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  • TCNICAS ROTINEIRAS DE PREPARAO EANLISE DE LMINAS HISTOLGICAS

    Llian de L. TimmCentro Universitrio La Salle

    Museu de Cincias Naturais La Salle ltimm@lasalle.tche.br

    lltimm@hotmail.com

    RESUMO

    Para a anlise das microestruturas ana-tmicas dos tecidos de animais sob microsco-pia ptica necessria a confeco de lmi-nas histolgicas. Neste artigo so abordadasas tcnicas de coleta, fixao, incluso, micro-tomia, criomicrotomia e colorao em amos-tras de tecidos moles e as tcnicas de desgatee descalcificao para tecidos sseos. So abor-dadas ainda, tcnicas especiais de preparaode amostras para anlise sob microscopia ele-trnica, criofratura e fracionamento celular.

    PALAVRAS-CHAVE: Tcnicas histolgicas, mi-crotomia, colorao, desgaste, descalcificao,microscpios eletrnicos

    INTRODUO

    Histologia o ramo da anatomia queestuda os tecidos animais e vegetais. Tanto azoologia quanto botnica apresentam nomen-claturas especiais. Neste artigo sero aborda-dos, exclusivamente, conceitos e tcnicas dehistologia animal.

    A maioria dos tecidos formada porclulas e matriz extracelular. Nesta categoriase enquadram os diferentes tipos de tecidosconjuntivos especializados cartilaginoso, adi-poso, sangneo e sseo alm dos tecidosconjuntivo propriamente dito, muscular e ner-voso. As clulas que os constituem, possuem

    formas e funes muito distintas. Contudo, to-das trabalham em conjunto na sustentao ena manuteno do tecido. A matriz formadaprincipalmente por fibras e gua que auxilia,principalmente no transporte de substncias.

    A exceo regra est no tecido epite-lial. Embora formado por clulas epiteliais comdiferentes formas, como cbicas, pavimento-sas ou colunares, e arranjadas em diferentescamadas (simples, estratificadas ou pseudo-estratificadas), este tecido freqentementecaracterizado pela ausncia de matriz extrace-lular. Sua nutrio acaba sendo efetuada pelotecido conjuntivo vascularizado adjacente.

    Maior variao ainda se encontra emalguns tipos de tecido sseo, como o tecidoacelular dos peixes telesteos, onde h a au-sncia completa de clulas sseas. Neste casoespecial, h uma perda progressiva dos oste-citos durante o crescimento do animal, queculmina na sua ausncia completa na matrizcalcificada do indivduo adulto (Enlow e Brown,1956).

    TCNICAS UTILIZADAS EMHISTOLOGIA

    Muitas so as tcnicas utilizadas em his-tologia e no seria possvel, neste momento,aborda-las detalhadamente. Deste modo, foramselecionadas algumas tcnicas freqentemen-te utilizadas em rotinas de laboratrios que pro-porcionam a visualizao das microestruturasdos tecidos.

    Caderno La Salle XI, Canoas, v.2, n 1, 231 - 239, 2005

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    Confeco de Lminas Histolgicas: Co-leta, Fixao, Incluso e Microtomia

    Para a anlise sob microscopia ptica necessria a confeco de lminas delgadasdos tecidos que formam os rgos. Estas lmi-nas podem ser permanentes ou provisrias.A seguir, sero descritas as etapas de confec-o de lminas histolgicas permanentes.

    Coleta do materialPartes de rgos so retiradas com o

    auxlio de um bisturi, pina ou lmina de bar-bear. No indicada a extrao de poresgrandes, uma vez que o objetivo final a ob-teno de uma camada fina que possa ser ana-lisada em um microscpio ptico.

    Fixao do materialEsta etapa consiste na utilizao de

    procedimentos fsicos ou qumicos para imo-bilizar as substncias constituintes das c-lulas e dos tecidos, fornecendo maior resis-tncia para suportar as demais etapas. Almdisso, os fixadores retardam os efeitos postmortem do tecido, mantendo sua arquitetu-ra normal. Os agentes fixadores mais utili-zados so o formol tamponado e o lquidode Bouin. Ambos fixam as protenas evitan-do sua degradao.

    O formol, por ser mais acessvel e deuso simples, o fixador mais utilizado nastcnicas histolgicas. Contudo, seus resul-tados geralmente no so satisfatrios. Poressa razo recomendada a dissoluo deformol em tampo fosfatado preparado doseguinte modo (Junqueira e Junqueira,1983):

    Formol (soluo a 37% de formaldedo)_______________________________ 100ml

    gua destilada___________________ 900ml

    Fosfato de sdio monobsico _______ 4,0g

    Fosfato de sdio dibsico (anidro) ____ 6,5g

    O tempo de fixao depender do ta-manho do fragmento do tecido, podendo va-

    riar entre 06 e 24h. recomendado que, sem-pre que possvel, no ultrapasse a 3mm deespessura e se utilize, no mnimo, um volume20 vezes maior de fixador, em relao ao te-cido a ser fixado, para que o material reajasatisfatoriamente. Uma vez fixado, a pea deveser transferida para lcool 70%, onde poderpermanecer indefinidamente.

    O fixador de Bouin tem a seguinte fr-mula (Junqueira e Junqueira, 1983):

    Soluo aquosa saturada de cido pcrico__________________________________ 75ml

    Formol ___________________________ 25ml

    cido Actico______________________ 5ml

    Aps a fixao fundamental a remo-o do cido pcrico dos tecidos para a pos-terior etapa de colorao. Alm disso, resdu-os deste cido podem favorecer a deteriora-o da pea com o passar do tempo. Para aeliminao do excesso de fixador dos tecidos recomendado (Junqueira e Junqueira,1983):

    1) Lavagem em gua corrente por 18h;

    2) Transferncia da pea para lcool50%, durante 30min;

    3) Armazenamento da pea em lcool70%.

    Importante: O contedo dos frascos de cidopcrico deve ser mantido mido, pois ele ex-plosivo quando seco (Junqueira e Junqueira,1983).

    InclusoEste procedimento consiste na impreg-

    nao do tecido com uma substncia de con-sistncia firme que permita, posteriormente,seccion-lo em camadas delgadas. Pelo fcilmanuseio e bons resultados, a parafina amais utilizada neste procedimento. Como elano miscvel em gua, a primeira etapa daincluso compreende a desidratao, quan-do ocorre a retirada da gua dos tecidos e asua substituio por lcool. A diafanizao

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    a etapa seguinte, com a substituio do lco-ol, agora presente nos tecidos, por xilol. Final-mente, na impregnao, ltima etapa, o xilol substitudo por parafina fundida a 60 empequenos blocos. Neste momento a catalo-gao do bloco importante para a posterioridentificao da pea.

    MicrotomiaEsta etapa (Fig. 1 A) consiste, basicamen-

    te, em utilizar um micrtomo para obter cortessucessivos, delgados e uniformes, a partir dosblocos de parafina com as peas includas. Esteaparelho (Fig. 2) formado por uma lmina (fixaou descartvel) de ao, afiada, e um brao aoqual se prende o bloco e que se desloca verti-calmente.

    Figura 1. Esquema das etapas de microtomia (A) edistenso da fita em banho-maria (B) (Modificado deJunqueira e Junqueira, 1983).

    Figura 2. Fotografia de um micrtomo para cortes emresina (Retirado de Junqueira e Carneiro, 1995)

    difcil obter cortes abaixo de 3 a 4micrmetros de espessura dos materiais inclu-dos em parafina. De um modo geral, so obti-dos cortes entre 5 e 7 micrmetros.

    Montagem da lmina histolgicaAs fitas obtidas a partir do micrtomo

    so transferidas para um banho-maria, com oauxlio de uma pina, para serem distendidas(Fig. 1 B). A gua deve estar entre 3 e 8 abai-xo do ponto de fuso da parafina utilizada.Nesta etapa, so retiradas as dobras e evita-das as bolhas abaixo da fita. Aps a distenso,os cortes so separados individualmente ou emgrupos, conforme a convenincia, utilizando-se lminas de vidro previamente limpas comdetergente, estocadas em lcool 80% e previ-amente secas. Antes da utilizao das lminas, necessrio revestir suas superfcies com umafina camada de albumina para facilitar a ade-so da pea. Os cortes obtidos podem ser trans-feridos, inicialmente, para uma estufa onde fi-cam alguns minutos (no mais que dez minu-tos) para posteriormente serem colocados emum suporte inclinado. Finalmente, os cortesdevem ser depositados em uma estufa a 60para secagem entre uma e 24 horas.

    Tcnica de Criomicrotomia (= Microtomiapor Congelamento)

    A tcnica descrita acima, sem dvida, a mais utilizada. Contudo, em alguns casos, estatcnica contra-indicada, como, por exemplo,no estudo da distribuio dos lipdios, em tc-nicas histoqumicas avanadas ou quando so

    (B)

    (A)

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    necessrios cortes urgentes, como em examespatolgicos. Nestes casos, os tecidos so en-durecidos atravs do congelamento. Os apa-relhos utilizados para os cortes podem ser dedois tipos: micrtomos de congelamento oucriostatos (Junqueira e Junqueira, 1983).

    Nos micrtomos de congelamento(Fig. 3) os tecidos so congelados tanto fixa-dos quanto frescos. O congelamento ocorrepor expanso de CO2 no suporte apropriadopara o tecido. Assim como nos micrtomosde parafina, estes micrtomos possuem umanavalha. Contudo, no produzem cortes muitofinos. Suas lminas cortam acima de 10 mi-crmetros. Outro inconveniente acertar atemperatura ideal para corte: se estes se frag-mentam durante a passagem pela navalha, otecido est frio demais; se ao contrrio, sedeformam, o tecido precisa ser resfriado.

    Figura 3. Fotografia de um micrtomo para cortes con-gelados.

    O criostato um aparelho mais aperfei-oado que o anterior. Permite a obteno decortes muito mais finos de tecidos no fixados(at dois micrmetros), facilitando a visualiza-o das clulas (Junqueira e Junqueira, 1983).

    Tcnicas de Colorao de Cortes Histo-lgicos

    A colorao consiste numa etapa muitoimportante para a visualizao das estruturasdo tecido. Normalmente so utilizados coran-tes hidrossolveis, sendo necessrio, deste

    modo, a remoo da parafina da pea que foipreparada nas etapas descritas anteriormentee que permanece na lmina de vidro.

    Existem muitos tipos de corantes, masde um modo geral podem ser agrupados emtrs classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999):

    Corantes que diferenciam os compo-