado por ROCHA et al. (2013) para as aves com sete e 14 dias.

Assim como o peso relativo maior no grupo contaminado, independente da via de

inoculação observado para as aves com 25 dias. Segundo ZUANON et al. (1998),

microrganismos patogênicos no intestino, podem causar lesões e espessamento

da parede intestinal que levam ao aumento do peso deste. Além disso, o peso do

intestino ter sido maior nas aves inoculadas via ração em relação às aves via

câmara de ar, pode ter ocorrido por causa do apetite diminuído, o que corrobora

com CHAVES, (2007) que o menor consumo de ração das aves infectadas resulta

em menor desenvolvimento e menor peso do órgão pela ausência de alimento. E

33

também devido ao maior isolamento da bactéria no ceco das aves desse grupo

(P<0,05), o que sugere uma maior infecção intestinal, que refletiu em aumento do

órgão por fatores inflamatórios causados pela infecção.

O maior comprimento do intestino nas aves inoculadas independente

da via de inoculação com 10 e 25 dias também foi observado no estudo de

ANDRADE et al. (2008) para as aves com sete dias.

O peso relativo do fígado maior nas aves contaminadas com 10 e 25

sugere que a aumento do peso foi resultado do processo infeccioso. Assim como

diferentes sorovares de Salmonella são capazes de causar, respaldado por

BARROW (1999) e ROCHA et al. (2013), este estudo mostra que Salmonella

Schwarzengrund também possui essa característica. O desdobramento

demonstrando que o aumento do peso do fígado além de ser influenciado pela

contaminação, também foi influenciado pela via de inoculação para as aves com

10 dias, sugere que as lesões macroscópicas de hepatomegalia mais observadas

nesse grupo (Tabela 5) foram significativas também no aumento relativo do peso

do órgão.

Para os órgãos também foi realizada a pesquisa de Salmonella (Tabela

8), os tratamentos controles permaneceram negativos. Entre os tratamentos

contaminados, Salmonella Schwarzengrund foi capaz de invadir os órgãos das

aves inoculadas experimentalmente simulando as vias de transmissão vertical e

horizontal, nas duas idades pesquisadas (10 e 25 dias). Nas aves do grupo

contaminado via ração com 10 dias 16,6 % (1/6) e 83,3 (5/6) tiveram,

respectivamente o coração e os cecos positivos, e com 25 dias 33,3% (2/6) do

baço, 16,6% (1/6) do fígado e 83,3% (5/6) dos cecos positivos. Nas aves oriundas

da infecção via câmara de ar com 10 dias 16,6 % (1/6) tiverem o coração e o ceco

e 33,3% (2/6) tiveram o baço e fígado positivos, e com 25 dias 16,6 % (1/6)

tiverem o coração, o fígado e o ceco e 33,3% (2/6) os baços positivos.

Verificaram-se resultados sem diferença estatística para os isolados do coração,

baço e fígado. E diferentes (P<0,05) nos isolados de ceco e tonsila cecal, nas

duas necropsias, com maior isolamento bacteriano no tratamento contaminado

pela ração (T2).

34

TABELA 8 – Frequência em % dos órgãos positivos para Salmonella das aves

com 10 e 25 dias de idade.

Tratamento 10 Dias 25 Dias

Coraç Baço Fígad Ceco Coraç Baço Fígad Ceco

T2 Contaminado_Ração

16,6 0 0 83,3ª 0 33,3 16,6 83,3a

T4 Contaminado_Câmara de ar

16,6 33,3 33,3 16,6b 16,6 33,3 16,6 16,6b

Valor de P (X2) 0,5537

0,099 0,099 0,0023

0,3916 0,2035

0,5538

0,002

3 1 Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem pele teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade.

Observa-se que no tratamento T2 com 10 dias, o patógeno foi isolado

no coração e no ceco, com maior frequência no ceco e tonsilas cecais. Com 25

dias pode ser detectado no baço, fígado e ceco, ainda este com maior isolamento.

No tratamento T4, desde a primeira necropsia a bactéria foi isolada em todos os

órgãos (Tabela 6).

A colonização intestinal e a presença do patógeno em órgãos nos dois

tratamentos, nas duas datas, nos possibilitam inferir que a Salmonella

Schwarzengrund colonizou o intestino e invadiu o epitélio com disseminação para

outros órgãos sem determinar mortalidade. Este resultado evidencia a capacidade

invasiva e de persistência da Salmonella Schwarzengrund e corrobora com

pesquisadores que trabalharam com outros sorovares paratíficos como HINTON

et al. (1989), ANDRADE et al. (2008) BOHEZ et al., (2008), HE et al., (2010),

ROCHA, et al. (2013) e LEONÍDEO (2014).

Não houve diferença estatística com relação ao isolamento nas

diferentes idades pesquisadas, o que difere de DESMIDT et al. (1997) que a

frequência da colonização intestinal e a capacidade invasiva em órgãos é maior

em pintos recém eclodidos do que em aves mais velhas. Porém o aumento da

contaminação ambiental pela excreção de Salmonella pelas aves infectadas

possibilitou a reinfecção (HOFER et al., 1997; KABIR, 2010).

Para causar doença sistêmica o patógeno ultrapassa a mucosa

intestinal, invade os fagócitos e dentro deles ativam seus mecanismos de

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virulência permitindo a sobrevivência e replicação. Os fagócitos infectados, por

sua vez, migram para os órgãos como baço e fígado, onde ocorre a replicação o

que facilita a disseminação da bactéria (OHL & MILLER, 2001). A partir do baço e

fígado, se espalham através da corrente sanguínea e sistema linfático, podendo

infectar ovário, oviduto, saco vitelino (CHAPPELL et al., 2009). Essa capacidade

de sobreviver e se multiplicar em órgãos, especialmente fígado e baço, está

correlacionada com a virulência do agente e as espécies de hospedeiros

(BARROW et al., 1994).

A maior frequência nos isolados de ceco e tonsila cecal do grupo

contaminado via ração pode ser respaldado também pela maior frequência de

isolamento da bactéria nos suabes de cloaca (Quadro 1), assim esse grupo

apresentou uma maior colonização intestinal, devido várias aves oriundas da

inoculação na câmara de ar não estarem contaminadas nesses dias. Porém

nesse tratamento (T4) a colonização intestinal foi acompanhada por maior

disseminação, comprovada pelo isolamento da bactéria em todos os órgãos

pesquisados, isso provavelmente se antecede da qualidade inferior dos pintos

oriundos desse tratamento quando comparados aos pintos inoculados na ração.

O comportamento da Salmonella Schwarzengrund para contaminação

por ração e também para provável re-contaminação ambiental dos pintos que

sobreviveram à inoculação pela câmara de ar, determinou colonização intestinal e

septicemia, mas não determinou mortalidade, pois em ambos a colonização foi

contínua e em quantidades menores, quando comparadas a inoculação nos

embriões via câmara de ar.

36

CONCLUSÃO

Salmonella Schwarzengrund possui a capacidade de invadir e persistir

nos órgãos de aves oriundas da inoculação pela câmara de ar, e em pintos de um

dia pela via ração contaminada.

O sorovar determina mortalidade dos embriões, e pintos de baixa

qualidade, menor ganho de peso se inoculado via câmara de ar.

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73. TIROLLI, I. C. C., COSTA, C.A. Ocorrência de Salmonella spp. em carcaças de frango recém abatidas em feiras e mercados da cidade de Manaus-AM. Acta Amazônica, Manaus, v.36, n.2, p.205-208, 2006. 74. UNI, Z.; FERKET, R. P. Enhancement of oviparous species by in ovo feeding. USA Patent n. 6592878 B2, 2003. 75. VUGIA, D. J., SAMUEL, M., FARLEY, M. M., MARCUS, R., SHIFERAW, B., SHALLOW, S., SMITH, K., ANGULO, F. J. Invasive Salmonella Infections in the United States, FoodNet, 1996–1999: Incidence, Serotype Distribution, and Outcome. Clinical Infectious Diseases, Chicago, v. 38, p. 149-156, 2004. 76. WILLIAMS, A., A. C. DAVIES, J. WILSON, P. D. MARSH, S. LEACH, AND T. J. HUMPHREY. Contamination of the contents of intact eggs by Salmonella typhimurium DT104. Veterinary Record, Londres, v.143, p.562–563, 1998.

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CAPÍTULO 3 - CONSIDERAÇÕES FINAIS

Para avicultura é fundamental buscar medidas que evite o risco de

contaminação de seus produtos, principalmente por patógenos causadores de

toxinfecção alimentar em humanos, como Salmonella. Uma dessas medidas é

conhecer a patogenia, as possíveis fontes de infecção e as vias de transmissão

dos diferentes sorovares, como ferramenta de monitoramento epidemiológico e

programas de controle eficientes.

Estudos com isolamento e tipificação de Salmonella têm mostrado que

diferentes sorovares são encontrados em toda a cadeia avícola, desde matrizes

reprodutoras ao abate, fortalecendo a necessidade de vigilância epidemiológica

constante, para que o Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA) se

atualize sempre que preciso.

Programas de controle eficientes, integrado a todos os elos de

produção, evitam a propagação indiscriminada dos patógenos por toda a cadeia

avícola, minimizando perdas econômicas e prevenindo problemas de saúde

pública.

Entre essas fontes se destaca a ração, como uma das principais fontes

de contaminação, entrada de diferentes sorovares nas criações e via de

transmissão horizontal, com o controle desde a colheita da matéria prima até o

armazenamento da ração pronta no local de consumo e limpeza de comedouros e

controle de vetores que também buscam essa ração como fonte de alimento,

como roedores e pássaros.

Controle também das reprodutoras que levam a transmissão vertical, e

cuidados com os ovos embrionados, por sua posição no início da cadeia, evita

que Salmonella se perpetue para outros elos da cadeia. Por meio de monitoria

constante utilizando bacteriologia e outras técnicas como PCR nas diversas

fontes de contaminação, começando pela fábrica de ração e pelas matrizes.

Posto que, comprovadamente, diferentes sorovares são capazes de

causar colonização intestinal, doença clínica, mortalidade e diminuição dos

índices zootécnicos acarretando um problema financeiro. Mas que também, esses

mesmos sorovares ao causar colonização intestinal, com excreção do patógeno

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para o meio ambiente e consequente perpetuação da contaminação de aves,

fômites e ambiente, sem o aparecimento de sinais clínicos e com quedas sutis da

produtividade, possam configurar um problema maior ainda, pela continuação da

contaminação sem o devido tratamento, que acarrete em um problema de saúde

pública, devido à falta de monitoramento.

Salmonella Schwarzengrund possui características importantes para

saúde pública, devido à comprovada capacidade de causar toxinfecção alimentar

em humanos, apresentar multiresistência a antimicrobianos e ser isolado em toda

a cadeia avícola, com estudos no País ainda bastante escassos e relacionados

apenas a frequência. E com o presente estudo, também para a avicultura, por ser

um sorovar capaz de causar colonização e doença clínica em frangos de corte por

diferentes vias de transmissão.

Assim o monitoramento de diferentes sorovares, deve ser constante e

não apenas focado no surgimento de doença e perdas econômicas, mas com um

caráter muito mais preventivo do necessariamente terapêutico, para se evitar

danos maiores à população consumidora e assim fortalecer a importância

alimentar que a cadeia avícola possui, por fornecer alimentos de alto valor

nutritivo e custo relativamente baixo de qualidade.

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ANEXO PARECER FAVORÁVEL COMITÊ DE ÉTICA

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