Técnico ISSN 1516-9308Campo Grande, MSNovembro, 2004

Teste Sorológico deImunofluorescênciaIndireta para oDiagnóstico daNeosporose em Bovinos

Renato Andreotti'Maria de Fátima Cepa Matos?Jacqueline Marques de OliveiraêRosangela Locattelli-Dittrich"

A neosporose é uma doença causada pelo protozoárioNeospora ceninum , um parasita intracelular obrigatóriopertencente ao phylum Apicomplexa, classe Sporozoea,ordem Eucoccidiida e família Sarcocystidae (Dubey et alo,20021. N. caninum tem como hospedeiro definitivo o cão, ecomo hospedeiros intermediários os bovinos, ovinos,caprinos, eqüinos, cervos e outros animais (Dubey &Lindsay, 19961.

Durante a última década, a infecção por N. caninum despon-tou como uma doença reprodutiva de bovinos, com distri-buição mundial (Venturini et alo, 1999; Hemphill et alo,2000; Reichel, 2000; Sawada et alo, 2000; Dijkstra et alo,

20031, causando principalmente abortos em rebanhosbovinos (Anderson et alo, 20001, com importância econômi-ca atribuída principalmente aos custos associados aoaborto; ao valor dos fetos; à inseminação artificial ou àcobertura; à diminuição da produção de leite; ao aumentodo descarte e à reposição dos animais descartados emfunção dessa enfermidade(Boger & Hattel, 20031.

No Brasil, a neosporose tem sido registrada em diferentesEstados da federação, tais como: Rio Grande do Sul(Corbelini et alo, 20021, Paraná (Locatelli-Dittrich et alo,20011, Mato Grosso do Sul (Andreotti et alo, 20031 eBahia (Gondin et alo, 20011.

As infecções congênitas ocorrem nos bovinos leiteiros e decorte, com maior número de casos nos rebanhos leiteiros.As vacas leiteiras soro positivas produzem menos leite e sãodescartadas mais cedo, diminuindo a vida produtiva (Mooreet alo, 20021. Nos bovinos de corte soro positivos há ummaior risco de abortos e natimortos, além do aumento dodescarte por problemas reprodutivos (McAllister, 19991.

A transmissão vertical parece ser a principal via de infecçãode Neospora nos rebanhos bovinos de áreas endêmicas.Nos rebanhos endemicamente infectados, com acompanha-mento extensivo, a sorologia demonstrou que pode ocorrerum baixo nível de infecção pós-natal, de origem aindadesconhecida (Baillargeon et alo, 20011.

I Médico-Veterinário, Ph.D., CRMV-MS N' 510, Embrapa Gado de Corte, Rodovia BR 262, Km 4, Caixa Postal 154, CEP 79002·970 Campo Grande, MS. Correio

eletrônico: andreott@cnpgc.embrapa.br2 Farmacêutica-Bioquímica, Ph.D., CRF-MS N' 411/80, Departamento de Farmácia e Bioquímica, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS. Correio

eletrônico: matosmf@nin.ufms.br

3 Médica-Veterinária, CRMV-MS N' 1.452, Agência Estadual de Defesa Sanitária Animal e Vegetal - lagro/MS.4 Médica-Veterinária, Ph.D., CRMV-PR N' 2.241, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Paraná - UFPR. Correio eletrônico:

roslocdi@ufpr.br

2 Teste sorológico de imunofluorescência indireta para o diagnóstico da neosporose em bovinos

o aborto associado à neosporose bovina segue doismodelos: o endêmico e o epidêmico. O endêmico ocorre namaioria dos rebanhos com vacas infectadas via congênita, eé caracterizado por uma elevada taxa de aborto (> 5% aoano), que persiste durante anos, sendo duas a três vezesmaior nas vacas soro positivas do que nas soronegativas. Jáo epidêmico, provavelmente por contaminação após onascimento sugerindo transmissão do tipo horizontal(McAllister & Latham, 2002).

Diagnóstico daneosporose

O diagnóstico depende de uma combinação entre o históricodo rebanho, sinais clínicos e dados de laboratório. O quadroclínico sugestivo de neosporose é a presença de sinaisneurológicos e de polimiosite em bovinos jovens. Embovinos adultos, a ocorrência de abortos e de natimortossão sinais sugestivos de infecção por N. caninum(McAllister, 1999).

Os casos assintomáticos em bovinos e os sinaisinespecíficos da neosporose dificultam o diagnóstico clínicoda doença. Conseqüentemente, o diagnóstico laboratorial éimprescindível para confirmar uma infecção por N. caninum.

A confirmação laboratorial é realizada pelo diagnósticoparasitológico, com os exames histopatológico e imuno-histoquímico, a reação em cadeia da polimerase - PCR-(Pitei et aI., 2001) e o isolamento dos parasitas (Yamane etaI., 1997) mediante a inoculação do material suspeito emcultivo celular ou em animais de laboratório.

O diagnóstico de aborto associado a N. caninum é feitogeralmente pelos exames histopatológico e imuno-histoquímico dos tecidos fetais. A utilização de diferentestécnicas de diagnóstico, como a PCR, aumenta a chance dedetectar a infecção por N. caninum nos fetos (Sager et aI.,2001). Nos casos de aborto também devem serinvestigadas outras doenças, como rinotraqueíte infecciosabovina - IBR =, diarréia viral bovina - BVD =,

campilobacteriose, leptospirose, brucelose, clamidiose etricomonose (Andreotti et aI., 2003).

A sorologia é utilizada como método de diagnóstico nosestudos epidemiológicos de abortos e o seu custo deve serobservado em função das limitações que podem acarretar.

Métodos dediagnóstico sorológico

Existem vários testes que detectam anticorpos séricosespecíficos para N. caninum, principalmente em cães ebovinos (Tabela 1) (Atkinson et aI., 2000). Os maisutilizados são a reação de imunofluorescência indireta - IFI

- e o teste imunoenzimático (Enzyme-/inked ImmunosorbentAssay - ELlSA) (Pereira-Bueno et aI., 2003).

Tabela 1. Exames soro lógicos utilizados no diagnóstico deNeospora caninum (Atkinson et aI., 2000).

IFI Taquizoítas

Immunoblot Extrato solúvel

ELlSA cinético Sonicado

ELlSA Extrato solúvel

ELlSA Extrato "iscorn"

CI-ELlSA P65

r-ELISA NCDGI-21, N54

IFAT-ELlSA Taquizoítas

MAT Taquizoítas

IFI ~ reação de imunofluorescência indireta

Immunoblot ~ identidade antigênica

ELlSA ~ ensaio imunoenzimático

CI-ELlSA ~ ELlSA de competição e inibiçãor-ELlSA ~ ELlSA recombinante"lscorn" ~ complexo imunoestimulante

IFAT ~ indirect fluorescent antibody testMAT ~ teste de aglutinação modificada

Os testes sorológicos de IFI e de ELlSA necessitam doconjugado (anticorpo secundário espécie-específico) paradetectar os anticorpos de N. caninum.

Os antígenos de N. caninum podem ser naturais ourecombinantes, e diferem de acordo com o teste sorológico.No método da IFI, os taquizoítas inteiros são fixados naslâminas, e nos diferentes tipos de ELlSA, utilizam o extratode taquizoítas (taquizoítas inteiros; antígenos de taquizoítasincorporados a um complexo imunoestimulante e antígenosrecombinantes) .

Os taquizoítas são obtidos de cultivo in vitro de cepas deN. caninum isoladas de bovinos e de cães, e não existemindicações que possíveis pequenas diferenças antigênicasentre os isolados afetem a eficácia dos testes (Yamane etaI., 1997).

Reacão deirnunofluorescênciaindireta paraNeospora caninum

A reação de imunofluorescência indireta para N. caninumocorre pela detecção de anticorpos direcionados aosantígenos da superfície celular dos taquizoítas. Osanticorpos do soropositivo em teste ligam-se aos antígenos

Teste sorológico de imunofluorescência indireta para o diagnóstico da neosporose em bovinos 3

de superfície dos taquizoítas fixados na lâmina. Em seguidaé usado o anticorpo sensibilizado contra o anticorpo daespécie animal em teste conjugado ao isotiocianato defluoresceína que se liga ao anticorpo positivo em teste (Fig.

1a). A presença dessa reação é detectada pela observaçãoda fluorescência de cor esverdeada na superfície dostaquizoítas, em um microscópio equipado com fonte de luzultravioleta (Fig. 1b).

Imunofluorescência indireta

Fluoresceína

~Antiimunoglobulinabovina

~

Imunoglobulina bovina

---. Antígeno de superfície

TaquizoítaNeosporacaninum 1a 1b

Fig. 1. Reação de imunofluorescência indireta. 1a - Esquema representativo da reação de imunofluorescência indireta. 1b -

Fotografia de um ensaio com um soropositivo para Neospora caninum em microscópio de campo escuro. Aumento de 100 X.

A reação de imunofluorescência indireta é a metodologia dereferência para pesquisa de anticorpos de N. caninum,considerada como padrão ouro, um teste padrão paracalibração e comparação com os novos testes. A presençados anticorpos IgM é indicativa de infecção aguda, porém, acinética de produção de IgM na neosporose ainda é poucoconhecida em bovinos. A determinação dos anticorpos daclasse IgG é utilizada para o diagnóstico de neosporose embovinos. Um aumento progressivo do título de anticorposda classe IgG, em um período, geralmente é indicativo deinfecção aguda (Moore et al., 2002).

o resultado positivo no método da IFI é indicado pelafluorescência de todo o taquizoíta, nos soros com títulosmoderados a elevados. Fluorescência reduzida ou apicalocorre nos soros com títulos baixos, e nas reações cruzadasnão específicas causadas por infecção com espéciesrelacionadas, como Toxoplasma gondií. Também pode serpor causa do mecanismo de escape imunológico usado peloparasita (Pires, 1987), devendo-se interpretar os resultadoscom cautela. Os anticorpos não específicos que produzemfluorescência reduzida e, conseqüentemente, uma reaçãocruzada são desconhecidos. A reação cruzada entre os

anticorpos de N. caninum e T. gondií não foi observada emsoros de bovinos (Dubey & Lindsay, 1996).

O teste de imunofluorescência indireta é uma alternativaeconomicamente viável para o diagnóstico soro lógico daneosporose levando um tempo aproximado de uma hora etrinta minutos para a execução do ensaio.

A Embrapa Gado de Corte, com o apoio da Fundação deApoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologiado Estado de Mato Grosso do Sul - Fundect/MS - e daUniversidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS -,criou condições laboratoriais e metodológicas a partir de umprojeto de pesquisa para a produção e padronização detaquizoítas de N. caninum, mantidos em cultivo em célulasVero e estocados em nitrogênio líquido, para a sua utiliza-ção como antígeno em IFI, e a realização dos ensaios para odiagnóstico sorológico. Essa tecnologia, já disponibilizada,permite o diagnóstico soro lógico da neosporose com ummenor custo e maior rapidez para atender o Brasil Central ea possibilidade de fornecimento de antígenos para outrasregiões do país.

Teste sorológico de imunofluorescência indireta para o diagnóstico da neosporose em bovinos

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SAWADA, M.; KONDO, H.; TOMIOKA, Y.; PARK, C.;MORITA, T,; SHIMADA, A.; UMEMURA, T. Isolation ofNeospora caninum from the brain of a naturally infectedadult dairy cow. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v.90, n. 3, p. 247-252, 2000.

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