Tema Marcadores Enologia 2011 Ampliado

DefiniciDefinicióónn

-- Los marcadores genLos marcadores genééticos son polimorfismos en ticos son polimorfismos en genes o en general en secuencias de ADN que genes o en general en secuencias de ADN que permiten diferenciar individuos, poblaciones o permiten diferenciar individuos, poblaciones o especiesespecies..

-- Deben ser variablesDeben ser variables

UsosUsos

-- GenGenéética de poblacionestica de poblaciones-- Programas de mejoraProgramas de mejora-- Mapas genMapas genééticosticos-- FilogeniasFilogenias-- Estudios evolutivosEstudios evolutivos-- Medicina forenseMedicina forense-- TrazabilidadTrazabilidad......

Materiales y MMateriales y Méétodos usados en el todos usados en el estudio de los marcadores genestudio de los marcadores genééticosticos

1.1.-- ElectroforesisElectroforesis

Materiales y MMateriales y Méétodos usados en el todos usados en el estudio de los marcadores genestudio de los marcadores genééticosticos

1.1.-- ReacciReaccióón en Cadena de la Polimerasan en Cadena de la Polimerasa

Tipos de marcadoresTipos de marcadores gengenééticosticos

-- AlozimasAlozimas-- RFLPRFLP-- AFLP AFLP -- VNTRVNTR--RAPDRAPD--..............

ALOZIMASALOZIMAS

DefiniciDefinicióón: diferentes formas de una enzima n: diferentes formas de una enzima codificada por alelos de un mismo locus.codificada por alelos de un mismo locus.

De manera resumida, los pasos consisten en De manera resumida, los pasos consisten en hacer una extraccihacer una extraccióón de proten de proteíínas de las plantas nas de las plantas a analizar y posteriormente llevar a cabo una a analizar y posteriormente llevar a cabo una una electroforesis en gel de almiduna electroforesis en gel de almidóón. n.

El polimorfismo se detecta aEl polimorfismo se detecta aññadiendo el sustrato adiendo el sustrato de la enzima al gel y mediante reacciones de la enzima al gel y mediante reacciones ququíímicas colorear, detectar y localizar las micas colorear, detectar y localizar las enzimas especenzimas especííficas, que aparecerficas, que apareceráán en el gel n en el gel como bandas. como bandas.

Las diferencias en la movilidad electroforLas diferencias en la movilidad electroforéética tica de las bandas, pondrde las bandas, pondráán de manifiesto la n de manifiesto la variabilidad genvariabilidad genéética en los genes (sus alelos) tica en los genes (sus alelos) estudiados.estudiados.

ALOZIMASALOZIMAS

V A

-+V A

-+

Esquema general del procesoEsquema general del proceso

ALOZIMASALOZIMAS

GenGenéética de poblacionestica de poblacionesMarcador de lMarcador de lííneas y neas y stocks stocks comercialescomercialesControversias Controversias filogenfilogenééticasticasUso en SistemUso en SistemááticaticaRelaciRelacióón alozimas con caracteres cuantitativosn alozimas con caracteres cuantitativos

-- VentajasVentajas ::

Aplicaciones :Aplicaciones :

Importante base de datosImportante base de datos

Rapidez y bajo costeRapidez y bajo coste

-- InconvenientesInconvenientes

No toda la variabilidad genNo toda la variabilidad genéética se ve reflejada en tica se ve reflejada en variabilidad proteica a nivel de bandas alozvariabilidad proteica a nivel de bandas alozíímicas. Entre las micas. Entre las razones para esta subestima de la variabilidad genrazones para esta subestima de la variabilidad genéética, tica, estestáán que los cambios en la composicin que los cambios en la composicióón aminoacn aminoacíídica de las dica de las proteproteíínas no implican cambios en la movilidad nas no implican cambios en la movilidad electroforelectroforéética en los geles y, por otra parte, la degeneracitica en los geles y, por otra parte, la degeneracióón n del cdel cóódigo gendigo genéético implica que cambios en la tercera base tico implica que cambios en la tercera base de los codones no implican variaciones en la secuencia de de los codones no implican variaciones en la secuencia de aminoaminoáácidos una vez traducido el ARN mensajero.cidos una vez traducido el ARN mensajero.

Polimorfismos de Longitud enPolimorfismos de Longitud enFragmentos de RestricciFragmentos de Restriccióónn

(RFLP)(RFLP)

1.1.-- DigestiDigestióón del ADNn del ADN

-- Enzimas de restricciEnzimas de restriccióón: Arber, Smith y Nathans: Nobel en 1978n: Arber, Smith y Nathans: Nobel en 1978

-- Utilizan las bacterias para cortar ADN forUtilizan las bacterias para cortar ADN forááneoneo

-- Cortan en unas secuencias del ADN: dianas de restricciCortan en unas secuencias del ADN: dianas de restriccióónn

-- Tipo II: reconocen la diana y cortan en ese puntoTipo II: reconocen la diana y cortan en ese punto

GG--AA--AA--TT--TT--CCCC--TT--TT--AA--AA--GG

GGCC--TT--TT--AA--AA

AA--AA--TT--TT--CCGG

Eco RI


(RFLP)(RFLP)

Los RFLPs expresan las diferencias entre individuos en sitios Los RFLPs expresan las diferencias entre individuos en sitios concretos del ADN que reconocen diferentes enzimas de concretos del ADN que reconocen diferentes enzimas de restriccirestriccióón. Estas enzimas cortan en secuencias especn. Estas enzimas cortan en secuencias especííficas del ficas del DNA (denominadas dianas de restricciDNA (denominadas dianas de restriccióón), dando lugar a n), dando lugar a fragmentos de tamafragmentos de tamañños diferentes que pueden ser analizados os diferentes que pueden ser analizados mediante electroforesis en geles de agarosa.mediante electroforesis en geles de agarosa.

Los pasos necesarios para su anLos pasos necesarios para su anáálisis son:lisis son:

1.1.-- ExtracciExtraccióón de DNA.n de DNA.

2.2.-- FragmetaciFragmetacióón del DNA mediante la digestin del DNA mediante la digestióón con enzimas n con enzimas de restriccide restriccióónn

3.3.-- SeparaciSeparacióón de los fragmentos generados mediante n de los fragmentos generados mediante electroforesis en geles de agarosa.electroforesis en geles de agarosa.

4.4.-- En algunos casos, se puede transferir e inmovilizar las En algunos casos, se puede transferir e inmovilizar las bandas del gel en membranas y detectar el polimorfimos bandas del gel en membranas y detectar el polimorfimos mediante hibridacimediante hibridacióón del ADN en la membrana con sondas n del ADN en la membrana con sondas marcadas.marcadas.

El uso de la PCR ha posibilitado la generaciEl uso de la PCR ha posibilitado la generacióón de nuevos n de nuevos marcadores de elaboracimarcadores de elaboracióón sencilla. Por ejemplo, se puede n sencilla. Por ejemplo, se puede amplificar por PCR un gen de interamplificar por PCR un gen de interéés o un fragmento s o un fragmento determinado del genoma y hacer una digestideterminado del genoma y hacer una digestióón con enzimas de n con enzimas de restriccirestriccióón para evaluar la aparicin para evaluar la aparicióón de RFLPs (PCRn de RFLPs (PCR--RFLP).RFLP).


(RFLP)(RFLP)

11

22

ElectroforesisElectroforesis

•• Polimorfismo en la secuenciaPolimorfismo en la secuencia

11 22

Tipos de polimorfismo (I)Tipos de polimorfismo (I)

11 22


(RFLP)(RFLP)

11


11 22

•• Polimorfismo en el tamaPolimorfismo en el tamañño de los fragmentoso de los fragmentos(inserciones, deleciones, duplicaciones...)(inserciones, deleciones, duplicaciones...)

11

Tipos de polimorfismo (II)Tipos de polimorfismo (II)Tipos de polimorfismo (II)Tipos de polimorfismo (II)


(RFLP)(RFLP)

22

11SondaSonda

SondaSonda


SouthernSouthern

11 22 11 22

Uso de sondas para detecciUso de sondas para deteccióón de polimorfismos en secuencias n de polimorfismos en secuencias determindasdetermindas


(RFLP)(RFLP)

Enfermedad fEnfermedad fúúngica en ngica en V. viniferaV. vinifera: : (Oidio: Powdery mildew)(Oidio: Powdery mildew)

Uncinula necatorUncinula necator

-- PPéérdidas en la produccirdidas en la produccióónn-- No existen comercialmente cultivares resistentes a No existen comercialmente cultivares resistentes a U. necatorU. necator-- Tratamientos fungicidas: elevado coste e impacto ambientalTratamientos fungicidas: elevado coste e impacto ambiental

-- Gen de resistencia a Gen de resistencia a U. necatorU. necator: Run1: Run1-- Es un gen dominante: los homocigotos y heterocigotos para Es un gen dominante: los homocigotos y heterocigotos para este gen presentan resistencia a este hongo. Los que no lo este gen presentan resistencia a este hongo. Los que no lo lleven son susceptibles.lleven son susceptibles.-- Cruzamientos entre la especie salvaje de uva Cruzamientos entre la especie salvaje de uva Muscadinia Muscadinia rotundifolia rotundifolia (resistente a (resistente a U. necatorU. necator) y ) y V. viniferaV. vinifera--Estrategia para localizar genes similares a Run1: generar Estrategia para localizar genes similares a Run1: generar sondas por PCR de genes (o partes de ellos) de resistencia y sondas por PCR de genes (o partes de ellos) de resistencia y usarlas en Southernusarlas en Southern--RFLP.RFLP.-- Resultados:Resultados:


(RFLP)(RFLP)

Marcadores: GLP1Marcadores: GLP1--1212MHD145MHD145MHD98MHD98

Estos marcadores se pueden generar por PCR fEstos marcadores se pueden generar por PCR fáácilmente, cilmente, marcarlos y usarlos como sondas sobre ADN genmarcarlos y usarlos como sondas sobre ADN genóómico mico digerido, la presencia de banda indica resistencia al hongo. digerido, la presencia de banda indica resistencia al hongo.

Elevado interElevado interéés s comercialcomercial

……continuacicontinuacióónn


(RFLP)(RFLP)

A partir de ahA partir de ahíí otras estrategias:otras estrategias:

Directamente mediante el anDirectamente mediante el anáálisis del producto lisis del producto de PCR de una planta que se desea conocer su de PCR de una planta que se desea conocer su resistencia o mediante PCRresistencia o mediante PCR--RFLP.RFLP.


(RFLP)(RFLP)

MAPA DE LIGAMIENTOMAPA DE LIGAMIENTO

El polimorfismo de fragmentos amplificados aleatoriamente El polimorfismo de fragmentos amplificados aleatoriamente (AFLP) se fundamenta en la amplificaci(AFLP) se fundamenta en la amplificacióón selectiva de los n selectiva de los fragmentos obtenidos en la digestion del ADN genfragmentos obtenidos en la digestion del ADN genóómico con mico con enzimas de restriccion. El proceso consta de los siguientes pasoenzimas de restriccion. El proceso consta de los siguientes pasos:s:

-- DigestiDigestióón del ADN con dos enzimas de restriccin del ADN con dos enzimas de restriccióón que generan n que generan dos extremos cohesivos con diferentes secuencias.dos extremos cohesivos con diferentes secuencias.-- Ligamiento a estos extremos de unos adaptadores (25Ligamiento a estos extremos de unos adaptadores (25--30 pb) que 30 pb) que encajan en los extremos cohesivos.encajan en los extremos cohesivos.-- AmplificaciAmplificacióón selectiva con dos cebadores de secuencias n selectiva con dos cebadores de secuencias ididéénticas a cada uno de los adaptadores mnticas a cada uno de los adaptadores máás tres nucles tres nucleóótidos tidos adicionales en el extremo 3adicionales en el extremo 3’’, con lo que se obtiene una reducci, con lo que se obtiene una reduccióón n drdráástica del nstica del núúmero de fragmentos amplificados.mero de fragmentos amplificados.

De esta forma se generan mDe esta forma se generan múúltiples bandas que responden a ltiples bandas que responden a fragmentos de origen aleatorio en el genoma y que se resuelven efragmentos de origen aleatorio en el genoma y que se resuelven en n geles desnaturalizantes de acrilamida o en analizadores de geles desnaturalizantes de acrilamida o en analizadores de fragmentos. Al igual que en los RAPD, para la generacifragmentos. Al igual que en los RAPD, para la generacióón de n de estos marcadores no es necesaria informaciestos marcadores no es necesaria informacióón previa, son n previa, son generalmente dominantes y no son transferibles, pero permite la generalmente dominantes y no son transferibles, pero permite la generacigeneracióón de gran nn de gran núúmero de marcadores con pocas reacciones. mero de marcadores con pocas reacciones. Requiere extracciones de DNA de gran calidad e infraestructura Requiere extracciones de DNA de gran calidad e infraestructura especializada.especializada.

Polimorfismos de Longitud Polimorfismos de Longitud en Fragmentos Amplificadosen Fragmentos Amplificados

(AFLP)(AFLP)


(AFLP)(AFLP)

ADN genADN genóómicomico

DigestiDigestióón con enzimas n con enzimas de restriccide restriccióónn

UniUnióón a adaptadoresn a adaptadores

AmplificaciAmplificacióón n selectivaselectiva

Geles de poliacrilamida oGeles de poliacrilamida oanalizadores de fragmentosanalizadores de fragmentos



(AFLP)(AFLP)

Gen Gen RunRun1 1 EjemploEjemplo

Repeticiones en Repeticiones en TTáándemndem de de NNúúmero Variablemero Variable

(VNTR)(VNTR)

DNA repetidoDNA repetido

Secuencias sin funciSecuencias sin funcióónnconocidaconocida

Secuencias funcionalesSecuencias funcionales

Repeticiones de la Repeticiones de la heterocromatinaheterocromatina

centromcentromééricarica

Repeticiones en TRepeticiones en Táándemndemde Nde Núúmero Variablemero Variable

Secuencias Secuencias transponiblestransponibles

Genes funcionalesGenes funcionales DNA espaciador DNA espaciador

DNA eucariDNA eucarióóticotico

MinisatMinisatéélitelite MicrosatMicrosatéélitelite

Repeticiones en Repeticiones en TTáándemndem de de NNúúmero Variablemero Variable

(VNTR)(VNTR)

-- Los microsatLos microsatéélites o SSR (Simple Sequence Repeats) se lites o SSR (Simple Sequence Repeats) se basan en la amplificacibasan en la amplificacióón por PCR usando cebadores de una n por PCR usando cebadores de una regiregióón microsatn microsatéélite. El microsatlite. El microsatéélite consiste en repeticiones lite consiste en repeticiones de dide di-- tritri-- o tetranucleo tetranucleóótidos (aunque puede ser mtidos (aunque puede ser máás s complejo) en tcomplejo) en táándem, por ejemplo, (CG)n. ndem, por ejemplo, (CG)n.

-- El polimorfismo en el nEl polimorfismo en el núúmero de repeticiones (n) da lugar a mero de repeticiones (n) da lugar a fragmentos amplificados de diferente longitud. Estas fragmentos amplificados de diferente longitud. Estas diferencias en longitud pueden ser analizadas en geles de diferencias en longitud pueden ser analizadas en geles de poliacrilamida o analizadores de fragmentos. Los poliacrilamida o analizadores de fragmentos. Los primers primers o o cebadores estcebadores estáán muy conservados dentro de la especie e n muy conservados dentro de la especie e incluso parcialmente entre especies afines. Se analizan por incluso parcialmente entre especies afines. Se analizan por PCR y posterior electroforesis. Muy usados en identificaciPCR y posterior electroforesis. Muy usados en identificacióón n de individuos y gende individuos y genéética de poblaciones.tica de poblaciones.

Repeticiones en Repeticiones en TTáándemndemde Nde Núúmero Variablemero Variable

(VNTR)(VNTR)

MICROSATMICROSATÉÉLITESLITES

11 22

11

22


AmplificaciAmplificacióón n por PCRpor PCR

Electroforesis de Electroforesis de los productos los productos amplificadosamplificados

Repeticiones en Repeticiones en TTáándemndemde Nde Núúmero Variablemero Variable

(VNTR)(VNTR)

MICROSATMICROSATÉÉLITESLITES

Electroforesis mostrando polimorfismo Electroforesis mostrando polimorfismo para 3 microsatpara 3 microsatéélites cuyos alelos migran lites cuyos alelos migran

a diferentes distancias en el gel. a diferentes distancias en el gel.

EL polimorfismo de productos amplificados al azar EL polimorfismo de productos amplificados al azar (RAPDs) es el m(RAPDs) es el máás sencillo de analizar. Se generan por la s sencillo de analizar. Se generan por la amplificaciamplificacióón del DNA con un cebador de secuencia corta n del DNA con un cebador de secuencia corta (10(10--12 bases) y aleatoria, no es necesario conocimiento 12 bases) y aleatoria, no es necesario conocimiento previo de secuenciacion y utiliza como sustrato poco DNA. previo de secuenciacion y utiliza como sustrato poco DNA.

Su sencillez y bajo coste estSu sencillez y bajo coste estáá contrapesada por sus contrapesada por sus limitaciones; herencia dominante, baja reproducibilidad limitaciones; herencia dominante, baja reproducibilidad entre laboratoriosentre laboratorios…… AdemAdemáás, la deteccis, la deteccióón en geles de n en geles de agarosa puede producir resultados erragarosa puede producir resultados erróóneos, ya que neos, ya que bandas que procedan de diferentes puntos de bandas que procedan de diferentes puntos de amplificaciamplificacióón de parecida longitud sean indistinguibles y n de parecida longitud sean indistinguibles y den una sola banda en el gel. Sin embargo, la ventaja de den una sola banda en el gel. Sin embargo, la ventaja de usar estos geles, es la sencillez con la que las bandas usar estos geles, es la sencillez con la que las bandas pueden ser extraidas, clonadas y secuenciadas, por lo que pueden ser extraidas, clonadas y secuenciadas, por lo que se obtiene la secuencia del fragmento amplificado. A partir se obtiene la secuencia del fragmento amplificado. A partir de de éésta, se puede redisesta, se puede rediseññar los primers para la ar los primers para la reproduccireproduccióón de este marcador. n de este marcador.

ADN polimADN polimóórficos amplificados al azarrficos amplificados al azar(RAPD)(RAPD)


11 22

33 44 55



11 22

33 44 55

Electroforesis mostrando RAPD.Electroforesis mostrando RAPD.

ANEXOSANEXOS

Doucleff et al., Doucleff et al., 20042004

Mapa genMapa genéético tico V. rupestris V. rupestris y y V. arizonicaV. arizonica

475 marcadores:475 marcadores:410 AFLP410 AFLP32 RAPD32 RAPD9 microsatelites (SSR)9 microsatelites (SSR)...otros...otros

DeterminaciDeterminacióón Sexual in n Sexual in Vitis sppVitis spp..

Localizado en grupo de ligamiento 14 (junto a otros marcadores)Localizado en grupo de ligamiento 14 (junto a otros marcadores)

DalbDalbóó et al., 2000et al., 2000277 RAPDs277 RAPDs25 microsatelites25 microsatelites12 AFLPs12 AFLPs...otros...otros

PROYECTO GENOMAPROYECTO GENOMA

33ªª) Desarrollo de mapas f) Desarrollo de mapas fíísicossicos

22ªª) Mapeo de genes relacionados ) Mapeo de genes relacionados con caracteres cuantitativoscon caracteres cuantitativos

11ªª ) Mapas de ligamiento usando marcadores) Mapas de ligamiento usando marcadores

EtapasEtapas

MAPAS FMAPAS FÍÍSICOSSICOS

FISH: HibridaciFISH: Hibridacióón In Situ de Fluorescencian In Situ de Fluorescencia

MAPAS FMAPAS FÍÍSICOSSICOS

FISH: HibridaciFISH: Hibridacióón In Situ de Fluorescencian In Situ de Fluorescencia

RetrotransposRetrotransposóón n Gret1 Gret1 en en V. viniferaV. vinifera

((Sofia Pereira Sofia Pereira et alet al., 2005)., 2005)

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