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TALES DUQUE ESTEVES
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA
ANÁLISE DE RESÍDUOS DE CHLORFENAPYR EM CITROS POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS – CLAE-EM/EM
v. 2
Orientado por:Prof. Dr. Adilson Roberto Gonçalves
Lorena – SP 2012
U N I V E R S I D A D E D E S Ã O P A U L O
E s c o l a d e E n g e n h a r i a d e L o r e n a E E L - U S P
Tales Duque Esteves
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA
ANÁLISE DE RESÍDUOS DE CHLORFENAPYR EM CITROS POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS – CLAE-EM/EM
Trabalho de Conclusão de Curso II apresentado à Escola de Engenharia de Lorena como requisito para conclusão do curso de graduação em Engenharia Química, área de concentração: Química
Analítica. Orientador: Prof. Dr. Adilson Roberto Gonçalves
Lorena – SP 2012
DEDICATÓRIA
Dedico o presente trabalho
de conclusão de curso ao meu irmão Tayrone Duque Esteves, por me abrir as portas de um novo mundo nesta universidade e que agora concluo.
AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Adilson Roberto Gonçalves, pela orientação para elaboração deste
trabalho.
Ao Engenheiro Químico José Wellington Germano, pelas inúmeras respostas
para as intermináveis perguntas; pelo eficiente apadrinhamento de mim como
estagiário e pela enorme força de vontade e atitude na busca da minha
contratação.
À Margarete Reis, pelo auxílio e companheirismo no “pacote chlorfenapyr” e
pela amizade em qualquer outra situação.
À Roberta Leite, Supervisora de Laboratório de resíduos do GENCS, que
permitiu a realização deste trabalho, proporcionando o uso do laboratório para
realização dos experimentos.
A todos os amigos que de alguma maneira contribuíram para realização deste
trabalho.
A todos os professores da Escola de Engenharia de Lorena que realmente
contribuíram e foram responsáveis pela minha formação.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CLAE: Cromatografia Liquida de Alta Eficiência, do inglês High Performance
Liquid Chromatography
CLAE-EM: Cromatografia Liquida de Alta Eficiência Aclopada à Espectrometria
de Massas
CLAE-EM/EM: Cromatografia Liquida de Alta Eficiência Aclopada à
Espectrometria de Massas em Série
CV: Coeficiente de Variação
DP: Desvio Padrão
LRM: Limite de Resíduo Máximo
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
TOF: Detector “Tempo de Voo”, do inglês Time of Flight
LOQ: Limite de Quantificação
LOD: Limite de detecção
SPC: Solução Padrão de Calibração
QC: Amostra Controle, do inglês Quality Control
r: Coeficiente de correlação
F1: Fortificado no nível do Limite de Quantificação
F6: Fortificado no nível 100 vezes o Limite de Quantificação
UT: Amostra testemunha (Amostra de laranja em que não foi aplicado
chlorfenapyr no campo. Utilizada para comprovar a ausência do composto na
matriz)
RESUMO
O Limite de Resíduo Máximo (LMR), cada vez menor, é visado nos
Estudos de Análise de Resíduo. Para isso se exige o desenvolvimento de
métodos de quantificação em tecnologias mais avançadas, como a
cromatografia líquida de alta eficiência com espectrômetro de massas como
detector: técnica veloz, precisa e exata quando comparadas à outras técnicas
de quantificação.
O cultivo de laranja é, sem dúvida, um dos maiores setores da
agroindústria brasileira. A produtividade elevada é resultado de um processo de
plantio e manutenção da colheita minuciosamente controlados, onde a
aplicação de defensivos agrícolas como o chlorfenapyr, utilizado para combater
ácaros que atacam a cultura, é fundamental.
As substâncias toxicologicamente significativas resultantes do uso
destes em concentrações significativas, deve ser quantificado para a análise de
risco e controle da liberação do produto no mercado. Para controlar estes
Estudos de Análise de Resíduo, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) exige, entre outros critérios, que o método de análise laboratorial
para a quantificação dos resíduos, presentes na matriz vegetal após a colheita,
seja validado quanto a critérios de exatidão, precisão, sensibilidade e
confiabilidade dos resultados.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a detector de
Espectrometria de Massas em Série (CLAE-EM/EM) é uma técnica muito
utilizada para a quantificação de moléculas orgânicas em matrizes complexas
como a vegetal, por ter grande eficiência na separação de interferentes
reduzindo o tempo e a complexidade depurificação da amostra.
O Método proposto no presente trabalho foi uma adaptação de um
método já existente com alterações na parte de cromatografia. Obteve
resultados satisfatórios quanto a todos os critérios exigidos pela ANVISA.
Mostrou-se sensível a pequenas alterações na concentração do
composto na amostra; apresentou uma faixa linear de trabalho
satisfatória;precisão e exatidão dentro do limite aceitável; livre de interferência
da matriz vegetal; e robusto, sem interferência de pequenas modificações no
fluxo de fase móvel e temperatura do forno de coluna.
As Soluções utilizadas nas etapas do método foram estocadas e sua
estabilidade foi avaliada, comparando concentrações com uma solução de
concentração igual porém fresca (preparada no dia). Tanto a Solução Padrão
de Calibração como a Solução Padrão de Estoque se mostraram estáveis nos
períodos de armazenagem propostos: 30 e 101 dias, respectivamente.
O método analítico de CLAE-EM/EM constitui, portanto, uma ferramenta
útil na rotina de estudos de análise de resíduo de defensivos agrícolas.
ABSTRACT
The Maximum Residue Limit (MRL) is aimed at diminishing Studies in
Residue Analysis and this requires the development of methods to quantify in
more advanced technologies such as high performance liquid chromatography
with mass spectrometer as the detector: Technical faster , precise and accurate
when compared to other quantification techniques.
The orange crop is undoubtedly one of the biggest sectors of the
Brazilian agribusiness. The high productivity is the result of a process of
planting and maintaining harvest thoroughly checked where the application of
agricultural chemicals such as chlorfenapyr, used to combat mites that attack
the crop is essential.
Toxicologically significant substances resulting from the use of these in
significant concentrations, should be quantified for risk analysis and control of
product release in the market. To control these studies Residue Analysis of the
National Health Surveillance Agency (ANVISA) requires, among other criteria,
the laboratory analytical method for the quantification of residues in vegetables
after harvest matrix is validated as the criteria of accuracy, accuracy, sensitivity
and reliability of the results.
The High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass
Spectrometry detector in series (HPLC-MS/MS) is a widely used technique for
the quantification of organic molecules in complex matrices such as vegetable
to have high efficiency in separating interfering reducing the time and
complexity of purification of the sample.
The method proposed in this study was an adaptation of an existing
method with changes in the chromatography and obtained satisfactory results
for all the criteria required by ANVISA.
Was sensitive to small changes in the concentration of the compound in
the sample showed a linear working satisfactorily; precision and accuracy within
the acceptable limit, free of interference from vegetable matrix, and robust,
without interference from small changes in the flow of mobile phase and column
oven temperature.
The solutions used in the steps of the method were stored and their
stability was evaluated by comparing concentrations with a solution of equal
concentration but fresh (prepared in days). Both the solution and the Calibration
Standard Stock Standard Solution were stable on storage periods proposed: 30
and 101 days, respectively.
The analytical method of CLAE-EM/EM therefore, constitutes a useful
technique to perform in routine studies of residue analysis of pesticides.
SUMÁRIO
1. OBJETIVOS.............................................................................................15
1.1 Objetivo Geral............................................................................15
1.2 Objetivos Específicos................................................................15
2. JUSTIFICATIVA.......................................................................................16
3. REVISÃO DA LITERATURA...................................................................17
3.1 A Laranja no Brasil....................................................................17
3.2 Defensivos Agrícolas.................................................................18
3.3 Chlorfenapyr..............................................................................19
3.4 Cromatografia............................................................................20
3.4.1 Cromatografia, uma breve cronologia..................................21
3.4.2 O Cromatograma...................................................................22
3.4.3 Cromatografia Líquida...........................................................22
3.5 Espectrometria de Massas........................................................24
3.6 A Análise de Resíduo por CLAE-EM/EM...................................27
3.7 Validação de um Método Analítico............................................27
3.7.1 Curva Analítica e Linearidade..............................................28
3.7.2 Sensibilidade........................................................................29
3.7.3 Limite de Detecção e Limite de Quantificação....................29
3.7.4 Recuperação (Exatidão)......................................................30
3.7.5 Precisão...............................................................................30
3.7.6 Robustez..............................................................................31
4. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................32
4.1 Equipamentos...........................................................................32
4.2 Reagentes, Solventes e Gases................................................32
4.3 Método Analítico......................................................................32
4.3.1 Metodologia de Purificação................................................33
4.3.2 Metodologia de Quantificação...........................................34
4.4 Critérios de Validação..............................................................34
4.5 Estabilidade de Soluções.........................................................35
5. RESULTADO E DISCUSSÕES...............................................................36
5.1 Adaptação do Método de Quantificação..................................36
5.2 Tabela de Resultados, Curva de Calibração e Cromatogramas
Típicos......................................................................................38
5.2.1 Curva Analítica e Linearidade............................................45
5.2.2 Sensibilidade......................................................................46
5.2.3 Limite de detecção e Limite de Quantificação...................46
5.2.4 Seletividade........................................................................46
5.2.5 Exatidão da Medição..........................................................47
5.2.6 Precisão da Medição..........................................................47
5.3 Robustez do Método.................................................................48
5.4 Interferência de Matriz..............................................................50
5.5 Estabilidade das Soluções........................................................51
6. CONCLUSÃO..........................................................................................54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................56
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Molécula de Chlorfenapyr.................................................................20
Figura 2 - Esquema de funcionamento da Espectrometria de Massas.........25
Figura 3 – Esquema de um Espectrômetro de Massas do tipo Triplo
Quadrupolo........................................................................................................26
Figura 4 – Cromatograma típico de solução padrão de concentração 20 ng/mL
em condições não ideais...................................................................................36
Figura 5 – Cromatograma típico de solução padrão de concentração 1,25
ng/mL em condições ideais...............................................................................37
Figura 6 – Curva de Calibração........................................................................40
Figura 7 -Branco de Reagentes – Amostra sem matriz de citros, apenas com
reagentes e solventes........................................................................................40
Figura 8 - UT (Amostra Testemunha): Amostra de citros sem adição de
chlorfenapyr.......................................................................................................41
Figura 9 - QC (Amostra Controle): Amostra testemunha fortificada no nível do
LOQ após a etapa de purificação......................................................................41
Figura 10 - F1 – Amostra Testemunha fortificada no nível do LOQ antes da
rota de purificação.............................................................................................42
Figura 11 - F6 – Amostra Testemunha fortificada em 100xLOQ antes da rota
de purificação....................................................................................................42
Figura 12 - SPC A – Solução Padrão de Calibração com concentração de
0,125 ng/mL.......................................................................................................43
Figura 13 - SPC B – Solução Padrão de Calibração com concentração de
0,250 ng/mL.......................................................................................................43
Figura 14 - SPC C – Solução Padrão de Calibração com concentração de
0,500 ng/mL.......................................................................................................44
Figura 15-SPC D – Solução Padrão de Calibração com concentração de 1,25
ng/mL.................................................................................................................44
Figura 16- SPC E – Solução Padrão de Calibração com concentração de 2,50
ng/mL.................................................................................................................45
Figura 17 – Cromatograma típico de Solução Padrão de concentração 1,25
ng/mL apósajustes para o teste de robustez.....................................................49
Figura 18 – Curva de Calibração (Teste de robustez)......................................49
Figura 19 – Comparação: Curva de calibração com e sem matriz.................51
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Propriedades do composto..............................................................20
Tabela 2 – Método de Quantificação modelo....................................................33
Tabela 3 – Método de Quantificação proposto..................................................38
Tabela 4 – Resposta das injeções Soluções Padrões de Calibração utilizadas
na Curva de Calibração.....................................................................................39
Tabela 5 – Recuperações dos Fortificados encontrados a partir da curva de
calibração...........................................................................................................39
Tabela 6 – Recuperações dos Fortificados encontrados a partir da curva de
calibração (Teste de robustez)..........................................................................48
Tabela 7 – Estabilidade de 28 Dias – SPE.......................................................52
Tabela 8 – Estabilidade de 56 Dias – SPE.......................................................52
Tabela 9 – Estabilidade de 101 Dias – SPE.....................................................53
Tabela 10 – Estabilidade de 15 Dias – SPC.....................................................53
Tabela 11 – Estabilidade de 30 Dias – SPC.....................................................53
15
1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo Geral
• Desenvolver e validar método analítico por CLAE-EM/EMpara
determinação de resíduos de Chlorfenapyr.
1.2 Objetivos Específicos
• Testar diferentes condições cromatográficas para otimização do método
• Validar Método em Citros (Grupo de Cultura coberto pela validação em
apenas uma cultura como limão, laranja ou tangerina)
• Comparar curva de calibração em solução de metanol com curva de
calibração em solução contendo matriz vegetal de laranja
16
2. JUSTIFICATIVA
A exigência e restrição cada vez maior dos órgãos nacionais e
internacionais com os estudos de análise de resíduo, assim como a
necessidade de se o quantificar quantidades de resíduo cada vez menores
para gerar um menor limite de resíduo máximo (LRM), faz com que seja
necessário o desenvolvimento de métodos de quantificação em tecnologias
mais avançadas como a cromatografia líquida de alta eficiência com
espectrômetro de massas como detector: capaz de detectar menores
quantidades do agroquímico presente na matriz de interesse com alta
seletividade, sensibilidade e confiabilidade.
17
3.REVISÃO DA LITERATURA
3.1.A Laranja no Brasil
A Laranjeira, assim como todas as plantas cítricas, é nativa da Ásia. Foi
levada, durante a Idade Média, para o norte da África e daí, para o sul da
Europa. Da Europa foi trazida para as Américas na época dos descobrimentos,
por volta de 1500. Atualmente, os pomares mais produtivos encontram-se nas
regiões de clima tropical e subtropical, destacando-se como grandes
produtores de citros o Brasil, Estados Unidos, Espanha, México é China.
(ABECITRUS, 2007)
As mudas e as técnicas de cultivo da laranja foram trazidas da Espanha
para o Brasil pelos Portugueses, entre 1530 e 1540, para suprir a necessidade
de vitamina C das tripulações dizimadas por escorbuto na época do
descobrimento e da colonização da América Latina. Graças à excelente
adaptação da laranja ao clima e solo brasileiros, por volta de 1800 surgiu no
Brasil uma variedade particular de laranja reconhecida internacionalmente: a
laranja Bahia. (ABECITRUS, 2007).
Após o declínio da produção de café no Brasil a laranja ganhou maior
espaço na agricultura brasileira e começou a ser exportada em 1910 e
rapidamente se tornou um dos 10 produtos mais exportados do Brasil. Há um
predomínio da cultura de laranja Pera na produção brasileira, por ser típica de
uso industrial, já que a produção brasileira é orientada para o processamento
de suco concentrado com destino à exportação. (ABECITRUS, 2007)
O sistema agroindustrial da laranja é, sem dúvida, um caso de sucesso
no Brasil, pois emprega diretamente mais de 400 mil pessoas, é a atividade
principal de 322 municípios paulistas e 11 mineiros. Também atende 50% da
demanda e 75% das transações internacionais trazendo, anualmente, 1 bilhão
de dólares em divisas para o Brasil, no centre de uma cadeia produtiva que
gera PIB equivalente a 5 bilhões de dólares (ABECITRUS, 2007). Segundo
pesquisa realizada pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) a
safra brasileira de laranja em 2011/2012 foi estimada em 375,74 milhões de
caixas, sendo cada caixa de 40,8 kg (IBGE, 2012).
18
3.2 Defensivos agrícolas
Êxodo rural, falta de mão de obra, competitividade, crescimento
populacional e diminuição de áreas cultiváveis. Esses são alguns dos motivos
para que a agricultura seja impulsionada a um nível de produção cada vez mais
exigente e eficiente. Para se atingir uma produção de alta qualidade, o uso de
defensivos agrícolas (agrotóxicos) para o controle de pragas antes ou durante
o cultivo de um alimento é cada vez mais necessário.
O governo brasileiro define como agrotóxico “Os produtos e os
componentes de processos físicos, químicos ou biológicos destinados ao uso
nos setores de produção, armazenamento e beneficiamento de produtos
agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas nativas ou implantadas e de
outros ecossistemas e também em ambientes urbanos, hídricos e industriais,
cuja finalidade seja alterar a composição da flora e da fauna, a fim de preservá-
la da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como
substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes,
estimuladores e inibidores do crescimento." (Lei Federal nº 7.802 de 11/07/89,
regulamentada através do Decreto 98.816, no seu Artigo 2º, Inciso I)(JARDIM,
2009).
Existem mais de 800 compostos registrados como ingredientes ativos de
produtos comercializados como agrotóxicos no mundo todo. O Brasil, por
possuir extensas e férteis áreas de plantio, é cada vez mais um forte
consumidor destes produtos.Este consumo cresceu bastante nas últimas
décadas, transformando o país em um dos líderes mundiais no consumo de
agrotóxicos. Entre 1972 e 1998, a quantidade de ingrediente ativo vendido
cresceu 4,3 vezes, passando de 28.043 toneladas para 121.100 toneladas/ano.
A importância econômica deste mercado é evidente: segundo a ABIFINA
(Associação Brasileira das Indústrias de Química Fina, Biotecnologia e suas
Especialidades), o faturamento do segmento agroquímico saltou de 1,2 bilhão
em 2002 para 4,4 bilhões em 2004. Em relação às classes de uso, em 2004,
40% dos produtos vendidos eram herbicidas, 31% fungicidas, 24% inseticidas e
5% outros(SWARUP, 2008).
Resíduos de agrotóxicos são definidos como as substâncias
toxicologicamente significativas resultantes do uso destes, que ocorre em
19
vegetais e/ou produtos de origem vegetal, em concentrações significativas.
Compreende o princípio ativo da substância teste, bem como seus metabólitos,
quando aplicável. O uso inadequado de agrotóxicos pode gerar um alimento
com teor de resíduo acima do aceitável e isso pode causar sérios prejuízos à
qualidade do solo, saúde do agricultor, assim como a saúde do consumidor e
por isso deve ser regulamentado por um órgão fiscal. (CHIARADIA, 2009). A
Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) coordena o Sistema Nacional
de Vigilância Toxicológica, regulamentando, analisando, controlando e
fiscalizando produtos e serviços que envolvam risco a saúde - agrotóxicos,
componentes e afins e outras substâncias químicas de interesse toxicológico.
Realiza a avaliação toxicológica para fins de registro dos agrotóxicos e a
reavaliação de moléculas já registradas; normatiza e elabora regulamentos
técnicos e monografias dos ingredientes ativos dos agrotóxicos; coordena o
Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos nos Alimentos (PARA) e a
Rede Nacional de Centros de Informação Toxicológica e promove ações de
capacitação em toxicologia no Sistema Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA, 2006).
3.3 Chlorfenapyr
Chlorfenapyr é um inseticida e, especificamente, um pró-inseticida (o
que significa que é metabolizado em um inseticida ativo após a entrada no
hospedeiro), derivado de uma classe de compostos conhecidos como pirróis
halogenados.
Age interrompendo a produção de ATP (Trifosfato de Adenosina)
gerando morte celular e finalmente, mortalidade do organismo. É largamente
utilizado no controle de ácaros em culturas de citros.
A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA) negou,
inicialmente, o registro deste ingrediente ativo para uso em algodão em 2000
por preocupações de que o inseticida era tóxico para pássaros que viviam na
área de aplicação. Posteriormente, após mais estudos, em 2001 foi registrado
pela EPA para culturas não-alimentares. Em 2005, a EPA estabeleceu uma
tolerância de resíduos de chlorfenapyr para culturas alimentares. (EPA)
20
No Brasil, é registrado para aplicação em diversas culturas como
algodão, alho, batata, cebola, citros, couve, crisântemo, feijão, maracujá,
mamão, melancia, melão, milho, pimentão, repolho e rosa. Com aplicação foliar
e IDA (Ingestão Diária Aceitável) de 0,03 mg/kg de peso corporal do
consumidor. (ANVISA)
A figura 1 mostra sua estrutura molecular com a presença de
halogêneos e anel aromático. Na tabela 1 é a apresentado suas propriedades
principais.
Figura 1 - Molécula de Chlorfenapyr
Tabela 1 – Propriedades do composto
3.4 Cromatografia
A cromatografia é um processo de separação físico-químico, cuja
aplicação permite a análise qualitativa ou quantitativa de uma amostra. A
cromatografia permite separar constituintes de uma mistura através de sua
distribuição por duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.
A fase móvel (solvente que percorre a coluna) na cromatografia pode
ser líquida ou gasosa. A fase estacionária (que fica fixa dentro da coluna) é
Propriedades
Fórmula Molecular C15H11BrClF3N2O
Massa Molar 407,6 g/mol
Densidade 0,543 g/mL
Ponto de Fusão 100-101 ºC
21
normalmente um líquido viscoso que cobre o interior de um tubo capilar ou a
superfície de partículas sólidas empacotadas dentro da coluna. (COLLINS,
2006)
3.4.1 Cromatografia, uma breve cronologia
A cromatografia é uma técnica analítica que teve sua origem no início do
século, mas cuja utilização, ainda que não definida como técnica analítica
remonta milênios.
No ano de 1850, as técnicas de Cromatografia Líquida de Troca Iônica
aparecem registradas na publicação no “Journal of Royal Agricultural Society”
por Way através de um trabalho sobre o emprego de trocadores iônicos
naturais.
Em 1893, a Cromatografia foi utilizada como tal, pelo químico inglês
Lester Reed, o qual publicou um trabalho nos “Procedures of Chemical Society”
sobre a separação de sais orgânicos e inorgânicos pela passagem de suas
soluções através de colunas contendo caolim; e pelo químico norte-americano
David Talbot Day, que publicou em 1897 um trabalho relatando suas
experiências no que chamava “Difusão Fracionada” de amostras de petróleo.
(HARRIS, 2001)
Como técnica analítica a cromatografia tem seu “debut” no ano de 1930
com a publicação de Tsvet do trabalho “Sobre uma nova categoria de
fenômenos de adsorção e sua aplicação em análises biomédicas” junto à
Sociedade de Ciências Naturais de Varsóvia.
Os primeiros trocadores iônicos sintéticos datam de 1935 através dos
trabalhos de Adams & Holmes no Departamento de Pesquisas Científicas e
Industriais do Reino Unido.
O ano de 1941 marca o início dos trabalhos em Cromatografia de
Partição com a publicação de Martin & Synge sobre a análise de aminoácidos
emhidrolizados de proteínas. Nesse mesmo ano, surge o primeiro relato formal
de experiências de Cromatografia em fase gasosa. O trabalho de
Eilbrecht&Chakhotin, estudantes da Universidade de Marburg, Alemanha,
separando ácidos graxos pela passagem de seus vapores através de colunas
22
contendo sílica gel, impregnado de CO2 como gás de arraste, o qual chamaram
de “Destilação de Adsorção”, foi publicado por Hesse no “Leibigs Ann. Chem.
O relato da construção do primeiro cromatógrafo gasoso cabe a Cremer
no ano de 1950 na Universidade de Innsbuuck, Áustria. O primeiro
cromatógrafo gás-líquido para uso em partição foi construído no ano de 1952
no Instituto Nacional de Pesquisas Médicas de Londres.
A cromatografia de exclusão surge no ano de 1959 com a publicação,
por Porath&Flodin, na revista “Nature”, de um trabalho relatando a síntese de
um gel de dextranas com ligações cruzadas. (HARRIS, 2001)
3.4.2 O Cromatograma
Em um cromatograma ideal, os picos apresentam-se separados e
simétricos; na prática pode haver sobreposição parcial devido a uma separação
deficiente na coluna, ou a presença de picos com assimetria frontal ou caudas.
A assimetria frontal está frequentemente relacionada com um excesso de
amostra injetada ou com o uso de colunas em uma temperatura abaixo do ideal
para determinada análise. As caudas aparecem devido às falhas na técnica de
injeção da amostra, ou devido à adsorção excessiva na fase estacionária ou
suporte. (HARRIS, 2001)
3.4.3 Cromatografia Líquida
A cromatografia líquida clássica que utiliza colunas comuns de vidro é
facilmente mantida em operação. A introdução de micro partículas (20 micra de
diâmetro) motivou o desenvolvimento da instrumentação necessária para
realizar a cromatografia líquida de alta performance. Assim, a cromatografia
líquida tornou-se uma poderosa técnica analítica, onde uma sofisticada
instrumentação é utilizada. Porém, para manter tal sistema em boas condições
operacionais cuidados devem ser tomados. Para diagnosticar, resolver ou
simplesmente evitar problemas operacionais, deve-se conhecer aspectos como
fase móvel, bomba, detector, colunas e preparação de amostras.
A fase móvel deve ser livre de impurezas que produzem respostas no
detector, não deve atacar as partes integrantes do cromatógrafo e não pode
23
conter partículas de gás dissolvidas. Os solventes utilizados no preparo da fase
móvel, são isentos de impurezas, entretanto, contêm estabilizantes, por
exemplo, etanol em clorofórmio, que podem afetar a separação e a linha de
base. Na maioria dos casos, estes compostos devem ser removidos, mas
deve-se lembrar que uma vez removidos, mudanças ocorrerão no solvente. A
água é um solvente comum, desta devem ser removidos íons, materiais
orgânicos em suspensão e microrganismos. A pressurização do solvente
também ajuda a eliminar a formação de bolhas, as quais podem interferir no
funcionamento da bomba, vazão e resposta do detector. (De AQUINO NETO,
2003)
Muitos problemas são produzidos por causa de uma amostra inadequada
ao cromatógrafo, como efeito de sólidos na coluna, aumentando a pressão
contrária. Nestes casos deve-se filtrar a amostra através do sistema “sep-pak”,
que consiste em um pequeno cartucho de plástico contendo sílica ou fase
reversa, sob o qual são adsorvidos estes contaminantes, preservando a coluna.
A coluna é responsável pela separação de uma mistura em seus
componentes. É importante tomar providências para assegurar à coluna ótimo
desempenho, e vida prolongada. A contaminação da coluna por componentes
que não eluem, e ficam adsorvidos na fase estacionária, causam mudanças no
tempo de retenção, que tende a aumentar. Assim deve-se permitir que a coluna
se equilibre antes de injetar a amostra, deixando estabilizar a linha de base;
nunca deixar a coluna exposta a fontes instáveis de radiação térmica, pois
podem provocar um gradiente de temperatura através da coluna acarretando
um deslocamento da linha de base, e guardar a coluna sempre com o solvente
adequado. (COLLINS, 2006)
Dentre as características que um detector ideal deve possuir, estão entre
elas: alta sensibilidade, responder a todos os solutos, ter uma larga faixa de
linearidade, não ser afetado pela temperatura da fase móvel, responder
independentemente da fase móvel utilizada, não provocar alargamento de
bandas, ter uma resposta rápida, não ser destrutivo (para que possa ser
recuperado) e fornecer informações estruturais a respeito do soluto.
24
Entre diversos detectores utilizados na cromatografia, um dos detectores
mais modernos para a análise de resíduos de agrotóxicos em matrizes vegetais
é o espectrômetro de massas.
3.5 Espectrometria de massas
Um espectrômetro de massa é um detector potente para as análises
qualitativas e quantitativas de constituintes em cromatografia gasosa ou líquida.
Na espectrometria de massa (EM) as moléculas gasosas são ionizadas
(geralmente para formarem cátions), aceleradas por um campo elétrico e então
separadas de acordo com a sua massa.
O uso do espectrômetro de massa como instrumento para analisar
substância química foi proposto por J.J.Thomson no início do século. Somente
um pequeno número de moléculas poderia ter sua estrutura elucidada. Com o
avanço da tecnologia em instrumentação, atualmente é possível obter espectro
de massa de uma gama de composto.
Assim um espectrômetro de massa é um instrumento que caracteriza e
identifica os íons de acordo com a massa/carga (m/z).Os íons são gerados a
partir de um gerador de íons “filamentos” sendo as moléculas ionizadas,
aceleradas e selecionadas (m/z), através de um analisador de massa sob
vácuo.
Os objetivos da espectrometria são obter a massa molecular exata dos
composto analisados, a fim de identificar, caracterizar e quantificar os mesmos.
(DEMOLINER, 2008)
25
Figura 2 - Esquema de funcionamento da Espectrometria de Massas.
Na EM-EM, ao invés de utilizar apenas um analisador de massas para
separar os íons de mesma razão m/z gerados na fonte de ionização, como na
EM, utiliza dois estágios de espectrometria de massas (EM1 e EM2), em que
um deles é usado para isolar o íon de interesse e o outro é usado para
estabelecer uma relação entre íon de interesse isolado e outros íons que foram
gerados a partir da decomposição induzida (CHIARADIA, 2009). O analisador
de massas opera sob vácuo, para assegurar que os íons se desloquem com
eficiência máxima. Existem vários tipos de analisadores de massas, tais como:
Sistemas Quadrupolo (QqQ): Os analisadores de massa quadrupolo usam
quatro eletrodos em forma de bastão paralelos organizados em um quadrado
para gerar campos elétricos que filtram os íons com base em sua relação m/z
enquanto se deslocam pelos eletrodos. Em determinadas magnitudes e
frequências, apenas íons com a massa selecionada atingem o detector.
Alterando os campos elétricos, as massas de todos os íons podem ser varridas
sequencialmente, de baixa para alta ou vice-versa, gerando um espectro de
massas (DEMOLINER, 2008)
26
Analisadores de tempo de vôo (Time-of-Flight – TOF): Os analisadores TOF
baseiam-se no principio de que, como os íons são gerados na mesma fonte de
ionização do espectrômetro de massas, elas possuem a mesma energia
cinética, de maneira que as sua velocidades serão apenas diferenciadas pelas
suas massas (velocidade é inversamente proporcional à raiz quadrada da
massa do íon). Por isso, neste analisador de massas, os íons produzidos na
fonte de ionização do espectrômetro são acelerados através de um tubo de vôo
para serem identificados, uma vez que o tempo que levam para atravessá-lo
está relacionado com a razão m/z de cada íon (DEMOLINER, 2008).
Sistemas Ion-trap: O íon-trap é um quadrupolo tridimensional que “captura”
todos os íons que são introduzidos em seu interior e os mantêm “aprisionados”
até que uma determinada radiofreqüência seja aplicada e torna os íons de
certa razão m/z instáveis, de forma que são liberados do trap (CHIARADIA,
2009).
Triplo Quadrupolo: Em um espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo
é formado pela junção de três quadrupolos em sequência. No primeiro um íon
selecionado é separado da corrente de íons vinda da fonte de íons. No
segundo quadrupolo este íon sofre nova fragmentação por colisão com íons de
N2 ou Ar. O terceiro quadrupolo seleciona então um dos fragmentos iônicos
formados para enviar ao detector (HARRIS, 2001).
Figura 3 – Esquema de um Espectrômetro de Massas do tipo Triplo Quadrupolo
O acoplamento CLAE em série com o espectrômetro de massas (CLAE-
EM/EM) tem se tornando muito importante para análise de resíduos de
27
agrotóxicos nos alimentos, permitindo a análise de agrotóxicos em níveis de
ultra-traços (da ordem de ng.kg-1), mesmo na presença de interferentes. A
fragmentação controlada da EM é uma ferramenta essencial para a
identificação confiável do analito de interesse com maior seletividade; além
disso, essa fragmentação gera sinais mais limpos melhorando a razão
sinal/ruído e diminuindo, portanto, os limites de detecção e quantificação. Desta
forma as análises com uso de CLAE-EM/EM podem ser consideradas no que
há de mais moderno e avançado em análises de resíduos de agrotóxicos.
3.6 A Análise de Resíduo por CLAE-EM/EM
A análise de multiresíduos de agrotóxicos representa um dos maiores
desafios analíticos. Existem cerca de 800 pesticidas controlados que abrangem
uma ampla gama de substâncias químicas e encontram-se presentes em
matrizes que variam de frutas e vegetais a água e solo. O desafio é analisar o
maior número possível destas substâncias no mais curto espaço de tempo e
poder quantificá-las abaixo dos níveis máximos permitidos (ANALITICA, 2010).
A técnica de referência recomendada na maioria dos casos é a LC-
EM/EM, por ser rápida, sensível e seletiva. Além disso é uma técnica auto-
confirmatória, que evita a emissão de laudos com resultados falso-positivos ou
falso-negativos(COMMISSION, 2002).
Rotineiramente equipamentos de LC-EM/EM permitem a detecção e a
quantificação de centenas de drogas em uma única análise, além de diminuir
as etapas de purificação da amostras, por se tratar de uma técnica altamente
seletiva(COMMISSION, 2002).
3.7 Validação de um Método Analítico
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através
de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez
mais reconhecida e exigida. Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a
decisões erradas e a prejuízos financeiros irreparáveis. Para garantir que um
28
novo método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a
amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada de validação (RIBANI,
2004)
Atualmente, há vários conceitos e definições, provenientes tanto de
pesquisadores (RIBANI, 2004) como de agências e normas (ANVISA 2003)
que objetivam responder questões como: qual a função da validação de
métodos e de que maneira deve ser realizada.
Validação é o ato ou efeito de validar, dar validade, tornar válido, legítimo
ou legal. Visa diminuir ou controlar os fatores que levam à imprecisão ou
inexatidão de uma dado gerado. Os instrumentos e métodos analíticos devem
ser validados do uso de rotina, após manutenção e em intervalos de tempos
regulares (RIBANI, 2004)
Alguns parâmetros envolvidos no processo de validação de métodos
analíticos são: curva analítica, linearidade, exatidão, precisão, limites de
detecção e de quantificação.
3.7.1 Curva Analítica e Linearidade
A calibração é um dos estágios fundamentais na análise química. A curva
analítica é a ferramenta de quantificação mais frequentemente utilizada e
consiste na determinação da resposta de determinado instrumento às várias
concentrações da substância em estudo.
Para a maioria das técnicas analíticas cromatográficas, uma relação linear
de primeira ordem é observada entre a resposta do detector (y) e a
concentração (x) do analito em estudo, podendo ser descrita pela Equação 1
da regressão linear:
Equação 1: y= ax+b
Em que a é a inclinação da reta (coeficiente angular) e b a intersecção
com o eixo y (coeficiente linear), y é a variável dependente e x a variável
independente. Idealmente, a deve ser reprodutível e b não deve ser
estatisticamente diferente de zero. A regressão linear deve também ter um alto
29
coeficiente de correlação (r > 0,9999 é considerado como ótimo) (RIBANI,
2004)
A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados
linearmente proporcionais à concentração do analito, enquadrados na faixa
analítica específica. Este parâmetro pode ser demostrado pelo coeficiente de
determinação (r2) do gráfico analítico. Também é possível calcular o coeficiente
de correlação (r), que pode ser utilizado para estimar a qualidade da curva
analítica uma vez que demonstra uma menor variação dos dados obtidos
quanto mais próximo de 1 for o valor de r (RIBANI, 2004)
Valor de r igual a 0,99 é recomendado pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária. (ANVISA, 2003)
3.7.2 Sensibilidade
A sensibilidade de um método analítico indica sua capacidade de
discriminar, com uma fidelidade estabelecida, concentrações próximas de um
analito. A sensibilidade pode ser determinada por intermédio da inclinação da
curva de calibração. No caso de uma reta, quanto maior o ângulo de inclinação
da reta, mais sensível será o método (RIBANI, 2004)
3.7.3 Limite de Detecção e Limite de Quantificação
A detectibilidade de um método analítico pode ser definida considerando-
se o Limite de Detecção (LOD, do inglês, Limit of Detection) e o Limite de
Quantificação (LOQ, do inglês, Limit of Quantification).
O LOD representa a menor concentração da substância em exame que
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um
determinado procedimento experimental, enquanto o LOQ representa a menor
concentração da substância em exame que pode ser medida/quantificada
também utilizando um determinado procedimento experimental (RIBANI, 2004)
A estimativa do valor do LOD pode ser calculada por várias maneiras,
como por exemplo através do método visual, método da relação sinal/ruído e
aqueles baseados em parâmetros da curva analítica (DEMOLINER, 2008)
30
3.7.4 Recuperação (Exatidão)
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos
pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro, usando um
procedimento experimental para uma mesma amostra repetidas vezes
(DEMOLINER, 2008)
Os intervalos aceitáveis de recuperação (R%) para análises de resíduos
geralmente estão entre 70 e 120%, com precisão de até + 20% (RIBANI, 2004)
Equação 2: �% =���� . �
��= Concentração encontrada na amostra
��= Concentração adicionada à amostra
3.7.5 Precisão
A precisão corresponde ao grau de concordância de resultados de testes
independentes obtidos sob condições estabelecidas e é expressa pela
estimativa do desvio padrão s (Equação 3) ou pelo Coeficiente de Variação CV
(Equação 4).
Equação 3: =�∑ ��−�����−�
Equação 4: �� = �� . �
�� = média aritmética de um certo número de medições
��= valor individual de uma medição
�= número de medições
A precisão pode ser determinada em termos de repetitividade, precisão
intermediária e reprodutibilidade, e avalia a proximidade entre várias medidas
efetuadas na mesma amostra (RIBANI, 2004). A precisão do método analítico
31
fornece informações da semelhança dos resultados obtidos, ou seja, mede a
capacidade de repetir e reproduzir o método analítico.
3.7.6 Robustez
Diz-se que um método é robusto quando ele se revelar praticamente
insensível a pequenas variações que possam ocorrer quando está sendo
executado (RIBANI, 2004).
A robustez de um método cromatográfico pode ser avaliada pela variação
de parâmetros como a composição e o fluxo da fase móvel em CLAE, natureza
do gás de arraste em Cromatografia Gasosa, programação de temperatura,
bem como tempo de agitação, extração, etc. (CHIARADIA, 2009)
32
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Equipamentos
Os equipamentos abaixo relacionados foram utilizados durante toda a
realização dos experimentos:
Cromatógrafo Líquido HPLC Agilent 1100 Series
Detector Massas/Massas AB Sciex API 4000
Coluna para cromatografia líquida ODS Hypersil (100 x 2.1)mm, 5µm
Balança semi-analítica com 2 casas de precisão
Balança analítica com 5 casas de precisão
Sistema de concentração de amostras (Turbo-Vap)
Dispensete analógico
Pipetador automático
Homogeneizador
Centrífuga
Sistema de eluição a vácuo
4.2. Reagentes, solventes e gases
Água Milli-Q: Grau 1 com resistividade de 18,2 megohm/cm
Acetato de Amônio pureza > 99%
Hexano grau HPLC
Metanol grau HPLC
Hidróxido de Sódio pureza >99%
Nitrogênio pureza >99,99%
4.3. Método Analítico
A metodologia desenvolvida no presente trabalho foi conduzida tendo
como base a metodologia descrita abaixo, porém, adaptações e otimizações
33
foram conduzidas na parte de cromatografia pois a coluna assim como o
detector descritos no método foram substituídos.
Testes com diferentes colunas, fluxo de fase móvel assim como sua
composição em um gradiente foram realizados para se obter a melhor
separação e intensidade de resposta do detector para o composto. Após
estabelecidos tais parâmetros, os testes para se validar o método foram
realizados.
A composição exata das soluções utilizadas na purificação não serão
descritas por políticas de sigilo da empresa.
4.3.1. Metodologia de Purificação
Pesar (5±0,1)g de amostra em recipiente de extração. Adicionar 100 mL
de Solução de Extração (Metanol:Água), extrair por 5 minutos no
homogeneizador e centrifugar por 5 minutos a cerca de 4000 rpm. Retirar uma
alíquota de 5mL para um tubo de ensaio, adicionar 5 mL de água e
homogeneizar1.
Condicionar o cartucho de extração em fase sólida de C18 (1g) com 5mL
de metanol e depois com 10 mL de água, sem deixar o cartucho secar. Passar
a amostra através do cartucho, descartando o eluato. Secar o cartucho por 20
minutos com auxílio de vácuo. Eluir o resíduo do cartucho com Solução de
Eluição (Hexano:Metanol) em vidraria para concentração de amostras.
Evaporar até secura e dissolver o resíduo em 5mL de Solução de Diluição2
(Metanol:Água).
Diluir todas as amostras 1:1 na via cromatográfica. Filtrar a amostra em
unidade filtrante, quando necessário. 1 Nota:No caso de matrizes ácidas, verificar o pH. Se o mesmo estiver ácido,
ajustar com gotas de NaOH 0,2 mol/L até pH neutro antes de eluir em cartucho
C18 (1g). 2Nota: Para preparo do QC tomar uma alíquota de 1 mL da amostra
testemunha diluída em 5 mL de Solução de Diluição e diluir em 1 mL com a
Solução Padrão de Calibração apropriada para a injeção no Sistema
Cromatográfico.
34
O Limite de Quantificação (LOQ) do método é 0,01 mg/kg e o Limite de
Detecção (LOD) é considerado 20% do LOQ (0,002 mg/kg).
4.3.2. Metodologia de Quantificação
Tabela 2 – Método de Quantificação modelo
HPLC Perkin-Elmer LC-200 Series Detector PE Sciex API 3000 Coluna Columbus 100 X 2.1 mm, 5µm Vol. Injeção 30 µL
Fase Móvel 5mM de Acetato de Amônio em Água (FM A) 5mM de Acetato de Amônio em Metanol (FM B)
Gradiente Tempo (minutos) FM A (%) FM B (%) 0.0 85 15 0.5 85 15 2.0 15 85 3.5 2 98 4.5 2 98 4.6 85 15 5.0 85 15 Fluxo 0.500 mL/min Tempo de Retenção esperado
3.4 min
Transições (m/z) 467.0/348.7 465.0/347.0
Modo de Ionização
Negativo
4.4. Critérios de Validação
Os critérios de validação de um métodompara determinação de resíduos
de agrotóxicos em matriz vegetal exigidos pela ANVISA e como serão
avaliados no presente trabalho podem ser assim resumidos:
1. Limite de Quantificação: Estabelido aqui em 0,01 mg/kg
2. Limite de Detecção : 20% do Limite de Quantificação (LOQ)
3. Níveis de Fortificação: No nível do LOQ e 100xLOQ
4. Seletividade: Avaliação de interferentes
5. Faixa Linear de Trabalho: Deve-se obter uma curva de calibração com
r>0,99
35
6. Precisão de Medição: A precisão de medição é considerada aceitável
quando o cálculo do coeficiente de variação (CV%) das recuperações
obtidas em cada nível de fortificação (no mínimo 5 fortificados em cada
nível) e todos os níveis de concentração da curva de calibração (no
mínimo 3 injeções de cada nível) apresenta CV ≤ 20 %
7. Exatidão de Medição (Acurácia): A exatidão é um conceito qualitativo e
foi determinada para um conjunto de recuperações, com o método
proposto, mostrando-se aceitável, com resultados de recuperação entre
(70 - 120) % para cada nível de fortificação e para todos os níveis de
concentração da curva de calibração.
Além destes critérios exigidos, os seguintes testes também serão
conduzidos:
1. A robustez do método: alterando a temperatura do forno de coluna do
HPLC e o fluxo para avaliar se todos os critérios se mantiveram,
2. A sensibilidade do método: inclinação da curva de calibração
3. Efeito da matriz na curva de calibração:comparação de uma curvade
calibração em solução de metanol com curva de calibração em solução
contendo matriz vegetal.
4.5 Estabilidade de Soluções
Durante o presente trabalho foi preparada uma solução Padrão de
Estoque (SPE), com concentração de 1x106ng/mL a partir da qual foram
preparadas as soluções de fortificação e as Soluções Padrões de Calibração
(SPC)
Para evitar a necessidade de preparo das soluções no mesmo dia em que
a análise ocorre, a estabilidade da solução padrão estoque (SPE) e solução
padrão de calibração (SPC) foi testada e avaliada comparando a concentração
de uma solução fresca com a solução estocada.
A SPE foi verificada estabilidade com pontos de análise em 28, 56 e 101
dias de estocagem enquanto a SPC teve pontos de análise em 15 e 30 dias. As
soluções foram estocadas em geladeira com temperatura controlada na faixa
de 5+1ºC
36
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1. Adaptação do método de quantificação
Um desenvolvimento dos parâmetros cromatográficos eficiente implica em
uma separação nítida com o mínimo de tempo de análise possível. A
adaptação do método exigiu testes com diferentes colunas, fluxos de fase
móvel e gradientes. A figura 4 mostra um cromatograma típico em que estes
parâmetros não eram ideais:
Figura 4 – Cromatograma típico de solução padrão de concentração 20 ng/mL em condições
não ideais
Com base no método cromatográfico já descrito, a metodologia foi
adaptada quanto ao recheio, tempo de corrida e gradiente. A figura 5
exemplifica um cromatograma típico ao final destas adaptações:
37
Figura 5 – Cromatograma típico de solução padrão de concentração 1,25 ng/mL em condições
ideais
Nota-se que, ao final das adaptações, o pico está mais fino, melhor
definido, com uma boa intensidade e livre de interferentes quando comparado
com o pico cromatográfico da figura 4.
Repara-se também que o tempo de retenção do analito foi maior se
comparado com o tempo de retenção do método utilizado como base, por isso,
um maior tempo de corrida foi necessário para que interferentes fossem
eliminados e para que a coluna voltasse ao seu estado de equilíbrio antes de
uma próxima injeção, ou seja, para que a composição de fase móvel presente
no interior da coluna seja a mesma que a composição inicial da corrida.
Percebe-se que uma coluna com as mesmas dimensões, mas com recheio
diferente, interagiu com a molécula de forma diferente e por isso, para se obter
um pico cromatográfico de qualidade, foi preciso adaptar-se o fluxo e o
gradiente do método.
Sendo assim, o método validado teve as seguintes condições
cromatográficas de quantificação:
38
Tabela 3 – Método de Quantificação proposto
HPLC Agilent Technologies 1100 Series Detector AB Sciex API 4000 (MS/MS) Coluna ODS Hypersil (100 x 2.1)mm, 5µm Vol. Injeção 30 µL
Fase Móvel 5mM de Acetato de Amônio em Água (FM A) 5mM de Acetato de Amônio em Metanol (FM B)
Gradiente Tempo (minutos) FM A (%) FM B (%) 0.00 85 15 1.00 85 15 3.50 15 85 6.50 2 98 8.00 2 98 8.01 85 15 9.00 85 15 Fluxo 1.00 mL/min Tempo de Retenção esperado
4.1 min
Transições (m/z) 467.0/348.7 465.0/347.0
Modo de Ionização
Negativo
5.2. Tabela de resultados, curva de calibração e cromatogramas típicos
As tabelas a seguir mostram os resultados de área e concentrações
calculadas utilizando a curva de calibração (figura 6) encontrada injetando-se
soluções padrões de calibração ao início, durante e ao fim das injeções das
amostras fortificadas utilizadas para comprovar a validação do método.
39
Tabela 4 – Resposta das injeções Soluções Padrões de Calibração utilizadas na Curva de
Calibração
Amostra Concentração
esperada (ng/mL)
Recuperação (%)
Desvio Padrão
%CV
Média de 4 injeções
SPC A 0,125 92 0,0080 7,02 SPC B 0,250 96 0,0121 5,01 SPC C 0,500 100 0,0196 3,90 SPC D 1,250 103 0,0743 5,79 SPC E 2,500 99 0,2241 9,02
Média de 6 injeções
F1 0,500 83 7 9 F6 0,500 93 4 4
Tabela 5 – Recuperações dos Fortificados encontrados a partir da curva de calibração
Amostra Área do
Pico (cps)
Concentração Calculada (ng/mL)
Repureção (%)
UT 2485 N/A N/A QC 21215 0,214 85,4 Branco 1458 N/A N/A F1.1 18193 0,181 72,5 F1.2 20363 0,205 81,8 F1.3 21399 0,216 86,2 F1.4 23422 0,237 94,9 F1.5 20272 0,204 81,4 F1.6 20329 0,204 81,7 F6.1 22199 0,224 89,6 F6.2 21869 0,221 88,2 F6.3 22932 0,232 92,8 F6.4 23320 0,236 94,4 F6.5 24375 0,247 99,0 F6.6 23314 0,236 94,4
3
40
Figura 6 – Curva de Calibração
Figura 7 -Branco de Reagentes – Amostra sem matriz de citros, apenas com reagentes e
solventes
41
Figura 8 - UT (Amostra Testemunha): Amostra de citros sem adição de chlorfenapyr
Figura 9 - QC (Amostra Controle): Amostra testemunha fortificada no nível do LOQ após a
etapa de purificação
42
Figura 10 - F1 – Amostra Testemunha fortificada no nível do LOQ antes da rota de purificação
Figura 11 - F6 – Amostra Testemunha fortificada em 100xLOQ antes da rota de purificação
43
Figura 12 - SPC A – Solução Padrão de Calibração com concentração de 0,125 ng/mL
Figura 13 - SPC B – Solução Padrão de Calibração com concentração de 0,250 ng/mL
44
Figura 14 - SPC C – Solução Padrão de Calibração com concentração de 0,500 ng/mL
Figura 15 - SPC D – Solução Padrão de Calibração com concentração de 1,25 ng/mL
45
Figura 16 - SPC E – Solução Padrão de Calibração com concentração de 2,50 ng/mL
5.2.1. Curva Analítica e Linearidade
O intervalo de trabalho nas concentrações entre 0,125 ng/mL e 2,50
ng/mL foi linear com um coeficiente de correlação (r) ≥ 0,99 como mostra a
curva de calibração na figura 6:
Isso indica que é possível encontrar concentrações de amostras com
quantidades desconhecidas do analito desde que estas apresentem uma área
do pico cromatográfico que se encontre entre o ponto mais baixo e o ponto
mais alto da curva de calibração.
O menor ponto utilizado na curva de calibração ( 0,125 ng/mL) é 50 vezes
menor que o maior ponto (2,50 ng/mL) o que mostra que o método tem uma
boa faixa linear de trabalho.
46
5.2.2. Sensibilidade
O método mostrou-se bem sensível na faixa de concentração trabalhada
já que a inclinação da curva foi de 9,43X104, o que indica que uma maior
quantidade de analito injetada apresentava um grande aumento de sinal no
detector, ou seja, é sensível a pequenas mudanças na concentração de
Chlorfenapyr. Essa sensibilidade pode ser reparada no aumento de área em
um padrão de menor concentração quando comparado com um de maior
concentração.
5.2.3. Limite de Detecção e Limite de Quantificação
O Limite de Quantificação (LOQ) validado foi de0,01 mg de chlorfenapyr
por kg de citros. Na amostra isso representa um concentração de 0,250 ng/mL.
O Limite de Detecção (LOD) do método foi convencionado como 20% do Limite
de Quantificação (LOQ).
5.2.4. Seletividade
Uma vez que a detecção foi realizada por CLAE-EM/EM, a determinação
de Chlorfenapyr foi altamente seletiva. Não houve nenhuma interferência no
tempo de retenção do analito como pode ser visto na figura 8, 9 e 13.
A figura 8, que representa uma UT(amostra testemunha: citros sem
tratamento com chlorfenapyr) mostra que não houve um aumento de sinal no
tempo de retenção do analitoe portanto, não há um interferente na matriz que
possa ser confundido com o composto em análise que possa gerar um falso
positivo
Quando a amostra é fortificada com uma quantidade conhecida de ativo
ao final da rota de purificação da amostra(figura 9), o pico se apresenta de
forma simétrica e sem nenhum interferente e semelhante a um padrão utilizado
como um dos níveis da curva de calibração, ou seja, de mesma concentração
porém sem matriz (figura 13). Isso comprova que a matriz não contém outras
substâncias capazes de serem confundidas com o analito quando se utiliza
47
este método cromatográfico. A comprovação mais eficiente dessa ausência de
interferentes será avaliada no item 5.4 do presente trabalho.
5.2.5. Exatidão de Medição
Todas as recuperações dos níveis de fortificação 1xLOQ e 100xLOQ
apresentaram valor de recuperação dentro da faixa aceitável entre 70 e 120% o
que significa que o método pode ser considerado válido neste critério. Uma
maior recuperação foi encontrada no nível de fortificação maior, porém não foi
algo muito significativo. Isso se deve pois o fortificado de maior nível (F6), por
ser adicionado uma maior quantidade de analito na amostra, precisa ser diluído
antes de ser injetado no sistema cromatográfico para que sua concentração
seja coberta pela faixa linear da curva de calibração e portanto tem menor
quantidade de matriz em relação ao fortificado 1xLOQ (F1). Essa maior
quantidade de matriz provavelmente suprimiu um pouco o sinal do detector e
por isso uma menor recuperação foi encontrada, mesmo que dentro da faixa de
aceitação. Essa supressão ou aumento de sinal no nível de fortificação mais
baixo é comum em matrizes complexas como a vegetal e por isso deve-se
sempre avaliar um fortificado no nível do LOQ (sem diluição) para comprovar
que essa interferência não seja significativa para os resultados.
Todos os padrões da curva de calibração também apresentaram
recuperação dentro da faixa aceitável com um desvio do valor real
desconsiderável, demonstrando que o equipamento e o preparo das soluções
são eficientes quanto à exatidão.
5.2.6. Precisão da Medição
A tabela 4 mostra que a variação dos valores encontrados para ambos os
níveis de fortificação foi satisfatório: CV = 9 e 4% para o nível do LOQ e
100xLOQ respectivamente. Isso mostra que o equipamento e o método de
extração e purificação da amostra tem reprodutibilidade e que parâmetros
importantes como temperatura ambiente, volume de injeção, fluxo de fase
móvel, volume de alíquota e de diluição foram mantidos constantes e
realizados com vidraria e equipamentos qualificados, já que ambos possuem
48
CV dentro do limite aceitável (< 20%).A comprovação de que o equipamento é
eficiente quanto a reprodutibilidade das condições de injeção pode ser vista
analisando o Coeficiente de Variância das soluções padrões de calibração, que
assim como as amostras fortificadas, apresentam variações pequenas.
5.3. Robustez do Método
Para se comprovar que o método é robusto, os seguintes parâmetros
foram alterados:
1. A temperatura do forno de colunas do HPLC foi alterada de 20
para 25 ºC.
2. O fluxo de fase móvel foi alterado de 1.00para 0.90 mL/min
A tabela 6 mostra os resultados de uma validação nas condições
descritas acima:
Tabela 6 – Recuperações dos Fortificados encontrados a partir da curva de calibração (Teste
de robustez)
Amostra Concentração
esperada (ng/mL)
Recuperação (%)
Desvio Padrão
%CV
Média de 4 injeções
SPC A 0,125 109 0,009 6,21
SPC B 0,25 103 0,016 6,29
SPC C 0,5 100 0,019 3,81
SPC D 1,25 97 0,042 3,50
SPC E 2,5 100 0,054 2,15
Média de 6 injeções
F1 0,5 96 10 10
F6 0,5 92 7 7
O cromatograma da figura 17 representa o perfil do pico cromatográfico
após as alterações do fluxo e temperatura do forno e a figura 18 apresenta a
curva de calibração obtida.
49
Figura 17 – Cromatograma típico de Solução Padrão de concentração 1,25 ng/mL
apósajustes para o teste de robustez
Figura 18 – Curva de Calibração (Teste de robustez)
50
Repara-se que houve um leve alargamento do pico e o tempo de retenção
aumentou ligeiramente. Isso já era esperado já que um fluxo menor implica em
uma menor velocidade em que o fase móvel percorre por dentro da fase
estacionária e portanto um maior tempo até que o analito chegue ao detector.
Porém, não foram alterações significativas para os resultados do método
como pode ser comprovado pelas recuperações dos fortificados e dos padrões
de calibração (dentro da faixa aceitável – 70 a 120%) e seus respectivos
coeficientes de variação (todos menor que 20%) e a curva de calibração com r
> 0,99.
Essa comprovação de que algumas alterações não afetam o resultado
esperado do método mostra que se trata de um método robusto e que tem
reprodutibilidade.
5.4. Interferência de Matriz
A figura 19 compara uma curva de calibração em solução de metanol e
uma curva de calibração em solução contendo matriz vegetal.
Como pode ser percebido, o efeito da matriz para essas condições
cromatográficas de análise de chlorfenapyr pode ser considerado desprezível.
O sinal não foi suprimido ou aumentado por interferentes e a curva de
calibração apresentou a mesmo comportamento nas duas soluções. Isso
comprova que o método de purificação da amostra é eficiente para a
quantificação de chlorfenapyr por Espectrometria de Massas/Massas, o
detector tem a capacidade de separar todos os interferentes que ainda restam
na amostra após o clean-up.
51
Figura 19 – Comparação: Curva de calibração com e sem matriz
5.5 Estabilidade das Soluções
As tabelas 7, 8 e 9 apresentam os resultados obtidos no estudo da
estabilidade da Solução Padrão de Estoque (SPE) e as tabelas 10 e 11
mostram os resultados da estabilidade da Solução Padrão de Calibração
(SPC). Verificou-se vários pontos de amostragem para garantir a estabilidade
da solução em um tempo inferior, caso no tempo ideal esperado, a degradação
ou concentração da solução já tenha ocorrido. Por exemplo, se a SPE em 101
dias apresenta-se alta variação, a tabela 8 já comprovaria sua estabilidade por
2 meses (56 dias)
A média da concentração da solução estocada a 101 dias apresentou
uma variação de 5,77% quando comparada com a uma solução fresca como
pode ser vista na tabela 9. Esse resultado demonstra que a solução pode ser
estocada e utilizada até 101 dias sem apresentar degradação ou concentração
de solvente significativas.
y = 90171x + 3063,8R² = 0,9961
y = 89798x + 1768,6R² = 0,9963
0,0E+00
5,0E+04
1,0E+05
1,5E+05
2,0E+05
2,5E+05
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Inte
nsi
da
de
(cp
s)
Concentração (ng/mL)
Área - Sem matriz(cps)
Área - Com matriz(ng/mL)
52
A estabilidade também foi comprovada para a SPC tendo variação de
concentração média de 6,61% após 30 dias de armazenagem (tabela 11)
Tabela 7 – Estabilidade de 28 Dias – SPE Estabilidade de 28 Dias – Solução Padrão Estoque
Concentração da Solução Fresca (ng/mL) Concentração da Solução
Armazenada (ng/mL)
0.505 0.515
0.479 0.522
0.508 0.548
0.492 0.521
0.514 0.526
0.526 0.538
0.517 -
Média 0.506 Média 0.528
Variação Entre as Médias de Concentrações Obtidas 4.44%
Tabela 8– Estabilidade de 56 Dias – SPE Estabilidade de 56 Dias - Solução Padrão Estoque
Concentração da Solução Fresca (ng/mL) Concentração da Solução
Armazenada(ng/mL)
0.508 0.502
0.575 0.503
0.479 0.541
0.515 0.477
0.498 0.507
0.460 0.524
- -
Média 0.506 Média 0.509 Variação Entre as Médias de Concentrações Obtidas 0.63%
53
Tabela 9– Estabilidade de 101 Dias – SPE
Estabilidade de 101 Dias - Solução Padrão Estoque
Concentração da Solução Fresca (ng/mL) Concentração da Solução
Armazenada (ng/mL)
0.556 0.582 0.512 0.584
- 0.555 - 0.549 - 0.568 - 0.551
Média /Mean: 0.534 Média /Mean: 0.565
Variação Entre as Médias de Concentrações Obtidas 5.77%
Tabela 10– Estabilidade de 15 Dias – SPC
Estabilidade de 15 Dias – Soluções Padrão de Calibração
Concentração da Solução Fresca (ng/mL) Concentração da Solução
Armazenada (ng/mL)
0.552 0.472 0.485 0.515 0.426 0.467
- 0.455 - 0.435 - 0.395
Média 0.488 Média 0.457
Variação Entre as Médias de Concentrações Obtidas 6.39%
Tabela 11– Estabilidade de 30 Dias – SPC
Estabilidade de 30 Dias - Soluções Padrão de Calibração
Concentração da Solução Fresca (ng/mL) Concentração da Solução
Armazenada (ng/mL)
0.455 0.524 0.513 0.548 0.530 0.544 0.495 0.569 0.540 0.539 0.524 0.535
Média 0.510 Média 0.543
Variação Entre as Médias de Concentrações Obtidas 6.61%
54
6. CONCLUSÃO
Um método analítico de Cromatografia líquida de Alta Eficiência acoplado
a um detector de Espectrometria de Massas em série foi proposto e validado
para doseamento deChlorfenapyr em matriz vegetal de citros demonstrando
ser simples, rápido, preciso, exato e reprodutível, segundo os critérios da
ANVISA.
A adaptação da fase estacionária utilizada no método foi considerada
satisfatória já que a validação proposta foi concluída sendo avaliados todos os
critérios exigidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
A análise do Coeficiente de Correlação, Coeficiente de Variação, e
Recuperação Calculada foi utilizada como ferramenta para análise da
linearidade; precisão e exatidão do método, respectivamente. r > 0,99,
CV<20% e Recuperações entre 70% e 120% foram encontradas para todas as
amostras fortificadas e padrões da curva de calibração. Além disso, a
sensibilidade foi avaliada pela a inclinação da curva de calibração, e a
seletividade se comprovou satisfatória pela análise de interferentes
apresentados no cromatograma.
A robustez do método foi comprovada pela mudança do fluxo de fase
móvel do método assim como a temperatura em que a fase estacionária se
encontrava durante o processo de quantificação.
A análise de possíveis interferentes na resposta do detector presentes na
matriz vegetal de citros foi realizada comparando-se a resposta do detector a
uma curva de calibração diluída em solução de metanol com uma curva de
calibração diluída em solução contendo a matriz vegetal.
A estabilidade das soluções utilizadas durante o estudo de validação foi
comprovada comparando soluções estocas com soluções frescas e obtendo-se
resultados semelhantes. A Solução Padrão de Calibração estocada por 30 dias
apresentou variação de 6,61% quando comparada com uma solução preparada
no dia, enquanto a Solução Padrão Estoque armazenada por 101 dias
apresentou variação de 5,77%.
O método analítico de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado
a um detector de Espectometria de Massas/Massas em série constitui,
55
portanto, uma ferramenta útil na rotina de estudos de análise de resíduo de
defensivos agrícolas.
56
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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