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TÉCNICAS MICROSCÓPICAS APLICADAS NA · PDF file Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária-EMBRAPA Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia-CNPAB TÉCNICAS MICROSCÓPICAS APLICADAS

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  • ISSN 0104-6187

    Ministrio da Agricultura e do AbastecimentoEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria-EMBRAPACentro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia-CNPAB

    TCNICAS MICROSCPICAS APLICADAS NA IDENTIFICAO E LOCALIZAODE BACTRIAS FIXADORAS DE NITROGNIO E BIOMACROMOLCULAS EM

    TECIDOS VEGETAIS

    CNPABSeropdica, RJ

    Julho/1998

  • ISSN 0104-6187

    M i n i s t r i o d a A g r i c ul t u r a e d o A b a s t e c i m e n t oE m p r e s a B r a s i l e i r a d e P e s q u i s a A g r o p e c u r i a - E M B R A P ACentro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia-CNPAB

    T C N I C A S M I C R O S C P I C A S A P L I C A D A S N A I D E N T I F I C A O E L O C A L I Z A OD E B A C T R I A S F I X A D O R A S D E N I T R O G N I O E B I O M A C R O M O L C U L A S E M

    T E C I D O S V E G E T A I S

    V . L . D . B a l d a n i , F . L . O l i v a r e s

    , S.R. Goi, R.A. da Silva,

    J . I . B a l d a n i & J . D b e r e i n e r

    C N P A BS e r o p d i c a , R J

    J u l h o / 1 9 9 8

  • Embrapa-CNPAB. Documentos, 50

    Exemplares desta publicao podem ser solicitadas Embrapa-CNPABAntiga Rodovia Rio/So PauloTelefone: (021)682-1086; (021)682-1500Fax: (021)682-1230Caixa Postal 7450523851-970 Seropdica, RJe-mail: [email protected]

    Comit de PublicaesSebastio Manhes Souto(Presidente)Johanna DbereinerJos Ivo BaldaniPaulo Augusto da EiraNorma Gouveia RumjanekDorimar dos Santos Felix(Bibliotecria)

    BALDANI, V.L.D.; OLIVARES, F.L.; GOI, S.R.; SILVA, R.A. da; BALDANI, J.I.;DBEREINER, J. Tcnicas microscpicas aplicadas na identificao elocalizao de bactrias fixadoras de nitrognio e biomacromolculas emtecidos vegetais. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, jul. 1998. 27p. (Embrapa-CNPAB. Documentos, 50).

    1. Bactria. 2. Fixao biologica de nitrognio(FBN). 3. Tecido vegetal. I. Olivares,F.L., colab. II. Goi, S.R., colab. III. Silva, R.A., colab. IV. Baldani, J.I., colab. V.Dbereiner, J., colab. VI. Embrapa . Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia(Seropdica, RJ). VII. Ttulo. VIIII. Srie.

    CDD 579.3 Embrapa

  • S U M R I O

    1. RESUMO..........................................................................................................................42. INTRODUO ................................................................................................................53. PREPARO DE AMOSTRAS DE TECIDOS VEGETAIS PARA MICROSCOPIA..........6

    3.1. FIXADORES..............................................................................................................73.2. RESINAS...................................................................................................................83.3. CORANTES/CONTRASTANTES..............................................................................93.4. ULTRAMICROTOMIA...............................................................................................9

    4. APLICAES COM O MICROSCPIO DE LUZ ..........................................................104.1. MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO....................................................................104.2. MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO, CONTRASTE DE FASE EINTERFERNCIA ...........................................................................................................114.3. MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA .................................................................124.4. OUTRAS TCNICAS DE MICROSCOPIA TICA E VIDEO-MICROSCOPIA .......13

    5. APLICAES AO MICROSCOPIO ELETRNICO ......................................................136. A IMUNOLOGIA E A MICROSCOPIA ...........................................................................167. A BIOLOGIA MOLECULAR E A MICROSCOPIA.........................................................188. CONSIDERAES FINAIS ...........................................................................................219. REFERNCIAS.............................................................................................................22

  • 4

    TCNICAS MICROSCPICAS APLICADAS NA IDENTIFICAO E LOCALIZAO DEBACTRIAS FIXADORAS DE NITROGNIO E BIOMACROMOLCULAS EM TECIDOS

    VEGETAIS

    V.L.D. Baldani1, F.L. Olivares2, S.R. Goi3, R.A. da Silva4, J.I. Baldani1 & J. Dbereiner1

    1. RESUMO

    Nenhuma ferramenta cientfica contribuiu tanto para o avano do conhecimento

    bsico e mudana de paradigmas em cincia como a microscopia. As primeiras

    observaes utilizando microscpios rudimentares datam do incio do sculo XXVII, e

    desde ento, com a evoluo de instrumentos e tcnicas, grande volume de informaes

    morfolgicas e ultraestruturais foram sendo acumuladas, contribuindo para o entendimento

    de muitos eventos biolgicos. Este trabalho, acompanhando a evoluo das tcnicas em

    microscopia tica e eletrnica, teve como objetivo relatar de forma sumria a gama de

    aplicaes e contribuies da microscopia ao estudo de bactrias fixadoras de nitrognio,

    passando pelas tcnicas descritivas mais bsicas de microscopia tica, envolvendo campo

    claro, contraste de fase e outras tcnicas de contraste, bem como tcnicas de colorao

    especfica e inespecfica. Ainda dentro da microscopia descritiva, o uso da microscopia

    eletrnica na identificao e descrio ultraestrutural de bactrias diazotrficas. Por fim,

    so relatadas tcnicas mais sofisticadas de imunologia e a biologia molecular, as quais

    capacitam o microscpio a gerar informaes mais completas que a simples localizao

    das bactrias no tecido vegetal, e envolvem o posicionamento taxonmico da bactria in

    situ, deteco especfica de uma estirpe especfica dentro do complexo microbiano,

    deteco da expresso de genes e biomacromolculas (enzimas, carboidratos) envolvidas

    1 Pesquisadores Ph.D., da Embrapa Agrobiologia, km 47, Caixa Postal 74505, CEP: 23851-970 Seropdica, RJ e-mail: [email protected]

    2 Bolsista da categoria Recm-Doutor do CNPq3 Professora Adjunta do Departamento de Cincias Ambientais da UFRRJ4 Bolsista de Iniciao Cientfica PIBIC/CNPq

  • 5

    na interao diazotrfico-planta (p. ex. nitrogenase). Paralelo ao avano na obteno de

    conhecimento na rea, avanos significativos na aquisio e processamento de imagens

    garantem o sucesso na qualidade das imagens documentadas.

    2. INTRODUO

    Desde sua inveno a cerca de quatrocentos anos atrs, o microscpio tem

    desempenhado um papel fundamental na explorao de amostras orgnicas e

    inorgnicas, tornando-se uma ferramenta indispensvel na pesquisa cientfica. Ao longo

    deste perodo, com evoluo do conhecimento cientfico bsico em fsica tica e a

    expanso dos campos de aplicao de microscopia nas reas biolgicas e de materiais,

    tanto no campo da microscopia tica como na microscopia eletrnica foram desenvolvidos

    instrumentos cada vez mais poderosos, uma gama de tcnicas de contraste, que aliadas

    ao surgimento de software e acessrios para processamento e anlise de imagem,

    tornaram a microscopia uma ferramenta imprescindvel na cincia moderna.

    Muitas das tcnicas microscpicas atualmente aplicadas na compreenso da

    interao entre plantas e bactrias fixadoras de nitrognio foram previamente

    desenvolvidas para resoluo de problemas na rea biomdica, sendo introduzidas no

    campo da microbiologia do solo com poucas modificaes e grande sucesso. Atualmente,

    a microscopia caminha lado a lado com uma gama de tcnicas imunolgicas a de biologia

    molecular, o que amplia tremendamente as informaes obtidas ao microscpio. O

    sucesso desta unio de tcnicas resulta na possibilidade de deteco especfica da

    bactria ou de seus componentes estruturais bem como componentes do tecido vegetal,

    enriquecendo sobremaneira as informaes de morfologia e ultraestrutura. A deteco

    fundamentada em mtodos imunolgicos baseia-se na habilidade de anticorpos

    reconhecerem estruturas tridimensionais especficas (partes de protenas ou

    polissacardeos) de biomacromolculas presentes na superfcie ou citoplasma da bactria.

    J, a deteco baseada em mtodos de biologia molecular determinada pelo

    pareamento especfico de fitas cidos nuclecos com bases complementares.

    Este trabalho tem como objetivo avaliar de forma sumria, a contribuio da

    microscopia per si ou associada a tcnicas imunolgicas e de biologia molecular para o

  • 6

    estudo de fitobactrias fixadoras de nitrognio, procurando abordar dentro de uma

    seqncia cronolgica, desde as tcnicas mais simples, quelas mais sofisticadas e de

    maior poder informativo.

    3. PREPARO DE AMOSTRAS DE TECIDOS VEGETAIS PARA MICROSCOPIA

    Durante os primrdios do desenvolvimento do microscpio eletrnico (1930-

    1940), as observaes eram limitadas a materiais muito pequenos ou naturalmente finos.

    Com a necessidade de maiores conhecimentos sobre o funcionamento e localizao de

    organelas e compostos celulares, tcnicas de preparo bsico de materiais biolgicos

    foram desenvolvidas, tais como fixao e ultramicrotomia.

    Uma das primeiras tcnicas de sucesso a revelar a estrutura celular foi a tcnica

    de sombreamento, desenvolvida por Willians & Wyckoff (1946) que consiste na cobertura

    da amostra em estudo, com metais pesados ou de alta densidade como o urnio, ouro ou

    paldio. Esta tcnica foi primeiramente utilizada para a observao de cloroplastos

    isolados e para a visualizao de microfibrilas de celulose da parede celular de clulas

    vegetais. Ainda hoje tem sido aplicada nos estudos da geometria dos

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