Staphylococcus Antonio Carlos Pignatari

Staphylococcus

Dra. Elsa Masae Mamizuka USP Dr. Antnio Carlos PignatariDiretor do Laboratrio Especial de Microbiologia LEMC

Introduo a cocos Gram-positivos Caractersticas do Gnero Staphylococcus Staphylococcus aureus Enzimas Extracelulares Testes de aglutinao rpida para coagulase Padres de Hemlise Regulao de Fatores de Virulncia Staphylococcus epidermidis Outras espcies de Staphylococcus Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus Deteco de resistncia de Staphylococcus aureus oxacilina e ou vancomicina Resistncia aos Antibiticos Staphylococcus aureus resistente oxacilina-ORSA Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxaclina ( meticilina) Resistncia Vancomicina Deteco da VISA/VRSA Relao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

ndice

Introduo a cocos Gram-positivos

Os cocos Gram positivos (CG+) compem um grupo de grande importncia clnica. So responsveis por inmeras e variadas afeces e sndromes. Os CG+ anaerbios facultativos de importncia clnica pertencem a uma de duas famlias: Micrococcaceae ou Streptococcaceae

Pesquisa de catalase na bactria


A partir da caracterizao da amostra como CG+ atravs da colorao de Gram, a determinao da famlia feita pela prova da catalase. A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactria em contato com o perxido de hidrognio, e pesquisar a formao de bolhas de oxignio.

catalase2H2O2

2H2O + O2


+MicrococcaceaeAs bactrias desta famlia so catalase POSITIVAS

StreptococcaceaeAs bactrias desta famlia so catalase NEGATIVAS

Caractersticas do Gnero Staphylococcus

Esta estrutura caracterstica lembra cachos de uva.


As sp mais importantes na clnica S. lugundensis S. schleiferi S. sciuri S. lentus S. caseolyticus S. hyicus S. chromogenes S. carnosus S. simulans S. cohnii S. xylosus S. saprophyticus S. gallinarium S. kloosii S. equorum S. arlettae S. epidermidis

S. capitisS. warnei S.saccharolyt. S. caprae S. hominis S. haemolyticus

S. intermediusS. delphini

S. auricularisS. aureus


As mais importantes no laboratrio clnico so: S. lugundensis S. schleiferi S. sciuri S. lentus S. caseolyticus S. hyicus S. carnosus S. simulans S. cohnii S. xylosus S. saprophyticus S. gallinarium S. epidermidis S. capitis

S. warneiS.saccharolyt. S. caprae S. hominis

S. chromogenesS. intermedius

S. kloosiiS. equorum

S. haemolyticusS. auricularis

S. delphini

S. arlettae

S. aureus

Staphylococcus aureus

De todas as espcies do gnero, o S. aureus o mais importante. responsvel pelo segundo maior nmero de infeces em seres humanos.O S.aureus est presente no trato respiratrio superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da populao em geral, e assim permanece sem causar doena em condies normais.


O gnero Staphylococcus composto por vrias espcies: S. lugundensis S. schleiferi S. sciuri S. lentus S. caseolyticus S. hyicus S. chromogenes S. intermedius S. delphini S. carnosus S. simulans S. cohnii S. xylosus S. saprophyticus S. gallinarium S. kloosii S. equorum S. arlettae S. epidermidis S. capitis S. warnei S.saccharolyt. S. caprae S. hominis S. haemolyticus S. auricularis S. aureus


O nome aureus significa dourado em latim, qualidade atribuda ao pigmento amarelado caracterstico produzido pela bactria.

Enzimas Extracelulares

A enzima extracelular mais importante a coagulase. A produo de coagulase exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critrio para a identificao de uma amostra como pertencente espcie. coagulase

Fibrinognioprotrombina

Fibrina

Estafilotrombina Causa coagulao

Fatores de Virulncia do StaphylosStaphylos no o nico que produz coagulase


No laboratrio clnico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A bactria em questo inoculada num tubo com plasma de coelho. Se o plasma coagular, a espcie S. aureus.

Se no coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente


Protena A (SpA) Tem a habilidade de se ligar poro FC de IgG, impedindo, portanto que ela sirva de fator de opsonizao na fagocitose. Fab

Fab

IgGS. aureus

Fc

SpA (Atn)

Testes de aglutinao rpida para coagulase

Testa a presena de proteina A e fator de coagulao (clamping factor) Fornece resultado + em 5 a 20 seg. Mostra correlao de 80% com mt.classico preo e mbalagem com 150un. U$116.00

Teste de aglutinao do latex azul para deteco do clumping factor e protein A associado Staphylococcus aureus Resultado em 60 seg Sensibilidade/especificidade: 99/92% Inclui partcula de latex , carto p/teste, haste, e controles positivo e negativo Preo: embalagem de 105 um. U$ 105.62 Validade 18 meses

Padres de Hemlise

esverdeado

Regulao de Fatores de Virulncia

Os fatores de virulncia produzidos por S. aureus no so expressados a toda hora, so dependentes da fase de crescimento da bactria.no de clulas Protena A adesinas coagulase hemolisinas Toxinas Alimento em abundncia alimento Taxa estacionria

Protena A adesinas coagulase hemolisinas toxinas

tempo

Staphylococcus epidermidis

A segunda espcie mais importante do gnero Staphylococcus o Staphylococcus epidermidis. O Staphylococcus epidermidis faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores.

Importante na infeco hospitalar


O Staphylococcus epidermidis uma espcie bem menos virulenta do que S. aureus. No apresentam a produo de coagulase e algumas cepas apresentam a produo muito tmida de certas enzimas proteolticas. Todavia, isto no significa que S. epidermidis no possa ser patognico. Esta espcie tem muitos fatores de adeso e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plstico (cateter, prteses, stents, etc.).


O Staphylococcus epidermidis um risco para pacientes imunocomprometidos e para usurios de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infeces generalizadas no-piognicas. Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infeces em locais com prtese.

Outras espcies de Staphylococcus

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade novobiocina.


No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade novobiocina.

Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica

Gnero Staphylococcus Planococcus Micrococcus Enterococcus Streptococcus Aerococcus Stomatococcus *

Catal.

Motilidade NaCl 5%

Oxidase

Aerbio

Ttrade

Estrito + + + neg neg neg varivel neg + neg varivel neg neg neg + + + + varivel + neg neg neg + neg neg neg neg no + varivel no no no no no varivel varivel no no + varivel

* aderente ao meio

Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus

Coco GRAM +Streptococcaceae

-

catalase + Micrococcaceae DNAse + Staphylococcus sp.

Sensvel novobiocina?

-

+ Staphylococcus no saprophyticus

Coagulase + Staphylococcus aureus

Staphylococcus grupo saprophyticus


No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua sensibilidade novobiocina.

Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus

Espcies de Staphylococcus do grupono saprophyticus (Grupo epidermidis)S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. capitis S. warneri

Espcies de Staphylococcus do grupo saprophyticus

S. saprophyticus S. cohnii S. xylosus

Staphylococcus saprophyticus

O Staphylococcus saprophyticus de interesse clnico pois frequentemente causa infeco do trato urinrio, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia.

As outras espcies de Staphylococcus de interesse clnico causam infeces parecidas com o S. epidermidis, e o tratamento igual. Logo, o mais importante discriminar o Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do Staphylococcus coagulase negativa.

Deteco de resistncia de Staphylococcus aureus oxacilina e ou vancomicina

Resistncia aos Antibiticos

A primeira vez que um antibitico foi usado, clinicamente, foi contra uma infeco por Staphylococcus aureus.

Sir Alexander Fleming


A penicilina funcionou bem contra infeces estafiloccicas at os anos 60, quando rapidamente comearam a surgir cepas resistentes penicilina.


Para contornar o problema, foi criado o beta-lactmico sinttico meticilina, que era resistente ao das betalactamases.

Anel b-lactmico

meticilina


A meticilina funcionou bem at os anos 70, quando comearam a surgir as cepas resistentes a meticilina (MRSA).

meticilina


Todo antibiticos beta-lactmico se liga a enzimas que participam da sntese da parede celular chamadas PBPs (Protenas Ligadoras de Penicilina). O MRSA desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP plenamente funcional mas no tem afinidade por beta-lactmicos.

penicilina

PBP2a(PVN) ligadora de penicilina = enzima


Devido a este mecanismo de resistncia, as cepas MRSA/ORSA so resistentes no s penicilina, mas a todos os antibiticos betalactmicos! No laboratrio clnico, deve-se reportar num antibiograma resistncia a todos os beta lactmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas s vezes so suscetveis = ocorre apenas in vitro) quando a amostra for MRSA mesmo quando so sensveis a alguns beta lactmicos in vitro. A PBP2a codificada pelo gene mecA. Este gene carreado num elemento gentico mvel chamado de Cassete Cromossmico Estafiloccico mec (SCCmec).

Staphylococcus aureus resistente oxacilina-ORSA

CIM meticilina Modalidade Nivel de expresso mecA PBP2a bla Maioria 8 8 1,5-3 6-12 10-200 800 Subp-R 200 400 800 800 Freq de Subp-R

BorderlineBORSA MOD-SA Heterognea Heterognea Heterognea Homognea

Baixo Baxo Baixo Medio Alto Alto

+ + + +

PBP 1,3,4 + + + +

+++ + + + + +/-

107 10-5 103 1

b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulao resistente.

Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxaclina ( meticilina)

Para detectar a resistncia a oxacilina no laboratrio clnico, pode-se utilizar a tcnica de disco difuso em gar (Kirby-Bauer).

Tambm pode-se detectar cepas MRSA atravs de um gar screening de oxacilina que gar Mller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentrao de oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colnias indica resistncia a oxacilina. Para a determinao da concentrao inibitria mnima de oxacilina, o mtodo de macrodiluio em caldo deve ser feito com caldo Mller-Hinton com uma concentrao final de 4% de NaCl.

Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxacilina ( meticilina)

O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina uma alternativa vlida em casos de dvida, com uma eficcia diagnstica praticamente similar ao do mtodo de referncia de diluo em gar hiper salino, a concentrao crtica de 6 g/ml de oxacilina (NCCLS,1997). Sistemas automatizados de micro diluio nem sempre oferecem sensibilidade, especificidade e eficcia suficientes para a deteco deste tipo de cepas, quando comparado aos mtodos de referncia (Snchez, 1998), Um mtodo alternativo, rpido e eficaz, embora nem sempre aplicvel em rotina, a deteco do gene mecA, por mtodos de amplificao por PCR (Murakami et al., 1991). Este mtodo teria a vantagem de no estar sujeito s condies do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em grande nmero de isolados, empregado em casos de dvida com valores de CIM prximo do limite.

Resistncia Vancomicina

O mecanismo de resistncia vancomicina em Staphylococcus aureus ainda no foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes.Em S. aureus, ocorrem fenmenos bizarros e pouco ortodoxos em relao resistncia vancomicina. Primeiramente, a morfologia das colnias de VRSA heterognea, dando a impresso de contaminao.

VSSA

VRSA

VRSA

VSSA

VRSA

VRSA


Em 1997, foi relatada no Japo, a primeira cepa clnica de Staphylococcus aureus resistente vancomicina (VRSA), pelo Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade Juntendo em Tquio.


Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcus aureus resistentes vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referncia de queimados. Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001. ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCIN Oliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm; Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu, Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhD Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui, and Hiramatsu)

Resistncia Vancomicina

Outro fenmeno comum oxacilina e a vancomincina a ocorrncia da resistncia heterognea (hetero-resistncia) de S. aureus a estes antibiticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de vancomicina (

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