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Técnica Básicas para Análises de Células e Tecidos Algumas grandezas...Algumas grandezas...Algumas grandezas...Algumas grandezas...

1km 1km 1km 1km →→→→ 1.000m1.000m1.000m1.000m

1m 1m 1m 1m →→→→ 100 cm 100 cm 100 cm 100 cm

1cm 1cm 1cm 1cm →→→→ 10 mm10 mm10 mm10 mm

1mm 1mm 1mm 1mm →→→→ 1000 1000 1000 1000 µµµµmmmm

1 1 1 1 µµµµm m m m →→→→ 1000 1000 1000 1000 nmnmnmnm

1111ÅÅÅÅ ((((AngstronAngstronAngstronAngstron)))) →→→→ 10101010----10101010mmmm

Visão panorâmica da célula

Visão panorâmica da célula

Aumento e Poder de Resolução

Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados.

O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 µm

Visão panorâmica da célula

Desenvolvimento da Microscopia

-Microscópio Óptico (luz)-Microscópio Eletrônico (elétrons)

Microscópio óptico – utiliza feixes de luz

Desenvolvimento da Microscopia

Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular)

O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva.

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Microscópio óptico

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio óptico de campo claro

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio óptico de fluorescência

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio óptico de fluorescência

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio óptico confocal

Desenvolvimento da Microscopia

Outros tipos de microscópios ópticos

Desenvolvimento da Microscopia

Iluminação direta (sem coloração)

Contraste de fase (refração da luz)

Contraste diferencial de interferência (refração da luz)

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Microscópio eletrônico-utiliza feixes de elétrons-lentes eletromagnéticas

Desenvolvimento da Microscopia

→Alta resolução, abaixo de 0,3 nm.→Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio

Microscópio eletrônico de transmissão:

Desenvolvimento da Microscopia

Estrutura e funcionamento

→ Alta resolução→ Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm)→ Material biológico éimpregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio→ Imagem elétron-densa (escura) e elétron-lúcida (clara)

Microscópio eletrônico de transmissão

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio eletrônico de varredura

Desenvolvimento da Microscopia

→ Alta resolução→ Fragmentos maiores ou tecidos inteiros→ Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina→ Estrutura tridimensional (3D)

Microscópio eletrônico de varredura

Desenvolvimento da Microscopia MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Microscópio eletrônico de varredura

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Centro de Microscopia Eletrônica

UNESP - Botucatu

MEVMET

Preparação de material para análise ao microscópio

As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas.

Preparação de material para análise ao microscópio

FixaFixaFixaFixaççççãoãoãoão – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado → Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.

Preparação de material para análise ao microscópio

LavagemLavagemLavagemLavagem

Preparação de material para análise ao microscópio

DesidrataDesidrataDesidrataDesidrataççççãoãoãoão – Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70%→80%→90%→100%).

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Preparação de material para análise ao microscópio

DiafanizaDiafanizaDiafanizaDiafanizaççççãoãoãoão ou clareamentoou clareamentoou clareamentoou clareamento – Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.

Preparação de material para análise ao microscópio

Meio de impregnaMeio de impregnaMeio de impregnaMeio de impregnaççççãoãoãoão – Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante.

Preparação de material para análise ao microscópio

Meio de inclusãoMeio de inclusãoMeio de inclusãoMeio de inclusão – Suporte para o tecido impregnado.

Preparação de material para análise ao microscópio

Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico

Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoInstrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).

Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado – Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes.

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Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoRealizando cortes do material

Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoInstrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).

Preparação de material para análise ao microscópio

Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 ooooCCCCDerreter e eliminar a parafina

Preparação de material para análise ao microscópio

XilolXilolXilolXilolRetirada da parafina

SSSSéééérie alcorie alcorie alcorie alcoóóóólica lica lica lica ---- Rehidratação.

Hidratação completa

Preparação de material para análise ao microscópio

Coloração

Preparação de material para análise ao microscópio

Hematoxilina/Eosina (HHHHEEEE))))Coloração freqüentemente utilizada

ColoraColoraColoraColoraççççãoãoãoão – A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.

→Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.

→Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.

Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...

Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...

Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros

tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro.

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Preparação de material para análise ao microscópio

Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados

em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre

outras, também podem ser empregados.

...outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia Celular e Molecular

: Radioautografia

: Imunocitoquímica

: Cromatografia

: Eletroforese

: Cristalografia e difração de raio-X

: Hibridação de ácidos nucléicos

Preparação de material para análise ao microscópio

Montagem das lâminas

Preparação de material para análise ao microscópio

Análise do Material

Preparação de material para análise ao microscópio

Resultados

Plano de corte