Técnicas de PCR AULA 3 - análise de produtos

Tcnicas de PCR: Aplicaes e Padronizao de ReaesBSc. Daniel Perez Vieira(Protozoologia-IMTSP/ Laboratrio de Biologia Molecular-IPEN)

Aula 3 - Anlise dos produtos: Qualitativa e SemiQuantitativaA anlise dos resultados das reaes de PCR feita normalmente utilizando protocolos diversos de eletroforese, como j dito anteriormente. O registro dos padres de bandas obtidos, de forma fotogrfica ou digital, o que nos fornece os resultados brutos que sero analisados a partir do enfoque a ser usado. A grosso modo, existem dois tipos de PCR: a Qualitativa e a Quantitativa.

PCR Qualitativa O enfoque qualitativo fornece como resultado final um conceito novo sobre a amostra utilizada, baseado na presena ou no do produto amplificado no gel. Portanto, existem apenas dois resultados, o positivo e o negativo. Devido sua alta especificidade e sensibilidade, as reaes de PCR estruturadas no admitem resultados inconclusivos. No entanto, para poder afirmar que um resultado negativo ou no, deve-se ter a certeza de que a ausncia de bandas devido ausncia de DNA molde, e no falhas na reao. Para tanto, deve-se considerar utilizar um CONTROLE DE AMPLIFICAO nas reaes. As bandas-controle nas reaes de PCR so geradas a partir da amplificao de uma seqncia que obrigatoriamente existe no material analisado, e preferencialmente em uma nica cpia. Vrios genes so utilizados para amostras de roedores e de humanos sendo os genes da -globina,

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-actina, e da GAPDH os mais usados. O resultado ser dado em funo do aparecimento da banda controle: se esta observvel no gel, o resultado (seja ele negativo ou positivo) pode ser dado como conclusivo. Exemplo 1: L 1 2 3 4 5 6

A foto acima representa as bandas geradas pela amplificao de 5 diferentes receptores de membrana de macrfagos de camundongo (Lanes 2 a 6) A lane L indica o padro de peso molecular e a 1 indica o a banda controle, resultado da amplificao do gene da -actina. Como a banda controle est ntida, o resultados das reaes para a deteco dos receptores foram considerados positivos, pois alm das bandas estarem presentes no gel, o controle mostra-se positivo tambm, confirmando os resultados.


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Exemplo 2: L 1 2 3 4 5 6

Este gel mostra produtos da amplificao dos mesmos receptores da figura acima. O controle tambm est presente, o que indica a fidelidade da reao. Neste caso, a amostra 2 foi considerada negativa para a PCR.

PCR Quantitativa Em alguns casos, a anlise qualitativa j foi realizada, ou no necessita de realizao. Nestas situaes, mais importante determinar o QUANTO de DNA foi amplificado em comparao a um padro. Este padro pode ser novamente um simples controle de amplificao (Semi-Quantitative PCR, a ser visto em melhores detalhes posteriormente), ou uma seqncia de DNA exgeno introduzido na reao em quantidades conhecidas e cuja seqncia tambm amplificada pelos primers da seqncia-alvo, com a diferena de produzir um tamanho de bandas diferente (Competitive PCR) Recentemente introduziu-se o conceito de Real-Time PCR, que uma PCR que utiliza primers e dNTP`s marcados por compostos fluorescentes. O diferencial desta reao, no entanto, a utilizao de termocicladores especiais que alm de realizar os ciclos de temperatura, possuem leitores de fluorescncia que fornecem www.etall.hpg.com.br 3

dados sobre a quantidade de DNA formada na durante a reao. Cada nucleotdeo fluoresce um determinado comprimento de onda, que captado pelo leitor do termociclador e os dados so analisados por um computador. Os resultados so grficos como os da figura abaixo.

Fig. 1: Grfico de quantificao de produtos de PCR em termociclador do tipo Real Time. O grfico mostra quantidades absolutas de DNA em funo do tempo, durante a PCR. A quantificao precisa do produto final de PCR costuma ser algo um tanto complicado. Inicialmente, tentou-se extrair o DNA presente nas bandas e determinar a sua concentrao, porm os procedimentos de extrao utilizados se mostraram pouco confiveis para isso (muita perda de material). Competitive PCR: Na PCR competitiva, uma seqncia exgena ao material compete por ligaes com a enzima e anelamentos com os primers com a seqncia-alvo. Normalmente, este fragmento construdo, inserindo-se as mesmas regies de anelamento do primer na seqncia-alvo nos flancos de uma outra seqncia qualquer, com o cuidado de o produto final deste DNA construdo seja distinguvel


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do produto-alvo pelo tamanho em pares de base da banda obtida. Em esquema da construo de um fragmento como este pode ser visualizado abaixo:Tsp 509 I (69) Sau 96I (200) SDF-1 (394 bp)

-actin (394 bp) Tsp 509 I (32) Sau 96I (291)

Hbrido 479 bp

Neste caso, usou-se enzima de restrio para cortar dois fragmentos de DNA: o do gene SDF-1 (alvo) e o do gene da -actina. Aps a digesto com a enzima, os fragmentos das bordas de SDF-1 podem ser unidos com o interior do fragmento da -actina, formando um hbrido de tamanho maior (cerca de 80pb), porm amplificvel pelos primers especficos de SDF-1. Este hbrido adicionado na reao em quantidades pr-determinadas, e aps a amplificao as bandas no gel so quantificadas quanto sua densidade ptica em programas de densitometria de imagem.Este mtodo utilizado em alguns kits de deteco de certas doena virais, usados rotineiramente em laboratrios clnicos e bancos de sangue. Semi-Quantitative PCR: Funciona da mesma forma que a competitiva, com a diferena que a seqncia controle no adicionada, e sim um produto da amplificao de uma seqncia controle.


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A tcnica parte do princpio que, se o controle de amplificao uma seqncia que tambm vai ser amplificada sob as mesmas condies da seqncia-alvo, ele pode ser utilizado com parmetro de quantificao dos produtos de PCR. Aps a eletroforese, o gel registrado eletronicamente (por scanner ou fotografia digital), e as bandas so analisadas tambm por programas de densitometria ptica. Talvez o programa mais popular desta srie seja o ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Trata-se de um programa de cdigo aberto e de graa, disponvel na Internet. O ImageJ faz a densitometria das bandas obtidas, contanto cada microponto de tonalidade escura na foto. Deste modo, traa-se uma relao entre a densidade ptica da banda da seqncia-alvo e a densidade ptica da banda controle. O programa gera uma curva, cujos picos representam as regies de maior densidade ptica e, portanto as regies que apresentam bandas. Ento, deve-se isolar este pico com as ferramentas adequadas oferecidas pelo programa, e obter o valor numrico de cada pico (o programa utiliza equaes integrais simples para transformar os picos em valores). A partir deste ponto, o que se tem a fazer dividir o valor de cada banda da(s) seqncias-alvo pelo valor da banda controle.


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Utilizao do ImageJ

I)

Abrir uma foto de algum gel (qualquer formato de imagem: *.bmp, *.gif, *.jpeg, *.tiff, etc.


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II)

Calibrar a escala de medio de densidade ptica

III)

Escolher Uncalibrated OD. O programa mostrar uma funo plotada sob a forma de curva; pode-se desprez-la simplesmente fechando a sua janela.

IV)

Rotacionar a figura 90 para a esquerda (o programa no aceita lanes verticais)


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V)

Com a Ferramenta retngulo, marcar a lane do controle de amplificao e teclar Ctrl+1

VI)

Marcar as outras lanes deslocando a seleo e teclando Ctrl+2


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VII)

Acessar o menu Plot Lanes ou teclar Ctrl+3

VIII)

Com a ferramenta linha, isolar o pico correspondente banda de interesse. No caso mostrado, trata-se da banda controle.


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IX)

Fazer o mesmo com as outras bandas (Dica: Selecionar a lane do padro de peso molecular pode ajudar a encontrar o pico que corresponde banda de interesse)


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X)

Os valores mostrados pela janela Results so as integraes das curvas, ou seja, sua traduo em valores numricos. A partir da, basta usar o valor medido para a banda da seqncia-alvo e dividir pelo valor obtido na medio da banda-controle. O resultado um valor relativo, de unidades de densidade ptica da amostra em relao s unidades da amostra. Valor arbitrrio (Sem unidade).


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