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1 INTRODUÇÃO

A análise do DNA e um dos maiores progressos técnicos da Ciência

(KOCH; ANDRADE, 2007). A capacidade de detectar e quantificar de forma

rápida, simples, precisa e confiavel segmentos específicos de ácidos nucleicos

se torna fundamental para as pesquisas básicas e para o diagnostico clinico.

Entre os diversos tipos de ensaio, o que mais se aproxima desse conjunto de

necessidades são os ensaios de hibridização in vitro. Esses ensaios são

baseados na capacidade de se determinar de maneira controlada e artificial o

grau de complementaridade necessário para formar duplex entre uma sonda e

um determinado acido nucleico (sequencia alvo) (EÇA, 2004).

As técnicas de sourthern blot, northern blot e westhern blot se fundamentam

na transferência de fragmentos específicos de DNA, RNA e proteinas,

respectivamente, de um determinado meio para uma membrana onde

posteriormente são hibridizados com sondas especificas (EÇA, 2004).

Supondo que você deseje verificar o grau de parentesco entre indivíduos a

partir do DNA destes, uma estratégia seria isolar esses DNAs, fragmenta-lo

com a mesma enzima de restrição de restrição e submeter o material

fragmentado a eletroforese. Feita a eletroforese, o gel deve ser tratado com

uma solução alcalina, para que o material genético nele contido seja

desanelado. Em seguida, uma membrana de naylon ou celulose é colocada

sobre o gel para que nela seja aderida parte do material contido no gel,

formando uma replica perfeita da eletroforese na membrana. Posteriormente a

membrana deve ser incubada com a solução que contenha as sondas

complementares do DNA a regiões de interesse do DNA. Levando em conta

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que o material impregnado na membrana estava desnaturado e que as sondas

são formadas por sequencias simples de DNA, se durante essa incubação o

meio for favorável as sondas se hibridizarão e as sequencias a que forem

complementares. As sondas utilizadas devem ser marcadas com radioisótopos,

a membrana é juntada a um filme de raio X em câmara escura. Devido a

presença dos marcadores radioativos na sonda, o filme é sensibilizadono local

onde houve hibridização, revelando assim o padrão eletroferetico de cada

individuo. Esses procedimentos vale tanto para DNA (sourthern blot) como para

RNA (northern blot) que forem submetidos a eletroforese e que as sondas são

sempre sequencias de DNA.

Figura 1 – Representação de um Southern Blot realizado a partir de um gel de agarose.

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O Western blot é um método para detectar proteínas em um homogenato

(células bem trituradas) ou um ex-trato de um tecido biológico. Essa técnica

usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa. As

proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (nitrocelulose),

onde foram usados como sonda anticorpos específicos à proteína. Como um

resultado, os pesquisadores podem examinar a quantidade de proteína em

uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos.

As amostras são fervidas de um a cinco minutos em uma solução tampão,

contendo corante, um composto sulfuroso e um detergente conhecido como

dodecil sulfato de sódio (SDS). A ebulinação e o detergente desnaturam a

proteína, desenovelando-a completamente. O SDS então cerca a proteína,

deixando-a coberta por uma carga negativa, e o enxofre impede a formação de

pontes de dissulfeto na proteína (TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979).

Eletroforese em gel

As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular

usando-se a eletroforese em gel. Géis têm várias formulações dependendo do

laboratório, peso molecular das proteínas de interesse e tampões disponíveis,

os géis de poliacrilamida são os mais comuns. Desde que as proteínas

caminham apenas em uma direção ao longo do gel, as amostras são

carregadas lado-a-lado em "poços" feitos no gel. As proteínas são então

separadas por massa em "bandas" dentro de cada canaleta. Uma canaleta é

reservada para um "marcador", ou ladder, uma mistura disponível

comercialmente de proteínas de pesos moleculares conhecidos (TOWBIN;

STAEHELIN; GORDON, 1979).

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Transferência

A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo, elas são

movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose. A membrana é colocada

face-a-face com o gel, e uma corrente elétrica é aplicada entre grandes placas

de cada lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para a

membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel.

Como resultado desse processo de "borramento" (blotting em Inglês), as

proteínas são expostas a uma fina camada para detecção. A ligação das

proteínas à membrana é baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em

interações de cargas entre a membrana e as proteínas (TOWBIN; STAEHELIN;

GORDON, 1979).

Bloqueio

Desde que a membrana escolhida por sua habilidade de ligar proteínas,

passos precisam ser feitos para impedir as interações não específicas entre a

membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo. O bloqueio

da ligação não específica é alcançado pondo-se a membrana em uma solução

diluída de uma proteína - tipicamente albumina de soro bovino (BSA) ou leite

seco desnatado, com uma pequena quantidade de detergente como Tween 20

(TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979).

Detecção

Durante o processo de detecção testa-se a membrana com anticorpos da

proteína de interesse, e se liga eles com uma enzima reveladora, a qual leva a

uma mudança de cor ou sinal fotométrico. Por uma variedade de razões, isto

tradicionalmente toma lugar em processo de dois passos, embora existam

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métodos de detecção de um passo disponíveis para certas aplicações

(TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979).

Método de dois passos

Anticorpo primário

Anticorpos são gerados quando uma espécie hospedeira ou uma cultura

de células imunes são expostos à proteína de interesse (ou a uma parte dela).

Normalmente uma parte da resposta imune é colhida e usada como ferramenta

de detecção específica e sensível que se liga à proteína diretamente - por isso

anticorpo primário (UK., 1970).

Depois de bloqueada a membrana, uma solução diluída do anticorpo

primário (geralmente entre 0,5 e 5 microgramas/mL) é encubada com a

membrana sobre leve agitação. Tipicamente, a solução é composta de uma

solução salina tamponada, e às vezes com BSA ou leite em pó. A solução de

anticorpos e a membrana podem ser seladas e incubadas juntas de 30 minutos

a uma noite. Também podem ser incubadas em diferentes temperaturas, com

temperaturas mais altas sendo associadas com mais ligações, tanto

específicas à proteína alvo (o sinal) e não específicas (o ruído) (UK., 1970).

Anticorpo secundário

Depois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo primário não

ligado, ela é exposta a outro anticorpo, direcionado a porções espécies-

específicas do anticorpo primário. Este é conhecido como anticorpo

secundário. Ele geralmente é ligado a biotina ou a uma enzima reveladora

como por exemplo fosfatase alcalina. Esse passo confere a vantagem de que

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vários anticorpos secundários se ligarão a um anticorpo primário,

providenciando um sinal intensificado (UK., 1970).

Mais comumente, uma peroxidase - ligada secundariamente é usada em

conjunção com um agente quimioluminescente, e a reação

produz fluorescência proporcionalmente à quantidade de proteína. Um filme

fotográfico é colocado contra a membrana, e exposta à luz da reação é criada a

imagem dos anticorpos ligados ao blot (UK., 1970).

Uma terceira alternativa é usar um marcador radioativo acoplada ao

anticorpo secundário (UK., 1970).

Análise

Depois das sondas não ligadas serem lavadas, o Western blot está pronto

para a detecção das sondas marcadas e ligadas à proteína de interesse. Em

termos práticos, nem todos os Westerns blots revelam proteínas em apenas

uma banda da membrana. Aproximações de tamanho são tomadas pela

comparação das bandas coloridas àquelas do marcador ou ladder carregado

durante a eletroforese (WN. 1981).

Detecção colorimétrica - Quimioluminescência

Os métodos de detecção quimioluminescentes dependem da incubação do

Western blot com um substrato que fluoresce quando exposto à enzima

reveladora no anticorpo secundário. A luz é então detectada por um filme

fotográfico. A imagem é analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade

de proteína colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade

óptica. Novos softwares permitem uma análise mais além da informação como

a análise do peso molecular se padrões apropriados forem usados. A detecção

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de quimioluminescência ampliada é considerada entre os métodos mais

sensíveis para análise em blot (WN. 1981).

Figura 2 – Eletrotransferência (western blotting). A – sequência de montagem

do sanduíche de transferência. B – Colocação do sistema da cuba e

preenchimento com tampão de transferência.

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2 OBJETIVO

Aula expositiva com discussão da técnica de Southern Blot.

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais para a Southern Blot

SOLUÇÕES:

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3.2 Métodos

1º DIA

Digerir 10mL do DNA genômico

2º DIA

1. Eletroforese em gel de agarose 0,8% (70 mA / 60 volts)

2. Fotografar o gel com a régua

3. Transferir o gel para um recipiente, cobrir com a solução de despurinação e

agitar. Observar a mudança de cor do azul de bromofenol para amarelo

(aproximadamente 10 - 12 min.)

4. Lavar o gel com água destilada

5. Cobrir o gel com a solução de desnaturação e agitar. Após o azul de

bromofenol retornar a cor azul, incubar por 25 minutos.

6. Lavar o gel com água destilada.

7. Cobrir o gel com a solução de neutralização. Agitar por 30 minutos.

8. Montar o aparato de transferência (SSC 20X no reservatório e SSC 10X no

papel).

Figura 3 – Esquema representativo de montagem do sistema de southern blot

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3º DIA

1. Preparar a solução de Pré-hibridização (NaCl 0,5M, 5% ECL blocking mix in

ECL hybridization solution). Para 25mL (0,73g NaCl, 1,25g blocking mix em

25mL de solução de hibridização)

2. Remova a membrana cuidadosamente, marcando as canaletas com lápis.

3. Lavar a membrana com SSC 6X e incubar a 80°C por 2 horas.

4. Pré-hibridizar a membrana por 1 hora a 42°C

5. Preparo da sonda: diluir o DNA para 10ng/μL (volume total=25mL); deixar

por 5 min. a 96°C e colocar imediatamente no gelo por 5 min.; spin down;

adicionar 25mL de DNA labelling reagent e homogeneizar lentamente;

adicionar 25mL de solução de glutaraldeído; centrifugar rapidamente; incubar

por 10 min. a 37°C (incubar por 20 min. se a sonda for menor que 300bp);

- colocar no gelo até o momento do uso

6. Adicionar a sonda à membrana

7. Hibridizar por 12 a 16 horas a 42°C

4º DIA

1. Remover a membrana da solução de hibridização.

2. Lavar a membrana por 20 min. com tampão de lavagem primário a 42°C.

Descartar a solução e lavar por 2 vezes, com o mesmo tampão, por 10 min, a

42°C.

3. Lavar a membrana por 2 vezes com SSC 20X a temperatura ambiente por 5

min.

4. Colocar a membrana em uma placa de vidro e aplicar ECL detection solution

5. Expor ao filme autorradiográfico.

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A realização da técnica não foi possível devido a falta dos materiais.

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5 CONCLUSÃO

Uma das mais comuns aplicações da técnica de southern é a detecção de

DNAs polimórficos derivados do surgimento ou da perda de sitos de restrição

na molécula de DNA; é possível também por esse meio verificar-se alterações

como translocações, deleções e inserções de trechos de DNA. Dependendo da

amostra original e da estringência do ensaio, a hibridização e membrana

podem fornecer diversas informações a respeito de uma determinada amostra

como o tamanho e a posição ou quantidade de sequências alvo. O fato de ser

facilmente executável torna esse tipo de ensaio bastante atrativo tanto para

aplicação em pesquisas como para o diagnóstico clínico. O fato de poder

detectar colônias de microrganismos tornou a técnica uma importante

ferramenta para a avaliação de clones bacterianos ou de fagos recombinantes

ou para a construção de bibliotecas de DNA ou cDNA (biblioteca genômica). O

northern blot é uma técnica que nos permite verificar se há ou não a transcrição

de moléculas de interesse, tendo em vista que permite a verificação da

quantificação de RNA numa amostra. Uma forma alternativa nesse caso seria

construir cDNAs a partir desse RNA e utilizar southern blot, mas seja qual for a

estratégia adotada ensaios realizados a partir de RNA normalmente se

relacionam com investigações que buscam o quanto um determinado gene é

transcrito. A aplicabilidade da técnica de western blot é a detecção de proteínas

de uma determinada amostra e serve como teste confirmatório dos resultados

obtidos em testes imunoenzimaticos (EÇA, 2004).

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6 REFERÊNCIAS

EÇA, Lilian Pinero. Biologia molecular: Guia prático e didático. Rio de Janeiro:

Revinter, 2004. 269 p.

HTOWBIN; STAEHELIN, T; GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins

from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some

applications. Pnas, Usa, p. 4350-4354. 12 jun. 1979. Disponível em:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC411572/?tool=pubmed>. Acesso

em: 01 jun. 2012.

KOCH, Analara; ANDRADE, Fabiana Michelsen de. A utilização de técnicas de

biologia molecular na genética forense: uma revisão. Rio Grande do Sul, n. ,

p.17-23, 18 out. 2007.

UK., Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4. Nature, Usa, p. 680-685. 15 jul. 1970. Disponível em:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5432063?dopt=Abstract>. Acesso em: 01

jun. 2012.

WN., Burnette. Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from

sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and

radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal

Biochem, San Diego, p. 195-203. 02 abr. 1981. Disponível em:

<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269781902815>. Acesso

em: 01 jun. 2012.