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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CATIANE DO SACRAMENTO SOUZA SINTASE DA QUITINA DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA: CARACTERIZAÇÃO GÊNICA E MODELAGEM DO PROVÁVEL SÍTIO CATALÍTICO. Feira de Santana, BA Julho. 2007

(Stahel) Aime & Phillips-Mora

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

BIOTECNOLOGIA

CATIANE DO SACRAMENTO SOUZA

SINTASE DA QUITINA DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA: CARACTERIZAÇÃO GÊNICA E MODELAGEM DO

PROVÁVEL SÍTIO CATALÍTICO.

Feira de Santana, BA Julho. 2007

CATIANE DO SACRAMENTO SOUZA

SINTASE DA QUITINA DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA: CARACTERIZAÇÃO GÊNICA E MODELAGEM DO

PROVÁVEL SÍTIO CATALÍTICO.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Julio Cezar de Mattos Cascardo Co-Orientador: Prof. Dr. Aristóteles Góes-Neto

Feira de Santana, BA Julho. 2007

BANCA EXAMINADORA

Feira de Santana – BA 2007

Aos meus pais, que em todos os momentos foram

os melhores pais de mundo. Um exemplo

inesgotável de amor, companheirismo, paciência,

caráter e todas as coisas boas que eu posso

imaginar. Vocês são meus “moldes” de seres

humanos.

AGRADECIMENTOS

Por chegar aqui agradeço primeiramente a A. Góes-Neto e J. C. M. Cascardo, pela

confiança, orientação, presença e apoio em minhas dúvidas e desesperos. Ao B. T. Hora-

Junior, B. M. Oliveira e M.C. Santos-Junior, por me revelar os primeiros segredos da

Biologia Molecular e Química Computacional. C. V. Dias, M. Lopes e C. P. Pirovani, pelo

pronto apoio sempre que solicitados. Ao pessoal do LAMOL, em especial ao R. Vilas-Boas

e A. K. Santos. À R. Galante pelas leituras que me proporcionou e pelo presença, pelos

puxões de orelha e por “tentar” polir umas arestas. Ao A. C. S. Rocha, I. K. C. Nobre, W. R.

A. Soares, R. Q. Oliveira et al. pela troca de conhecimento e pelo apoio nas “Atividades

Complementares” e afins. B. S. Andrade (uma ótima pessoa para trabalhar junto) foram

fantásticas e valiosas suas dicas em bioinformática e os riso (todos eles!!!) G. J. Bulos e M.

L. C. Pontes pelo modo novo de ver velhas fotografias e pelas intensivas experimentações

do resultado da fermentação de Vitis spp; a C. E. L. Fiuza, O. F. Paixão, J. Rodrigues, A.

Estrela, G. M. A. Aires e H. R. Carneiro-Junior pelos cafés, vinhos, ombros, ouvidos e

afins. Não poderia esquecer de agradecer a Klb. Gomes e F. José pela simples

objetividade, P. Drumond (também o poeta, mas aqui me refiro a “pessoinha”) pela

delicadeza com todas as coisas e pela presença (ainda que via-Graham Bell). À S. V.

Oliveira, Sr. Falcão e M. Camargos, por me devolver à pesquisa. A D. Sampaio por sua

insubstituível e “imaginativa” contribuição. Aos Amigos do LAPEM, em especial àqueles da

BioMol, pelos géis, pelos risos, por tudo... Aos meus pais por entenderem minha ausência.

Ao CNPq/FINEP e à PPGBiotec, pela logística, e em especial ao Mississipi Center for

Supercomputing Research pelo acesso ao Amber, e principalmente a Sra. Sônia, por ter

facilitado muita coisa.

E ao Deus, claro, por ter nos proporcionado um maravilhoso mundo codificado por genes

(que ocupam nosso tempo e enchem de significado nossas vidas), mas principalmente,

pela Cachoeira da Fumaça, pelas estrelas que reservou para o céu de lá e por ter posto

em meu caminho incríveis pessoas como, L. C. Pereira e D. M. Novaes, com quem eu

pude caminhar naquelas trilhas: Amiguinhos, amo vocês de “montanha”!!!!!

Agradecimento Especial

Pelo modo empolgante com que orienta, pela atenção, incentivo e, principalmente, por seu

envolvimento em cada passo que dei à frente, agradeço a Aristóteles Góes Neto, que foi

mais que um orientador, foi um exemplo, o melhor.

“... um passo à frente e você não está mais no mesmo lugar”.

Chico Science

SUMÁRIO

RESUMO 07 ABSTRACT 08 LISTA DE FIGURAS 09 LISTA DE TABELAS 13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 14 1. INTRODUÇÃO 15 2. REVISÃO DA LITERATURA 18 2.1. O fungo Moniliophthora perniciosa 18 2.2. Parede Celular 22 2.3. A sintase da quitina 25 2.4. Determinação e caracterização de gene por primer walking 28 2.5. A busca pelo controle da doença 29 3. MÉTODOS EM BIOLOGIA COMPUTACIONAL 31 3.1. Química computacional 34 3.2. Emprego da química computacional na modelagem

comparativa 38

4. MATERIAL E MÉTODOS 41 4.1. Busca e anotação das prováveis seqüências do gene da

sintase da quitina do Banco de Dados do Projeto Genoma do M. perniciosa

42

4.2. Desenho de oligonucleotídeos iniciadores 43 4.3. Extração e purificação do DNA total de M. perniciosa 43 4.4. Amplificação de fragmentos de DNA genômico 44 4.5. Seqüenciamento 46 4.6. Análise das seqüências 47 4.7. Análise filogenética 48 4.8. Determinação da estrutura 3D: Modelagem da região

conservada contendo o sítio ativo 49

4.9.1. Identificação e alinhamento seqüencial da proteína molde 49 4.9.2. Construção e refinamento do modelo 50 4.9.3. Validação 53 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 54 5.1. Seqüenciamento do gene da sintase da quitina 54 5.2. Resultados em Química Computacional 74 6. CONCLUSÃO 98 7. REFERÊNCIAS 100 APÊNDICES 112

RESUMO

A sintase da quitina (CHS) converte UDP-N-acetilglicosamina em quitina, o principal componente da parede celular de fungos. Esta glicosiltransferase tem cinco diferentes níveis de expressão, dependendo do estádio do ciclo da vida do fungo. A sintase da quitina classe III age diretamente na formação da parede celular, são responsáveis por muitas das quitinas na célula e é, por isso, um alvo molecular altamente especifico para fármacos que podem inibir o crescimento e desenvolvimento do fungo patogênico, pois a CHS é um precursor imediato da quitina e cataliza uma reação irreversível. Este trabalho objetivou a caracterização molecular experimental e in silico do gene da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa, (MopCHS), um provável homólogo do gene chs1 do Agaricus bisporus. Os contigs de M. perniciosa foram mapeados com, uma cobertura de aproximadamente 80% no produto gênico de A. bisporus com alta significância estatística, e pares de oligonucleotideos iniciadores foram produzidos para garantir a amplificação para o seqüenciamento de dois intervalos do provável gene MopCHS por primer walking. Após o sequenciamento completo do gene, que compreende 3443 pb (14 éxons e 13 íntrons), constituindo um cDNA com uma fase de leitura aberta com 2739 pb e codificando uma proteína com 913 aa, um modelo do provável sitio ativo foi construído pelo método de modelagem por homologia. Um dos homólogos utilizado, o 1Z3X, apresentou 61% de identidade. O modelo foi construído pelo Swiss Model e refinado por cálculos de Mecânica e Dinâmica Molecular executados pelos campos de força presentes no BioMediCache 6.1 (MM3) e Amber 8.0 (ff99). A qualidade do modelo resultante foi testada pelo programa Procheck 3.0 e ANOLEA. O gráfico de Ramachandran produzido mostrou que o modelo proposto tem cerca de 94,5% de seus resíduos nas regiões favoráveis. O completo conhecimento da geometria do sítio ativo de MopCHS será útil para desenvolver inibidores contra a doença vassoura-de-bruxa.

Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, sintase da quitina, seqüenciamento, estrutura 3D, homologia.

ABSTRACT

Chitin synthases (CHS) converts UDP-N-acetylglycosamine into chitin, the main component of the fungal cell wall. These glycosyltransferases have five different expression levels depending on the fungal life cycle stage. Class III chitin synthases act directly in the formation of the cellular wall, are responsible for most of the chitin synthesis in the cell, and are, therefore, a highly specific molecular target for drugs that could inhibit the growth and development of pathogenic fungi, since CHS is the immediate precursor of chitin and catalyzes an irreversible reaction. This work aims to an in silico and experimental molecular characterization of Moniliophthora perniciosa chitin synthase gene (MopCHS), a putative homologous of Agaricus bisporus chs1 gene. M. perniciosa contigs were successfully mapped onto A. bisporus CHS gene product, with a coverage of approximately 80% with high statistical significance, and pairs of primers were produced to generate amplicons for sequencing two gaps inside the putative M. perniciosa gene by primer walking. After the complete sequencing of the gene, which has 3443 pb (14 exons and 13 introns), a cDNA ORF with 2739 pb and codes for a protein with 913 aa, a model of active site was constructed using Homology Modeling approach. The homologous 1Z3X, with 61% identity, was used as one of the templates. The model was constructed using Swiss Model and refined by a set of Molecular Mechanics and Molecular Dynamics calculation, both using MM3 force field in BioMedCache 6.1. and ff99 from Amber 8.0. The quality of resultant model was evaluated by Procheck 3.0 and ANOLEA. Ramachandran plot indicated that the model has 94,5% of residues in the most favored regions. The complete knowledge about the geometry of active site of MopCHS will be useful to develop new inhibitors against witches’ broom disease. Keywords: Moniliophthora perniciosa, sequencing, chitin synthase, 3D structure, homology.

LISTA DE FIGURAS Figura 01: Aspecto da doença vassoura-de–bruxa nos botões florais e nos frutos de cacau causados pelo M. perniciosa (Fonte: AIME, PHILLIPS-MORA, 2005).

19

Figura 02: Ciclo de vida do M. perniciosa. As partes em azul e laranja do ciclo correspondem às fases biotrófica e saprofítica, respectivamente. Em verde, está delimitada à parte do ciclo do fungo na sua interação com a planta do cacau, e em amarelo, está a parte do ciclo que ocorre fora do hospedeiro (Adaptado de LOPES, 2005).

21

Figura 03: Polimerização da UDP-GlcNAc pela sintase da quitina para formar a quitina (Fonte: YEAGER, FINNEY, 2004).

24

Figura 04: Representação da parede celular de A. fumigatus Fresen, com destaque para a biossíntese de α-1-3-glicano e quitina que são sintetizados por diferentes famílias de genes com diferentes funções, entre eles está a sintase da quitina (Fonte: BEAUVAIS, 2003).

24

Figura 05: Rota metabólica da sintase da quitina na síntese da parede celular. (1) Glutamina-frutose-6-fosfato amidotransferase (EC 2.6.1.16); (2) Glicosamina fosfato N-acetiltransferase (EC 2.3.1.4); (3) fosfo-N-acetilglicosamina mutase (EC 5.4.2.3); (4) UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (EC 2.7.7.23) e (5) Sintase da quitina (EC 2.4.1.16) (Fonte: LAGORCE et al., 2002; HOGENKAMP, 2006).

27

Figura 06: Movimentos atômicos de estiramento de ligação, de deformação angular, de torção e interação entre átomos não ligados.

35

Figura 07: Superfície de Energia Potencial. 38

Figura 08: Fluxograma da metodologia utilizada para a determinação da seqüência primária do gene da sintase da quitina do fungo M.perniciosa e posterior construção do modelo 3D do provável produto gênico.

41

Figura 09: Esquema representativo do gene da sintase da quitina, com destaque para os fragmentos amplificados e seqüenciados neste trabalho. O icontig5 está representado em amarelo, icontig3 em azul e o contig4 em vermelho. Em branco estão as regiões inicialmente desconhecidas que foram determinadas por primer walking.

44

Figura 10: Processo de alinhamento da seqüência problema com o molde. A: em verde, fragmento da estrutura primária da seqüência de sintase da quitina de M. Perniciosa, em vermelho está a região da seqüência que apresenta identidade com o molde, e em laranja, a região do molde que tem identidade com a seqüência; B: Estrutura e molde alinhados, com a estrutura molde sobreposta pela seqüencial problema (Fonte: Swiss PDB Viewer 3.7).

50

Figura 11: Fluxograma da metodologia para construção do modelo. 52

Figura 12: Chs1 de Agaricus bisporus (909aa). Destaque para a delimitação das regiões de similaridade, obtida por BLAST, com contigs de M. perniciosa. Amarelo: icontig 5 - Fase de leitura +1: Valor-E = 1e-88, Identidade = 55%, Positividade = 63%, Gaps = 12%, Fase de leitura +2: Valor-E = 1e-37, Identidade = 91%, Positividade = 98%, Gaps = 0% e Fase de leitura +3: Valor-E = 1e-37, Identidade = 83%, Positividade = 91%, Gaps = 0%; Azul: icontig 3 - Valor-E = 6e-37 Identidade = 78%, Positividade = 81%, Gaps = 0%; Verde: icontig 4 - Valor-E = 1e-82, Identidade = 58%, Positividade = 66%, Gaps = 24%, 690 aminoácidos (aprox. 76% do total de 909 aa). Aminoácidos em negrito correspondem ao alvo do par de primers Pchsic13.3 e Pchsic34, respectivamente; Aminoácidos grifados

54

Figura 13: Alinhamento entre o icontig5 de M. perniciosa e a região inicial da seqüência codante do cDNA da CHS de M. perniciosa com A. Bisporus (emb|CAB96110.1), P. ostreatus (dbj|BAF37219.1) e P. graminis (gb|ABB70409.1) (Fonte: Resultados experimentais, http://tcoffee.vital-it.ch/).

56

Figura 14: A - Tradução da região inicial do iContig5 na fase de leitura +1. A - Os aminoácidos em azul representam o início da similaridade, por BLASTX, com A. bisporus; destaque, em verde, para o provável códon de iniciação que está situado a sete aminoácidos antes do início do BLAST, com o sexto aminoácido da referida enzima. Em vermelho, provável região promotora (TATA BOX), B - Cromatograma do sequenciamento

56

da placa CP02-S1-000-015-C08-EM-F na região do provável TATA BOX, disponível no banco de dados do genoma do M. perniciosa (Fonte: Resultado experimental gerado pelo programa FinchTV).

Figura 15: Alinhamento mostrando a região do domínio característico das sintases da quitina e provável sítio catalítico em Basidiomycota.

57

Figura 16: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa via PCR. No gel de agarose a 1,0% foi aplicado 3 µL do produto da reação de amplificação em cada poço. A eletroforese ocorreu por 90 min., 60 v e 50 mA. M - Marcador de massa molecular 100 base pair Ladder da Fermentas®. Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de dNTPs a 10 mM; 0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada oligonucleotídeo específico a 10 pMol; 1,0 µL de gDNA de M. perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de Taq DNA Polymerase (5U/µL) da Phoneutria® e água ultrapura (q.s.p. 25 µL). 1 e 2 - Fragmentos de cerca de 290 pb obtido com o par de oligonucleotideo Pchsic34F e Pchsic34R. A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 59,7 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 1 min. 3 e 4 - Fragmento de cerca de 480 pb obtido com o par de oligonucleotideo CHSiC13.3F e CHSiC13.3R. A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 61,6 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 2 min.

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Figura 17: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa por PCR. Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de dNTPs a 10 mM; 0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada oligonucleotídeo específico a 10 pMol; 1,0 µL de gDNA de M. perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de Taq Platinum DNA Polymerase (5U/µL) da Invitrogen® e água ultrapura (q.s.p. 25 µL). A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 3 min, anelamento a 65,0 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 10 min. Análise de 3 µL do produto da reação de amplificação em gel de agarose a 1,2%, por 120 min., 60 v e 50 mA. M - Marcador de massa molecular DNA Step Ladder Promega®; 1 e 2 - Pchs54-F/Pchsic13.3-R, com fragmento de 1700 pb; 3 e 4 - Pchsic13.3F/PchsiC34R, com fragmento de 1400 pb; 5 e 6 - PchsiC34F/Pchs54F, com fragmento de 1100 pb e 7 e 8 – Pchs54F/Pchs54R, com fragmento de aproximadamente 4000 pb.

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Figura 18: Esquema representativo demonstrando a organização do gDNA da sintase da quitina de M. perniciosa. As linhas representam os éxons e as barras verticais os íntrons.

60

Figura 19: Predição da topologia de hélices transmembranares na sintase da quitina (Fonte: TMHMM).

61

Figura 20: Localização dos domínios que são considerados consenso e que identificam a sintase da quitina e caracterizam a Classe III e a Divisão 1.

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Figura 21: Domínios conservados da sintase da quitina de M. perniciosa nos bancos de dados: pfam01644, com Valor-E 2e-62, pfam08407 com valor-E 7e-25, COG1215 com Valor-E 2e-22 e pfam03142 com Valor-E 4e-19.

64

Figura 22: Método de inferência bayesiana. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.

66

Figura 23: Método de distância. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.

67

Figura 24: Máxima Verossimilhança. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.

68

Figura 25: Método da Parcimônia. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.

69

Figura 26: Consenso de maioria dos quatro diferentes métodos. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem aos valores percentuais de ocorrência dos grupos formados nos quatro diferentes métodos.

70

Figura 27: A - Esquema representativo do gene da sintase da quitina de M. perniciosa, a porção em vermelho corresponde à região conservada utilizada na construção da estrutura tridimensional; B: Alinhamento da seqüência da sintase da quitina de M. perniciosa com A. bisporus (CAB96110.1), C. cinerea (EAU84753.1), P. ostreatus (BAF37219.1), C. neoformans (AAW43575.2) e P. graminis (ABB70408.1), com destaque para a região conservada. Os aminoácidos em negrito correspondem àqueles utilizados no modelo proposto (Fonte: Notradame et al., 2000 <http://www.tcoffee.org>).

75

Figura 28: PSI-BLAST contra o banco de dados do PDB, mostrando o alinhamento dos fragmentos com os moldes das estruturas correspondentes.

76

Figura 29: Resultado da submissão dos projetos dos fragmentos com os moldes da estrutura correspondentes (Fonte: Swiss PDB Viewer 3.7).

77

Figura 30: Modelos construídos a partir das seqüências fragmentadas. Em A: Estrutura resultante da submissão do fragmento achs1 com o molde 2D4W; B: fragmento achs2 com o molde 2BYT; C: fragmento achs3 com o molde 1Z3X; D: fragmento achs4 com o molde 2HY5 e E: modelo 0CSM, resultante da junção dos modelos iniciais gerados no Swiss Model, sem refinamento, para a região conservada da sintase da quitina (Fonte: VMD 1.8.6).

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Figura 31: Validação representada pelo gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) dos fragmentos que compõem o modelo 3D da região conservada da sintase da quitina. Em A - fragmento achs1; B - fragmento achs2; C: fragmento achs3 e D: fragmento achs4.

80

Figura 32: Destaque para as α-hélices (A) e folhas-β (B) que compõem o modelo proposto. 81

Figura 33: Gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) do modelo 0CSM da região conservada da sintase da quitina. Em A: Ramachandran da estrutura; B: Ramachandran da Glicina e C: Ramachandran da Prolina, onde se pode notar, em destaque o resíduo Pro-211 em região desfavorável (Fonte: Procheck 3.0).

83

Figura 34: De A até N- Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com o ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).

84

Figura 35: Qualidade da cadeia principal do modelo 0CSM: A - avaliação do gráfico de Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins; D - distorção dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

85

Figura 36: Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 0CSM região conservada da sintase da quitina: A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0)

86

Figura 37: Gráfico do ANOLEA (energia potencial de cada átomo na cadeia de proteína). As projeções em vermelho referem-se a um valor positivo de energia potencial para cada resíduo, e as projeções em verde identificam os valores de energia que são satisfatórios, ou seja, os valores negativos (Fonte: Swiss Model).

87

Figura 38: Mapas gerados pela dinâmica realizada pelo BioMedCache 6.1. Os pontos em cinza indicam a posição das moléculas de menor energia. Em A: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h3; B: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h4, C: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h5 e D: Dinâmica Molecular realizada A Hélice h6.

89

Figura 39: Mapa gerado pela dinâmica molecular de 200 ps realizada pelo Amber 8.0. 90

Figura 40: Representação gráfica da validação dos modelos do gene da sintase da quitina após a realização da dinâmica molecular. A e B – Modelos CHS-a1 e CHS-a2, submetidos ao campo de força MM3 (BioMedCache), C, D, E, F e G – Modelos 1csm, 2csm, 3csm, 4csm e 5csm, respectivamente, resultantes do campo de força ff99 (Amber). Destaque, em vermelho, para o grafico que a presentou o melhor valor de energia (Fonte: ANOLEA).

91

Figura 41: Gráfico de Ramachandran para o modelo 4csm proposto para a região 93

conservada da sintase da quitina do M. perniciosa.

Figura 42: Analise da cadeia principal do modelo 4csm: A - avaliação do gráfico de Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins entre os átomos não-ligados; D - distorção dos angulos tetraedricos dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

94

Figura 43: Análise da cadeia lateral do modelo 4CSM da região conservada da sintase da quitina: A - Conformação gauche menos; B - Conformação trans; C - Conformação gauche mais; D - Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E - Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

95

Figura 44: Modelo 4CSM final. A - Destaque para a região do provável domínio catalítico do gene da sintase da quitina do Moniliophthora perniciosa; B - Região do provável domínio catalítico em destaque e C – Representação tridimensional do modelo 4CSM (Amber) gerado pelo VMD 1.8.6. Os hidrogênios dos átomos de carbono foram suprimidos para uma melhor visualização.

97

LISTA DE TABELAS Tabela 01: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para determinar as regiões desconhecidas do gene da sintase da quitina do fungo causador da vassoura-de-bruxa.

45

Tabela 02: Seqüências do M. perniciosa relacionados aos genes da sintase da quitina em Agaricus bisporus (emb|CAB96110.1) identificados por BLASTx.

55

Tabela 03: Característica da organização dos éxons e íntrons do gene da sintase da quitina de M. perniciosa.

60

Tabela 04: Predição de Hélices transmembrana para o gene MopCHS.

61

Tabela 05: Predição das topologias transmembranares das sintase da quitina de Basidiomicota, obtida em análise realizada pelo TMHMM.

62

Tabela 06: Alinhamento com pontuação de alta significância do provável produto gênico (sintase da quitina) de M. perniciosa contra a base de dados do Pfam.

64

TABELA 07: Seqüências de sintase da quitina (CHS) de Basidiomycota e Ascomycota com valor esperado (E) = 0,0 e identidade = ou > que 50%.

71

Tabela 08: Identificação dos moldes utilizados para construção do modelo 3D da sintase da quitina de M. perniciosa.

77

Tabela 09: Sumário dos gráficos de Ramachandran para os fragmentos que compõem o modelo 3D da região conservada da sintase da quitina.

80

Tabela 10: Sumário dos modelos gerados para a região conservada do gene da sintase da quitina destacando o resultado da validação representada pelo gráfico de Ramachandran realizada pelo Procheck 3.0

88

Tabela 11: Sumário dos resíduos de aminoácidos que apresentaram valor de energia positiva na análise do ANOLEA.

92

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % - Percentagem µL - Microlitros 10X - Dez vezes concentrado 1X - Concentração para uso normal CCMB – Coleção de cultura microbiológica da Bahia CEPLAC - Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira CHS – Gene da sintase da quitina DFT - Teoria do funcional de densidade DM – Dinâmica Molecular DNA - Ácido desoxirribonucléico dNTP - Desoxirribonucleotídeo EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária K – Graus Kelvin Kb - Kilobases KDa – Kilodaltons M - Molar mA - Miliamper min - Minutos mL - Mililitros mM – Milimolar MpCHS – Gene da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa ng - Nanogramas nº - Número ºC - Graus centígrados pb - Pares de bases PCR - Reação em cadeia da polimerase pH - Potencial hidrogeniônico pI – Ponto isoelétrico pmol - Picomoles ps - picossegundos q.s.p. - Quantidade suficiente para QM/MM – Quantum-Mecanical/Molecular-Mecanical RMS - Rout mean square RNAse - Ribonuclease SDS - Sódio dodecil sulfato seg - Segundos SEP – Superfície de Energia Potencial TAE - Tampão Tris, Acetato e EDTA Tris - Tri(hidroximetil)aminometano U - Unidade de atividade enzimática UEFS - Universidade Estadual de Feira de Santana UESC - Universidade Estadual de Santa Cruz UFBA - Universidade Federal da Bahia UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas UV - Ultravioleta v/v - Volume por volume

15

1. INTRODUÇÃO

Nativa da Amazônia, a planta do cacau (Theobroma cacao L.) é uma

espécie arbórea, que tem como principal produto comercial suas amêndoas, a

matéria-prima do chocolate (SANTOS, 2005). No início do século 20 as maiores

regiões produtoras de cacau do mundo eram o litoral do Equador e o Estado da

Bahia no Brasil (LASS, 1985). Na década de 70, cerca de 90% da produção de

cacau no Brasil era destinada a exportação (BASTOS, 1987). Deste total 80% era

produzido na Bahia, que nos anos 80 chegou a produzir cerca de 400.000

toneladas. Os maiores problemas da cultura cacaueira são os fungos patogênicos,

principalmente o Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora, o

causador da vassoura-de-bruxa, considerado como o mais devastador deles

(ALMEIDA, ANDEBHAN, 1987).

No sul da Bahia a cacauicultura sofreu prejuízos econômicos de grande

escala devido à propagação deste patógeno, que foi detectada na Bahia em 1989.

No ano 2000 a produção baiana foi reduzida em cerca de 50% (FAO, 2002) devido

à presença da vassoura-de-bruxa, que retirou o Brasil do grupo dos paises

exportadores de cacau, e trouxe complexos problemas de caráter social,

econômico e ecológico para as regiões produtoras (ANDEBRHAN et al., 1999;

BASTOS, 1990). O fungo infecta os lançamentos foliares novos, os frutos em

desenvolvimento e as almofadas florais, podendo até provocar a morte da planta

quando afetada por sucessivos ciclos do patógeno associados a fatores abióticos

(QUEIROZ et al., 2003).

Com base nessas implicações, foi estruturada a Rede de Genômica do

Estado da Bahia e implantado o Projeto Genoma do M. perniciosa, o fungo

causador da vassoura-de-bruxa, com o objetivo de fornecer dados para o

desenvolvimento e controle da doença. A rede conta com seis laboratórios, dos

quais cinco estão situados no estado da Bahia (UESC, UEFS, UFBA e CEPLAC).

O Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da Universidade Estadual de

Feira de Santana é um dos laboratórios desta rede. Mais de 155.900 seqüências já

foram obtidas e inúmeros genes de interesse têm sido identificados (PEREIRA,

2004).

16

Os estudos do genoma da vassoura-de-bruxa buscam soluções para este

problema, sendo que o seqüenciamento gênico, seguido dos estudos de

proteômica, possibilita um avanço considerável na compreensão da biologia do

fungo. Interações moleculares e transformações químicas têm sido a base da

biologia, e todo fenômeno biológico que pode ser atualmente analisado pode ser

traçado por processos químicos (GOLDSMITH-FISCHMAN, HONIG, 2003).

Na busca por um controle efetivo da doença, a caracterização bioquímica e

funcional de produtos gênicos (PIROVANI et al., 2005), a prospecção e o

desenvolvimento de inibidores específicos são de importância fundamental. Os

genes codificadores de enzimas associadas ao metabolismo dos principais

carboidratos da parede celular, quitina e glicanos, quando bem caracterizados

quanto à forma de regulação da expressão e quanto à ação dos produtos gênicos,

podem ser alvo de interferência, e promover a instabilidade das paredes celulares

do fungo, que podem levar à autodestruição das hifas e, conseqüentemente, a

inibição do crescimento do patógeno (GEORGOPAPADAKOU, TKACZ, 1995). A

inibição da enzima sintase da quitina, responsável pelo metabolismo de quitina, por

exemplo, é uma estratégia de controle de vários fungos patogênicos (COLE,

HUNG, 2001). O entendimento do funcionamento do metabolismo do fitopatógeno

a partir dos dados moleculares poderá levar ao desenvolvimento de diversas

estratégias de controle da doença.

A sintase da quitina constitui-se essencialmente por folhas-β. É classificada

como uma enzima da família glicosiltransferase, sendo oficialmente denominada de

UDP-N-acetil-D-glicosamina: quitina 4-β-N-acetilglicosamina-transferase. Outras

demoninações também encontradas na literatura científica são: quitina-UDP-N-

acetilglicosaminatransferase, quitina-uridina difosfato acetilglicosaminatransferase

ou trans-N-acetilglicosaminasilase (DBGET, 2005).

Os antibióticos nucleosídios-peptídios, polioxina e nicomicina são inibidores

competitivos da sintase da quitina (GEORGOPAPADAKOU, TKACZ, 1995) e, ao

menos em sistemas animais, como mamíferos, não apresentam toxicidade,

representando um modelo potencial para o tratamento de infecções causadas por

fungos (ZHANG, MILLER, 1999). Quanto mais seletivo for o fármaco ou pesticida

para seu alvo, menos chance terá de interagir com diferentes alvos ou de causar

reações adversas indesejáveis (PATRICK, 2001), e, considerando que a quitina é

essencial para a constituição da parede celular do fungo, e está ausente em

17

plantas, é um potencial alvo antifúngico (GEORGOPAPADAKOU, TKACZ, 1995).

Por ser exclusiva do fungo no patossistema Moniliophthora perniciosa/Theobroma

cacao, a sintase da quitina constitui-se, portanto, em um alvo potencial para

compostos inibidores do desenvolvimento da parede celular deste fitopatógeno. A

construção de um modelo refinado e validado para posterior uso no

desenvolvimento de inibidores através da metodologia de docking, que consiste na

aplicação de metodologias computacionais para estudar a interação entre o

complexo proteína-ligante (TAUFER, 2004), é uma estratégia que pode ser usada

para encontrar um agente químico eficaz contra a vassoura-de-bruxa do cacaueiro.

Este trabalho teve como objetivos: (i) identificar e caracterizar, no M.

perniciosa, a seqüência primária do gene da sintase da quitina em DNA genômico,

e (ii) caracterizar a estrutura tridimensional da região filogeneticamente conservada

desta enzima, contendo o sítio catalítico, por modelagem comparativa.

18

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. O fungo Moniliophthora perniciosa

O fungo considerado o agente etiológico da doença do cacaueiro

(Theobroma cacao L.), popularmente conhecida, a vassoura-de-bruxa, foi

inicialmente descrito como Marasmius perniciosa Stahel. Após a revisão do gênero

Marasmius por Singer, a espécie foi transferida para o gênero Crinipellis sobre o

binômio C. perniciosa (Stahel) Singer (GRIFFITH, et al., 2003; PURDY, SCHMIDT,

1996), e, atualmente, como resultado de estudos de filogenia molecular de

representantes de Marasmiaceae, realizados por AIME, PHILLIPS–MORA (2005) é

validamente reconhecido como Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-

Mora.

A primeira descrição da doença vassoura-de-bruxa foi feita pelo naturalista

brasileiro Alexandre Rodrigues Ferreira, por volta de 1785, mas esta patologia

somente se tornou conhecida quando os sintomas de um surto ocorrido no

Suriname em 1895 foram descritos em 1904 por Went (GRIFFTH et al., 1994).

Trata-se de um Basidiomycota, Agaricales, com característicos filamentos

pseudoamilóides no píleo (SINGER, 1986). O M. perniciosa não é um parasita

exclusivo do cacaueiro, podendo ocorrer em outras Malvaceae, como T.

grandiflorum Schum. (cupuaçu) e T. speciousum Willd. (cacauí) (BASTOS, EVANS,

1985). Ocorre ainda, em representantes de outras famílias, como Bignoniaceae,

Bixaceae e Malpighiaceae que não são filogeneticamente próximos ao cacaueiro

(GRIFFITH, et al., 2003). Segundo a classificação de BASTOS (1988) apresenta-se

em quatro diferentes biótipos que se distinguem por seus grupos de hospedeiros, e

nos quais sintomas similares aos do cacaueiro infectado podem ser encontrados. O

biótipo C afeta T. cacao e espécies filogeneticamente próximas, como espécies do

gênero Theobroma (BASTOS, EVANS, 1985). Os biótipos S e B afetam,

respectivamente, plantas das famílias Solanaceae e a espécie Bixa orellana L.,

enquanto o biótipo L afeta plantas da família Bignoniaceae (principalmente

Arrabidaea verrucosa (Standl.) A. H. Gentry), mas não causa os sintomas da

doença no hospedeiro. O biótipo L é heterotálico (auto-estéril) e apresenta uma

distribuição geográfica restrita (GRIFFITH, HEDGER, 1994). Evidências culturais e

19

moleculares sugerem uma maior identidade entre os biótipos B e C enquanto que

perfis isoenzimáticos e o DNA mitocondrial diferenciam os biótipos S e C

(GRIFFTH et al., 1994). O biótipo C é tipicamente homotálico (auto-fértil) e

apresenta um ciclo de vida hemibiotrófico, no qual o fungo invade os tecidos

meristemáticos da planta hospedeira como um parasita biotrófico, mas

posteriormente cresce saprofiticamente sobre os tecidos mortos.

O M. perniciosa provavelmente se originou na bacia amazônica e é o único

patógeno do cacau que se desenvolve concomitantemente à planta (FIGURA 01).

Seu surgimento na Bahia em 1989 foi responsável por 95% de perda na produção

do cacau (PEREIRA et al., 1990; ISAAC et al. 1993), porém são conhecidas

algumas variedades resistentes à doença em seu habitat natural (PURDY,

SCHMIDT, 1996).

Figura 01: Aspecto da doença vassoura-de–bruxa nos botões florais (a) e nos frutos de cacau (b) causados pelo M. perniciosa (Fonte: AIME, PHILLIPS-MORA, 2005).

As estruturas capazes de infectar o cacaueiro em condições naturais são os

basidiósporos uninucleados, produzidos em lamelas na parte inferior do píleo do

basidioma onde os dois núcleos dos compartimentos hifais da hifa dicariótica da

camada do himênio migram para dentro do basídio onde ocorre a fusão nuclear

(LOPES, 2006). A penetração dos basidiósporos no hospedeiro se dá por meio de

estômatos e ferimentos nas bases de tricomas lesados (SREENIVASAN,

20

DABYDEEN, 1989). A infecção se inicia com o crescimento dos tubos germinativos

dos basidiósporos em tecidos meristemáticos da planta, como os brotos apicais, as

flores e os frutos (MUSE et al., 1996; ORCHARD et al., 1994). O patógeno causa

uma desordem fisiológica na planta, provavelmente alterando o seu balanço

hormonal, o que resulta na hipertrofia e hiperplasia das células dos tecidos

infectados. O brotamento de gemas laterais dos ramos é aumentado, dando o

aspecto de uma vassoura, na qual os ramos são visivelmente mais espessos que o

ramo original (LOPES, 2005 citando BAKER, CROWDY, 1943).

A liberação dos basidiósporos ocorre quando as condições ambientais são

de umidade próxima da saturação (>99% de umidade relativa) e a temperatura

entre 20 a 30 °C (ROCHA, WHELLER, 1985). São libera dos à noite e sua

dispersão se dá pela chuva e pelo vento. A altura em que os basidiósporos são

produzidos é importante no desenvolvimento da doença (COSTA, 1993). Na

superfície do solo as vassouras produzem poucos basidiomas e há uma menor

chance dos basidiósporos atingirem os órgãos suscetíveis. Já nas áreas mais

altas, a disseminação atinge maiores distâncias (ANDERBRHAN et al., 1993) de

modo que as principais fontes de inóculo são as vassouras localizadas na copa

(ANDEBRHAN et al., 1985; COSTA, 1993). É improvável que os basidiósporos se

dispersem por distâncias superiores a 60 km, pois são sensíveis as radiações UV-

B e podem perder sua capacidade de germinação devido à dessecação (FRIAS et

al., 1991; ANDEBRHAN et al., 1993).

Estes basidiósporos penetram no hospedeiro ao atingirem os tecidos

meristemáticos dos órgãos de plantas sadias e ocorre o desenvolvimento de hifas

espessas, não-fibuladas localizadas intercelularmente nos tecidos infectados que

caracterizam o micélio primário ou biotrófico. A dicariotização do micélio ocorre

após um período que varia de três a nove semanas, ocorrendo a formação de um

micélio secundário, com hifas mais delgadas (1-3 µm de diâmetro) e apresentando

fíbulas (ansas ou grampos de conexão), que invade as células do tecido

hospedeiro, levando à morte dos ramos. Esta é a fase saprofítica da doença

denominada “vassoura seca”. Duas hipóteses explicam a morte da vassoura: a

primeira, segundo Orchard et al. (1994), afirma que as células morreriam devido à

infecção primária, induzindo a dicariotização do fungo enquanto que na hipótese

formulada por Evans (1980), primeiro ocorreria a dicariotização, responsável pela

fase saprofítica e, posteriormente, a morte da vassoura. Da quarta a oitava

21

semanas após o início das chuvas, os basidiomas se desenvolvem do micélio

dicariótico dos tecidos necróticos, e produzem basidiósporos. As vassouras, agora

necróticas e de coloração amarronzada, podem permanecer presas à planta ou se

destacar e cair ao solo (ISAAC et al., 1993; PURDY, SCHMIDT, 1996). BAKER,

CROWDY (1943) citados por Lopes (2005) descrevem que em locais onde a

estação seca é bem definida, o fungo sobrevive de forma latente nas vassouras

secas e frutos mumificados até o início da estação chuvosa, quando ocorre, então,

novamente, a formação dos basidiomas (Figura 02).

Figura 02: Ciclo de vida do M. perniciosa. As partes em azul e laranja do ciclo correspondem às fases biotrófica e saprofítica, respectivamente. Em verde, está delimitada à parte do ciclo do fungo na sua interação com a planta do cacau, e em amarelo, está a parte do ciclo que ocorre fora do hospedeiro (Adaptado de LOPES, 2005).

22

2.2. Parede Celular

A parede celular é uma estrutura externa a membrana plasmática da qual

depende a vida da hifa ou célula fúngica. É um arcabouço que sustenta a célula do

fungo e ao mesmo tempo interage com o ambiente. Sua integridade é essencial à

sobrevivência de suas hifas em ambientes hostis, e está presente nas hifas (fungos

filamentosos) ou células (leveduras) dos diferentes grupos fúngicos (RONCERO,

2002). É ela que protege a célula fúngica contra variações osmóticas, químicas e

biológicas, e está envolvida em várias outras funções incluindo morfogênese,

expressão antigênica, adesão e interação célula-célula, e ainda desempenha papel

fundamental no crescimento, desenvolvimento e interações dos fungos com o

ambiente e com outras células (WESSELS, 1993). É uma estrutura onde a

arquitetura e composição é regulada de forma coordenada com o crescimento da

célula (CABIB, SBURLATI, 1989), tendo polissacarídeos e glicoproteínas como

seus principais componentes (KOLLÁR et al., 1997). É altamente dinâmica e está

sujeita às constantes mudanças, como, por exemplo, durante a expansão e divisão

celular nas leveduras, e durante a germinação de esporos e formação de septos e

crescimento apical de hifas em fungos filamentosos (ADAMS, 2004).

Pesquisas de genômica e proteômica têm demonstrado que em ascomicetos

há incorporação altamente controlada de um grande número de diferentes

proteínas em suas paredes. A composição destas proteínas de parede celular pode

variar dependendo da fase do ciclo celular em que se encontram, condições

ambientais e o estádio de desenvolvimento (DE GROOT, et al., 2005). Na levedura

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, a parede contém áreas

representativas onde os quatro maiores componentes, quitina, β-(1,3)-D-glicano

(Figura 03), β-(1,6)-D-glicano e manoproteínas, encontram-se ligados. A

descoberta da existência dessas ligações covalentes entre estes diferentes

constituintes confirma que os polissacarídeos têm uma função estrutural,

conferindo a forma e a alta resistência da parede celular dos fungos (KOLLÁR et

al., 1997) (Figura 04).

Segundo Cabib et al. (2001), em leveduras, o β-(1,3)-D-glicano é o maior

componente estrutural da parede celular, β-(1,6)-D-glicano está relativamente em

menor quantidade, mas é muito importante para a formação de ligações cruzadas.

23

As manoproteínas formam uma camada localizada na superfície externa, e agem

como um filtro para moléculas de grande peso. O polissacarídeo quitina é o que

está presente em menor quantidade (1-3%), estando concentrado na região do

septo, embora possa estar disperso através da parede. Ainda que esteja em menor

quantidade, a quitina é essencial para a sobrevivência das leveduras,

provavelmente devido ao seu papel central na formação do septo.

Alguns autores consideram que a quitina é derivada da celulose, pois ambos

os polímeros compartilham grande similaridade em estruturas moleculares e na

função (MERZENDORFER, 2006). A quitina é um polímero linear de N-acetil-

glicosamina cristalino, cuja resistência se deve às ligações hidrogênio ao longo da

cadeia enquanto está sendo formada (RONCERO, 2002).

Análises de difração de raio-X mostram que a quitina é polimórfica,

ocorrendo em três formas cristalinas, quitina-α, quitina-β e quitina-γ, que diferem

principalmente no grau de hidratação, tamanho e números de cadeias de quitina na

unidade celular. Na forma-α todas as cadeias têm orientação antiparalela. A

quitina-β exibe um arranjo paralelo, enquanto que a forma-γ alterna duas cadeias

antiparalelas com uma paralela (MERZENDORFER, 2006).

A importância da quitina para a arquitetura da parede celular é bem

documentada, tendo sido descrito várias décadas atrás que a inibição da sintase

da quitina produz a morte celular. Em nível celular, a quitina é o resultado da

atividade da enzima sintase da quitina (CS), descrita nos anos 50 por GLASER e

BROWN (1957), enquanto que o gene correspondente só foi determinado em 1986

(CABIB, 1986). Recentemente a presença do gene codificador de CS foi reportada

para outros grupos como insetos, bactéria, protozoários e vertebrados. O gene que

codifica a sintase da quitina é chamado de chs (RONCERO, 2002).

Segundo Wessels (1993), em Schizophyllum commune Fr., durante o

crescimento da parede celular, novos polímeros de quitina e β-1,3-glicano são

adicionados à parede em formação, interagindo para formar microfibrilas de quitina

e hélices triplas de β-glicano. Em seguida, ligações covalentes entre esses

polímeros são formadas e ocorrem ramificações. Novos polímeros são então

lançados na região apical, mantendo a espessura da parede e determinando a

morfogênese. A parede formada vai se consolidando à medida que ocorre o

crescimento da hifa.

24

Figura 03: Polimerização da UDP-GlcNAc pela sintase da quitina para formar a quitina (Fonte: YEAGER, FINNEY, 2004).

Figura 04: Representação da parede celular de A. fumigatus Fresen, com destaque para a biossíntese de α-1-3-glicano e quitina que são sintetizados por diferentes famílias de genes com diferentes funções, entre eles está a sintase da quitina (Fonte: BEAUVAIS, 2003).

GPI Proteína Ancora

ββββ-1,3-glicano

Polissacarídeos anamorfos

Quitina Proteínas (antígenos)

Enzimas Transmembrana

(Sintase da quitina)

Quitina

UDP Sintase da

Quitina

UDP-GlcNAc

25

A parede celular do fungo foi utilizada como o primeiro alvo para o

desenvolvimento de agentes antifúngicos, assim como para a classificação

taxonômica (RONCERO, 2002). Atualmente, embora esta classificação não seja

muito utilizada, ainda reflete a maior diferença entre os grupos fúngicos. Células

fúngicas destituídas de parede celular só podem sobreviver em condições de

laboratório, onde o suporte osmótico previne a sua lise (RONCERO, 2002). A

seleção da parede celular como alvo na busca de uma defesa efetiva justifica-se

por ela ser essencial aos fungos, uma vez que não está presente em vertebrados e

plantas, de modo que as rotas biossintéticas das moléculas que compõem a

parede são importantes alvos para o desenvolvimento de agentes inibidores do

crescimento destes patógenos (GEORGOPAPADAKOUS, TKACZ, 1995;

RONCERO, 2002).

2.3. A sintase da quitina

A sintase da quitina (E.C. 2.4.1.16) é uma enzima que desempenha

importantes funções na diferenciação e morfogênese de fungos filamentosos, como

o M. perniciosa, que possuem a quitina como principal componente estrutural de

sua parede celular (RUIZ-HERRERA et al., 2002). Para a sua atividade, essa

enzima utiliza um cátion bivalente (Mn+2 ou Mg+2) (MERZENDORFER, 2006) e o

nucleotídeo UDP-GlcNAc, como doador de açúcar. A sintase da quitina pertence à

família multigênica das glicosiltransferases (MÜLLER, et al., 2002). Com base na

similaridade da seqüência, a sintase da quitina pertence à família 2 (GTF2), que

contém seqüências de fungos, bactérias, plantas e animais. Análises filogenéticas

indicam que as enzimas da GTF2 derivam de um ancestral comum

(MERZENDORFER, 2006). As glicosiltransferases desta família, segundo

Campbell et al., (1997), têm seu mecanismo catalítico nos resíduos de Asp e Glu

das cadeias laterais, pois estes apresentam reatividade apropriada para agir como

aceptor da ativação.

A enzima sintase da quitina diferencia-se em cinco classes distintas, as

quais apresentam variados níveis de expressão, a depender do estádio de seu

ciclo de vida e sua localização. A classe III é muito importante no desenvolvimento

dos fungos, pois atua na formação da parede celular, sendo responsável pela

26

síntese de 90% de toda a quitina da célula. Este metabólito é sintetizado em

eucariotos por uma seqüência de cinco reações sucessivas: (i) conversão de Fru-6-

P em GlcN-6-P por glutamina-Fru-6-P amidotransferase (E.C. 2.6.1.16), (ii)

acetilação de GlcN-6-P gerando GlcNAc-6-P por GlcN-fosfato acetiltransferase

(E.C. 2.3.1.4), (iii) interconversão de GlcNAc-6-P em GlcNAc-1-P por N-

acetilglicosamina fosfato mutase (E.C. 5.4.2.3), (iv) uridinação de GlcNAc-1-P por

UDP- GlcNAc pirofosforilase (E.C. 2.7.7.23) e (v) conversão de UDP-GlcNAc no

polímero quitina pela sintase da quitina (E.C. 2.1.4.16) (MIO et al., 1998,

LAGORCE et al., 2002) (Figura 05).

O consenso QRRRW é considerado uma assinatura da sintase da quitina,

por estar presente em todas elas. Os aminoácidos deste motif têm sido apontados

como o local direcionado à metagênese em leveduras, sendo essenciais para a

atividade da enzima. Outras regiões conservadas podem ter importante papel na

catálise (S/TWGTKG) ou no processo de transporte do polímero através da

membrana (S/TWGT(K/R)) (MERZENDORFER, 2006).

Atualmente, mais de 1500 genes Chs estão total ou parcialmente

seqüenciados (NCBI, Acesso: 05.Jul.2007), embora poucos tenham sido

caracterizados funcionalmente (RONCERO, 2002). Muitos desses genes,

codificadores de sintase da quitina de diferentes eucariotos, incluindo fungos, vêm

sendo clonados e caracterizados (SREENIVASAPRASAD et al., 2000), tornando

esta enzima um alvo bastante atraente para o desenvolvimento de pesticidas e

inibidores de sua atuação. Estudos da complexidade genética da sintase da quitina

realizados por Roncero (2002), revelaram que os genes chs de insetos e

nematódeos se agrupam com os das classes IV e V, o que sugere uma origem

evolutiva comum para todos os chs. Além disso, o gene nodC de Sinorhizobium

meliloti (Dangeard) De Lajudie também apresenta significativa similaridade com o

gene chs. Com isso é possível propor que a origem do gene chs é muito antiga, e

que ele divergiu de um gene já presente nos ancestrais das bactérias atuais. Em S.

cerevisiae, o gene chs1 provavelmente codifica a maioria da CS in vitro, mas in

vivo isto não foi comprovado. Foi demonstrado que a CS-I está envolvida na

citocinese, ou seja, na divisão celular, sendo responsável pelo reparo da quitina

após a divisão celular. Esta atividade se opõe ao papel da quitinase neste

processo. O chs2 codifica a sintase da quitina que está envolvida na formação do

disco de quitina que separa fisicamente a célula-mãe da célula-filha e constitui o

27

septo primário. Essa atividade é essencial para o crescimento em certas condições

e o homólogo chs1, de Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, demonstrou ser

essencial para a sobrevivência deste organismo. Scchs3 codifica a CS responsável

por mais de 90% da quitina celular. A maior parte está localizada no anel que forma

o broto embora uma parte menor esteja distribuída uniformemente pela parede

celular. Os fungos filamentosos têm a família CS1 diretamente envolvida na

manutenção da integridade da parede celular, enquanto que a família II está

envolvida na formação da quitina (RONCERO, 2002).

Figura 05: Rota metabólica da sintase da quitina na síntese da parede celular. (1) Glutamina-frutose-6-fosfato amidotransferase (EC 2.6.1.16); (2) Glicosamina fosfato N-acetiltransferase (EC 2.3.1.4); (3) fosfo-N-acetilglicosamina mutase (EC 5.4.2.3); (4) UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (EC 2.7.7.23) e (5) Sintase da quitina (EC 2.4.1.16) (Fonte: LAGORCE et al., 2002; HOGENKAMP, 2006).

Glicose

Glicose-6-P Glicolise Carboidrato de reserva

Glicogênio/Trealose

Frutose-6-P + Glutamina Glicosamina-6-P + Glutamato

CoASH

Acetil-ASH

N-acetil-glicosamina-6-P

N-acetil-glicosamina-1-P

UDP-N-acetil-glicosamina-6-P

PPi

UTP

Quitina + UDP Parede Celular

Quitina (β-1,4-poli-n-acetil-D-glicosamina)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

28

Células de leveduras com vários defeitos, incluindo mutações em alguns

genes mostram significativo aumento na sintase da quitina, acompanhado por um

aumento na síntese de várias proteínas de parede celular. Esses dados sugerem

que estas células reagem contra os danos da parede celular pela ativação de um

mecanismo compensatório que garante a sua estabilidade (GARCÍA-RODRIGUEZ,

et al., 2000). Devido à integridade estrutural que a quitina provê a parede celular a

sintase da quitina tem sido um excelente alvo para agentes anti-fúngicos

(BOWMAN, FREE, 2006).

2.4. Determinação e caracterização de gene por primer walking

Para seqüênciar um genoma com razoável velocidade, baixo custo (RAJA,

et al., 1997) e confiabilidade, a estratégia empregada é um fator a ser considerado.

Algumas das técnicas propostas são shotgun e primer walking. O shotgun é

utilizado em projetos genomas de larga escala, mas a alta redundância de

seqüências e grandes esforços para fechar intervalos (gaps) podem criar custos e

problemas no processo de montagem dos contigs (HATTORI, et al., 1997). A

estratégia de primer walking minimiza estes problemas, sendo feita com um

mínimo de redundância (RAJA, et al., 1997), embora seja lenta e exija o desenho e

a síntese de um variado número de oligonucleotídeos iniciadores ou primers

(HATTORI, 1997).

A metodologia de primer walking utiliza primers que se ligam em uma porção

conhecida do DNA em estudo para determinar uma região adjacente, onde a

informação da seqüência obtida será usada para o desenho de um novo primer

que, por sua vez, possa seqüênciar uma porção além daquela conhecida. Pela

repetição deste procedimento obtém-se uma extensão da seqüência desejada

(AZHIKINA, et al., 1993). Esta técnica pode ser usada para “caminhar” ao longo da

seqüência de DNA ou para buscar seqüências de nucleotídeos que devem ser

desenhadas (PARKER, et al., 1991).

29

2.5. A busca pelo controle da doença

Em 1957 foi criado pelo Governo Federal a "Comissão Executiva do Plano

da Lavoura Cacaueira" (CEPLAC) para auxiliar os produtores de cacau no manejo

das culturas. Porém, desde que a doença começou a dizimar as culturas de cacau

na Bahia, um dos principais objetivos da CEPLAC tornou-se o estudo e

desenvolvimento de técnicas para controlar a doença. Diferentes formas de

controle vêm sendo empregadas contra a vassoura-de-bruxa, inclusive controle

químico, podas fitossanitárias e seleção de clones resistentes. A eliminação de

todos os tecidos infectados tem sido a principal medida de controle para reduzir a

fonte de inóculo e os danos causados por M. perniciosa.

O controle adequado da vassoura-de-bruxa depende da remoção das partes

infectadas (BASTOS, 2000; RUDGARD, 1987; WHEELER, 1985) que consiste na

remoção de grupos de vassouras infectadas (nas quais os basidiomas são

formados antes da estação chuvosa), aplicação de fungicidas químicos e seleção

de hospedeiros resistentes. Esta última medida tem sido a melhor opção para os

cultivares da Bahia, e cultivares resistentes à doença vêm sendo selecionados a

partir de germoplasmas selvagens. Este método de controle é preferido por seu

baixo custo e por ser de mais fácil manejo do que a poda das partes infectadas,

pois, para ser efetivo, a remoção das fontes de inóculo deve ser feita por todos os

fazendeiros de uma determinada área (GRIFFITH et al., 2003). Estas estratégias

aliadas à aplicação de fungicidas, no entanto, não foram suficientes para reduzir a

disseminação do patógeno (ANDEBRHAN et al., 1995), já que o nível de infecção

da planta determina a eficiência e o custo dessa prática (BASTOS, 1996a). A poda,

por exemplo, só é efetiva quando realizada regularmente ou de forma intensiva.

Embora esta seja eficaz em reduzir as fontes do inóculo, as infecções observadas

em áreas onde foi realizado esse tipo de controle são provenientes das fontes não

removidas ou daquelas localizadas em outras áreas (ANDEBRHAN, 1985).

Portanto, o controle da doença se torna difícil se a poda não for generalizada,

sendo necessária à aplicação de fungicidas para minimizar as perdas

(ANDEBRHAN; BASTOS, 1980).

Fungicidas para o controle químico da vassoura-de-bruxa, como o tebuconazol,

por exemplo, não são suficientes, pois eles não protegem os tecidos em

crescimento ativo, necessitando inúmeras pulverizações. Fungicidas sistêmicos

30

poderiam restringir o número de aplicações necessárias, no entanto, a maioria

avaliada tem demonstrado eficiência somente em testes in vitro, não apresentando

o mesmo comportamento em campo (TOVAR, 1991). Diferentes compostos

químicos têm sido testados na tentativa de prevenir ou erradicar a vassoura-de-

bruxa, porém os resultados não são satisfatórios (MCQUILKEN et al., 1998;

SOBERANIS et al., 1999), pois o rápido crescimento da superfície dos frutos

durante os dois ou três meses de desenvolvimento faz com que o fungicida tenha

de ser aplicado freqüentemente, e isto é especialmente difícil em árvores altas

(SOBERANIS et al., 2000). Como alternativa, tem sido utilizado o controle

biológico, que envolve antagonistas capazes de suprimir a formação ou destruir os

basidiomas de M. perniciosa em vassouras secas. Algumas espécies de

Trichoderma sp. revelaram-se promissoras, não só no controle de fitopatógenos

habitantes do solo (PAPAVIZAS, 1985) como também no controle daqueles que

colonizam as partes aéreas de plantas (ELAD et al., 1993). BASTOS (1996a)

demonstrou a eficiência de T. viridae Pers. no controle de M. perniciosa, com

redução da incidência de frutos infectados, em comparação com os tratamentos

por poda fitossanitária. Foi observada perda da viabilidade do micélio após o

tratamento de culturas e de vassouras secas de cacau com suspensão de conídios

de T. viridae, o qual parasita as hifas do M. perniciosa (BASTOS, 1996b).

A elaboração de novas estratégias de controle através de estudos

moleculares é uma das alternativas mais promissoras para o manejo da vassoura-

de-bruxa. Estudos moleculares do M. perniciosa e sua interação com o T. cacao

têm sido alvos de muitos projetos de pesquisas que visam elucidar a biologia do

fungo e seus diferentes mecanismos de defesa. A partir do seqüenciamento do

gDNA e do cDNAs das fases de desenvolvimento do fungo em sistema artificial e

da interação Theobroma/Moniliophthora, importantes descobertas têm sido feitas,

as quais têm contribuído para elaboração de uma estratégia eficiente no controle

(SANTOS, 2005).

Assim, o presente trabalho representa uma das etapas de um projeto

proteômico que busca contribuir para o controle da doença vassoura-de-bruxa,

tendo como ênfase encontrar um alvo molecular para que seja desenvolvido novos

agentes químicos. A contribuição deste trabalho somado com outros da rede de

genômica do estado da Bahia, poderá contribuir para a reversão do atual quadro

sócio-econômico ligado à produção de cacau, e fazer com que o Brasil possa voltar

31

a ter uma das melhores, senão a melhor, posição entre os produtores da matéria

prima do chocolate no mercado internacional.

3. MÉTODOS EM BIOLOGIA COMPUTACIONAL

Os projetos genomas possuem como principal desafio o conhecimento da

estrutura de novos alvos moleculares, principalmente proteínas e enzimas. A

compreensão molecular de estruturas terá um papel cada vez mais significativo

nos avanços de diagnósticos e tratamentos de doenças (SANTOS-FILHO,

ALENCASTRO, 2003). Os projetos proteômicos possuem como objetivo estudar a

função bioquímica de uma proteína, a qual pode ser definida por suas interações

com outras moléculas, sendo a função biológica conseqüência dessas interações.

Desta forma, a função de uma proteína é geralmente determinada por sua

estrutura tridimensional, que esclarece o mecanismo enzimático e a interação com

inibidores, mensageiros, receptores e transportadores. Por esta razão, é útil

conhecer a estrutura 3D das milhares de seqüências de proteínas que surgem

destes diversos projetos (SÁNCHEZ, ŠALI, 1998; KUNDROTAS, ALEXOV, 2006).

Métodos experimentais para a determinação da estrutura da proteína nem

sempre são bem sucedidos (SÁNCHEZ, ŠALI, 1998). Como exemplo, temos que

proteínas da membrana celular raramente cristalizam, e também dificilmente

podem ser tratadas de modo satisfatório por Ressonância Magnética Nuclear

(RMN) (SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003). Em 1971 foi estabelecido o

Protein Data Bank (PDB), pelo Brookhaven National Laboratories, para arquivar as

estruturas cristalinas de macromoléculas biológicas, sendo iniciado com apenas

sete estruturas. Na década de 80 o número de deposições começou a crescer

devido a implementos na tecnologia de processos cristalográficos e métodos de

RMN. Grandes progressos vêm sendo realizados no campo de estruturas

experimentais por cristalografia de raio-X e RMN, mas ainda consomem bastante

tempo sem a garantia de sucesso (BERMAN et al., 2000). Assim, o número de

proteínas estruturalmente caracterizadas (43.823 estruturas depositadas no PDB,

até 07 de junho de 2007) é baixo em comparação com o número de proteínas com

32

seqüência conhecida (264.492 depositadas no banco de dados SWISS-PROT)

(SCHWEDE, et al., 2003; SWISS-PROT 2007).

Com o objetivo de superar as limitações experimentais, métodos

computacionais foram desenvolvidos com base nos conceitos da Biologia e

Química, os quais destacam-se os métodos ab initio, enovelamento (threading), e

modelagem comparativa. Os métodos de predição ab initio concentram-se na

construção de uma estrutura sem uma informação prévia. Estes métodos possuem

pequenas bibliotecas de segmentos a partir dos quais as estruturas podem ser

construídas, e também assumem que a estrutura nativa corresponde ao mínimo

global de energia livre durante o tempo de vida da proteína. Assim o espaço

estrutural a ser buscado no modelo é restrito. Desta forma, este procura encontrar

uma região de mínimo através da exploração de várias conformações protéicas

possíveis de existir. Ferramentas para a modelagem por este método estão

disponíveis on line em http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/i-

sites/Isites/download.html e http://www.bioinfo.rpi.edu/~bystrc/hmmstr/server.php.

No entanto, pouco é compreendido sobre o enovelamento de proteínas, o que

torna esta metodologia ainda insipiente (HOLM, SANDER, 1998; YUAN,

BYSTROFF, 2005).

A metodologia de enovelamento (threading) é recomendada quando a

similaridade é pequena entre uma dada seqüência problema com as disponíveis no

PDB, ou quando, embora haja a mesma topologia, ocorram diferenças estruturais

na região não conservada, ou mesmo no tamanho das seqüências (PANCHENKO

et al., 2000). Diferente do método ab initio, em que todas as conformações

possíveis são exploradas, nesta metodologia o espaço de pesquisa limita-se a

conformação de estruturas conhecidas, podendo falhar para qualquer proteína com

uma seqüência completamente nova (BRYANT, 1996). Vários exemplos destes

métodos podem ser encontrados no site do Expert Protein Analysis System –

ExPASy oferecido pelo Swiss Institute of Bioinformatics (http://ca.expasy.org/).

Quanto à modelagem por homologia, esta se baseia no fato de que proteínas

que estão correlacionadas evolutivamente, a partir de um ancestral comum,

possuem função e estrutura semelhante, e por isso são ditas como proteínas

homólogas entre si. Em outras palavras, a seqüência é menos conservada do que

a estrutura. No entanto, o sucesso desta metodologia depende do quanto a

seqüência entre as proteínas são similares entre si. A modelagem por homologia é

33

a ferramenta de predição melhor sucedida (SANTOS-FILHO, ALENCASTRO,

2003). Esta consiste em estudar a geometria e a propriedade das moléculas com

técnicas computacionais, contribuindo para elucidar as interações intra e

intermoleculares, mecanismos de reações químicas, estrutura e função de

proteínas difíceis de serem purificadas em grande escala (FIGUEIREDO et al.,

2005). A modelagem por homologia utiliza-se de dados cristalográficos conhecidos

para determinar a estrutura de uma proteína não conhecida (FIGUEIREDO et al.,

2005) baseando-se na semelhança estrutural e funcional, uma vez que as

proteínas homólogas apresentam regiões internas conservadas, enquanto que

suas principais diferenças estruturais estão nas regiões externas (SANTOS-FILHO,

ALENCASTRO, 2003).

Para realizar a modelagem por homologia costuma-se seguir uma rotina como:

(i) localizar a estrutura de uma proteína conhecida; (ii) produzir o melhor

alinhamento global possível entre a seqüência desconhecida (seqüência problema)

e o modelo; (iii) construir um modelo do arcabouço da proteína, tendo o arcabouço

da estrutura como modelo referência; (iv) nas regiões onde há lacunas (alvo ou

molde), realizar a modelagem de alças para substituir os segmentos de extensão

apropriada; (v) acrescentar cadeias laterais ao arcabouço do modelo; (vi) otimizar

as posições das cadeias laterais e (vii) refinar a geometria obtida (GIBAS,

JAMBECK, 2001) e finalmente, (viii) validar o modelo construído (GOLDSMITH-

FISCHMAN, HONIG, 2003; SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003; PATNY, et al.,

2006).

Os moldes para a modelagem podem ser encontrados através de métodos de

comparação de seqüências, tais como PSI-BLAST, ou baseados em métodos de

threading seqüência-estrutura que podem ocasionalmente revelar relações mais

distantes do que as puramente baseadas em seqüências (BAKER, ŠALI, 2001).

Programas como o Swiss Model, um servidor de modelagem por homologia

desenvolvido pelo Swiss Institute of Bioinformatics (SIB -

http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html), auxiliam na construção do

modelo, utilizando o programa Swiss PDB Viewer, que se trata de um ambiente

gráfico interativo que analisa a proteína e a estrutura do ácido nucléico e,

combinados com o servidor automatizado retornam a estrutura da nova proteína

modelada (GUEX, et al., 2001).

34

Embora existam três distintas metodologias disponíveis para a geração de

estruturas 3D de proteínas, a confiabilidade dos métodos ab initio e threading é

muito pequena para problemas que requerem boa qualidade de informação

estrutural como, por exemplo, o design de fármacos baseado na estrutura do alvo.

Por outro lado, a modelagem por homologia é melhor sucedida em relação às

demais. No entanto, esta somente fornece modelos razoáveis quando o grau de

homologia entre as proteínas molde e alvo está entre 25-30% ou superior. Esta

conclusão é baseada pela competição existente na área denominada de “Critical

Assessment of techniques for protein Structure Prediction (CASP)”, a qual avalia as

diferentes metodologias existentes para a predição de estruturas. (GIBAS,

JAMBECK, 2001; HOLTJE et al., 2001)

3.1. Química Computacional

Como existe uma necessidade de se entender o comportamento de

biomacromoléculas, modelos teóricos são criados usando a Química

Computacional como ferramenta. A química computacional simula estruturas e

reações químicas numericamente, através de modelos matemáticos baseados em

parte ou completamente nas leis fundamentais da física. Estes modelos permitem o

estudo de fenômenos químicos por meio de cálculos realizados em computador

antes de examinar estes fenômenos experimentalmente. Pode-se, portanto,

“construir fenômenos” que sequer existem naturalmente, mudando a concepção

filosófica de que o processo de fazer ciência está relacionado ao estudo de

fenômenos dados pela natureza. Além da modelagem de moléculas estáveis,

alguns métodos podem ser usados também na modelagem de intermediários de

reação instáveis e mesmo estados de transição, fornecendo informações sobre

moléculas e reações químicas impossíveis de serem obtidas através da

observação. Portanto, a química computacional é tanto uma área de pesquisa

independente quanto um importante complemento a estudos experimentais

(FORESMAN, FRISCH, 1996).

Existem várias metodologias dentro da Química Computacional, que são

utilizadas a depender do fenômeno físico-químico e dos recursos computacionais

disponíveis. Em se tratando de biomacromoléculas, utilizam-se os métodos

35

híbridos quantum-mechanical/molecular mechanical (QM/MM), e de mecânica

molecular (MM).

A metodologia QM/MM foi descrita pela primeira vez por Warshel e Levitt

(1976). Estes métodos envolvem o tratamento de uma pequena região do sistema

onde requer um formalismo mecânico-quântico (QM), por exemplo, onde requer

quebra e formação de ligação, e trata a região remanescente da proteína e do

solvente com um método de mecânica molecular, a qual possui menor custo

computacional (WARSHEL, LEVITT, 1976). Esta metodologia híbrida tem sido

desenvolvida devido ao alto custo computacional requerida pelos métodos QM

quando aplicados a grandes sistemas (MONARD, MERZ, 1999). Neste trabalho,

será dada ênfase aos métodos de mecânica molécula, uma vez que os métodos

híbridos não foram utilizados por não se aplicarem ao problema em questão.

Os métodos de MM usam as leis da mecânica clássica para prever a energia

associada a uma dada conformação (estrutura) e propriedades moleculares. O

modelo considera os átomos como esferas de raios característicos e as ligações

como molas com diferentes elasticidades. A matemática relacionada à deformação

de molas pode ser usada para descrever os movimentos (estiramentos,

deformações e torções) e para calcular a energia potencial associada a eles

(Figura 06) de modo a predizer a energia total associada a uma dada conformação

molecular (FORESMAN, FRISCH, 1996).

Figura 06: Movimentos atômicos de estiramento de ligação, de deformação angular, de torção e interação entre átomos não ligados.

36

A energia total da molécula, Etotal, é calculada pelo somatório de um conjunto

de equações que descrevem as características atômicas.

E total = Er + Eθθθθ + Eφφφφ + Enl + ....

Onde Er é a energia associada a uma ligação que está sendo estirada ou comprimida em

relação ao seu comprimento de ligação natural. De modo similar, o mesmo formalismo

matemático é aplicado em relação aos ângulos de ligação, ângulos torsionais e a energia

relacionada às interações entre átomos não ligados, Eθ, Eφ e Enl, respectivamente. Outros

parâmetros físico-químicos também podem se adicionados à equação levando a cálculos

mais apurados.

Todas estas funções de energia potencial requerem dados (parâmetros)

para descrever os diferentes tipos de átomos e ligações, obtidos

experimentalmente ou através de cálculos ab initio1, e juntamente com os termos

da equação, definem o que é denominado de campo de força. As equações usadas

são relativamente simples e são desenvolvidas para uma determinada classe de

compostos. Existem diferentes tipos de campos de forças que se diferenciam de

acordo com a forma matemática dos termos de energia e caracterizam os

diferentes métodos de mecânica molecular. Dependendo dos objetivos de estudo,

outros componentes de energia podem ser incluídos (FORESMAN, FRISCH,

1996).

Os métodos de mecânica molecular não consideram explicitamente os

elétrons em um sistema molecular (baseiam-se em interações entre núcleos),

embora os efeitos eletrônicos estejam implicitamente incluídos nos campos de

força através da parametrização.

Esta aproximação torna os cálculos de mecânica molecular

computacionalmente rápidos, permitindo seu uso em sistemas muito grandes

contendo até milhares de átomos. Entretanto, estes métodos possuem várias

limitações, entre as mais importantes destacam-se:

1 Método ab initio em Química Teórica refere-se aos métodos baseados em aproximações da equação de Schrödinger, a qual fornece a energia do sistema além de outras propriedades moleculares.

37

a) Cada campo de força permite que se alcance bons resultados somente

para uma classe limitada de moléculas relacionadas com aquelas as quais o

campo de força foi parametrizado;

b) Como não levam em consideração os elétrons, estes métodos não podem

ser aplicados em problemas químicos onde os efeitos eletrônicos são

predominantes como, por exemplo, em processos que envolvam formação

ou quebra de ligações (FORESMAN, FRISCH, 1996; BYSTROFF, et al.,

2004; YUAN, BYSTROFF, 2005; BYSTROFF, SHAO, 2002);

c) Propriedades moleculares que dependem de detalhes da estrutura

eletrônica também não são reprodutíveis pelos métodos de mecânica

molecular (FORESMAN, FRISCH, 1996).

Cálculos de mecânica molecular são preferencialmente usados no estudo de

moléculas grandes, tais como proteínas, enzimas, polímeros, DNA, etc. como, por

exemplo, em problemas que envolvam o reconhecimento molecular, processo

fundamental dos sistemas bioquímicos e importante ponto de partida para a

descoberta de novos fármacos (PATRICK, 2001). O modelo geral de interações

fármaco-receptor molecular é equivalente ao modelo chave-fechadura das

interações enzima-substrato. O alvo molecular ideal para um fármaco seria a de

uma molécula cuja superfície fosse exatamente complementar a superfície do

fármaco, em termos de forma, carga e energia potencial eletrostática. Esta

metodologia é denominada de docking (BYSTROFF, SHAO, 2002), que é o estudo

da interação ligante-enzima por métodos de mecânica molecular (MM) ou através

de métodos híbridos, a qual fornece informações da interação entre o fármaco e o

seu alvo biológico. De posse destas informações pode-se estudar as interações

intermoleculares entre o ligante e a enzima-alvo, podendo, em uma etapa posterior,

propor modificações do composto protótipo2 (BARREIRO, FRAGA, 2001;

BYSTROFF, SHAO, 2002).

Existem vários métodos de MM (campos de força) os quais diferem-se pela

natureza das equações, assim como detalhes de suas parametrizações. Como

exemplos de campos de força pode-se citar: SYBYL, MMX, MM3, ff94, ff99

2 Composto orgânico com desejável atividade biológica. Esta atividade normalmente é otimizada por diferentes métodos utilizados pela Química Medicinal, incluindo docking.

38

(Amber), UFF, CVFF, CHARMM, GROMOS dentre outros (FORESMAN, FRISCH,

1996).

Ambos os métodos descritos anteriormente calculam a energia de uma

estrutura molecular particular (arranjo espacial de átomos ou núcleos e elétrons),

propriedades relacionadas à energia, e também executam a otimização da

geometria, localizando a estrutura de menor energia próxima da estrutura de

partida especificada. A otimização da geometria depende, primariamente, do

gradiente da energia - a derivada primeira da energia em relação às posições

atômicas (Figura 07), gerando assim a superfície de energia potencial (SEP)

(FORESMAN, FRISCH, 1996).

Figura 07: Superfície de Energia Potencial.

3.2. Emprego da química computacional na modelagem comparativa

Proteínas obtidas, tanto por modelagem comparativa como por cristalografia,

necessitam de refinamento (HOLTJE, et al., 2003). Durante a geração de modelos

de proteínas os loops e as conformações da cadeia lateral, em geral, são criados

aleatoriamente. Conseqüentemente, as conformações não correspondem a

estruturas energeticamente razoáveis. Adicionalmente, estruturas cristalinas

também precisam ser refinadas para remover comprimentos de ligação muito

39

extensos e interações atômicas não favoráveis (átomos muito próximos entre si).

Em ambos os casos, esta desordem na posição dos átomos leva a formação de

forças que resultam em movimentos distantes da estrutura original quando o

processo de minimização se inicia. A metodologia geral para se eliminar esta

condição consiste em “relaxar” o modelo de forma gradativa. Assim, os métodos de

MM utilizam algorítmos para otimizar a geometria encontrando confórmero de

menor energia na SPE. Os algorítmos aplicados para a otimização de geometria

normalmente encontram regiões de mínimo nas SEP próximo as coordenas inicias

(geometria de partida). Dentre os métodos de minimização de energia mais

freqüentemente utilizados estão o Steepest Descent e Gradiente Conjugado,

ambos utilizam técnicas que calculam a primeira derivada da energia (LIPKOWITZ,

BOYD, 1990).

O algorítmo de Steepest Descent calcula a energia da geometria inicial, e

segue aplicando um pequeno movimento nos átomos, conforme parametrizado

pelo campo de força que está sendo utilizado, gerando assim uma nova geometria.

Desta forma, este processo é então repetido sempre buscando uma região de

mínimo na superfície potencial. O processo total somente pára quando condições

pré-estabelecidas, como valores de energia ou número de interações, são

alcançadas. Como este método é lento, próximo às regiões de mínimo, é mais

comumente utilizado somente para gerar uma geometria mais adequada para um

outro algorítmo de minimização de energia mais sofisticado, como o Gradiente

Conjugado (LIPKOWITZ, BOYD, 1990).

O Gradiente Conjugado acumula a informação da função de uma interação

anterior, calculando um novo vetor em direção à região de mínimo, gerando uma

nova estrutura que será continuamente refinada. O custo computacional deste

método é maior do que Steepest Descent. No entanto, isso é compensado pela sua

eficiente convergência para a região de mínimo (LIPKOWITZ, BOYD, 1990). Dessa

forma, para estruturas longe do mínimo são utilizados algorítmos como Steepest

Descent para as 10-100 primeiras interações, e a seguir, o processo de

refinamento é concluído com o método de Gradiente Conjugado ou um método que

utiliza a segunda-derivada, como por exemplo, Newton-Raphson (HÖLTJE, et al.,

2003).

Se o modelo gerado é baseado somente em técnicas de modelagem

comparativa, os loops e as cadeias laterais necessitam de um refinamento mais

40

apurado. Isto se deve ao fato que a geometria obtida pelo processo de otimização

representa somente uma possível conformação encontrada pelo algorítmo na

região de mínimo local. Sendo assim é necessário investigar o comportamento

conformacional através da SEP para que se possa aproximar o máximo possível

da região de mínimo global, encontrando a estrutura 3D mais favorável

energeticamente. A metodologia para que possa resolver esta questão denomina-

se dinâmica molecular (DM), que é um processo sistemático de busca

conformacional, sendo uma ferramenta bastante útil para se encontrar várias

regiões de mínimo da SEP (HOLTJE et al., 2003).

As simulações de DM usam como estrutura de partida a geometria previamente

refinada a qual aplica, de forma integrada, equações clássicas de movimento

durante um período de tempo para o sistema molecular, em uma determinada

temperatura. A trajetória resultante pode ser utilizada para observar o

comportamento da molécula durante este período de tempo, sendo este o objetivo

desta metodologia. Este método se baseia na MM, assumindo que os átomos

interagem entre si de acordo com a parametrização empregada pelo campo de

força.

Diferentemente dos processos de otimização, dinâmica molecular é capaz de

“vencer” barreiras rotacionais entre diferentes conformações. Dessa forma, é

possível encontrar outras regiões de mínimo além da região próxima da estrutura

de partida. No entanto, se estas barreiras são muito altas ou a estrutura possui um

número muito grande de graus de liberdade, então possíveis confôrmeros podem

não ser encontrados devido ao tempo utilizado pela simulação. Uma estratégia

para contornar este problema é utilizar elevadas temperaturas. Os protocolos de

DM geralmente usam as temperaturas de 300 K, 400 K e 600 K, fornecendo

energia cinética suficiente para que as barreiras rotacionais de energia possam ser

“ultrapassadas” entre diferentes confôrmeros, explorando melhor a SEP (HOLTJE,

et al., 2003).

A dinâmica molecular representa uma ferramenta adicional que pode ser usada

para vasculhar as diferentes conformações possíveis de uma biomacromolécula.

No entanto, o uso necessita de cuidados devido à escolha do método e as

condições de simulação para que se possa assegurar a completa busca

conformacional e a validade dos resultados (PATNY, et al., 2006).

41

4. MATERIAL E MÉTODOS

Os passos seqüenciais utilizados para a identificação e caracterização da

seqüência primária do gene da sintase da quitina em DNA genômico, e a

caracterização da estrutura tridimensional da região filogeneticamente conservada

da enzima, contendo o sítio catalítico, por modelagem comparativa é sintetizado no

fluxograma mostrado na Figura 08.

Figura 08: Fluxograma da metodologia utilizada para a determinação da seqüência primária do gene da sintase da quitina do fungo M. perniciosa e posterior construção do modelo 3D do provável produto gênico.

Busca e anotação de seqüências no Banco do Proj. Genoma M.

perniciosa

Desenho de oligonucleotídeos

Extração e purificação de DNA total

Sequenciamento de gDNA

Amplificação dos fragmentos

Identificação de molde(s)

Modelo inicial

Refinamento do modelo

Validação

Análise das seqüências e contigs

Análise filogenética

Modelagem comparativa

Modelo final

42

4.1. Busca e anotação das prováveis seqüências do g ene da sintase da

quitina do Banco de Dados do Projeto Genoma do M. perniciosa

A busca de dados no banco de DNA genômico do Projeto Genoma do

Moniliophthora perniciosa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/) compreendeu

cinco etapas: (i) obtenção dos reads (seqüências) através de buscas textuais e

buscas por similaridade (utilizando seqüências de gene), (ii) triagem dos reads

coletados, (iii) montagem dos reads em contigs, (iv) triagem dos contigs obtidos, (v)

análise comparativa da estrutura primária (seqüência) dos contigs e do provável

homólogo aos níveis gênico e protéico (FAYYAD et al., 1996).

A obtenção dos reads foi realizada através de buscas textuais, utilizando

palavras-chave com os operadores booleanos, e buscas por similaridade,

utilizando seqüências completas de genes e proteínas correspondentes de

basidiomicetos já depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ.

Os reads resultantes das buscas textuais e por similaridade foram

inspecionados com a finalidade de eliminar os que continham informações

duvidosas ou espúrias, e apenas aqueles considerados de alta qualidade (valor E <

1 x 10-5, e seqüência com pelo menos 250 bases contíguas com valor Phred acima

de 20) foram considerados como significativos e utilizados para as análises

posteriores.

A montagem do gene a partir de fragmentos derivados de seqüenciamento

genômico do tipo shotgun, que corresponde à união de fragmentos (reads) com

terminações similares (sobreposições) em fragmentos maiores (contigs), foi

efetuada utilizando-se o programa Phrap (GREEN, 2007). Os contigs formados

foram então avaliados através da análise comparativa por similaridade, utilizando-

se o BLAST (versão 2.2.16) (ALTSCHUL, et al., 1997) e o FastA (versão 3.4)

(PEARSON, et al., 1997), com seqüências completas de genes e proteínas

correspondentes de basidiomicetos já depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ para

avaliar as regiões conservadas e variáveis. Utilizou-se ainda o pacote de

programas Lasergene versão 7.1.0 (BURLAND, 2000), para a inspeção e edição

manuais dos contigs gerados, através da comparação com os eletroferogramas

originais, sempre que necessário.

43

4.2. Desenho de oligonucleotídeos iniciadores

Após a análise das prováveis seqüências do gene da sintase da quitina do

Banco de Dados do Projeto Genoma do M. perniciosa, foram desenhados diversos

oligonucleotídeos específicos (senso e anti-senso) que foram usados para

determinar regiões não conhecidas de fragmentos de gDNA. Os oligonucleotídeos

foram desenhados manualmente e verificados utilizando as informações geradas

pela <https://www.operon.com/oligos/toolkit.php?> e a análise comparativa das

seqüências através dos resultados da busca por similaridade com seqüências

gênicas de basidiomicetos já determinadas, através do BLAST e FastA.

4.3. Extração e purificação do DNA total de M. perniciosa

Para a extração do material genético do M. perniciosa utilizou-se o isolado

CCMB 000257, obtido a partir de basidiomas coletados na Estação Experimental

Sósthenes de Miranda (ESOMI) da CEPLAC, localizada no município de São

Sebastião do Passé, Km 62/63 da rodovia Salvador-Feira de Santana, na região do

Recôncavo da Bahia (12º 30’ S, 38º 29’ W). O DNA foi extraído da massa micelial

crescida em meio de cultura líquido, a partir de plugs com micélio retirados de meio

de cultura sólido ágar-batata-dextrose (BDA). O meio líquido era composto por LB

e as culturas foram mantidas a 25 ºC, sob agitação constante de 250 RPM. A

massa micelial (50-60 mg) foi macerada em nitrogênio líquido com um pistilo em

um gral de porcelana. O material pulverizado resultante foi transferido para

microtubos de 1,5 mL, contendo 400-650 mL de tampão de extração aquecido a 65

ºC. Utilizou-se o tampão de extração CTAB (brometo de N-acetil-n-n-n-

trimetilamônio) modificado (100 mM Tris-HCl pH 8,1, 4 M NaCl, 2% CTAB, 20 mM

EDTA, 1% PVP) (ROGERS, BENDICH, 1994). O DNA foi extraído duas vezes com

clorofórmio-álcool-isoamílico (24:1), precipitado com isopropanol, e lavado com

etanol 70%. A ressuspensão foi feita com água ultrapura previamente autoclavada.

A análise qualitativa e quantitativa do material extraído foi realizada por meio de

eletroforese (DNA de fago-λ, digerido com Hind III) e de espectrofotometria

ultravioleta nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm.

44

Pchs54F

1700pb

Pchsic13.3R Pchsic34F Pchsic 54R 1100pb Pchsic13 .3 F Pchsic34R

1400pb

Alvo Pchsic34

Alvo Pchsic13.3

Pchsic54F Pchsic54R ≈ 40≈ 40≈ 40≈ 4000pb

Os géis de agarose foram preparados em TAE 1x (Tris/ ácido acético/ EDTA)

com SYBR Safe (Invitrogen®) a 1:10000, em concentrações de 1% e 1,2%. As

amostras de DNA analisadas foram preparadas com o tampão de corrida

bromofenol. A eletroforese foi feita em TAE 1x a 80 V, 70 mA e 70 W por 90 min. A

visualização dos fragmentos de DNA foi visualizada através de transiluminador de

luz ultravioleta. Após a corrida, os géis foram fotografados com o sistema de

fotografia digital KODAK EDAS 290.

4.4. Amplificação de fragmentos de DNA genômico

A reação em cadeia da polimerase (PCR) simétrica (SAIKI et al., 1988) foi à

técnica empregada para amplificar, pelo método de primer walking, as regiões não

conhecidas a partir de seqüências conhecidas (PARKER et al., 1991), utilizando-se

várias combinações de pares de primers (direto e reverso) (Figura 09 e Tabela 01).

Figura 09: Esquema representativo do gene da sintase da quitina, com destaque para os fragmentos amplificados e seqüenciados neste trabalho. O icontig5 está representado em amarelo, icontig3 em azul e o contig4 em vermelho. Em branco estão as regiões inicialmente desconhecidas que foram determinadas por primer walking.

As amplificações foram realizadas em um volume final de 25 µL, constituído por

tampão de amplificação a 10x; mix de dNTPs a 10mM; MgCl2 a 50 mM;

oligonucleotídeo específico a 10 pMol; DNA genômico de M. perniciosa (12,5 ng);

Taq DNA Polymerase a 0,02 U/µL da Invitrogen® e água ultrapura autoclavada

(q.s.p. 25 µL).

45

Os parâmetros das reações de amplificação foram os seguintes: desnaturação

a 94 oC por 3 min., anelamento a 61,6 ºC por 45 seg., para o par Pchsic13.3F/

Pchsic13.3R; 59,7 ºC por 45 seg. para o par Pchsic34; e 65 oC para os demais

primers, por 60 seg. e a extensão a 72 oC por 45 seg., perfazendo 34 ciclos com

extensão final de 72 oC por 10 min. Controles negativos, sem DNA, foram

preparados em cada uma das diversas séries de amplificação para se excluir a

possibilidade de contaminação dos reagentes.

Tabela 01: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para determinar as regiões desconhecidas do gene da sintase da quitina do fungo causador da vassoura-de-bruxa.

Primer Seqüência (5’ ���� 3’) Posição*

Pchsic34-F ggT gAA CgT gCA gCA TAC ACg 2352

Pchsic34-R gCT CCC ACT ggT CCT Tgg AAg 2585

pchsc63-F CgA Cgg TCT CgA AgC AAT gg -

pchsc63-R ggg CTg ATT CTg gCA CAT CCg 1814

Pchsic13.3-F CCA CCg TTg gTT gTT CAA CgC C 1192

Pchsic13.3-R gCC AAC gAA TgA TCC CCA Tgg 1644

pchs54-F CTA CTA Tgg CgA ATC gCC Cg 1

Pchs54-R CAT TTA gTT CCg TCT gCA ACA TCT g 3422

ChsHindIII-F(13F) Agg gcA ACT TCA TCA CCg AgT ATC C 475

ChsXholI-R (13-R) CgT ggC TCg Agg gTgC ACC AgT Tg 1097

ChsHindIII-F(10F) ggg TAC gAA AgC TTg CgA TAA AgC C 2936

ChsXholI-R (10-R) gAA gTA CTC gAg ACA CTg TCA Tgg 3381

*Posição no provável gDNA

Após o término da reação, 3,0 µL de cada amostra amplificada foi submetida à

eletroforese em géis de agarose, na concentração de 1% e 1,2%, preparados em

TAE 1x com SYBR Safe Invitrogen a 1:10000. As amostras de DNA para a análise

em gel foram preparadas com o tampão de amostra azul de bromofenol

(SAMBROOCK, RUSSELL, 2001). A eletroforese foi feita em TAE 1x com 70 V, 60

mA e 60 W por 90 min. A separação dos fragmentos de DNA foi visualizada

através de transiluminador de luz ultravioleta e fotografados com o sistema de

fotografia digital KODAK EDAS 290. Os produtos de PCR foram então purificados

46

com kit PureLink Invitrogen, adicionando-se 4x de tampão de ligação (fornecido

pelo fabricante) com isopropanol para cada volume de produto de PCR (50-100 µL)

contidos em uma coluna PureLink acoplada em um tubo de 1,5 mL. Em seguida, o

material foi centrifugado em T.A. por 1 min. a 10.000 g, e a coluna transferida para

um novo tubo. Adicionou-se 650 µL de tampão de lavagem (fornecido pelo

fabricante) com etanol, seguindo para uma nova centrifugação, e após o descarte

da solução filtrada, procedeu-se a uma nova centrifugação, em velocidade máxima

por 3 min. para total remoção do tampão. A coluna foi transferida para um tubo de

1,7 mL, e adicionou-se 50 µL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCl, pH 8,5)

fornecido pelo fabricante. O material foi incubado por 1 min. e em seguida

centrifugado por 2 min. à velocidade máxima. A coluna foi descartada e o material

recuperado, contendo a amostra de DNA purificada (48 µL), que foi armazenada a -

20 ºC, de acordo com as instruções do fabricante.

4.5. Seqüenciamento

Os produtos de PCR purificados foram seqüenciados diretamente. Os mesmos

iniciadores utilizados para amplificação (Tabela 01) foram também utilizados como

iniciadores nas reações de seqüenciamento.

Os amplicons purificados foram marcados com o Kit Big Dye Terminator Cycle

Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems) de acordo com as

recomendações do fabricante. As reações foram realizadas em microtubos de 0,2

mL em um volume total de 12 µL, sendo 4 µL de mistura do kit de seqüenciamento,

5 µL de água ultrapura, 1,0 µL (3,2 pmoles/µl) de solução do iniciador, e 20 ng de

amplicon purificado. Após a reação de seqüenciamento, purificaram-se os produtos

da reação através de precipitação com acetato de sódio 3 M pH 4,6 e etanol 95%

resfriado, com subseqüentes lavagens (mínimo de duas vezes) com etanol 70%,

seguido de secagem e ressuspensão do pellet em 18 µl formamida + EDTA. As

seqüências foram obtidas através da eletroforese capilar em seqüenciador

automático e foram feitas, no mínimo, duas repetições de cada fragmento, em

ambos os sentidos (direto e reverso).

47

4.6 Análise das seqüências

Os eletroferogramas obtidos foram analisados pelo programa FinchTV

(versão 1.4.0) (Geospiza Inc.) e as seqüências correspondentes foram

comparadas pelo SeqMan (versão 4.0) (BURLAND, 2000) e incorporadas aos

contigs previamente analisados.

As seqüências nucleotídicas dos contigs obtidos experimentalmente

foram então traduzidas pelo EditSeq (BURLAND, 2000) em seqüências

aminoacídicas nas seis possíveis fases de leitura e submetidas à análise

comparativa por similaridade com seqüências completas de genes e proteínas

correspondentes de basidiomicetos já depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ,

utilizando-se o BLAST (versão 2.2.16) e o FastX (versão 3.46) e Clustal W

(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

A determinação das bordas de éxons-íntrons, e, conseqüentemente, do

número, tamanho e estrutura primária dos íntrons no provável gene da sintase

da quitina de M. perniciosa foi realizada tanto através da comparação com

seqüências de DNA genômico dos genes homólogos de basidiomicetos como

também através de um algoritmo baseado em redes neurais treinadas com

bordas de éxons-íntrons dos genomas de espécies de Aspergillus

(NetAspGene 1.0 Server) (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAspGene/).

A análise de domínios e regiões conservadas da provável proteína foi

efetuada utilizando-se o InterPro que integra 11 bases de dados proteômicos,

como o UniProt (integra informações sobre proteínas contidas no Swiss-Prot,

TrEMBL e pIR), ProSite (base de dados de famílias e domínios de proteínas),

Pfam (dados de multiplas sequencias alinhadas), SMART (identificação e

anotação de dominios e arquiteturas de domínios de famílias protéicas), o

TMHMM v2.0 e TMPRED (domínios transmembranares) e SignalP v3.0 e

PSORT (localização subcelular e presença de peptídio-sinal), Swiss Model

(servidor de modelagem molecular por homologia), CATH (classificação

estrutural de proteínas) e muitos outros.

48

4.7 Análise filogenética

O conjunto de dados utilizados compreendeu as seqüências aminoacídicas

completas da sintase da quitina, depositadas no NCBI/EMBL/DDDJ, de todos os

táxons do clado fúngico com identidade igual ou superior a 50% (o que

corresponde a um valor-E de 0,0 e score acima de 882 bits) à provável proteína da

sintase da quitina de M. perniciosa, utilizando o programa BLASTp 2.2.17 (24-jun-

2007), com a matriz BLOSSUM 80.

As árvores resultantes foram enraizadas no ramo cujo terminal é o Ascomycota

Tuber borchii Kauffman (Pezizomycetes), uma vez que os Ascomycota são o

grupo-irmão dos Basidiomycota e, dentro dos Ascomycota, os Pezizomycetes

provavelmente originaram-se anteriormente aos grupos correspondentes às

demais espécies amostradas (HIBBETT et al., 2007).

Foram efetuadas análises filogenéticas nos programas PAUP 4.0b10

(SWOFFORD, 2002), PHYLIP versão (FELSENSTEIN, 2005) e Mr. Bayes 3.1

(RONQUIST, HUELSENBECK, 2003), utilizando métodos de distância, parcimônia

máxima, verossimilhança máxima e bayesianos para os conjuntos de seqüências

protéicas. Na análise pelo método de distância foram utilizadas as distâncias

médias e o algorítmo do vizinho-mais-próximo (Neighbour-Joining ou NJ), enquanto

que no modelo de parcimônia máxima, utilizou-se a parcimônia simples, sem

pesagem, não considerando os indels como um outro caráter. Para a análise de

verossimilhança máxima, utilizou-se o modelo de evolução molecular de proteínas

JTT (Jones-Taylor-Thornton), com amostragem de todos os caracteres com taxas

de evolução heterogêneas entre os caracteres, seguindo uma distribuição gama

(alfa = 0,5). Na análise bayesiana, utilizou-se o modelo de BLOSSUM como

probabilidade anterior, com a amostragem de todos os caracteres com taxas de

evolução heterogêneas entre os caracteres também adotando uma distribuição

gama (alfa = 0,5). A análise foi efetuada com 100.000 gerações, utilizando 4

cadeias distintas.

A avaliação do suporte dos grupos formados nas árvores filogenéticas foi

acessada por valores percentuais de reamostragem aleatória com reposição

(bootstrap), utilizando-se 1000 pseudoreplicações (FELSENSTEIN, 1985), para as

análises de distância, parcimônia e verossimilhança máxima, e valores percentuais

49

de probabilidades posteriores para a análise bayesiana. As árvores geradas foram

editadas utilizando-se o programa TreeView versão 1.6.6 (PAGE, 1996).

4.9 Determinação da estrutura 3D: Modelagem da regi ão conservada

contendo o sítio ativo

A predição da estrutura 3D da região conservada da sintase da quitina foi

realizada por modelagem comparativa (GOLDSMITH-FISCHMAN, HONIG, 2003;

SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003), utilizando métodos computacionais como

ferramentas do Swiss PDB Viewer (versão 3.7), que permite a submissão de uma

seqüência, retornando respostas por processos automatizados, como no processo

de modelagem por homologia descrito por Gibas, Jambeck (2001).

4.9.1 Identificação e alinhamento seqüencial da pro teína molde

Assim, a seqüência primária da região conservada da proteína foi submetida ao

PSI-BLAST (ALTSCHUL et al., 1997) contra as proteínas presentes no Protein

Data Bank (PDB) (BERMAN, et al., 2000). Dessa forma, foram selecionadas

estruturas de proteínas conhecidas como molde(s), que apresentaram grau de

homologia igual ou superior a 25% (GOLDSMITH-FISCHMAN, HONIG, 2003).

Como a busca por um molde para toda a região selecionada não retornou

resposta, seguiu-se para a divisão da região conservada em quatro partes

aleatórias, buscando manter a região do provável sítio ativo em uma única porção.

Os fragmentos da região conservada foram novamente submetidos ao PSI-BLAST,

obtendo-se os moldes esperados. O molde e a seqüência alvo foram alinhadas

pelas ferramentas disponíveis no Swiss PDB Viewer (versão 3.7) e em seguida foi

submetido ao Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), que é um servidor de

modelagem por homologia (Figura 10).

50

A B Figura 10: Processo de alinhamento da seqüência problema com o molde. A: em verde, fragmento da estrutura primária da seqüência de sintase da quitina de M. Perniciosa, em vermelho está a região da seqüência que apresenta identidade com o molde, e em laranja, a região do molde que tem identidade com a seqüência; B: Estrutura e molde alinhados, com a estrutura molde sobreposta pela seqüencial problema (Fonte: Swiss PDB Viewer 3.7).

4.9.2 Construção e refinamento do modelo

O modelo 3D da proteína-problema foi construído através da metodologia de

corpos rígidos (SANTOS FILHO, ALENCASTRO, 2003). Para o seu refinamento,

foram utilizados dois métodos de MM, MM3 (LII, ALLINGER, 1989) e ff99,

conhecido também como Amber (CASE, et al., 2004; PEARLMAN et. al., 1995). Os

cálculos envolvendo os método MM3 foram executados no programa

BioMedCache 6.1 desenvolvido pela Fujitsu (2005) usando computador tipo PC em

ambiente Windows, presente no Laboratório de Modelagem Molecular da

Universidade Estadual de Feira de Santana, enquanto os cálculos realizados pelo

campo de força ff99 foram executado pelo pacote Amber 8.0 (CASE, et al., 2004;

PEARLMAN et. al., 1995) utilizando a estação de trabalho RedWood, presente no

Mississipi Center for Supercomputing Research (MCSR) da University of Mississipi

via acesso remoto (Figura 11).

Ambos os pacotes possuem rotinas para minimização de geometria e

simulação por dinâmica molecular de biomacromoléculas. No entanto, as proteínas

foram previamente preparadas pelo programa tLEaP, presente no pacote Amber

51

8.0, a qual gerou uma proteína com carga neutra sendo utilizada tanto no

BioMedCache como no Amber 8.0 (CASE, et al., 2004).

Após a neutralização da proteína, foi realizado um prévio estudo cujo o

objetivo foi determinar qual seria a distância das interações de Van der Walls para

átomos não ligados a ser empregado em todos os cálculos a seguir. Esta distância

é denominada de cut-off, e a sua prévia determinação é importante uma fez que

quanto maior é esta distância, maior também é o custo computacional (tempo de

processamento e memória), sendo que isto necessariamente não traduz em uma

alteração significativa na geometria durante o processo de refinamento. Para isso,

variou-se o valor de cut-off entre 3 a 20 Ǻ através de cálculos single point pelo

método MM3.

Para o refinamento do modelo foi feita a sua minimização, que consistiu em

encontrar a melhor conformação da molécula na superfície de energia potencial

através dos algorítmos Steepest Descent e, posteriormente, Gradiente Conjugado.

Ambas as metodologias buscam uma região de mínimo na SEP, sendo o gradiente

conjugado descrito como mais sofisticado (HOLTJE, et al., 2003).

A seguir iniciou-se a etapa de refinamento do modelo através de otimização

de geometria, sempre através dos algorítmos Steepest Descent e, posteriormente,

Gradiente Conjugado, seguido de simulações de dinâmica molecular (DM) nos dois

métodos, a qual foi empregado protocolos distintos entre si. Através do método

MM3 (BioMedCache 6.1), foram executados uma série de cálculos de otimização

com 300 passos, seguidos de simulações de DM. Inicialmente, os átomos da

cadeia principal e das alfa-hélices foram fixos, e a cada ciclo de otimização e DM

as alfa-hélices foram relaxados uma a uma ,sempre a estrutura de menor energia

para o cálculo seguinte, até que se obteve uma estrutura final completamente livre.

O primeiro ciclo foi realizado à 1.000 K, e os ciclos posteriores à 600 K. Todas as

simulações foram realizadas por 50 ps, gerando 2501 estruturas (FUJITSU, 2005).

Paralelamente, a proteína modelo também foi refinada pelo campo de força Amber.

Neste caso, a proteína foi otimizada com 800 ciclos para cada algorítmo descrito

acima. A seguir, a estrutura de equilíbrio foi submetida à simulações de DM, por

300, 1000, e 200 e 3000 ps à 300 K, incluindo uma adicional simulação por 300 ps

à 600 K, obtendo no final do processo 5.000 estruturas diferentes em casa

simulação (CASE, et al., 2004). Dessa forma, no final do processo obteve-se dois

52

modelos por diferentes métodos. As estruturas geradas por ambos os programas

foram descritas graficamente. Este processo permitiu obter uma estrutura refinada,

a qual se encontra em uma região de mínimo na SEP, além de permitir estudar o

movimento atômico, avaliar o comportamento termodinâmico e observar a

estabilidade da proteína.

Figura 11: Fluxograma da metodologia para construção do modelo.

Construção do Modelo

Minimização

Congelamento da cadeia principal e αααα-Hélices

Dinâmica

Steepest Decent

Gradiente Conjugado

1000 K/50 ps

Minimização

Steepest Decent

Liberação de um turn por vez em cada αααα-Hélices

Dinâmica

600 K/300 ps

Determinação de cut-off

Swiss Model

Neutralização: tLEaP AMBER

BioMedCache

BioMedCache

AMBER BioMedCache

Minimização

Steepest Decent

Gradiente Conjugado

Dinâmica

300 K/300, 1000, 2000, 3000 ps

M o d e l o P r o p o s t o

53

4.9.3. Validação

O modelo foi avaliado sobre a qualidade do efeito estérico da cadeia

principal (ŠALI, BLUNDELL 1993) utilizando o programa Procheck (Versão 3.0).

Este programa gera variados gráficos que demonstram a qualidade geométrica,

através das coordenadas da estrutura da proteína, estabelecendo uma pontuação

para a qualidade estérica do modelo em estudo. Neste programa é possível gerar o

gráfico de Ramachandran, que determina os ângulos de torção ω (Phi) e φ (Psi)

dos resíduos da estrutura. Separadamente é gerado um Ramachandran para os

resíduos de glicina e prolina, pois estes aminoácidos diferem dos demais em sua

conformação, e conseqüentemente, sua região favorável também é diferente. Em

um terceiro gráfico é representado os ângulos de torsão chi1 e chi2 pra todos os

resíduos. A qualidade do Ramachandran, planaridade das ligações peptídicas, má

interação entre os átomos não-ligados, energia de ligação hidrogênio na cadeia

principal, propriedades da cadeia lateral e outros parâmetros também são

ilustrados pelo Procheck 3.0 (LASKOWSKI et al., 1994).

Uma outra opção de validação utilizada é o ANOLEA (Atomic Non-Local

Environment Assessment), também disponível pelo Swiss Model. Segundo MELO

e FEYTMANS (1998) este método calcula o somatório da interação dos átomos,

dentro de um raio de 7 Ǻ, para cada um dos aminoácidos (Atomic mean force

potencial - AMFP) obtendo o perfil de energia potencial da estrutura de uma

proteína, demonstrando quanto o ambiente químico ao redor do átomo contribui

para a sua estabilidade. Este cálculo gera uma pontuação para cada aminoácido

que é demonstrado graficamente. As menores pontuações são encontradas em

loops ou regiões de diferença entre o molde e a proteína alvo (GUEX, PEITSCH,

1997; GUEX et al., 2001).

54

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Seqüenciamento do gene da sintase da quitina

A busca no banco de dados do Projeto Genoma do Moniliophthora

perniciosa retornou 72 reads, com os quais foram formados 19 contigs. Nenhum

dos contigs formou o gene inteiro da sintase da quitina, mas alguns deles tiveram

um valor-E consideravelmente negativo, o que significa ser este um alinhamento

altamente significativo e não devido ao acaso, sendo os mais adequados para os

estudos funcionais. Três deles (iContig3, iContig4 e iContig5) apresentaram

significativa identidade à sintase da quitina de Agaricus bisporus, sendo mapeados

com sucesso, no citado produto gênico, com uma cobertura descontínua de 76%,

com dois intervalos na região central do gene (Figura 12 e Tabela 02).

Figura 12: Chs1 de Agaricus bisporus (909aa). Destaque para a delimitação das regiões de similaridade, obtida por BLAST, com contigs de M. perniciosa. Amarelo: icontig 5 - Fase de leitura

+1: Valor-E = 1e-88, Identidade = 55%, Positividade = 63%, Gaps = 12%, Fase de leitura +2: Valor-E

= 1e-37, Identidade = 91%, Positividade = 98%, Gaps = 0% e Fase de leitura +3: Valor-E = 1e-37,

Identidade = 83%, Positividade = 91%, Gaps = 0%; Azul: icontig 3 - Valor-E = 6e-37 Identidade =

78%, Positividade = 81%, Gaps = 0%; Verde: icontig 4 - Valor-E = 1e-82, Identidade = 58%, Positividade = 66%, Gaps = 24%, 690 aminoácidos (aprox. 76% do total de 909 aa). Aminoácidos em negrito correspondem ao alvo do par de primers Pchsic13.3 e Pchsic34, respectivamente; Aminoácidos grifados representam a região de anelamento do Pchsic13.3, em vermelho, e do Pchsic34, em azul.

MGDFKPSPNSSQTRIDNYGDPFADRPRQTQFVEPERPYGSSASARPFESSASLPQDLGGGFDDEEYVEKLPLNTGGNFAGGFYPPGPVDPSAYGDSHIHPGRPSSVVSTSTNGVDSAWRRRQTIKRGVTRKVKLTQGNFIAEYPVPTPILNAVEDKWKSTNKTEFSHMRYTAATVDPDEFSEENGWSLRTKMYNRDTEILIAVTSYNEDKTLYARTLHGVMLNIRDICKTKQSKYWRRHAEEGTPGWQKITVALI VDGLEPMDKTVLDILATIGVYQDGVMKKQVDGKDTVAHIFEYTTQLSVDATPQLVLPRAEDPNNLVPVQIIFVLKAQNQKKINSHRWLFNAIGRMLNPEICVLIDAGTKPGHKSIYYLWEAFYNDPHLGGCCGEIHAMIKGGKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFQAITGCPLEQYFHGDHSLADRLGPKGIYGMNIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAKDRWTLTYVKPSKAETDVPESAAELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYRSGHGIIRMFFLHIQGLYNVFSLIFSWFALANMWLTFSIIIDLVPSQGIVIFGTETVTHWVNLSFKWLYLSFLALQFILALGNRPKGERMAYVATLWVYGFLAVYLLVCSFALTIKAFKNIPNELSFEGKSAGEIVLQFFEPPVGALIAAMISTYGIYLVASFLYRDPWHMFSSFLQYLCLAPSFTNVLNVYAFCNLHDVSWGTKGSDKAEALPSVSSSKTKGADMAVVEDTTKIQEDVDAAFKETVTRAITKIESKEVVEKPTMDDQNKTFRTRLVSLWMLSNATLAIAIENISGLPSKDPSVDADTLQKRQSTYFAIILYSTFGLAMVRFIGCLFYFFKRNLFRCCRKNRLFQVVNGHDSSF

55

Tabela 02 – Seqüências do M. perniciosa relacionados aos genes da sintase da quitina em Agaricus bisporus (Número de acesso: emb|CAB96110.1) identificados por BLASTx.

Reads Contigs Valor-E

CP02-S3-000-118-A08-UC.G CP02-PF-096-002-C08-UC.F CP02-PF-096-002-C08-UC.G

3 6e-37

CP02-S2-000-036-D04-EM.R CP02-S2-000-166-A03-CL.F CP02-S2-000-166-C10-UC.F

4 1e-82

CP02-S1-000-007-A08-CL.F CP02-S2-038-242-G02-EM.F CP02-S2-000-180-A03-UC.F CP02-S2-000-138-A09-EM.R CP02-S1-000-015-C08-EM.F CP02-S2-000-032-G09-EM.R

5 1e-88

O resultado do BLASTx do iContig5 mostrou ainda significativa similaridade

com o início do gene da sintase da quitina de Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.

(6 e-72) e Coprinopsis cinerea (Schaeff.) Redhead, Vilgalys & Moncalvo (2e-69). Na

busca de um provável códon de iniciação para representar a metionina da sintase

da quitina do M. perniciosa, com a região inicial do iContig5, traduzida para a fase

de leitura +1, de acordo com o BLASTx, pôde-se encontrar uma metionina a sete

aminoácidos antes do início do códon encontrado no BLAST do icontig5

comparada à seqüência de AbChs1, mostrando-se como um indício de que esta

seja a região 5’ do provável gene CHS do M. perniciosa. Esta mesma região

também resultou num alinhamento com 100% de identidade, entre as regiões

iniciais dos genes de Puccinia graminis Pers. e P. ostreatus (Figura 13). Outra

evidência para essa suposição é a presença de uma região rica em AT, com 6

nucleotídeos (TTAATT), correspondendo a um sinal de transcrição inicial, a

exatamente 39 nucleotídeos antes do provável códon de iniciação, indicando ser a

região promotora do gene alvo (Figura 14). Isso confirma a informação de que

genes eucarióticos apresentam uma região promotora conhecida como TATA BOX

numa faixa de 35 a 40 nucleotídeos antes do códon de iniciação (SMALE,

KADONAGA, 2003).

56

iC5-MpChs MA NRPPLP------------------SNA-- SSSTVNDPYA-- DPFADRPRQ 30 A.bisporus MGDFKPSPN---------------------- SSQTRI DNYG-- DPFADRPRQ 28 P.ostreatus MSNTPPTPRFDAPRPSTPLSLMPSQGRSGSLSSTPEPSVYGGDDPFGDSRSQ 52 P.graminis MSPHRNDPFSDQPNPDL--------GRYHLS--DNDDSFTG--Q PPVDNHHY 40

Figura 13: Alinhamento entre o icontig5 de M. perniciosa e a região inicial da seqüência codante do cDNA da CHS de M. perniciosa com A. Bisporus (emb|CAB96110.1), P. ostreatus (dbj|BAF37219.1) e P. graminis (gb|ABB70409.1) (Fonte: Resultados experimentais, http://tcoffee.vital-it.ch/).

A iC5: CCATCTTGCCCTTGCCTCGCTTTCTGTCACGACTCTTGTTGCTTAATTCTT iC5: TCCTTAGCTTTCAGTTTTTTTCTTCCTTTGACTACTATGGCGAATCGCCCG +1: M A N R P iC5: CCACTCCCTTCAAATGCTTCTAGCTCTACAGTCAATGATCCTTATGCAGAC +1: P L P S N A S S S T V N D P Y A D

B

Figura 14: A - Tradução da região inicial do iContig5 na fase de leitura +1. A - Os aminoácidos em azul representam o início da similaridade, por BLASTX, com A. bisporus; destaque, em verde, para o provável códon de iniciação que está situado a sete aminoácidos antes do início do BLAST, com o sexto aminoácido da referida enzima. Em vermelho, provável região promotora (TATA BOX), B - Cromatograma do sequenciamento da placa CP02-S1-000-015-C08-EM-F na região do provável TATA BOX, disponível no banco de dados do genoma do M. perniciosa (Fonte: Resultado experimental gerado pelo programa FinchTV).

A tradução do iContig3, na fase de leitura +2, revelou a presença do domínio

QRRRW, considerado como a assinatura da sintase da quitina em leveduras e

fungos filamentosos. Esta informação foi confirmada também por BLASTx e em

alinhamentos, onde se pode perceber 100% de identidade nas seqüências

completas de sintase de quitina de Basidiomycota (Figura 15). Esta região também

é indicada como provável região do domínio catalítico (TELLAM, et al. 2000).

O DNA total do M. perniciosa foi extraído da massa micelial segundo Rogers

e Bendich (1994) e analisado em gel de agarose 1%. Com a espectrofotometria

57

ultravioleta nos comprimentos de onda de 260 nm determinou-se que o material

extraído apresentava uma massa de 3.972 ng/µL.

A partir das seqüências obtidas no banco de dados foi possível construir

pares de primers com os quais foram feitas as amplificações dos fragmentos

desconhecidos. O fragmento menor com cerca de 290 pb foi obtido com o par de

primers Pchsic34F e Pchsic34R, e o par Pchsic13.3F e Pchsic13.3R originou um

fragmento maior com aproximadamente de 480 pb (Figura 16), como o esperado.

Mperniciosa GKKLLNPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAIL GRPLEQYFHGD 461 Abisporus G KKLLNPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFQAI TGCPLEQYFHGD 456 Ccinerea824 G KKLLNPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFKALLGRPLEQYFHGD 384 Postreatus G KKLLNPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAIL GKPLEQYFHGD 479 Ccinerea864 GKRLLNPLVAAQNFEYKMSNIL DKPFESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAI QGRPLEQYFHGD 417 Cneoformans901 GVKLFNPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYKAI QGRPLTQYFHGD 429 Cneoformans931 GVKLFNPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYKAI QGRPLTQYFHGD 464 Umaydis GRKLI NPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESTFGYVSVLPGAFSAYRFRAI QGRPLQQYFHGD 504 Pgraminis868 GKKLI NPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESAFGYVSVLPGAFSAYRFRALSGRPLQQYFHGD 434 Pgraminis977 GKKLI NPLVAAQNFEYKMSNIL DKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAIL GRPLQQYFHGD 495 * : * : ******************** : ** : *************** :: * : * ** ****** Mperniciosa HS LADRLGPKRYYGNEHLHQEHVLAEDRIL CFELVAKKNDRWTLTYVKPSKAETDVPESA 521 Abisporus HSLADRLGPKGI YGMNIF TKNMFLAEDRIL CFELVAKAKDRWTLTYVKPSKAETDVPESA 516 Ccinerea824 HS LADRLGPKGI HGMSIF TKNMFLAEDRIL CFELVAKKGDRWTLTYVKPSKAETDVPESV 444 Postreatus HS LADRLGAKGI HGMSIF TKNMFLAEDRIL CFELVAKAGDRWTLTYVKPSKAETDVPESA 539 Ccinerea864 HSLADRLGEHGI NGMSIF QKNMFLAEDRIL CFELMAKRGEKWTLGYVKDSKAETDVPETA 477 Cneoformans901 ATLAARLGKKGI YGMGIF TKNMFLAEDRIL CFELVAKKGEKWVLQYVKPSKAETDVPEQA 489 Cneoformans931 ATLAARLGKKGI YGMGIF TKNMFLAEDRIL CFELVAKKGEKWVLQYVKPSKAETDVPEQA 524 Umaydis HTLADRLGKKGLHGMDIF TKNMFLAEDRIL CFELVAKAGDKWTLTYVKPSKGETDVPEGA 564 Pgraminis868 HTLADRLGKKGLNGMGIF TKNMFLAEDRIL CFELAAKANDAWLLSYVRAAKGETDVPEQA 494 Pgraminis977 HSLSERLGKKGI QGMGIF KKNMFLAEDRIL CFELVAKAKSRWVLGYVKPAKGETDVPEQA 555 : * : *** : * : :: .*********** ** . * * ** : : *.****** . Mperniciosa P ELI GQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYQSGHGIF RMFFFHVQALYNIF SLVFSWFSLA 581 Abisporus AELI GQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYRSGHGII RMFFLHI QGLYNVFSLIF SWFALA 576 Ccinerea824 AELI GQRRRWLNGSFAASVYALVNFFSFYRSGHGPI RMFFFHI QAI YNVLSLVFSWFALA 504 Postreatus AELI GQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKI YKSGHGII RLFFLHLQALYNSFSLFFTWFALA 599 Ccinerea864 PELI GQRRRWLNGSFAASI YALVHFWRVYQSGHNFVRIFFF HI QALFNAFNLFFSWFALA 537 Cneoformans901 AELI SQRRRWLNGSFAASVYSVFHFFRLYRSGHGPI RMLFLHI QAI YNVFSLIF SWFALA 549 Cneoformans931 AELI SQRRRWLNGSFAASVYSVFHFFRLYRSGHGPI RMLFLHI QAI YNVFSLIF SWFALA 584 Umaydis AELI SQRRRWLNGSFAASI YSLVHFFRI YKSNHGII RLFFLHI QALYNAIVLLF SWFALA 624 Pgraminis868 AELI SQRRRWLNGSFAASI YATI HFFRFYKSSHNPI RLLMFHVQALFNIF QLIF TWFSLA 554 Pgraminis977 AELI GQRRRWLNGSFAAGI YSLAHFSRMYSSSHGIV RMFFLHVQAFYATAGLIMSWFALG 615 .***.************. : * : : * .* *.*. .* :::: * : *. :: *. :: ** : *.

Figura 15: Alinhamento mostrando a região do domínio característico das sintases da quitina e provável sítio catalítico em Basidiomycota.

Com diferentes combinações dos pares de primers construídos para a sintase

da quitina foi possível também realizar a amplificação de todo o gene, com

extensões diferentes e contínuas (Figura 17). Com os pares Pchs54F/Pchsic13.3R,

58

Pchsic13.3F/Pchsic34R e Pchsic34F/Pchs54R obtiveram-se amplicons de

diferentes regiões do gene em estudo que apresentaram, respectivamente, 1700,

1400 e 1100 pb. Com o par Pchs54F/Pchs54R o gene da sintase da quitina foi

amplificado por inteiro, apresentado cerca de 4 kb. Os fragmentos amplificados

foram seqüenciados, confirmando as informações dos experimentos anteriores,

bem como aquelas contidas no banco de dados do projeto. A montagem de

contigs, a partir dos fragmentos amplificados e seqüenciados, sugere que no M.

perniciosa há, pelo menos, um gene da sintase da quitina.

Figura 16: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa via PCR. No gel de agarose a 1,0% foi aplicado 3 µL do produto da reação de amplificação em cada poço. A eletroforese ocorreu por 90 min., 60 v e 50 mA. M - Marcador de massa molecular 100 base pair Ladder da Fermentas®. Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de dNTPs a 10 mM; 0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada oligonucleotídeo específico a 10 pMol; 1,0 µL de gDNA de M. perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de Taq DNA Polymerase (5U/µL) da Phoneutria® e água ultrapura (q.s.p. 25 µL). 1 e 2 - Fragmentos de cerca de 290 pb obtido com o par de oligonucleotideo Pchsic34F e Pchsic34R. A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 59,7 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 1 min. 3 e 4 - Fragmento de cerca de 480 pb obtido com o par de oligonucleotideo CHSiC13.3F e CHSiC13.3R. A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 1 min, anelamento a 61,6 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 2 min.

500 pb

M 1 2 3 4

59

Figura 17: Análise eletroforética dos produtos de amplificação do DNA total do M. perniciosa por PCR. Condições experimentais: 2,5 µL de tampão de amplificação a 10x; 0,5 µL do mix de dNTPs a 10 mM; 0,8 µL de MgCl2 a 50 mM; 1,0 µL de cada oligonucleotídeo específico a 10 pMol; 1,0 µL de gDNA de M. perniciosa (12,5 ng); 0,13 µL de Taq Platinum DNA Polymerase (5U/µL) da Invitrogen® e água ultrapura (q.s.p. 25 µL). A desnaturação procedeu-se a 94 ºC por 3 min, anelamento a 65,0 ºC por 1 min. e extensão a 72 ºC por 2 min., perfazendo 34 ciclos com extensão final de 72 ºC por 10 min. Análise de 3 µL do produto da reação de amplificação em gel de agarose a 1,2%, por 120 min., 60 v e 50 mA. M - Marcador de massa molecular DNA Step Ladder Promega®; 1 e 2 - Pchs54-F/Pchsic13.3-R, com fragmento de 1700 pb; 3 e 4 - Pchsic13.3F/PchsiC34R, com fragmento de 1400 pb; 5 e 6 - PchsiC34F/Pchs54F, com fragmento de 1100 pb e 7 e 8 – Pchs54F/Pchs54R, com fragmento de aproximadamente 4000 pb.

Com as informações disponíveis no banco de dados e aquelas resultantes dos

seqüenciamentos dos intervalos desconhecidos, foi possível a determinação da

provável seqüência gênica para a sintase da quitina de M. perniciosa. O gene

MopCHS é composto por 3443 pares de bases, organizados em 13 íntrons e 14

éxons que constituem um cDNA com uma fase de leitura aberta com 2739 pb e

uma proteína com 913 aminoácidos (Figura 18/Tabela 03). Os íntrons seguiram um

padrão característico, tanto para as bordas (GT/AG), sendo o mesmo encontrado

descrito para as bordas da sintase da quitina de Exophiala dermatitidis (LIU et al.,

2004) quanto para o tamanho apresentado que foi entre 51 e 60 pb. Na análise do

número de íntrons e éxons existentes nos genes completamente seqüenciados de

representantes de Basidiomycota, existe uma redução em número nos genes

destas espécies em relação aos grupos considerados filogeneticamente mais

antigos. É possível que este decréscimo seja uma possível tendência evolutiva

dentro de Basidiomycota.

M 1 2 3 4 5 6 7 8

1000 pb

4000 pb

60

A proteína predita apresenta, aproximadamente, 102 KDa, com um pI de 8,43

em pH 7,0, o que a caracteriza como altamente básica em comparação com o

recém-seqüenciado gene MsCHS2 da sintase da quitina de Manduca sexta e

Lentinula edodes que apresentaram pH de 6,06 (HOGENKAMP, 2006) e 5,33

(NISHIHIMA et al., 2007) respectivamente.

Figura 18: Esquema representativo demonstrando a organização do gDNA da sintase da quitina de M. perniciosa. As linhas representam os éxons e as barras verticais os íntrons.

Tabela 03: Característica da organização dos éxons e íntrons do gene da sintase da quitina de M. perniciosa.

EXON INTRON

Nº Tamanho

(pb) Posição Nº

Tamanho (pb)

Posição (5’ ... 3’)

1 275 1-275 1 53 276-328 GTGAGC...CCTCAG

2 237 329-565 2 55 566-620 GTAAGT...GGCCAG

3 391 621-1011 3 52 1012-1063 GTTTGT...CTATAG

4 168 1064-1231 4 55 1232-1286 GTAAGC...CATCAG

5 199 1287-1485 5 55 1486-1540 GTAAGT...CCACAG

6 350 1541-1890 6 56 1891-1946 GTAAGT...TTCTAG

7 81 1947-2027 7 53 2028-2080 GTAAGT...CTCCAG

8 132 2081-2212 8 52 2213-2264 GTAAGT...TTCTAG

9 119 2265-2383 9 51 2384-2434 GTGCGA...GAATAG

10 200 2435-2634 10 60 2635-2694 GTGAGC...ACTTAG

11 29 2695-2723 11 51 2724-2774 GTACGT...CTCTAG

12 102 2775-2876 12 51 2877-2927 GTACGT...TCCTAG

13 405 2928-3332 13 57 3333-3389 GTACGT...TGACAG

14 51 3390-3440 - - -

(Fonte: Resultados experimentais)

Uma análise da predição da topologia da proteína pelo software TMHMM (v2.0)

(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), revelou um total de oito regiões com

hélices transmembranares, seis delas com probabilidade de aproximadamente 1,0

e duas com probabilidade próximas a 0,6 (Figura 19). A mesma análise foi feita

também pelo software SOSUI da Universidade de Nagoya (http://bp.nuap.nagoya-

u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html) e confirmaram os resultados para algumas das

hélices preditas (Tabela 04). Em ambas as análises nota-se a concentração das

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

500 pb

61

hélices transmembranares a partir da segunda metade da proteína, confirmando

que esta é uma região rica em aminoácidos hidrofóbicos. Esta análise sugere que

a provável região do domínio catalítico da enzima em estudo esteja em uma região

intermembranar. Tellam et al. (2000), os primeiros a determinarem a seqüência

completa de cDNA da provável sintase da quitina de artrópodo, utilizando esta

ferramenta de análise, detectaram de 15 a 18 hélices transmembranas, indicando

que a enzima, no artrópodo, é uma proteína integral de membrana. A analise da

topologia transmembranar de outros basidiomicetos filogeneticamente relacionados

ao M. perniciosa relevam semelhanças, principalmente no que se refere a posição

inicial dos aminoácidos transmembranares como pode ser visto na tabela 05.

Figura 19: Predição da topologia de hélices transmembranares na sintase da quitina (Fonte: TMHMM). Tabela 04: Predição de Hélices transmembrana para o gene MopCHS.

(Fonte: Resultado experimental, http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ e http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html

TMHMM SOSUI

N-Terminal C-Terminal N-Terminal C-Terminal

559 581 554 576 - - 585 607

614 636 617 638 651 673 652 674 705 727 705 727 737 759 735 757 838 860 - - 880 902 - -

62

Tabela 05: Predição das topologias transmembranares das sintase da quitina de Basidiomicota, obtida em análise realizada pelo TMHMM.

Basidiomicota Nº de regiões

transmembrana

Nº de regiões transmembrana

(Prob. > 1.0)

Posição inicial das prováveis regiões transmembranas

Nº de Acesso

M. perniciosa 8 6 559 EU154354

SOUZA et al., 2007

A. bisporus 7 6 526 CAB96110.1

SREENIVASAPRASAD, et al., 2000

C. cinerea 7 5 487 EAU87177.1

BIRREN, et al., 2003

C. cinerea2 7 6 454 EAU84753.1

BIRREN, et al., 2003

C. neoformans 7 6 535 EAL20616.1

FUNG, et al., 2004

C. neoformans2 7 6 389 XP_570882.1

LOFTUS, et al., 2005

C. neoformans3 7 6 570 AAW43575.2

LOFTUS, et al., 2005

P. ostreatus 7 6 558 BAF37219.1

NISHIHARA, et al., 2007

P. gaminis 7 6 541 ABB70408.1

BROEKER, et al., 2006

P. graminis2 7 7 593 ABB70409.1

BROEKER, et. Al., 2006

U. maydis 7 6 574

P30598 KAMPER, et al. 2006; WEBER, et al. 2006 e BOWEN, et al. , 1992;

L. edodes 7 7 919 AB262360

NISHIHARA, et al., 2007

Motifs altamente conservados podem ser encontrados na seqüência

determinada, tais como EDRXL, QRRRW e QXXEY que são considerados como

assinaturas, pois estão presentes em todos os tipos de sintase da quitina, sendo,

como supracitado, uma possível região catalítica. O motif QXFEY é comum em

fungos e nematódeos, e é descrito como altamente conservado também em

insetos (MERZENDORFER, ZIMOCH, 2003). Sugere-se que o motif (S/T)WGTKG,

também encontrado em MopCHS, possa desempenhar um importante papel na

catálise, sendo que a substituição do triptofano (W) e da segunda treonina (T)

resulte na perda dessa atividade (MERZENDORFER, 2006). A proteína

determinada possui todos os domínios descritos por Ruiz-Herrera et al. (2002)

como sendo característicos da Classe III, quais sejam:

(D/E)YPVP(T/S)(A/P)I(Q/L)SA, RTLHGVM(Q/L)N(V/I)RDI, LNPE(I/V)C,

PLEQYFHG, RMFF, WF(A/S)LA, LQF(I/V)LALGNRPK, FRT(S/R)LV. Apresenta

63

ainda outros 09 domínios referenciados como específicos da Divisão 1, que são:

EF(T/SAK)X(L/M)(T/R)YXA(A/VC)T(C/V/S), LAEDRILC(F/W/Y)(E/D)(L/V)(V/A),

T(M/Y/S)YNE(D/E/N), WXK(I/V)XVXX(I/V)XDG, (L/I)(L/I/V)(D/E)(A/V/C)GT,

F(C/V)(L/M)K(E/Q/A)XNXKK(L/I)NSH)R/L)W, TDVP, PLV(A/Y)XQNFEYK(MI/L)SNI-

LDK(P/T)(L/TV)ESX(F/M)G(Y/F/H)(I/V)(S/T)VLP(G/A)A(F/L)(S/C)AYR, E(F/L)(I/V)-

XQRRRW(L/I)N(G/Q)X(FL/M)(F/A)A (Figura 20) e, de acordo co Coquer et al.

(2004), os motifs DAGT e TSYNE apresentam provável função na ligação de

substrato; presume-se que o motif LAEDRIL refere-se a uma base catalítica.

Figura 20: Localização dos domínios que são considerados consenso e que identificam a sintase da quitina e caracterizam a Classe III e a Divisão 1.

O BLASTp revelou uma semelhança entre os domínios conservados

presentes nas bases de dados do Pfam e COG (Figura 21), e apresentou um

alinhamento com valor E = 0,0 para as 50 diferentes seqüências que são

apresentadas na Tabela 07. Além do valor de confiança dos alinhamentos, os

valores de cobertura da região alinhada, tanto para a seqüência em estudo

(MopCHS) como para as seqüências depositadas, são bastante significativos,

variando de 81 a 100%. Contra o A. bisporus o valor de identidade foi de 79% e

contra P. ostreatus foi de 67%, com coberturas de, respectivamente, 98 e 100%. A

análise de domínios conservados na base de dados do Pfam08407, pela

ferramenta de pesquisa de proteína (Pfam v21.0/HMMs - http://pfam.janelia.org/)

apresentou três domínios de valores estatísticos altamente significativos, como

pode ser visto na Tabela 06 e Figura 21. Dentre os 41 componentes da base de

dados Pfam08407 encontra-se o A. bisporus (Q9P4U1_AGABI), mais uma vez

corroborando a identidade entre estas proteínas e a proteína em estudo.

Consensos da Classe - III Consensos da Divisão 1 Consensos de todas as CS

1 456 913

64

A Sintase_quit-1N: domínio 1 de 1, de 129 até 209: Va lor-E = 3.2 e-42 Pfam08407 *->RRRKTIRRKVKLVNGQGNLVSLDCPVPTKLLNQLPRKYRDERDSDEF +R ++ RKVKL++ GN++ +++PVPT +L++++ KY++ + + EF MopCHS 129 IKRGVT-RKVKLTK--GNFI-TEYPVPTPILSATEAKYTA- TSTTEF 170 Pfam08407 THMRYTAVTCDPDDFTVENGYTLRQALYNPPRETELFIVIT <-* +HMRYTA+TCDPD+F++ NGY+LR+++YN RETEL+I++T MopCHS 171 SHMRYTAATCDPDEFSEANGYSLRTKMYN--RETELLIAVT 209

B

Figura 21: Domínios conservados da sintase da quitina de M. perniciosa nos bancos de dados: pfam01644, com Valor-E 2e-62, pfam08407 com valor-E 7e-25, COG1215 com Valor-E 2e-22 e pfam03142 com Valor-E 4e-19. Tabela 06: Alinhamento com pontuação de alta significância do provável produto gênico (sintase da quitina) de M. perniciosa contra a base de dados do Pfam.

Alinhamento Modelo

MopCHS Pfam Valor-E Descrição

Nº de representantes

alinhados

Pfam08407 129-209 1-88 3.2e-42 Sintase da quitina N-terminal l 41

Pfam03142 180-739 1-548 5.5e-06 Sintase da quitina l 10

Pfam01644 211-382 1-168 8.3e-93 Sintase da quitina l 14

O resultado do BLAST das seqüências de proteína com valor-E igual a 0,0 e

identidade igual ou superior a 50% foi utilizado para análise filogenética pelos

métodos de distância, de parcimônia máxima, de verossimilhança máxima e

inferência bayesiana, além de uma última análise na qual foi feito o consenso de

maioria dos resultados dos quatro métodos supracitados (Figuras 22, 23, 24 e

25/Tabela 07). A filogenia das seqüências da sintase da quitina dos fungos citados,

utilizando tanto a análise de parcimônia como a bayesiana, mostraram a separação

dos grupos Basidiomycota e Ascomycota, com medidas de suporte confiáveis,

independente do tipo de análise realizada.

65

A análise de Parcimônia, utilizando seqüências de nucleotídeos, apresentou

índice de consistência (CI) igual a 0,6198, índice de retenção (RI) igual a 0,7256 e

índice de homoplasia (HI) igual a 0,3802. Para a analise de distância utilizou-se

seqüências de nucleotídeos, apresentou índice de consistência (CI) igual a 0,6160,

índice de retenção (RI) igual a 0,7211 e índice de homoplasia (HI) igual a 0,3840.

A proximidade filogenética entre A. bisborus e M. perniciosa foi confirmada

pela semelhança entre seus respectivos genes de sintase da quitina, a qual

facilitou a identificação de regiões conservadas.

66

Figura 22: Método de inferência bayesiana. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.

T.borchii P. graminis2

P. graminis

U. maydis C.neoformans3

C.neoformans

C.neoformans2

C.cinerea

P.ostreatus C.cinerea2

A.bisporus A.nidulans

N. fischeri2

A.niger

A.terreus

A.oryzae2

A.niger2

A.oryzae

A.clavatus N. fischeri2 A.fumigatus

A.fumigatus2 A.fumigatus3

E.dermatides

B.fuckeliana

M.grisea

C.globosum N.crassa

N.crassa2 N.crassa3

G.graminicola G.zeae

B.fuckeliana2

G.zeae2 F.oxysporum

A.nudulans2

P. chrysogenum

E.nudulans

A.clavatus2

N.fischeri3

A.fumigatus4

A.fumigatus5

A.fumigatus6

A.oryzae3 A.niger3

A.terreus2

A.capsulatus

C.immitis

C.posadasii

M.perniciosa

1.00

0.96

0.62

0.98

0.98

1.00 0.64

0.96

0.98 0.98

1.00 1.00

1.00 1.00

1.00

1.00 0.99

0.99

0.99

0.98 0.97

0.98

1.00

0.70

1.00

1.00

1.00 1.00 1.00

1.00

1.00 1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

0.58

0.98

1.00 1.00

1.00 1.00

1.00

1.

00

67

Figura 23: Método de distância. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.

10

Tub bor

Glo gra

Gib zea

Mag gri

Cha glo

Neu cra

Neu cra 2

Neu cra 3

Bot fuc 2

Gib zea 2

Fus oxy

Exo der

Bot fuc

Pen chr

Asp nig 3

Asp ter 2

Asp ory 3

Asp cla 2

Neo fis 3

Asp fum 4

Asp fum 5

Asp fum 6

Asp nid 2

Eme nid

Aje cap

Coc pos

Coc imi

Asp ter

Asp ory 2

Asp ory

Asp nig

Asp cla

Neo fis

Asp fum 2

Asp fum

Asp fum 3

Asp nid

Neo fis 2

Asp nig 2

Puc gra 2

Puc gra

Cop cin

Ple ost

Cop cin 2

Mon per

Aga bis

Ust may

Cry neo 2

Cry neo

Cry neo 3C.neoformans3

1.00 1.00

0.99

A.nidulans

A.terreus2

A.oryzae3

T.borchii

P. graminis

U. maydis

C.neoformans2

C.cinerea

P.ostreatus

C.cinerea2

A.bisporus

A.niger

A.terreus

A.oryzae2

A.niger2

A.oryzae

A.clavatus

N. fischeri2

A.fumigatus2

E.dermatides

B.fuckeliana

M.grisea

C.globosum

N.crassa

N.crassa2

N.crassa3

G.graminicola

G.zeae

B.fuckeliana2

G.zeae2

F.oxysporum

A.nudulans2

P. chrysogenum

E.nidulans

A.clavatus2

N.fischeri3

A.fumigatus4

A.fumigatus5 A.fumigatus6

A.niger3

A.capsulatus

C.immitis

C.posadasii

M.perniciosa

A.fumigatus

N. fischeri

0.56

0.95

1.00

0.68

0.80 1.00

0.90

0.90

0.95

0.99

0.74

0.83 0.98 0.80

1.00

0.53

0.86

1.00

1.00

0.98

1.00

1.00 1.00

1.00

0.99

0.54

0.64

1.00

1.00

1.00 0.99

1.00 1.00

1.00

0.97 0.90

1.00

0.99

1.00

0.99

0.99

P. graminis2

A.fumigatus3

C.neoformans

68

Figura 24: Máxima Verossimilhança. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.

10

Tub bor

Bot fuc

Glo gra

Mag gri

Cha glo

Neu cra

Neu cra 2

Neu cra 3

Gib zea

Bot fuc 2

Gib zea 2

Fus oxy

Exo der

Pen chr

Asp nig 3

Asp ter 2

Asp ory 3

Asp cla 2

Neo fis 3

Asp fum 4

Asp fum 5

Asp fum 6

Asp nid 2

Eme nid

Aje cap

Coc pos

Coc imi

Puc gra 2

Puc gra

Ust may

Cop cin

Ple ost

Cop cin 2

Mon per

Aga bis

Cry neo 3

Cry neo

Cry neo 2

Asp ter

Asp ory 2

Asp ory

Asp nig

Asp cla

Neo fis

Asp fum

Asp fum 2

Asp fum 3

Asp nid

Neo fis 2

Asp nig 2

A.oryzae3

T.borchii

P. graminis2

P. graminis

U. maydis

C.neoformans3

C.neoformans2

C.cinerea

P.ostreatus

C.cinerea2

A.nidulans

A.terreus

A.oryzae2

A.niger2

A.oryzae

A.clavatus

A.fumigatus2

E.dermatides

B.fuckeliana

M.grisea

C.globosum

N.crassa

N.crassa2

N.crassa3

G.graminicola

G.zeae B.fuckeliana2

A.nudulans2

P. chrysogenum

E.nidulans

A.clavatus2

N.fischeri3

A.fumigatus4 A.fumigatus5

A.fumigatus6

A.niger3

A.capsulatus

C.immitis

C.posadasii

M.perniciosa

A.fumigatus

C.neoformans

A.terreus2

A.bisporus

A.niger

G.zeae2 F.oxysporum

A.fumigatus3

N.fischeri

N.fischeri 2

1.00 0.83

0.65

0.57 1.00

1.00

0.99

0.84

0.99

0.50

0.98

1.00

0.95

0.52

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00 1.00

0.91

1.00

0.65

1.00

0.58 0.89

0.98

0.99

0.70

0.70

0.94 1.00

0.99 0.70

0.99

1.00

0.90

0.82

0.55

1.00

1.00

0.72

69

Figura 25: Método da Parcimônia. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.

10

Tub bor

Bot fuc

Glo gra

Mag gri

Cha glo

Neu cra

Neu cra 2

Neu cra 3

Gib zea

Bot fuc 2

Gib zea 2

Fus oxy

Exo der

Pen chr

Asp ory 3

Asp nig 3

Asp ter 2

Asp cla 2

Neo fis 3

Asp fum 4

Asp fum 5

Asp fum 6

Asp nid 2

Eme nid

Aje cap

Coc pos

Coc imi

Puc gra 2

Puc gra

Ust may

Cop cin

Ple ost

Cop cin 2

Mon per

Aga bis

Cry neo 3

Cry neo

Cry neo 2

Asp ter

Asp ory 2

Asp ory

Asp nig

Asp cla

Neo fis

Asp fum

Asp fum 2

Asp fum 3

Asp nid

Neo fis 2

Asp nig 2

A.oryzae3

T.borchii

C.neoformans3

C.neoformans2

C.cinerea

P.ostreatus

C.cinerea2

A.terreus A.oryzae2

A.oryzae

A.clavatus

A.fumigatus2

E.dermatides

B.fuckeliana

M.grisea

C.globosum N.crassa

N.crassa2

N.crassa3

G.graminicola

G.zeae B.fuckeliana2

A.nudulans2

P. chrysogenum

E.nidulans

A.clavatus2 N.fischeri3

A.fumigatus4

A.fumigatus5 A.fumigatus6

A.niger3

A.capsulatus

C.immitis

C.posadasii

M.perniciosa

A.fumigatus

C.neoformans

A.terreus2

A.bisporus

A.niger

G.zeae2 F.oxysporum

A.fumigatus3

N.fischeri

P. graminis2

P. graminis

U. maydis

A.nidulans

A.niger2 N.fischeri2

1.00 1.00

0.99

1.00 0.80

0.66

0.83

1.00

0.55

1.00

0.

99

0.99 0.95

0.99 1.00

1.00

1.00 1.00

0.91

0.52

0.99

1.00

0.62

0.66

0.59 0.90

0.99

0.99

1.00

0.66

1.00

0.71 0.99

0.97

0.98

0.82

0.91

0.51

0.93 1.00

1.00

70

Figura 26: Consenso de maioria dos quatro diferentes métodos. A identificação completa dos fungos utilizados está descrita na tabela 07. Números abaixo dos ramos correspondem aos valores percentuais de ocorrência dos grupos formados nos quatro diferentes métodos.

1

Tub borAsp nid

Neo fis 2Asp nig 2

Asp nigAsp ory

Asp ory 2Asp ter

Asp claNeo fis

Asp fumAsp fum 2Asp fum 3

Exo derPen chr

Asp ory 3Asp cla 2

Neo fis 3Asp fum 4

Asp fum 6Asp fum 5

Asp ter 2Asp nig 3

Eme nidAsp nid 2

Aje capCoc posCoc imi

Bot fucGlo gra

Mag griCha glo

Neu craNeu cra 3Neu cra 2

Gib zeaBot fuc 2

Gib zea 2Fus oxy

Puc gra 2Puc gra

Ust mayCop cin

Ple ostCop cin 2

Mon perAga bis

Cry neo 3Cry neoCry neo 2

A.niger2

A.niger3

T.borchii

P. graminis2 P. graminis

U.maydis

C.cinerea2

A.bisporus

A.nidulans

A.niger

A.terreus A.oryzae2

A.terreus2

A.oryzae

A.clavatus

N. fischeri2

E.dermatides

B.fuckeliana

M.grisea C.globosum

N.crassa

N.crassa2 N.crassa3

G.graminicola

G.zeae B.fuckeliana2

G.zeae2 F.oxysporum

A.nudulans2

P.chrysogenum

E.nidulans

A.clavatus2 N.fischeri3

A.fumigatus4 A.fumigatus5 A.fumigatus6

A.oryzae3

A.capsulatus

C.immitis C.posadasii

M.perniciosa

A.fumigatus N. fischeri

A.fumigatus2

A.fumigatus3

C.neoformans2

C.neoformans

C.cinerea P.ostreatus

0.50 0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75 0.75

0.50

0.75

0.75

0.75

0.75

0.50 0.50

0.75 0.75

0.75

0.75

0.75 0.75

0.75

0.75 0.75

0.75

0.50

0.50

0.75

0.75

0.50 0.75

0.50

0.50 0.75

0.75

0.75

0.75

1.00

0.75

0.75

0.75

0.75

0.75

C.neoformans3

71

TABELA 07: Seqüências de sintase da quitina (CHS) de Basidiomycota e Ascomycota com valor esperado (E) = 0,0 e identidade = ou > que 50%.

Espécie ID Proteína

(aa) cDNA

(nt)

Cobertura Seqüência-alvo (query)

(%)

Cobertura Seqüência do Banco (subject)

Score (bits)

Ident (%)

Simil. (%)

Gaps (%)

Agaricus bisporus (A. bisporus)

gi|8919410|emb|CAB96110.1| Provável enzima sintase da quitina

909 2730 99 98 1733 79 86 2

Ajellomyces capsulatus (A. capsulatus)

gb|ABQ88371.1| Sintase da quitina 2

905 2715 99 96 1031 51 67 8

Aspergillus clavatus NRRL 1 (A. clavatus)

gi|121719536|XP_001276467.1 gi|119404665|gb|EAW15041.1| Sintase quitina C

896 2688 88 88 976 54 70 4

Aspergillus clavatus NRRL 1 (A. clavatus2)

gi|121706256|XP_001271391.1 gi|119399537|gb|EAW09965.1| Sintase quitina G

911 2733 89 91 995 53 68 7

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus)

gi|1523778|CAA63929.1 Sintase quitina C

889 2667 87 91 967 53 67 6

Aspergillus fumigatus Af293 (A. fumigatus2)

gi|70985514|XP_748263.1 gi|66845891|gb|EAL86225.1| Sintase quitina C

856 2568 83 97 957 52 66 5

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus3)

gi|83301407|Q92197 Sintase quitina C (Classe-III)

893 2679 89 91 983 53 68 5

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus4)

gi|1353638|AAB07679.1 Sintase quitina G (classE III)

911 2733 89 95 987 51 66 6

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus5)

gi|1197187|CAA63928.1 Sintase quitina G

911 2733 89 95 990 51 66 6

Aspergillus fumigatus Af293 (A. fumigatus6)

gi|70998925|XP_754184.1 gi|6166003|sp|P54267| gi|1353636|gb|AAB07678.1|

gi|66851821|gb|EAL92146.1| Sintase quitina G (Classe III) 911 2733 89 95 993 51 66 6

Aspergillus nidulans FGSC A4 (A. nidulans)

gi|67528338|XP_661971.1 gi|40741338|gb|EAA60528.1| Proteína hipotética AN4367.2

905 2715 85 87 916 53 67 6

Aspergillus nidulans FGSC A4 (A. nidulans2)

gi|67524131|XP_660127.1 gi|40745472|gb|EAA64628.1| Sintase quitina B

916 2748 98 95 1007 51 65 9

Aspergillus niger (A. niger)

gi|145247670|ref|XP_001396084.1 Proteína hipotética An12g10380

884 2652 88 90 815 52 68 4

Aspergillus niger (A. niger2)

gi|134058200|emb|CAK38392.1| gi|145235725|XP_001390511.1 Proteína hipotética An03g06360

873 2619 90 92 974 53 68 5

Aspergillus niger (A. niger3)

gi|145242142|XP_001393717.1 gi|134078262|emb|CAK96843.1 Proteína hipotética

914 2742 98 95 992 50 64 9

Aspergillus oryzae (A. oryzae)

gi|83769560|BAE59695.1 Produto de proteína não nomeado

876 2628 86 89 931 54 68 4

Aspergillus oryzae (A. oryzae2)

gi|134080824|emb|CAK41385.1|gi|19071963|BAB85683.1 Proteína hipotética An12g10380

893 2679 86 99 952 49 63 7

Aspergillus oryzae (A. oryzae3)

gi|13641436|AAK31732.1 gi|83772151|dbj|BAE62281.1 Sintase quitina

916 2748 97 94 970 50 64 9

72

Aspergillus terreus NIH2624 (A. terreus)

gi|114190488|gb|EAU32188.1| Sintase quitina C

896 2688 86 90 938 52 66 7

Aspergillus terreus NIH2624 (A. terreus2)

gi|115390352|XP_001212681.1 gi|114195077|gb|EAU36777.1| Sintase da quitina G

915 2745 99 95 1007 51 66 8

Botryotinia fuckeliana (B. fuckeliana)

gi|20162483|AAM14606.1 | Sintase da quitina classe III

911 2733 89 90 1008 54 68 6

Botryotinia fuckeliana (B. fuckeliana2)

gi|22212820|AAM94406.1 Sintase quitina classe III

904 2712 87 90 882 49 65 7

Chaetomium globosum CBS 148.51

(C. globosum)

gi|88184893|gb|EAQ92361.1| gi|116179936|XP_001219817.1 Sintase quitina 1

906 2718 87 88 967 53 68 6

Coccidioides immitis RS (C. immitis)

gi|119191199|XP_001246206.1| gi|90304992|gb|EAS34623.1 Sintase da quitina G

903 2709 99 96 1039 52 66 7

Coccidioides posadasii (C. posadasii)

gi|10436182|AAG16851.1 Sintase da quitina classe III

755 2265 99 96 1039 64 75 7

Coprinopsis cinerea okayama 7#130

(C. cinerea)

gi|116504282|gb|EAU87177.1| Proteína hipotética CC1G_05866

864 2595 89 95 1240 64 76 6

Coprinopsis cinerea okayama 7#130

(C. cinerea2)

gi|116501858|gb|EAU84753.1| Proteína hipotética CC1G_00272

824 2475 92 100 1535 76 85 2

Cryptococcus neoformans var. neoformans B-3501ª

(Filobasidiella neoformans) (C. neoformans)

gi|134112149|ref|XP_775263.1| gi|50257918|gb|EAL20616.1| Proteína hipotética CNBE3240

901 2706 86 90 1232 64 75 6

Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21 (C. neoformans2)

gi|58267452|XP_570882.1 755 2265 81 99 1168 64 75 7

(Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21

(Filobasidiella neoformans ) (C. neoformans3)

gi|71064312|gb|AAW43575.2| Sintase da quitina 7

931 2796 98 99 1239 58 70 8

Emericella nidulans (E. nidulans)

gi|1091875|prf||2022175B | gi|6166002|Q00757 gi|465391|dbj|BAA04807.1 gi|1732431|dbj|BAA11845.1

Sintase da B (Classe-III) 916 2748 98 95 1008 51 65 9

Exophiala dermatitidis (E. dermatidis)

gi|3582755|gb|AAC35278.1|gi|6165999|P30602 Sintase da quitina 3 (Classe-III)

885 2655 84 85 1016 57 71 6

Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici

(F. oxysporum)

gi|50429187|AAT77183.1 Sintase quitina class III

978 2934 89 83 907 52 67 5

Gibberella zeae PH-1 (G. zeae)

gi|46137201|XP_390292.1 Proteína hipotética FG10116.1

905 2715 85 85 924 53 68 4

Gibberella zeae PH-1 (G. zeae2)

gi|46115152|XP_383594.1 Proteína hipotética FG03418.1

995 2985 85 77 889 53 68 4

Glomerella graminicola gi|19068024|AAL23718.1 912 2736 97 96 996 51 65 8

73

(G. gramminicola) Sintase quitina B Magnaporthe grisea 70-15

(M. grisea) gi|145613215|XP_363876.2

gi|145020341|gb|EDK04470.1 Sintase quitina 2 929 2787 94 93 979 51 66 7

Neosartorya fischeri NRRL 181 (N. fischeri)

gi|119499407|XP_001266461.1 gi|119414625|gb|EAW24564.1| Sintase quitina C

856 2568 83 89 962 56 70 3

Neosartorya fischeri NRRL 181 (N. fischeri2)

gi|119474341|XP_001259046.1| gi|119407199|gb|EAW17149.1|

Sintase quitina 788 2364 86 99 966 54 69 4

Neosartorya fischeri NRRL 181 (N. fischeri3)

gi|119490296|XP_001263020.1 gi|119411180|gb|EAW21123.1| Sintase quitina G

911 2733 89 95 993 51 66 6

Neurospora crassa (N. crassa)

gi|67476617|P29070 gi|18376397|emb|CAD21286 Sintase quitina 1 (Classe-III).

917 2751 88 88 964962 53 68 5

Neurospora crassa 80 (N. crassa2)

gi|168773|AAA33568.1 gi|228519|prf||1805248A Sintase quitina: ISOTYPE=1

960 2880 80 87 920 53 68 4

Neurospora crassa OR74A (N. crassa3)

gi|85102490|XP_961338.1|gi|28922882|gb|EAA32102.1 Sintase quitina 3

960 2880 83 79 948 55 70 4

Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum)

gi|6166424|AAF04828.1 Sintase quitina classe III

915 2745 97 94 989 50 65 9

Pleurotus ostreatus (P. ostreatus)

gi|118420983|dbj|BAF37219.1| gi|119224834|dbj|BAF41224.1| Sintase da quitina

938 2817 100 100 1472 67 76 7

Puccinia graminis f. sp. tritici (P. graminis)

gi|81296277|gb|ABB70408.1| Sintase da quitina hipotética classe III

868 2607 90 93 1160 60 73 6

Puccinia graminis f. sp. tritici (P. graminis2)

gi|81296279|gb|ABB70409.1| Sintase da quitina hipotética classeIII

977 2934 97 99 1027 50 63 13

Tuber borchii (T. borchii)

gi|14275780|CAC39621.1 | Sintase da quitina classe III

892 2676 89 90 1025 55 69 6

Ustilago maydis (U. maydis)

gi|122065152|sp|P30598|CHS1_USTMA Sintase quitina 1 (Chitin-UDP acetil-glicosaminiltransferase 1)

939 2820 97 95 1217 58 71 7

1 - O cDNA inclui o códon de terminação (tamanho da proteína x 3) +3. 2 - O gDNA inclui o códon de terminação. 3 - Cálculo do percentual da cobertura da seqüência: (posição final – posição inicial do alinhamento) +1 ⁄ tamanho original da seqüência (obs. Somar com uma unidade corresponde a fórmula matemática do cálculo de intervalos). Obs: arrendondamento quando igual ou superior a metade de uma unidade (0,5). 4 - Em azul estão identificados os Basidiomycota e em preto os Ascomycota.

74

5.2. Resultados em Química Computacional

Após a determinação da seqüência de nucleotídeos e posterior tradução para

aminoácido, optou-se por selecionar apenas uma região para a construção da

estrutura 3D (Figura 27). Esta decisão justifica-se pela dificuldade em modelar

proteínas de membrana celular, descrita em literatura (SALI, SANCHEZ, 1998) e

pela ausência de moldes que contemplassem todo o gene descrito. A escolha da

região a ser modelada considerou o fato desta ser uma região de grande

similaridade com o gene de outros fungos como, por exemplo, dos Basidiomycota

com seqüências completas da sintase da quitina e, principalmente, pela presença

do motif QRRRW, provável região do sítio catalítico do produto gênico em estudo.

Sendo assim, a região escolhida compõe-se por 281 resíduos, estando eles na

posição 325-606 da provável sintase da quitina de M. perniciosa. Uma análise

realizada pelo EditSeq/Lasrgene (BURLAND, 2000) mostrou que o fragmento

apresenta uma massa molecular de cerca de 32,08 KDa. Dos aminoácidos que o

compõem, 31 são básicos (Lys, Arg), 22 ácidos (Asp, Glu), 118 hidrofóbicos (Ala,

Ile, Leu, Phe, Trp, Val) e 63 polares (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr).

Para esta região foi feito o PSI-BLAST contra o PDB

(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) para buscar estruturas que pudessem

servir de molde para a construção do modelo proposto. A ferramenta de busca de

moldes disponível no Swiss PDB Viewer (SPDBV) (versão 3.7) e o BLAST de

proteínas, utilizando a base de dados do PDB, não retornaram resultados

satisfatórios. Por este motivo, a estratégia foi, mais uma vez, fragmentar a

seqüência e, retornar para o BLAST de proteínas contra a base de dados do PDB.

Os fragmentos da seqüência resultaram, para algumas regiões, em diversos

possíveis moldes, sendo escolhido aquele com melhor valor de identidade,

baseado no alinhamento local (Figura 28/Tabela 08).

75

A

B M.perniciosa VGVYQDGVMKKQVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDATPQLVLP--QANDP-NNLVPVQIIFV 333 A.bisporus IGVYQDGVMKKQVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDATPQLVLP--RAEDP-NNLVPVQIIFV 328 C.cinerea VGVYQDGIMKKKVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDDKPQLVLP--QENDDGSNLVPVQIILV 291 C.neoformans IGVFQDGILKKEVDGKKTAAHIFEQYTTQLSIDATPQLVQP--HPGEP-NNLVPVQIIFV 301 U.maydis VGVYQDGVMKRKVDGKDTVAHLFE-YTTQLSVDPTPALIQP--HADDA-SNLVPVQMIFC 376 P.ostreatus VGVYQDGVMKKDVDGKDTVAHIFE-YTTQLSVDAKPQLVLP-TEGNDA-LNLVPVQIIFV 351 P.graminis VGVYQDGLMKKEIDGKETVAHIFE-YTTQLSVDHKPSLVVPTQDGDSK-TNLVPVQMIFC 306 P.graminis2 IGLYQDGIMKRQVDGKETQAHVFE-YTTLLSVSPKPELIQP-H-A NDP-ANLVPVQMTLV 367 :*::***::*:.:***.* **:** *** **:. . * *: * . ******: : M.perniciosa LKAKNQKKINSHRWLFNAIGKILNPEVCVLIDAGTKPGHKSIFYLWKAFYNDPHLGGCCG 393 A.bisporus LKAQNQKKINSHRWLFNAIGRMLNPEICVLIDAGTKPGHKSIYYLWEAFYNDPHLGGCCG 388 C.cinerea VKAKNQKKINSHRWLFNALGRQLNPEICVLIDAGTKPGYKAIYHLWEAFYNNENLGGCAG 351 C.neoformans LKQENSKKINSHRWLFNALGRQLQPEICVLLDAGTKPGHKAIYHLWEAFYNNRNLGGACG 361 U.maydis LKQKNSKKINSHRWLFNALGRHLQPELCVLIDAGTKPGHKSLYYLWEAFYNNANLGGACG 436 P. ostreatus LKAKNQKKINSHRWLFNAIGRMLEPETCVLIDAGTKPGHKSIYYLWEAFYNDRNMGGCCG 411 P.graminis LKQKNSKKINSHRWLFNAIGRQLDPEVCILIDAGTKPGKRSLYYLWQAFHNDRNLGGACG 366 P.graminis2 LKQKNAKKINSHRWLFNAVAAHLEPEVCILIDAGTKPGTRSLYYLWEAFHHNPHMGGACG 427 :* :* ************:. *:** *:*:**** *** ::::: *..* M.perniciosa EIHAMIKGGKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGRP 453 A.bisporus EIHAMIKGGKKLLNPLVAA QNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRFQAITGCP 448 C.cinerea EIYAM--GGKRLLNPLVAA QNFEYKMSNILDKPFESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAIQGRP 409 C.neoformans EIHAMIKKGVKLFNPLVAA QNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYKAIQGRP 421 U.maydis EIHAMIKNGRKLINPLVAA QNFEYKMSNILDKPLESTFGYVSVLPGAFSAYRFRAIQGRP 496 P.ostreatus EIHAMIKGGKKLLNPLVAA QNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGKP 471 P.graminis ETYAMLKGGKKLINPLVAA QNFEYKMSNILDKPLESAFGYVSVLPGAFSAYRFRALSGRP 426 P.graminis2 EIHAMLSRGKKLINPLVAA QNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGRP 487 * :** * :*:********************:* *:***************::*: * * M.perniciosa LEQYFHGDHSLADRLGPKRYYGNEHLHQEHVLAEDRILCFELVAKKNDRWTLTYVKPSKA 513 A.bisporus LEQYFHGDHSLADRLGPKGIYGMNIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAKDRWTLTYVKPSKA 508 C.cinerea LEQYFHGDHSLADRLGEHGINGMSIFQKNMFLAEDRILCFELMAKRGEKWTLGYVKDSKA 469 C.neoformans LTQYFHGDATLAARLGKKGIYGMGIFTKNMFLAEDRILCFELVAKKGEKWVLQYVKPSKA 481 U.maydis LQQYFHGDHTLADRLGKKGLHGMDIFTKNMF LAEDRILCFELVAKAGDKWTLTYVKPSKG 556 P.ostreatus LEQYFHGDHSLADRLGAKGIHGMSIFTKNMFLAEDRILCFELVAKAGDRWTLTYVKPSKA 531 P.graminis LQQYFHGDHTLADRLGKKGLNGMGIFTKNMFLAEDRILCFELAAKANDAWLLSYVRAAKG 486 P.graminis2 LQQYFHGDHSLSERLGKKGIQGMGIFKKNMFLAEDRILCFELVAKAKSRWVLGYVKPAKG 547 * ****** :*: *** : * : :: .**** ******* ** . * * **: :*. M.perniciosa ETDVPESAPELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYQSGHGIFRMFFFHVQALYNIFSL 573 A.bisporus ETDVPESAAELIG QRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYRSGHGIIRMFFLHIQGLYNVFSL 568 C.cinerea ETDVPETAPELIG QRRRWLNGSFAASIYALVHFWRVYQSGHNFVRIFFFHIQALFNAFNL 529 C.neoformans ETDVPEQAAELIS QRRRWLNGSFAASVYSVFHFFRLYRSGHGPIRMLFLHIQAIYNVFSL 541 U.maydis ETDVPEGAAELIS QRRRWLNGSFAASIYSLVHFFRIYKSNHGIIRLFFLHIQALYNAIVL 616 P.ostreatus ETDVPESAAELIG QRRRWLNGSFAASVYALVNFFKIYKSGHGIIRLFFLHLQALYNSFSL 591 P.graminis ETDVPEQAAELIS QRRRWLNGSFAASIYATIHFFRFYKSSHNPIRLLMFHVQALFNIFQL 546 P.graminis2 ETDVPEQAAELIG QRRRWLNGSFAAGIYSLAHFSRMYSSSHGIVRMFFLHVQAFYATAGL 607 ****** ..***.************.:*: :* .* *.*. .*::::*:*.:: * M.perniciosa VFSWFSLANIWLTFSIIIDLLPNL-------------------- PGDTAIIVFGTKAVTH 613 A.bisporus IFSWFALANMWLTFSIIIDLVPSQ----------------------- -GIVIFGTETVTH 604 C.cinerea FFSWFALANLWLTFSIIIDLLPAN-------------------- ------IKGANLVFFH 563 C.neoformans IFSWFALANLWLTFSIIIELLPE-----------------------S ANINLFGTADVTH 578 U.maydis LFSWFALANLWLTFSIIIEFLPDEL-------LKNS------- --------SHTTLVVFH 654 P.ostreatus FFTWFALANLWLTFSIIIDLLPSQG-------VVIISRAFVRLAPS DVNWADFGS-LQAH 643 P.graminis IFTWFSLANLWLTFSIIIELLPQN--------------------- ---GVFLFKDEVITH 582 P.graminis2 IMSWFALGNWFTTFSAIIDIIAENWRDPFLAAGISN--YTLTPPP -SPPNSSEGAQALVA 664 .::**:*.* : **: **:::.

Figura 27: A - Esquema representativo do gene da sintase da quitina de M. perniciosa, a porção em vermelho corresponde à região conservada utilizada na construção da estrutura tridimensional; B: Alinhamento da seqüência da sintase da quitina de M. perniciosa com A. bisporus (CAB96110.1), C. cinerea (EAU87177.1), , C. neoformans (EAL20616.1), U. maydis (sp|P30598) P. ostreatus (BAF37219.1) e P. graminis (ABB70408.1 e ABB70409.1 ), com destaque para a região conservada. Os aminoácidos em vermelho correspondem àqueles utilizados no modelo proposto (Fonte: NOTRADAME et al., 2000 <http://www.tcoffee.org>).

913aa 325 1 606

1 281

76

Achs1 pdb|2D4W|B Cadeia B, Estrutura Cristal da Glicerol quinase de Cellulomonas sp. Nt3060 Extensão = 504 Identitidade = 12/27 (44%), Positividade = 16/27 (5 9%), Gaps = 0/27 (0%)

Query 110 VSVLPGAFSAYRYRAILGRPLEQYFHG 136 V L G A +Y++I+G PL YF G Sbjct 110 VDELGGDEGAEKYKSIVGLPLATYFSG 136

Achs2

pdb|2BYT|D Cadeia D, Thermus thermophilus Leucyl-tRNA Synthetase Complexed With A Trnaleu Transcript Length=878 Identities = 13/33 (39%), Positives = 20/33 (52%), Gaps = 0/38 (0%)

Query 6 VLAEDRILCFELVAKKNDRWTLTYVKPSKAETD 38 VLA + L EL A + L YV+ +K +T+ Sbjct 260 VLAPEHPLTLELAAPEKREEVLAYVEAAKRKTE 292

Achs3 pdb|1Z3X|A Cadeia A, Estructura de Gun4-1 de Thermosynechococcus elongatus Length=238 Identidade = 8/13 (61%), Positividade = 9/13 (69%), Gaps = 3/13 (23%)

Query 7 ELIG---QRRRWL 16 EL G Q+RRWL Sbjct 126 ELAGPLAQKRRWL 138

Achs4 pdb|2HY5|A Cadeia A, Estructura Cristal de Dsrefh Length=130

Identidade = 8/13 (61%), Positividade = 11/13 (84%) , Gaps = 0/13 (0%)

Query 10 QSGHGIFRMFFFH 22 + GH IFR+FF+H Sbjct 29 EKGHEIFRVFFYH 41

Figura 28: PSI-BLAST contra o banco de dados do PDB, mostrando o alinhamento dos fragmentos com os moldes das estruturas correspondentes.

77

Tabela 08: Identificação dos moldes utilizados para construção do modelo 3D da sintase da quitina de M. perniciosa.

Fragmento Molde Identidade Estrutura

Achs1 2D4W (IMADA, et al., 2005)

44 Transferase

Achs2 2BYT (TUKALO, et al., 2005)

39 Sintetase

Achs3 1Z3X (DAVISON, et al., 2005)

61 Ativador de transferase

Achs4 2HY5 (SHIN, et al., 2006)

61 Transferase

(Fonte: Resultado experimental – PSI-BLAST/PDB)

Em resposta à submissão dos projetos (seqüências problemas alinhadas

estruturalmente aos seus respectivos moldes) ao Swiss Model, obtém-se o

resultado finalizado da modelagem por homologia (Figura 29) (GUEX et al., 2001).

Foi necessária a construção de quatro estruturas que contemplaram diferentes

extensões de toda a região conservada (Figura 30).

A B

C D

Figura 29: Resultado da submissão dos projetos dos fragmentos com os moldes da estrutura correspondentes. A – achs1; B – achs2; C – achs3 e D – achs4. (Fonte: Swiss PDB Viewer 3.7).

78

Os modelos foram construídos pelas ferramentas do Swiss PDB Viewer e

foram validados inicialmentepelo Procheck 3.0, o qual gerou o gráfico de

Ramachandran apresentado na Figura 31 e Tabela 09. Nos parâmetros do

Ramachandran, considera-se um modelo satisfatório quando este possui 90% dos

resíduos dentro das regiões favoráveis (LASKOWSKI et al., 1994). A

representação de Ramachandran é o melhor indicativo da qualidade

estereoquímica do modelo de uma proteína (LASKOWSKI, et al., 1993).

Posteriormente utilizou-se o BioMedCache 6.1, para construiu as ligações

peptídicas, formando uma única proteína onde a seqüência primária foi respeitada.

Em seguida, a molécula foi neutralizada pelo programa tLEaP, presente no pacote

Amber 8.0, sendo adicionados 09 íons cloretos (Cl-) a estrutura. Após a construção

partiu-se para determinação do valor de cutoff através do BiomedCache 6.0, onde

foi calculado valores de 3 a 20 Å . Os resultados obtidos apontaram o cutoff 14 com

sendo o valor ideal para posteriores cálculos da estrutura resultante.

O modelo inicial da região conservada da sintase da quitina de M.

perniciosa, denominado de 0CSM, é composto por 281 aminoácidos, formados por

4.571 átomos, unidos por 4.630 ligações químicas. Em análise realizada pelo VDM

(Versão 1.8.6), com um cutoff padronizado para 3,2 Ǻ, o modelo possui 03 ligações

salinas (Asp-100-Arg206; Asp192-Lys94 e Glu158-Arg143), que são elementos que

influenciam positivamente em sua estabilidade.

Em sua extensão, este modelo apresenta 10 α-hélices, 11 folhas-β e 22

turns. As α-hélices são as estruturas mais facilmente reconhecidas e ocorre devido

à semelhança nos ângulos de torção dos carbonos-α (Figura 32). Nas α-hélices do

modelo 3D gerado ocorrem 03 prolinas (Pro62, Pro114 e Pro186) em diferentes

hélices. De acordo com Höltje et al., (2003) o aminoácido prolina normalmente não

ocorre nas α-hélices devido a sua incompatibilidade estrutural (forma cíclica com

presença de nitrogênio), mas pode aparecer nas proteínas transmembranares,

como é o caso da sintase da quitina. A presença da prolina pode gerar distorções

locais na geometria da hélice.

79

A B

C D

E Figura 30: Modelos construídos a partir das seqüências fragmentadas. Em A: Estrutura resultante da submissão do fragmento achs1 com o molde 2D4W; B: fragmento achs2 com o molde 2BYT; C: fragmento achs3 com o molde 1Z3X; D: fragmento achs4 com o molde 2HY5 e E: modelo 0CSM, resultante da junção dos modelos iniciais gerados no Swiss Model, sem refinamento, para a região conservada da sintase da quitina (Fonte: VMD 1.8.6, HUMPHREY et al., 1996).

80

A B

C D

Figura 31: Validação representada pelo gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) dos fragmentos que compõem o modelo 3D da região conservada da sintase da quitina. Em A - fragmento achs1; B - fragmento achs2; C: fragmento achs3 e D: fragmento achs4.

Tabela 09: Sumário dos gráficos de Ramachandran para os fragmentos que compõem o modelo 3D da região conservada da sintase da quitina.

Posição dos resíduos (%)

Fragmento Favorável Permitido Aceitável Desfavoráve l A - achs1 87,8 9,6 2,6 0,0 B - achs2 84,6 15,4 0,0 0,0 C - achs3 89,5 5,3 0,0 5,3 * D - achs4 93,0 5,3 1,8 0,0

*Representa a apenas 01 aminoácido (Glu7, correspondente ao Glu199 do modelo integral).

81

Sete folhas-β paralelas e 4 antiparalelas podem ser encontradas no modelo

proposto. Em geral, as folhas paralelas (4 ou mais) são mais comuns que as

antiparalelas (2 a 3) (HÖLTJE et al., 2003). Este também é um outro tipo estrutural

facilmente reconhecido e é parte de um sistema mais complexo, pois, ao contrário

das α-hélices, neste arranjo as ligações de hidrogênio não são estabelecidas de

forma intramolecular, mas sim, intermolecular, o que faz com que elas sejam

energeticamente menos favoráveis. As folhas antiparalelas podem ser compostas

por várias cadeias que podem se distribuir por várias partes da seqüência,

podendo ser composto por aminoácidos hidrofílicos, como os resíduos Asn14,

Gln15, Ser20, Gly29 e Thr44, ou hidrofóbicos, (Val9, Phe8, Ala12, Ile18, e Leu32),

que compõe o modelo proposto (HÖLTJE et al., 2003).

Neste modelo têm-se ainda turns, que são as estruturas que revertem a

direção da cadeia do polipeptídio e podem conectar as folhas-β. Um terço dos

resíduos de uma proteína geralmente estão envolvidos com a formação de turns,

que são predominantemente constituídos por aminoácidos polares com cargas,

como os resíduos Glu70, His72, Lys101, Asp192 e Arg234 (SIBANDA,

THORNTON, 1985) deste modelo.

A B

Figura 32: Destaque para as α-hélices (A) e folhas-β (B) que compõem o modelo proposto.

A qualidade geométrica do modelo 0CSM foi avaliada pelo programa

Procheck (Versão 3.0), como pode ser observado nas figuras 33-36 e,

adicionalmente, pelo software ANOLEA, disponível no Swiss Model. O gráfico de

82

Ramachandran (Figura 33A) tem 93,5% dos resíduos na região favorável e 6,5%

em área desfavorável, o que significa apenas um resíduo (Glu199). De forma

semelhante, o Procheck analisa separadamente os resíduos de glicina e prolina,

conforme é mostrado pelas figuras 33B e 33C, respectivamente. Esta separação é

necessária, pois estes aminoácidos apresentam diferenças estereoquímicas, e isso

requer diferentes características em suas regiões favoráveis ou desfavoráveis

(LASKOWSKI et al., 1993). A figura 36 (A –Q) mostra a qualidade estereoquímicas

dos ângulos de torção da cadeia lateral de todos os aminoácidos. A figura 35 avalia

a qualidade do gráfico de Ramachandran obtido, planaridade das ligações

peptídicas, má interação entre os átomos não-ligados e energia de ligação de

hidrogênio na cadeia principal. Nestas representações o desejado é que o modelo

em estudo, representado pelo ponto em preto, atinja o núcleo da região sombreada

(LASKOWSKI et al., 1994).

83

A

B C

Figura 33: Gráfico de Ramachandran (Procheck 3.0) do modelo 0CSM da região conservada da sintase da quitina. Em A: Ramachandran da estrutura; B: Ramachandran da Glicina e C: Ramachandran da Prolina, onde se pode notar, em destaque vermelho para os resíduos em região desfavorável (Fonte: Procheck 3.0).

84

Figura 34: De A até N - Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com o ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).

A B C D

E F G H

I J K L

M N

85

Figura 35: Analise da cadeia principal do modelo 0CSM: A - avaliação do gráfico de Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins entre os átomos não-ligados; D - distorção dos angulos tetraedricos dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

A B

C D

E

86

Figura 36: Análise da cadeia lateral do modelo 0CSM da região conservada da sintase da quitina: A - Conformação gauche menos; B - Conformação trans; C - Conformação gauche mais; D - Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E - Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

A B

C D

E

87

Em todas as validações citadas obteve-se um resultado satisfatório para o

modelo inicial proposto. No entanto, a análise de energia obtida através da

representação do gráfico de ANOLEA (MELO, FEYTMANS, 1998), que calcula o

desempenho de cada residuo da cadeia de proteína apresentou um resultado

insatisfatório para uma maioria, como pode ser observado no gráfico da figura 37.

Por esta análise apenas os resíduos Pro3 (-5,803), Val4 (-17,803), Gln5 (-23,381),

Ile6 (-24.101), Ile7 (-19.781), Phe8 (-11,351), Val9 (-8,798), Leu10 (-6,707), Lys11

(-4,274), Ala12 (-5,642), Lys13 (-8,093), Asn14 (-3,671), Gln15 (-1,145), Lys16 (-

5,567), Lys17 (-4,084), Ile18 (-3,045), Asn18 (-5,611), Ser20 (-4,692) Ile28 (-2.793),

Gly29 (-7.187) Lys30 (-8.932), Ile31 (-8.574), Leu32 (-5.811), Asn33 (-3.815),

Met74 (-8.124), Ile75 (-9.170), Lys76 (-15.529), Gly77 (-12.857), Gly78 (-7.355)

Lys79 (-2.072), Arg128 (-1.980), Pro129 (-1.987), Leu130 (-2.345) apresentaram

um valor de energia negativo, sendo que a maior parte deles (80,43%) obteve um

valor positivo e, portanto, insatisfatório. Esta validação apresentou um valor total de

energia de 16910,907 E/kT. A energia do gráfico do ANOLEA é dada pela razão

entre a energia (E) e a constante de Boltzmann (k = 0,582 kcal/mol) pela

temperatura (MELO, FEYTMANS, 1998).

Figura 37: Gráfico do ANOLEA (energia potencial de cada átomo na cadeia de proteína). As projeções em vermelho referem-se a um valor positivo de energia potencial para cada resíduo, e as projeções em verde identificam os valores de energia que são satisfatórios, ou seja, os valores negativos (Fonte: Swiss Model).

88

A estratégia para melhorar a qualidade da estrutura 3D e torná-la

energeticamente mais favorável cosistiu em submeter o modelo gerado à dinâmica

molecular. O processo foi desenvolvido em dois diferentes campos de força, o

MM3 que foi realizado no BioMedCache e o ff99, no Amber, sendo que esse

processo utilizou os seguintes parâmetros: i) imin=1, realiza a otimização da

estrutura; ii) maxcyc=600, número máximo de ciclos; iii) ncyc=300, números de

ciclos necessários para a mudança de Steeptest Descent para Gradiente

Conjugado; iv) cut=14, valor de cutoff; v) ntb=0, manter volume constante; vi)

igb=0, não incluir modelo de solvatação. Ao fim do processo foram obtidos 08

modelos que estão sumarizados na tabela 10. No BioMedCache seguiu-se um

protocolo que consiste em submeter a molécula a uma dinâmica seriada, levando-

se em conta o número de α-hélices presentes no modelo. Para o cálculo de

dinâmica de cada hélice, a molécula de menor energia de superfície gerada

durante a dinâmica foi utilizada no passo seguinte. Alguns dos gráficos gerados

pela dinâmica molecular realizada no Amber e no BioMedCache 6.1 podem ser

visualizados, respectivamente nas Figuras 38 e 39.

Tabela 10: Sumário dos modelos gerados para a região conservada do gene da sintase da quitina destacando o resultado da validação representada pelo gráfico de Ramachandran realizada pelo Procheck 3.0

Posição dos resíduos (%) Software

utilizado Modelo Favorável Não

favorável

Metodologia

Aplicada

AMBER 8.0 e BioMedCache 6.1

0csm 93,5 6,5 Modelo inicial gerado por homologia

neutralizado

BioMedCache 6.1 csc1 86,5 13,5 Após a DM + Otimização travada

BioMedCache 6.1 csc2 86,6 13,4 Após a DM + Otimização “relaxada”

AMBER 8.0 1csm 96,3 3,7 Modelo otimizado por 800 ciclos/300 K

AMBER 8.0 2csm 91,0 9,0 Dinâmica Molecular 300 ps/300 K

AMBER 8.0 3csm 94,1 5,9 Modelo gerado por homologia

Dinâmica Molecular 1000 ps/300 K

AMBER 8.0 4csm 94,5 5,5 Modelo gerado por homologia

Dinâmica Molecular 2000 ps/300 K

AMBER 8.0 5csm 92,3 7,7 Modelo gerado por homologia

Dinâmica Molecular 3000 ps/300 K

89

Como pode ser observado pela figura 38 e 39, o valor de rms, determinado

sempre em relação à estrutura de partida, torna-se praticamente constante. Na

figura 39, após atingir 600 x (103) Kcal/mol não há variação significativa em sua

geometria, atingindo uma estrutura de equilíbrio.

A B

C D Figura 38: Mapas gerados pela dinâmica realizada pelo BioMedCache 6.1. Os pontos em cinza indicam a posição das moléculas de menor energia. Em A: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h3; B: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h4, C: Dinâmica Molecular realizada para a Hélice h5 e D: Dinâmica Molecular realizada A Hélice h6.

Nesta figura, pode ser observado que a cada simulação a proteína assume

uma conformação de menor energia na SPE, a qual é indicado por um ponto nos

gráficos de energia potencial pelo tempo. As simulações iniciais, mostradas através

das figuras 38 A e B, possuem estruturas com alto valor de energia, sendo

mostrado pelas cores verde, amarelo e vermelho. No entanto, durante as

simulações seguintes, figuras 38C e D, a proteína atinge o seu equilíbrio

termodinâmico, não havendo variações nos valores da energia potencial (cor azul).

90

0

100

200

300

400

500

600

700

2.40

25.4

0

48.4

0

71.4

0

94.4

0

117.

40

140.

40

163.

40

186.

40

209.

40

232.

40

255.

40

278.

40

301.

40

324.

40

347.

40

370.

40

393.

40

416.

40

439.

40

462.

40

485.

40

Figura 39: Mapa gerado pela dinâmica molecular de 200 ps realizada pelo Amber 8.0.

Os modelos resultantes das dinâmicas realizadas pelo campo de força MM3

apresentaram incongruências na posição de alguns resíduos demonstrados pela

validação do Procheck e também do ANOLEA. No entanto, os modelos gerados

pela dinâmica molecular (300, 1000, 2000 e 3000 picossegundos) no campo de

força ff99 do Amber resultaram em um melhor arranjo espacial da cadeia principal

na representação de Ramachandran (91,0, 94,1, 94,5 e 92,3%, respectivamente), e

mesmo tendo havido uma redução da qualidade dos parâmetros da cadeia

principal, pode-se perceber um um aumento da qualidade do modelo nas cadeias

laterais. Considerando a análise feita no ANOLEA, obteve-se uma melhor energia

total (-1006,215 /kT) para o modelo submetido à dinâmica do Amber com 2000 ps,

denominado 4CSM, como pode ser visualizado na figura 40, sendo que, neste

modelo, apenas 14,84% dos resíduos (Tabela 11) apresentaram uma energia

positiva.

En

ergi

a R

elat

iva

(101

000

Kca

l/m

ol)

91

A B

C D

E F

G

Figura 40: Representação gráfica da validação dos modelos do gene da sintase da quitina após a realização da dinâmica molecular. A e B – Modelos CHS-a1 e CHS-a2, submetidos ao campo de força MM3 (BioMedCache), C, D, E, F e G – Modelos 1csm, 2csm, 3csm, 4csm e 5csm, respectivamente, resultantes do campo de força ff99 (Amber). Destaque, em vermelho, para o grafico que a presentou o melhor valor de energia (Fonte: ANOLEA).

92

Tabela 11: Sumário dos resíduos de aminoácidos que apresentaram valor de energia positiva na análise do ANOLEA gerado para o modelo 4csm. *E/kT: E = Energia; kT = Constante de Boltz-mann que corresponde a 0,582 kcal/mol

(MELO, FEYTMANS, 1998).

Comparando os métodos utilizados para o refinamento do modelo, podemos

observar que a qualidade dos modelos gerados pelo Amber foram melhores do que

os modelos obtidos pelo MM3. Isto pode ser explicado por dois fatos. Primeiro, o

Amber é executado utilizando sempre dois arquivos (topológicos e coordenadas)

como inputs, tornando assim os cálculos mais eficientes por incluir maiores

informações sobre a proteína. Segundo, os termos de parametrização no campo de

força e da equação podem estar influenciando de forma intrínseca ao sistema

(CASE, et al., 2004). Assim, o Amber foi capaz de gerar um modelo a qual foi

capaz em satisfazer as exigências de duas metodologias de validação distintas,

Procheck e ANOLEA.

Após o refinamento do modelo, pôde-se chegar a uma estrutura protéica

cuja energia potencial de -1498,6502 Kcal/mol pelo Amber. De acordo com o

gráfico de Ramachandran (Figura 41), 94,5% dos resíduos encontram-se em

regiões energeticamente favoráveis. Na validação da cadeia principal e da cadeia

lateral, verificados pelo Procheck (Figura 42 e 43), nota-se que o modelo

submetido ao refinamento e a dinâmica molecular, 4csm, possui uma melhor

qualidade em relação ao modelo 0csm (Figuras 33-36), e também foi o que melhor

respondeu às análises do ANOLEA sendo, portanto, o modelo 3D proposto para o

estudo da região do provável sítio catalítico sintase da quitina de M. perniciosa.

Identidade do

Resíduo

Energia (E/kT)*

Nº de contatos

Identidade do

Resíduo

Energia (E/kT)*

Nº de contatos

Leu1 0,000 190 Lys147 25,723 284 Val2 0,000 66 Arg148 27,123 246 Val38 0,058 11 Tyr149 26,800 184

Phe107 30,186 190 Ala173 0,076 0 Gly108 32,280 113 Asp177 0,169 0 Tyr109 34,719 503 Trp179 0,162 44 Val110 36,003 130 Gly231 4,406 59 Ser111 35,366 128 Ile259 0,252 140 Ser118 0,030 41 Pro271 0,535 285 Leu144 0,365 165 Ile280 0,000 69 Gly145 25,375 87 Val281 0,000 232 Pro146 27,044 145

93

A

B C Figura 41: Gráfico de Ramachandran para o modelo 4csm proposto para a região conservada da sintase da quitina do M. perniciosa.

94

Figura 42: Analise da cadeia principal do modelo 4csm: A - avaliação do gráfico de Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações ruins entre os átomos não-ligados; D - distorção dos angulos tetraedricos dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

A B

C D

E

95

Figura 43: Análise da cadeia lateral do modelo 4CSM da região conservada da sintase da quitina: A - Conformação gauche menos; B - Conformação trans; C - Conformação gauche mais; D - Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E - Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

A B

C D

E

96

Após a DM, em análise realizada pelo VDM (Versão 1.8.6), com um cutoff

padronizado para 3,2 Ǻ, o modelo possui que inicialmente apresentou apenas 3

pontes salinas, passou a presentar 16 ligações salinas (Glu153-Arg121; Asp177-

Lys174; Asp41-Arg204; Asp100-Arg206; Glu195-Lys94; Glu170-Arg128; Glu35-

Arg206; Glu158-Arg143; Glu104-Arg148; Glu35-Lys45; Asp164-Lys79; Glu35-

Lys11; Asp100-Lys80; Asp100-Lys11; Asp192-Lys49 e Glu163-Lys79). A região

descrita como provável sítio catalítico foi construída a partir do molde 1Z3X. Este

sítio compreende os resíduos 190-194. Os aminoácidos 190-192 e 193-194

assumem uma conformação α–hélice e turn, respectivamente. Como pode ser

observado pela figura 43A, estas estruturas secundárias localizam-se

essencialmente em uma região mais externa da proteína, ou seja, estão expostos

ao solvente. A figura 43B mostra detalhes do arranjo espacial do sítio ativo, o qual

as cadeias laterais dos aminoácidos Arg191, Arg193 e Trp194 estão direcionados

para a parte externa da proteína, enquanto que nos aminoácidos Gln190 e Arg192

estas estão direcionados para o interior. Neste ambiente enzimático, o ligante pode

complexar-se com os nitrogênios protonados das argininas 191 e 193 através de

ligação de hidrogênio. Adicionalmente o ligante pode realizar uma interação com o

Trp194, através de uma outra ligação de hidrogênio e/ou com uma interação

hidrofóbica. Com isso, têm-se indicações para o design de ligantes inibidores da

sintase da quitina. A figura 43C mostra em destaque as estruturas secundárias

presentes na proteína resultante.

97

Figura 44: Modelo 4CSM final. A - Destaque para a região do provável domínio catalítico do gene da sintase da quitina do Moniliophthora perniciosa; B - Região do provável domínio catalítico em destaque e C – Representação tridimensional do modelo 4CSM (Amber) gerado pelo VMD 1.8.6. Os hidrogênios dos átomos de carbono foram suprimidos para uma melhor visualização.

A

B

C

98

6. CONCLUSÃO

As análises das seqüências do banco de dados do Projeto Genoma, a

amplificação dos fragmentos alvo por PCR, que atenderam aos tamanhos

esperados e cobriram os intervalos existentes, e o posterior seqüenciamento

completo por primer walking, indicam que um gene da sintase da quitina de M.

perniciosa foi totalmente identificado e caracterizado.

Este gene compreende 3443 pb, organizado em 14 éxons e 13 íntrons,

compreendendo um cDNA com uma fase de leitura aberta com 2739 pb e

codificando uma proteína com 913 aa.

O produto gênico obtido apresenta extensas regiões conservadas e

significativa similaridade com as seqüências das sintases da quitina de outros

Basidomycota (principalmente) e Ascomycota, com a ocorrência de motifs que o

caracterizam como pertencente à Classe III e Divisão 1 das sintases da quitina,

assim como a maioria das sintases da quitina de fungos.

De posse da seqüência primária da sintase da quitina, foi construído um

modelo 3D da sintase da quitina (0csm) por modelagem comparativa. Esta foi

submetida a diferentes processos de refinamento, usando dois métodos MM bem

distintos, gerando 06 modelos finais. Estes foram respectivamente validados sendo

o modelo denominado de 4csm, obtido a partir do Amber, o que apresentou os

melhores resultados frente ao Procheck e ANOLEA, embora a identidade entre a

seqüência problema e os moldes tenha sido inferior à 30%. Isso também mostra

que a intervenção humana é melhor sucedida para a construção de modelos

protéicos do que os processos automatizados por homologia.

Como perspectivas futuras, sugerem-se: (i) a identificação do número de

cópias do gene por Southern Blot, (ii) o isolamento e clonagem do cDNA deste

gene, (iii) expressão heteróloga, purificação e caracterização da proteína

recombinante e (iv) a seleção e teste de inibidores específicos da sintase da quitina

de M. perniciosa in vitro e in vivo.

A continuação destes estudos, in silico e experimentalmente, é uma

estratégia essencial para desenvolvimento de inibidores específicos para o

fitopatógeno do cacau. O modelo 3D proposto, não somente possui um sítio ativo

bem definido, mas também outros elementos que compõe o ambiente protéico e

pode ser utilizado em posteriores estudos de interação ligante-receptor por

99

metodologias de docking, QM/MM e simulações Car-Parrinello, inclusive

considerando o efeito do solvente.

100

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Apêndices

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Apêndice I >Provável protéina da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa com 913 aa MANRPPLPSNASSSTVNDPYADPFADRPRQTHFTEPQHPYPSQASIPRPFESATSLPQEFGARDQQFEEDDYVEKQPLTGGQAFAGGFYPPGPVDPEAYGDPYAGSRPASVVSSSTGGEKSAWRRRQTIKRGVTRKVKLTKGNFITEYPVPTPILSATEAKYTATSTTEFSHMRYTAATCDPDEFSEANGYSLRTKMYNRETELLIAVTSYNEDKTLYARTLHGVMLNIRDICKTKQSKYWRRQAEEGNPGWQKITVALIVDGLEPMDKSVLDILATVGVYQDGVMKKQVDGKDTVAHIFEYTTQLSVDATPQLVLPQANDPNNLVPVQIIFVLKAKNQKKINSHRWLFNAIGKILNPEVCVLI DAGTKPGHKSIFYLWKAFYNDPHLGGCCGEIHAMIKGGKKLLNPLVAAQNFEYKMSNILDKPLESSFGYVSVLPGAFSAYRYRAILGRPLEQYFHGDHSLADRLGPKRYYGNEHLHQEHVLAEDRIL CFELVAKKNDRWTLTYVKPSKAETDVPESAPELIGQRRRWLNGSFAASVYALVNFFKLYQSGHGIFRMFFFHVQALYNIFSLVFSWFSLANIWLTFSIIIDLLPNLPGDTAIIV FGTKAVTHWVNFGFKWIYLAFLALQFVLALGNRPKGERAAYTVTLWVYAILALYLLVVYAILALYLLVCSFWLTIQAFQNIPKLVQANGGDAIKTLFQGPVGALIAAMFSTYGIYIIASFLYRDPWHMFSSFFQYLLLAPSFTNVLNVYAFCNLHDVSWGTKGSDKAEALPSVSSSKAKDADVAVVEDTAKVQEDVDAAFKETVTRAVTKIETKEEIEKPTMDDQNKTFRTRLVAFWMLSNASLAVAISNLNGLPSSNPAQDEKDLADKQSTYFNIILYSTFGLAFVRFIGCLWYFFKRNLFRCCRRN >Provável cDNA da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa 2739 pb (gDNA = 3440 + códon de terminação, 14 exons, 13 in trons) ATGGCGAATCGCCCGCCACTCCCTTCAAATGCTTCTAGCTCTACAGTCAATGATCCTTATGCAGACCCGTTTGCAGACCGTCCTCGGCAGACCCACTTTACTGAACCCCAGCACCCTTATCCTTCACAAGCCAGCATTCCTCGTCCTTTCGAGAGCGCGACTTCTCTGCCGCAGGAGTTTGGAGCACGGGACCAGCAGTTCGAAGAAGATGACTACGTAGAAAAGCAACCGTTGACAGGCGGACAAGCGTTCGCTGGCGGGTTCTATCCACCAGGTCCTGTTGATCCTGAGGCCTATGGCGATCCTTATGCTGGGAGTCGCCCTGCTTCCGTCGTGTCATCGTCGACAGGCGGTGAAAAAAGTGCATGGCGACGACGACAGACCATCAAGCGTGGTGTTACCCGCAAGGTCAAACTGACCAAGGGCAACTTCATCACCGAGTATCCAGTCCCTACACCTATTCTCAGCGCGACAGAAGCCAAATATACTGCCACGTCCACAACCGAGTTTTCGCATATGCGATACACAGCTGCAACATGCGATCCGGATGAATTTTCAGAGGCCAACGGTTACTCACTGCGAACAAAGATGTACAACCGTGAGACCGAGCTTCTTATTGCCGTTACGTCATACAACGAAGACAAGACGCTCTACGCCCGTACTCTGCATGGCGTCATGCTGAACATTCGTGACATTTGCAAGACAAAGCAATCCAAATACTGGCGTCGACAGGCCGAGGAAGGCAATCCAGGGTGGCAAAAGATCACCGTTGCGTTGATTGTAGATGGACTTGAACCAATGGACAAGAGTGTACTGGATATCCTGGCCACCGTGGGCGTATACCAGGACGGCGTCATGAAGAAGCAAGTCGATGGAAAAGACACCGTCGCCCATATTTTCGAGTACACCACTCAATTATCAGTGGATGCCACTCCTCAACTGGTGCTTCCTCAGGCCAACGATCCAAACAACCTGGTTCCTGTTCAAATCATTTTTGTCTTGAAGGCTAAGAATCAGAAGAAGATCAACTCCCACCGTTGGTTGTTCAACGCCATCGGCAAGATTCTCAACCCCGAAGTTTGTGTCTTGATTGATGCGGGTACGAAGCCCGGCCACAAATCAATCTTCTACCTCTGGAAGGCTTTCTATAATGACCCTCACCTCGGTGGTTGCTGTGGTGAAATTCATGCCATGATCAAGGGTGGAAAGAAGCTTCTGAATCCATTGGTTGCCGCTCAAAATTTTGAGTACAAGATGTCCAATATCTTGGACAAACCTCTGGAAAGTAGTTTCGGCTACGTCTCTGTGTTACCTGGTGCTTTCTCAGCGTACCGTTATCGTGCCATCCTCGGACGTCCATtGGAGCAATATttCCATGGGGATCATTCGTTGGCAGACCGGCTCGGACCCAAAAGGTATTACGGAAATGAACATCTTCACCAAGAACATGTCTTGGCCGAAGATCGTATTCTGTGCTTCGAGCTGGTGGCAAAGAAGAATGATAGATGGACGCTGACATACGTGAAACCAAGTAAAGCAGAAACGGATGTGCCAGAATCTGCCCCCGAATTAATCGGTCAGCGTCGTCGTTGGTTGAACGGTTCTTTCGCTGCCTCAGTGTACGCTCTGGTCAATTTCTTCAAACTCTACCAATCTGGCCATGGCATTTTCCGCATGTTCTTCTTCCATGTTCAGGCTTTATACAACATCTTTTCGCTGGTCTTCTCTTGGTTTTCTCTTGCCAACATCTGGTTGACATTTAGTATCATCATCGACTTGCTTCCCAACCTGCCCGGTGATACTGCCATTATAGTGTTTGGCACAAAGGCAGTTACACACTGGGTCAACTTTGGTTTCAAATGGATCTACCTGGCTTTCCTTGCTTTACAATTCGTCCTCGCCCTCGGGAACCGGCCGAAAGGTGAACGTGCAGCATACACGGTTACTTTATGGGTATATGCCATACTCGCTCTTTACTTGCTTGTTGTATATGCCATACTCGCTCTTTACTTGCTTGTTTGCTCTTTCTGGCTTACCATTCAAGCCTTTCAGAACATACCCAAACTGGTCCAGGCAAACGGTGGCGATGCAATCAAGACGCTCTTCCAAGGACCAGTGGGAGCTTTGATCGCAGCCATGTTTTCGACTTATGGTATCTATATCATCGCTTCCTTCCTCTACCGTGATCCTTGGCACATGTTCTCGAGTTTCTTCCAATATCTCTTGTTGGCGCCCAGCTTCACCAATGTACTCAACGTCTATGCGTTCTGCAATCTCCACGATGTCTCGTGGGGTACGAAAGGTAGCGATAAAGCCGAAGCACTACCTTCAGTGTCATCTTCCAAAGCAAAAGACGCTGATGTGGCTGTTGTCGAGGATACCGCAAAGGTCCAAGAGGATGTTGACGCTGCATTCAAGGAAACCGTCACAAGAGCCGTCACCAAAATCGAAACCAAGGAGGAAATTGAAAAGCCTACGATGGACGACCAGAACAAGACATTCCGTACTCGTCTCGTCGCGTTCTGGATGTTGTCCAATGCATCGCTTGCCGTTGCTATTTCAAACTTGAATGGTCTGCCTAGTTCAAACCCTGCCCAAGACGAAAAAGACTTGGCCGACAAGCAGAGCACATATTTCAACATCATCTTGTATTCAACATTTGGTCTTGCTTTCGTTCGTTTCATTGGATGTCTCTGGTACTTCTTCAAGCGCAACCTCTTCAGATGTTGCAGACGGAACTAA

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>Provável gDNA da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa 3440 + códon de terminação, 14 exons (1-275; 329-565; 621-1011; 1064-1231; 1287-1485; 1541-1890; 1947-2027; 2081-2212; 2265-2383; 2 435-2634; 2695-2723; 2775-2876; 2928-3332 e 3390-3440) e 13 íntrons (276-328; 566-620; 1012-1063; 1232-1286; 1486-1540; 1891-1946; 2028-2080; 2 213-2264; 2384-2434; 2635-2694; 2724-2774; 2877-2927; 3333-3389) . ATGGCGAATCGCCCGCCACTCCCTTCAAATGCTTCTAGCTCTACAGTCAATGATCCTTATGCAGACCCGTTTGCAGACCGTCCTCGGCAGACCCACTTTACTGAACCCCAGCACCCTTATCCTTCACAAGCCAGCATTCCTCGTCCTTTCGAGAGCGCGACTTCTCTGCCGCAGGAGTTTGGAGCACGGGACCAGCAGTTCGAAGAAGATGACTACGTAGAAAAGCAACCGTTGACAGGCGGACAAGCGTTCGCTGGCGGGTTCTATCCACCAGGGTGAGCTCTTTTTTTCAGTTATACGTGTTTTATCAGCTCACCTTTGACCTCAGTCCTGTTGATCCTGAGGCCTATGGCGATCCTTATGCTGGGAGTCGCCCTGCTTCCGTCGTGTCATCGTCGACAGGCGGTGAAAAAAGTGCATGGCGACGACGACAGACCATCAAGCGTGGTGTTACCCGCAAGGTCAAACTGACCAAGGGCAACTTCATCACCGAGTATCCAGTCCCTACACCTATTCTCAGCGCGACAGAAGCCAAATATACTGCCACGTCCACAACCGAGTTTTCGTAAGTCCAACTGTCAATCGATCATGTTCTTTTCTTTCTCATTACCCTTGGCCAGGCATATGCGATACACAGCTGCAACATGCGATCCGGATGAATTTTCAGAGGCCAACGGTTACTCACTGCGAACAAAGATGTACAACCGTGAGACCGAGCTTCTTATTGCCGTTACGTCATACAACGAAGACAAGACGCTCTACGCCCGTACTCTGCATGGCGTCATGCTGAACATTCGTGACATTTGCAAGACAAAGCAATCCAAATACTGGCGTCGACAGGCCGAGGAAGGCAATCCAGGGTGGCAAAAGATCACCGTTGCGTTGATTGTAGATGGACTTGAACCAATGGACAAGAGTGTACTGGATATCCTGGCCACCGTGGGCGTATACCAGGACGGCGTCATGAAGAAGCAAGTCGATGGAAAAGACACCGTCGCCCATATTTTCGAGGTTTGTACAAGAGTAATCGTGGCCAAGTTTACAATACTTATTCTACCTATAGTACACCACTCAATTATCAGTGGATGCCACTCCTCAACTGGTGCTTCCTCAGGCCAACGATCCAAACAACCTGGTTCCTGTTCAAATCATTTTTGTCTTGAAGGCTAAGAATCAGAAGAAGATCAACTCCCACCGTTGGTTGTTCAACGCCATCGGCAAGATTCTCAACGTAAGCTTGTTTCTTCGTTGCTATCTGTATACGTGTCTTGATTCGGTATCATCAGCCCGAAGTTTGTGTCTTGATTGATGCGGGTACGAAGCCCGGCCACAAATCAATCTTCTACCTCTGGAAGGCTTTCTATAATGACCCTCACCTCGGTGGTTGCTGTGGTGAAATTCATGCCATGATCAAGGGTGGAAAGAAGCTTCTGAATCCATTGGTTGCCGCTCAAAATTTTGAGTACAAGATGTCCAATATCTTGGGTAAGTTGCACCACTACCACATTGTGTTTGTTCACTCATTCCGTCATCACCACAGACAAACCTCTGGAAAGTAGTTTCGGCTACGTCTCTGTGTTACCTGGTGCTTTCTCAGCGTACCGTTATCGTGCCATCCTCGGACGTCCATtGGAGCAATATttCCATGGGGATCATTCGTTGGCAGACCGGCTCGGACCCAAAAGGTATTACGGAAATGAACATCTTCACCAAGAACATGTCTTGGCCGAAGATCGTATTCTGTGCTTCGAGCTGGTGGCAAAGAAGAATGATAGATGGACGCTGACATACGTGAAACCAAGTAAAGCAGAAACGGATGTGCCAGAATCTGCCCCCGAATTAATCGGTCAGCGTCGTCGTTGGTTGAACGGTTCTTTCGCTGCCTCAGTGGTAAGTTTCCGTGTTTGTCTTTATAATGAGTTGCTGTAATCAAGATGGCTTTCTAGTACGCTCTGGTCAATTTCTTCAAACTCTACCAATCTGGCCATGGCATTTTCCGCATGTTCTTCTTCCATGTTCAGGCTTTAGTAAGTCGCATCTTATTCTACTTTCTGATCATAGATATTCATGCTGTCTCCAGTACAACATCTTTTCGCTGGTCTTCTCTTGGTTTTCTCTTGCCAACATCTGGTTGACATTTAGTATCATCATCGACTTGCTTCCCAACCTGCCCGGTGATACTGCCATTATAGTGTTTGGCACAAAGGCAGTTGTAAGTGCTATGCGTTCGCGATTGACAGGACGAAATTGAAAGCGTCTTCTAGACACACTGGGTCAACTTTGGTTTCAAATGGATCTACCTGGCTTTCCTTGCTTTACAATTCGTCCTCGCCCTCGGGAACCGGCCGAAAGGTGAACGTGCAGCATACACGGTTACTTTATGGTGCGACACACTATAGCTACGTGGATCGAGCTAACATTAATCATGGAATAGGGTATATGCCATACTCGCTCTTTACTTGCTTGTTGTATATGCCATACTCGCTCTTTACTTGCTTGTTTGCTCTTTCTGGCTTACCATTCAAGCCTTTCAGAACATACCCAAACTGGTCCAGGCAAACGGTGGCGATGCAATCAAGACGCTCTTCCAAGGACCAGTGGGAGCTTTGATCGCAGCCATGTTTTCGACTTATGGTGAGCCTTTCAGGTTCTTGGCTTGCTGTCTGGTTGGGCTAACCTGTGAACAACACTTAGGTATCTATATCATCGCTTCCTTCCTCTACGTACGTTGCAGACCTGCGCTTGATGACTACCGTATTCACCGTTGCCTCTAGCGTGATCCTTGGCACATGTTCTCGAGTTTCTTCCAATATCTCTTGTTGGCGCCCAGCTTCACCAATGTACTCAACGTCTATGCGTTCTGCAATCTCCACGATGTACGTATATGTGTATCTTTTACATTTAAGGTTCTAAGAGCCCTTTCCTAGGTCTCGTGGGGTACGAAAGGTAGCGATAAAGCCGAAGCACTACCTTCAGTGTCATCTTCCAAAGCAAAAGACGCTGATGTGGCTGTTGTCGAGGATACCGCAAAGGTCCAAGAGGATGTTGACGCTGCATTCAAGGAAACCGTCACAAGAGCCGTCACCAAAATCGAAACCAAGGAGGAAATTGAAAAGCCTACGATGGACGACCAGAACAAGACATTCCGTACTCGTCTCGTCGCGTTCTGGATGTTGTCCAATGCATCGCTTGCCGTTGCTATTTCAAACTTGAATGGTCTGCCTAGTTCAAACCCTGCCCAAGACGAAAAAGACTTGGCCGACAAGCAGAGCACATATTTCAACATCATCTTGTATTCAACATTTGGTCTTGCTTTCGTTCGTTTCATTGGAGTACGTTTTATCTACTCGCGTTGTGCAAGGAGTTGATTGACATTACATCCATGACAGTGTCTCTGGTACTTCTTCAAGCGCAACCTCTTCAGATGTTGCAGACGGAACTAA

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Seja gentil com a natureza,

Imprima apenas o indispensável.