Tecnología del ADN

8/13/2019 Tecnologa del ADN

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Curso: Biologa Celular y MolecularOscar Nolasco Crdenas MSc.

[email protected] 2013

Tecnologa del DNA

recombinante
mailto:[email protected]:[email protected]


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Dos importantes enzimas en la generacin deDNA recombinate

Enzimas de restriccin:

Corta el DNA de un organismo en una secuenciaespecifica.

DNA Ligasas:

Une fragmentos de DNA produciendo DNA

recombinates.

DNA recombinante: Es el DNA compuesto porsegmentos de DNA de diferentes orgenes

Tecnologa del DNA recombinante


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5` G A A T T C 3`

Enzima de restriccin: EcoRI

3` C T T A A G 5`

Corte

5` G A A T TC 3`

3` C T T A A G 5`

ExtremoscohesivosDNA Ligasas

3` T T A A P

5` OH

+

3` T T A A P5`OH

3` C G P5` OH

3` T A C G P5` OH

A

C

B

Unin por

complementaridadde pares de bases

5` A A T T 3`

3` T T A A 5`

OH

P P

OH

+FragmentosB y C noapareados

5` A A T T 3`

3` T T A A 5`

DNAligasas

Mecanismo paracortar y unir DNA

Enzima derestriccin

Secuencia de reconocimientopalindrome


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ClonacinGenerar copias idnticas de un organismo,

clulas o secuencias de cidos nucleicos de un

organismoLa oveja Dolly Genes clonados

Involucra la intervencin humana.

Origina una nueva generacin

Tecnologa desarrollada para clonar genes


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Elementos necesarios para una clonacinde secuencias

Vector

segmento de DNA con propiedad de replicarse y serfuncional dentro de un organismo. Posee un

segmento de seleccin (antibitico) y otro de insercin

de un DNA forneo

Plasmidos, bacteriofagos,adenovirus, baculovirus,

El hospedero celular

organismo que sirve para albergar al vector y su

inserto.

E.coli, levadura, celulas humanas, celulas insecto

Secuencia a insertar INSERTO

segmento de DNA de inters que queremos reproduciry/o expresar. Ejm. un segmento de genoma, gen,

cDNA, etc.

VectorPlasmido

Fragmento deDNA para ser

clonado


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VectorPlasmido

+FragmentoDNA a serclonado

El vector escortado yligado alinserto

PlasmidoRecombinante

Transformacinde E.coli(CaCl2, electroporacin)

Cultivadas en placasconteniendo ampicilina

Las clulas queno tienen elplasmido

mueren enplacas conampicilina

Las clulastransformadas

son las quesobreviven

CromosomaBacteriano

El plasmidotiene una

replicacinindependiente

Multiplicacincelular

Amp R.

Amp R.

ORI

ORI


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Bacteriofagos Permite insertos de 20 30 kb

Lambda es el bacteriofago comnmente empleado

Presenta mayor eficiencia en transformar clulas en comparacin a los plasmidos

Cosmidos Permite la insercin de 40 Kb

Los cosmidos combinan los elementos esenciales de un plasmido y un bacteriofago

Bacterial Artificial Chromosomes BACs)

BACs permiten la insercin de 300 kbs. El factor F de E.coli es capaz de mantener fragmentos largos de DNA.

YACs permiten la insercin de 300-500 kbs.

YACs : un centromero de levadura con dos telomeros de levadura. Un origen dereplicacion bacteriano marcadores de seleccion.

YAC plasmidoCromosoma de levadura

Yeast Artificial Chromosomes YACs)

Plasmidos Permite insertos menores de 10 kb

Existen una gran variedad de plasmidos y son la base del desarrollo de los otrossistemas de clonacin


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Multiple cloning site (Polylinker)


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Blue/White Seleccin


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Bibliotecas de DNA:

Colleccin de secuencias diferentes de DNA deun organismo cada cual ha sido clonada en unvector para su purificacin, almacenamiento y

analisisBibliotecas genomicas

Bibliotecas de expresin o de cDNA

Bibliotecas de DNA

(Hechas a partir de DNA

Genomico total o de cromosomas )

Usos secuenciamiento

anlisis de secuencias

(Hechas de cDNA- copia de mRNA)

Usos anlisis de protenas

Expresin de genes, los vectores para esta finalidad

tienen que tener un promotor fuerte de expresion


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1 pgina 3000 letras1 libro grande milpginas

3 millones letras

Genoma completo (23 pares decromosomas) alrededor de mil libros-3,200 millones de letras, 1 milln depginas.

1 cromosoma promedio, equivalentea 30 libros grandes (30,000 pginas,100 milllones de letras, 700 genes).

Demasiado grande

Necesidad de DNA recombinante:Banco genmico: Genoma compiladoen coleccin de 30,000 separatas de

30-50 pginas. Cada uno con espaciopara uno o pocos genes. Permiteanlisis detallado de cualquier lugardel genoma. Facilita identificacin degenes y marcadores.

Complejidad del genoma y banco genmico


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BAC plsmido secuencia

Clonacin de cromosoma en diferentes clones

a diferentes escalas segn su tamao

33,000 clones BAC por

juego haploide (entre 5-

7X veces el tamao

completo de DNA)

para cubrir 95-98%

genoma

Separatas pginas prrafos


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Digestin Parcial

EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR IEcoR I

Digestin Completa

Alta concentracin de la enzima

Digestion IncompletaBaja concentracin de la enzima


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EcoR I Digestion Parcial

Biblioteca Genomica

Celulas infectadas


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Miles de clones

BACs en placas

Petri

Trasladadas a placas de

microarreglos (microarrays)

4 arreglos de 384 (16X24) BACs


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Bibliotecas de expresinAislacin de mRNA

La mayora de mRNAs eucariotes son

poliadenilados en el 3

Oligo (dT) pueden enlazarse a poli(A) ypueden usarse para recuperar mRNA.

AAAAAAAAAAn5 cap

Porque expresar?

Cuando el producto de la secuencia clonada esuna protena.

La identificacin de un gen en una libreria obiblioteca requiere de su expresin.

Para sobreproducir una protena y purificarla.

Para estudios in vivo de la protena.


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Identificacin del producto proteicodel gen de interes

1. Actividad de la protena2. Western blotting empleando un

anticuerpo especifico

Screening por Expresin

Sintesis de cDNA :

Sintesis de la primera hebra:transcriptasa reversa


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Screening o buscado unaclona recombinante enuna biblioteca de cDNA

con un anticuerpo comosonda


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Algunas protenas recombinantes ensalud humana

Insulina Diabetis

Interfern Alfa Cancer

Interleukinas Cancer

Factores VIII, IX de coagulacin Activador tisular del plasmingeno

Hormona del crecimiento HGH Dwarfism Estatura corta

Vacunas (anticuerpos y antgenos) Herpes,Hepatitis B vacuna

Malaria

AIDS


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Animales transgnicos Animales que portan genes o secuencias de

DNAexgeno, introducidos por intervencinhumana (Ejm. ratones con insulina humana).

Procedimiento: microinyeccin de ovocitos (lentoe ineficaz para incorporar el DNA)

Son utilizados para generar Modelos animales:comportamiento de un gen in vivo

Son utilizados como animales bioreactores:Como produccin de leche con proteinasadicionales.

Posibilidad de uso en xenotransplantes Mas difcil que procariotes pero expresin mas

correcta: splicing, glicosilacin, pptido seal,etc.


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Mtodos de transferencia de genes Microinyeccion directa Mediada por virus Embrionica stem cells Transferencia Nuclear

Sperm-mediated gene transfer Transferencia de genes mediante

cromosomas artificiales

Transgenesis in Mice


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Microinjection



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Retroviral Vector

E b i i t ll


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Embrionicas stem cells

Derivada del embrion en estado de blastocito

Dividida in vitro indefinidamente sin diferenciacion

Pueden ser transfectados con transgenes o conremosion de genes (knockout)

T f i l


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Transferencia nuclear

Dolly 1997

Las clulas somticas pueden ser

transfectadas o geneticamente alteradasantes de la transferencia nuclear


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Biorreactores de protenas humanas

(No en bacterias porque no

realizan modificaciones

postranscripcionales nipostraduccionales)

Cabra transgnica con TPA humano

(tissue plasminogen activator) en leche

Transgnico con lactoferrina humana

Bi f tifi i


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GOLDEN RICE Arroz fuente de alimento para mayorparte de pases pobres de Asia y

frica Falta Vitam. A: Ceguera y

problemas corneales hasta 40%poblacin

Vitamina A se encuentra en cscaray partes verdes ; pero no en grano

Golden rice: arroz transgnico conVit A en granos, meta dosis diariade Vit A en un plato: conseguida

(150ug/100g arroz) Profesores Peter Beyer (U. Freiburg,

Alemania) e Ingo Portrykus (Inst Tec.Fed Suiza), con compaa Syngenta(patentado), donacin a pases endesarrollo.

Biofortificacin

G


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46 cromosomas: 22 pares autosomas + XX/XY

3.2 X 109pares de bases (bp) haploide

Menos de 25,000 genes traducidos a protenas (vs 120,000 a 70,000inicial). Drosophila 14,000, C. elegans 18,000

Humanos: ms de 300,000 protenas. Genes segmentados => Splicingalternativo: 1 gen varias protenas segn el tejido

Catlogo de genes humanos y sus secuencias para genes candidatos a

enfermedades. Inmensas cantidades de secuencias repetidas (40% del total), muchas

polimrficas. Ejm. Alu (cicatriz de transposones), microsatlites.

Desarrollo de databases genmicas y de expresin en otras especies,acceso libre Internet.

Logros Genmica => transcriptoma, protema, metaboloma. Evolucion entre organismos Modelos: bacterias, levaduras, Arabidopsis, drosophila, ratn. Correlacin de SNPs con los estados de salud y enfermedad Susceptibilidad y prediccin de enfermedades

Genoma Humano


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Mitocondrial:

1 cromosoma circular X 100s

16, 569 bp

37 genes: 13 prot, tRNAs

Enfermedades raras neurodegenerativas,

musculares y pticas Enfermedades degenerativas comunes:

diabetes, Alzheimer, cncer

Genoma Mitocondrial


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Identidad 99.9% => 0.1% variabilidad (3 millones de bases)

Variabilidad en casi todos los genes y regiones -5 millones de mutacionespuntuales polimrficas (SNPs) hasta ahora.

Miles de marcadores genticos en todas las regiones cromosmicas (facilitaestudio de mapeo de genes y diagnstico en familias y en poblaciones)

Algunos genes inactivos o ausentes en individuos normales: CCR5

Otros genes duplicados: CYP2D6 (40% de frmacos)

Inters por poblaciones no estudiadas previamente (ejm. Sudamericanas)

Variabilidad del GenomaHumano


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Identificacin de genes causales de enfermedades3, 500 - 5, 000 enfermedades hereditarias, estadosprevios asintomticos, intermedios, alternativos

Conocimiento de procesos normales y enfermedades.Reconsideracin conceptual de enfermedades raras,

comunes, propensiones Tests de diagnstico (comparacin de genes normalesvs afectados)

Anlisis del material gentico para factores de riesgo Prevencin (multifactoriales)

Conocimiento de protenas Protenas recombinantes Farmacoterapia molecular Farmacogentica

Terapia gnica

Aplicacin Prctica


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Diagnstico Molecular

Caracterizacin de mutaciones causales engenes o marcadores asociados aenfermedades.

Diagnstico en pacientes, prenatal(microvillosidades corinicas 8-11 sem,amniocentesis 12-18 sem), presintomtico,preimplantacional.

Sirve para determinar la enfermedad:pronstico, prevencin, tratamiento, terapia,consejo gentico en posibles portadores, etc.


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TECNOLOGIAS DE DIAGNOSTICO Tecnologas de diagnostico basadas en

cidos nucleicos (NAT)

Tecnologas de diagnostico NO basadasen NAT


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Tecnologas de diagnosticobasadas en cidos nucleicos

(NAT) PCR: Mtodos basados en amplificacin

FISH : Mtodos basados en hibridacin


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http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html

Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chainreaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.

Kary Mul l is 1983

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Tcnica desarrollada por el Premio Nobel Kary Mullis

Basada en el descubrimiento de la actividad biolgica a altastemperaturas de las DNA polimerasas encontradas enbacterias termfilas.


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PCR - Aplicaciones

clonacin

secuenciacin

diagnstico Mutagnesis sitio-dirigida

Anlisis de mutaciones

Cuantificacin de diferencias en expresin gnica (RT-

PCR) Pruebas de paternidad

Anlisis forense

Control de calidad a nivel industrial

La tcnica de PCR es una herramienta esencial dentro de labiologa molecular:


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PCR: Mtodos basados enamplificacin

Pruebas de amplio rango genes altamenteconservados y polimrficos: GenesRibosomales

Pruebas mltiples que permiten ladeteccin paralela de especies


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De PCR clsico a PCR en tiempo realbasado en la deteccin de fluorescencia.

Mayor robustez del sistema, menos

laboriosa, menos contaminacin. Cuantificacin relativa y absoluta PCR en tiempo real son mas costosas y

los sistemas todava no alcanzan sudesarrollado para su masificacin.Presencia de inhibidores en la muestra


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Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp.Kathy A. Mangold,1,2 Rebecca U. Manson,2 Evelyn S. C. Koay,3,4 LindseyStephens,1

MaryAnn Regner,1 Richard B. Thomson, Jr.,1,2 Lance R. Peterson,1,2and Karen L. Kaul1,2*JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2005, p. 24352440 Vol. 43, No. 5


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Xpert MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular

diagnostic for

tuberculosis and rifampicin resistance. Stephen D Lawnand Mark P Nicol

o os asa os en


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o os asa os enhibridacin

PNA FISH Evolucin de una sonda de nucletidos a una

sonda de acido nucleico peptdico PNA es unoligomero sinttico que imita la estructura del DNA

o el RNA, la carga negativa del esqueleto azcarfosfato es remplazada por una molcula sin cargaN-(2 aminoetil) glicina al cual se une la basenitrogenada por un enlace metilen carbonil

Son menos susceptibles de inhibicin por

impurezas en diferentes muestras clnicas acomparacin de los mtodos basados enamplificacin


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Tecnologas de diagnostico NObasadas en NAT

Uso de anticuerpos Uso de bacteriofagos (MicroPhage)

Herramientas de proteomica:

matrix-assisted laser desorptionionizationtime-offlight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

SECUENCIAMIENTO DE ADN


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Dos Mtodos desarrollados a fines de los70s: Mtodo Qumico Maxam y Gilbert

Mtodo Enzimtico Sanger de anlisis postreaccin

Ambos basados en la obtencin de molculas conterminaciones en A, G, C y T; para separar estosfragmentos en geles de poliacrilamida denaturantes.

Determinar el ordenamiento de los nucletidosen un fragmento de ADN

SECUENCIAMIENTO DE ADN

Radioactividad

l d


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reemplazado a

partir de

1987

Dideoxinucleotidos

marcados

fluorescentemente

Diciembre 2000


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Diciembre 2000

Un consorcio internacional completa el secuenciamiento del genoma de laprimera plantaArabidopsis thalianade125 Mb.

Febrero 2001El consorcio HGP publica su borrador en Nature(15 Febrero), y Celera lopublica en Science(16 Febrero)

Nuevos mtodos de secuenciamiento


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Nuevos mtodos de secuenciamientoPirosecuenciamiento

Secuenciamiento Masivo permite


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Centrifuge Step

Load Enzyme

Beads

44 m

Load beads into

PicoTiterPlate

Secuenciamiento Masivo permiteobtener genomas en menor tiempo


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MICROARRAYS


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Documents

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