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DETECCION GENOTIPICA DETECCION GENOTIPICA DE LA RESISTENCIA A DE LA RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS LOS ANTIMICROBIANOS Por Ana Cristina Villagra de Por Ana Cristina Villagra de Trejo Trejo

Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

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TECNICAD DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EN MICROBIOLOGIA

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Page 1: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

DETECCION DETECCION GENOTIPICA DE LA GENOTIPICA DE LA RESISTENCIA A LOS RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOSANTIMICROBIANOS

Por Ana Cristina Villagra de Por Ana Cristina Villagra de TrejoTrejo

Page 2: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología

Objetivos:Objetivos:

““Conocer los aportes de la Conocer los aportes de la Biología Molecular en la Biología Molecular en la

detección genotípica de la detección genotípica de la Resistencia a los Resistencia a los

Antimicrobianos” Antimicrobianos”

Page 3: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología

Temas a abordar:Temas a abordar: Técnicas de Biología Molecular y BacteriologíaTécnicas de Biología Molecular y Bacteriología Breve reseña sobre los métodos usados.Breve reseña sobre los métodos usados. Reacción de la Polimerasa en Cadena.Reacción de la Polimerasa en Cadena. Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico.Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico. Aplicación en la Microbiología clínica de la Aplicación en la Microbiología clínica de la

PCRPCR DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA

ANTIMICROBIANA.ANTIMICROBIANA.

Page 4: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Técnicas de Biología Molecular Técnicas de Biología Molecular en Bacteriologíaen Bacteriología

Métodos de hibridización.Métodos de hibridización. DNA/RNA sondas.DNA/RNA sondas.

Métodos de amplificación de ADN.Métodos de amplificación de ADN. PCR.PCR.

PCR de Tiempo Real.PCR de Tiempo Real.

NABSA – LCR.NABSA – LCR.

Métodos de separación de ADN.Métodos de separación de ADN. PFGE – RFLP.PFGE – RFLP.

Métodos de secuenciamiento de ADN.Métodos de secuenciamiento de ADN.

Page 5: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología

Temas a abordar:Temas a abordar: Técnicas de Biología Molecular y BacteriologíaTécnicas de Biología Molecular y Bacteriología Breve reseña sobre los métodos usados.Breve reseña sobre los métodos usados. Reacción de la Polimerasa en Cadena.Reacción de la Polimerasa en Cadena. Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico.Biología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico. Aplicación en la Microbiología clínica de la Aplicación en la Microbiología clínica de la

PCRPCR DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA

ANTIMICROBIANA.ANTIMICROBIANA.

Page 6: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Métodos de hibridizaciónMétodos de hibridización

SouthernblotLos fragmentos de ADN se encuentran en un gel de agarosa.

Se transfieren a membranas de nylon o nitrocelulosa.Por la presión creada por una cámara conectada a bomba de vacío.Los fragmentos de ADN van desde el gel a la membrana.En dirección de la presión generada por el sistema.

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Métodos de amplificación de Métodos de amplificación de ADN.ADN.

PCR: Reacción de la Polimerasa en CadenaPCR: Reacción de la Polimerasa en Cadena

““La PCR es una herramienta La PCR es una herramienta integral en Biología Molecular, integral en Biología Molecular, que debido a su versatilidad y que debido a su versatilidad y

fácil estandarización se ha fácil estandarización se ha convertido en una pieza clave convertido en una pieza clave

tanto en el área de la tanto en el área de la investigación como en el investigación como en el

diagnóstico”.diagnóstico”.

Page 8: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico

Técnica de amplificación genética.Técnica de amplificación genética.ETAPAS DE LA PCR:ETAPAS DE LA PCR: ((Reacción en cadena de la polimerasa)Reacción en cadena de la polimerasa)

Extracción y purificación de los ácidos nucleicosExtracción y purificación de los ácidos nucleicos

Amplificación de un segmento seleccionado del genoma.Amplificación de un segmento seleccionado del genoma.

Detección de fragmentos amplificados por PCR (amplicones)Detección de fragmentos amplificados por PCR (amplicones)

Del microorganismo aislado Directamente de la muestra

PCR propiamente dicha

Por electroforesis en gel de agarosa y tinción con

bromuro de etidio.

Por hibridación con sondas específicas marcadas con

fluorocromos

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Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico

PCRPCR ( Reacción en cadena de la polimerasa): ( Reacción en cadena de la polimerasa): primera etapa.

Proteinasa K:Proteinasa K: 2hs a 65 °C , 2hs a 65 °C , inactivar 10 minutos.inactivar 10 minutos.

Preparación y agregadoPreparación y agregado : : MixMix

Primer Primer

DNTPs (2 mM)DNTPs (2 mM)

Buffer Taq 10 XBuffer Taq 10 X

Mg (25mM)Mg (25mM)

H2OH2O

TaqTaq

MoldeMolde

Volumen finalVolumen final

Controles: negativo 3 l de agua destilada.Positivo 1 l de cepa control+2 l de agua destiladaDe inhibición 1 l de cepa control+2 l de muestra.

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Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico

Técnica de amplificación genética.Técnica de amplificación genética.PCR: segunda etapa

Procesos

Son controlados por diferentes Tº para los tres fenómenos básicos:

Desnaturalización

Annealing.

Extensión.

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Diagnóstico Diagnóstico MicrobiológicoMicrobiológico

Técnica de amplificación genética.Técnica de amplificación genética.PCR(tercera etapa): Observación con el transiluminador

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PCR de Tiempo RealPCR de Tiempo Real

““En la PCR a tiempo Real, los En la PCR a tiempo Real, los procesos de amplificación y procesos de amplificación y detección se producen de detección se producen de

forma simultánea en el forma simultánea en el mismo vial cerrado, sin mismo vial cerrado, sin

necesidad de ninguna acción necesidad de ninguna acción posterior”posterior”

Page 13: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Métodos de separación de Métodos de separación de ADNADN

PFGE: PFGE: Electroforesis de campo pulsante.Electroforesis de campo pulsante.

““Explora todo el Explora todo el cromosoma cromosoma

detectando la detectando la variabilidad existente variabilidad existente

en los lugares de en los lugares de restricción de la restricción de la

enzima utilizadas para enzima utilizadas para la digestión del ADN”la digestión del ADN”

Page 14: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Métodos de separación de Métodos de separación de ADNADN

Page 15: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Biología Molecular en Biología Molecular en BacteriologíaBacteriología

Temas a abordar:Temas a abordar: Técnicas de Biología Molecular y BacteriologíaTécnicas de Biología Molecular y Bacteriología Breve reseña sobre los métodos usados.Breve reseña sobre los métodos usados. Reacción de la Polimerasa en Cadena.Reacción de la Polimerasa en Cadena. Biología Molecular/Diagnóstico BacteriológicoBiología Molecular/Diagnóstico Bacteriológico.. Aplicación en la Microbiología clínica de la Aplicación en la Microbiología clínica de la

PCRPCR DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA

ANTIMICROBIANA.ANTIMICROBIANA.

Page 16: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Reacción de la Polimerasa en Reacción de la Polimerasa en Cadena.Cadena.

Diagnóstico Molecular y Diagnóstico Diagnóstico Molecular y Diagnóstico BacteriológicoBacteriológico

Menor desarrollo en comparación con el Menor desarrollo en comparación con el diagnóstico virológico.diagnóstico virológico.

Muchas especies bacterianas de importancia Muchas especies bacterianas de importancia clínica son cultivadas y caracterizadas clínica son cultivadas y caracterizadas fenotípicamente.fenotípicamente.

Gran desarrollo de métodos de diagnósticos Gran desarrollo de métodos de diagnósticos fenotípicos automatizados o semiautomatizados.fenotípicos automatizados o semiautomatizados.

Técnicas tradicionales mas baratas q las Técnicas tradicionales mas baratas q las moleculares.moleculares.

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Aplicación en Microbiología Aplicación en Microbiología Clínica de la PCRClínica de la PCR

Identificación rápida de Identificación rápida de agentes infecciosos en agentes infecciosos en pacientes críticos.pacientes críticos.

Identificación de agentes Identificación de agentes no viables o no no viables o no cultivables.cultivables.

Identificación y Identificación y caracterización de caracterización de organismos fastidiosos.organismos fastidiosos.

Tipificación de cepas para Tipificación de cepas para estudios epidemiológicos.estudios epidemiológicos.

Ejemplo microorganismosCausantes de Sepsis o

Meningitis.

Mycobacterium tuberculosoBordetella pertussis.Bartonella henselae.

Micosis invasiva por Aspergills

Herpes virus Virus respiratorios.

Enterovirus.

uEjemplo bacterias causantes De infecciones alimentarias.

o DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA..

Page 18: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Page 19: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Ventajas de los Métodos Genéticos:Ventajas de los Métodos Genéticos: Se pueden entregar resultados en Se pueden entregar resultados en

menor tiempo.menor tiempo. Útil en agentes de crecimiento lento.Útil en agentes de crecimiento lento. Solo útil si se conoce la genética del Solo útil si se conoce la genética del

mecanismo de resistencia.mecanismo de resistencia. Los métodos convencionales detectan Los métodos convencionales detectan

la resistencia en forma global.la resistencia en forma global.

Page 20: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Ventajas de los Métodos Genéticos:Ventajas de los Métodos Genéticos: Se pueden realizar directamente Se pueden realizar directamente

sobre muestras clínicas.sobre muestras clínicas. Útil en agentes no cultivables.Útil en agentes no cultivables. Si se hicieran con equipos de PCR a Si se hicieran con equipos de PCR a

tiempo Real, al usar equipos cerrados, tiempo Real, al usar equipos cerrados, se disminuye al máximo el riesgo se disminuye al máximo el riesgo biológico frente a agentes peligrosos.biológico frente a agentes peligrosos.

Page 21: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Microorganismo Antimicrobiano Gen blanco Métodos Moleculares

Staphylococcus spp Meticilina y

lactámicosAdquisición del gen

MecAPCR

Southern hibridization

Enterococcus spp. Vancomicina

Genes Van D y Van C (1,2,3)

VanB y VanA PCR - RFLP.

GéneroEnterobacteriaceae

Ceftazidima.Cefotaxima. Aztreonam.

Genes que codificanβLEE (plasmídicas)

PCR - RFLP.

Streptococcus pneumoniae Penicilina pbp 1 A

PCR - RFLP. 

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ETH implicados en la diseminación epidémica de

genes de resistenciaResistencia

principal

Fenotipo Genotipo

Otras resistenciasa

Microorganismos Comentarios

VanA (Van, Tei)

vanA - Enterococcus spp, Streptococcus spp, Lactococcus Corynebacterium, Bacillus circulans, Staphylococcus aureus

- ETH epidémico en Europa. - Gran polimorfismo genético específico de área geográfica.

VanB(Van) vanB - E. faecium, E. faecalis, S. bovis, S. gallolyticus

ETH epidémico en Europa.

VanB (Van)

vanB (Amp)b E. faecium, E. faecalis, S. bovis, S. gallolyticus

ETH epidémico universalmente Extraordinario polimorfismo genético específico de área geográfica.

HLRGm aac(6´)

aph(2´´)

- E. faecalis, ETH epidémico universalmente

Staphylococcus aureus

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ETH implicados en la diseminación epidémica de

genes de resistenciaResistencia principal

Fenotipo Genotipo

Otras resistenciasa

Microorganismos Comentarios

BLEE clase A (cefotaximasa)

βla

CTX-M-9

Tmp, Sm, Spec

Enterobacteriaceae ETH epidémico en España

BLEE clase A (cefotaximasa)

la

CTX- M-2

ß-lactamic,

AAGG

Enterobacteriaceae ETH epidémico en Argentina

BLEE clase A la

GES-1

Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa

No descrito en España pero sí en Europa. Ejemplo de diseminación de genes en distintos ETH

Quinolonas qnr In36 (Tmp,ß-lac, Ag, Su)

In37 (Ag, Cm, Rf, ß-

lac, Su)

Escherichia coli ETH encontrado en China

Page 24: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

ETH implicados en la diseminación epidémica de

genes de resistenciaResistencia principal

Fenotipo Genotipo

Otras resistenciasa

Microorganismos Comentarios

BLEE clase B la

IMP-1

la

IMP-2

In31 (Ag, Cm, Su)

Otros ( variable)

Pseudomonas, Alcalígenes, Acinetobacter, Klebsiella,

Citrobacter

No descrito en España pero sí en Europa y otros continentes Ejemplo de diseminación de gen de resistencia y variables alélicas en distintos ETH

macrólidos mef (A) - Streptococcus pneumoniae ETH epidémico en Italia

macrólidos mef (E) - Streptococcus pneumoniae

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Staphylococcus aureusMecanismos de Resistencia

S/a Oxa R/a Oxa ------- ------- ------- ------- 2 a

------- -------- ------- 3’ -------- ------- 4 -------- -------

Gen Mec A

PBP 2 a

R/a PenicilinasCefalosporinasCarbapenems

AMS.

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Staphylococcus aureusMecanismos de Resistencia

Comportamiento frente a Oxacilina

Resistencia

Falsa R: * Hiperproducción de Lactamasa Mec A (-) (AORSA) * PBP modificada ( < afinidad: MODSA)

R.verdadera: * Homogénea (fácil detección) Mec A (+) * Heterogénea (Clases 1-2 y 3.)

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Staphylococcus aureusMecanismos de Resistencia

PBP 2 a vs. CIM y Grado de Expresión

CIMs Grado de

expresiónR. Heterogénea

R. Homogénea.

Clase 1 1,5 – 3 g/ml 1/ 10 (7-8) cel RClase 2 6 – 12 g/ml 1/10 (4-6) cel RClase 2-3 25 – 50 g/ml Clase 3 100 - 200 g/ml 1/10 (2-3) cel R

Clase 4 > ó = 400 g/ml todas

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Staphylococcus aureusStaphylococcus aureusR/a Macrólidos y R/a Macrólidos y

LincosamidasLincosamidas R/a Macrólidos: Eflujo……gen msrA.R/a Macrólidos: Eflujo……gen msrA. R/a Clindamicina: Metilación del R/a Clindamicina: Metilación del

rRNA 23S……….gen erm. (Tb se rRNA 23S……….gen erm. (Tb se llama MLS)llama MLS)Interpretación:

Sin achatamiento: S/a Clinda.Con achatamiento: R/a ClindaLa detección de R inducible a Clinda, en este aislamiento aparenta

Determinar R/a Clinda, aunque en algunos pacientes podría ser efectiva”

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Staphylococcus aureusStaphylococcus aureusResistencia a VancomicinaResistencia a Vancomicina

Recomendaciones: Halo = o > a 15 mm: S/a

Vanco. Halo = o < a 14 mm hacer

CIM.

Page 30: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Microorganismo Antimicrobianos Gen blancoMétodos

Moleculares

  Isoniacida

Genes KatGinhAahpC PCR - RFLP.

Complejo Rifampicina Gen rpoB PCR.

Mycobacterium Etambutol Gen embB PCR

tuberculosis. Estreptomicina Gen rrs PCR - RFLP.

  Pyrazinamida Gen pncA PCR

Complejo MAI      

Mycobacterium avium-intracelulare Macrólidos Gen 23S rRNA PCR

Page 31: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Mycobacterium tuberculoso

Detección de genes de Resistencia

Isoniacida Se producen mutaciones en los Genes:kanG, inhA y aphC

Rifampicina

Etambutol

Estreptomicina

Fluorquinolonas

Mutación en el gen rpo

Mutación en el gen embB.

Mutación en los genes rpsL y rrs.

Mutación en los genes gyrA y B

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DETERMINACION RAPIDA DE LA DETERMINACION RAPIDA DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANARESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Microorganismo Antimicrobiano Gen blancoMétodos

Moleculares

Virus de la Inmunodeficiencia

humana Inhibidores de la    

(VIH)transcriptasa

reversa Gen pol RT-PCR-DNA

 Inhibidores de la

proteasaGen de la

proteasa RT-PCR-RFLP

Citomegalovirus GanciclovirGenes UL97 y

UL54 PCR-DNA

Virus de la hepatitis C (VHC) Interferón

Variante genética de VHC RT-PCR-RFLP

Page 33: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Enterobacteriaceae: tipos de Enterobacteriaceae: tipos de ββLEELEE

ββLEELEE

TEM SHV OXA CTX-M PER GES TLA

Page 34: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Métodos Moleculares para Métodos Moleculares para Detección de Detección de ββLEELEE

Sondas de Hibridización:Sondas de Hibridización:

Para Genes TEM, SHVTécnica laboriosaNo distingue entre LEE y no LEE

No puede determinar las variantes de TEM o SHV

PCRPCR Ídem a sonda de hibridización

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Métodos Moleculares para Métodos Moleculares para Detección de Detección de ββLEELEE

PCR – RFLP. PCR – RFLP. Fácil de realizar, detecta cambios Fácil de realizar, detecta cambios

nucleotídicos, detecta variantes de nucleotídicos, detecta variantes de ββLEE.LEE.LCR.LCR.Determina variantes de Determina variantes de ββLEE, utiliza gran LEE, utiliza gran

variedad de primersvariedad de primersSecuenciación ADN.Secuenciación ADN. Es el gold standard, puede detectar todas Es el gold standard, puede detectar todas

las las variantes, técnica cara y laboriosa.variantes, técnica cara y laboriosa.

Page 36: Tecnicas de Biologia Molecular en Bacteriologia

Desventajas de los Métodos Desventajas de los Métodos Genéticos en la Detección de la Genéticos en la Detección de la

ResistenciaResistencia Falta de Sensibilidad si la concentración del Falta de Sensibilidad si la concentración del

microorganismo es baja en la muestra.microorganismo es baja en la muestra.

Para cada antimicrobiano se requieren Para cada antimicrobiano se requieren diferentes pruebas.diferentes pruebas.

La Resistencia a un determinado La Resistencia a un determinado antimicrobiano puede ocurrir por varios antimicrobiano puede ocurrir por varios mecanismos asociados mecanismos asociados

a diferentes genes de resistencia.a diferentes genes de resistencia.

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Desventajas de los Métodos Desventajas de los Métodos Genéticos en la Detección de la Genéticos en la Detección de la

ResistenciaResistencia Para algunos agentes, los mecanismos Para algunos agentes, los mecanismos

genéticos de resistencia son aun genéticos de resistencia son aun desconocidos.desconocidos.

Pueden detectar resistencia expresada a Pueden detectar resistencia expresada a un nivel que no sea clínicamente un nivel que no sea clínicamente relevante.relevante.

Falsos positivos por contaminación de la Falsos positivos por contaminación de la muestra.muestra.

Estandarización y control de calidad Estandarización y control de calidad multicéntrico aún en etapas iniciales.multicéntrico aún en etapas iniciales.

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Muchas Gracias por Muchas Gracias por su atención.su atención.