SPORE NEWS

Volúmen 11 Número 6Abril 2015

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Problemas planteados con los BI imposibles

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por Kellie Matzinger

SPORE NEWSProblemas planteados con los BI imposibles

Caso #1: El efecto “Bourbon”Tipo de BI utilizado: Ampolla de MagnaAmp (o ProSpore) Problema observado: El cliente informa que el indicador biológico (BI) ya se estaba volviendo positivo al sacarlo del esterilizador.Solución: Educar al cliente sobre el uso de controles negativos.

Todos los productos de indicadores biológicos (BI) actúan del mismo modo en general – el BI se expone al ciclo de esterilización, activado o cultivado de manera que las esporas entren en contacto con el medio de cultivo y se incuba a la temperatura adecuada específica de la especie de espora. Los productos MagnaAmp, SterilAmp, ProSpore (1 y 4ml) y ProAmp simplemente fueron incubados, por cuanto las esporas ya están suspendidas en el medio de cultivo. Si en el BI expuesto quedan esporas viables, éstas germinarán a su estado vegetativo ya que ahora disponen de una fuente de nutrientes y de una temperatura de crecimiento ideal. Usando carbohidratos en el medio, las células vegetativas producen metabolitos ácidos que causan una caída del pH del medio a medida que se van acumulando. La caída del pH provoca un desplazamiento del indicador de pH y, por lo tanto, la confirmación visual de un ciclo de esterilización fallido. Sólo hace falta que sobreviva una espora para que cambie el color del medio de cultivo. Sin embargo, incluso con un gran fallo de esterilización por el que muchas células viables siguen en el BI, la aparición del cambio de color todavía requeriría un par de horas de incubación para poder ser detectado.

En ciclos de vapor de alta temperatura y/o larga duración, los componentes dentro del medio MagnaAmp empiezan a degradarse ligeramente, adquiriendo un color “bourbon” o marrón púrpura. A veces, este cambio de color desde el púrpura brillante es confundido con una unidad positiva cuando se observa inmediatamente después de su retirada del ciclo de esterilización o una vez concluido el ciclo de incubación BI. Por este motivo, se diseñó la “ampolla de control negativo” que ahora acompaña al producto BI. Las ampollas de control negativo contienen el mismo tipo y volumen de medio de recuperación aunque no incluyen esporas. La ampolla de control negativo debe exponerse en la cámara de esterilización junto con los BI que contienen esporas, incubándose ambos a continuación. En el momento crítico de lectura, se compararán el color del medio con el BI y el color del medio con el control negativo. Una diferencia de color respecto al amarillo en el test BI al compararlo con la ampolla de control negativo indicaría supervivencia de esporas en el ciclo y que el cambio de color era debido a actividad microbiana en el test BI. Si el color tanto del BI como del control negativo sigue igual tras la incubación, significa que la unidad es negativa y que el ciclo de esterilización ha sido un éxito.

Después de mucho debate, se observó que este cliente no exponía la ampolla de control negativa en el ciclo de esterilización y simplemente comparaba el control negativo no expuesto con el BI expuesto con el resultado de una evidente diferencia de color. Véase Spore News V8N3 para información adicional sobre este tema.

Figura 11) No-expuesto, crecimiento positivo2) Exposición subletal, crecimiento positivo3) Exposición letal, crecimiento negativo4) Una exposición prolongada muestra degradación térmica del medio, crecimiento negativo5) Una exposición más prolongada muestra una degradación térmica adicional del medio, crecimiento negativo.6) Unidad no expuesta y no incubada mostrada para la comparación de color.

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Caso #2: Da positivo ¿es positivo? Tipo de BI utilizado: ProTest Steam (o EZTest Steam)Problema observado: El BI se volvió amarillo pero no hay presencia de esporas tras el subcultivo. Solución: Educar al cliente en técnicas de cultivo post-proceso.

Los procesos bioquímicos que se suceden en un BI positivo imitan lo representado en la gráfica de una curva de crecimiento estándar. Al principio, las células proliferan muy rápidamente aunque, cuando se agotan los nutrientes, el crecimiento se ralentiza hasta el punto en el que un número equivalente de células se vuelve no viable a la vez que se producen nuevas células (“fase estacionaria” representada en la figura 2). Debido a la acumulación de metabolitos ácidos y al agotamiento de los nutrientes disponibles, las células empiezan a morir a medida que el entorno se vuelve tóxico debido a sus propios desechos metabólicos.

Es por este motivo que el subcultivo de un BI positivo se ha de realizar inmediatamente después de detectar que la unidad es positiva. En el caso de este cliente, el positivo se detectó a las 24 horas, sin embargo la unidad se siguió incubando durante 72 horas y no fue subcultivada hasta ese momento. Cuando se colocó en una placa de agar tripticasa de soya (TSA) y se incubó, no se hallaron colonias. Esto se debió al hecho de que ya no había células viables en el medio.

Stationary Phase

Log PhaseDeath Phase

Lay Phase

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Caso #3: Reversión – No es negativoTipo de BI utilizado: EZTest GasProblema observado: El BI inicialmente era positivo (amarillo) pero luego se volvió negativo (rosa) al prolongar la incubación. Solución: Educar al cliente respecto a la “reversión”.

Como se ha indicado anteriormente, todos los indicadores biológicos se usan de la misma manera en general – el BI es procesado, activado o cultivado y luego incubado en el rango de crecimiento propio de las especies de esporas específicas. En la mayoría de las especies bacterianas, la germinación y proliferación iniciales es debida a los carbohidratos (azúcares) presentes en el medio de cultivo que les proporcionan una fuente de energía. El subproducto del metabolismo de los carbohidratos es ácido. Algunas especies tienen también la capacidad de metabolizar proteínas como fuente de energía por lo que el subproducto de dicha metabolización es básico. La especie de espora presente en nuestro producto EZTest Gas es Bacillus atrophaeus que tiene la capacidad de metabolizar tanto carbohidratos como proteínas. Los azúcares simples son mucho más fáciles de metabolizar. Así, en un entorno donde hay una gran disponibilidad de carbohidratos y proteínas, los microbios siempre metabolizarán primero los carbohidratos.

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En el caso de este cliente, las esporas sobrevivieron al ciclo, germinaron y las células resultantes inicialmente metabolizaron los carbohidratos del medio – de ahí el color amarillo del medio que significa una unidad positiva. Al prolongar la incubación y habiéndose agotado los carbohidratos, las células empezaron a metabolizar las proteínas del medio, dando como resultado que el medio se volviera básico. Al principio, el medio cambió de amarillo a naranja rojizo (que es el color original del medio de este producto y normalmente significaría un resultado negativo) y progresivamente se fue volviendo de color magenta o rosa brillante. En este punto, un examen detallado del medio debería confirmar también la presencia de turbidez o crecimiento en la ampolla. Hemos diseñado las formulaciones de nuestros medios de cultivo para proporcionar abundancia de carbohidratos de tal manera que, en la mayoría de los casos, las células mueren por la reducción del pH antes que revertir el metabolismo de las proteínas.

Caso # 4: Subtilis es un problema “sensible”Tipo de BI utilizado: SterilAmp ‘5230’Problema detectado: “Algo le pasa al BI – se volvió positivo durante mi ciclo de esterilización.”Solución: Educar al cliente respecto a la sensibilidad del Bacillus subtilis

El producto SterilAmp ‘5230’ fue diseñado para clientes que precisaran monitorizar la esterilización de líquidos a temperaturas inferiores a 121º C. Normalmente, los clientes que usan este producto realizan ciclos de esterilización en el rango de los 105-118º C. Las esporas inoculadas en estas unidades son de la especie Bacillus subtilis ‘5230’ ATCC 35021. El rango de crecimiento óptimo para esta especie es de 30-39º C. Este es el rango de temperatura que ofrece la germinación de esporas y proliferación celular más rápida. Sin embargo, el rango de crecimiento en el que las esporas siguen teniendo capacidad de germinación y proliferación (aunque a un ritmo más lento) se amplía a 15-50º C aproximadamente. Por lo tanto, mantener una temperatura de almacenamiento inferior a 15º C (59º F) es esencial para que este producto permanezca estable y para proporcionar una provocación de esporas al usar ciclos de esterilización. Si se alcanzan temperaturas superiores a los 15º C durante cualquier lapso significativo de tiempo, las esporas empezarán a germinar inutilizando el producto ya que las células vegetativas no ofrecen una resistencia relevante a los procesos de esterilización.

Lo que se averiguó con este cliente fue que los BI estaban siendo colocados en el líquido a esterilizar y parte de la fase de preacondicionamiento de su ciclo era un tiempo de espera a 40º C. Con esta temperatura en el rango de crecimiento de esta especie, las esporas germinaron durante el tiempo de espera y las células resultantes proliferaron provocando que el medio se volviera amarillo. Las células ya vegetativas, habiendo perdido toda capacidad de resistencia, fueron eliminadas cuando la temperatura subió a 115º C durante la fase de exposición del ciclo. Así pues, en realidad los BI parecerían positivos aunque no habrían ofrecido ninguna seguridad de esterilidad del líquido esterilizado.

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Caso # 5: ¿Quién soy y de dónde vengo?Tipo de BI utilizado: Tiras de esporas para GasProblema observado: Tras la inspección de entrada de este lote, el cliente realizó la identificación del 16s rRNA de las esporas. Las esporas fueron identificadas como Bacillus vallismortis y no como Bacillus atrophaeus.Solución: Educar al cliente sobre los fundamentos lógicos de la identificación.

No solo se mantiene la trazabilidad de nuestros cultivos de esporas, sino que también se utiliza un enfoque polifásico al confirmar la identidad antes de la fabricación de nuestros productos BI. La fuente de nuestros cultivos se obtiene a partir de una colección reconocida de cultivos, realizando la trazabilidad inversa de cada cultivo de esporas hasta la respectiva fuente específica. También se lleva a cabo la confirmación fenotípica realizando tests bioquímicos reconocidos, pruebas de rango de crecimiento y verificación visual de la morfología de las colonias. Además, la confirmación genotípica de la identidad se obtiene gracias a los análisis del 16s rRNA efectuados.

Los tests bioquímicos son muy exclusivos para la especie Bacillus atrophaeus, a saber, la capacidad de producir pigmento marrón/negro en agar conteniendo tirosina y la capacidad de producir pigmento naranja en agar conteniendo dextrosa. Cada especie tiene una “huella digital” bioquímica única comparada con especies similares. Con la mayoría de las especies bacterianas, esta huella digital se utiliza para apoyar los resultados de la identificación por secuenciación del 16s rRNA ya que éste es el principal medio de identificación. Sin embargo, cuando se identifican especies formadoras de esporas mesofílicas – el opuesto exacto es verdadero y la información genética respalda los diferentes resultados bioquímicos. El Bacillus atrophaeus y otras especies mesofílicas están tan estrechamente relacionadas desde el punto de vista genético, que sólo 1 o 2 pares de bases difieren entre los 500 pares de bases secuenciados al procesar el 16s rRNA. Por este motivo, el informe genético puede ofrecer confianza únicamente a nivel de género y puede registrar algunas especies (incluyendo el Bacillus vallismortis) como posibles coincidencias.

Al tener en cuenta la trazabilidad, la confirmación fenotípica, la confirmación genotípica (habiendo registrado el Bacillus atrophaeus) combinadas con la resistencia confirmada del lote específico fabricado, estamos seguros de que la especie de espora es realmente el Bacillus atrophaeus. Para más información sobre la identificación, consultar Spore News V1N4.

Kellie Matzinger forma parte de la plantilla de Mesa Labs Bozeman Facility desde 2001. Kellie es licenciada en microbiología por la Universidad Estatal de Montana y ha ocupado cargos en el Laboratorio de Cultivo de Esporas, Laboratorio de Producción de BI y en el Departamento de Soporte Técnico. Su cargo actual es Jefa de Atención al Cliente y Soporte técnico.

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