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 UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO CURSO DE FARMÁCIA CAMPUS CAMPINAS UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE ESPECTROMETRIA DE INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) PARA ANÁLISE QUANTITATIVA  Alessandra A. de S. Cirino Vanessa C. de S. Ildefonso Campinas 2011

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UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCOCURSO DE FARMÁCIACAMPUS CAMPINAS

UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE ESPECTROMETRIA DEINFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) PARA ANÁLISE QUANTITATIVA

 Alessandra A. de S. Cirino

Vanessa C. de S. Ildefonso

Campinas

2011

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UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCOCURSO DE FARMÁCIACAMPUS CAMPINAS

GUIA DIDÁTICO PARA UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DEESPECTROMETRIA DE INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) PARA

ANÁLISE QUANTITATIVA

 Alessandra A. de S. Cirino

Vanessa C. de S. Ildefonso

Monografia da disciplina de Trabalhode Conclusão de Curso deGraduação em Farmácia daUniversidade São Francisco, campusde Campinas

Orientação: Prof.ª Drª. Iara LúciaTescarollo Dias

Campinas

2011

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente à Deus por sua graça, sua misericórdia e pelas forças que tem renovado

a cada manhã.

 A nossas famílias que contribuíram grandemente para que pudéssemos superar os

desafios.

 A todos os profissionais que colaboraram com as experiências e ensinamentos, para a

conclusão deste trabalho.

 Aos amigos e colegas pelo companheirismo em relação à conclusão desta jornada.

 Aos professores que durante todo esse período nos capacitaram, dando condições para

 juntos trilhamos uma etapa importante de nossas vidas.

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RESUMO

O presente trabalho tem como objetivo elucidar de forma didática a utilização da técnica

para fins quantitativos, assim como trazer exemplos práticos e as principais vantagens

e desvantagens da técnica de Quantificação de Compostos Químicos através de

Infravermelho Próximo (NIR). A técnica de espectrometria de infravermelho (IV) ou

infrared (IR) é a medição de comprimento de onda e intensidade da absorção de luz

infravermelha próxima realizada pela amostra. A luz infravermelha próxima se estende

em uma faixa de 800 nm - 2.500 nm (12,500 - 4000 cm-1) e tem energia suficiente para

excitar sobretons e combinações de vibrações moleculares a altos níveis de energia. Aespectrometria NIR é tipicamente usada na identificação de grupos funcionais

orgânicos, especialmente O-H, N-H, e C=O. Os limites de detecção são normalmente

0.1% e as aplicações mais comuns incluem análises farmacêuticas, agrícolas,

poliméricos e clínicos. Os componentes e o design do instrumental do NIR são similares

aos espectrômetros de absorção UV-Vis. A fonte de luz normalmente é uma lâmpada

de tungstênio e o detector é um detector de Sulfato de Chumbo estado sólido. Os

recipientes para a amostra podem ser de vidro ou quartzo e os solventes típicos são

Tetracloreto de Carbono e Dissulfeto de Carbono. O instrumental da espectroscopia de

infravermelho próximo (NIR) comparado com a espectroscopia de infravermelho

tradicional torna-o mais adequado para o monitoramento on line e o controle de

processos.

Palavras-chave: espectrometria, luz infravermelha próxima, radiação.

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ABSTRACT

This study aims to elucidate in a didactic manner using the technique for quantitative as

well as bring practical examples and the main advantages and disadvantages of the

quantification of chemical compounds using Near Infrared (NIR). The technique of 

infrared spectroscopy (IR) or infrared (IR) is the measurement wavelength and intensity

of the absorption of near-infrared light held by the sample. Near-infrared light extends

over a range of 800 nm - 2,500 nm (12,500 - 4000 cm-1) and have enough energy to

excite overtones and combinations of molecular vibrations to higher energy levels. NIR

spectrometry is typically used to identify organic functional groups, especially OH, NHand C = O. The detection limits are typically 0.1% and the most common applications

include pharmaceutical, agricultural, polymer and biological. The components and

design of NIR instrumentation are similar to the absorption spectrometers UV-Vis. The

light source is usually a tungsten lamp and the detector is a detector of lead sulfate

solid. The sample containers can be glass or quartz and typical solvents are carbon

tetrachloride and carbon disulfide. The instruments of near-infrared spectroscopy (NIR)

compared to traditional infrared spectroscopy makes it more suitable for on-line

monitoring and process control.

Keywords: spectrophotometry, near-infrared light, radiation.

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LISTA DE ABREVIATURAS

 ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

 ASTM American Society for Testing and Material

CG Cromatografia Gasosa

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

FIR Infravermelho Longíquo

FTIV Transformada de Fourier  

ICH International Conference on Harmonisation’s

INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

IR ou IV Infrared ou Infravermelho

MID Infravermelho Médio

MLR Regressão Linear Múltipla

NIR Near Infrared ou Infravermelho próximo

NIRR Reflexão no infravermelho próximo

PLS Regressão por quadrados mínimos parciais

PCR Regressão por Componentes PrincipaisUSP United States Pharmacopoeia

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Comparativo das características das técnicas analíticas

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Experimento de William HershellFigura 2: Modos de Vibrações Moleculares

Figura 3: Espectro de Etanol.

Figura 4: Tipos de radiação

Figura 5: Espectrômetros Dispersivos

Figura 6: Espectrômetros com Transformada de Fourier 

Figura 7: Componentes básicos de um equipamento que opera na região do

infravermelho.

Figura 8: Construção da matriz X para calibração multivariada.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................01

2. JUSTIFICATIVA..........................................................................................................06

3. OBJETIVO...................................................................................................................06

4. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................................08

5. RESULTADOS............................................................................................................09

5.1. Definição..............................................................................................................09

5.2. Princípio da espectroscopia no infravermelho.....................................................11

5.3. Tecnologias..........................................................................................................14

5.3.1. Tipos de radiação infravermelha................................................................145.3.2. Evolução Tecnológica................................................................................15

5.3.3. Espectrômetros dispersivos.......................................................................15

5.3.4. Instrumentos não dispersivos.....................................................................16

5.3.5. Espectrômetros com Transformada de Fourier.........................................17

5.4. Principais componentes de um equipamento de infravermelho...................18

5.5. Processamento de Dados.............................................................................20

5.5.1. Quimiometria..............................................................................................20

5.5.2. Análise Multivariada...................................................................................22

5.5.3. Calibração...................................................................................................23

5.5.4. Regressão Linear Múltipla – MIR...............................................................23

5.5.5. Regressão por Componentes Principais....................................................26

5.5.6. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais............................................26

5.5.7. Detecção de amostras anômalas – Outliers..............................................27

5.6. Aplicações da Espectroscopia e da Quimiometria na análise de medicamentos

.........................................................................................................................................28

6. DISCUSSÃO...........................................................................................................30

7. CONCLUSÃO.........................................................................................................35

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................36

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1. INTRODUÇÃO

Os medicamentos vêm sendo cada vez mais objetos de preocupação e de

inúmeras pesquisas realizadas mundialmente. Estas pesquisas dizem respeito à prática

médica, reações adversas, aumento e disseminação de resistência bacteriana à

antibióticos, padrão e influência da propaganda na prescrição de medicamentos na área

clínica, como também na área odontológica (CASTILHO, PAIXÃO, PERINI, 1999).

Por tais razões, é de enorme importância o desenvolvimento de métodos

eficazes e rápidos para maior controle de qualidade dos medicamentos

comercializados, tornando-se imprescindível o desenvolvimento de rotinas de análisesque, além de servirem para este propósito, favoreçam sua implantação em comparação

aos métodos usuais (PARISOTTO et al., 2005).

Havendo a necessidade de métodos rápidos, versáteis, confiáveis, capazes de

emitir resultados em tempo real, como alternativas eficazes aos métodos tradicionais.

O infravermelho e demais métodos espectroscópicos modernos como a

ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia na região do ultravioleta–visível

(UV-VIS) e espectrometria de massas (EM) constituem hoje os principais recursos para

a identificação e elucidação estrutural de substâncias orgânicas. São, também, de alta

relevância na determinação da pureza e quantificação de substâncias orgânicas, bem

como no controle e acompanhamento de reações e processos de separação. O uso dos

referidos métodos físicos de análise traz uma série de vantagens, destacando-se a

redução no tempo de análise, diminuição substancial nas quantidades de amostra,

ampliação da capacidade de identificar ou caracterizar estruturas complexas, não

destruição da amostra (exceto EM) e a possibilidade de acoplamento com métodos

modernos de separação, como a cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) e

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A espectroscopia na região do

infravermelho tem sido, também, amplamente utilizada em linhas de produção, no

controle de processos industriais (LOPES,FASCIO,2004).

 A radiação na região do infravermelho foi descoberta por William Herschel, um

astrônomo inglês que, em 1800, estava investigando qual cor da radiação solar 

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produzia calor. Ele empregou um prisma de vidro, transparente à radiação, para

decompor a luz branca do sol em seus comprimentos de onda visíveis e, com o auxílio

de um termômetro com um bulbo enegrecido, pôde verificar a temperatura produzida

por cada cor. Surpreendentemente, a mais intensa variação de temperatura foiobservada quando o termômetro foi colocado logo acima da região vermelha do

espectro. Herschel chamou esta radiação de “raios caloríficos”, que mais tarde foi

denominada Infravermelho (LIMA et al. 2009).

  Atualmente, a espectroscopia na região do infravermelho tem se destacado

como técnica analítica, proporcionando métodos rápidos, robustos, não-destrutivos,

não-invasivos, possibilitando aplicações automáticas e em tempo real. Muitos dos

métodos baseados na espectroscopia na região do infravermelho médio (MID) ou naregião do infravermelho próximo (NIR) empregam um feixe de fibras ópticas para

efetuar medidas de reflectância ou transflectância diretamente na amostra, sem a

necessidade de pré-tratamento. Esta peculiaridade é facilmente explicada considerando

que as fibras ópticas conferem muitas vantagens para medidas em campo e na análise

de processos, uma vez que a sonda de fibra óptica “vai” até a amostra, mesmo em

locais de difícil acesso, mantendo o instrumento longe de ambientes hostis. Muitos dos

métodos analíticos no infravermelho são baseados nas propriedades intrínsecas dos

constituintes da amostra e o sinal analítico resulta da interação da radiação

eletromagnética com os níveis vibracionais das moléculas. Neste sentido, os métodos

no infravermelho baseados em fibras ópticas podem ser classificados no escopo de

sensores ópticos, uma vez que a fibra óptica atua passivamente como guia de luz. Este

tipo de sensor pertence à primeira geração, possibilitando o sensoriamento remoto

desde que uma propriedade óptica intrínseca da amostra possa ser distinguida. Em

outras palavras, o analito fornece a informação analítica diretamente, por meio de

absorção ou emissão de radiação (LIMA et al. 2009). A espectroscopia no infravermelho vem sendo amplamente estudada, como por 

exemplo, a técnica de reflexão no infravermelho próximo (NIRR) que abrange a faixa

entre 1300 a 2500 nm, que vem sendo utilizada em análises farmacêuticas (BLANCO et

al., 1999a; HERKERT, PRINZ, KOVAR, 2001; PASQUINI, 2003).

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  Até recentemente, a espectroscopia na região do infravermelho era pouco

utilizada em análises quantitativas em decorrência de algumas limitações inerentes à

técnica (DE SOUZA, FERRÃO, 2006). Porém, com a utilização da transformada de

Fourier, aliada à evolução de técnicas quimiométricas, ao advento dosmicroprocessadores digitais e de técnicas computacionais avançadas, permitiu-se a

análise de misturas complexas, como os medicamentos (DE SOUZA et al., 2004).

 Associada ao crescente desenvolvimento do método de refletância difusa, este tipo de

análise garante a caracterização de fármacos com extrema rapidez (DE SOUZA,

FERRÃO, 2006). A identificação destas substâncias pode ser alcançada tanto

quantitativamente como qualitativamente através da espectroscopia por refletância

difusa no infravermelho com transformada de Fourier (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy  - DRIFTS) (YANG, IRUDAYARAJ, 2002), aliada a

ferramentas quimiométricas de análise multivariada (NEUMANN et al., 2004;

PARISOTTO et al., 2005).

 A espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier é uma técnica

instrumental que vem sendo amplamente utilizada no controle de qualidade de

fármacos, principalmente, pela rapidez e facilidade com que podem ser obtidos os

espectros. Deve-se destacar, também, que a combinação da espectroscopia de

infravermelho com as ferramentas quimiométricas (análise exploratória de dados e

calibração multivariada) vem colaborando para a disseminação do infravermelho como

ferramenta analítica na indústria, pois, além de quantificar o medicamento já acabado,

permite controlar o processo de fabricação do medicamento (monitoramento on-line) e

obtenção de informações que não poderiam ser alcançadas com as técnicas

convencionais de análise (GABRIELSSON; LINDBERG; LUNDSTEDT, 2002).

 A interpretação de espectros de infravermelho de substâncias orgânicas é uma

tarefa que, devido ao grande número de informações que devem ou precisam ser manipuladas, geralmente apresenta dificuldades para os alunos e profissionais

iniciantes. Assim, é necessário um meio para, de modo sistemático, interpretar um

espectro na região do infravermelho e propor uma possível estrutura molecular. Os

livros textos geralmente apresentam tabelas de correlação entre as absorções de

estiramento e deformação, em número de onda (4000 - 400 cm-1) e/ou comprimento de

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onda (2,5 - 25 μm), e os respectivos grupos funcionais ou ligações químicas

correspondentes. Não há, contudo, uma preocupação com a sistematização de um

caminho que possibilite aos alunos, assim como demais profissionais analisar um

espectro infravermelho, obter informações sobre as principais ligações e gruposfuncionais de uma determinada substância orgânica e, finalmente, propor uma possível

estrutura (LOPES,FASCIO,2004).

Para facilitar a quantificação de compostos químicos através da técnica de IV

NIR, associa-se a calibração multivariada, possibilitando métodos seguros e práticos

para várias quantificações, como por exemplo: teor de proteínas, umidade, entre outros.

(LIMA et al., 2009).

Em métodos de Calibração Multivariada duas ou mais respostas instrumentaissão relacionadas com a propriedade de interesse. Esses métodos possibilitam análises

mesmo na presença de interferentes, desde que estejam presentes nas amostras de

calibração, determinações simultâneas, análises sem resolução etc. Isso faz com que,

modelos de Calibração Multivariada sejam uma alternativa quando métodos univariados

não podem ser aplicados. Diversos modelos de calibração multivariada vêm sendo

utilizados, tais como Regressão Linear Múltipla (MLR), Regressão por Componentes

Principais (PCR) e Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS). Esses modelos

têm apresentado ótimos resultados, com aplicações em diversas áreas. Contudo, sua

aceitação e implementação têm sofrido restrições em alguns setores, como as áreas

farmacêutica e médica, devido às exigências de validação. Essa validação é feita com

base no cálculo e análise das chamadas figuras de mérito, que certificam que o modelo

multivariado proposto é confiável e atende às especificações impostas pela indústria e

órgãos de fiscalização nacionais e internacionais como “United States Pharmacopoeia”

(USP), “International Conference on Harmonisation’s” (ICH), “American Society for 

Testing and Materials” (ASTM), Instituto Nacional de Metrologia, Normalização eQualidade Industrial (INMETRO), Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)

etc. (BRAGA, POPPI, 2004).

Os fabricantes de equipamentos disponibilizam diferentes softwares, que utilizam

métodos matemáticos e estatísticos para o máximo aproveitamento das informações

obtidas, têm sido desenvolvidos e aplicados para tratar estes tipos de dados, sendo o

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da regressão por quadrados mínimos parciais (PLS) um dos mais empregados. Embora

nem sempre ocorram relações lineares entre os sinais espectroscópicos e as medidas

da concentração total das espécies contidas na amostra, estes procedimentos já foram

aplicados com sucesso em análises de matrizes complexas, fornecendo resultadosrápidos, precisos e exatos (LIMA et al., 2009).

O presente trabalho tem como objetivo elucidar a utilização da técnica para fins

quantitativos, assim como trazer exemplos práticos e as principais vantagens e

desvantagens da técnica de Quantificação de Compostos Químicos através de

Infravermelho Próximo (NIR). Contribuir de forma a facilitar a tarefa de análise e

interpretação de espectros de infravermelho, estabelecendo um caminho bjetivo e

prático que permita a quantificação de compostos químicos. O trabalho foi desenvolvidoatravés de pesquisa bibliográfica de artigos publicados, literaturas auxiliares (manuais

de equipamentos) e livros e experiência prática de usuários da técnica.

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2. JUSTIFICATIVA

 Apresentar uma nova alternativa para a quantificação de compostos químicos

através da técnica de Infravermelho Próximo (NIR), em substituição aos métodos

tradicionais (Cromatografia Líquida, Cromatografia Gasosa, UV/Vis).

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3. OBJETIVO

Elucidar a utilização da técnica para fins quantitativos, as principais vantagens e

desvantagens da técnica de Quantificação de Compostos Químicos através de

Infravermelho Próximo (NIR), de modo a facilitar a utilização da técnica por alunos e

também profissionais ingressantes na química analítica, de uma forma clara e objetiva,

estimulando ao uso de mais uma ferramenta na química analítica.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

Foi realizada uma revisão bibliográfica sobre o tema escolhido, com coleta de

dados, utilizando as palavras-chave: Infravermelho, radiação, quimiometria e

multivariada. Através de pesquisa de artigos científicos e trabalhos acadêmicos,

utilizando as seguintes bases de dados digitais: Medline (www.medline.com/ 

nlm.nih.gov/PubMed); Lilacs (www.bireme.br) e SciELO (www.scielo.br ). A consulta em

literatura impressa também foi utilizada na elaboração do trabalho.

Os dados foram analisados, sendo adotado como critério para a seleção dos

trabalhos e artigos, aqueles que faziam menção a utilização da técnica de análise por 

infravermelho, independente do tipo específico, como por exemplo, médio ou próximo,

sem limitação de data, nos idiomas inglês e português. Como não foram encontrados

muitos trabalhos publicados com as palavras-chave utilizadas, foi adotado como critério

para exclusão a avaliação dos trabalhos, sendo excluídos trabalhos que não

apresentaram informações relevantes para a elaboração dessa monografia.

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5. RESULTADOS

5.1. Definição

 A espectrometria de infravermelho próximo (NIR) é a medição de comprimento

de onda e intensidade da absorção de luz infravermelha próxima realizada pela

amostra. A luz infravermelha próxima se estende em uma faixa de 800 nm - 2.500 nm

(12,500 - 4000 cm-1) e tem energia suficiente para excitar sobretons e combinações de

vibrações moleculares a altos níveis de energia. A espectroscopia NIR é tipicamente

usada na medição quantitativa de grupos funcionais orgânicos, especialmente O-H, N-

H, e C=O. Os limites de detecção são normalmente 0.1% e as aplicações mais comuns

incluem análises farmacêuticas, agrícolas, poliméricos e clínicos (LINDE, 2011).

 A radiação infravermelha (IV) é uma radiação não ionizante na porção invisível

do espectro eletromagnético que está adjacente aos comprimentos de onda longos, ou

final vermelho do espectro da luz visível. Ainda que em vertebrados não seja percebida

na forma de luz, a radiação IV pode ser percebida como calor, por terminações

nervosas especializadas da pele, conhecidas como termorreceptores (WIKIPÉDIA,

2011). A radiação infravermelha foi descoberta em 1800 por William Herschel, um

astrônomo inglês de origem alemã. Hershell colocou um termômetro de mercúrio no

espectro obtido por um prisma de cristal com o a finalidade de medir o calor emitido por 

cada cor (BURNS; CIURCZAC, 2001).

Descobriu que o calor era mais forte ao lado do vermelho do espectro,

observando que ali não havia luz. Esta foi a primeira experiência que demonstrou que o

calor pode ser captado em forma de imagem, como acontece com a luz visível. Em umaprimeira fase, as aplicações qualitativas concentraram-se principalmente na faixa

espectral do infravermelho médio, uma vez que nessa região é possível a observação

de bandas de absorção de grupos orgânicos específicos como N-H, C-H, O-H, C-C,

entre outros. Assim, esta técnica foi largamente empregada pelos químicos orgânicos

para auxiliar a caracterização de diversas substâncias químicas (BURNS; CIURCZAC,

2001).

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Fonte: < http://www.geocities.ws/saladefisica5/leituras/infravermelho.html>

Figura 1: Experimento de William Hershell.

  A partir dos anos setenta uma nova fase de estudos espectroscópicos foi

iniciada, agora também no campo das análises quantitativas, promovido pelo

desenvolvimento dos espectrofotômetros com Transformada de Fourier, da informática,

do interfaceamento de instrumentos eletrônicos com computadores e a introdução de

recursos matemáticos mais sofisticados. Com essas inovações tecnológicas, os

estudos quantitativos expandiram suas fronteiras para as regiões espectrais no

infravermelho próximo e médio. Isso desencadeou um surpreendente interesse de

vários grupos acadêmicos de pesquisas, governamentais e industriais, na tentativa de

desenvolver metodologias de análise, trazendo como conseqüência o impacto direto no

crescimento da produção e produtividade industrial, redução de gastos e da quantidade

de resíduos industriais (BURNS; CIURZACK, 2001).

 A primeira aplicação da espectroscopia no infravermelho foi para monitorar a

qualidade e controlar a produção na indústria petroquímica, por ocasião da segunda

guerra mundial. Os principais compostos monitorados foram combustíveis, lubrificantes

e polímeros e os equipamentos utilizados, projetados pelas maiores companhias

químicas da época como, Dow, Shell e Cyanamid, eram configurados somente paramedidas de absorção na região do infravermelho médio (COATES,1999).

 A espectroscopia no infravermelho próximo não foi considerada inicialmente

como uma técnica analítica com algum valor prático, sendo originalmente, uma

extensão da região do visível que não foi explorada até por volta de 1970

(COATES,1999). Os primeiros trabalhos que proporcionaram interesse pelo estudo da

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espectroscopia no infravermelho próximo como ferramenta de análise industrial foram

desenvolvidos na década de setenta, pelo grupo de pesquisa do professor Karl Norris,

quando este era responsável por um grupo de pesquisa do Departamento de

 Agricultura dos Estados Unidos. Entretanto, as limitações tecnológicas da época nãopermitiram o desenvolvimento vertiginoso do NIR como atualmente é observado em

diversos setores industriais como agrícola, petroquímico, alimentício e farmacêutico

(WILLIAMS, 1998).

  Atualmente, o valor, a funcionalidade e os benefícios oferecidos pela

espectroscopia no infravermelho, principalmente a espectroscopia no infravermelho

próximo, são incontestáveis (COATES,1999).

5.2. Princípio da espectroscopia no infravermelho

  A radiação infravermelha não é suficientemente energética para causar 

transições eletrônicas e a absorção desta radiação está muito restrita a espécies

moleculares que possuem diferenças de energia pequenas entre vários estados

vibracionais e rotacionais. Para absorver radiação infravermelha a molécula precisasofrer uma variação no momento de dipolo como conseqüência do movimento

vibracional ou rotacional. Apenas nessas circunstâncias o campo elétrico alternado da

radiação pode interagir com a molécula e causar variações na amplitude de um de seus

movimentos. O momento dipolar é determinado pela magnitude da diferença de carga e

a distância entre os dois centros de carga. Quando uma molécula que possui essa

variação do momento dipolar vibra, uma variação regular do momento dipolar ocorre e

surge um campo que pode interagir com o campo elétrico associado à radiação. Se a

freqüência da radiação coincidir exatamente com a freqüência vibracional natural da

molécula, ocorre uma transferência de energia efetiva e resulta em uma variação da

amplitude da vibração molecular e a conseqüência é a absorção de radiação. Do

mesmo modo, a rotação de moléculas assimétricas em torno dos seus centros de

massa resulta em uma variação periódica do dipolo que pode interagir com a radiação.

Nenhuma variação efetiva no momento de dipolo ocorre durante a vibração ou rotação

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de uma molécula homonuclear, como O2, N2 ou Cl2 e, conseqüentemente, essas

substâncias não podem absorver no infravermelho (COATES, 1999;SKOOG, 2002).

 A energia necessária para causar uma mudança de nível rotacional é pequena,

da ordem de 100 cm-1 ou menor que 100.000 nm. O espectro infravermelho de um gásconsiste normalmente de uma série de linhas aproximadamente espaçadas, isso

porque há vários estados rotacionais de energia para cada estado vibracional. Por outro

lado, a rotação está rigorosamente restrita em líquidos e sólidos e nestas condições as

linhas discretas vibracionais/rotacionais desaparecem deixando picos vibracionais

alargados (SKOOG, 2002).

Em uma molécula, as posições relativas dos átomos não estão fixas variando

continuamente em conseqüência dos tipos de vibrações e rotações em torno dasligações da molécula. Para uma molécula diatômica ou triatômica simples é possível

definir com certa facilidade o número e a natureza de tais vibrações e relacioná-las às

energias de absorção. Entretanto, para moléculas constituídas de muitos átomos

possuindo um grande número de centros de vibração, como também para moléculas

apresentando interações entre vários centros, é muito difícil definir o número e a

natureza das vibrações envolvidas e relacioná-las à suas respectivas energias de

absorção (SKOOG, 2002).

 As vibrações são divididas em duas categorias: estiramentos (deformação axial)

e deformações angulares. Uma vibração de estiramento envolve uma variação contínua

na distância interatômica ao longo do eixo da ligação entre dois átomos podendo

acontecer de forma simétrica ou assimétrica, enquanto que as deformações angulares

são caracterizadas pela variação do ângulo entre duas ligações e podem acontecer no

plano ou fora do plano da molécula. Além desses tipos de vibração, interações ou

acoplamentos de vibrações podem ocorrer se as vibrações envolverem ligações de um

mesmo átomo central e o resultado disso é uma variação nas características dasvibrações envolvidas (SKOOG, 2002).

Considerando que as vibrações acontecem de forma isolada em uma molécula,

estas podem ser representadas por um modelo mecânico simples e conhecido como

oscilador harmônico. As características da vibração de estiramento pode se aproximar 

às de um modelo mecânico consistindo de duas massas ligadas por uma mola e as

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freqüências fundamentais de quaisquer dois átomos ligados podem ser calculadas

assumindo que a energia segue o comportamento de um oscilador harmônico que

obedece a Lei de Hooke. Assim as massas representam os átomos e a mola representa

a ligação química entre eles. Uma perturbação de uma das massas ao longo do eixo damola resulta em uma vibração denominada de movimento harmônico simples e a força

restauradora é proporcional ao deslocamento (lei de Hooke) e tende a restaurar as

massas para sua posição original (BURNS; CIURZACK, 2001).

Fonte: < http://www.sorocaba.unesp.br/gpm/ftir.htm >

Figura 2: Modos de vibração molecular. Os sinais X e • indicam movimentos

para dentro e para fora do plano do desenho, respectivamente.

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Fonte: < http://www.webbook.nist.gov/chemistry>

Figura 3: Espectro do Ethanol.

5.3. Tecnologias

5.3.1. Tipos de radiação

200-400nm – U.V.

400 – 1000nm – U.V. Visível

1000 – 2500nm – Infravermelho

Infravermelho próximo (NIR)

Infravermelho médio (MID)

Infravermelho longínquo (FIR)

Microondas

Rádio

Fonte:<http://estadoquantico.blogspot.com/2011/04/25-anos-do-desastre-de-

chernobyl.html>

Figura 4: Tipos de radiação.

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5.3.2. Evolução tecnológica

O início da utilização da técnica de infravermelho para análises de compostos

químicos teve início nos anos 70, sendo inicialmente utilizada apenas para análises

qualitativas, devido a necessidade de ferramentas algébricas de difícil processamento,

o que impossibilitava o uso para análises quantitativas, no decorrer dos anos a técnica

foi aprimorada, passando por diversas tecnologias.

1970: Filtros - Técnica mais antiga, uso de Filtros Coloridos.

1980: Dispersivos - Luz de uma fonte decomposta através de um prisma (ouuma grade).

1980: Arranjo de fotodiodos

1990: Transformada de fourier 

5.3.3. Espectrofotômetros dispersivos

Os espectrofotômetros dispersivos no infravermelho são instrumentosregistradores de feixe duplo, que usam redes de difração para dispersar a radiação.

Essa é uma característica importante devido à baixa intensidade das fontes de

infravermelho, à baixa sensibilidade dos transdutores para infravermelho e à

conseqüente necessidade de grandes amplificações de sinal (COATES, 1999; SKOOG,

2002).

Geralmente, este tipo de equipamento incorpora um modulador de baixa

freqüência que permitirá ao detector distinguir entre o sinal da fonte e sinais de radiação

espúria, tal como emissão infravermelha ao redor do transdutor. Baixas velocidades de

modulação são requeridas devido ao tempo de resposta lento dos transdutores para

infravermelho usados na maioria dos instrumentos dispersivos. Em geral, a óptica dos

instrumentos dispersivos é muito parecida com a de equipamentos no UV/VIS, exceto

que os compartimentos de amostra e referência estão sempre localizados entre a fonte

e o monocromador nos instrumentos no infravermelho. Essa disposição é possível

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porque a radiação infravermelha, em contraste com a UV/VIS, não é energética o

suficiente para causar decomposição fotoquímica da amostra. Colocando a amostra e a

referência antes do monocromador, tem-se a vantagem de que a maior parte da

radiação espalhada, gerada no compartimento da célula, é efetivamente removida pelomonocromador e não atinge o transdutor (SKOOG, 2002).

Fonte: FELLI,2011.

Figura 5: Espectrofotômetros Dispersivos.

5.3.4. Instrumentos não-dispersivos

Estes instrumentos são simples e robustos e foram projetados para análise quantitativa.

 Alguns são fotômetros de filtro único ou não-dispersivo, outros usam filtros no lugar de

um elemento dispersivo para a obtenção de um espectro completo, outros ainda, não

fazem uso de qualquer dispositivo para seleção de comprimento de onda. Em geral,

este tipo de instrumento é menos complexo, mais robusto, fácil de manter e menos caroque os instrumentos descritos anteriormente. Os fotômetros de filtro podem utilizar 

filtros de interferência e são normalmente designados para análises quantitativas. Uma

variedade de filtros é disponível atualmente, cada um indicado para uma aplicação

específica (SKOOG, 2002).

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5.3.5. Espectrofotômetro com Transformada de Fourier 

Espectroscopia no infravermelho por  transformada de Fourier  (FTIV) é uma

técnica de análise para colher o espectro infravermelho mais rapidamente. Em vez de

se coletar os dados variando-se a freqüência da luz infravermelha monocromática, a luz

IV (com todos os comprimentos de onda da faixa usada) é guiada através de um

interferômetro. Depois de passar pela amostra o sinal medido é o interferograma.

Realizando-se uma transformada de Fourier no sinal resulta-se em um espectro

idêntico ao da espectroscopia IV convencional (dispersiva) (WIKIPÉDIA, 2010).

Esse tipo de equipamento utiliza um interferômetro ao invés de redes dedifração. Sua popularização ocorreu com o surgimento de microcomputadores, com o

seu interfaceamento e com a utilização da transformada de Fourier para o tratamento

de dados. Espectrofotômetros com Transformada de Fourier apresentam algumas

vantagens, como a grande eficiência no transporte da radiação até o detector, o que

melhora a relação sinal/ruído, apresenta um alto poder de resolução e reprodutibilidade

do comprimento de onda, todos os elementos de resolução para um espectro são

medidos simultaneamente o que possibilita a aquisição de dados de um espectro inteiroem cerca de um segundo ou menos (COATES, 1999; SKOOG, 2002).

  A maioria dos equipamentos utilizados atualmente, utilizam o princípio

interferométrico, sendo que diante de tantas vantagens, a existência e utilização de

equipamentos dispersivos para a região NIR é justificada pelo fator custo e por se tratar 

de uma região onde os sinais observados são em sua maioria bandas relativamente

largas, em que uma grande resolução não é requerida na maioria das vezes, uma vez

que as aplicações geralmente são quantitativas (BURNS; CIURCZAK, 2001, dentre

outros).

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Fonte: FELLI,2011.

Figura 6: Espectrofotômetros com Transformada de Fourier.

5.4. Principais compontes de um equipamento de infravermelho

 A Figura 1 mostra um esquema básico dos componentes principais de um

equipamento de infravermelho:

→ → →↓

FONTE SELETOR DECOMPRIMENTODE ONDA

RECIPIENTE

DEAMOSTRA TRANSDUTOR

PROCESSADORDISPOSITIVO D

SAÍDA

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Figura 7. Componentes básicos de um equipamento que opera na região do

infravermelho.

 As fontes de infravermelho consistem em um sólido inerte como a fonte deNernst que é composta de óxido de terras raras, a fonte Globar que consiste em uma

barra de carbeto de silício, a fonte de filamento incandescente que é representada

através de um espiral de níquel-cromo, o arco de mercúrio, a lâmpada de filamento de

tungstênio, o laser de dióxido de carbono, são exemplos de fontes para a região do

infravermelho que encontram aplicações de acordo com o interesse específico ou a

região NIR/MID/FAR (COATES, 1999; SKOOG, 2002).

  A princípio, os equipamentos de infravermelho não diferem muito dosequipamentos utilizados nas regiões do ultravioleta e do visível no que diz respeito

aos componentes básicos. Contudo, diferenças notórias são encontradas

principalmente na fase de seleção de comprimento de onda, que originam

espectrofotômetros dispersivos ou interferométricos ou, ainda, fotômetros que são

equipados com filtros (COATES, 1999; SKOOG, 2002).

Os recipientes para a amostra variam de acordo com a região NIR/MID/FAR e

com o estado físico da amostra.

Os transdutores para o infravermelho são de três tipos gerais:

1. Transdutores térmicos: a resposta depende do efeito de aquecimento da

radiação sendo comumente encontrados em fotômetros e espectrofotômetros

dispersivos.

2. Transdutores piroelétricos: consiste em um transdutor térmico muito

especializado com propriedades térmicas e elétricas especiais e são

encontrados em fotômetros e espectrofotômetros dispersivos.3. Transdutor fotocondutor: consiste na absorção da radiação pelos materiais

componentes do transdutor, essa absorção promove elétrons não-condutores de

valência a um estado condutor, de energia mais elevada, decrescendo a

resistência elétrica do semicondutor. A composição dos materiais componente

do transdutor varia de acordo com a região NIR/MID/FAR. Esse tipo de

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transdutor é encontrado em instrumentos multiplexados com transformada de

Fourier (SKOOG, 2002).

Os instrumentos para a região do infravermelho próximo são semelhantes aosutilizados para a espectroscopia de absorção no UV/VIS. Lâmpadas de

tungstênio/halogênio com janelas de quartzo servem como fontes, as células para

medidas de absorção são normalmente de quartzo ou sílica fundida, transparentes até

3.000 nm. O caminho óptico varia de 0,1 a 10 cm. Os detectores são, em geral,

fotocondutores de sulfeto de chumbo (SKOOG, 2002).

Estão disponíveis uma série de fotômetros e espectrofotômetros projetados

especificamente para a região do infravermelho próximo. A variedade de instrumentos émuito grande, indo dos mais sofisticados com Transformada de Fourier, aos de feixe

duplo com redes de difração ou arranjo de diodos, até os instrumentos mais simples

baseados em filtros (BURNS, 2001; MCCLURE, 1994, dentre outros).

5.5. Processamento dos dados

5.5.1. Quimiometria

  A quimiometria pode ser definida como a pesquisa e utilização de métodos

matemáticos e estatísticos para o tratamento de dados químicos de forma a extrair uma

maior quantidade de informações e melhores resultados analíticos. Os métodos

utilizados na quimiometria, a princípio, foram desenvolvidos em outras disciplinas que

com a aplicação e pesquisas voltadas para o tratamento de dados químicos acabou

dando origem a uma nova área dentro da química analítica. Isso se deu após a

segunda metade dos anos 60, com o surgimento de métodos instrumentais

computadorizados para a análise química que promoveu a geração de uma grande

quantidade de dados. Até este período, os químicos baseavam suas decisões em uma

pequena quantidade de dados que, na maioria das vezes, eram obtidos de forma lenta

e dispendiosa. A partir dos anos 60, com a grande quantidade de dados de obtenção

rápida e com menor esforço, foi preciso analisar todos esses dados e extrair maior 

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quantidade de informações relevantes. Foi então, que teve início a pesquisa e utilização

dos métodos matemáticos e estatísticos que acabaram resultando nessa nova área

conhecida como quimiometria (OTTO, 1999).

 A quimiometria pode ser considerada uma das áreas mais recentes da químicaanalítica. Desde o seu surgimento no final dos anos 60 até os dias de hoje, foram

desenvolvidos muitos métodos que tem tornado possível o processamento e

interpretação de dados que antes seriam impossíveis de serem analisados. Um

exemplo importante do sucesso da utilização da quimiometria são as análises

realizadas na região do infravermelho próximo, as quais, sem a utilização de modelos

de calibração multivariada não apresentam possibilidades para determinações

quantitativas (OTTO, 1999).Com o crescimento da quimiometria foram desenvolvidas novas ferramentas

para tratamento de dados encontrando aplicações distintas conforme o objetivo do

estudo como, por exemplo, a otimização de processos, a classificação de dados,

as determinações quantitativas, entre outros. Assim, a quimiometria foi dividida em

diversas frentes de pesquisa e aplicação:

- Processamento de sinais analíticos;

- Planejamento e otimização de experimentos;

- Reconhecimento de padrões e classificação de dados;

- Calibração multivariada;

- Métodos de inteligência artificial (OTTO, 1999).

Dentro dessa divisão, a principal linha de pesquisa da quimiometria aplicada à

química analítica tem sido a construção de modelos de regressão a partir de dados de

primeira ordem, ou seja, dados que podem ser representados através de um vetor para

cada amostra, sendo a construção desses modelos denominada de calibração

multivariada (BRERETON, 2000).

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5.5.2. Análise multivariada

Métodos de Análise Multivariada têm sido cada vez mais utilizados em química

analítica, principalmente quando os componentes presentes em uma mistura precisam

ser determinados, mas a informação analítica disponível não apresenta seletividade, ou

seja, em uma mistura não é possível se identificar os componentes individuais de cada

espécie a partir da resposta instrumental. A calibração multivariada baseia-se em

estabelecer uma relação entre duas matrizes (ou blocos) de dados químicos, quando

ocorrer uma dependência entre as propriedades que descrevem cada uma delas (DE

SOUZA et al., 2004).

Nos métodos de análise univariáveis, somente a absorbância de uma freqüênciaé associada à concentração, enquanto que métodos multivariados usam,

simultaneamente, duas ou mais freqüências. A precisão dos métodos univariáveis é

dependente da capacidade para identificar uma única banda isolada para cada

componente. Os métodos multivariáveis,entretanto, podem ser utilizados igualmente

quando estão sobrepostas informações espectrais selecionadas (DE SOUZA et al.,

2004). 

Os métodos de análise multivariada aplicados na modelagem de informações

químicas fazem parte da área da quimiometria, e são assim denominados pois no caso

da espectroscopia permitem manipular dados de absorbância espectrais associadas a

uma ou mais freqüências ao mesmo tempo. Estes métodos têm recentemente tornado

possível modelar propriedades químicas e físicas de dados simples e complexos, a

partir de dados espectroscópicos (Zamora et al., 1997).

Pode-se citar a regressão por quadrados mínimos parciais (PLS) como um dos

tratamentos de dados matemáticos mais utilizados em análises de multicomponentes

na calibração de sistemas complexos e verificação da precisão e exatidão da exatidão

da sua calibração, bem como previsão sem experiência espectroscópica extensiva (DE

SOUZA et al., 2004).

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5.5.3. Calibração

 A calibração pode ser definida como uma série de operações que estabelecem,

sob condições específicas, uma relação entre medidas instrumentais e valores para

uma propriedade de interesse correspondente (EURACHEM/CITAC, 1998).

O conjunto de dados empregado para essa finalidade é chamado de conjunto de

calibração. Os parâmetros do modelo são denominados de coeficientes de regressão

(b) determinados matematicamente a partir dos dados experimentais (HELLAND, 1998;

MARTENS, 1996).

O passo seguinte à calibração é a validação. Nesta etapa, as variáveis

independentes obtidas, para um outro conjunto de amostras, são utilizadas em conjuntocom o coeficiente de regressão, para calcular os valores previstos para a variável

dependente. No conjunto de validação utilizam-se amostras cujas variáveis

dependentes sejam conhecidas para que seja possível estabelecer uma comparação

entre os valores previstos pelo modelo e os valores conhecidos previamente através de

uma metodologia padrão, o que permitirá a avaliação sobre o desempenho do modelo

de calibração proposto (MARTENS, 1996).

Existem diversos métodos para a construção de modelos de calibração, sendoque a função que ajusta as variáveis dependentes e independentes pode ser linear ou

não, dependendo da complexidade do sistema em estudo (SEKULIC, 1993).

Dentre os métodos de calibração existentes, sem dúvida, os mais difundidos são

ainda os métodos de calibração univariada que também são conhecidos como

calibração de ordem zero, ou seja, tem-se apenas uma medida instrumental para cada

uma das amostras de calibração, isto é, para cada amostra tem-se apenas um escalar.

Esses métodos são descritos na literatura em vários trabalhos sua aplicação e

validação são relativamente fáceis. No entanto, a aplicação da calibração univariada é

restrita, visto que, quando a amostra não é livre de interferentes e a medida é realizada

diretamente na metodologia instrumental, isso provavelmente provocará desvios na

determinação da propriedade de interesse e a aplicação deste método de calibração

torna-se inviável (CHARNE, 1999;MILLER, 2000, dentre outros).

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Em calibração multivariada, mais de uma resposta instrumental é relacionada

com a propriedade de interesse. Esses métodos de calibração possibilitam a análise

mesmo na presença de interferentes, desde que esses interferentes estejam presentes

nas amostras utilizadas para a construção do modelo de calibração. Outraspossibilidades apresentadas por este tipo de calibração são determinações simultâneas

e análises mesmo sem resolução. Isso faz com que os modelos de calibração

multivariada sejam uma alternativa quando os métodos univariados não encontram

aplicação. Neste tipo de calibração a resposta instrumental é representada na forma de

matriz, enquanto a propriedade de interesse, determinada por uma metodologia padrão,

é representada por um vetor (VALDERRAMA, 2005).

Uma diversidade de métodos de regressão vem sendo utilizado em químicaanalítica para a construção de modelos de calibração multivariada, dentre esses os

mais empregados tem sido a regressão linear múltipla (MLR), regressão por 

componentes principais (PCR) e regressão por mínimos quadrados parciais (PLS), que

são métodos para ajuste linear entre as variáveis. Tem-se verificado que a maioria dos

métodos de calibração multivariada empregados em espectroscopia utiliza ajuste linear 

entre as variáveis, uma vez que este representa o modelo de mais fácil elaboração e

interpretação (VALDERRAMA, 2005).

5.5.4. Regressão Linear Múltipla – MLR

O modelo mais simples em calibração multivariada consiste na resolução de um

sistema de equações lineares em uma regressão linear múltipla (MLR – do inglês,

Multiple Linear Regression) (OTTO, 1999). Este modelo de calibração inversa, para a

determinação de um analito, pode ser obtido a partir de uma matriz X de respostas

instrumentais. com dimensão (i x j), arranjada de acordo com a Figura 2, onde i

representa o número de amostras a ser utilizada na construção do modelo (conjunto de

calibração) e j representa o número de variáveis, e um vetor y de dimensão (i x 1), que

contém as concentrações de referência das amostras de calibração. A partir daí cada

variável dependente de y é expressa como uma combinação linear das variáveis

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independentes da matriz X e um vetor que contém os coeficientes de regressão, bMLR,

relaciona X e y por meio da expressão (BRERETON, 2000):

y = XbMLR (1)

em que bMLR é um vetor de dimensão (j x 1).

Para a obtenção do vetor dos coeficientes de regressão, esta equação pode

ser resolvida por mínimos quadrados (BRERETON, 2000):

b̂ MLR (XTX) -1XTy (2)

em que, os índices sobrescritos –1 e T representam a inversão e transposição de

uma matriz ou vetor, respectivamente. Uma estimativa para a concentração da espécie

de interesse ( yˆ ) pode ser obtida por (BRERETON, 2000):

yˆ = XbMLR (3)

 A regressão linear múltipla apresenta dois problemas que limitam sua aplicação. O

primeiro deles é que o número de amostras deve ser igual ou superior ao número de

variáveis, uma vez que o modelo consiste na resolução de um sistema de equações

lineares simultâneas quando o número de variáveis é superior ao número de amostras,

ou vice-versa, o sistema de equações a ser resolvido torna-se indeterminado. O

segundo problema constatado para a MLR é que a matriz (XTX) pode não apresentar 

inversa devido a alta correlação entre as variáveis (BRERETON, 2000):

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Fonte: VALDERRAMA, 2005.Figura 8. Construção da matriz X para calibração multivariada.

5.5.5.Regressão por Componentes Principais

 A regressão por componentes principais (PCR- do inglês, Principal Components

Regression) surge como uma alternativa no intuito de contornar os problemas

apresentados pela MLR. Neste método de regressão utiliza-se a análise decomponentes principais (PCA – do inglês, Principal Component Analysis) como a

técnica de ortogonalização baseada em mudança de base vetorial. Este procedimento

resolve os dois principais problemas da MLR, uma vez que a PCA pode ser utilizada

para a redução do número original de variáveis sem acarretar na perda significativa de

informação resolvendo, assim, o problema de existência de alta colinearidade entre as

colunas de X e a necessidade de um número excessivo de amostras para a construção

do modelo por MLR (OTTO, 1999; BEEBE, 1987, dentre outros).

5.5.6. Regressão por mínimos quadrados parciais

Este método foi desenvolvido nos anos 70 por Herman Wold, e um excelente

guia prático foi escrito por Geladi e Kowalski (1986). Como usual em procedimentos

analíticos primeiro desenvolve-se um modelo de calibração (Pimentel, Barros Neto,

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1996). Uma matriz X com m colunas, correspondendo ao sinal espectral (p. e.

absorbância) para cada número de onda, e n linhas, representando cada amostra

(padrão). Uma segunda matriz  Y, é definida com k colunas, com as informações

químicas (p. e. concentrações) e com n linhas, correspondendo a cada amostra.Utilizado técnicas de análise fatorial a matriz X é decomposta numa soma de matrizes

menores (equação 1).

X = M1 + M2 + ... + Ma + E (4)

Sendo Mi os componentes principais ou variáveis latentes, com dimensão 1, 2 ...

a, onde a corresponde ao número de fatores (componentes principais ou variáveislatentes) selecionado para truncar a igualdade. E corresponde a matriz de resíduos,

relacionada ao número de fatores.

  A matriz  Y é decomposta de maneira análoga. Finalmente, determina-se a

correlação entre as variáveis latentes usando os componentes das matrizes menores.

No modelo PLS as decomposições das matrizes X e  Y são feitas

simultaneamente por meio interativo e se acredita que a informação contida em  Y é

transferida para X.

 Após a calibração é possível prever as propriedades de novas amostras a partir 

de medidas espectrais. Os sinais espectrais são definidos numa nova matriz Xp, que

contém m colunas mas t linhas, correspondendo as t novas amostras. Usando a

correlação construída na fase de calibração as propriedades desconhecidas são

coletadas numa nova matriz Yp (DE SOUZA, FERRÃO, 2006).

5.5.7. Detecção de amostras anômalas – Outliers

Outliers é o termo utilizado para designar amostras anômalas que podem estar 

presentes nos conjuntos de calibração e de validação, que serão empregados na

construção e validação de um modelo de calibração multivariada, respectivamente.

Normalmente, essas amostras anômalas possuem um comportamento diferente das

demais amostras do conjunto de dados (VANDEGINSTE, 1998).

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 A presença desse tipo de amostra no conjunto de calibração pode conduzir a modelos

com baixa capacidade de previsão, ou seja, que produzem altos valores de erro.

Quando presentes no conjunto de validação, podem influenciar os resultados,

geralmente, levando a resultados que indicam que o modelo não é adequado ou que asua capacidade é inferior à que poderia ser apresentada na ausência destas amostras

anômalas. Assim, a identificação de anomalias é um passo importante para a

otimização dos conjuntos de calibração e validação, sendo que, a exclusão destes

permite a construção de modelos mais eficientes e precisos e com melhor capacidade

de previsão (MARTENS; NAES, 1996).

Existem diversas técnicas para a identificação de amostras anômalas, como por 

exemplo: a distância de Mahalanobis, método da incerteza (HOY, 1998;FERNÁNDEZPIERNA, 2002, dentre outros), uma metodologia conhecida como “convex hull” funções

potenciais, (FERNÁNDEZ PIERNA, 2002;JOUAN-RIMBAUD, 1999), RHM (do inglês,

Resampling by the Half-Means) (FERNÁNDEZ PIERNA, 2002;EGAN, 1998, dentre

outros), SHV (do inglês, Smallest Half- Volume), (FERNÁNDEZ PIERNA, 2002;EGAN,

1998), entre outros, sendo que esta área constitui uma linha de pesquisa recente e em

andamento que, no entanto, é de grande importância tendo em vista a variedade de

tipos de equipamentos e a grande quantidade de amostras que geram dados de

primeira ordem.

5.6. Aplicações da espectroscopia e da quimiometria na análise de

medicamentos

  A técnica de análise de reflexão no infravermelho próximo (NIR) pode ser 

aplicada nas análises farmacêuticas, sua aplicação ainda é um desafio, pois a técnica

ainda não é descrita em farmacopéias para fins quantitativos, porém é amplamente

utilizada em outros segmentos, como por exemplo, polímeros, agroquímicos,

agrotóxicos, entre outros. O desenvolvimento da técnica se deve a adequada

determinação qualitativa e quantitativa de parâmetros físicos e químicos, habilidade no

processo, além de ser compatível com a fibra ótica, fator este que acaba por facilitar as

análises. O método de análise por NIR geralmente é utilizado como uma alternativa

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para os métodos de referência, como por exemplo, Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE), Cromatografia Gasosa (CG), Espectrofotômetria de UV/Vis, visando

a diminuição nos custos analíticos, otimização dos processos e diminuição no tempo de

análise.

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6. DISCUSSÃO

Os resultados apresentados, demonstram que a técnica de quantificação de

compostos químicos por Infravermelho Próximo (NIR) é de grande relevância, ainda em

expansão, principalmente quando se fala na aplicação em química analítica

quantitativa.

 A técnica representa hoje uma alternativa eficaz, que depende de alguns fatores

importantes, para que sejam obtidos resultados confiáveis e precisos.

 A calibração é um dos fatores de grande importância, os melhores equipamentos

disponíveis no mercado atual, devem conter em seu sistema operacional a calibração

multivariada, que faz o uso de um simples ponto espectral, mas leva em consideração

as características espectrais de uma larga faixa. Por essa razão, as análises de bandas

espectrais com picos largos tornam-se possíveis. A informação contida no espectro de

amostras de calibração serão comparadas com a informação de valores usando a

regressão, que pose ser a PLS. O método assume que as variações observadas no

espectro são em conseqüência da mudança na concentração dos componentes.

Contudo, a correlação entre a mudança de concentração dos componentes e amudança de sinal do infravermelho não é necessariamente linear.

As principais desvantagens da Calibração Multivariada são:

 A calibração Multivariada requer um grande número de amostras de calibração

contendo grande quantidade de informações (vários espectros com centenas ou

milhares de pontos com informações relevantes).

Para manipular as informações de forma conveniente, os dados espectrais e os

dados de concentração são escritos na forma de matrizes, onde cada linha na

matriz de dados espectrais representa os espectros das amostras.

  A matriz de dados de concentração contem os correspondentes valores de

concentração das amostras.

 As matrizes serão quebradas em vetores que serão chamados de fatores ou

componentes principais.

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 As principais vantagens da Calibração Multivariada são:

 A principal vantagem dessa abordagem, é que nem todos os componentes

principais são necessários para descrever uma relevante característica espectral,

por exemplo, alguns desses vetores representam simplesmente o ruído espectral

da análise. Somente relevantes componentes principais serão então usados ao

invés de todos os dados espectrais originais, reduzindo consideravelmente a

quantidade de informações.

O Algoritmo PLS entrará em ação para encontrar a melhor função de correlação

entre a matriz dos dados espectrais e matriz da concentração.

 A utilização do algoritmo PLS permite quantificar mais de um componente em umaamostra.

Para a utilização da técnica, além de um equipamento que tenha disponível a

calibração multivariada, com um logaritmo tipo PLS, é necessário que seja

desenvolvido um método quimiométrico, usando um número representativo de

amostras de calibração de composição conhecida, que tenha como referência um

método analítico confiável, validado. Os espectros IR destas amostras serão usados

para calcular uma função de calibração, que é um elemento indispensável no modelo

quimiométrico que será usado posteriormente para analisar as amostras

desconhecidas.

Para se desenvolver um método quimiométrico é necessário:

O primeiro passo para se construir um modelo quimiométrico é selecionar um

número suficientemente de amostras para representar o sistema.

Essas amostras precisam ter seus componentes analisados quantitativamente

em métodos confiáveis (métodos de referência) e seus espectros coletados no

infravermelho.

Dependendo do tipo de método de validação usado, um set de calibração e um

set de teste são formados com esses espectros.

Número mínimo de amostras recomendados:

Estudo de viabilidade: ~ no mínimo 20 amostras

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 Aplicações comuns: ~ 50-100 amostras

 Aplicações complexas: > 150 amostras

  Alguns fatores que podem interferir na modelagem e na precisão do método

quimiométrico:

Qualidade do instrumento (Resolução, estabilidade, relação sinal/ruído, precisão,

robustez);

Preparação da amostra e representatividade da amostra;

Precisão do método referência (por exemplo, via úmida) (em muitos casos, a

precisão do método IR ou NIR depende unicamente da precisão do método

referência).

 Alguns fatores que podem interferir na qualidade da predição:

Seleção da faixa espectral:

Regiões com ruídos espectrais incluídos na calibração;

Regiões com absorção total incluídos na calibração.

Seleção correta do experimento para medição; Ferramentas para o processamento de dados;

Valores das amostras de calibração bem distribuídas na faixa selecionada.

Evitar o ruído espectral, como por exemplo a borda direita ou esquerda

(extremos) onde o detector tem menor sensibilidade.

 Evitar faixas espectrais com absorção total (absorção > 2,0 AU).

Outro cuidado à ser tomado no desenvolvimento de um método quimiométrico, sãoos outliers, que são erros de calibração devido a valores de referência ruins.

 As possíveis causas para os outliers são:

 A amostra não homogeneizada corretamente;

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Variação de temperatura de amostras líquidas;

Utilização incorreta de probe;

Presença de bolhas no “gap” óptico;

Seleção errada do método ou do experimento (parâmetros de medição);

Os porta amostras utilizados na calibração e na medição não são idênticos.;

Mesmas condições de análise. (exemplo: ângulo da probe, etc.).

 As soluções para os outiliers são:

Revisão do método de análise referência;

Revisão de precisão, limite de erros e reprodutibilidade das análises referência;

Repetição e/ou determinação múltipla de valores referência de algumas

amostras.

 A tabela 1 abaixo, mostra as características da técnica de análise por Infravermelho

Próximo quando comparado aos métodos tradicionais:

Tabela 1: Comparativo das características das técnicas analíticasParâmetros NIR CLAE UV/VIS

Custo Equipamento Relativamente

Elevado

Relativamente

Elevado

Médio

Tempo de Análise Rápido (cerca de

5 segundos)

Considerado

Demorado

Rápido

Forma de Medição Automático Automático Semi-AutomáticoPreparo na amostra Não necessário Necessário NecessárioUso de reagentes Não necessário Necessário Necessário

Uso de Consumíveis Não necessário Necessário NecessárioCusto Manutenção Médio Alto MédioMetodologia pode ser 

validada

Sim, mas

depende de outro

método como

referência

Sim,

independente

Sim, independente

  Analisa mais de um Sim Sim Não

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composto de uma vezEmite Resultados

Precisos

Sim Sim Sim

7. CONCLUSÃO

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  Através do presente trabalho foi possível esclarecer e elucidar a técnica de

analítica de quantificação de compostos químicos através da espectrometria de IV NIR.

Conclui-se que a técnica analítica é uma alternativa eficaz, rápida e robusta e

representa uma alternativa para a substituição dos métodos analíticos tradicionais,

como por exemplo, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), Cromatografia

Gasosa (CG), Espectrofotômetria de UV/Vis desde que observados as condições para

a aplicação da técnica, que exige o avanço dos sistemas informatizados, assim como

também um investimento considerado elevado, porém esse investimento deve ser 

avaliado com cautela, levando-se em consideração o custo benefício que a técnica traz,principalmente pela rapidez nos resultados e por não exigir pré-tratamento de amostras,

além disso o método não substitui totalmente os métodos tracionais, já que necessita

de um método de referência validado para a sua utilização, sendo assim se torna muito

útil a utilização dessa técnica na rotina laboratorial de controle de qualidade de

medicamentos, pois com a implantação da técnica de Infravermelho Próximo (NIR) em

um laboratório, pode-se poupar os equipamentos tradicionais ou utilizá-los para

análises mais complexas ou outras atividades laboratoriais. As principais vantagens da aplicação da técnica são: rapidez, método não

invasivo, não necessidade de reagentes e possibilidade monitoramento on-line.

  As principais desvantagens da aplicação da técnica são: Custo elevado,

necessidade de software avançado, necessidade de um método de referência validado,

e aceitabilidade os órgãos de fiscalização.

  Avaliando-se cuidadosamente as vantagens e desvantagens da técnica e a

aplicação desejada, é possível implantar em um laboratório analítico a técnica de

quantificação de compostos químicos através da espectrometria de IV NIR e obter 

ótimos resultados, que associada as demais técnicas analíticas pode contribuir 

positivamente na rapidez, otimização dos processos, diminuição dos custos a longo

prazo, geração de processos automatizados, diminuição de gastos de reagentes, e

melhor utilização e aproveitamento dos equipamentos analíticos tradicionais.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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