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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
FACULDADE DE FARMÁCIA
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETORA DE
EXTRATO DE Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE) VISANDO APLICAÇÕES
COSMÉTICAS
TAMIRES CALAES OLIVEIRA
Juiz de Fora
2016
2
Tamires Calaes Oliveira
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETORA DE
EXTRATO DE Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE) VISANDO APLICAÇÕES
COSMÉTICAS
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
a Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal de Juiz de Fora como requisito parcial
a obtenção do título de Farmacêutica.
Orientadora: Profª. Drª. Fabiola Dutra Rocha
Juiz de Fora
2016
3
Tamires Calaes Oliveira
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETORA DE
EXTRATO DE Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE) VISANDO APLICAÇÕES
COSMÉTICAS
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado à Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Juiz de Fora
como requisito parcial a obtenção do título
de Farmacêutica.
Aprovada em _____ de____________ de 2016
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Profª. Drª. Fabiola Dutra Rocha - Orientador
Universidade Federal de Juiz de Fora
________________________________________
Prof. Dr. Guilherme Diniz Tavares
Universidade Federal de Juiz de Fora
________________________________________
Mestre Jordana Abreu Lazzarini
Universidade Federal de Juiz de Fora
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente Deus, pelo amor incondicional, pela força e amparo
em momentos tão difíceis.
Ao meu pai José Romeu e minha mãe Vera pelo exemplo de vida, carinho e
atenção em todos os momentos dessa jornada!
Aos meus irmãos Viviane e Paulo Henrique pelo incentivo, exemplo e carinho
sempre que precisei. À minha grande família, pelo amor e apoio de sempre.
Às minhas grandes amigas IgGs que sempre me ouviram, deram força, me
empurrando para frente e me aturando nos momentos de “picos” de estresse!!
Ao meu namorado Thomaz pelo apoio, carinho e compreensão.
À minha orientadora, Profª Drª Fabíola, não somente por toda sua
contribuição neste trabalho, mas por sua amizade, paciência, dedicação e pelos
ensinamentos tanto profissionais quanto pessoais. Você sempre será para mim um
modelo de profissional que um dia pretendo ser.
A toda equipe do laboratório de Farmacognosia, professora Magda, Celinha e
alunos de iniciação científica, pela ajuda e amizade em todos os momentos sem os
quais não seria possível a conclusão desse trabalho.
Aos professores e alunos da UFRJ que coletaram e identificaram as plantas
estudadas e que forneceram alguns dos extratos e frações que foram testados.
A PROPESQ pelo apoio financeiro à iniciação científica.
Ao CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro que possibilitou adquirirmos
reagentes e equipamentos para a realização dos ensaios.
Aos membros da banca pela disponibilidade e boa vontade.
E por último, a todos que torceram por mim para a conquista dessa nova
etapa.
MUITO OBRIGADA!!
5
RESUMO
A exposição à radiação solar traz vários benefícios a saúde, uma vez que
estimula a produção de vitamina D, ajuda a controlar algumas doenças crônicas da
pele e provoca uma sensação de bem-estar. No entanto, quando em excesso, pode
causar danos cutâneos agudos e crônicos, como queimaduras solares,
aparecimento de rugas e outras mudanças associadas com o envelhecimento da
pele, além de certos tipos de tumores. O uso de fotoprotetores é uma das principais
abordagens na prevenção dos efeitos prejudiciais da radiação ultravioleta (UV). A
busca por alternativas mais eficientes, multifuncionais (fotoproteção, antioxidante,
antienvelhecimento), bem como menor uso de agentes sintéticos e com menor
potencial irritante, tem despertado o interesse de muitos pesquisadores. Nesse
sentido, os extratos vegetais ricos em quantidade e variedade de metabólitos
fenólicos, associado com pronunciada atividade antioxidante, com baixa toxicidade e
impacto ambiental insignificante, surgem como alternativa promissora. A espécie
Eugenia uniflora L. (Myrtaceae), popularmente conhecida como pitangueira,
pertence a um gênero que é conhecidamente rico em metabólitos fenólicos
(flavonoides, taninos, fenólicos simples) e com grande potencial antioxidante. Desta
forma, o presente trabalho teve como principal objetivo avaliar as atividades
antioxidante e fotoprotetora, in vitro, do extrato hidroalcoólico dos ramos em forma
de galhos de E. uniflora (EEAgEu) e suas frações, bem como desenvolver uma
formulação a base de silicone, contendo tal extrato incorporado. O perfil químico do
EEAgEu e suas frações em hexano (FHgEu), em diclorometano (FDgEu), em
acetato de etila (FAgEu) e fração residual (FRgEu) foi estabelecido quali e
quantitativamente através, respectivamente, de CCD e de determinação do teor de
metabólitos fenólicos totais pelo método espectrofotométrico com o reagente de
Folin-Ciocalteu. A atividade antioxidante das amostras foi estabelecida pelo método
de redução do radical DPPH. Já o potencial fotoprotetor do EEAgEu foi avaliado pelo
método espectrofotométrico in vitro do Fator de Proteção Solar (FPS). A análise dos
cromatogramas por CCD revelou a presença predominante e diversificada de
metabólitos polifenólicos no EEAgEu e suas frações. O teor total de substâncias
fenólicas encontrado foi de 23 a 376 mg EAG/g de amostra e as CE50 no teste com
DPPH variaram de 9 a 52 µg/mL, sendo que os melhores resultados foram para o
EEAgEu (376 mg EAG/g ±64,5 e CE50 = 9 µg/mL ±0,35). O valor de FPS (espectrométrico)
para o EEAgEu a uma concentração de 200mg/L, diluído em etanol, foi de 7. O
EEAgEu foi incorporado a uma formulação a base de silicone em concentrações de
2,5, 5 e 10% p/p, a qual demonstrou ser estável preliminarmente após a adição do
extrato, quanto a características físico-químicas (análises macroscópicas, ensaio de
centrifugação e pH). A formulação contendo 100 mg/g de EEAgEu teve um valor de
FPS(espectrométrico) de 6. Os resultados indicam que o EEAgEu pode ser fonte de
substâncias bioativas com pronunciada atividade antioxidante, além de interessante
atividade fotoprotetora e dessa forma constitui uma alternativa para futuras
aplicações cosméticas.
Palavras-chaves: Eugenia uniflora L., substâncias fenólicas, potencial antioxidante;
atividade fotoprotetora.
6
ABSTRACT
Exposure to solar radiation has several health benefits, since it stimulates the
production of vitamin D, helps control certain chronic diseases of the skin and causes
a feeling of well-being. However, when excessive, can cause acute and chronic skin
damage such as sunburn, appearance of wrinkles and other changes associated with
skin aging, and certain types of tumors. The use of sunscreens is a major approach
in preventing the damaging effects of ultraviolet (UV) radiation. The search for more
efficient, multifunctional alternative (photoprotection, antioxidant, anti-aging) and less
use of synthetic agents and less irritation potential has aroused the interest of many
researchers. In this sense, the plant extracts rich in quantity and variety of phenolic
metabolites associated with pronounced antioxidant activity, low toxicity and
negligible environmental impact, emerge as a promising alternative. The species
Eugenia uniflora L. (Myrtaceae), popularly known as Surinam cherry, belongs to a
genre that is known to be rich in phenolic metabolites (flavonoids, tannins, simple
phenols) with great potential antioxidant. Thus, this study aimed to evaluate the
antioxidant activity and fotoprotera, in vitro, the hydroalcoholic extract of the branches
in the form of E. uniflora branches (EEAgEu) and its fractions, as well as develop a
formulation based on silicone, containing such embedded statement. The chemical
profile EEAgEu and its fractions in hexane (FHgEu) in dichloromethane (FDgEu) in
ethyl acetate (FAgEu) and residual (FRgEu) was established qualitatively and
quantitatively by, respectively, CCD and determining the content phenolic metabolites
by the spectrophotometric method with the Folin Ciocalteu method. The antioxidant
activity of the samples was established by the reduction of the DPPH method. But the
potential of photoprotective EEAgEu was evaluated by spectrophotometric method in
vitro Sun Protection Factor (SPF). The analysis of chromatograms by TLC revealed
the predominant and diverse presence of polyphenol metabolites in EEAgEu and its
fractions. The total content of phenolic compounds was found to be 23-376 mg
GAE/g of sample and EC50 in the test with DPPH varied 9 to 52 µg/mL, and the best
results were to EEAgEu (376 mg GAE/g ± EC50 = 9 and 64.5 µg/mL ± 0.35). The
value of SPF (spectrometric) for EEAgEu at a concentration of 200mg/L diluted in ethanol
was 7. The EEAgEu was incorporated into a silicone formulation in concentrations of
2.5, 5 and 10% p/p, which proved to be stable after the addition of the extract, as the
physicochemical characteristics (macroscopic analysis, assay centrifugation and pH).
The formulation containing 100 mg/g EEAgEu had an value SPF(spectrometric) 6. The
results indicate that the EEAgEu can be a source of bioactive substances with a
pronounced antioxidant activity, and interesting photoprotective activity and therefore
constitute an alternative for future cosmetic applications.
Keywords: Eugenia uniflora L., phenolic substances, antioxidant potential;
photoprotective activity.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Foto de exemplares da planta Eugenia uniflora L. – PITANGA. 16
Figura 2. Flor de Eugenia uniflora L. 17
Figura 3. Fruto de Eugenia uniflora L. 18
Figura 4. Estruturas químicas de (1) galocatequina e (2) miricitrina. 19
Figura 5. Estruturas químicas de (1) oenoteína B, (2) eugeniflorina D1 e (3)
eugeniflorina D2. 19
Figura 6. Estruturas químicas de (1) galoil-2,3-di-O-galoil-β-D-glicose; (2) 1,2,3,4,6-
penta-O-galoil-β-D-glicose; (3) gemina D; (4) hippomanina A; (5) camptotina A; (6)
canferol-3-α-L-ramnopiranosídeo; (7) miricetina-3-O-(2”-O-galoil)-α-L-
ramnopiranosídeo. 20
Figura 7. Estruturas químicas. Carotenoides: (A) Licopeno e (B) β-Caroteno; (C)
Rubixantina. 22
Figura 8. Estruturas de antocianinas descritas para espécies de Eugenia. 22
Figura 9. Estruturas químicas de (1) miricetina, (2) canferol e (3) quercetina. 23
Figura 10. Estruturas químicas de alguns constituintes identificados no óleo
essencial de E. uniflora. (A) Citronelol; (B) Geraniol; (C) Cineol; (D) e (E)
Sesquiterpenos: Germacreno B e curzereno e furanodieno. 24
Figura 11. Estruturas das substâncias (1) germacrona, (2) curzereno, (3)
furanodieno, (4) germacreno B, (5) β-elemenona, (6) γ-elemeno e (7) β-cariofileno
presentes no óleo essencial das folhas de Eugenia uniflora L. 24
Figura 12. Exemplos das principais classes de metabólitos fenólicos: ácidos
fenólicos (1), fenilpropanoides (2), flavonoides (3) e taninos (4). 26
Figura 13. Estrutura química geral de derivados do ácido benzóico. 27
Figura 14. Estrutura química geral de derivados do ácido cinâmico. 28
Figura 15. Estrutura básica dos flavonoides. 28
Figura 16. Exemplos das principais subclasses de flavonoides. 29
Figura 17. Esquema simplificado da respiração celular. 31
Figura 18. Reações de Fenton [1] e Haber-Weiss [2]. 32
Figura 19. Esquema exemplificador da estabilização do radical fenoxila por
ressonância. 33
Figura 20. Representação das camadas da pele. 35
8
Figura 21: Representação do espectro de radiação eletromagnética emitido pelo sol.
37
Figura 22. Mecanismos de interação dos filtros ultravioleta com a radiação solar.
40
Figura 23. Forma de ação dos filtros UV inorgânicos e orgânicos. 40
Figura 24. Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos
E. uniflora. 48
Figura 25. Incorporação do EEAgEu à formulação 1. 56
Figura 26. Cromatogramas em CCD. Fase estacionária: sílica GF254. Fase móvel
hexano:acetato de etíla 8:2 para (A), (B) e (C); cloroformio metanol 9:1 para (D).
Reveladores utilizados (A): sulfato cérico (B): anisaldeído sulfúrico (C): cloreto férrico
(D): NP/PEG. 60
Figura 27. Cromatograma CCD. Fase estacionária: sílica C18 (fase inversa). Fase
móvel: Butanol : ácido acético: água (4: 1: 5). Revelador: NP/PEG. 60
Figura 28. Varredura do extrato de E. uniflora na região do ultravioleta (200 a
400nm). 61
Figura 29. Esquema de desprotonação do ácido gálico em meio alcalino e posterior
reação com molibdênio presente no reagente de Folin Ciocaulteu. 62
Figura 30. Redução do radical livre DPPH. 66
Figura 31. Varredura na região do ultravioleta (200 a 400nm) das formulações 1 e 2.
72
Figura 32. Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel incorporado à formulação 1 a 10%v/p.
73
Figura 33. EEAgEu incorporado a formulação 1 nas concentrações de: (A) 2,5%; (B)
5% e (C) 10%p/p. 73
9
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Curvas analíticas sobrepostas de ácido gálico, obtidas para a
quantificação de substâncias fenólicas por espectrofotometria no ultravioleta-visível
em λ 760 nm. 63
Gráfico 2. Curva analítica de ácido gálico equivalente aos três dias de ensaio. Os
valores representam a média ± desvio padrão. A equação da reta e o R2 se referem
à resultante dos três dias de ensaio. 63
Gráfico 3. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu comparados com o
valor mínimo de atividade fotoprotetora UVB de 6. 75
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fontes endógenas e exógenas das espécies reativas de oxigênio no corpo
humano. 29
Tabela 2. Constante EE x I empregada no cálculo por espectrofotometria. 54
Tabela 3. Formulação 1- com silicone 9011 54
Tabela 4. Formulação 2- com silicone 5225. 55
Tabela 5. Doseamento de substâncias fenólicas expressos em equivalente em ácido
gálico (EAG mg/g amostra). 64
Tabela 6. CE50 do EEAgEu, suas frações e extrato de G. Biloba frente ao radical
DPPH. 67
Tabela 7. Análise estatística pela Correlação de Pearson entre o teor de derivados
fenólicos total e a atividade antioxidante obtida pelo método DPPH. 69
Tabela 8: Resultados de FPS das soluções em etanol de EEAgEu, por leitura em
espectrofotômetro. 70
Tabela 9. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu, por leitura em
espectrofotômetro. 74
11
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 13
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14
2.1. Gênero Eugenia 14
2.2. Eugenia uniflora Linnaus 15
2.3. Metabólitos fenólicos 25
2.4. Estresse oxidativo e antioxidantes 29
2.5. Efeitos da radiação solar sobre a pele 34
2.6. Proteção solar 39
3. OBJETIVOS 43
3.1. Objetivo Geral 43
3.2. Objetivos Específicos 43
4. MATERIAL E MÉTODOS 44
4.1. Material vegetal 44
4.1.1. Autorizações 44
4.1.2. Eugenia uniflora Linnaeus 44
4.2. Equipamentos e reagentes 44
4.3. Preparação de reagentes 46
4.4. Obtenção dos extratos e frações 47
4.5. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do extrato e das frações
48
4.6. Obtenção do espectro de varredura na região do ultravioleta 48
4.7. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos 49
4.8. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de redução
do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH•) 51
4.9. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS
espectrofotométrico) in vitro do extrato 53
4.10. Preparação das formulações 54
4.10.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações 55
4.10.2. Incorporação do EEAgEu a formulação 1. 55
4.11. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS
espectrofotométrico) in vitro 56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 58
12
5.1. Caracterização Química de Eugenia uniflora 58
5.2. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos 61
5.3. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de redução
do radical 1,1-difenil-2-picrilidrazila (DPPH) 65
5.4. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS espectrofotométrico)
in vitro do extrato 70
5.5. Obtenção das formulações 71
5.5.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações 72
5.6. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS
espectrofotométrico) in vitro 73
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO 77
REFERÊNCIAS 79
13
1. INTRODUÇÃO
A espécie Eugenia uniflora L., de nome popular pitangueira, é uma árvore
nativa no Brasil, mas muito cultivada e difundida em outros países da América do Sul
(SANTOS, FILHO & CASTRO, 2015). Essa espécie possui muitos constituintes já
identificados, dentre eles muitos metabólicos fenólicos (CARVALHO, 2013). Em
geral, substâncias fenólicas são descritas como potentes antioxidantes, agindo por
diversos mecanismos como: doação de elétrons, interrupção da cadeia de reações
de oxidação e quelação de metais (MARTOS et al., 2010; SOUZA, 2013).
A teoria de que o envelhecimento é resultado de danos causados por radicais
livres baseia-se na observação de que a irradiação da luz solar, dependendo da
energia, em seres vivos induz a formação de radicais livres. Uma produção
exacerbada de radicais livres diminui o tempo de vida desses seres e produz
mudança que conduz ao envelhecimento. De acordo com esta teoria, o lento
desenvolvimento de danos celulares irreversíveis leva ao envelhecimento (HIRATA,
SATO & SANTOS, 2004).
A exposição da pele à radiação ultravioleta (UV) é responsável por alterações
cutâneas relacionadas com o envelhecimento precoce, sendo que a maioria é
resultante da ação das espécies reativas de oxigênio (ERO). Embora muitas
formulações cosméticas contenham filtros para radiação UV, estes não
proporcionam uma proteção total da pele, principalmente quando são considerados
efeitos crônicos como o fotoenvelhecimento (DAMIANI et al., 2006). Desta maneira,
os antioxidantes, com extratos vegetais ricos em metabólitos fenólicos, têm sido
empregados em formulações fotoprotetoras com finalidade de proteger a pele contra
os ERO.
Nesse contexto, formulações fotoprotetoras com associações de extratos
vegetais ricos em constituintes fenólicos e outros filtros químicos de radiação UV têm
despertado grande interesse na área dermocosmética. Esse interesse surge a partir
da comprovação de sua capacidade tanto de absorver a radiação solar como a
antioxidante, que juntas podem intensificar a proteção final do produto e/ou
neutralizar os radicais livres produzidos na pele após exposição ao sol (SOUZA et
al., 2013). Assim, os resultados desta pesquisa poderão contribuir para um melhor
entendimento dos efeitos fotoprotetores dos extratos de Eugenia uniflora, quando
estes são adicionados a uma formulação cosmética.
14
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Gênero Eugenia
Eugenia é um dos 145 gêneros que compõem a família Myrtaceae. A família
Myrtaceae tem grande distribuição, sendo encontrada na sua maioria em zonas
tropicais e subtropicais e é representada por 5.970 espécies (THE PLANT LIST
2010). No Brasil, são registrados 23 gêneros e 1.034 espécies. Os gêneros de maior
representatividade em espécies são: Eugenia com 2.218 espécies e Myrcia com
1.227 espécies (THE PLANT LIST 2010; SOBRAL et al., 2016).
Uma grande variedade de Myrtaceae é registrada nas restingas brasileiras,
podendo ser considerada a família mais representativa da restinga do Rio de
Janeiro. Também o gênero Eugenia é o mais representativo da região (PLAZA,
2007).
O gênero Eugenia se destaca por seu grande potencial econômico,
farmacológico e possui grande exploração comercial dos seus frutos (que são
comestíveis), de sua madeira, do óleo essencial, além do uso como plantas
ornamentais (QUEIROZ et al., 2015).
Uma grande gama de plantas do gênero Eugenia tiveram suas atividades
biológicas registradas, como atividades antimicrobiana, antifúngica (SÁ, 2008),
hipoglicemiante (COUTO et al., 2009), diurética (TIMBOLA et al., 2002), adstringente
(REVILLA, 2002), anti-inflamatória (HUSSEIN et al., 2003), desordens gástricas
(CONSOLINI, BALDINI & AMAT, 1999), anticonvulsivante (DIAS et al., 2012),
carminativa (LEE et al., 1997), ente outras atividades. Esses registros conduziram a
vários estudos relativos à variabilidade genética, análise de composição e atividades
biológicas dos constituintes que integram as plantas, com finalidade de comprovação
terapêutica (DONATO & MORRETES, 2007; SLAVIERO et al., 2009; STEFANELLO,
PASCOAL & SALVADOR, 2011; QUEIROZ et al., 2015).
A composição dos óleos essenciais de espécies de Eugenia, bem como outras
plantas da família Myrtaceae já foi amplamente estudada. Existe uma grande
predominância de monoterpenos e sesquiterpenos nos óleos essenciais de espécies
desta família (LIMBERGER et al., 2004). Diferenças quantitativas e qualitativas nos
óleos essenciais entre espécies de Eugenia têm sido propostas como dado útil para
melhor caracterização taxonômica de espécies do gênero (COLE, HARBER &
SETZER, 2007).
15
O perfil químico do gênero Eugenia revela-se rico em substâncias fenólicas,
como taninos, substâncias fenólicas simples e flavonoides. Por possuir alto teor de
derivados polifenólicos, as espécies do gênero Eugenia têm como característica
importante a atividade antioxidante, relacionada a estas substâncias (EINBOND et
al., 2004). Além de substâncias fenólicas, como taninos (LEE et al., 1997; YANG,
LEE & YEN, 2000) e flavonoides (EINBOND et al., 2004), foram descritos para o
gênero Eugenia substâncias derivados do metabolismo dos terpenos, como os
triterpenos e esteroides (GU et al., 2001; LUNARDI et al., 2001), carotenoides
(AZEVEDO-MELEIRO & RODRIGUEZ-AMAYA, 2004), entre outros metabólitos
(CRUZ & KAPLAN, 2005).
A presença de metabólitos flavonoidicos é descrita em várias espécies do
gênero Eugenia, sendo que são formados principalmente pelas agliconas quercetina
e miricetina. Muitas agliconas são relacionadas às atividades biológicas
apresentadas para estas espécies, como anti-inflamatória, inibidora da xantina-
oxidase (enzima relacionada a patologia da artrite e gota) e também à atividade
antioxidante (THEODULOZ et al., 1988; EINBOND et al., 2004).
2.2. Eugenia uniflora Linnaus
A espécie Eugenia uniflora L. (Figura 1), a popular pitangueira, é uma árvore
nativa no Brasil, contudo muito cultivada e difundida em outros países da América do
Sul (SANTOS et al., 2015). No Brasil, essa espécie ocorre desde o estado de Minas
Gerais até o Rio Grande do Sul, sendo abundante em matas ciliares, florestas de
ilhas da costa litorânea e nos biomas caatinga e restinga (FIUZA et al., 2008; DIAS
et al., 2011).
16
Figura 1. Foto de exemplares da planta Eugenia uniflora L. – PITANGA.
Fonte: LOPES, 2008.
É uma planta semidecídua, heliófita e higrófita seletiva, tendo arbustos ou
arvoretas de até 8 m e com 20-50 cm de altura. O fruto possui sabor agradável e
refrescante, com um aroma atrativo, o que desperta interesse em relação ao cultivo
dessa espécie, como uma promissora atividade econômica (BRUN & MOSSI, 2010;
DIAS et al., 2011).
A espécie E. uniflora possui folhas jovens de coloração bronze que passa a
verde escuro de acordo com seu envelhecimento. São plantas glabras de folhas
mais ou menos coriáceas, elípticas ou ovadas, com ápice agudo ou acuminado e
base obtusa ou aguda, opostas simples com pequenas espículas. São peninérveas
com uma nervura que acompanha a base do limbo, de 3 a 7 cm de comprimento e
com aroma característico (BRUN & MOSSI, 2010; SANTOS et al., 2015). As flores
(Figura 2) são brancas, podendo ser encontrada sozinhas ou em grupos de 2 ou 3
flores nas axilas e nas extremidades dos ramos (FIUZA et al., 2008).
17
Figura 2: Flor de Eugenia uniflora L.
FONTE: FLORARS, 2012.
Os frutos (Figura 3) são bagas arredondadas e relativamente pequenas, de
cor vermelha, amarela ou preta, contendo 1 a 2 sementes, tendo como parte
comestível a sua polpa carnosa e agridoce. A polpa possui sabor exótico e é rica em
cálcio, fósforo, antocianinas, flavonoides, carotenoides e vitamina C, o que indica
seu elevado poder antioxidante (FIUZA et al., 2008; BIERHALS et al., 2012).
18
Figura 3: Fruto de Eugenia uniflora L.
FONTE: FLORARS, 2008.
Os primeiros registros do uso de E. uniflora na medicina popular brasileira
datam do século XV, pelos índios Guaranis contra diversas enfermidades. A espécie
é preconizada na medicina tradicional como anti-hipertensiva, diurética, adstringente,
antipirético e para o tratamento de desordens digestivas. Na Ilha da Madeira as
folhas de E. uniflora têm seu uso no tratamento de bronquites, gripes e problemas
no intestino e na Nigéria como um febrífugo (FIUZA et al., 2008).
As folhas têm seu uso na medicina popular na forma de infusões ou
decocções para controlar a diarreia e a tosse, como hipotensor, antigota e
hipoglicemiante (SANTOS et al., 2015; BRUN & MOSSI, 2010). Os frutos podem ser
consumidos in natura, polpa integral congelada, suco engarrafado, sorvetes, picolés,
licores, geleias, vinho entre outros. A pitangueira também pode fornecer madeira,
além de servir como planta ornamental e cerca viva por possuir copa densa e
compacta (DIAS et al., 2011; BIERHALS et al., 2012).
Nos trabalhos realizados por Lee e colaboradores (1997) foram verificados, a
partir das folhas de pitanga, constituintes fenólicos no extrato metanólico, entre eles
os derivados flavonoidicos galocatequina e miricitrina, (figura 4) além de taninos
como oenoteína B, eugeniflorina D1 e eugeniflorina D2 (figura 5).
19
Figura 4. Estruturas químicas de (1) galocatequina e (2) miricitrina.
(1) (2)
Fonte: LEE et al., 1997; MEOTTI, 2006.
Figura 5. Estruturas químicas de (1) oenoteína B, (2) eugeniflorina D1 e (3)
eugeniflorina D2.
(1)
(2) (3)
Fonte: LEE et .al., 1997.
20
Em um estudo recente, foram identificados a partir de extratos de folhas de
Eugenia uniflora L. diversos metabólitos fenólicos, entre eles o galoil-2,3-di-O-galoil-
β-D-glicose, o 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose, gemina D, hippomanina A,
camptotina A, canferol-3-α-L-ramnopiranosídeo e miricetina-3-O- (2”-O-galoil) -α-L-
ramnopiranosídeo (Figura 6) (CARVALHO, 2013).
Figura 6. Estruturas químicas de (1) galoil-2,3-di-O-galoil-β-D-glicose; (2) 1,2,3,4,6-
penta-O-galoil-β-D-glicose; (3) gemina D; (4) hippomanina A; (5) camptotina A; (6)
canferol-3-α-L-ramnopiranosídeo; (7) miricetina-3-O- (2”-O-galoil) -α-L-
ramnopiranosídeo.
(1) (2)
(3) (4)
21
(5)
(6) (7)
Fonte: CARVALHO, 2013.
Os frutos são ricos em carotenoides, como o licopeno, β-caroteno e
rubixantina, (Figura 7) (AZEVEDO-MELEIRO & RODRIGUEZ-AMAYA, 2004). Em
outra publicação, tendo como material de estudo a polpa congelada de pitanga, foi
encontrado alto ter de substâncias fenólicas e carotenoides. A pitanga contém
antocianidinas, as quais têm função importante na pigmentação tanto das flores
como dos frutos e apresentaram ação antioxidante. Vários pigmentos antociânicos
derivados de cianidina-3-O-β-glicopiranosídeo e delfinidina-3-O-β-glicopiranosídeo
têm sido descritos para espécies de Eugenia (Figura 8) (EINBOND et al., 2004). Em
pesquisas realizadas por HOFFMANN-RIBANI e colaboradores (2009) foram
identificados nos frutos de pitangueira os flavonoides miricetina, canferol e
quercetina (figura 9).
22
Figura 7: Estruturas químicas. Carotenoides: (A) Licopeno e (B) β-Caroteno; (C)
Rubixantina.
FONTE: Adaptado de AMBROSIO, CAMPOS & FARO, 2006; Adaptado de ARPIN &
LIAAEN-JENSEN SIMAS, 1969.
Figura 8. Estruturas de antocianinas descritas para espécies de Eugenia.
Fonte: KUSKOSKI et al., 2003.
(B)
(A)
(C)
23
Figura 9. Estruturas químicas de (1) miricetina, (2) canferol e (3) quercetina.
(1) (2) (3)
Fonte: PESSANHA, 2010.
No extrato em acetona dos frutos de Eugenia uniflora foram encontrados
carotenoides, sendo que o predominante foi o licopeno, seguido por derubixantina,
cis-rubixantina, β-criptoxantina, cis-licopeno, β-caroteno, γ-caroteno, zeaxantina,
luteína, violaxantina e β-caroteno-5,6-epóxido (AZEVEDO-MELEIRO &
RODRIGUEZ-AMAYA, 2004).
Nos óleos essenciais das folhas de E. uniflora foram encontrados
monoterpenos como citronelol, geraniol, cineol e sesquiterpenos (germacreno B,
curzereno e furanodieno) (Figura 10) (AURICCHIO et al., 2007; FIUZA et al., 2008;
LOPES, 2008 ALMEIDA, FARIA & SILVA, 2012). Em outro trabalho realizado com as
folhas, foi encontrado no óleo essencial a presença de β-ocimeno (7,4%), α-selineno
(7,2%), β-selineno (5,2%), germacreno B (7,2%) e ácido hexadecanóico (11,7%)
(BAGETTI, 2009). Santos e colaboradores (2015) identificaram no óleo essencial
das folhas jovens e maduras de E. uniflora, como principais constituintes, o
curzereno, a germacrona, o furanodieno, o germacreno B, a β-elemenona, o γ-
elemeno e o β-cariofileno (Figura 11).
24
Figura 10: Estruturas químicas de alguns constituintes identificados no óleo
essencial de E. uniflora. (A) Citronelol; (B) Geraniol; (C) Cineol; (D) e (E)
Sesquiterpenos: Germacreno B e curzereno e furanodieno.
Fonte: (A) Adaptado de MACIEL et al, 2010; (B) Adaptado de SIMAS et al, 2004; (C)
Adaptado de MORAIS et al, 2006; (D) Adaptado de LOPES, 2008; Adaptado de
MELO et al, 2007.
Figura 11. Estruturas das substâncias (1)germacrona, (2)curzereno, (3) furanodieno,
(4) germacreno B,(5) β-elemenona, (6) γ-elemeno e (7) β-cariofileno presentes no
óleo essencial das folhas de Eugenia unifloraL.
Fonte: SANTOS et al., 2015.
(B) (A) (C)
(D) Germacreno B Curzereno Furanodieno
25
Em relação ao uso na medicina tradicional da espécie E. uniflora, as folhas
têm sido citadas como eficientes no tratamento de diversas enfermidades como
febre, doenças estomacais e hipertensão (BANDONI et al., 1972; ALICE, 1991),
reumatismo (ALICE, 1991), bronquite (RIVERA & OBON, 1995), como atividade
calmante (CONSOLINI & SARUBBIO, 2002) e anti-inflamatória (SCHAPOVAL et al.,
1994).
Ensaios farmacológicos realizados com os extratos das folhas da E. uniflora
permitiram evidenciar atividade inibitória da enzima xantina-oxidase por ação dos
flavonoides (FIUZA et al., 2008). Também foi observada a ação das folhas na
medicina como diurético através de métodos in vitro (AMAT & YAJIA, 1991;
CONSOLINI et al., 1999), antimicrobiano e também como antifúngico (ADEBAJO,
OLOREK & ALADESANMI, 1989; HOLETZ et al., 2002; COELHO DE SOUZA et al.,
2004).
Também foi observado que o extrato de folhas age na inibição da digestão de
açúcares e gorduras, reduzindo a absorção gastrintestinal destes nutrientes, o que
pode ser eficiente no tratamento de diabete e obesidade (ARAI et al., 1999;
MATSUMURA et al., 2000).
Extratos dos frutos da pitangueira, assim como das folhas, também
demonstraram ter alta atividade antimicrobiana contra Lactobacillus casei,
Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Providencia spp., Proteus mirabilis,
Shigella sonnei, Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp. (Auricchio & Bacchi,
2003, Castro et al., 2010).
Estudos com óleos essenciais extraídos de folha de pitanga demonstram
atividades biológicas, tais como antimicrobiana, antioxidante, hepatoprotetora,
antifúngica e inseticida (SANTOS et al., 2015).
Com o seu grande uso em diversas áreas no tratamento tradicional e a
identificação de metabólitos biologicamente ativos, é possível inferir que E. uniflora
L. possui um elevado atrativo para pesquisas no campo medicinal e na área
cosmética (SANTOS et al., 2015).
2.3. Metabólitos fenólicos
As plantas, dentre alguns seres vivos, possuem dois tipos de metabolismo,
sendo eles classificados como primário e secundário. O metabolismo primário tem
26
como função a sobrevivência da planta, estando ligado à fotossíntese, à respiração
e à fixação de nutrientes. Já o denominado metabolismo secundário, se torna
responsável pelos mecanismos de defesa, perpetuação, adaptação, crescimento e
reprodução (SOUZA, 2013). Dessa forma, os metabólitos secundários, dentre eles
os metabólitos fenólicos, são essenciais para a sobrevivência da planta, tendo sua
produção aumentada em condições de estresse como infecções, ferimentos e
incidência de radiação ultravioleta (ANGELO & JORGE, 2007; SOUZA, 2013).
Os metabólitos fenólicos estão distribuídos em diversas espécies na natureza,
tendo-se uma estimativa de mais de 8000 substâncias fenólicas já identificadas em
plantas. Essas substâncias podem assumir função de pigmento, conferindo
aparência colorida aos alimentos ou agir no seu metabolismo secundário, atuando
no crescimento e reprodução além de agirem como agentes antipatogênico (SILVA
et al., 2010; SOUZA, 2013).
Quimicamente, substâncias fenólicas são definidas como aquelas que
possuem em sua estrutura um (ou mais) anel aromático com um ou mais substituinte
hidroxila (ANGELO & JORGE, 2007). Essas substâncias possuem estrutura variável
e, portanto, são multifuncionais. Dentre os metabólitos fenólicos, destacam-se os
ácidos fenólicos, os flavonoides, os fenólicos simples, os fenilpropanoides, as
cumarinas, os taninos, as ligninas e tocoferóis (Figura 12) (SOOBRATTEE et al,
2005; ANGELO & JORGE, 2007).
Figura 12. Exemplos das principais classes de metabólitos fenólicos: ácidos
fenólicos (1), fenilpropanoides (2), flavonoides (3) e taninos (4).
27
Fonte: Adaptado de SOOBRATTE et al., 2005.
Em geral, substâncias fenólicas são descritas como potentes antioxidantes,
agindo por diversos mecanismos como: doação de elétrons, interrupção da cadeia
de reações de oxidação e quelação de metais (MARTOS et al., 2010; SOUZA,
2013).
Além de sua capacidade antioxidante, as substâncias fenólicas, principalmente
ácidos fenólicos, flavonoides e taninos possuem outras propriedades benéficas à
saúde como anticancerígena, antimicrobiana, antialérgica, hepatoprotetora,
antitrombótica, antiviral, vasodilatador, antimutagênica e atividade anti-inflamatória.
Visto que, muitas destas funções biológicas têm sido correlacionadas com a sua
capacidade antioxidante (SOOBRATTEE et al., 2005; BAGETTI, 2009).
Entre os metabólitos fenólicos com grande potencial antioxidante, destacam-se
dois grandes grupos, os flavonoides e seus derivados e os ácidos fenólicos (ácidos
benzóico, cinâmico e seus derivados) (SOARES, 2002).
Os ácidos fenólicos podem ser divididos em duas categorias principais. A
primeira é composta pelos derivados do ácido benzóico (Figura 13), que possuem
sete átomos de carbono e são os ácidos fenólicos mais simples encontrados na
natureza. A segunda é formada pelos derivados do ácido cinâmico (Figura 14),
também chamados fenilpropanoides, que possuem nove átomos de carbono
(SOARES, 2002).
Figura 13. Estrutura química geral de derivados do ácido benzóico.
Fonte: SOARES, 2002.
28
Figura 14. Estrutura química geral de derivados do ácido cinâmico.
Fonte: SOARES, 2002.
Os derivados flavonoidicos (Figura 15) possuem uma estrutura básica formada
por C6-C3-C6, sendo uma das classes de metabólitos secundários mais diversificada
do reino vegetal (SOARES, 2002).
Figura 15. Estrutura básica dos flavonoides.
Fonte: LEE et al., 2004.
Entre as principais subclasses de flavonoides (Figura 16), encontram-se as
antocianidinas, flavonas, flavonóis e, com menor frequência, as auronas, chalconas
e isoflavonas, dependendo do lugar, número e combinação dos grupamentos
participantes da estrutura da molécula (SOARES, 2002).
29
Figura 16. Exemplos das principais subclasses de flavonoides.
Fonte: CERQUEIRA et al., 2007.
2.4. Estresse oxidativo e antioxidantes
O metabolismo oxidativo, que ocorre naturalmente no organismo de
mamíferos, tem como um de seus produtos as espécies reativas de oxigênio (ERO).
A formação das ERO acontece através da ação de enzimas no processo de
transferência de elétrons, além da exposição a outros fatores, entre eles, o ozônio,
radiação gama e ultravioleta, medicamentos, dieta e tabagismo (Tabela 1)
(BAGETTI, 2009).
Tabela 1. Fontes endógenas e exógenas das espécies reativas de oxigênio no corpo
humano.
Fonte: BIANCHI et al., 1999.
30
Radicais livres são espécies definidas como aquelas que possuem em sua
estrutura um ou mais elétrons não emparelhados, com alta reatividade e capacidade
de formar outros radicais através de reações químicas em cadeia. (SELLÉS, 2011).
A presença de elétron não pareado confere ao radical livre instabilidade energética e
cinética, pois para que se mantenham estáveis precisam doar ou retirar um elétron
de outra molécula (COTINGUIBA et al., 2013).
As espécies reativas de oxigênio incluem radicais livres como o radical
hidroxila (HO•), o ânion superóxido (O2•), o radical hidroperoxila (HO2
•) os radicais
alcoxila (RO•) e peroxila (ROO•), além de substâncias não radicalares, entre elas o
peroxido de hidrogênio (H2O2), ânion hidroxila (HO-), o oxigênio singleto (1O2) e o
ozônio (O3) (LIMA & ABDALLA, 2001; PESSANHA, 2010).
Outras espécies reativas produzidas no organismo de mamíferos são, por
exemplo, as espécies reativas do nitrogênio (ERN). Entre as ERN, estão incluídos o
íon peroxinitrito (ONOO-), o óxido nítrico (NO•), o radical dióxido de nitrogênio (NO2•)
e o ânion peroxinitrito (ONOO-) (LIMA e ABDALLA, 2001). Além disso, radicais tiíla
(RS•), cloraminas (R2NCl e RNCl2- onde R representa um grupo orgânico ou o
hidrogênio), cloreto de nitrila (NO2Cl) e metais de transição (Fe, Cu, Mn, etc.) podem
desencadear reações via radicais livres (VASCONCELOS et al, 2007).
Durante o processo de respiração aeróbica, é fornecido às células do
organismo o oxigênio necessário para produção de energia, através do processo de
metabolismo oxidativo. Em suma, o oxigênio é reduzido e as ligações covalentes da
glicose são clivadas, gerando como produtos gás carbônico, água e energia (Figura
17). A principal organela envolvida é a mitocôndria, onde atuam diversas enzimas
responsáveis por catalisar as etapas desse processo. Nessas etapas, ocorre a
formação de subprodutos que, em sua maioria, são benéficos. No entanto,
aproximadamente 5% podem ser tóxicos para a célula, quando em altas
concentrações (SILVA & JASIULIONES, 2014).
31
Figura 17. Esquema simplificado da respiração celular.
Fonte: CÉSAR & SEZAR, 1988.
O radical hidroxila (•OH) é o mais reativo dentre as ERO e interage
rapidamente com moléculas próximas. Uma vez formado, o organismo humano não
dispõe de mecanismo de defesa que neutralize esse radical livre. A alta reatividade
dessa ERO pode causar modificação no DNA, danos nas proteínas e inativação
enzimática, além de desencadear a peroxidação lipídica. Essa espécie reativa é
formada no organismo principalmente por dois mecanismos: reação de H2O2 com
metais de transição e hidrólise da água por exposição à radiação ionizante.
(FERREIRA & MATSUBARA, 1997; BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006;
GUARATINI, MEDEIROS & COLEPICIOLO, 2007; VASCONCELOS et al., 2007).
O organismo humano possui um sistema eficaz no controle da produção de
substâncias reativas de oxigênio, o qual neutraliza os efeitos danosos vindos do
metabolismo de oxigênio e da oxidação lipídica. Tais ações podem ser alcançadas
por meio de diferentes mecanismos: inibição da formação dos radicais livres ou
espécies não-radicalares (sistemas de prevenção), impedimento da ação das
espécies reativas (sistemas de neutralização) ou, ainda, favorecimento do reparo e a
reconstituição das estruturas biológicas lesadas (sistemas de reparo). Esse controle
pode acontecer pela remoção enzimática dos intermediários reativos, através da
ação conjunta de enzimas intracelulares (BAGETTI, 2009; BARBOSA et al., 2010).
Estresse oxidativo é definido como o desequilíbrio entre a produção de
substâncias oxidantes e sua degradação. Normalmente, ocorre quando a produção
de espécies reativas está acelerada ou quando os sistemas de defesa antioxidante
encontram-se deteriorados ou são insuficientes. Fatores genéticos, exposição a
32
fatores ambientais (como radiação UV) e propriedades intrínsecas específicas de
grupos celulares podem exacerbar o dano oxidativo, ou diminuir a capacidade das
células de degradar estes agentes agressores (VICENTINO & MENEZES, 2007).
O sistema de defesa enzimático é representado principalmente pelas enzimas:
superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationaperoxidase (GPx) e
glutationa redutase (GR) (COTINGUIBA et al., 2013).
Outro mecanismo de defesa são os antioxidantes não enzimáticos, o qual é
constituído por grande variedade de substâncias que podem ter origem endógena ou
exógena. Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, mesmo
presentes em baixas concentrações, podem evitar a oxidação do substrato. Entre os
antioxidantes endógenos incluem: a glutationa, o ácido úrico e a ubiquinona. Entre
os antioxidantes exógenos podemos citar as substâncias fenólicas, vitamina C (ácido
ascórbico), carotenoides, entre outros (VASCONCELOS et al., 2007; BAGETTI,
2009).
Os antioxidantes podem atuar em diferentes mecanismos de defesa no
organismo. Seu primeiro mecanismo de defesa contra os radicais livres é impedir
sua formação, o que acontece pela inibição em cadeia com o ferro e o cobre
(formação do radical HO•, pela redução do ferro ou cobre, nas reações de Fenton e
Haber-Weiss como demonstrado na Figura 18) (GUARATINI et al., 2007). O
segundo mecanismo seria a intercepção de radicais livres gerados pelo metabolismo
celular ou por outras fontes. Nesse último caso, o antioxidante interage com as
espécies radicalares e são consumidos durante a reação, impedindo os danos às
células do corpo humano. Nesta classificação, incluem-se os antioxidantes naturais
e sintéticos. (BAGETTI, 2009; LUZIA, BERTANHA & JORGE 2010; PESSANHA,
2010).
Figura 18. Reações de Fenton[1] e Haber-Weiss [2].
Fonte: VASCONCELOS et al, 2007.
33
As substâncias fenólicas são conhecidamente possuidoras de ação
antioxidante, podendo agir tanto na inibição da peroxidação lipídica como também
da lipoxigenase. As substâncias fenólicas desempenham um papel importante,
agindo tanto na primeira etapa de iniciação como na segunda etapa que é a de
propagação do processo oxidativo. Esses antioxidantes fenólicos podem agir como
neutralizadores de radicais livres, doando um átomo de hidrogênio a um radical
lipídico, e podendo agir também como quelantes de metais. Os produtos
intermediários, formados através dessas reações, são relativamente estáveis devido
a ressonância do anel aromático apresentado por estas substâncias. A eficiência
desses antioxidantes é determinada pelos grupos funcionais presentes e pela
posição que ocupam no anel aromático (LUZIA, BERTANHA & JORGE, 2010).
Na etapa onde ocorre a autoxidação (oxidação de lipídeos) os antioxidantes
fenólicos interagem preferencialmente com o radical peroxila (formando pelos
radicais de carbono que reagem espontaneamente com o oxigênio, propagando a
cadeia de peroxidação lipídica), por ele ser o mais prevalente e por possuir menor
energia do que outros radicais (JIALAL & GRUNDY, 1992). Como resultado da
reação, é formado o radical fenoxila, embora relativamente estável, pode interferir na
reação de propagação, ao reagir com um radical peroxila, via interação entre
radicais (Figura 19). (ANGELO & JORGE, 2007).
Figura 19. Esquema exemplificador da estabilização do radical fenoxila por
ressonância.
Fonte: Sociedade Brasileira de Química – Resveratrol. Disponível
em:<http://qnint.sbq.org.br/sbq_uploads/layers/imagem2403.png> Acesso em: 27 de
maio de 2016.
34
A atividade antioxidante dos ácidos fenólicos e dos taninos está relacionada
com a posição dos grupos hidroxilas e também com a proximidade do grupo –CO2H
em relação ao grupo fenila. Quanto maior a proximidade com grupo fenila, maior
será a capacidade antioxidante do grupo hidroxila em posição meta (SOOBRATTE
et al., 2005).
Existem muitos métodos in vitro para avaliar a atividade antioxidante de
produtos naturais, os quais envolvem desde ensaios químicos simples baseados em
reações colorimétricas a ensaios mais complexos, utilizando as mais diversas
técnicas instrumentais (ALVES et al, 2010).
Levando-se em conta a complexidade envolvida na ação in vivo de
antioxidantes, diferentes métodos in vitro têm sido desenvolvidos para estimar, de
uma forma experimental simples, o potencial antioxidante das amostras. Os ensaios
baseiam-se em diversas estratégias como: avaliar a capacidade do antioxidante em
neutralizar radicais livres; o potencial de redução de íons cúpricos ou férricos; a
capacidade de antioxidantes em inibir a oxidação de lipídeos, entre outros (LÓPEZ-
ALARCÓN & DENICOLA, 2013).
2.5. Efeitos da radiação solar sobre a pele
A pele é o maior órgão do corpo humano com uma área de superfície de
aproximadamente 1,7 m2 no individuo adulto, o que corresponde a aproximadamente
5,5% da massa corporal (GOLDSMITH, 1990; HARRIS, 2009). A pele exerce
diversas funções, sendo uma delas a proteção do organismo contra a radiação
ultravioleta e contra as agressões mecânicas, químicas e térmicas. Além disso, sua
superfície, relativamente impermeável, impede a desidratação em excesso e age
como um obstáculo à invasão microbiana. Nos humanos, a pele é o principal órgão
termorregulador, exercendo tal função por meio de tecido adiposo e dos pêlos que
juntos impedem a diminuição excessiva de temperatura. Outro mecanismo
termorregulador é a secreção das glândulas sudoríparas, que ao ser lançada na
superfície cutânea e evaporar-se, garante a diminuição da temperatura corporal
quando isso se faz necessário. A pele exerce ainda diversas funções metabólicas,
pois os triglicerídeos no tecido adiposo (hipoderme) representam importante reserva
de energia, enquanto que a síntese de vitamina D, que ocorre na epiderme, é
35
indispensável para complementar a quantidade desta vitamina obtida na dieta
alimentar (BECHELLI & CURBAN, 1975; HALLER, 1989; BLATTEIS, 2012).
A pele é constituída por três camadas de tecido: a epiderme , a derme e a
hipoderme (figura 20). A epiderme está estruturada por um grupo de células vivas,
denominado epiderme viável e por um conjunto de células mortas que formam o
estrato córneo. A epiderme viável é constituída de células metabolicamente ativas
que formam outras três camadas distintas: granulosa, espinhosa e basal. Em locais
do organismo onde a pele é mais espessa, por exemplo, nas regiões palmar existe
mais uma camada epidérmica chamada lúcida, que se localiza entre as camadas
granulosa e córnea (EDWARDS & MARKS, 1995; AZULAY & AZULAY, 2006).
Figura 20: Representação das camadas da pele.
Fonte: <http://clinicalposters.com/anatomy/body/038.html> Acesso em: 18/06/2016.
A camada basal é a mais interna e consiste de uma fileira única de células
cubicas que possuem uma alta atividade reprodutiva, tendo por função garantir a
renovação da epiderme. A camada espinhosa é formada por células volumosas e
poliédricas que se encontram em fase de crescimento e no início da síntese de
queratina. A camada granulosa, por sua vez, é constituída por células em seu último
estágio de diferenciação, que ao serem totalmente queratinizadas, tornam-se
anucleadas e perdem sua capacidade metabólica, passando a formar o estrato
córneo, onde sofrem um processo de esfoliação. O estrato córneo é, então, formado
por camadas extremamente coesas de corpos de células epidérmicas, os
corneócitos, que desempenham o papel fundamental de proteger os tecidos vivos da
36
perda de água, mantendo-os adequadamente hidratados. Dessa forma, a principal
função desempenhada pelo estrato córneo é garantir a homeostase cutânea
(EDWARDS & MARKS, 1995; KHAVKIN & ELLIS, 2011).
A derme é uma camada vascularizada de cido conjuntivo denso fibroelástico,
possuindo arteríolas e vênulas, por onde circula o sangue. Há presença de vasos
linfáticos, que são responsáveis pelo transporte de substâncias formadas durante os
processos metabólicos realizados na pele. Esta camada é composta por fibroblastos,
glicosaminoglicanos e macromoléculas, tais como, o colágeno e a elastina. O
colágeno presente na derme papilar aparece como uma rede de fibras finas
aleatoriamente orientadas, enquanto que, na derme reticular, consiste de fibras
maiores e onduladas. Já a elastina é o componente essencial das fibras que formam
os tecidos elásticos, sendo extremamente insolúvel e estável quimicamente
(HOLBROOK & WOLFF, 1993; BRAZ, 2005).
O processo de envelhecimento é definido como um acúmulo de modificações
moleculares no organismo que resultam em manifestações clínicas macroscópicas
(GIACOMONI, 1995). Em relação ao envelhecimento cutâneo ocorre uma
combinação de fatores intrínsecos e extrínsecos (BEITNER, 2003). Os fatores
extrínsecos consistem na exposição da pele a diversas agressões como radiação
ultravioleta (fotoenvelhecimento), poluição atmosférica, traumatismos, fumo e
metabólitos de substâncias ingeridas ou inaladas. Esses fatores são causadores de
modificações moleculares e induzem alterações das propriedades morfológicas e
biofísicas da pele, podendo resultar elastose e atrofia da derme com perda de
colágeno. As manifestações clínicas incluem hiperpigmentação, rugas, mudanças na
textura da pele e formação de comedões (BEITNER, 2003). O envelhecimento
extrínseco é um intensificador do envelhecimento cronológico, sendo esse o motivo
pelo qual, áreas expostas e não expostas à radiação UV costumam apresentar
aspectos muito diferentes (STEINER, 1995; ENJELKE et al., 1997; ORIÁ et al.,
2003).
Com o envelhecimento da pele é verificado na camada basal células
heterogêneas em tamanho e volume (BRÉGÉGÈRE et al., 2003), além de terem
uma atividade mitótica reduzida, o que aumenta o tempo renovação epidérmica em
50% (ENKELKE et al., 1997; NAMAZI & FEILY, 2011). Esta alteração chamada de
discrasia epidérmica é acentuada na pele fotodanificada (NAMAZI & FEILY, 2011). O
Processo de envelhecimento também altera o número, a morfologia e a função dos
37
melanócitos, sendo estes melanócitos inativos mais abundantes nos folículos pilosos
(BUSHAN et al., 2002).
O efeito solar imediato sobre a pele é a hiperpigmentação cutânea, com atraso
na formação de nova melanina, sendo esse efeito reversível. Enquanto a exposição
solar prolongada e recorrente implica em alterações definitivas na quantidade e
distribuição de melanina na pele (MONTAGNER & COSTA, 2009).
Existem evidências de que o estresse oxidativo exerce papel relevante nos
processos de envelhecimento. Além disso, as substâncias reativas em excesso
também estão relacionadas com a transformação e morte celular, consequências
diretas em muitas patologias, dentre elas, a indução do câncer e a propagação de
AIDS em pacientes soropositivos (HIV+), bem como na fisiopatologia de muitas
doenças crônicas, entre as quais, doenças autoimunes, cardiopatias, doenças
pulmonares, intoxicação por xenobióticos e muitas outras (VASCONCELOS et al,
2007).
A teoria de que o envelhecimento é resultado de danos causados por radicais
livres é creditada a Denham Harman que, em 1956, baseou-se na observação de
que a irradiação em seres vivos leva à indução da formação de radicais livres, os
quais diminuíam o tempo de vida desses seres e produziam mudanças semelhantes
ao envelhecimento. De acordo com esta teoria, o lento desenvolvimento de danos
celulares irreversíveis leva ao envelhecimento (HIRATA, SATO & SANTOS, 2004).
O sol emite um amplo espectro de radiação eletromagnética, que é desviado
ou atenuado pelas camadas atmosféricas da Terra. As radiações que chegam à
superfície são classificadas como não ionizantes e subdivididas em infravermelho (>
780nm), visível (400-780nm) e ultravioleta (UV) (100-400nm) (figura 21) (RIBEIRO,
2004; BALOGH, 2011).
Figura 21. Representação do espectro de radiação eletromagnética emitido pelo sol.
Fonte: Instituto Schulman de investigação científica. Disponível em: <http://isic.net.br/artigo-32>. Acesso em: 31/07/2016.
38
A radiação ultravioleta é ainda subdividida de acordo com o comprimento de
onda. A radiação UVA (comprimento de onda de 320 a 400nm) age na pele através
do efeito pigmentogênico, porém seu acúmulo, ao longo dos anos, provoca
alterações das fibras colágenas e elásticas, favorecendo o envelhecimento precoce,
podendo causar fotossensibilidade (BILLHIMER, 1989; GUARATINI, MEDEIROS &
COLEPICOLO, 2007). A radiação UVB (comprimento de onda de 290 a 320nm)
causa reação eritematosa, sendo uma reação de defesa do organismo. Essa
radiação provoca um aumento na formação de melanina (efeito pigmentogênico),
mas também causa queimaduras solar e inflamação cutânea, podendo resultar em
carcinogênese (RIEGER, 1989). A radiação UVC (comprimento de onda de 200 a
290nm) é germicida, por sua ação esterilizante, é prejudicial ao tecido cutâneo,
porém é “filtrada” pela camada de ozônio (RIBEIRO, 2004).
O estresse oxidativo acelera o fenômeno do envelhecimento por danos ao
DNA e por atuarem nas reações de desidrogenação, hidroxilação e na glicação
proteica. A última reação envolve a perda das funções biológicas de proteínas, como
o colágeno e proteoglicanas, resultando em alterações da estrutura da membrana e
aumento da flacidez da pele. Dentre as várias fontes exógenas de radicais livres os
efeitos da radiação solar são a mais importante causa do envelhecimento cutâneo,
uma vez que a luz ultravioleta (UV) atua na produção de radicais livres (HIRATA,
SATO & SANTOS, 2004).
Exposição à radiação UV provoca alterações físicas na pele em função dos
danos ao tecido conjuntivo, causados pela formação de peróxidos de lipídeos e
espécies reativas do oxigênio (ERO). Peróxidos de lipídeos podem ser
metabolizados para formar produtos secundários que prejudiquem a matriz
extracelular (ECM), enquanto as ERO estão envolvidas na perda de elasticidade e
alguns tipos de câncer de pele (JENKINS, 2002).
A radiação ultravioleta (UV) penetra a pele e, de acordo com o comprimento
de onda, interage com as diferentes células localizadas nas diversas camadas. A
radiação de ondas curtas (UVB: 290-320nm) é mais absorvida na epiderme e afeta
predominantemente os queratinócitos, enquanto as ondas mais longas (UVA: 320-
400nm) penetram de modo mais profundo e atingem queratinócitos da epiderme e
fibroblastos da derme (HERNANDEZ-PIGEON et al., 2007).
A radiação UVA age indiretamente através da geração de ERO que atuam na
ativação de fatores envolvidos na transcrição do DNA. Esse processo resulta em
39
mutações no DNA mitocondrial. A radiação UVB, por sua vez, também gera
espécies reativas, porém sua principal ação é a indução direta de danos ao DNA,
resultando em mutação (STEGE et al., 2000; HERNANDEZ-PIGEON et al., 2007).
Assim, mesmo a radiação solar sendo indispensável à vida, uma vez que é
necessária à fotossíntese nos vegetais, assim como à saúde e bem estar no homem,
a radiação ultravioleta pode ter efeitos nocivos, dependendo da duração e
frequência de exposição a ela, bem como, de sua intensidade (em relação à latitude)
e da sensibilidade do indivíduo aos seus efeitos. Ela atinge pele, olhos e mucosas,
podendo causar queimaduras (eritemas), envelhecimento precoce e até alguns
cânceres de pele. (SHAATH, 1997; SOUZA et al., 2013).
2.6. Proteção solar
Segundo González e colaboradores (2008), fotoproteção é um elemento
profilático e terapêutico frente aos efeitos danosos da radiação ultravioleta. A
abordagem é realizada por meio do uso de protetores solares, vestimentas
protetoras e exposição restrita a luz solar. A primeira linha de defesa contra estes
efeitos nocivos é a utilização dos fotoprotetores, também denominados protetores
solares. Estudos diversos evidenciam que o uso adequado e regular de
fotoprotetores evita o envelhecimento precoce da pele (BALOGH, 2011).
Pelos conceitos atuais, fotoprotetores tópicos, ou protetores solares (ou ainda
filtros solares), são substâncias de aplicação cutânea, em diferentes apresentações,
que contenham em sua formulação ingredientes capazes de interferir na radiação
solar, reduzindo seus efeitos deletérios (SCHALKA & REIS, 2011).
Os filtros solares (filtros UV) são os ingredientes presentes nos fotoprotetores,
os quais interagem com a radiação incidente através de três mecanismos básicos:
reflexão, dispersão e absorção, conforme apresentado na figura 22 (RIBEIRO et al.,
2004; SCHALKA & REIS, 2011).
40
FIGURA 22: Mecanismos de interação dos filtros ultravioleta com a radiação solar.
Fonte: SCHALKA & REIS, 2011.
Esses filtros são divididos em inorgânicos e orgânicos. Os filtros inorgânicos
podem abranger também os bloqueadores físicos, os quais dispersam a luz
incidente, não a deixando passar ou diminuindo sua passagem através das camadas
da pele, tendo como exemplo o dióxido de titânio (TiO2) e óxido de zinco (ZnO). Já
os filtros orgânicos são substâncias com bons cromóforos, os quais absorvem a
radiação de alta energia, diminuindo sua intensidade e seus efeitos prejudiciais
(Figura 23) (GONZÁLEZ, FERNÁNDEZ-LORENTE & GILABERTE-CALZADA, 2008).
Figura 23. Forma de ação dos filtros UV orgânicos e inorgânicos.
Fonte: Informativo técnico. Filtros solares inorgânicos.
<http://volp.com.br/site/br/informativo/Filtros%20Solares%20Inorganicos/> Acesso
em: 01/08/2016.
Os filtros orgânicos têm como mecanismo de ação a interferência com a
radiação incidente por meio da absorção da radiação UV. Quando um filtro atua
41
como cromóforo exógeno, ao absorver um fóton de energia, ocorre excitação do
orbital π HOMO (orbital preenchido de mais alta energia) com transferência de
elétron para orbital π* LUMO (orbital vazio de mais baixa energia). Ao retornar para
estado estável (não excitado), ocorre à liberação de energia em um comprimento de
onda mais longo, seja na faixa da luz visível (como fluorescência), seja na faixa da
radiação infravermelha (como calor). O processo pode repetir-se inúmeras vezes
pelo mecanismo denominado ressonância (SCHALKA & REIS, 2011).
Essencialmente, são substâncias com estruturas aromáticas conjugadas com
grupos carbonílicos e, geralmente, possuem um grupo doador de elétrons como, por
exemplo, uma amina ou metoxila na posição orto ou para do anel aromático.
(BALOGH, 2011).
Os filtros químicos são divididos em filtros UVA, que exercem proteção frente
à radiação UVA, filtros UVB, que exercem proteção frente à radiação UVB, e filtros
de amplo espectro, que promovem proteção contra radiação UVA e UVB (Figura 22)
(CABRAL, PEREIRA & PARTATA, 2013).
Muitas formulações contendo filtros químicos não proporcionam proteção
total, principalmente quando são considerados efeitos crônicos como:
fotoenvelhecimento e fotocarcinogênese. Assim, extratos vegetais, principalmente
aqueles ricos em constituintes fenólicos, vêm sendo empregados em formulações
fotoprotetoras associadas aos filtros UV. Uma vez que, comprovada sua capacidade
de absorver radiação solar de alta energia, diminuindo seus efeitos nocivos, além
dos efeitos antioxidantes, os extratos vegetais podem intensificar a proteção final do
produto e/ou neutralizar os radicais livres produzidos na pele após exposição ao sol
(SOUZA et al., 2013).
A eficiência dos filtros é dependente da sua capacidade de absorção da
energia radiante, que é proporcional à sua concentração, ao intervalo de absorção e
ao comprimento de onda onde ocorre absorção máxima (PAOLA & RIBEIRO, 1998;
SCHALKA & REIS, 2011). A eficiência dos filtros orgânicos está diretamente
relacionada à estabilidade fotoquímica, à dispersão e dissolução facilitadas e
permanentes no veículo e à resistência ao enxague. Estes filtros devem ser atóxicos
e não causar irritação ou alergia (BALOGH, 2011). Essa eficiência dos filtros pode
ser verificada através de métodos in vitro e in vivo, como a determinação do fator de
proteção solar (FPS) em relação à radiação UVB e em relação ao fator de proteção
FPUVA (Sociedade Brasileira de Dermatologia, 2013).
42
A determinação do FPS avalia capacidade protetiva dos filtros químicos
contra a radiação UVB do espectro eletromagnético. Como a UVB é o responsável
por causar eritema na pele, um filtro bastante eficaz é aquele que é capaz de
proteger a pele exposta contra a queimadura solar. O valor de FPS consiste na
razão entre a dose mínima de exposição à radiação ultravioleta necessário para
produzir eritema (vermelhidão) na pele protegida pelo protetor solar e a dose de
exposição, para o mesmo efeito, com a pele desprotegida (RIBEIRO, 2004). O valor
de FPS é calculado a partir da equação:
Como alternativa, existem métodos in vitro que se baseiam nas propriedades
absortivas ou refletoras do filtro e que podem ser utilizadas para avaliar o FPS,
durante o desenvolvimento de formulações e para o controle de qualidade de rotina,
lote a lote (RIBEIRO, 2004).
O método proposto por Mansur e colaboradores (MANSUR et al., 1986), o
qual consiste de modificações no método de Sayre e colaboradores (1979 e 1980),
representa uma alternativa eficaz e rápida, além de apresentar uma boa correlação
com os resultados in vivo (BARTH, 2000; GARCIA et al., 1990).
No Brasil, todo protetor solar deve ser registrado pela ANVISA como
cosmético, segundo legislações específicas, necessitando ser testado por métodos
in vivo (Brasil, 2012b).
Com isso é possível inferir, que pela grande presença de compostos fenólicos
nos órgãos vegetativos da Eugenia uniflora, além de sua potente ação antioxidante,
ela demonstra uma possível atividade fotoprotetora, devendo com isso ser
comprovado seu potencial fotoprotetor. Com esse potencial comprovado pode ser
considerada uma matéria prima com grande apelo no uso de cosméticos
fotoprotetores e antienvelhecimento, por ser natural, apresenta menor potencial
irritante, baixa toxicidade e impacto ambiental insignificante.
Equação 1
43
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
O objetivo desse trabalho foi padronizar e adequar o método
espectrofotométrico de determinação do fator de proteção solar (FPS) de amostras
em soluções diluídas, às condições do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF). Assim como utilizar o
método padronizado para determinar o FPS de formulações contendo extrato de
Eugenia uniflora L. (Myrtaceae).
3.2. Objetivos Específicos
Estabelecer o perfil químico do extrato hidroalcoólico dos ramos em forma de
galhos de E. uniflora (EEAgEu) e de suas frações em hexano (FHgEu), em
diclorometano (FDgEu), em acetato de etila (FAgEu) e fração residual (FRgEu).
Padronizar o extrato hidroalcoólico de Eugenia uniflora (EEAgEu) e suas
frações em teor total de metabólitos fenólicos.
Verificar o potencial antioxidante do extrato hidroalcoólico de Eugenia uniflora
(EEAgEu) e suas frações.
Obter formulações cosméticas contendo extrato hidroalcoólico de Eugenia
uniflora (EEAgEu).
Estabelecer o fator de proteção solar (FPS) de uma formulação contendo o
extrato hidroalcoólico de Eugenia uniflora (EEAgEu).
44
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Material vegetal
4.1.1. Autorizações
Para o desenvolvimento das atividades deste projeto o grupo dispõe de
autorizações de coleta de material SISBIO nº 19245-1/61555311 e 09/2008
14/000.808/2010-Coordenadoria de Recuperação Ambiental, Gerencia de Gestão de
Unidades de Conservação e INEA/ RJ 040/2008 Fundação Instituto Estadual de
Florestas.
Além das autorizações locais de acesso/coleta para atividade de pesquisa,
dispomos também de autorização para atividades com finalidade cientifica,
contemplando acesso ao patrimônio genético SISBIO n 26189-7/ 35277546.
4.1.2. Eugenia uniflora Linnaeus
O material botânico foi coletado no Parque Nacional da Restinga de
Jurubatiba, no município de Quissamã, Rio de Janeiro. Uma amostra testemunho foi
processada, identificada pela profa Dra Tatiana Ungaretti Paleo Konno e depositada
na Coleção Botânica do Núcleo de Ecologia e Desenvolvimento Socioambiental
(NUPEM/UFRJ), vinculado ao Herbário do Instituto de Biologia da UFRJ (RFA),
recebendo o tombo RFA 38755.
4.2. Equipamentos e reagentes
4-hidroxibenzoato de metila
6-propilparabeno
2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) – Sigma Aldrich
Acetato de etila P.A / ACS. Vetec / TEDIA
Ácido acético glacial All Chemistry do Brasil
Ácido clorídrico P.A. 37% - Isofar
Ácido gálico Riedel-de Haën
45
Ácido p-cumárico
Ácido sulfúrico P.A. / ACS 97% Vetec
Ácido tânico Sinth
Agitador magnético. (Fisatom) Modelo: 702AC.
Agitador mecânico. (Fisatom). Modelo: 713D.
Agitador vortex (Phoenix Luferco). Modelo: AP-56.
Água ultrapura
Álcool Etílico (etanol) P. A. – Tedia
Álcool Metílico (metanol) P. A. – Cromato produtos químicos (CRQ)
Anisaldeído Fluka
Balança analítica (LINI). Modelo: 205A.
Bomba de vácuo (Marte). Modelo: 131B.
Carbonato de sódio anidro Vetec
Catequina Sigma Aldrich
Centrífuga (Excelsa baby I). Modelo 206.
Cloreto de ferro (III) hexahidratado - Vetec
Cloreto de sódio
Clorofórmio P. A. – Vetec
Cumarina Fluka
DCR 245 silicone D’ Altomare
DCR 5225C formulation AID D’ Altomare
DCR 9011 silicone elastone D’ Altomare
Dicloromentano (cloreto de metileno) P. A. - Impex
Dimetil Sulfóxido (DMSO) P. A. - Tedia
Espectrofotômetro (Schimadzu). Modelo: UV-1800.
Espectrofotômetro (biospectro). Modelo: SP-220.
Eugenol Vetec
Extrato seco padronizado de Gingko biloba Deg
Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel Chemistry do Brasil LTDA
Glicerina
Hexano ACS / P.A. Tedia / Vetec
Lâmpada ultravioleta com cabine escura Camag®
46
Micropipetas (Gilson e Labmate soft)
n-Butanol P.A. Carlo Erba
pHmetro (Mettler Toledo). Modelo: MP 220.
Polietilenoglicol
Quercetinadiidratada 99% HPLC – FlukaBioChemica
Reagente Folin Ciocalteau Haloquímica
Rotaevapores (Buchi). Modelos: B-480.
Rutina Fluka
Sulfato cérico
Ultrassom (Unique): Modelo: 1400.
4.3. Preparação de reagentes
Anisaldeído sulfúrico - Foi misturado 0,5mL de anisaldeído, 10mL de ácido
acético glacial, 85mL de metanol e 5mL de ácido sulfúrico a 97% v/v, sob
resfriamento.
Cloreto férrico 10% em etanol - 10g de Na2CO3 para 100mL de etanol.
NP-PEG - Foi pesado 0,1g de difenilboriloxietilamina (NP) em 10mL de
metanol. A solução de polietilenoglicol foi preparada por meio de dissolução de 0,5g
de polietilenoglicol 4000 (PEG) em 10mL de etanol e armazenada a temperatura
ambiente.
Solução saturada de Na2CO3 - 10g de Na2CO3 para 100mL de água
deionizada.
Sulfato cérico – A solução de sulfato cérico foi preparada a partir de 2 g de
sulfato cérico dissolvido em 55mL de H2SO4 concentrado e completando o volume
de 1000mL de água destilada. Sedo realizado em capela com o auxílio do banho de
gelo.
4.4. Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos de
E. uniflora
Para o desenvolvimento desta proposta escolheu-se os ramos em forma de
galhos como material de partida, um órgão vegetativo onde caracteristicamente são
47
armazenados metabólitos fenólicos, são comparativamente maiores que em outros
órgãos. Os galhos foram secos em estufa a 40º C e triturados em moinho de facas.
1,288 Kg dos galhos secos e triturados foram submetidos ao processo de
extração, em percolador, primeiramente com mistura hexano: diclorometano
(Hex:DCM) 80:20, sendo o líquido extrator renovado continuamente até exaustão.
Após esta etapa, prosseguiu-se à extração exaustiva da torta resultante, utilizando a
mistura de etanol: água (80:20), renovando-se continuamente o liquido extrator até a
exaustão. Os extratos líquidos foram filtrados através de papel de filtro e os
solventes orgânicos foram retirados, utilizando rotaevaporador. Ao final do processo
de rotaevaporação, obteve-se o extrato bruto Hex:DCM (extrato lipofílico - EHDgEu)
e o concentrado aquoso do extrato hidroalcoólico, o qual foi liofilizado, resultando no
extrato bruto hidroalcoólico seco (EEAgEu).
O extrato bruto hidroalcoólico (EEAgEu) foi fracionado por extração sólido-
líquido, com auxílio de agitação em ultrassom, até exaustão, com solventes em
ordem crescente de polaridade: hexano, diclorometano e acetato de etila. Esse
processo, após evaporação dos solventes sob pressão reduzida, rendeu as frações
em hexano (FHgEu), em diclorometano (FDgEu) e em acetato de etila (FAgEu). A
fração residual (FRgEu), obtida após o processo de purificação do EEAgEu, foi
mantida para os testes químicos (figura 24).
Figura 24. Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos
E. uniflora.
48
4.5. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do extrato e das
frações
Foram utilizadas cromatofolhas de sílica gel 60 F254 em alumínio, espessura
0,2 mm da MERCK cortadas na medida de 12 cm de altura, sendo deixados 10 cm
de campo de corrida. As amostras analisadas foram solubilizadas em metanol
(EEAgEu; FHgEu) ou diclorometano (FDgEu; FAgEu; FRgEu), sendo aplicados 5µL
(capilar graduado) de cada amostra, a uma altura de 1 cm da borda inferior da placa,
e cerca de 0,3 cm de distância das bordas laterais. Como perfil de comparação,
foram utilizados diversos padrões (eugenol, estigmasterol, terpeno, cumarina, ácido
cumárico, quercetina, catequina, rutina e ácido tânico), os quais foram analisados de
forma semelhante aos extratos e frações. Os sistemas eluentes utilizados foram:
hexano: acetato de etila (8:2); hexano: clorofórmio (7: 3); hexano: acetato de etila
(1:1); clorofórmio: acetato de etila (9:1); clorofórmio: metanol (9:1); acetato de etila:
metanol (9:1); acetato de etila: metanol (7:3); clorofórmio: metanol (1:1); butanol:
ácido acético: H20 (4: 1: 1); clorofórmio: metanol: água (70: 30: 4); acetato de etila:
ácido acético: ácido fórmico: água (100: 11: 11: 27). Os cromatogramas foram
49
visualizados sob a luz ultravioleta nos comprimentos de onda de 254 e 360nm e,
então, revelados com agentes químicos diversos como: sulfato cérico, anisaldeído
sulfúrico e cloreto férrico 10% em etanol.
Além disso, foi usado cromatofolhas de sílica fase inversa (RP18). Utilizou-se
para o desenvolvimento cromatográfico, os sistemas eluentes acetato de etíla: ácido
acético: ácido fórmico: água (100: 11: 11: 27); clorofórmio: metanol (9:1); acetato de
etíla: metanol (9:1); clorofórmio: metanol: água (70: 30: 4); butanol: ácido acético:
água (4: 1: 1); clorofórmio: acetato de etila (7: 3); metanol: água: ácido fórmico (16:
1: 3); butanol: ácido acético: água (4: 1: 5). Os cromatogramas foram revelados com
difenilboriloxietilamina-polietilenoglicol 4000 (NP-PEG).
4.6. Obtenção do espectro de varredura na região do ultravioleta
Foi preparada uma solução em metanol do EEAgEu a uma concentração de
1mg/mL. Dessa solução, foi retirada uma alíquota de 0,2mL e diluída para 10mL com
metanol. A solução na concentração final de 0,02mg/mL foi submetida à varredura
espectroscópica, na faixa de comprimento de onda de 200nm a 400nm, usando-se
metanol como branco.
4.7. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos
A quantificação espectrofotométrica dos metabólitos fenólicos foi realizada
pelo método descrito por Wettasinghe e Shahidi (1999), também Zielinski e
Kozlowska (2000), com pequenas modificações. Para tanto, as amostras EEAgEu,
FHgEu, FDgEu, FAgEu e FRgEu, em triplicata, foram solubilizadas e diluídas em
metanol, a fim de obter-se as concentrações de 50µg/mL; 100µg/mL; 150µg/mL;
200µg/mL; 250µg/mL; 300µg/mL; 400 µg/mL para EEAgEu, FAgEu e FRgEu, já para
FHgEu e FDgEu foram usadas as concentrações de 50µg/mL; 100µg/mL; 200µg/mL;
500µg/mL; 1000µg/mL; 2000µg/mL; 4000 µg/mL. Para a reação colorimétrica foram
adicionados, em tubo cônico plástico, 250µL de cada concentração testada e 250µL
de reagente de Folin-Ciocalteau. Após agitação leve, foram acrescentados 500 µl de
solução de Na2CO3 10% e 4 ml de H2O deionizada. Foram preparadas solução de
compensação, constituída de todos os reagentes exceto a solução de amostra, e um
branco para cada concentração de amostra testada, constituída de 0,25mL de
50
amostra e 4,75mL de água deionizada. Dessa forma, como ocorre uma diluição de
20 vezes da amostra, resultou em concentrações de 2,5µg/mL;5µg/mL; 7,5µg/mL;
10µg/mL; 12,5µg/mL; 15µg/mL; 20µg/mL para EEAgEu, FAgEu e FRgEu e
concentrações de 2,5µg/mL;5µg/mL; 10µg/mL; 25µg/mL; 50µg/mL; 100µg/mL;
200µg/mL para FHgEu e FDgEu.
Os tubos, então, foram agitados vigorosamente em vórtex por 20 segundos e
deixados de repouso, ao abrigo da luz, à temperatura ambiente, por 25 minutos. Ao
final do período de incubação, os tubos foram centrifugados a 5000 rpm por 7
minutos, sendo o sobrenadante utilizado para fazer a leitura em espectrofotômetro
no comprimento de onda de 760 nm, utilizando o metanol para zerar o equipamento.
Para expressar os resultados, foi construída curva analítica de ácido gálico.
Curvas analíticas em triplicatas, em três dias diferentes, foram submetidas à análise
de covariança. e, comprovando-se a ausência de diferença estatística entre elas, os
dados foram reunidos, obtendo-se a curva analítica resultante. A equação da
regressão do melhor ajuste foi calculada, bem como o valor de correlação (R2). Para
esta análise estatística utilizou-se o programa GraphPad Prism, versão 5 (2007) da
GraphPad Software.
Para a curva analítica foi escolhido o ácido gálico (marca Riedel-de Haën)
sendo um metabólico fenólico simples, na qual uma solução estoque a 1mg/mL, em
triplicata, foi preparada a partir de 10mg da substância pura em balão volumétrico de
10mL, utilizando água deionizada como solvente. Foram pipetadas alíquotas de
10µL; 25µL; 50µL; 75µL; 100µL e 125µL desta solução estoque para microtubos
cônicos de plásticos (ependorff) e o volume completado para 1mL. Dessa forma,
preparou-se as concentrações de partida a. 10µg/mL; 25µg/mL; 50µg/mL; 75µg/mL;
100µg/mL; 125µg/mL. A reação colorimétrica foi realizada em tubos cônicos
plásticos, aos quais foram adicionados 250 µL de cada diluição de ácido gálico, junto
com 4 mL de água deionizada, 250 µL do reagente de Folin Ciocalteu e 500 µL de
carbonato de sódio a 10%. Ao final, obteve-se concentrações em ácido gálico de
0,5µg/mL;1,25µg/mL; 2,5µg/mL; 3,75µg/mL; 5µg/mL; 6,25µg/mL. Também foi feita
uma solução compensação constituída de todos os reagentes, exceto a solução
padrão, de mesmo volume final.
As soluções foram agitadas em vórtex e, após 25 minutos de repouso, ao
abrigo da luz e temperatura ambiente, as absorvâncias espectrofotométricas foram
obtidas em comprimento de onda () de 760nm.
51
Para achar o valor de absorvância real utilizou-se a seguinte equação:
Abs Amostra (real) = Abs A – Abs B – Abs C
Na qual, Abs A é a medida espectrofotométrica da absorbância gerada pela
amostra na presença do reagente de Folin Ciocalteu, Abs B é a medida da absorção
da amostra na ausência do reagente Folin Ciocalteu e Abs C é a leitura
correspondente à absorvância do controle de reagentes sem presença da amostra.
4.8. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de
redução do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH•)
A avaliação da atividade antioxidante pelo método espectrofotométrico, in
vitro, de redução do radical livre estável DPPH• (2,2-difenil-1-picrilidrazila) foi
baseada no método proposto por BLOIS (1958), com algumas modificações. Neste
método, verifica-se a capacidade da amostra em reduzir o radical DPPH por doação
de elétron, o que resulta na descoloração da solução de DPPH (MARTOS et al,
2010).
Uma solução estoque de DPPH• (PM= 394,32) (Sigma Aldrich) foi preparada
na concentração de 0,3mM em etanol, em balão volumétrico de 100mL, e protegida
da luz. A absorvância da solução controle de reação (1mL de DPPH• 0,3mM + 2,5
mL etanol P.A.) é verificada no comprimento de onda de pico máximo de absorção
516 nm, de forma a ajustar-se a concentração da solução estoque de DPPH• para
obter-se valor de absorvância dentro da faixa de 0,6 – 0,8 (solução DPPH• de
trabalho).
As soluções dos extratos e frações testadas também foram preparadas em
balões volumétricos e diluídas em etanol. As amostras foram testadas em
concentrações finais variadas, a fim de se verificar a linearidade.
O teste foi realizado em tubos de ensaio com tampa de rosca, protegidos por
papel alumínio e na penumbra. Para cada tubo teste de amostra (extratos e frações),
em cada concentração testada, adicionou-se 2,5mL de amostra e 1mL da solução
DPPH• de trabalho. Os brancos das amostras correspondem à adição de 1mL de
Equação 2
52
etanol a 2,5mL de cada uma das concentrações testadas para as amostras (extratos
e frações). Como referência para comparação, foi utilizado extrato hidroacoólico
70%, seco, padronizado, de Ginkgo biloba (Deg) preparados em diferentes
concentrações e testados nas mesmas condições que as amostras testes.
Após a adição da solução de DPPH•, as amostras foram incubadas por um
período de 30 minutos para que ocorresse a reação e, após esse tempo, foram
realizadas as leituras das absorvâncias no comprimento de onda de 516nm.
As amostras foram analisadas em triplicata e o percentual da atividade
antioxidante (%AAO) das amostras, em cada uma das concentrações testadas, foi
calculado utilizando a seguinte equação:
% AAO = 100 – [ (Aamostra – Abranco) /Acontrole] X 100
Na qual, Aamostra é a medida espectrofotométrica da absorbância de 2,5mL da
amostra adicionada de 1mL da solução de DPPH•, Acontrole é a medida da absorção
de 2,5mL de etanol com 1mL de DPPH• (controle de reação) e Abranco é a leitura
correspondente à 2,5mL de solução da amostra, em cada concentração, mais 1mL
de etanol.
A eficiência antirradicalar foi estabelecida utilizando a análise de regressão
linear no intervalo de confiança de 95% (p<0,05). Os resultados foram expressos
através do valor da concentração efetiva 50% (CE50). Os valores de CE50 das
amostras foram inicialmente submetidos a análise de variância (ANOVA) e
posteriormente ao teste de Tukey para comparação das concentrações médias de
cada amostra e destas com a amostra de referência. As análises estatísticas foram
realizadas pelo programa GraphPadPrism, versão 5 (2007) da GraphPad Software.
4.9. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS
espectrofotométrico) in vitro do extrato
Equação 3
53
A determinação das características de absorção dos agentes de proteção
solar foi realizada com base na análise espectrofotométrica de soluções diluídas das
amostras, segundo proposta de Sayre e colaboradores (1979).
Assim, o extrato bruto hidroalcoólico de E. uniflora (EEAgEu), em triplicata, foi
diluído em etanol para obter-se as concentrações finais de 2,5; 5; 25; 50; 100 e 200
mg/L. Cada uma dessas soluções, em triplicata, foram analisadas em
espectrofotômetro, sob radiação de luz ultravioleta, na faixa de comprimento de onda
de 290 a 320nm, com intervalo de 5nm. O equipamento foi zerado com etanol puro,
antes de cada leitura de absorvância nos diferentes comprimentos de onda.
A determinação da capacidade de absorção de luz ultravioleta, pelas
amostras em solução diluídas, foi realizada empregando-se a fórmula proposta por
Sayre e colaboradores (1979) e modificada por Mansur e colaboradores (1986).
Para o cálculo do valor de FPS utilizou-se a equação desenvolvida por
Mansur e colaboradores (1986):
FPS=FC. 320290 .EE (λ).I (λ).abs (λ)
Na qual, FC é igual a 10 sendo o fator de correção, determinado de acordo
com dois filtros solares de FPS conhecido e de tal forma que um creme contendo 8%
de homossalato desse um FPS de 4. EE (λ) representa o efeito eritemogênico da
radiação de comprimento de onda (λ). I (λ) representa a intensidade do sol no
comprimento de onda (λ). Por fim, abs (λ) representa a leitura espectrofotométrica da
absorvância da solução do filtro solar no comprimento de onda (λ) (MANSUR et al.,
1986).
Onde os valores de EE (λ) x I (λ) são tabelados (Tabela 2):
Tabela 2. Constante EE x I empregada no cálculo por espectrofotometria.
Equação 4
54
Fonte: SAYRE et al., (1979).
4.10. Preparação das formulações
Foi realizado um estudo de pré-formulação buscando realizar a seleção
adequada de excipientes (tabelas 3 e 4), quali e quantitativamente, para o
desenvolvimento de formulações com característica “oil free” (produto praticamente
livre de óleo). Os componentes de característica hidrossolúvel, entre eles os
parabenos (4-hidroxibenzoato de metila e 6-propilparabeno) que tem ação
antimicrobiana, a glicerina (umectante), e o cloreto de sódio (espessante), foram
adicionados sobre os componentes de característica lipossolúvel, entre eles o DCR
245 silicone (veículo volátil), DCR 9011 silicone (estabilizador de formulações) e
DCR 5225 silicone (estabilizador de formulações), sendo os dois últimos variados
para analisar a emulsão final quanto a sua característica sensorial. Sendo a mistura
mantida sobe agitação mecânica, rotação de 300rpm, por 10 minutos, até a
formação de uma emulsão.
Tabela 3. Formulação 1- com silicone 9011.
Silicones Componentes hidrossolúveis
DCR 9011 silicone 10% NaCl 2%
DCR 245 silicone 7% Glicerina 5%
Parabeno (4-hidroxibenzoato de
metila e 6-propilparabeno) 3,3%
Agua qsp 100%
Tabela 4. Formulação 2- com silicone 5225.
Silicones Componentes hidrossolúveis
55
DCR 5225 silicone 10% NaCl 2%
DCR 245 silicone 7% Glicerina 5%
Parabeno (4-hidroxibenzoato de
metila e 6-propilparabeno) 3,3%
Agua qsp 100%
4.10.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações
As medidas de pH foram realizadas em pHmetro. Para tanto, as formulações
foram diluídas em água destilada a uma concentração de 10% p/v. O pH foi ajustado
para o valor de 5,5 com adição de 2 gotas de solução de ácido cítrico a 5mg/mL. As
formulações foram centrifugas por 30 minutos em rotação de 3000rpm para verificar
a estabilidade preliminar das formulações.
Foi realizada uma varredura espectroscópica das formulações, na faixa
espectral de 200 a 400nm, usando soluções em metanol, a uma concentração de
0,02mg/mL. Metanol foi usado como branco.
4.10.2. Incorporação do EEAgEu a formulação 1.
Na sequência, o EEAgEu foi incorporado à formulação 1, nas concentrações
de 2,5; 5 e 10 % p/p, de acordo com a figura 25. Sendo realizado todo o
procedimento em triplicata.
Figura 25. Incorporação do EEAgEu à formulação 1.
56
Fonte: Elaborado pelo autor.
O extrato bruto de E. uniflora foi solubilizado com o uso de diluente (DMSO
0,1mL+ água 0,1mL) e depois foi incorporado à formulação 1, através de agitação
manual, com auxílio de espátula.
Preparo das formulações contendo EEAgEu, nas concentrações pré-
determinadas: para cada porcentagem de EEAgEu incorporado (2,5; 5 e 10% p/p),
as massas correspondentes de EEAgEu (25mg, 50mg e 100mg) foram solubilizadas
no diluente (DMSO: água 1:1) e, a seguir, as soluções foram incorporadas,
manualmente com ajuda de espátula, a 1g da formulação 1. Sendo realizado todo o
procedimento em triplicata. Para fins comparativos, foi preparada a incorporação de
um filtro químico sintético (filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel), na proporção de
100µL do filtro para 1g da formulação 1. A homogeneização foi manual com auxílio
de uma espátula.
4.11. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS
espectrofotométrico) in vitro
A determinação das características de absorção dos agentes de proteção
solar foi realizada com base na análise espectrofotométrica de soluções diluídas das
amostras, segundo proposta de Sayre e colaboradores (1979).
Para a análise espectrofotométrica, cada produto final de incorporação do
extrato na formulação foi diluído em etanol: 0,5g do produto em balão volumétrico de
25mL. A formulação contendo EEAgEu, assim diluído, foi filtrado em papel de filtro,
Pesar 1g da formulação 1
Produto final
57
descartando-se os primeiros 10mL. Uma alíquota de 1mL do filtrado foi, então,
diluído com etanol em balão volumétrico de 10mL. Ou seja, diluição final da
formulação contendo EEAgEu foi de 250 vezes. Essa mesma diluição foi utilizada
para as formulações sem nenhum ativo ou para a formulação contendo filtro químico
sintético (filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel).
Essas soluções etanólicas das formulações em concentração final de
0,2mg/mL foram utilizadas para determinação das absorvâncias
espectrofotométricas, na faixa do ultravioleta, nos comprimentos de onda de 290 a
320nm, em intervalos de 5nm. Antes das leituras de absorvância em cada
comprimento de onda, o equipamento foi zerado com etanol. Todo o procedimento,
para cada formulação foi realizado em triplicata. Para o cálculo do valor de FPS
utilizou-se a equação desenvolvida por Mansur e colaboradores (1986) descrita no
item 4.9.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização Química de Eugenia uniflora L. (Myrtaceae)
58
Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos de
Eugenia uniflora
O extrato hidroalcoólico dos galhos (EEAgEu), após evaporação do solvente
orgânico sob pressão reduzida, foi liofilizado, resultando no extrato hidroalcoolico
dos galhos de E. uniflora (EEAgEu) que teve um rendimento de 6,3% p/p em relação
a massa de matéria prima seca. A extração sólido-líquido, assistida por ultrassom,
do EEAgEu em solventes de polaridade crescente, resultou em: 1,5% p/p da fração
em hexano (FHgEu), 1,87% p/p a fração em diclorometano (FDgEu), 11,1% p/p da
fração em acetato de etila (FAgEu) e 30,7% p/p da fração residual (FRgEu). Todos
os rendimentos foram calculados em relação a massa de EEAgEU. O extrato
lipofílico dos galhos de E. uniflora (EHDgEu) teve um rendimento de 0,19% p/p, em
relação ao material vegetal seco.
Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do extrato e das frações
A cromatografia é um processo físico e químico de separação dos
componentes de uma mistura de substâncias, no qual o fluxo do solvente promove a
separação dos componentes da mistura em um meio poroso. Esta distribuição se dá
entre duas fases que estão em contato íntimo, onde uma delas permanece
estacionária e a outra se move através da mesma. Através da relação gerada entre
fase estacionária / substância ou mistura de substâncias / fase móvel, consegue-se
uma separação mais efetiva dos componentes da mistura (PESSANHA, 2010).
Sendo assim, utilizou-se a cromatografia em camada delgada para registrar o
perfil químico dos extratos e frações de E. uniflora e, assim, estabelecer os
parâmetros de continuidade dos trabalhos. Para tanto, foram obtidos diversos
cromatogramas das amostras, em placas cromatográficas de gel de sílica, eluídas
em diferentes sistemas eluentes. Os cromatogramas foram analisados sob luz
ultravioleta nos comprimentos de onda de 254/366nm e também com reveladores
químicos diversos. Para fins comparativos, foram usadas substâncias de referências
de diferentes classes de metabólitos secundários (eugenol, estigmasterol, terpeno,
cumarina, ácido cumárico, quercetina, catequina, rutina e ácido tânico).
59
A partir disso, foi verificado que os sistemas eluentes que melhor separaram
foram hexano:acetato de etíla (8:2) para visualização das frações EHDgEu; FHgEu;
FDgEu e acetato de etíla: ácido acético: ácido fórmico: água (100: 11: 11: 27) para
visualização das frações FAgEu; FRgEu; EEAgEu.
A visualização dos cromatogramas revelados com sulfato cérico, um revelador
de uso geral, possibilita avaliar a complexidade das amostras. A solução de
anisaldeído sulfúrico permite uma melhor visualização dos derivados terpênicos,
bem como também para alguns derivados fenilpropanoídicos, como taninos, por
apresentar maior sensibilidade a essas classes de metabólitos. O uso de solução de
cloreto férrico auxilia na verificação da presença de substâncias fenólicos através da
visualização da cor azul ao ser revelado. Já o reagente de difenilboriloxietildiamina
em polietilenoglicol (NP-PEG) possibilita evidenciar a presença de derivados
cumarínicos e flavonoídicos. Estes últimos se mostram como manchas fluorescentes
de colorações que variam de acordo com a estrutura química das substâncias, onde
a cor laranja sugere flavona e flavonol e a cor amarela sugere glicosídeos de
flavonol e quercetina.
Com base na análise dos cromatogramas (Rf e coloração) e comparando-se
com as amostras referências, foi visualizada a presença de taninos pela coloração
escura na revelação com cloreto férrico nas amostras EHDgEu; FHgEu; FDgEu
(Figura 26 (C)). Foram identificados predominantemente metabólitos secundários de
origem fenólica como os derivados flavonoidicos, visualizados através de manchas
amarelo-alaranjadas dotadas de leve fluorescência após a revelação com NP-PEG
(figura 26 (D) e figura 27). Derivados terpênicos e esteroidais puderam ser
visualizados como manchas roxas/róseas após revelação com anisaldeído nas
amostras EHDgEu; FHgEu; FDgEu (figura 26 (B)). Estes resultados estão em
conformidade com a literatura científica na qual os estudos mostram que em
analises com folhas de E. unflora predominam os derivados fenólicos (FIUZA et al.,
2008; SILVA et al., 2015; FIUZA et al., 2011).
Figura 26: Cromatogramas em CCD. Fase estacionária: sílica GF254. Fase móvel
hexano:acetato de etíla 8:2 para (A), (B) e (C); cloroformio metanol 9:1 para (D).
60
Reveladores utilizados (A): sulfato cérico (B): anisaldeído sulfúrico (C): cloreto férrico
(D): NP/PEG.
(A) (B) (C) (D)
Amostras: Da esquerda para a direita nas cromatoplacas: EHDgEu; FHgEu; FDgEu.
Figura 27: Cromatograma CCD. Fase estacionária: sílica C18 (fase inversa). Fase
móvel: Butanol : ácido acético: água (4: 1: 5). Revelador: NP/PEG.
Amostras: Da esquerda para a direita na cromatoplaca: FAgEu; FRgEu; EEAgEu.
Obtenção do espectro de varredura na região do ultravioleta
61
O espectro de absorção para o extrato hidroalcoólico de E. uniflora (Figura
28) mostra picos de absorvância na região do ultravioleta nos comprimentos de onda
206, 260, 272nm, compatível com a presença de metabólitos fenólicos, já
visualizado no perfil químico em CCD. Dessa forma, espera-se que esse extrato, ao
ser incorporado em formulações apropriadas, possa contribuir para uma boa
proteção solar.
Figura 28. Varredura do extrato de E. uniflora na região do ultravioleta (200 a
400nm).
5.2. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos
A determinação espectrofotométrica de derivados fenólicos de uma amostra
pode ser realizada por meio de diversas técnicas, todavia, a que utiliza o reagente
de Folin-Ciocalteau (RFC) está entre as mais extensivamente utilizadas (BONOLI et
al., 2004; ROGINSKY & LISSI, 2005). O RFC consiste de mistura dos ácidos
fosfomolibídico e fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se
no estado de oxidação 6+, porém, em presença substâncias redutoras, como as
substâncias polifenólicas, a média do estado de oxidação dos metais passa para
entre 5 e 6. A coloração azul adquirida com a redução dos metais permite a
determinação da concentração das substâncias redutoras, que não necessariamente
precisam ter natureza fenólica (IKAWA et al., 2003; NACZK & SHAHIDI, 2004). O
ajuste do pH ideal (pH = 9,0) para que ocorra a reação entre os grupos fenólicos e o
RFC é feito com solução de Na2CO3 (TREVISAN et al., 2009). A Figura 29 mostra a
62
desprotonação de hidroxilas fenólicas, em meio alcalino, o que favorece a reação de
óxido-redução entre ânion fenolato e os metais do RFC. Segundo Singleton e
colaboradores (1999), o molibdênio sofre redução e o meio reacional muda de
coloração de verde para azul.
Figura 29. Esquema de desprotonação do ácido gálico em meio alcalino e posterior
reação com molibdênio presente no reagente de Folin Ciocaulteu.
Fonte: OLIVEIRA et.al., 2009.
Para expressar os resultados em relação ao conteúdo de metabólitos
fenólicos no extrato bruto hidroalcoólico dos galhos de E. uniflora (EEAgEu) e suas
frações, em equivalente em ácido gálico (mg EAG/g amostra), foram construídas
curvas analíticas do padrão ácido gálico. Durante três dias, em triplicata, foi
realizado o ensaio pelo método de Folin-Ciocalteau com o padrão de ácido gálico.
Ao fim dos três dias, procedeu-se com a análise de covariância das curvas geradas
(programa GraphPad Prism 5.01.) e, constatando-se que as inclinações e
interceptos mostravam equivalência (p > 0,05), a equação de melhor ajuste foi
estabelecida em y = 0,0803396x + 0,006622298 (com R2 = 0,9942). A sobreposição
das curvas de calibração referentes aos três ensaios com ácido gálico nas
concentrações de 0,5 a 6,25 µg/mL estão demonstradas no Gráfico 1 e a curva
analítica obtida pela média dos resultados pode ser vista no Gráfico 2.
63
Gráfico 1. Curvas analíticas sobrepostas de ácido gálico, obtidas para a
quantificação de substâncias fenólicas por espectrofotometria no ultravioleta-visível
em λ 760 nm.
Gráfico 2. Curva analítica de ácido gálico equivalente aos três dias de ensaio. Os
valores representam a média ± desvio padrão. A equação da reta e o R2 se referem
à resultante dos três dias de ensaio.
Na quantificação do conteúdo de metabólitos fenólicos, o maior resultado
encontrado foi para o EEAgEu (376,1±64,5mgEAG/g do extrato), seguido pela
FRgEu (290,1±68,7mgEAG/g da fração) e FAgEu (268,1±1,2mgEAG/g da fração). A
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 2 4 6 8
Ab
s (7
60 n
m)
[ ] de ácido gálico µg/mL
1ª curva
2ª curva
3ª curva
Y=0,0803396X+0,00662298
R² = 0,9942
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 2 4 6 8
Ab
s (7
60 n
m)
[ ] de ácido gálico µg/mL
curva padrão
Linear (curva padrão)
64
FDgEu foi a que mostrou menor conteúdo de substâncias fenólicas
(23,3±2,9mgEAG/g da fração). Embora com resultado inferior, a FHgEu mostrou um
conteúdo relativamente alto de metabólitos fenólicos (146,1±4,5mgEAG/g da fração),
já que se trata da fração de polaridade muito baixa e não se esperava um conteúdo
tão alto desses metabólitos que, em geral, têm de média a alta polaridade (Tabela
5).
Esses resultados corroboram aqueles encontrados no perfil químico por
análise em CCD, onde foi possível visualizar presença de substâncias fenólicas em
todas as amostras de E. uniflora. Como já era esperado, as frações mais polares e o
extrato bruto foram aqueles onde se verificou o maior teor de metabólicos fenólicos.
Tabela 5: Doseamento de substâncias fenólicas expressos em equivalente em ácido
gálico (EAG mg/g amostra).
Amostra [ ] em EAG mg/g amostra ± DP
EEAgEu 376,1 ± 64,5
FHgEu 146,1 ± 4,5
FDgEu 23,3 ± 2,9
FAgEu 268,1 ± 1,2
FRgEu 290,1 ± 68,7
EAG: equivalente em ácido gálico; DP: desvio padrão.
Souza (2013) realizou a avaliação da concentração de substâncias fenólicas
totais para o extrato em etanol 80% das folhas de E. uniflora, encontrando o valor de
206,26 mg EAG/g. Luzia e colaboradores (2010) determinaram um teor de
metabólitos fenólicos de 75,64 mg EAG/g para o extrato em etanol das sementes de
E. uniflora. Já no trabalho de Bagatti (2019), é citado um teor de metabólitos
fenólicos totais, em equivalente de ácido gálico, para o extrato em metanol dos frutos
de E. uniflora, de 4,63 mg EAG/g. A espécie E. uniflora pode ser considerada
promissora na busca por substâncias fenólicas, como taninos, flavonoides e outros
fenólicos, tendo em vista o teor de metabólitos fenólicos registrados na literatura
65
para diferentes partes vegetativas dessa espécie. Assim, os valores encontrados
nesse trabalho para os ramos em forma de galhos de E. uniflora, estão de acordo
com a literatura e, uma vez que se trata de um órgão vegetativo onde
caracteristicamente são armazenados metabólitos fenólicos, são comparativamente
maiores.
Estes resultados demonstrando a diversidade e alto conteúdo de substâncias
fenólicas desses extratos e frações obtidas a partir dos galhos de E. uniflora,
desperta o interesse em relação ao seu potencial antioxidante e de proteção solar.
5.3. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de
redução do radical 1,1-difenil-2-picrilidrazila (DPPH)
O método DPPH está baseado no descoramento de uma solução composta
por radical estável DPPH• (2,2-difenil-1-picrilidrazila) de cor violeta. É um método
fotocolorimétrico, in vitro, de redução do radical livre, baseado na proposta por
BLOIS (1958) com algumas modificações. O DPPH, quando em solução, possui
coloração violeta com forte absorção em torno de 515 - 517nm e apresenta
paramagnetismo conferido pelo elétron não emparelhado. Assim, ao receber um
elétron, seu elétron passa a ser pareado, tornando-se uma molécula diamagnética e
a absorção característica desaparece (Figura 30). Quando esta solução é colocada
junto de substâncias que podem transferir elétrons, ocorre o descoramento. Logo se
baseia na transferência de elétrons de um composto antioxidante para um oxidante.
(HUANG et al., 2005).
Assim, a atividade antioxidante de uma amostra pode ser expressa em função
da sua capacidade de provocar um decréscimo na absorção (λ 515 - 517nm) de uma
solução de DPPH•, a uma determinada concentração. O método é simples, rápido e
conveniente, sendo útil para a triagem de muitas amostras no intuito de avaliar a
atividade neutralizante de radical livre (BRAND-WILLIAMS et al, 1995; KOLEVA et
al., 2001).
66
Figura 30. Redução do radical livre DPPH.
Fonte: GÜLÇIN, 2012.
A capacidade antioxidante foi estimada através da redução do radical 1,1-
difenil-2-picrilidrazila pelas amostras, em triplicatas e em concentrações variadas
(200 a 2,5 µg/mL), a fim de se verificar a faixa de linearidade. A eficiência
antirradicalar foi estabelecida utilizando a análise de regressão linear no intervalo de
confiança de 95% (p<0,05). Os resultados foram expressos através do valor da
concentração efetiva 50% (CE50), encontrado com a aplicação da equação da reta
originada do gráfico resultante dos valores médios.
As CE50 do extrato hidroalcoólico dos galhos de E. uniflora e suas frações
variaram de 9,08 – 52,81 µg/mL (Tabela 6). Valores de CE50 menores do que 30
µg/mL indicam uma boa atividade antioxidante (RAMOS et al., 2003), portanto é
notável o bom potencial antioxidante da maioria dos extrato e frações obtidas de E.
uniflora.
67
Tabela 6: CE50 do EEAgEu, suas frações e extrato de G. Biloba frente ao radical
DPPH.
Amostra CE50 µg/mL ± DP
EEAgEu 9,08 ± 0,35
FHgEu 48,85B ± 1,46
FDgEu 52,81B ± 1,02
FAgEu 13,69A ± 0,36
FRgEu 12,75A ± 0,36
Extrato seco padronizado de Ginkgo biloba 39,1844 ± 0,18
Os valores referentes à CE50 são a média das três determinações mais o desvio
padrão entre elas. Letras iguais indicam médias equivalentes – ANOVA/Teste de
Tukey p<0,05
As amostras testadas apresentaram alta atividade antioxidante, sendo
EEAgEu o mais efetivo em doar elétrons ao radical estável DPPH•. O maior
potencial antioxidante foi encontrado para o EEAgEu (CE50 = 9,08 µg/mL), seguido
pelas amostras FRgEu (12,75 µg/mL) e FAgEu (13,69 µg/mL), depois a FHgEu
(48,85 µg/mL) e pôr fim a FDgEu (52,81 µg/mL).
A análise dos resultados desse trabalho considera como valores de referência
a CE50 do extrato seco padronizado de Ginkgo biloba (39,18 μg/mL) para comparar a
atividade antioxidante das amostras testadas, uma vez que, a espécie G. biloba é
uma das plantas consideradas com alta atividade antioxidante (MENSOR et al.,
2001).
O interesse na descoberta de antioxidantes naturais tem aumentado, com o
intuito de substituir aqueles sintéticos, os quais têm tido o uso restringido devido à
toxicidade e até mesmo carcinogênese. Muitas plantas medicinais têm sido
pesquisadas e sua atividade antioxidante e de extinção de radicais livres reportadas,
com intuito de seu potencial ser provado para futuros fármacos e formulações
cosméticas possam fazer uso dessas plantas medicinais (RAJBAPOOR, BURKAN &
SENTHILKUMAR, 2010; RAJKUMAR & GUHA, 2010).
Luzia, Bertanha e Jorge (2010) ao avaliarem a atividade antioxidante do
extrato em etanol das sementes de E. uniflora, pelo método DPPH, encontraram
68
CE50 30,72 µg/mL, uma atividade antioxidante pronunciada e compatível com aquele
obtido para o extrato hidroalcoólico e frações de E. uniflora.
No estudo realizado por Reynertson, Basile e Kennelly (2008) foi avaliada a
atividade antioxidante da fração acetato de etila das folhas E. uniflora, pelo método
DPPH, encontrando um valor de CE50 de 19.6 µg/mL. Uma atividade antioxidante
comparável com aquela verificada para a FAgEu cujo CE50 foi de 13,69 µg/mL.
Já Pessanha (2010) avaliou a atividade antioxidante do extrato aquoso e das
frações em acetato de etila e em butanol das sementes de Eugenia uniflora. Os
resultados obtidos demonstraram o alto potencial antioxidante da fração em acetato
de etila, com 84,1% de atividade para uma concentração de 1mg/mL, em relação às
outras amostras utilizadas nesse estudo. Em relação às amostras de galhos de E.
uniflora, pode se verificar que a atividade antioxidante de FAgEu (13,69 µg/mL)
também foi maior em relação as outras frações testadas FHgEu (48,85 µg/mL) e
FDgEu (52,81 µg/mL). Esses resultados podem demonstrar que essa fração
concentra maior número de compostos ativos. Já o valor o CE50 para o EEAgEu
(9,08 µg/mL) foi menor do que de todas as suas frações, ou seja, maior atividade
oxidante, uma possível explicação para isso seria o sinergismo dos constituintes do
extrato.
Comparando-se os resultados no método antioxidante frente ao radical
DPPH, encontrados para as amostras a partir dos ramos em forma de galhos de E.
uniflora, com aqueles descritos na literatura, nota-se que esse órgão vegetativo
possui um potencial antirradicalar maior do que outros órgãos como folhas, frutos e
sementes.
Como foram verificadas em CCD e na quantificação de substâncias fenólicas,
os extratos e frações dos galhos de E. uniflora são muito ricos em substâncias
fenólicas. Assim, as amostras mais polares apresentaram melhor atividade
antioxidante, o que pode estar relacionado com o alto conteúdo de substâncias
fenólicas, uma vez que essas substâncias possuem propriedades redutoras que
desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres
e quelação de metais de transição (SOARES, 2002; CHUN et al., 2005).
69
Correlação do teor de metabólitos fenólicos com a atividade antioxidante
pelo método DPPH
Em geral, a atividade antioxidante de produtos naturais está fortemente
relacionada com o a composição fenólica das amostras, especialmente, sendo
promovida pelos flavonoides e polifenóis. Deste modo, foi aplicado um teste
estatístico para verificar a correlação entre a composição em metabólitos fenólicos
das amostras de E. uniflora com a atividade antioxidante estimada pelo método do
DPPH. O teste escolhido nesse caso foi o de Pearson, assumindo uma distribuição
Gauseana normal para os dados e um intervalo de confiança de 95% (p<0,05).
O coeficiente de correlação de Pearson foi significativo para todas as
amostras, o que demonstra que a atividade antioxidante está muito fortemente
relacionada com a composição fenólica dessas, Pearson>0,9 para todas as
amostras (Tabela 7). Isto indica que as substâncias fenólicas contribuem de forma
significativa para a capacidade antioxidante do extrato e das frações.
Tabela 7. Análise estatística pela Correlação (Pearson) entre o teor de substâncias
fenólicas e a atividade antioxidante obtida pelo método DPPH de confiança de 95%
(p>0,05). GraphPad Prism 5.01.
Amostra Coeficiente de correlação de Pearson
EEAgEu 0,9786
FHgEu 0,9901
FDgEu 0,9855
FAgEu 0,9328
FRgEu 0,9577
Junior e colaboradores (2014) trabalhando com extratos e frações de folhas
de Eugenia copacabanensis, encontraram uma correlação de Pearson forte entre a
quantidade de substâncias fenólicas e a atividade antioxidante pelo método DPPH
(R2 = 0,72), onde o teor de substâncias fenólicas foi igual a 970,32 ± 2,72 mgEAG/g
e a CE50 de 3,66 ± 0,02 μg/mL. Os autores sugeriram que esses resultados
70
demonstram a contribuição destas substâncias para o pronunciado potencial
antioxidante de extratos e frações de folhas e galhos de Eugenia copacabanensis.
Em relação aos resultados para o EEAgEu foi demonstrado uma correlação
de Pearson entre a quantidade de substâncias fenólicas e a atividade antioxidante
pelo método DPPH muito forte (R de Pearson > 0,9). Com isso, pode-se inferir que
as amostras de E. uniflora tem um grande potencial antioxidante, em função do alto
e variado conteúdo de metabólitos fenólicos e que, portanto, desperta o interesse
quanto ao seu efeito fotoprotetor e antienvelhecimento.
5.4. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS
espectrofotométrico) in vitro do extrato
O resultado da determinação do FPS, in vitro está apresentado na tabela 8.
De acordo com a legislação brasileira, RDC nº 30 de 01 de junho de 2012 (Brasil,
2012b), apenas FPS maior ou igual a 6 pode ser considerado como produtos
cosméticos com atividade fotoprotetora UVB, sendo que para sua comprovação
deve ser realizado métodos in vivo obrigatoriamente.
Como resultado de pesquisa científica preliminar, podemos ver que o EEAgEu
diluído em etanol, na concentração de 200mg/L, teve atividade fotoprotetora
satisfatória, com valor de FPS espectrofotométrico igual a 7 (Tabela 8), ou seja, dentro do
especificado pela ANVISA.
Tabela 8. Resultados de FPS das soluções em etanol de EEAgEu, por leitura
em espectrofotômetro.
Amostras FPS Desvio padrão
2,5mg/L de EEAgEu 0,297 0,004
5mg/L de EEAgEu 0,316 0,029
25mgL de EEAgEu 0,951 0,056
50mg/L de EEAgEu 1,739 0,061
100mg/L de EEAgEu 3,344 0,018
200mg/L de EEAgEu 7,003 0,372
71
ARAÚJO, FONTINELES e CHAVES (2015) analisaram diversas espécies
procurando um potencial fotoprotetor dos extratos etanólicos na concentração de
100mg/L, onde encontraram para Handroanthus ochraceus, Handroanthus
serratifolius e Tabebuia aurea o fator de proteção solar (FPS) 3, 5 e 9,
respectivamente. Demonstrando que apenas a espécie Tabebuia aurea apresentou
o potencial de proteção solar, onde sua atividade se mostrou similar a solução de
EEAgEu na concentração de 200mg /L.
5.5. Obtenção das formulações
Desde a década de 1950, os compostos orgânicos derivados do silício,
constituídos por cadeias onde alternam átomos de silício e oxigênio ligados a
radicais orgânicos, têm ampliado sua gama e suas aplicações. De maneira geral, os
diversos tipos de silicone se caracterizam por serem emolientes de alta estabilidade
térmica (resistente a variações de temperatura de -40 a 316ºC) e química (não
reagem com outros produtos químicos), de baixa tensão superficial, bom perfil
reológico a baixas temperaturas e repelência à água. Além de proporcionarem
lubrificação, facilidade de espalhamento, sedosidade ao toque e brilho, sem
possuírem efeito comedogênico. Além disso, são resistentes à ação de bactérias e
fungos e não agridem o meio ambiente. A gama de silicones oferecida para a área
cosmética é ampla e, dependendo da aplicação e da necessidade, pode-se utilizar
uma combinação dessas matérias-primas para otimizar resultados, facilitando o
desenvolvimento de formulações cosméticas devido a sua multifuncionalidade
(STARCH, 2008; GOIATO, COELHO & SANTOS, 2009).
Portanto, para as formulações desenvolvidas nesse estudo, usou-se silicones
como veículo, pretendendo-se alcançar características como aspecto visual e textura
adequados, facilidade de aplicação e redução da pegajosidade (SOMASUNDARAN
et al, 2006).
Os excipientes usados foram escolhidos de acordo com características
necessárias para que a formulação apresentasse perfil físico e químico adequado.
Os excipientes foram incorporados por agitação até a total mistura entre as fases,
fazendo com que a formulação se tornasse emulsionada, estável e adequada para
os testes qualitativos com a formulação de forma preliminar.
72
5.5.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações
O pH das formulações foi verificado com o uso de pHmetro. As formulações
mostraram pH no valor de 7, o qual foi corrigido, com adição de ácido cítrico, para o
valor de 5,5, valor necessário para formulações cosméticas que são usadas na pele
para que não haja agressão a sua estrutura. A correção do pH das formulações foi
feita para que se aproximasse e, portanto, fosse compatível com a faixa de pH do
manto ácido da pele que é de 4,1 e 5,8 (SEGGER et al., 2007). O processo de
centrifugação (30 minutos em rotação de 3000rpm) das formulações não resultou na
separação de fases, o que demonstra uma emulsão preliminar adequada.
O espectro de absorção das formulações 1 e 2 em estudo (figura 31) mostrou
picos máximos em 282nm (traço em azul da figura 31) para a da formulação 1 e
200nm (traço em vermelho da figura 31) para a formulação 2, demonstrando que
essas formulações não têm grande absorção na região de 290 a 320nm, equivalente
a radiação ultravioleta UVB.
Figura 31. Varredura na região do ultravioleta (200 a 400nm) das formulações 1 e 2.
Foi escolhida como a formulação para incorporação dos extratos a formulação
1, pois a partir das análises realizadas na varredura das duas formulações
preparadas, os picos espectrofotométricos não se encontraram dentro da faixa de
ação dos filtros UVB, não apresentando atividade fotoprotetora, com isso o critério
de escolha foi em relação a característica sensorial, no qual a formulação 1 teve
maior atração no aspecto de espalhabilidade.
Após a incorporação do extrato a formulação 1 e o filtro solar UVA/UVB
hidrossolúvel de comparação, não foi apresentado separação das fases em um curto
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
200 250 300 350 400 450
formulação 1 formulação 2
73
período de análise e não demonstrou alterações na sua viscosidade, verificando que
as formulações apresentam boa estabilidade física, além de uma boa
espalhabilidade, como pode ser visto na figura 32 e 33.
Figura 32. Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel incorporado à formulação 1 a 10%v/p.
Figura 33. EEAgEu incorporado a formulação 1 nas concentrações de: (A) 2,5%;
(B) 5% e (C) 10%p/p.
(A) (B) (C)
5.6. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS
espectrofotométrico) in vitro
Os resultados preliminares com as soluções do EEAgEu, onde encontrou-se
para uma solução a 200mg/L valor de FPS maior que 6, em consonância com outros
resultados da literatura para extratos vegetais(SÁ-NETA et al., 2015; ARAÚJO,
FONTINELES e CHAVES, 2015), serviram como parâmetro para a incorporação de
tal extrato à formulação 1, nas concentrações de 25mg de EEAgEu/g da formulação,
50mg de EEAgEu/ g de formulação e 100mg de EEAgEu/g de formulação, ou seja,
concentrações finais 2,5; 5 e 10 % p/p do EEAgEu. Para fins comparativos, um filtro
74
solar hidrossolúvel foi incorporado à formulação 1, na concentração de 10% (v/p),
concentração preconizada para essa substância.
Os produtos contendo EEAgEu em diferentes concentrações, bem como o
produto de referência, foram diluídos em etanol à concentração de 0,2mg/mL, sendo
obtidos os valores de absorvância na faixa de 290 a 320nm e o fator de proteção
solar (FPS espectrofotométrico) foi calculado usando a equação desenvolvida por Mansur
e colaboradores (1986):
FPS=FC. 320290 .EE (λ).I (λ).abs (λ)
Os valores encontrados estão mostrados na tabela 9, onde pode-se constatar
que o melhor resultado, dentro do estabelecido pela ANVISA (gráfico 3), foi para o
produto contendo 10% de EEAgEu (FPS = 6), tendo, inclusive, melhor resultado do
que o produto de referência contendo 10% de um filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel,
cujo valor de FPS foi 4.
Tabela 9. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu, por leitura em
espectrofotômetro.
Amostras FPS Desvio padrão
Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel 10% + formulação 1 4,50 0,04
2,5% ou 25mg de EEAgEu/1g da formulação 1 1,11 0,03
5% ou 50mg de EEAgEu/1g da formulação 1 2,46 0,02
10% ou 100mg de EEAgEu/1g da formulação 1 6,31 0,3
Equação 4
75
Gráfico 3. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu comparados com o
valor mínimo de atividade fotoprotetora UVB de 6.
Reis e colaboradores (2015) realizaram uma análise similar, determinando o
fator de proteção solar espectrofotométrico para o extrato hidroalcoólico (70%) das
cascas do caule de Ximenia americana L. incorporado a 10% em uma emulsão
lanette®, encontrando um valor de FPS igual a 6,13. Os autores consideraram uma
atividade fotoprotetora promissora e, portanto, fortalece os resultados encontrados
para a formulação 1 contendo 10% de EEAgEu, demonstrando que o extrato dos
galhos de E. uniflora tem potencial como um possível ativo fotoprotetor.
Já Mansur e colaboradores (2016) determinaram o FPS para o extrato
etanólico das folhas de Bauhinia microstachya incorporado puro e em associação
com outros filtros químicos. O melhor resultado observado foi para a associação do
extrato com os filtros (benzofenona - 3 , metoxicinamato de octila e octocrileno) solar
gerando um FPS igual a 17,8. Para o extrato etanólico de B. microstachya foi
verificado um valor de FPS igual a 0,7. Assim, os autores concluíram que B.
microstachya apesar de não ter demonstrado atividade fotoprotetora in vitro, contem
compostos fenólicos que podem atuar prevenindo danos induzidos por UV por
outros mecanismos, por exemplo, capturando e inativando os ERO, o que foi
comprovado por testes in vivo (GREUL et al., 2002). Esse resultado indica que a
presença de substâncias fenólicas por se só, que podem atuar na prevenção contra
os danos caudados pelos raios UV, além de agir como um filtro orgânico.
Os resultados encontrados para o EEAgEu mostraram que este é rico em
metabólitos fenólicos, tanto em teor como em diversidade, os quais estão
0
1
2
3
4
5
6
7
Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel 10%+
formulação 1
2,5% de EEAgEu/1g de formulação 1
5% de EEAgEu/1g de formulação 1
10% de EEAgEu/1g de formulação 1
76
correlacionados de forma muito forte (R de Pearson = 0,9786) com a atividade
neutralizadora do radical livre DPPH, além de ter mostrado uma atividade
fotoprotetora considerada promissora dentro dos parâmetros da legislação vigente e
em consonância com outros extratos vegetais descritos na literatura.
77
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO
O extrato hidroalcoólico dos ramos em forma de caule de Eugenia uniflora e
suas frações a partir da cromatografia verificou-se a presença de esteroides;
terpenos; taninos; flavonoides e metabólitos fenólicos sendo que a presença de
metabólitos fenólicos pode ser visualizada em todas as frações, mesmo aquelas de
baixa polaridade. A quantificação de substâncias fenólicas pelo método
espectrofotométrico com reagente de Folin-Ciocalteu está em acordo com o perfil de
CCD, uma vez que foi verificada uma grande concentração de mgEAG/g no extrato
hidroalcoólico seguido pelas frações FRgEu e FAgEu, seguido por FHgEu e FDgEu.
O EEAgEu foi onde encontrou-se maior teor de substâncias fenólicas
(206,26±64,5mgEAG/g), sendo assim esperado que nele seria encontrado a maior
atividade fotoprotetora.
Para analise espectrofotométrica da atividade antioxidante, o extrato e as
frações apresentaram um valor de EC50 relativamente baixo, sendo que o EEAgEu
teve o menor valor (CE50 = 9,08±0,35µg/mL) e nas frações os melhores resultados
foram para FRgEu e FAgEu, onde quanto menor o valor de EC50 maior é sua
atividade antioxidante.
A partir dessas duas últimas analises é possível correlacionar a atividade
antioxidante com a presença de substâncias fenólicas. Isto indica que os derivados
fenólicos contribuem de forma importante para a capacidade antioxidante do extrato
e das frações.
Na determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS) in
vitro, o extrato de E. uniflora na concentração de 200 mg/L teve atividade
fotoprotetora satisfatória e acima do limite mínimo exigido pela ANVISA. Nas
formulações testadas foi encontrado valor de FPS superior a 6 apenas na
concentração de 100mg (10%) de EEAgEu/1g de formulação 1, demonstrando uma
atividade fotoprotetora promissora em relação aos raios solares do tipo UVB.
Portanto, o extrato hidroalcoólico a partir dos ramos na forma de galhos de
Eugenia uniflora L. (EEAgEu) mostrou-se rico em metabólitos fenólicos, com grande
potencial antioxidante e considerável absorção na região do ultravioleta (picos de
absorção em 206, 260 e 272nm) e, ainda, quando incorporado a uma formulação a
base de silicone, na concentração de 10% p/p, mostrou considerável atividade
fotoprotetora (FPS = 6). Esses resultados nos despertam interesse em ralação a
78
uma possível ação sinérgica desse extrato com filtros químicos, podendo intensificar
a proteção final do produto e/ou neutralizar as espécies reativas produzidas na pele
em função da exposição ao sol. Assim, conclui-se que, apesar de serem necessários
maiores estudos in vitro para análise do fator de proteção FPUVA e in vivo, através
dos métodos preconizados pela ANVISA (FDA, Department of Health and Human
Services, Sunscreen drug products for over-the-counter human use. Final
Monograph: Proposed Rule, 21 CFR Part 352 et al, 1999; COLIPA/JCIA/CTFA-SA.
International Sun Protection Factor (SPF) Test Method, 2006), além de ser testado
sua toxidade na pele, o EEAgEu poderia ser um componente interessante para
formulações farmacêuticas/cosméticas fotoprotetoras e antienvelhecimento.
79
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