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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE E
FUNCIONALIDADE DO INTESTINO UTILIZADAS NA CIÊNCIA
ANIMAL
Fernanda Vieira Castejon
Orientador: Prof. Dr. José Henrique Stringhini
GOIÂNIA
2011
ii
FERNANDA VIEIRA CASTEJON
TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE E
FUNCIONALIDADE DO INTESTINO UTILIZADAS NA CIÊNCIA
ANIMAL
Seminário apresentado junto à disciplina
Seminários Aplicados do Programa de Pós-
graduação em Ciência Animal da Escola de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás
Nível: Mestrado
Área de concentração:
Produção animal
Linha de pesquisa:
Metabolismo nutricional, alimentação e
forragicultura na produção animal
Orientador:
Prof. Dr. José Henrique Stringhini – EVZ/UFG
Comitê de orientação:
Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição – FF/UFG
Prof. Dra. Elisabeth Gonzales – EVZ/UFG
GOIÂNIA
2011
iii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................ 2
2.1 AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE INTESTINAL ............................................... 2
2.1.1 Avaliação da diferenciação e desenvolvimento ........................................... 2
2.1.2 Avaliação dos fatores endógenos que regulam o desenvolvimento e
crescimento intestinal ............................................................................................. 9
2.2 AVALIAÇÃO DA FUNCIONALIDADE ............................................................ 12
2.2.1 Avaliação dos parâmetros físico-químicos ................................................ 12
2.2.2 Avaliação da permeabilidade intestinal ..................................................... 14
2.2.3 Avaliação das proteínas da parede intestinal ............................................ 16
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 19
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 20
1 INTRODUÇÃO
Pesquisadores da ciência animal têm um objetivo comum, que é o
de manter a integridade física, funcional e comportamental dos animais. Isso é
obtido por meio de um conjunto de ações e fatores interdependentes que vão
desde o período anterior ao nascimento (melhoramento genético e qualidade
das matrizes) à nutrição e ambiência adequadas.
Na produção animal, para que se obtenha os melhores resultados
zootécnicos (menor mortalidade, melhor conversão alimentar e menor tempo
de criação até o abate), o perfeito funcionamento intestinal é necessário. A
integridade física e funcional da parede intestinal dos animais é um dos
principais fatores a serem considerado na produção, pois se deve associar
essa integridade intestinal a correta digestão dos alimentos e absorção dos
nutrientes.
Além das funções de digestão e absorção, outra função não menos
importante do epitélio intestinal, é a de proteção. O epitélio intestinal possui a
capacidade de impedir que substâncias indesejáveis como microorganismos e
toxinas presentes no lúmen intestinal atravessem a mucosa e atinjam tecidos e
órgãos.
A integridade da mucosa intestinal é mantida por dois fatores
principais. O primeiro deles é a própria camada contínua de células que
íntegras constituem uma forte barreira. O segundo é a camada de muco
produzido pelas células caliciformes que recobre as células intestinais.
Há necessidade que os estudos feitos por pesquisadores da área de
produção animal elucidem os princípios básicos morfológicos e fisiológicos dos
animais para que se possa obter, de fato, o controle completo de todos os
fatores envolvidos.
Existem algumas técnicas desenvolvidas e que estão
constantemente sendo aprimoradas para avaliar o intestino e auxiliar na
compreensão de processos que ocorrem no mesmo.
Objetivou-se elucidar alguns fatores que afetam a integridade
intestinal, assim como especificar as metodologias mais utilizadas na ciência
animal para avaliações dos mesmos.
2
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE INTESTINAL
2.1.1 Avaliação da diferenciação e do desenvolvimento
As células que compõem o epitélio intestinal são formadas nas
criptas através de divisões mitóticas de células totipotentes. Essas células
produzidas migram ao longo da membrana basal até o topo da vilosidade, e
durante esse processo amadurecem. Já no topo da vilosidade, ocorre a
apoptose da célula que é então descartada no lúmen intestinal (JEURISSEN et
al., 2002). O processo de extrusão de células no ápice dos vilos ocorre,
também, em decorrência do atrito com o bolo alimentar, presença de toxinas e
microorganismos com potencial patogênico (MAIORKA et al., 2002).
O processo de absorção de nutrientes é totalmente dependente dos
mecanismos que ocorrem na mucosa intestinal. Desta forma, a integridade não
pode ser comprometida, pois influencia diretamente a produtividade dos
animais, devendo permanecer saudável e funcional por toda a vida (SANTOS,
2010).
O desenvolvimento intestinal consiste basicamente da associação
entre a renovação celular e a perda de células. O equilíbrio entre esses dois
processos denomina-se turnover celular.
O desenvolvimento e diferenciação intestinal podem ser avaliados
por diversas técnicas, variando de algumas bastante específicas a outras que
devem ser realizadas em conjunto com outras técnicas para que seja possível
apresentar resultados confiáveis.
Uma das técnicas utilizadas é a quantificação do ácido ribonucléico
(RNA), ácido desoxirribonucléico (DNA) e proteínas totais. A dosagem de RNA
é indicadora da capacidade de síntese protéica, e a de DNA é indicadora da
proliferação celular do epitélio (BAGALDO et al., 2006).
A quantidade de proteína por célula é verificada pela relação
proteína/DNA. A concentração de RNA e proteínas pode aumentar, mesmo
mantendo constante o número de células. A esse estado denomina-se
hipertrofia da mucosa (MAIORKA et al., 2002).
3
FURLAN (2008) afirmou que o mecanismo de secreção de enzimas
e transportadores de membrana depende de estímulos para ativar a transcrição
de genes, os quais pelo processo de tradução sintetizam as enzimas
envolvidas na digestão e absorção de nutrientes.
As concentrações de DNA, RNA e suas relações com o conteúdo de
proteína passam por uma variação natural durante o desenvolvimento do trato
gastrointestinal específicos para cada espécie.
De acordo com MAIORKA et al., (2002) o método mais comumente
utilizado para essa avaliação é a incorporação de 3H-timidina (isótopo
radioativo) ao DNA e quantificados através de auto-radiografias ou
radioautografia. Porém, trabalhos que utilizam essa técnica, em sua maioria,
não a utilizaram com a finalidade de quantificar DNA e RNA.
GARTNER & HIATT (2003) descrevem a técnica de radioautografia,
e afirmam ser um método útil para localização e o estudo de uma seqüência
temporal de eventos. WHEBY et al. (1963) utilizaram a técnica de
radioautografias para verificar a absorção intestinal de ferro em ratos.
GERSHON et al., (1965) também utilizaram a técnica, porém para avaliar a
síntese e liberação de serotonina pelo plexo mioentérico do intestino de ratos
(Figura 1).
FIGURA 1 - Radioautografias do plexo mioentérico do intestino de ratos. Seqüência temporal (A e B). O acúmulo de grãos prata que indica presença de serotonina tituláveis em torno de células ganglionares(G). Fonte: GERSHON et al. (1965)
4
O elemento que se deseja estudar é radiomarcado (etapa de
incorporação) e é injetado no animal. Fragmentos do tecido em estudo são
colhidos em vários intervalos de tempo. A lâmina de vidro é recoberta com uma
fina camada de emulsão radiográfica. Posteriormente, a lâmina é colocada em
uma caixa escura por alguns dias ou semanas, durante os quais partículas
emitidas pelo isótopo radioativo atingem a emulsão nos locais da célula em que
o isótopo está localizado. A emulsão é revelada e fixada por técnicas
fotográficas e pequenos grãos de prata fixam-se nas porções expostas da
emulsão. O espécime é então lacrado com uma lamínula e observado em
microscópio óptico (GARTNER & HIATT, 2003). Provavelmente, o menor uso
dessa técnica, atualmente, é devido à descoberta de novas técnicas com maior
rapidez e facilidade de execução, e que não necessitem de instalação
específica para uso de material radioativo.
Os métodos que utilizam o espectrofotômetro para quantificação de
DNA e RNA são os mais utilizados. BAGALDO et al. (2006) realizaram
experimento para comparar o desenvolvimento dos segmentos jejuno e íleo do
intestino delgado de bezerros com o uso de indicadores de atividade celular
(DNA, RNA e proteína) e pela expressão do gene do IGF-I (“insuline like growth
factor”) e de seu receptor. Para extração do DNA um grama de tecido foi
homogeneizado em 19 mL de água deionizada, e após seguiu-se a
metodologia de LABARCA & PAIGEN (1980) que utilizaram o
espectrofotômetro calibrado para diferentes comprimentos de ondas. Para a
quantificação da proteína total, retirou-se 1mL do homogenato, sendo feita a
determinação segundo o método de LOWRY et al. (1951). A utilização dessas
técnicas possibilitou a conclusão, pelos autores, de que as porções do intestino
delgado, jejuno e íleo, apresentam diferenças temporais no seu
desenvolvimento.
BAGALDO et al. (2007) determinaram o DNA total do jejuno, íleo e
fígado de bezerros para verificar a ação do IGF-I presente no colostro de vacas
tratadas com o hormônio somatrotopina recombinante bovina (rbST). A
determinação do DNA e RNA foi realizada pelas mesmas metodologias já
citadas. Através das respostas dos indicadores de atividade celular intestinal e
hepática, os autores sugeriram a importante participação do IGF- I na
maturação celular e no comportamento da primeira geração de enterócitos.
5
Outra técnica, utilizada para identificação do material genético
celular, é a reação em cadeia da polimerase (PCR). A técnica básica foi sendo
modificada para diferentes finalidades, fazendo com que hoje existam diversos
tipos de protocolos. O PCR em tempo real, por exemplo, pode quantificar a
expressão gênica. Em humanos, é bastante utilizada na pesquisa de doenças e
câncer de intestino (DYDENSBORG et al., 2006). HOUGHTON & COCKERILL
(2006) publicaram uma revisão sobre a técnica relatando também várias
aplicações da mesma, inclusive a possível aplicação para avaliação intestinal.
LEHMANN & KREIPE (2001) fizeram algumas considerações sobre
a técnica de PCR em tempo real para a quantificação de DNA e RNA em
tecidos já fixados com formalina e embebidos em parafina, o que é bem útil
quando se faz análises conjuntas de um mesmo material por diferentes
técnicas.
A avaliação do intestino através de cortes histológicos e mensuração
de parâmetros morfométricos é, sem dúvida, a técnica mais utilizada nos
trabalhos feitos para avaliação intestinal, principalmente na ciência animal. É
uma técnica simples, barata e que oferece bons resultados para avaliação.
O desenvolvimento da mucosa intestinal é avaliado por meio de
dados morfométricos do tamanho e número de vilos, da profundidade das
criptas, da altura do epitélio, da altura e número de microvilos do enterócito e
da integridade da mucosa ou perda de epitélio (STERZO, 2007).
Quando o intestino responde a algum agente com desequilíbrio da
relação de extrusão e proliferação, ocorre modificação na altura dos vilos. O
número e o tamanho dos vilos dependem do número de células que o
compõem. Assim, quanto maior o número de células, maior o tamanho do vilo,
e por conseqüência, maior é a área de absorção de nutrientes. No geral, a
maior altura de vilos e relação vilo/cripta estão associadas com uma boa
diferenciação da mucosa intestinal (JEURISSEN et al., 2002). Criptas menos
profundas indicam melhor estado de saúde intestinal (VIOLA & VIEIRA, 2007).
SCHEEMAN et al. (1982) sugeriram que vilos curtos (relativo a profundidade de
cripta) tem menos células absortivas e mais células secretórias.
Outro fator relevante para a absorção dos nutrientes na membrana
luminal é a quantidade de microvilos existentes nos enterócitos. Os microvilos
são modificações do plasmalema apical das células epiteliais que recobrem as
6
vilosidades intestinais (GARTNER & HIATI, 2003). O número de microvilos atua
como um amplificador de área para a absorção dos nutrientes (MAIORKA et
al., 2002).
As metodologias utilizadas para confecção das lâminas histológicas
para visualização em microscópio óptico já são consolidadas e variam entre si
de acordo com protocolos dos laboratórios nos quais é feito o processamento
do material. Fragmentos do duodeno, jejuno e íleo são coletados e
imediatamente lavados com solução fisiológica e fixados, na maioria dos
protocolos, em solução de Bouin por 24 horas. Passam pelas etapas de
desidratação em álcool, diafanização ou clareamento por xilol e inclusão em
parafina. São feitos cortes com micrótomo que, posteriormente, são corados.
Quanto à coloração, SILVA et al. (2010) em análise dos efeitos da
infecção causada pelo Toxoplasma gondii sobre a parede do duodeno de
gatos, utilizaram em seu experimento diferentes corantes, sendo o Azan para
evidenciação de fibras colágenas, o Tricrômico-Mallory para detecção das
células de Paneth. Já o Ácido Periódico de Schiff (PAS) é indicado para
detecção de mucinas neutras e sialomucinas lábeis. O Alcian- Blue (AB) pH 2,5
para detecção de sialomucinas e sulfomucinas e Alcian-Blue (AB) pH 1,0 para
detecção das sulfomucinas. Um dos resultados encontrados por SILVA et al.
(2010), foi que na avaliação qualitativa, as fibras colágenas ocupavam uma
área dos estratos da parede intestinal visivelmente maior, o que sugere que
estejam aumentadas no grupos infectados (Figura 2).
FIGURA 2 - Cortes transversais, corados com Azan, de 3 µm da parede do duodeno de gatos. Evidência de fibras colágenas envolvendo glândulas duodenais. Gatos hígidos (esquerda) e submetidos à infecção pelo Toxoplasma gondii (direita). Fonte: Adaptado de SILVA et al. (2010).
7
A coloração para a análise morfométrica é feita com os corantes
hematoxilina e eosina (HE) que são de utilização rotineira na avaliação
histológica de tecidos. Pode-se, também, quantificar linfócitos intraepiteliais.
A hematoxilina cora preferencialmente os componentes ácidos da
célula com tonalidade azulada. Como o DNA e o RNA, o núcleo e as regiões do
citoplasma ricas em ribossomos coram-se em azul-escuro, estes componentes
são ditos basófilos. A eosina é um ácido que cora os componentes básicos da
célula com uma cor rósea. Como muitos dos componentes citoplasmáticos têm
pH básico, várias regiões do citoplasma se coram em rosa, estes elementos
são ditos como acidófilos (GARTNER & HIATT, 2003).
A avaliação é feita a partir de imagens dos cortes corados com HE,
capturadas com o auxílio de uma câmera digital acoplada a um microscópio de
luz. São efetuadas medidas, em micrômetros, de vilosidades e profundidade de
cripta. As medidas de altura das vilosidades são tomadas a partir da região
basal. A medida de profundidade das criptas é realizada da base até a região
de transição cripta-vilo.
FASINA et al. (2010) estudaram a influência da infecção por
Salmonella enterica Sorovar Typhimurium nas células caliciformes e na
morfologia de vilos intestinais de frangos de corte. Determinaram a densidade e
o tamanho das células caliciformes, além dos tradicionais parâmetros
morfométricos. A densidade foi definida pelo número de células PAS ou Alcian
blue (ALB) positivas por mm2 de superfície quadrada do vilo (Figura 3).
A segunda barreira de proteção da integridade do epitélio intestinal é
o muco. O muco é produzido por células caliciformes, glândulas unicelulares,
que se encontram entre as células epiteliais. O duodeno tem o menor número
de células caliciformes e seu número aumenta ao se aproximar do jejuno.
Essas células produzem mucinógeno, cuja forma hidratada constitui a mucina,
um componente do muco (GARTNER & HIATT, 2003).
É composto por glicosaminoglicanas que protegem o vilo, ou até
mesmo participam do processo absortivo através das proteínas ligadoras de
cálcio (MACARI et al. 1994). O aumento da proliferação celular na cripta pode
alterar o número de células caliciformes e podem mudar a composição da
mucina e propriedades físico-químicas do muco.
8
A determinação do número de células caliciformes é uma técnica
estabelecida usando segmentos intestinais corados com Alcian blue e ácido
periódico Schiff (PAS). Embora a alta densidade de células caliciformes pode
resultar em um aumento da secreção de mucina, o número de células
caliciformes não pode ser usado para quantificar a secreção de mucina, que
necessita de análise específica.
A biometria dos órgãos que compõem o sistema digestório é outra
metodologia utilizada para avaliação do desenvolvimento intestinal expressa
pelo comprimento e peso relativo. O peso do intestino grosso é dado pela soma
do peso dos cecos (aves), cólon e reto. O peso e comprimento do intestino
delgado são medidos da porção compreendida entre o piloro e a junção íleo-
ceco-cólica (LEITÃO, 2007).
ROCHA (2009) avaliou a inclusão de glicomanano esterificado em
rações para frangos contendo milho ou sorgo contaminado por fungos, e fez a
biometria dos órgãos do aparelho digestório das aves. Obteve resultados
diferentes dos relatados na literatura. O autor sugere que a avaliação somente
dos dados de peso dos órgãos não constitui em bom indicador de avaliação do
efeito de grãos de diferentes tipos e qualidades na ração.
FIGURA 3 – Vilosidades do jejuno coradas em PAS, ALB e HE, respectivamente. ME: camada epitelial da mucosa; VLP: lâmina própria. 1) Células coradas em rosa são PAS positivas; 2) Células coradas em azul são ALB positivas. 3) a- altura do vilo; b- largura do vilo; c- profundidade de cripta. Fonte: Adaptado de FASINA et al. (2010)
9
Portanto, avaliação qualitativa e quantitativa da perda do epitélio é
muito importante, tendo em conta que permitem uma avaliação confiável da
capacidade digestiva e absortiva do intestino, além da avaliação dos danos
causados à mucosa intestinal por agentes patogênicos ou jejum.
Para avaliação qualitativa da mucosa intestinal, tem-se usado a
técnica de microscopia eletrônica de varredura. Usada para observar a
superfície de um espécime sólido, obtendo uma imagem tridimensional do
objeto. O material a ser observado é preparado de um modo especial que torna
possível o depósito de uma delgada camada de metal pesado (ouro, paládio,
ósmio, etc.) sobre a superfície do espécime.
O microscópio emite um feixe de elétrons que varre a superfície do
objeto. Alguns elétrons são refletidos diretamente, mas outros são emitidos
pela cobertura de metal pesado. Ambos são capturados por detectores de
elétrons e essas diferenças são interpretadas e mostradas em um monitor
como uma imagem tridimensional. Pode ser acoplado a um computador para
armazenar as imagens obtidas (GARTNER & HIATT, 2003).
GOMIDE JUNIOR et al. (2004) realizaram, com microscopia
eletrônica, estudo sobre a estrutura do duodeno, jejuno e íleo de frangos de
corte que passaram por período de restrição hídrica e alimentar. Com as
imagens obtidas, fizeram classificação por escore das lesões através das
imagens obtidas. Assim, o número de vilosidades com perda de epitélio foi
expressa como porcentagem do número total de vilosidades, considerando
cada grau de perda do epitélio. Desta forma puderam não só qualificar quanto
quantificar as lesões (Figura 4).
2.1.2 Avaliação de fatores endógenos que regulam o desenvolvimento e
crescimento intestinal
Estudos relacionados ao controle do crescimento e renovação da
mucosa intestinal têm sido feitos, principalmente, em relação aos efeitos
modulatórios dos peptídeos secretados na mucosa. Os peptídeos são
produzidos por células enteroendócrinas e têm ação regulatória sobre o
desenvolvimento da mucosa.
10
Dentre esses peptídeos incluem-se os fatores de transformação do
crescimento (“transforming growth factor”) – TGF, sendo os mesmos TGF-,
TGF- e IGF (“insuline like growth factor”). O TGF-é estimulador da
proliferação celular e o TGF- potente inibidor da proliferação das células
intestinais indiferenciadas. As evidências de participação desses peptídeos no
processo regulatório são claras, pois o TGF- é encontrado em grandes
concentrações nas células não proliferativas dos vilos. Por outro lado, a
expressão do TGF- tem sido verificada em maior concentração nas células da
cripta (MAIORKA et al., 2002).
Como a maioria dos fatores de crescimento, o IGF-I é produzido
amplamente pelo organismo e é liberado assim que é sintetizado, diferindo da
FIGURA 4 – Micrografia eletrônica de varredura de intestino de frangos. Níveis de perda epitelial das vilosidades intestinais. A) graus 0 e 1; B) grau 2; C) grau 3; D) grau 4; E) grau 5; F) grau 6. Fonte: Adaptado de GOMIDE JUNIOR et al. (2004)
11
maioria dos hormônios clássicos que são armazenados em grânulos secretores
(BAGALDO et al., 2006). A síntese do IGF-I é difusa, porém o fígado é a maior
fonte do peptídeo circulante (MURPHY et al., 1987).
Em aves, o receptor do IGF é expresso na maioria dos tecidos. No
intestino, é expresso na região da submucosa e células da cripta. A quantidade
de receptor de IGF diminui com o avançar da idade (JEURISSEN et al., 2002).
Os níveis séricos de IGF podem ser detectados em radioimuno
ensaios (RIE). KINDLEIN et al. (2008) realizou ensaio imunoradiométrico
utilizando kit comercial para quantificação da concentração de IGF-I no
colostro.
O radioimunoensaio é uma reação de ligação competitiva, na qual
uma quantidade fixa de antígeno radio-marcado e antígeno da amostra
competem por um número limitado de sítios de ligação de anticorpos
específicos. Ambos os antígenos, marcado e não marcado, ligam-se ao
anticorpo e formam complexos precipitáveis. Os antígenos marcados livres e
os ligados ao anticorpo são separados por centrifugação, decantação, etc. para
mensurar a radioatividade dos radioisótopos ligados. A concentração de
antígeno nas amostras testadas é inversamente proporcional à quantidade de
radioatividade na fração ligada (STEINBECK & WYNER, 1993).
O RIE possui alta sensibilidade para detectar antígenos em
concentrações picomolares ou inferiores. É prático, pois na maioria dos kits de
RIE os tubos já possuem forração com o anticorpo específico, diminuindo
assim a quantidade de pipetagens a serem realizadas e facilitando o processo
de separação (STEINBECK & WYNER, 1993).
As desvantagens deste método são que a utilização do radioisótopo
de iodo, 125I, exige licença e instalações adequadas para sua manipulação e
descarte, ocasionando ainda, problemas de armazenamento e, principalmente,
o perigo de exposição à sua radiação (REGHELIN, 2007).
Outra técnica que pesquisadores utilizam para mensurar IGF é a
quimioluminescência. TSE et al. (2010), avaliando a adição de proteínas
lácteas e zinco suplementar em leitões desmamados, analisaram as
concentrações séricas de IGF-I pelo método de quimioluminescência com kits
comerciais.
12
Vários sistemas estão disponíveis comercialmente com a finalidade
de dosar hormônios, drogas e outras substâncias presentes em baixos níveis
em fluidos orgânicos. Esses métodos utilizam um anticorpo ligado a um
marcador quimioluminescente ou luminescente (luciferina, luciferase, luminol e
outros). A energia excedente é dissipada na forma de radiação
eletromagnética, diferente do que a maioria das reações exotérmicas, onde a
dissipação é na forma de calor ou exitação rotacional ou vibracional (SANTOS
et al., 1993)
Segundo REGHELIN (2007), as principais vantagens da
quimioluminescência em relação ao RIE são a ausência do risco de
contaminação radioativa tanto pessoal quanto ambiental e o fato de não serem
necessárias licenças para que sejam realizados. Porém, possui menor
sensibilidade, ocorrem problemas na leitura de algumas amostras e há
necessidade de ambiente refrigerado, pois os reagentes só atuam
adequadamente em baixas temperaturas.
2.2 AVALIAÇÃO DA FUNCIONALIDADE
2.2.1 Avaliação dos parâmetros físico-químicos
A viscosidade e o pH do conteúdo intestinal são os principais
parâmetros físico-químicos avaliados, pois podem interferir nos processos
digestivos e absortivos.
A viscosidade da dieta é fator importante principalmente em animais
não ruminantes. Dietas que contém grandes quantidades de polissacarídeos
não amiláceos (PNAs) solúveis apresentam maior viscosidade. São dietas
formuladas com trigo, aveia, centeio e outros cereais.
MEURER & HAYASHI (2003) relataram que a diminuição do
desempenho animal relacionado ao aumento dos níveis de PNAs na ração é
consequência da influência destes elementos sobre a digestão. Ocorre menor
digestibilidade dos nutrientes e energia, além de diminuição da ingestão de
matéria seca. Há aumento da demanda energética com o aumento da
produção de secreções digestivas, aumento do tamanho dos órgãos do trato
13
gastrointestinal e maior taxa de renovação celular, quando o organismo faz
modificações adaptativas às rações com altos níveis de PNAs. O aumento da
viscosidade do bolo alimentar dificulta o acesso das enzimas aos substratos e
dos alimentos digeridos à borda do intestino (BEDFORD, 1996).
JEURISSEN et al. (2002) afirmaram que o aumento da viscosidade
intraluminal pode limitar a mistura de nutrientes da dieta com enzimas
pancreáticas e ácidos biliares. Além disso, também aumenta a espessura da
camada aquosa estacionária que recobre as células da mucosa. As duas ações
limitam, respectivamente, a digestão e absorção de nutrientes.
Os mesmos autores ainda acrescentam que o crescimento de
determinados microorganismos pode ser favorecido, já que a redução da
mistura diminui a oxigenação do conteúdo intestinal. Há aumento na velocidade
de passagem, com dietas contendo PNA insolúvel,que também pode interferir
no equilíbrio da microbiota intestinal.
A medida da viscosidade da dieta é feita por uma técnica
estabelecida por BEDFORD & CLASSEN (1993) em que há coleta e
centrifugação do conteúdo do intestino delgado, com a viscosidade do
sobrenadante sendo determinada por um viscosímetro. A limitação dessa
técnica é a quantidade de digesta. Após a centrifugação deve haver quantidade
suficiente de sobrenadante para avaliar a viscosidade.
O pH intestinal aumenta da extremidade oral para aboral e o pH de
cada segmento é regulado pela atividade secretória do próprio segmento. A
produção bacteriana de metabólitos ácidos diminui o pH no papo, ceco e cólon.
Essa alteração do pH ao longo do trato gastrointestinal é necessária para que
atividade enzimática seja ótima para os grupos enzimáticos presentes em cada
segmento.
Modificação no pH da dieta pode, além de interferir na atuação
enzimática, alterar também a absorção, já que alguns mecanismos de
absorção ativa dependem de potenciais iônicos. A absorção de minerais, assim
como o tamanho dos complexos minerais também podem ser alterados
(JEURISSEN et al., 2002).
A determinação do pH é simples, e pode ser feita na mesma fração
aquosa na qual a viscosidade é medida.
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CALAÇA (2009) ao pesquisar ácidos orgânicos para controle de
Salmonella enteritidis, mensurou o pH intestinal utilizando a metodologia
descrita por SILVA et al. (2000), em que os conteúdos do intestino e cecos
foram colhidos, diluídos 15 mL em água destilada, homogeneizados por 30
minutos, deixado em descanso por 5 minutos e determinado o pH.
A determinação do pH utiliza o peagâmetro digital. O principio de
funcionamento desse equipamento é a quantificação de íons H+ devido à
diferença de potencial entre a substância na qual o pH está sendo medido e à
solução padrão presente dentro do eletrodo.
2.2.2 Avaliação da permeabilidade intestinal e turnover
A permeabilidade intestinal (PI) está relacionada com a capacidade
da mucosa intestinal em permitir a passagem de moléculas para a corrente
sanguínea (MENDONÇA et al., 2009), por difusão (JEURISSEN et al., 2002).
As técnicas estudadas são capazes de estimar a permeabilidade
intestinal através da administração oral de açúcares que não são
metabolizados, e posteriormente são determinados em fluidos biológicos,
principalmente na urina. Os açúcares mais utilizados, segundo JEURISSEN et
al. (2002) são L-rhamnose, manitol, lactulose, 3-O-metilglicose, porém outros
monossarídeos e dissacarídeos são utilizados.
STEINER et al. (2000) descrevem, na introdução de seu trabalho
para avaliação da permeabilidade em caninos, os principais tipos de transporte.
Acredita-se que há dois tipos de transporte que permitem a passagem de
moléculas de maneira passiva pela mucosa gastrointestinal. Poros menores
estão localizados entre as células da parede intestinal (diâmetro máximo de 0,4
nm) permitindo a passagem de moléculas pequenas (massa molecular 150-185
Da) como os monossacarídeos. A freqüência desses poros transcelulares é
maior e é mais dependente da área de superfície da mucosa intestinal.
Poros maiores com raios máximos de diâmetro de aproximadamente
0,5 a 0,8 nm permitem a penetração de moléculas maiores, como o Cr-EDTA e
dissacarídeos (aproximadamente 340 Da). Esses poros estão localizados na
15
área das junções celulares (“tight junctions”). A freqüência desses poros
paracelulares é bem menor e muito dependente da integridade da mucosa.
O método mais aceito para verificação da integridade da barreira
intestinal é o teste de manitol (monossacarídeo) e lactulose (dissacarídeo) que
são transportados por caminhos transcelular e paracelular, respectivamente.
Através da razão lactulose/manitol (L/M) infere-se as condições da
permeabilidade intestinal (MENDONÇA et al., 2009).
Em processos patológicos do intestino delgado, as junções
paracelulares podem permitir a passagem de moléculas maiores, levando ao
aumento da permeabilidade dos marcadores dissacarídeos. Geralmente estão
associados a diminuição da área de superfície, levando a diminuição da
permeabilidade a marcadores monossacarídeos (STEINER et al., 2000).
Para medir a presença dos açúcares na urina muitos métodos já
foram desenvolvidos e validados. Há relatos do uso de cromatografia líquida de
alta eficiência, ensaio imunoenzimático, espectrometria de massas (LEE &
CHUL CHUNG, 2006) e cromatografia gasosa. MENDONÇA et al. (2009)
desenvolveram um protocolo de cromatografia gasosa que permite medir
adequadamente a presença de manitol e lactulose em amostras biológicas,
comprovando ser um excelente método para explorar a permeabilidade
intestinal normal e em condições patológicas. É mais realizada em humanos e
em animais nos quais a urina é facilmente coletada. Em aves, há limitação ao
uso dessa técnica, devido à produção de excretas. Entretanto, é possível que
seja realizada utilizando sondas nas aves (JEURISSEN et al., 2002).
A integridade intestinal também pode ser avaliada in vitro. A
vantagem é que pode-se investigar a permeabilidade de diferentes regiões
intestinais, e há a possibilidade de eliminar a interferência de outros fatores que
não sejam o objeto de estudo, já que as condições experimentais podem ser
controladas e monitoradas.
São estudos que utilizam a metodologia semelhante à realizada por
WAGNER & GALEY (2003). Os autores fizeram análise cinética do transporte
de hexoses para determinar a cinética de absorção de medicamentos.
Para avaliação do turnover intestinal e da taxa metabólica dos
tecidos, técnicas que utilizam isótopos estáveis estão sendo cada vez mais
usadas. Os isótopos são átomos de um mesmo elemento químico que
16
possuem mesmo número de prótons, mas diferente número de nêutrons.
Características que fazem com que tenham propriedades físicas distintas, mas
as mesmas propriedades químicas. São ditos estáveis por não emitirem
radiação. Para mensuração das diferenças de proporção entre isótopos nos
tecidos, após preparação do material, utiliza-se espectrômetro de massa
(BORDINHON, 2008).
CALDARA et al., 2010 afirmaram que dietas isotopicamente distintas
podem ser usadas para medir taxas de turnover nos tecidos do animal. Após a
troca de dieta, a mudança na composição isotópica do tecido depende de quão
rápido esses constituintes são assimilados.
Tecidos com rápido metabolismo refletem dietas recentes, enquanto
aqueles com baixo turnover metabólico representam dietas consumidas há
mais tempo. Esses autores avaliaram a influência da glutamina sobre o
turnover do carbono da mucosa intestinal de leitões desmamados.
PELÍCIA et al. (2011) utilizando também isótopos estáveis de
carbono, avaliaram o efeito da dieta suplementada com nucleotídeos sobre
taxa de turnover da mucosa intestinal de frangos antes e após lesões causadas
por coccidiose.
2.2.3 Avaliação das proteínas da parede intestinal
A camada de muco presente no trato gastrointestinal, como já
mencionado, é secretada pelas células caliciformes e é fundamental na
manutenção da integridade e saúde intestinal. As propriedades funcionais das
mucinas são a lubrificação das superfícies epiteliais, formação da barreira de
difusão para nutrientes, proteção contra microorganismos patogênicos e
interação com o sistema imune.
Várias técnicas foram desenvolvidas e modificadas durante os anos
para mensurar a secreção de muco. Variam de testes inespecíficos até
imunoensaios para quantificação de determinadas proteínas mucinas. Os
ensaios de proteína por espctofotometria permitem a quantificação da proteína
total do muco dentro de uma área específica do intestino, mas sem a
especificidade da origem dessa proteína.
17
Técnicas colorimétricas são formas específicas para medir as
glicoproteínas que são presentes em uma amostra a partir de superfícies
epiteliais. Além disso, são uma forma muito barata para determinar a
quantidade e composição do muco.
SHIRAISHI et al. (2009) estudaram a dinâmica de mucinas
secretadas no íleo de frangos infectados por Toxoplasma gondii. Utilizaram o
protocolo descrito por MYERS et al. (2008), no qual foi quantificado o número
de células caliciformes presentes em 0,3 mm2 de túnica mucosa de cada
animal. Essa análise foi realizada com lâminas submetidas às técnicas
histoquímicas para detecção de glicoconjugados (PAS, AB pH 2,5 e AB pH
1,0).
A composição de mucinas em condições patológicas é expressa
pela alteração na relação entre mucinas neutras, sulfatadas e sialomucinas. No
estudo de SHIRAISHI et al. (2009) houve somente alteração no perfil
secretório de mucinas neutras. Sugere-se que o aumento da secreção de
mucinas neutras nos grupos infectados tem a finalidade de deixar mais denso o
muco que recobria o epitélio, no intuito de protegê-lo da abrasão que
normalmente ocorre durante a diarréia que foi observada nesses animais.
MONTAGNE et al. (2000) propuseram um teste de ELISA (Enzyme-
Linked Immunoabsorbent Assay) para isolamento, caracterização e
quantificação de mucinas na digesta ileal desenvolvido para bezerros. O
método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-
antígeno. A limitação da utilização do ELISA é a necessidade de desenvolver
teste específico para cada espécie animal. As mucinas não apresentam
reatividade cruzada entre as espécies animais (JEURISSEN et al., 2002).
Aumento na secreção de mucina pode ser benéfico ou não de
acordo com a espessura da camada de muco. Se essa camada aumenta
somente em quantidades suficientes para maior proteção contra adesão
bacteriana, pode ser benéfico. Porém, se tornar-se demasiadamente densa,
pode ocorrer alteração na mistura da digesta com enzimas digestivas.
O aumento da renovação celular resulta em maturidade reduzida de
células caliciformes. Nessa situação verifica-se aumento de sialomucinas e
redução de sulfomucinas. Assim, o tipo de mucina produzida pode ser reflexo
18
do comprimento do vilo e, portanto, o perfil de mucina particular pode ser
indicativo de uma morfologia intestinal alterada.
Outra avaliação que pode ser feita é a da atividade das enzimas da
borda em escova. Na superfície dos microvilos são encontradas enzimas de
membrana (dissacaridases, oligapeptidases, etc.) que têm papel importante na
digestão de nutrientes (MACARI et al., 1994). São dissacaridases, fosfatase
alcalina, g-glutamiltransferase, aminopeptidases, sacarase-isomaltase (BOLELI
et al., 2002), que degradam oligômeros e oligopeptídeos em componentes
absorvíveis.
SAKAMOTO (2009) utilizou a metodologia descrita por DAHLQVIST
(1964) com espectrofotômetro para avaliação de atividade enzimática em
frangos de corte suplementados com glutamina e nucleotídeos. A unidade de
atividade especifica das enzimas foi definida como a quantidade de enzima que
hidrolisa 1 mol de substrato por mg de proteína por minuto.
19
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Técnicas histológicas para observação em microscópio de luz
continuam sendo bastante utilizadas para avaliação intestinal devido à
facilidade de execução, custo reduzido, e principalmente, porque resultam em
bons dados para análise.
Porém, as metodologias moleculares são promissoras por serem
bastante específicas, sensíveis, possibilitar diagnósticos rápidos e não serem
invasivas. Na medicina humana essas técnicas são as mais utilizadas e nota-
se que a pesquisa animal já está seguindo esse caminho, principalmente
devido à preocupação crescente com o número de animais utilizados pela
experimentação animal. Pelo mesmo motivo, metodologias in vitro para
determinar funções fisiológicas também devem ser promissoras.
As técnicas disponíveis para avaliação da integridade e
funcionalidade intestinal têm mostrado serem eficientes para as determinações
em que são utilizadas. Porém, alguns ajustes nas metodologias são sempre
necessários para que as diferenças fisiológicas entre indivíduos e espécies
sejam minimizadas.
Sempre que possível, deve-se preferir realizar as análises de dados
obtidos por várias técnicas, para que se tenha maior segurança ao relatar um
evento no intestino. E assim, poder inferir os eventos de digestão e absorção,
conhecê-los e otimizá-los, obtendo o melhor desempenho do animal.
20
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