TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

UM TESTE SOROLÓGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO ...

• Qualitativo: + ou – • Semi-quantitativo: amostra testada foi diluída

– a maior diluição que apresentar reação é o seu título (ex. + ate a diluição 1:320)

• Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado.

IMPORTANTE : Finalidade do teste - 1.Triagem 2.Diagnóstico

?

Alguns fatores que afetam as medições das reações Ag/Ac

• Afinidade• Avidez• Taxas Ag-Ac• Reações Cruzadas

Anticorpos:• Monoclonais• Policlonais

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

• Técnicas sem uso de marcadores– Reações de Precipitação– Reações de Aglutinação

• Técnicas com uso de marcadores– ELISA– Citometria de fluxo– Imunofluorescência– Radioimunoensaio

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

• PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese

• AGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs

• IMUNOENSAIOS- Radioimunoensaio- ELISA - Imunofluorescência - Citometria de Fluxo

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO

ZONA DE EQUIVALÊNCIA

EFEITO PRÓ - ZONA

EFEITO PÓS - ZONA

IMUNODIFUSÃO DUPLA

Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs)

Utiliza uma matriz de ágar

Ag + Ac = linha de precipitação visível

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

• As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação

• Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante

Utilização da técnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imunes

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

• Interpretação– Diâmetro do anel é

proporcional à concentração do Ag

• Método de Mancini– Anticorpo no gel– Antígeno no poço– Vice-versa

IMUNODIFUSÃO RADIAL

Ag Concentração

Dia

met

er2

AgAgAgAg

Ac no gel

IMUNODIFUSÃO RADIAL

Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas

Fácil, baixo custoUtiliza uma matriz de ágarÉ quantitativa

IMUNOELETROFORESE

+ -

Ag

Ag

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

2- Anti-soro na canaleta

canaleta

3- Difusão e precipitação

• Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

• As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

• Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. • Ag e Ac formam arcos de precipitação.• É qualitativo• Utiliza lâminas recobertas com ágar

Útil para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e a macroglobulinemia

IMUNOELETROFORESE

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

• Pode ser direta ou indireta• + sensíveis qtidade de Ac 500 vezes menorpartículas

amplificam a reação• Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-

quantitativo)

Agregação visível de partículas

EritrócitosBactériasFungoslátex

USO: Tipagem ABOTestes confirmatórios para sífilis, FR

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Partículas que apresentamdeterminantes antigênicosnaturais na sua superfície

+ Ac = Aglutinação

3) Controle negativo:

4) Mistura-se:

HemáciasBactériasProtozoários

AGLUTINAÇÃO DIRETA5) Leitura do resultado:

negativo positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste);

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas:

• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.

Aglut +

Aglut -

Ags solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias)

AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: FATOR REUMATÓIDE

•Fator Reumatóide: Anticorpos que reconhecem epítopos presentes na fração cristalizável (Fc) da molécula de IgG. A maioria destes Acs são da classe IgM porém pode-se encontrar também Acs IgA e IgG.

•Teste: Visualização de aglutinação das partículas de látex revestidas pelo antígeno (no caso IgG humana ou de coelho)

•Interpretação: No caso de artrite reumatóide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade

Causas virais HBV, HCV, Mononucleose, influenza, AIDS, pós vacinação

Doenças auto-imunes

Artrite Reumatóide, Lúpus Eritematoseo sistêmico, Esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjörgren, cirrose biliar, hepatite auto-imune, etc

Neoplasias Após irradiação ou quimioterapia

Infecções bacterianas

Tuberculose, sífilis, hanseníase, salmonelose, endocardite bacteriana subaguda, brucelose, borreliose

Doenças parasitárias

Malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíase

Enfermidades em que o encontro de FR é comum

TESTE DE COOMBS (Antiglobulina)

• DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrócitos

• INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrócitos no soro

1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (mãe produz IgGantiRh).

2.R. medicamentosa3.R. transfusional

Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com antígeno solúvel.

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.

Resultado negativo:(ausência de hCG na urina): ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

Princípio da técnica:

• Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível.

• A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio de fluorescência

• Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).

IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

IFA direta:• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes

de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele.

IFA indireta: • pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos ( sífilis,

toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Treponema pallidum

Pneumocystis carinii

Tripanosoma cruzi

Giardia lamblia

• Separação de células marcadas por fluorescência;• Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou Antígenos do

Conjunto de Diferenciação (CD)• Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.• É um teste qualitativo e quantitativo. • Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em

uma corrente através de um feixe de Laser.

CITOMETRIA DE FLUXO ( célula medida em movimento )

CD 4

CD 18

CD 125

CD 147

CITÔMETRO DE FLUXO

• SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO

• SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.• SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS

ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

CD4

CD8

CD20

USO

Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas Isolar populações celularesQuantidade, tamanho, granulosidade; Distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ags Tamanho celular.

APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO

- Análise da subpopulação linfocítica- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas- Análise de reticulócitos- Detecção de anticorpos antiplaquetários

- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)

- Avaliação imunológica de paciente transplantado

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

• O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.

• O produto final ação da enzima sobre o substrato = COR• Produto final corado leitura em fotocolorímetro. • Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo.

Vantagens do ELISA:-Utiliza reagentes estáveis-Teste de alta sensibilidade-Seguros e de baixo custo-Não trabalha com radioisótopos-pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação-Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc.

Direto = Ag Indireto = Ac

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

substrato

Qualitativos Quantitativos

Ac marcados com Enzimas

+ +Ag

Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase

DIRETO OU SANDUÍCHEINDIRETO

= COR

Ponte de corte (“ cut-off”) : é o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo

ESTE EXEMPLO É DE ELISA DIRETO OU INDIRETO?

CURVA PADRÃO - ELISA

RADIOIMUNOENSAIO - RIA

Moléculas marcadas com isótopo ( I 125 ,I 131 ) Marcações:

I125: emite raios gama H3: raios beta

Desvantagem manipulação de isótopo radioativo.

RADIOIMUNOENSAIO

• Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc.

• Vantagens:– Alta sensibilidade– Permite medidas rápidas e precisas– Limiar de detecção em nanogramas e picogramas.

• Desvantagens:– Custo– Vida média dos reagentes– Risco operacional (radiação)

RADIOIMUNOENSAIO