Técnicas de Imuno-Citoquímicae Imuno-Histoquímica

Doutorando: Romeu Moreira dos Santos

Prof. Hélio José Montassier

Disciplina: Imunologia Veterinária

Linfócitos T

Seleção e maturação de células T

TCR αβ se transformam em CD4+ ou

CD8+ na medula tímica

T CD4+ virgem : MHC deantígenos exógenos

T CD8+ virgem : MHC de

antígenos endógenos

classe II-

classe I –

Linfócitos B

Linfócitos B são ativados pelo antígenosecretam anticorpos para eliminá-los

Citocinas produzidas pelas céls T auxiliares que são ativadas por patógenos regulam a mudança do isótipo

e

Marcadores

Técnica - definição

Utilização de Acs para detecção do

antígeno distribuído no tecido ou no

compartimento de uma célula

Histoquímica◦ Corte de tecido congelado ou parafinado

Citoquímica◦ Esfregaço sanguíneo, aspirados ou suabes

Principais fatores

Qualidade da marcação:

A. Fase pré-analítica (destacando-sefixação do tecido e processamento);

B. Recuperaçãoepítopos;

antigênica de

C. Sensibilidadedetecção.

do sistema de

História

Coons, Creech e Jones em 1941

◦ Conjugaram umfluorescente.

anticorpo com um corante

Novos compostos marcadores como as

enzimas horseradish peroxidase (HRP)em 1966 e fosfatase alcalina em 1978

Aplicações

Pré-requisitos

Antígeno - Anticorpo

Antígeno: molécula que se une de

maneira específica a um anticorpo

Epítopo: sítios de reconhecimento

de ligação

Imunógeno: molécula que pode

desencadear uma reposta

◦ Peptídeos sintéticos

◦ Antígeno purificado

ou

Soros

Reagente da técnica

Imunização de animais-alvo

Soros policlonais e monoclonais

Soros policlonais

Vários plasmócitos

◦ Reage com diversos epítopos

antígenode um

Coelho, cabra, porco, equino ouovelha

Soros monoclonais

Produto de um único clone de

plasmócitos

Uniforme em estrutura, especificidade

afinidade

Anticorpos de um clone -

e

imunoquimicamente idênticos e reagemcom um epítopo específico

Ratos

Métodos Imunohistoquímicos

Métodos diretos

AC primário possui o marcador

Simples, rápido

Pouca ampliação de sinal

orado e com

Métodos indiretos

Método indireto simples

Anticorpo primário

Anticorpo secundário possui

marcador

Mais sensível que o método

o

direto,

maior versatilidade, mais econômico

Mais demorado e maisdireto

complexo do que o

Métodos de avidina-biotina

Detecta pequenas quantidade deantígenos

Alta sensibilidade (1 molécula de

anticorpo se liga a 150 moléculas

biotina )– diminui o “fundo”

Técnica mais rápida

Alta versatilidade

de

Métodos de avidina-biotina

Técnica streptABC

Anticorpo primário

Anticorpo secundário biotinilado

Aplicação do complexo streptavidina-

biotina (marcado com substância

propiciadora da visualização -

normalmente HRP).

Aspecto prático dosreagentes Cuidado com material e reagentes

Diluição do anticorpo

Testar diluições diferentes

Pipetagem

Tempo e temperatura de incubação

Higiene e segurança do laboratório

Preparação

Fixação

Preservação

Estabilização

Proteção

de amostras

Preparação de amostras

Formaldeído

Econômico, mais utilizado, penetratecidos

nos

◦ Pontes de metileno entre os aminoácidos devárias proteínas

“Máscarar” antígenos

Algumas alterações estruturais nas

biomoléculas, principalmente nas proteínas

Recuperação antigênica

◦◦

◦

Preparação de amostras

Fixação para cortes de criostato

> preservação dos tecidos

Fixadores: álcool, acetona

Microtomia

Cortes finos, sem pregas ou estrias

Não desbastar os cortes entre HE e

IHQ

Recuperação antigênica

Cortes parafinados

Digestão enzimática proteolítica

Recuperação antigênica de origem

térmica por alta temperatura

◦ Forno de micro-ondas, autoclave, panela

de pressão, banho de água quente e vapor

quente

Inibição de partículasendógenas Peroxidase endógena

Baço, Rins, Fígado, Medulaem áreas de necrose

óssea e

◦ Bloqueada por um excesso de substrato (

H2O2) que leva à saturação da atividade

enzimática

Fosfatase alcalina

Rim, fígado e osso

Figura 112 - CD3 (negro) e CD20(castanho) em gânglio linfático

Figura 92 - Receptores deEstrogênio