Tese Doutorado Jacqueline Ferreira

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Sensor de pH baseado em filmes de polímero conjugado e Sensor

biológico baseado em filmes de ouro nanoestruturado

Tese apresentada por Jacqueline Ferreira ao Programa de Pós-Graduação em Química do Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Estadual de Maringá como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.

MARINGÁ, JUNHO/2009

Universidade Estadual de Maringá

Centro de Ciências Exatas

Departamento de Química

Maringá - 2009

Sensor de pH baseado em filmes de

polímero conjugado e Sensor

biológico baseado em filmes de

ouro nanoestruturado

Tese de Doutorado

Jacqueline Ferreira

Orientador: Emerson Marcelo Girotto

Grupo de Materiais Poliméricos e Compósitos

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Ferreira, Jacqueline F383s Sensor de pH baseado em filmes de polímero

conjugado e sensor biológico baseado em filmes de ouro nanoestruturado / Jacqueline Ferreira. -- Maringá : [s.n.], 2009.

xxiii, 169 f. : figs. color Bibliografia : f. 152-169. Orientador : Prof. Dr. Emerson Marcelo Girotto. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de

Maringá, Programa de Pós-Graduação em Química, 2009. 1. Sensor óptico - Detecção de pH. 2. Sensor de

pH. 3. Polímeros condutores - Caracterização por Raman e espectroeletroquímica in situ. 4. Polipirrol. 5. Biosensor - Detecção de marcadores tumorais. 6. Plasmon de superfície (SPR) - Nanoestrutura. I. Girotto, Emerson Marcelo, orient. II. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Química. III. Título.

CDD 21.ed. 681.25

Aos meus pais, Cícero e Nair,

irmãs Janicler e Karina e ao Marcos

pelo incentivo, carinho, compreensão e

amor incondicional.

i

“You can be the most brilliant scientist in all the

world; put you on a desert island with the very best

scientific equipment and the very best library and

you'll do uninteresting research. You must have

interaction. You must have discussion.”

A. J. MacDiarmid

Agradecimentos

ii

À Deus pela vida, carinho e proteção

Ao Prof. Emerson, pela orientação.

Aos Professores do GMPC: Adley Forti Rubira, Eduardo Radovanovic, Gizilene M.

de Carvalho e Edvani C. Muniz e também ao Prof. Gentil J. Vidotti pela amizade e

ensinamentos.

Ao Prof. Alexandre G. Brolo, pela acolhida em Victoria, BC, Canadá, durante o

estágio em seu laboratório.

À equipe de trabalho do Prof. Brolo: David Sinton, Reuven Gordon e Duan Xiabo e

aos alunos do grupo: Fatemeh, Carlos, Christy, John, Paul, Asif, Andrew e Michael

pela colaboração e amizade.

Aos amigos do laboratório: Marcos Kunita, Thelma, Guilherme, Rafael, Marcos R.

Maurício, Chico, Tiago, Gedalias, Aline, Rafão, Shirani, Adriano e, também aos

amigos que passaram pelo laboratório: Aline, Ana Paula, Juliana, Rafaelle, Janaína,

Luiz Henrique, Andrélson, Roberto, Rafael, Raíssa, pelo agradável convívio e

amizade.

Ao Marcos Kunita, novamente por manter o laboratório sempre funcionando, pela

sua amizade e pela constante disposição em ajudar.

Ao Roberto e Andrélson por me guiarem durantes os primeiros passos no

laboratório.

Aos amigos do Canadá, os quais têm feito muita falta: Meikun, Yuchun, Celly,

Gustavo, Simon, Jason, Laura, Milton e Mohammad pela amizade, companheirismo

e por terem feito do meu estágio uma fase especial da minha vida.

À todos os professores que participaram da minha formação.

À Rafaelle, pelas medidas de EDS.

Ao Prof. Eduardo, pelas medidas de AFM.

À Prof. Liliana, pelas medidas de espessura.

Ao Prof. Fernando Josepetti Fonseca, pelos microeletrodos de ouro digitalizado.

Ao Prof. Reuven pelos cálculos teóricos por FDTD.

Ao Mohammad e Fatemeh, pelas amostras fabricadas utilizando o FIB.

Ao Carlos, Paul e Michael pela contribuição na área de microfluídos.

Às pessoas que mesmo distantes sempre estiveram muito perto: meus pais, irmãs,

sobrinhos, Ewandro, Adhiely, Paulinha, Cris e Duda.

Ao Seu Zé, D. Maria e Eliane, pela paciência e compreensão.

Aos órgãos de financiamento: CAPES, CNPq, GSEP e NSERC.

Ao Claudemir e à Cristina da secretaria de Pós-Graduação.

Ao meu Marcos, principalmente pela paciência durante os momentos de estresse.

E a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para este trabalho.

Resumo

iii

Título: Sensor de pH baseado em filmes de polímero conjugado e Sensor biológico

baseado em filmes de ouro nanoestruturado

Autora: Jacqueline Ferreira

Orientador: Emerson M. Girotto

Palavras-chave: Sensor óptico, polipirrol, pH, biosensor, EOT, SPR

Este trabalho está dividido em duas partes: i) o estudo de filmes de polipirrol

dopado com azul de bromofenol (Ppi-AB) para aplicação em sensor de pH e ii) o

estudo de filmes de ouro nanoestruturado para aplicação em biosensor baseado em

emissão extraordinária de luz (EOT) induzido por ressonância de plasmón de

superfície (SPR). Na primeira parte, filmes de Ppi-AB foram sintetizados

eletroquimicamente e então foram opticamente, eletroquimicamente e

estruturalmente caracterizados por espectroeletroquímica UV-Vis e Raman in situ,

IV, EDS-MEV e AFM. A interação entre dopante e polímero mostrou-se dependente

tanto do pH quanto do nível de oxidação do polímero. Durante a oxidação da cadeia

do Ppi, o equilíbrio de dissociação do AB se desloca para neutralizar as cargas

positivas geradas na matriz polimérica. Como as propriedades ópticas e ôhmicas do

filme de Ppi são afetadas pela presença do indicador AB, fez-se em seguida o

estudo destas propriedades frente a variações de pH. O Ppi-AB apresentou pKa em

7,4; o que o viabiliza para análise de amostras fisiológicas. Além disso, o Ppi-AB

apresentou características importantes de um sensor eficiente como estabilidade,

reversibilidade, reprodutibilidade e curto tempo de resposta. Durante a segunda

parte deste trabalho, desenvolvemos um novo esquema para a detecção de

moléculas biológicas utilizando um substrato contendo nanoburacos perfurados

através de um filme de Au, o qual exibe EOT devido à SPR. Esta amostra foi

utilizada para a detecção de marcadores de câncer de ovário através do método de

aquisição de imagens, permitindo a detecção de diferentes concentrações do

marcador biológico em medidas de tempo real. Este dispositivo pode ser futuramente

utilizado para avaliar a eficiência de tratamentos de câncer, já que pode detectar a

variação da concentração dos marcadores tumorais durante o tratamento. Para

melhorar as propriedades analíticas do sensor, recobriu-se o filme de ouro com SiOx,

sendo ambos perfurados posteriormente para a fabricação de nanoburacos. Desta

forma, há ouro exposto somente na parte interna do nanoburaco, consequentemente

os plasmóns de superfície se confinam no interior do buraco, onde é feita a detecção

das moléculas. Este dispositivo foi aplicado com sucesso na detecção de

quantidades attomolares de proteínas, apresentando sensibilidade de 650 nm/UIR.

Abstract

iv

Title: pH Sensors based on conjugated polymer films and Biosensor based on

nanostructured gold films

Author: Jacqueline Ferreira

Supervisor: Emerson M. Girotto

Keywords: Optic sensor, polypyrrole, pH, biosensor, EOT, SPR

The present work is divided in two parts: i) the investigation of Ppi-AB films for

application as pH sensor and ii) the investigation of nanostructured gold films for

application as biosensor based on extraordinary optical transmission (EOT) through

surface plasmon resonance (SPR). In the first part, bromophenol blue doped

polypyrrole (Ppi-AB) films were electrochemically synthesized and then optically,

electrochemically and structurally characterized by in situ UV-Vis and Raman

spectroelectrochemistry, IR, EDS-MEV, and AFM. The interaction between dopant

and polymer was found both pH and oxidation level dependent. During the oxidation

of the ppy chains, the dissociation equilibrium of AB is shifted in order to neutralize

the positive charges created in the polymer matrix. As both optical and ohmic

properties of the ppy film are affected by the presence of AB, an investigation of

these properties at different pH was also perfomed. Ppi-AB presented pKa 7.4,

making possible for this system to be applied in the analysis of physiological

samples. In addition, Ppi-AB presents important characteristics of an efficient sensor

such as stability, reversibility, reproducibility and short response time. During the

second part of this work, a new approach for the detection of biomolecules based on

nanoholes milled through gold films was developed, which presents EOT due to SPR.

This sample was used to detect biomarkers of ovarian cancer by acquiring images,

allowing the detection of different concentrations of the biomarker during real-time

measurements. According to the results, this device can be applied to track the

efficiency of a cancer treatment. Aiming to improve the analytical properties of the

sensor, nanoholes were milled all the way through gold films covered with a SiOx

layer. Therefore, the only gold surface exposed is inside the nanoholes. As result the

surface plasmon is also confined in the nanoholes where the biomolecules detection

occurs. This approach was successfully applied to detect attomolar amounts of

protein, presenting sensitivity of 650 nm/RIU.

Informações Curriculares

v

Formação acadêmica

Bacharelado e Licenciatura plena em Química (2000 – 2003).

Universidade Estadual de Maringá, PR.

Iniciação científica com bolsa CNPQ (2000 – 2003).

Início do mestrado em março de 2004 com passagem direta para o doutorado em

agosto de 2005 (bolsa CAPES).

Estágio sanduíche (setembro 2007 – outubro 2008) realizado na University of

Victoria (Canada).

Produção Científica

Artigos:

1) J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, In situ investigation of a chemical process

inside polypyrrole matrix by Raman spectroelectrochemistry, ACS Applied

Materials & Interfaces, 2009, submetido.

2) J. Ferreira, E. M. Girotto, pH ohmic sensor based on bromophenol blue-doped

polypyrrole, Journal of the Brazilian Chemical Society, 2009, aceito.

3) F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, X. Duan, E. M. Girotto, A. G. Brolo, R.

Gordon, D. Sinton, Nanoholes as nanochannels: flow-through plasmonic

sensing, Analytical Chemistry, 2009, 81, 4308.

4) J. Ferreira, M. J. L. Santos, M. M. Rahman, A. G. Brolo, R. Gordon, D. Sinton,

E. M. Girotto, Attomolar Protein Detection Using in-Hole Surface Plasmon

Resonance, Journal of the American Chemical Society, 2009, 131, 436.

5) M. J. L. Santos, J. Ferreira, E. Radovanovic, R. Romano, O. L. Alves, E. M.

Girotto, Enhancement of the Photoelectrochemical Response of

Poly(terthiophenes) by CdS(ZnS) Core-Shell Nanoparticles, Thin Solid Films,

2009, 517, 5523.

6) J. Ferreira, E. M. Girotto, Optical pH sensitive material based on bromophenol

blue-doped polypyrrole, Sensors and Actuators, B Chem, 2009, 137, 426.


vi

7) A. G. Brolo, J. Ferreira, M. J. L. Santos, C. Escobedo, D. Sinton, E. M. Girotto,

F. Eftekhari, R. Gordon, Development of plasmonic substrates for biosensing,

Proceedings of SPIE, 2008, 7035, 703503.

8) J. Ferreira, M. J. L. Santos, R. Matos, O. Ferreira, A. F. Rubira, E. M. Girotto,

Structural and electrochromic study of polypyrrole synthesized with azo and

anthraquinone dyes, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2006, 591, 27.

Participações em Congressos:

1) J. Ferreira, E. M. Girotto, O. N. de Oliveira Jr., “Biosensor Based on Surface

Plasmon for Earlier Diagnostic of Cancer”, INEO – 1st Workshop of the National

Institute for Organic Electronics, Atibaia, SP, Brasil, 2009.

2) C. Escobedo, J. Ferreira, F. Eftekhari, R. Gordon, A. G. Brolo, D. Sinton,

“Plasmonic Nanohole array sensors integrated in ELISA-type anf flow-through

array platforms”, MicroTAS – The 13th International Conference on Miniaturized

Systems for Chemistry and Life Sciences, Jeju, South Korea, 2009.


E. M. Girotto, “Attomolar Protein Detection Using in-Hole surface Plasmon

Resonance”, BiopSys Network for Bioplasmonic Systems – 1st All Network

Meeting of BiopSys, Toronto, ON, Canada, 2008.


E. M. Girotto, “Attomolar Protein Detection Using in-Hole surface Plasmon

Resonance”, PCCAM – Pacific Centre for Advanced Materials and

Microstructures, Victoria, BC, Canada, 2008.

5) C. Escobedo, J. Ferreira, F. Eftekhari, R. Gordon, A. G. Brolo, D. Sinton, “Solid

and Fluid Mechanics of Flow-through nanohole array based sensing”,

PCCAM - Pacific Centre for Advanced Materials and Microstructures, Victoria,

BC, Canada, 2008.

6) F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, P. Wood, R. Gordon, A. G. Brolo, D.

Sinton, “Biaxial Nanohole Array Sensing and Optofluidic Integration”,

IEEE/LEOS Summer Topicals – Optofluidics, Acapulco, Guerrero, Mexico,

2008.


vii

7) F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, P. Wood, R. Gordon, A. G. Brolo, D.

Sinton, “Nanohole Arrays as Optical and Fluidic Elements for Sensing”,

ASME-IMECE – International Mechanical Engineering Congress & Exposition,

Boston, MA, United States of America, 2008.

8) J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, “Ppy/BPB Characterization by in situ

Raman spectroelectrochemistry”, CSC – 91st Canadian Chemistry Conference

and Exibition, Edmonton, AB, Canada, 2008.

9) J. Ferreira, M. J. L. Santos, E. M. Girotto, “Estudo de interferentes na resposta

óptica frente ao pH do polipirrol dopado com corantes”, SIBEE – XVI Simpósio

Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, Águas de Lindóia, SP, Brasil,

2007.

10) M. J. L. Santos, J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, “Evolution of the Ppy

vibrational bands resulting from polaron and bipolaron states determined by in

situ Raman spectroelectrochemistry”, SIBEE – XVI Simpósio Brasileiro de

Eletroquímica e Eletroanalítica, Águas de Lindóia, SP, Brasil, 2007.

11) R. F. M. S. Marcondes, P. S. D. Agostini, E. M. Girotto, A. F. Rubira, J. Ferreira,

A. Pawlicka, D. C. Dragunski, “Characterization of Amylopectin-Rich Starch

Plasticized with Glycerol”, 10th International Symposium on Polymer

Electrolytes, Foz do Iguaçú, Pr, Brasil, 2006.

12) R. F. M. S. Marcondes, P. S. D. Agostini, E. M. Girotto, J. Ferreira, A. Pawlicka,

D. C. Dragunski, “Chemically Modified Cassava Starch Plasticized with Ethylene

Glycol and Sorbitol”, 10th International Symposium on Polymer Electrolytes, Foz

do Iguaçú, Pr, Brasil, 2006.

13) J. Ferreira, E. M. Girotto, “Polipirrol Dopado com Indicadores Ácido-Base para

Aplicação de Sensores de pH”, SIBEE – XV Simpósio Brasileiro de

Eletroquímica e Eletroanalítica, Londrina, Pr, Brasil, 2005.

14) J. Ferreira, A. W. Rinaldi, E. M. Girotto, “Sensores Condutimétricos de pH

Baseados em Polipirrol Dopado com Indicadores Ácido-Base”, SBQ-Sul – XIII

Encontro de Química da Região Sul, Florianópolis, SC, Brasil, 2005.

Lista de Abreviações e Símbolos

viii

comprimento de onda

mobilidade relativa

c comprimento de onda de

corte

max comprimento de onda

para o máximo de

transmissão

3-APTES aminopropiltrietoxisilano

A absorbância

A0 absorbância do filme

imerso em solução

tampão sem interferente

Aác absorbância da forma

ácida

AB azul de bromofenol

Abás absorbância da forma

básica

AC anticorpo

AFM microscopia de força

atômica

AG antígeno

Ai absorbância da mistura

contendo as formas

ácidas e básicas

An anilina

atto prefixo do sistema

internacional de unidades

que denota um fator de

10-18

Ax absorbância do filme

imerso em solução

tampão contendo

interferente

b caminho óptico

BC banda de condução

BNHS biotina éster N-hidróxi

succinimidil

BSA albumina de soro bovino

BV banda de valência

C concentração (mol.L-1)

c velocidade da luz no

vácuo

C.I. coeficiente de

interferência

ca. do latim “circa” =

aproximadamente

CCD dispositivo de carga

acoplado

CG-MS cromatografia gasosa

acoplada a

espectrometria de massa

cols. colaboradores

DMSO dimetil sulfóxido

DNA ácido desoxirribunucleico

DSU ditiobis(succinimidil

undecanoato)

E potencial aplicado

e unidade de carga

eletrônica (1,6 x 10-19 C)

e.g. do latim “exempia gratia”

= por exemplo

E.T. eletrodo de trabalho

E0redox potencial redox padrão

Índice de Abreviações e Símbolos

ix

ECS eletrodo de calomelano

saturado

EDS energia dispersiva de

raios-X

Eelet energia dos níveis

eletrônicos

Egap valor de energia do gap

ELISA Análise-Enzima-Imuni-

Adsorvida

EMF evaporated metal films

EOT extraordinary optical

transmission

EPR ressonância

paramagnética eletrônica

Erot energia dos níveis

rotacionais

Evib energia dos níveis

vibracionais

FDTD Diferenças Finitas no

Domínio de Tempo

FIB feixe de íons focado

FTIR Infravermelho por

transformada de Fourier

FTO-vidro vidro recoberto com

óxido de flúor dopado

com índio

ATR reflexão total atenuada

He-Ne hélio-neônio

HInd forma protonada de um

indicador ácido-base

HOMO highest occupied

molecular orbital

i corrente elétrica

IAB Intensidade da banda

Raman para a forma AB

IAB- Intensidade da banda

Raman para a forma AB-

IAB2-

Intensidade da banda

Raman para a forma AB2-

Id intensidade do campo

eletromagnético

Ind- forma desprotonada de

um indicador ácido-base

IT intensidade transmitida

IR infrared

k comprimento do vetor de

onda da luz incidente

com comprimento de

onda fixo

kpara vetor de onda do fóton

paralelo ao plano de

incidência no prisma

ksp vetor de onda do fóton

que excita os elétrons

livres na superfície

LUMO lowest unoccupied

molecular orbital

MEV microscopia eletrônica de

varredura

MPTMS 3-mercaptopropil-

trimetoxisilano

n concentração de

portadores livres no

material


x

na índice de refração para

uma camada com

espessura entre 0 e d

NA abertura numérica

(numerical aperture)

nb índice de refração para

uma camada com

espessura entre d e

infinito correspondente

ao branco da medida

neff índice de refração efetivo

NHS éster

N-hidroxisuccinimida

oPD o-fenilenodiamina

ƟSPR ângulo de SPR

P periodicidade = distância

entre o centro dos

buracos

PA poliacetileno

PANI polianilina

PAX8 pared box gene 8

(anticorpo para câncer de

ovário)

STF solução tampão fosfato

PDMS poli (dimetilsiloxano)

PEG poli (etileno glicol)

PET poli (tereftalato de

etileno)

Pi pirrol

PICe polímeros

intrinsecamente

condutores eletrônicos

PiQH 3-(2,5-dihidroxibenzil)

Ppi polipirrol

Ppi-AB polipirrol dopado com

azul de bromofenol

Ppi-Cl polipirrol dopado com

cloreto

Ppi-ClO4 polipirrol dopado com

perclorato

Ppi-PVS polipirrol dopado com

ácido polivinilssulfônico

r raio do buraco

R0 resistência do filme antes

da imersão em solução

tampão

Ri resistência do filme

imerso em solução

tampão contendo

interferente

RIU refractive index unit

Rms rugosidade média

quadrada

r-PAX8 recombinant pared box

gene 8 (antígeno para

câncer de ovário)

Rx resistência do filme após

imersão em solução

tampão

S sensibilidade

S% sensibilidade ôhmica

(percentual) ao pH

SAM camada auto montada

SP plasmóns de superfície

SPR ressonância de plasmón

de superfície


xi

T temperatura

UIR unidade de índice de

refração

uni. arb. Unidade arbitrária

UV-Vis ultravioleta-visível

VC voltametria cíclica

z distância acima da

superfície do ouro

ε absortividade

εa constante dielétrica do

meio

εm constante dielétrica do

metal

ηB eficiência de transmissão

σ condutividade elétrica do

bulk

ω frequência da luz incidente

Índice de Figuras

xii

Figura 1: Aplicações tecnológicas dos polímeros condutores.1 ................................... 3

Figura 2: Estrutura da forma neutra de alguns polímeros conjugados com suas

respectivas condutividades para altos níveis de dopagem. Destaca-se o

polipirrol por ser o polímero utilizado neste trabalho. ........................................... 4

Figura 3: Diagrama de energia mostrando as propriedades intrínsecas do material

como resultado da diferença de energia na região do gap. .................................. 6

Figura 4: Modelo do soliton no poliacetileno, ilustrando o soliton negativo, neutro e

positivo, da esquerda para a direita, respectivamente.11 ...................................... 7

Figura 5: Ilustração hipotética de todos os possíveis defeitos estruturais

apresentados pelo polipirrol.1 ............................................................................. 11

Figura 6: Modelos do polaron e bipolaron no polipirrol. A espécie X- representa um

íon dopante. ........................................................................................................ 13

Figura 7: Mecanismo de polimerização eletroquímica do pirrol.42 ............................. 14

Figura 8: Esquema da evolução da estrutura de bandas para o polipirrol. ................ 14

Figura 9: Evolução do espectro de absorção do Ppi em função do nível de

dopagem.11 ......................................................................................................... 16

Figura 10: Equilíbrio de dissociação do indicador de pH azul de bromofenol (AB).... 20

Figura 11: Ilustração dos espalhamentos Rayleigh e Raman e da absorção no

infravermelho. As linhas 0 e 1 representam os níveis de energia vibracionais.

........................................................................................................................... 27

Figura 12: Típica excitação do sinal para voltametria cíclica, potencial na forma de

onda triangular. ................................................................................................... 30

Figura 13: Arranjo experimental para as medidas espectroeletroquímicas e Raman in

situ. ..................................................................................................................... 35

Índice de Figuras

xiii

Figura 14: Voltamograma cíclico durante a síntese do Ppi-AB. Velocidade de

varredura 20 mV.s-1. Segunda varredura. .......................................................... 37

Figura 15: Espessura dos filmes Ppi-ClO4 e Ppi-AB variando o número de ciclos

utilizado durante a síntese eletroquímica por voltametria cíclica vs ECS. .......... 38

Figura 16: Contraste óptico em função do pH para filmes de Ppi-AB sintetizados

eletroquimicamente com diferentes números de ciclos durante a voltametria

cíclica. Absorbâncias correspondentes a 584 nm. ............................................. 39

Figura 17: Espectros de FTIR-ATR para filmes de Ppi-ClO4, Ppi-AB e para o

indicador AB. ...................................................................................................... 40

Figura 18: a) Imagem por MEV para o filme Ppi-AB. Mapeamento por EDS da

superfície do filme Ppi-AB, sendo b) distribuição de átomos nitrogênio e

c) distribuição de átomos bromo. ........................................................................ 41

Figura 19: Intensidades dos picos de N e Br no espectro de EDS da amostra de

Ppi-AB eletropolimerizado sobre FTO-vidro. ...................................................... 42

Figura 20: Imagens de AFM na escala de 2,55 μm x 2,55 μm para o Ppi-AB e

2,81 μm x 2,81 μm para o Ppi-ClO4. Rms = rugosidade média quadrática. ......... 44

Figura 21: Imagens de AFM (diferença na dureza da superfície) na escala de

2,52 x 2,52 μm para Ppi-AB e 2,81 x 2,81 μm para Ppi-ClO4. ........................... 45

Figura 22: Voltamogramas cíclicos do a) Ppi-ClO4 e b) Ppi-AB em pH 1,5 e 7,5. Em

detalhe: voltamograma cíclico do AB em pH 1,5. Solucão tampão fosfato foi

utilizada como eletrólito. Velocidade de varredura de 20 mV.s-1. ....................... 46

Figura 23: Espectros UV-Vis do corante AB solubilizado em solução tampão fosfato

de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0. .................................................................... 48

Figura 24: Espectros UV-Vis para o Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de pH

a )1,5; b) 3,0; c) 7,5 e d) 11,0. ............................................................................ 50

Índice de Figuras

xiv

Figura 25: Espectros Raman do corante AB (Azul de Bromofenol) solubilizado em

solução tampão fosfato com diferentes pH. Fonte com emissão em 785 nm. .... 52

Figura 26: Espectros Raman in situ em pH 3,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em

detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em

633 nm. ............................................................................................................... 53



633 nm. ............................................................................................................... 55



633 nm. ............................................................................................................... 56

Figura 29: Dependência do equilíbrio do corante com o potencial aplicado em pH 3,0

e 8,0. As intensidades analisadas correspondem às bandas em 860 cm-1 (AB2-)

e em 893 cm-1 (AB). ............................................................................................ 57

Figura 30: Dependência do pKa do Ppi-AB com o potencial aplicado para os

equilíbrios envolvendo as formas AB e AB- (curva em vermelho) e AB- e AB2-

(curva em azul). Em detalhe: intensidades relativas das bandas Raman

atribuídas às formas AB- e AB2- com potencial aplicado de -0,4 V. .................... 58

Figura 31: a) Espectros de absorção do filme Ppi-ClO4 imerso em solução tampão

fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0; e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva

de calibração para Ppi-ClO4 imerso em solução tampão de diferentes pH para

valores de absorbância em 680 nm. ................................................................... 69

Figura 32: a) Espectros de absorção do indicador AB solubilizado em solução

tampão fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. Em

detalhe: imagem das soluções de pH 1,5; 3,0 e 7,0 com suas respectivas

colorações. b) Roda de cores desenhada por Newton. ...................................... 70

Índice de Figuras

xv

Figura 33: a) Espectros de absorção do filme Ppi-AB imerso em solução tampão

fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva

de calibração para Ppi-AB imerso em solução tampão de diferentes pH. .......... 72

Figura 34: Curva de histerese para Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de

pH 1,5 a 11,0 e pH 11,0 a 1,5. ............................................................................ 75

Figura 35: Tempo de resposta do filme Ppi-AB em 594 nm para diferentes pH. ....... 77

Figura 36: Estabilidade óptica dos filmes Ppi-AB imersos em solução tampão fosfato

de diferentes pH. O desvio padrão foi calculado utilizando diferentes filmes de

Ppi-AB. ............................................................................................................... 78

Figura 37: Absorbância em 584 nm para Ppi-AB imerso em soluções tampão de

diferentes pH em função do número de medidas para determinação da

reprodutibilidade e reversibilidade do filme. Os desvios padrão foram calculados

utilizando diferentes filmes de Ppi-AB. ............................................................... 80

Figura 38: (a) Espectro UV-Vis do filme Ppi-AB imerso em pH 3,0 em diferentes

temperaturas e (b) efeito da temperatura na resposta óptica do Ppi-AB em

584 nm imerso em diferentes pH. ....................................................................... 81

Figura 39: Esquema mostrando eletrodos com microarranjos interdigitados.168 ....... 88

Figura 40: a) Eletrodo digitalizado de ouro e b) com o filme de Ppi-AB depositado

eletroquimicamente. Dimensão do substrato de vidro 2,5 cm2. .......................... 91

Figura 41: Sensibilidade ôhmica (resistência relativa) ao pH dos filmes Ppi-AB. ...... 93

Figura 42: Dinâmica da resposta ôhmica do Ppi-AB entre meio alcalino (pH 8,0) e

meio ácido (pH 3,0). ........................................................................................... 94

Figura 43: Estabilidade ôhmica do filme Ppi-AB imerso em tampão fosfato de pH 3,0,

7,0 e 8,0. ............................................................................................................. 96

Figura 44: Reversibilidade e reprodutibilidade do filme Ppi-AB imerso em solução

tampão fosfato com pH 3,0; 7,0 e 8,0. ................................................................ 97

Índice de Figuras

xvi

Figura 45: Efeito da temperatura sobre a resistência elétrica do filme Ppi-AB imerso

em soluções tampão fosfato de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0................................. 99

Figura 46: Decaimento exponencial da onda evanescente relacionada com a

distância da superfície metálica. ....................................................................... 109

Figura 47: Difração e espectro de transmissão típico de luz visível através de um

buraco com sub-comprimento de onda em um filme metálico perfeito

infinitamente fino. ............................................................................................. 111

Figura 48: Transmissão óptica através de um único buraco em um filme metálico de

prata. a) Buraco circular de 270 nm de diâmetro em um filme com 200 nm de

espessura e b) seu espectro de transmissão.278 .............................................. 111

Figura 49: Guia de ondas cilíndrico com raio r muito menor que o comprimento de

onda do campo eletromagnético incidente, perfurado em um filme metálico de

espessura h. A diminuição exponencial representa a atenuação do regime de

sub-comprimento de onda.278 ........................................................................... 112

Figura 50: Imagens (esquerda) e espectros (direita) de transmissão com incidência

normal de luz branca através de arranjos quadrados contendo buracos com

sub-comprimento de onda. Para os arranjos azul, verde e vermelho, foram

utilizadas periodicidades de 300, 450 e 550 nm, respectivamente, os diâmetros

dos buracos são 155, 180 e 225 nm e o comprimento de onda para máxima

transmissão ocorre em 436, 538 e 627 nm. Os arranjos foram fabricados em um

filme de prata de 300 nm de espessura.276....................................................... 113

Figura 51: Esquema de imobilização e detecção por bioafinidade das moléculas

biotina e estreptavidina. .................................................................................... 119

Figura 52: Micrografias obtidas por MEV de a) arranjos de nanoburacos

periodicamente ordenados, fabricados por FIB em um filme de ouro de 100 nm

de espessura. b) Imagem ampliada mostrando o tamanho do arranjo de

nanoburacos. c) Imagem ampliada mostrando a dimensão dos nanoburacos.

Índice de Figuras

xvii

Esta amostra foi utilizada durante as medidas por aquisições de imagens

(seção I.4.1). ..................................................................................................... 127

Figura 53: Esquema e descrição do método de fabricação de microestruturas por

litografia soft. .................................................................................................... 128

Figura 54: (a e b) Imagens MEV de arranjos de nanoburacos perfurados através do

filme de SiOx (50 nm de espessura) e de ouro (100 nm de espessura). Os

nanoburacos foram fabricados com 170 nm de diâmetro e periodicidade de

500 nm. ............................................................................................................. 129

Figura 55: Arranjo experimental para as medidas de transmissão de luz através dos

arranjos de nanoburacos. ................................................................................. 131

Figura 56: Esquema experimental para a aquisição de imagens por transmissão de

luz através dos arranjos de nanoburacos usando uma câmera CCD. .............. 132

Figura 57: Espectros de transmissão para um arranjo de nanoburacos ilustrando a

diminuição da intensidade da luz transmitida no comprimento de onda

equivalente a 633 nm. ...................................................................................... 134

Figura 58: a) Intensidade da luz transmitida através de arranjos de nanoburacos para

diferentes índices de refração. b) Curva de calibração obtida através do gráfico

em a) Fonte utilizada: He-Ne. ........................................................................... 135

Figura 59: Micrografias obtidas por MEV das matrizes de nanoburacos criadas em

um filme de ouro. a) Imagem dos buracos com 200 nm de diâmetro e

periodicidade de 420 nm. b) Imagem da configuração da amostra com matrizes

de nanoburacos organizadas em 7 colunas espaçadas por 150 μm, contendo 4

linhas de arranjos espaçados por 60 μm. ......................................................... 135

Figura 60: Sistema de microcanais utilizado para a determinação da concentração de

um analito através de uma curva de calibração adquiridos durante experimento

em tempo real. .................................................................................................. 136

Índice de Figuras

xviii

Figura 61: Imagem fotográfica (lente objetiva 10X) das matrizes quadradas

(15 x 15 μm2) de nanoburacos alinhadas com os microcanais de 100 μm de

largura. ............................................................................................................. 137

Figura 62: Imagem obtida por uma câmera CCD dos arranjos de nanoburacos

alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados

para a detecção do anticorpo PAX8. ................................................................ 138

Figura 63: a) Intensidades normalizadas da luz transmitida para a linha B de arranjos

de nanoburacos após a detecção do anticorpo PAX8. b) Intensidade média

transmitida em função da diluição (calculada para os arranjos em cada

microcanal). ...................................................................................................... 139


alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados

para a detecção do antígeno r-PAX8. .............................................................. 140

Figura 65: Intensidades normalizadas de luz transmitida para a linha B de arranjos

de nanoburacos após a detecção do antígeno r-PAX8. a) amostra diluída e

b) amostra concentrada de r-PAX8. ................................................................. 141

Figura 66: Intensidade média transmitida em função da diluição (calculada para os

arranjos de nanoburacos presentes em cada microcanal). .............................. 142

Figura 67: a) Representação de um nanoburaco, ilustrando a camada de ouro de

100 nm (amarelo) entre o substrato de vidro e uma camada de SiOx de 50 nm

de espessura. b) Esquema ilustrando a detecção das três camadas de

moléculas confinadas dentro do buraco. Os experimentos foram realizados

utilizando arranjos de 8 μm x 8 μm, contendo nanoburacos com 170 nm de

diâmetro e periodicidade de 500 nm. ............................................................... 143

Figura 68: Voltamogramas em solução aquosa de K3[Fe(CN)6] utilizando como

eletrodo de trabalho: a) eletrodo de ouro sem modificação e b) eletrodo de ouro

coberto com filme de SiOx obtido após 120 h de deposição............................. 144

Índice de Figuras

xix

Figura 69: Espectros de transmissão normalizados empregando soluções de glicose

com índices de refração conhecidos. Bandas relacionadas aos modos de

ressonância a) (1,1) e b) (1,0). ......................................................................... 145

Figura 70: Curvas de calibração resultantes dos deslocamentos dos máximos de

transmissão para a) banda (1,1) e b) banda (1,0). ........................................... 146

Figura 71: a) Espectro de transmissão para arranjos de nanoburacos periodicamente

organizados, obtidos através de um filme de 50 nm de SiOx e um filme de

100 nm de ouro, quando a superfície do ouro foi modificada sequencialmente

por uma monocamada de cisteamina, BNHS e estreptavidina. b) Medidas dos

deslocamentos do máximo de transmissão após a adição de BNHS e

estreptavidina, relativos à superfície modificada com cisteamina. ................... 148

Índice de Tabelas

xx

Tabela 1: Análise quantitativa por EDS dos átomos presentes no Ppi-AB

eletropolimerizado sobre FTO-vidro. .................................................................. 43

Tabela 2: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medidas de absorção do

Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de

interferentes. ....................................................................................................... 83

Tabela 3: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medida de resistência para

o Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de

interferentes. ..................................................................................................... 100

Tabela 4: Comprimentos de onda referentes ao máximo de transmissão obtidos

através de cálculos por FDTD, comparado a valores experimentais onde foram

utilizadas soluções de glicose com diferentes índices de refração. .................. 147

Sumário

xxi

Parte I .......................................................................................................................... 2

I. Considerações Iniciais ........................................................................................... 2

I.1. Introdução ............................................................................................................ 2

I.1.1. Polímeros Condutores .................................................................................... 2

I.1.1.1. Polipirrol .................................................................................................. 10

I.1.2. Sensores ....................................................................................................... 16

I.1.2.1. Sensores baseados em PICe ................................................................. 17

I.1.2.2. Sensores para pH baseados em PICe ................................................... 19

II. Objetivos Gerais .................................................................................................. 22

III. Caracterização do filme polimérico .................................................................. 24

III.1. Introdução ........................................................................................................ 24

III.1.1. Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis) ........................................... 25

III.1.2. Espectroscopia Infravermelho e Espectroscopia Raman ....................... 25

III.1.3. Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS) ..................... 27

III.1.4. Microscopia de Força Atômica (AFM) .................................................... 28

III.1.5. Voltametria Cíclica ................................................................................. 29

III.2. Objetivo específico .......................................................................................... 32

III.3. Parte Experimental .......................................................................................... 33

III.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 33

III.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de platina ........... 35

III.3.3. Síntese dos filmes de polipirrol ................................................................... 36

III.4. Resultados e Discussão ................................................................................. 38

III.4.1. Medidas de Espessura ................................................................................ 38

III.4.2. FTIR-ATR e EDS-MEV................................................................................ 39

III.4.3. Microscopia de Força Atômica (AFM) ......................................................... 43

III.4.4. Voltametria Cíclica (VC) .............................................................................. 45

III.4.5. Caracterização in situ .................................................................................. 47

III.4.5.1. UV-Vis .................................................................................................. 47

III.4.5.2. Medidas por espectroscopia Raman .................................................... 51

III.5. Conclusões Parciais ........................................................................................ 60

IV. Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH ................................. 62

IV.1. Introdução ........................................................................................................ 62

IV.2. Objetivo específico ......................................................................................... 66

Sumário

xxii

IV.3. Parte Experimental .......................................................................................... 67

IV.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 67

IV.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de platina e

Síntese dos filmes de polipirrol ................................................................................ 67

IV.4. Resultados e Discussão ................................................................................. 68

IV.4.1. Sensibilidade Óptica ao pH ......................................................................... 68

IV.4.2. Histerese ..................................................................................................... 74

IV.4.3. Tempo de resposta ..................................................................................... 76

IV.4.4. Estabilidade Óptica ..................................................................................... 77

IV.4.5. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica ................................................ 79

IV.4.6. Efeito da Temperatura ................................................................................ 81

IV.4.7. Efeito de Interferentes ................................................................................ 82

IV.5. Conclusões Parciais ....................................................................................... 84

V. Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH ................................ 86

V.1. Introdução ......................................................................................................... 86

V.2. Objetivo ............................................................................................................. 89

V.3. Parte Experimental ........................................................................................... 90

V.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ........................................................ 90

V.3.2. Síntese dos filmes de polipirrol sobre eletrodos de ouro digitalizado .......... 90

V.4. Resultados e Discussão .................................................................................. 92

V.4.1. Sensibilidade Ôhmica ao pH ........................................................................ 92

V.4.2. Tempo de resposta ...................................................................................... 94

V.4.3. Estabilidade Ôhmica .................................................................................... 95

V.4.4. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica ................................................. 96

V.4.5. Efeito da Temperatura ................................................................................. 98

V.4.6. Efeito de Interferentes ................................................................................. 99

V.5. Conclusões Parciais ...................................................................................... 101

VI. Conclusões Gerais ........................................................................................... 102

Parte II ..................................................................................................................... 104

I. Considerações Iniciais ....................................................................................... 104

I.1. Introdução ........................................................................................................ 104

I.1.1. Câncer ........................................................................................................ 104

I.1.1.1. Marcadores de Câncer ......................................................................... 106

Sumário

xxiii

I.1.2. Sensores biológicos .................................................................................... 106

I.1.3. Ressonância de plasmón de superfície (SPR) ............................................ 107

I.1.3.1. SPR através de filme de ouro com nanoburacos ................................. 110

I.1.3.2. Aplicação de sensores baseados em SPR ........................................... 116

I.1.3.3. Aplicação de sensores baseados em SPR para detecção de câncer .. 117

I.1.3.4. Tecnologia de sensores baseados em SPR ......................................... 118

I.1.4. Estratégias para a melhora da sensibilidade............................................... 121

I.1.4.1. Fatores Geométricos ............................................................................ 121

I.1.4.2. Métodos de imobilização ...................................................................... 122

I.1.5. Microcanais para fluxo de soluções ............................................................ 123

I.2. Objetivos .......................................................................................................... 124

I.3. Parte Experimental .......................................................................................... 125

I.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 125

I.3.2. Fabricação dos nanoburacos ...................................................................... 126

I.3.3. Fabricação dos microcanais........................................................................ 127

I.3.4. Deposição de SiOx ...................................................................................... 129

I.3.5. Teste de sensibilidade ................................................................................ 130

I.3.6. Prova de conceito – detecção de proteína dentro do nanoburaco .............. 130

I.3.7. Medidas Ópticas e Sistema de Fluxo .......................................................... 130

I.4. Resultados e Discussão ................................................................................. 133

I.4.1. Detecção por imagens ................................................................................ 133

I.4.2. Detecção dentro dos nanoburacos por espectrofotometria UV-Vis ............. 142

I.5. Conclusões ...................................................................................................... 151

VII. Referências Bibliográficas ............................................................................. 152

Parte I

Capítulo I

Sensor de pH baseado em

filmes de polímero

conjugado

Capítulo I - Introdução Parte I

2

Parte I

I. Considerações Iniciais

I.1. Introdução

I.1.1. Polímeros Condutores

Uma das principais conquistas industriais da química no século XX foi a

fabricação em grande escala de polímeros sintéticos, os chamados polímeros

convencionais. Com eles foram criados materiais fundamentais para o

desenvolvimento tecnológico, como o plástico, as fibras sintéticas e as resinas

artificiais. Devido ao grande interesse nas pesquisas envolvendo estes materiais

poliméricos, desencadeou-se um avanço na sua tecnologia, possibilitando o

desenvolvimento de novos produtos. Certamente, uma das propriedades mais

importantes dos polímeros convencionais está relacionada com sua capacidade de

se comportar como isolante elétrico tanto para altas frequências quanto para altas

voltagens, o que confere a eles uma grande aplicabilidade. O estudo e compreensão

das propriedades destes materiais são de grande importância no sentido de

possibilitar a proposição e desenvolvimento de novos materiais.

A partir da década de 70, polímeros com sistemas π estendidos, também

conhecidos como polímeros conjugados, ficaram conhecidos por apresentarem

propriedades semicondutoras (ou seja, capacidade de conduzir eletricidade).

Inicialmente eles não despertaram interesse científico, uma vez que muitos deles

eram opacos, insolúveis e infusíveis, fatores que dificultavam seu processamento.

Neste aspecto, apresentavam propriedades principalmente mecânicas inferiores

quando comparadas com as dos polímeros até então conhecidos.1-3 A descoberta

destes materiais ocorreu em meados dos anos 70 quando H. Shirakawa e cols.4

verificaram que o tratamento do poliacetileno com ácido ou base de Lewis

aumentava sua condutividade em até dez ordens de grandeza. Esse fato despertou

grande interesse por parte de um número significativo de grupos de pesquisa criando

a área de “Polímeros Intrinsecamente Condutores eletrônicos” (PICe)*

* A especificação “eletrônicos” deve ser feita para diferenciá-los dos “Polímeros Intrinsecamente

Condutores iônicos” (PICi).


3

proporcionando ainda o prêmio Nobel de química em 2000 a H. Shirakawa

(Universidade de Tsukuba, Japão), A. G. MacDiarmid (Universidade da Pensilvânia,

EUA) e A. J. Heeger (Universidade da Califórnia, Santa Bárbara, EUA). Estes PICe

são caracterizados por uma seqüência de ligações duplas conjugadas na cadeia

polimérica, passando de isolantes a condutores e vice-versa através de um processo

de oxidação-redução, também chamado de “dopagem e desdopagem”.

O grande interesse em se estudar polímeros condutores resulta do grande

número de possibilidades de aplicações destes materiais, incluindo o seu uso como

componente ativo em baterias, sensores, dispositivos eletrocrômicos, capacitores,

diodos emissores de luz (OLED), células solares, entre outros.1-8 A Figura 1

apresenta um diagrama esquemático de propriedades e possíveis aplicações

tecnológicas dos polímeros condutores eletrônicos.

Figura 1: Aplicações tecnológicas dos polímeros condutores.1

Os polímeros condutores, também conhecidos como “metais sintéticos”, são

característicos por possuírem longos sistemas π conjugados, com ligações duplas e

simples alternadamente ao longo da cadeia polimérica. Dentre os polímeros

condutores mais estudados estão o poliacetileno, a polianilina, o polipirrol e o

Polímeros Condutores

Estado Sólido

SuperfícieCondutoraEMI/ESO

Ferromagnetismo

Eletrocromismo

Processoóptico não-linear

Super condutores

Compósitoscondutores

Condutividade

Fotocondutividade

Piezoeletricidade

Reações fotoquímicasno estado sólido

SensoresLed,

fotocopiadoras

Gravaçãomagnética

Dispositivoseletrocrômicos

GeradoresHarmônicos

Super capacitoresconectores

Junção de JosephsonComputadores lógicos

Geradores de alto campo magnético

MicromotoresTransdutores

Litografia

Baterias plásticas


4

politiofeno, cujas estruturas em sua forma neutra e suas respectivas condutividades

eletrônicas no estado altamente dopado9 estão representadas na Figura 2. Estes

materiais apresentam diferentes condutividades eletrônicas, a qual varia dependendo

do material e do seu nível de dopagem. A condutividade eletrônica de um PICe é

também dependente do método de preparação e do contra-íon usado como dopante.

Embora esteja apresentado o segmento das estruturas mais simples e suas

respectivas condutividades, derivados destes PICe podem apresentar condutividade

maior do que os valores apresentados na Figura 2.

Figura 2: Estrutura da forma neutra de alguns polímeros conjugados com suas

respectivas condutividades para altos níveis de dopagem. Destaca-se o polipirrol por

ser o polímero utilizado neste trabalho.

Os elétrons deslocalizados em sistemas π ao longo da cadeia polimérica

permitem que esta classe de polímeros tenha propriedades condutoras e

proporcionem habilidade para suportar os portadores de carga positivos e/ou

negativos com alta mobilidade ao longo da cadeia. As propriedades semicondutoras

N

N

N

N

H

H

H

H

S

S

S

S

N N N N

H

H

poli(p-fenileno)

polianilina

politiofeno

polipirrol

poli(trans-acetileno)

CONDUTIVIDADE

Scm-1

POLÍMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR

10-100

200

600

105

500

N

N

N

N

H

H

H

H

S

S

S

S

N N N N

H

H

poli(p-fenileno)

polianilina

politiofeno

polipirrol


CONDUTIVIDADE

Scm-1


10-100

200

600

105

500

N

N

N

N

H

H

H

H

S

S

S

S

N N N N

H

H

poli(p-fenileno)

polianilina

politiofeno

polipirrol


CONDUTIVIDADE

Scm-1


10-100

200

600

105

500

N

N

N

N

H

H

H

H

S

S

S

S

N N N N

H

H

poli(p-fenileno)

polianilina

politiofeno

polipirrol


CONDUTIVIDADE

Scm-1


10-100

200

600

105

500

N

N

N

N

H

H

H

H

S

S

S

S

N N N N

H

H

poli(p-fenileno)

polianilina

politiofeno

polipirrol


CONDUTIVIDADE

Scm-1


10-100

200

600

105

500

Polímero Intrisecamente Condutor Condutividade (S.cm-1)


polipirrol

poli(p-fenileno)

politiofeno

polianilina

100

104


5

destes materiais surgem da sobreposição de orbitais pz provenientes das ligações

insaturadas. Esta sobreposição sobre vários sítios resulta na formação de bandas de

valência (BV) π e bandas de condução (BC) π*, com um pequeno gap de energia

entre elas (condição necessária para o comportamento semicondutor).3,10-14

A condutividade destes materiais pode ser aumentada muitas vezes através

do processo de “dopagem”. Este processo pode ser obtido através de métodos

químicos de exposição direta do polímero a agentes de transferência de carga

(dopantes) em fase gasosa ou solução, ou ainda por oxidação eletroquímica. A

dopagem também pode ser realizada utilizando substituintes como agentes

oxidantes ou redutores, ou ainda radicais, íons doadores ou aceptores de elétrons. O

termo dopagem é utilizado em analogia aos semicondutores inorgânicos cristalinos,

uma vez que em ambos os casos a dopagem é aleatória e não altera a estrutura do

material, contudo, na dopagem de polímeros condutores eletrônicos os dopantes não

são considerados apenas “impurezas” do ponto de vista de “quantidade”, pois estão

presentes em maior concentração quando comparados com semicondutores

inorgânicos. A dopagem de polímeros condutores envolve a dispersão aleatória ou a

agregação de dopantes em toda a cadeia, levando à formação de defeitos e

deformações na cadeia polimérica, resultando na formação de bandas eletrônicas

desocupadas, as quais são as responsáveis pelo aumento da condutividade.3,12

A teoria de bandas não explica porque os portadores de carga, elétrons ou

buracos, possuem spin nulo no poliacetileno.2,10,11 Para explicar estes fenômenos,

alguns conceitos físicos, como polarons, bipolarons e solitons, são utilizados em

polímeros condutores desde o início dos anos 80.2

A interação de um monômero com suas vizinhanças, quando da formação do

polímero, leva à formação de vários níveis de energia muito próximos, ocorrendo a

formação de bandas eletrônicas. A banda de valência (BV) abrange os níveis

eletrônicos ocupados, sendo designado como HOMO (Highest Occupied Molecular

Orbital) o estado eletrônico no topo da BV, ou seja o de maior energia, e a banda de

condução (BC) é constituída pelos níveis não ocupados, sendo designado LUMO

(Lowest Unoccupied Molecular Orbital) o estado eletrônico no fundo da BC, ou seja o

de menor energia. A região do gap está relacionada com a diferença de energia

entre a BV e a BC e determina as propriedades elétricas intrínsecas do material,

como mostrado na Figura 3.


6

Figura 3: Diagrama de energia mostrando as propriedades intrínsecas do material

como resultado da diferença de energia na região do gap.

Polímeros condutores podem ser separados em duas classes, aqueles com

estado fundamental degenerado e aqueles com estados não-degenerados. O

poliacetileno (PA) é um exemplo para o primeiro caso, possuindo um estado

fundamental de energia duplamente degenerado (devido às ligações simples e

duplas que podem ser alternadas sem gasto de energia). Alguns polímeros como

polipirrol, polianilina, politiofeno se encaixam na segunda classe de polímeros

condutores, os quais possuem estados fundamentais não-degenerados de energia,

isso ocorre, por exemplo, no caso do polipirrol, devido à diferença de energia entre

as formas quinóide e benzóide.

Com relação ao PA, Su e cols.15 propuseram um modelo baseado na existência

de defeitos estruturais na cadeia originados durante a polimerização, resultando na

formação de radicais no estado desdopado.16 Estes defeitos deslocalizados seriam

provenientes de alguns átomos de carbono da cadeia polimérica. Na configuração

cis este defeito, por unir duas estruturas de energia ligeiramente diferentes, seria

localizado, enquanto que na configuração trans o defeito por unir estruturas

exatamente de mesma energia (híbridos de ressonância degenerados), permitiria um

rearranjo na cadeia do polímero envolvendo o radical livre e os elétrons-π da ligação

dupla mais próxima. Este defeito (Figura 4) foi chamado de soliton,17 que em termos

de estrutura eletrônica, é o responsável pelo aparecimento de um único nível de

BVBV

BV

BCBC

BC

METAL SEMICONDUTOR

ISOLANTE

GAPGAP

Energia

HOMO

LUMO


7

energia localizada exatamente no meio do gap, devido à degenerescência do

sistema no estado fundamental.

Figura 4: Modelo do soliton no poliacetileno, ilustrando o soliton negativo, neutro e

positivo, da esquerda para a direita, respectivamente.11

Através de processos de oxidação ou redução é possível remover ou adicionar

elétrons na cadeia polimérica, originando solitons carregados positiva ou

negativamente. Estas espécies podem se mover ao longo da cadeia do PA

transportando a carga, no entanto com spin zero. Quando um elétron é adicionado

ao cátion ou removido do ânion, um radical soliton neutro é outra vez estabelecido.

Este modelo baseado nos solitons não explica o comportamento exibido por outros

polímeros condutores poli-heterocíclicos, pois não possuem estado fundamental

degenerado.

O modelo polaron/bipolaron consiste em uma extensão do Modelo de Bandas,

sendo o modelo teórico mais empregado para explicar a condução elétrica nos

polímeros intrinsecamente condutores. Polaron18-20 é o nome que se dá ao cátion

- +

OxidaçãoRedução

BV

BC

BV

BC

BV

BC


8

radical (buraco). Este cátion radical, com spin ½ é associado a presença de um

estado eletrônico localizado no gap. Ele é inserido na cadeia polimérica com ligações

duplas conjugadas através de um processo de oxidação, levando então à formação de

uma carga localizada por um processo energeticamente favorecido. A presença deste

buraco na matriz polimérica, ou seja, o estado ionizado do polímero pode ser

estabilizado por uma distorção geométrica local.1 Tomando a dopagem do tipo p como

exemplo, a remoção inicial de um elétron da cadeia polimérica leva a formação do

polaron associado com a mudança da cadeia da forma aromática para a forma

quinóide. Esse processo conduz à formação de estados eletrônicos no gap (símbolo

Egap), (região de energia entre o topo da BV e o fundo da BC), causando um

deslocamento energético da BV e da BC.11 Os estados intermediários de energia

criados no gap durante o processo de oxidação permitem transições eletrônicas que

induzem notáveis mudanças na coloração devido a dopagem, este processo que é

reversível é chamado de eletrocromismo.21

Quando um segundo elétron é retirado da cadeia polimérica, podem ocorrer

duas situações: (i) em níveis baixos de oxidação o elétron pode ser retirado de um

segmento diferente na cadeia polimérica, criando um novo polaron independente ou

(ii) o elétron é retirado de um nível polarônico já existente (remoção do elétron

desemparelhado), levando à formação de um dicátion radical, que é chamado de

bipolaron.2 Bipolarons, assim como polarons, estão associados com distorções

geométricas locais na cadeia. A formação do bipolaron indica que a energia ganha

na interação com o retículo é maior que a repulsão coulômbica entre as duas cargas

confinadas no mesmo espaço.2,11 Idealmente assume-se a formação de múltiplos

estados diiônicos termodinamicamente estáveis (bipolarons) durante os processos de

ionização associados com distorções geométricas locais da cadeia. A formação de um

bipolaron leva a uma diminuição da energia de ionização do polímero, motivo pelo

qual um bipolaron é termodinamicamente mais estável do que dois polarons.11 Além

disso, assume-se que o estado bipolaron localmente distorcido compreende somente

quatro ou cinco unidades monoméricas de um segmento polimérico e que o ganho de

energia, em comparação a dois estados polarons, é de 0,45 eV. Em termos de

energias redox, isso significa que o potencial redox E0redox para a formação do

bipolaron poderia ser menor que o E0redox para a formação de dois polarons. Ambos,


9

polarons e bipolarons podem mover-se ao longo da cadeia polimérica através do

rearranjo das ligações conjugadas quando expostos a um campo elétrico.2

Os bipolarons criados na cadeia polimérica são responsáveis pela condução

elétrica. O transporte acontece via mobilidade ao longo dos segmentos da cadeia

conjugada polimérica e por saltos intercadeia (hopping). A condutividade elétrica do

bulk é equivalente ao produto da concentração dos portadores livres contidos no

material (n) e a sua mobilidade relativa (), (Equação 1), onde e é a unidade de

carga eletrônica (1,6 x 10-19 C). Como a mobilidade do íon dopante dentro do

material seco é muito baixa, estes polímeros são verdadeiramente condutores

eletrônicos e não iônicos.

Equação 1

O fator limitante da condutividade é a mobilidade do portador de carga e não a

concentração. Existem no mínimo três elementos que contribuem para a mobilidade

dos portadores: transporte intracadeia, transporte intercadeia e contato interpartícula.

Estes elementos compreendem uma complicada e resistiva rede, a qual determina

uma mobilidade efetiva dos portadores. Assim, a mobilidade e, portanto, a

condutividade é determinada em ambos os níveis microscópico (intra e intercadeia) e

macroscópico (interpartículas).22 Dados experimentais sobre a mobilidade dos

portadores em filmes de PA confirmaram que o transporte intercadeia e interpartícula

são os fatores limitantes para a condução.23 Desta forma, embora a teoria particular

da estrutura molecular possa prever uma menor condutividade baseada na

conjugação de uma cadeia simples, a condutividade observada é um reflexo da

interação interpartícula e das interações intercadeia.24,25

A condutividade em um sólido é causada por dois fatores:1 o número de

portadores de carga (elétrons/buracos) e a mobilidade destes portadores, que como

mencionando anteriormente é o fator limitante da condutividade. A condutividade

elétrica de muitos polímeros condutores está na mesma faixa de grandeza da

maioria dos semicondutores inorgânicos.26 No entanto, os semicondutores

inorgânicos possuem um baixo número de portadores (na ordem de 1016 a

1018 cm-3), mas possuem altas mobilidades (102 a 105 cm2.V-1.s-1). Esta alta

mobilidade ocorre devido ao alto grau de cristalinidade e pureza destes materiais,

bem como ao número relativamente baixo de defeitos presentes na sua estrutura.2

en..


10

Os polímeros condutores, por outro lado, possuem um grande número de portadores

(1021 a 1023 cm-3), mas uma baixíssima mobilidade (10-4 a 10-5 cm2.V-1.s-1), devido

principalmente ao grande número de defeitos estruturais (reticulação e

desordenamento das cadeias), como exemplificado para o polipirrol na Figura 5.

Desta maneira, a obtenção de polímeros condutores com maiores condutividades

está diretamente relacionada ao aumento da mobilidade dos portadores. Isto pode

ser viabilizado pela obtenção de materiais mais ordenados, ou seja, com melhor

orientação das cadeias, livre de reticulações e defeitos.2

A influência do arranjo estrutural do material, comparando condutores

orgânicos e inorgânicos, deve também ser levada em conta nos mecanismos de

transporte de carga. Em polímeros conjugados, como em todos os materiais

orgânicos, a ionização resulta em uma substancial distorção do arranjo em torno dos

sítios ionizados, o que leva a uma limitação do movimento dos portadores de carga e

portanto, a uma diminuição da mobilidade. Em semicondutores inorgânicos a

distorção é menos evidenciada e como resultado estes materiais alcançam altas

condutividades. Como a desordem representa uma regra dominante, polímeros

conjugados são provavelmente mais análogos a semicondutores amorfos do que a

semicondutores cristalinos.20

I.1.1.1. Polipirrol

O poliacetileno foi o primeiro polímero condutor a ser sintetizado.27 No

entanto, este polímero possui instabilidade térmica e ambiental. Como

consequência, outros polímeros passaram a ser intensivamente investigados com o

intuito de superar estas limitações. Dentre eles o polipirrol (Ppi) é um dos que mais

se destacam, sendo muito promissor para aplicações comerciais. Apesar de ser

conhecido há muito tempo (1916),28 ele passou por uma espécie de “redescoberta”

no final da década de 7029 quando foram descobertas suas propriedades

condutoras. Este polímero condutor é um material que apresenta alto potencial para

aplicação em dispositivos elétricos e eletrocrômicos devido principalmente à sua alta

condutividade elétrica, reatividade redox, facilidade de síntese, alta estabilidade

térmica, além de boa estabilidade química em condições ambientais normais.30-35

Desde a descoberta das propriedades condutoras do polipirrol em 1979, numerosos

estudos foram realizados sobre este material. Sua condutividade e outras

propriedades elétricas como efeito eletrocrômico atraem muito interesse,


11

principalmente devido ao possível controle das propriedades elétricas através das

condições experimentais de síntese.30,34

A síntese do polipirrol pode ser feita através de diferentes métodos, incluindo

polimerização por oxidação química, eletroquímica30 ou fotoquímica.36 Os agentes

oxidantes mais utilizados durante a polimerização por oxidação química são:

persulfato de amônio, peróxido de hidrogênio e sais de metais de transição (Fe3+,

Cu2+, Cr6+, Ce4+, Ru3+ e Mn7+).30 Durante este tipo de polimerização, ocorre a

formação do cátion radical intermediário, extremamente reativo. O acoplamento

ocorre de maneira aleatória, resultando em um grande número de defeitos e

reticulações, além da falta de orientação entre as cadeias.

Figura 5: Ilustração hipotética de todos os possíveis defeitos estruturais

apresentados pelo polipirrol.1

Idealmente, o crescimento das cadeias do polipirrol se dá através dos átomos

de carbono nas posições 2 e 5 do anel pirrólico. Desta forma, a conjugação entre as

ligações duplas e simples seria maximizada, uma vez que aumentam a mobilidade

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH

O

H

H

OH

n

grupamentocarboxila

acoplamento2,3

hidrogenação

grupamentosOH

anéis subsequentes sem rotação


12

dos portadores de carga.1,2 No entanto, é verificado um grande número de

acoplamentos em outros átomos de carbono do anel, o que leva à diminuição da

mobilidade dos portadores de carga. Cerca de 30% das ligações C-C entre os anéis

pirrólicos não são ideais.2 A Figura 5 mostra alguns dos vários tipos de defeitos

possíveis de serem encontrados no Ppi.

A polimerização eletroquímica é o método de síntese mais usado,37 uma vez

que possibilita a formação de filmes sobre eletrodos. A eletropolimerização tem

estequiometria eletroquímica38 entre 2,2 e 2,6 F.mol-1. No processo de polimerização

são consumidos 2,0 F.mol-1 e a carga excedente é usada no processo de dopagem

do polímero, o qual ocorre simultaneamente à síntese. O mecanismo de

eletropolimerização para heterocíclicos considera a formação de um cátion-radical

do monômero, seguida do acoplamento de dois cátions radicais, com saída de dois

prótons e reconstituição de cátions radicais do monômero e dos oligômeros

formados.

A estabilidade do cátion radical do monômero é o fator determinante para

obtenção de um polímero com elevado grau de conjugação (ou comprimento de

conjugação). Um cátion radical muito estável pode difundir do eletrodo dando origem

a oligômeros solúveis, enquanto que um muito reativo pode sofrer reações

colaterais. As propriedades elétricas e físico-químicas do material eletrosintetizado

dependem fortemente das condições de síntese, tais como: concentração do

monômero, natureza do meio eletrolítico, temperatura, etc.37,39,40

A natureza do dopante tem um papel importante na estabilidade e

condutividade dos polímeros condutores. No polipirrol, uma alta concentração de

dopante leva à formação de espécies polarônicas paramagnéticas. Aumentando-se o

grau de dopagem, estes polarons são convertidos a bipolarons, os quais se

estendem, cada um, sobre quatro anéis pirrólicos. As estruturas esquematizadas do

polaron e bipolaron no polipirrol estão representadas na Figura 6. O fragmento

portador de carga, constituído de quatro anéis pirrólicos, pode viajar ao longo da

cadeia através de um rearranjo das ligações duplas e simples.2 Scott e cols.,41

observaram a formação de filmes de polipirrol com altos valores de condutividade

obtidos eletroquimicamente. Essa observação levou esses autores a sugerir que a

ausência de paramagnetismo observada por ressonância paramagnética eletrônica


13

(EPR), associada com uma corrente de portadores pode ser explicada atribuindo

esses portadores a espécies bipolaronicas com spin nulo.20,41

Figura 6: Modelos do polaron e bipolaron no polipirrol. A espécie X- representa um

íon dopante.

A eletropolimerização do pirrol (Figura 7) envolve uma etapa inicial, na qual

ocorre a oxidação do monômero formando um cátion radical. Este pode se ligar a

outro cátion radical ou a um monômero, seguida de uma transferência de carga.

Nesta etapa são eliminados dois prótons, formando um dímero neutro. A reação

continua levando a um aumento da massa molar desse oligômero, até a formação

das cadeias poliméricas. O polímero resultante da polimerização eletroquímica

apresenta preferencialmente acoplamento 2-5, de acordo com o esquema ilustrado

na Figura 7.42

Polaron

CH4

NH

C+

NH

NH

NH

NH

CNH

X-

n

CH4

NH

C+

NH

NH

NH

NH

C+

NH

X-

n

X-

Bipolaron


14

Figura 7: Mecanismo de polimerização eletroquímica do pirrol.42

A evolução da estrutura de bandas proposta por Bredas e cols.20 para o

polipirrol em diversos níveis de dopagem está mostrada na Figura 8. Quando uma

única carga positiva é introduzida na cadeia, ocorre a formação do polaron (energia de

ligação 0,12 eV). Sua presença na cadeia introduz dois níveis eletrônicos localizados

no gap: um estado polaron ligante, ocupado com um elétron e localizado 0,49 eV

acima da BV e um estado polaron antiligante vazio localizado 0,53 eV abaixo da BC.

Figura 8: Esquema da evolução da estrutura de bandas para o polipirrol.

NH

NH

+

CH

NH

+C

H

NH

NH

+C

H

NH

+

NH

CH

H

H

-e

NH

+

NH

+H

H NH

NH

+ 2H+

NH

NH

NH

n

-e

NH

NH

NH

+C

H

n

BV BVBV

BC BCBC

0,49 eV

0,53 eV

3,16 eV

0,75 eV

0,79 eV

0, 39 eV

0,76 eV

0,70 eV

0,45 eV

3,56 eV

POLARONbaixo nível de oxidação

BIPOLARONparcialmente oxidado BANDA BIPOLARON

altamente oxidado


15

Os estados polarônicos no gap permitem que três diferentes transições ocorram

(Figura 9) quando o polímero se encontra em baixos níveis de oxidação, (estado

parcialmente neutro, reduzido). Nestas condições, o polipirrol possui um máximo de

absorção intenso em 3,16 eV (400 nm) que ocorre devido à Egap (energia de gap)

associada com a transição π – π*. Dentro desta região de gap é possível observar 3

bandas de absorção, relacionadas às três diferentes transições mencionadas acima.

Uma destas bandas aparece em 0,7 eV (1771 nm) e pode ser atribuída à transição da

BV para o estado polaron ligante. A banda em 1,4 eV (886 nm) é associada com a

transição do estado polaron ligante para o polaron antiligante e finalmente a banda em

2,1 eV (590 nm) corresponde à transição da BV para o estado polaron antiligante. As

diferentes localizações do estado polaron antiligante e ligante comparado com a BC e

BV, respectivamente, ocorrem devido às diferentes contribuições dos orbitais do

nitrogênio para as bandas de valência e para as bandas de condução.

O aumento do nível de oxidação faz com que os estados polarônicos comecem

a interagir. Cálculos teóricos indicam que dois polarons, ao se aproximarem, se tornam

instáveis com respeito a orientação de seus spins e ocorre então a formação do

bipolaron duplamente carregado e com spin nulo. A extensão do bipolaron é sobre 4

anéis pirrólicos, mas a deformação da cadeia é muito menor do que no caso do

polaron. Com respeito aos dois processos de ionização, o ganho em energia total ao

formar o bipolaron é 0,69 eV. Isto indica que a formação de um bipolaron é favorecida

em relação a formação de 2 polarons por 0,45 (= 0,69 – 2 x 0,12) eV. Um bipolaron

introduz dois estados de transição na região do gap em 0,75 eV acima da BV e 0,79 eV

abaixo da BC. O estado bipolaron ligante, ao contrário do polaron ligante, encontra-se

vazio. Como resultado, somente duas transições serão possíveis, ocorrendo, portanto,

o desaparecimento do modo de absorção em 1,4 eV, além disso as demais transições

se deslocam para maiores valores de energia.

Em altos níveis de dopagem (por exemplo, um bipolaron para cada 6 anéis de

pirrol) a Egap é de aproximadamente 3,6 eV (344 nm), ou seja, 0,40 eV maior

comparada com a Egap do polímero desdopado. Além desta, aparecem duas bandas de

absorção intensas, centradas em 1,0 eV (1240 nm) e em 2,7 eV (459 nm),

relacionadas à existência de duas bandas bipolaron formadas na região de Egap.


16

Figura 9: Evolução do espectro de absorção do Ppi em função do nível de

dopagem.11

I.1.2. Sensores

Um sensor é um dispositivo que mede ou detecta uma condição, convertendo

a resposta em um sinal que pode ser lido ou observado por um instrumento.43 Um

exemplo simples de sensor é o termômetro de mercúrio, o qual converte a medida

de calor (temperatura) em expansão e contração do líquido, registrando a resposta

em um tubo de vidro graduado. Sensores são usados diariamente em, por exemplo,

botões de elevadores e lâmpadas, os quais são acesos ou apagados ao serem

tocados (sensíveis ao toque). Existem inúmeras aplicações para sensores, tantas

que muitas vezes as pessoas não se dão conta. Dentre estas aplicações estão

incluídos sensores em carros, computadores, naves espaciais, fábricas e robôs,

entre outros.

A técnica de utilização de sensores na área científica tem algumas vantagens

sobre outros métodos de análise visto que não utiliza reagentes e não necessita de

Den

sidade

óptic

a

Aum

enta

ndo

o n

ível

de

do

pag

em

v1,0

2,7

3,6

3,2

2,11,40,7

3,00,0 1,0 2,0 4,0 5,0 6,0

E / eV


17

qualquer tipo de pré-tratamento. Além disso, possui bons níveis de sensibilidade e

especificidade e retorna um resultado de forma rápida ao analista. Esta técnica

também pode ser utilizada em uma linha de controle de qualidade durante um

processo de fabricação, por exemplo. Entretanto, os sensores também têm algumas

desvantagens, principalmente no que diz respeito à reprodutibilidade, recuperação e

os efeitos da umidade e da temperatura na resposta.

Atualmente, muitos sensores comerciais estão disponíveis no mercado

juntamente com um grande número de protótipos de sensores que estão sendo

desenvolvidos por instituições de pesquisa. Todos estes tipos de sensores exibem

interações físicas e químicas quando expostos aos compostos químicos. Devido à

grande quantidade de sensores disponíveis, a opção de escolha é portanto, muito

ampla.

I.1.2.1. Sensores baseados em PICe

O interesse em sensores baseados em polímeros conjugados aumenta ano

após ano desde que Diaz e cols.44 desenvolveram o primeiro sensor de polipirrol. Na

forma mais simples, um filme fino de polímero é depositado num substrato condutor

formado por dois eletrodos paralelos de platina ou ouro com uma base isolante como

óxido de silício ou vidro para formar o sensor.45

Os polímeros mais usados em sensores são:46-48 polipirrol, polianilina e

politiofeno, os quais são sintetizados na presença de agentes dopantes como ácidos

ou sais.49 A cada dia, novos polímeros contendo sistemas de ligações conjugadas

estão sendo sintetizados para ampliar as aplicações em produtos microeletrônicos.50

As características desses tipos de sensores explicam o porquê de serem os mais

utilizados em conjuntos sensoriais. Eles são facilmente fabricados, seu consumo de

energia é baixo, são robustos e podem trabalhar à temperatura ambiente. Como

mencionado anteriormente, existem vários tipos de polímeros, incluindo uma grande

variedade de derivados e além disso, um grande número de polímeros novos surge

todos os anos. A possibilidade de modificar suas propriedades utilizando diferentes

dopantes,49 torna possível o desenvolvimento de sensores específicos para

compostos voláteis (e.g., cetonas, aldeídos ou álcoois), ou para alguma aplicação

particular (caracterização ou identificação). O estado de oxidação do polímero

também pode ser alterado após sua deposição, para investigar sua característica

sensível.45


18

Os PICe são resistentes ao envenenamento por compostos que inativam

sensores fabricados com óxidos semicondutores inorgânicos, mas o tempo de vida

de um sensor PICe é cerca de apenas 9 a 18 meses, ou seja, bem menor que dos

sensores à base de óxidos metálicos. Este ainda é um problema a ser resolvido.

Além disso, a natureza randômica do processo de deposição é um problema

no que diz respeito à produção de sensores reprodutíveis.45 Os sensores possuem

também outros inconvenientes como o longo tempo de resposta (de 20 a 40 s),49

tornando-os inaptos com o passar do tempo ou com mudanças na temperatura.

Entretanto, o principal problema é que eles também são extremamente sensíveis à

umidade, contudo esse aspecto pode ser positivamente aplicado para o

desenvolvimento de sensores de umidade.51

Devido ao fato dos PICe serem sensíveis a muitos tipos de voláteis, muitas

aplicações são descritas na literatura. Eles são sensíveis a álcoois, cetonas,

benzeno e outros compostos polares. Diversas pesquisas mostram aplicações dos

PICe em produtos alimentícios como cervejas e outras bebidas alcoólicas,52,53 óleo

de oliva,54 suco de laranja,55 peixe,56 leite,57 café58 e vinho.59 Além das aplicações na

área alimentícia, os sensores a base de PICe também podem ser aplicados no

monitoramento de hidrocarbonetos aromáticos60 e na identificação de odores de

materiais plásticos utilizados em automóveis,61 entre outras aplicações.

O polipirrol é especialmente promissor para aplicações comerciais devido a

sua boa estabilidade ambiental e facilidade de síntese. A polimerização

eletroquímica do pirrol em solução aquosa permite o uso de um grande número de

ânions como dopante,62-64 incluindo indicadores de pH.65,66 Desta forma, ele pode

atuar como matriz hospedeira para diferentes tipos de dopantes. Essa propriedade

tem sido explorada para fazer deste material um dispositivo sensível a diferentes

tipos de analitos.67-75

A pesquisa baseada no polipirrol tem sido motivada devido às suas

importantes aplicações como em baterias,76-78 membranas de separação de gás,79,80

sensores,81-84 dispositivos microeletrônicos,85 revestimento,86 compósitos87,88 e

sensores químicos.89-95 Todos estes dispositivos têm propriedades ópticas,

mecânicas e elétricas interessantes devido à possibilidade de aplicação onde

materiais inorgânicos não são adequados.


19

I.1.2.2. Sensores para pH baseados em PICe

Pode-se dizer que o íon hidrogênio é unipresente, já que pode ser encontrado

na maioria das reações químicas.96 Ele é quantificado como pH através do logaritmo

negativo da sua atividade.

𝑝𝐻 = − log 𝑎𝐻 Equação 2

O pH de uma solução tem um efeito significante nas reações químicas, desta

forma as medidas e controle do pH são fundamentais na química, bioquímica,

química clínica e ciência ambiental, sendo usualmente feitas utilizando eletrodos de

vidro. O método pioneiro para medidas de pH foi baseado na utilização de

indicadores, por exemplo papel tornassol, o qual muda sua cor de acordo com o pH

da solução, ficando na coloração azul em meio alcalino e vermelho em meio ácido.

Para processos químicos dependentes do pH é importante que as amostras

aquosas tenham seu pH medido ou monitorado. Além do método óptico, onde a

medida é resultante de mudanças de absorbância,97,98 refletância99,100 ou

fluorescência101,102 de um indicador sensível ao pH, que reage reversivelmente com

os prótons da amostra, existem outros sistemas comuns para medir o pH baseados

em dispositivos amperométricos ou potenciométricos. Membranas íon-seletivas,

fibras ópticas, sensores baseados em fluorescência e dispositivos condutimétricos

sensíveis a pH também foram desenvolvidos.103,104 No entanto, estes dispositivos

podem ser instáveis e, portanto, requerem constante re-calibração. Embora o

indicador tornassol e outros indicadores de pH mencionados anteriormente sejam

amplamente usados em várias áreas, um considerável interesse na pesquisa tem

sido focado no desenvolvimento de sensores químicos ou biológicos usando

polímeros conjugados. Como resultado, na literatura encontra-se revisões completas

sobre a aplicação de polímeros em vários dispositivos sensoriais105 e, mais

especificamente, revisões de vários métodos utilizados para as medidas.106

As propriedades de troca iônica dos polímeros condutores são de especial

interesse para o desenvolvimento de sensores potenciométricos.107-109 Muitos

polímeros condutores possuem grupos ácidos e/ou básicos, os quais podem ser

protonados ou desprotonados (por exemplo, polianilina e polipirrol). A desprotonação

destes PICe resulta na diminuição da concentração de portadores de carga ao longo

da cadeia polimérica, a qual é acompanhada de mudanças nas propriedades ópticas


20

e elétricas do material. Levando em consideração o polipirrol, a protonação aumenta

a sua condutividade, enquanto que a desprotonação a diminui.105 Devido à

desprotonação das cadeias de Ppi, a absorbância entre 600 e 900 nm aumenta

quando o pH é variado de 6 para 12, além disso ocorre um deslocamento da banda

para menores valores de comprimento de onda.

Como dito anteriormente, o Ppi além de ter suas propriedades ópticas e

elétricas afetadas pelo pH do meio, pode ainda ser utilizado como matriz hospedeira

para a incorporação de diferentes dopantes, como por exemplo um indicador ácido

base (e.g. Azul de Bromofenol (AB)). Este indicador (Figura 10) apresenta

grupamento sulfônico que contribui para sua solubilidade em água, e ainda quando

altamente desprotonado se torna um contra-íon diiônico para o polipirrol,

proporcionando maior organização do polímero, a nível molecular.110 Além disso,

possui pKa ácido (faixa de viragem 3,0 a 4,6),111-114 o qual difere do apresentado pelo

Ppi (8,6).115 Esta diferença de pKa apresentada pelo dopante e matriz polimérica é

particularmente interessante para a compreensão da sensibilidade ao pH do sistema

e estudo do comportamento do dopante no interior da matriz polimérica em

diferentes condições.

Figura 10: Equilíbrio de dissociação do indicador de pH azul de bromofenol (AB).

Br

BrBr

O

OH

SO3

-

Br

Br

BrBr

O

SO3

-

-O

Br

O

S

OH

Br

BrO

O

BrBr

OH

H+H+

pKa = 4,6pKa = 3,0

AB AB- AB2-

21

Capítulo II

Objetivos Gerais

Capítulo II – Objetivos Gerais Parte I

22

II. Objetivos Gerais

Na Parte I deste trabalho, objetivou-se a obtenção de um material sensível ao

pH baseado em Ppi dopado com o indicador ácido-base AB (Ppi-AB) e o estudo e

compreensão da origem da sensibilidade ao pH deste material. Além de investigar a

influência do corante sobre a resposta do Ppi ao pH, explorando suas propriedades

ópticas e elétricas, objetivamos o estudo do processo que ocorre no equilíbrio

químico de dissociação deste corante, quando no interior da matriz polimérica. A

partir destes estudos buscamos a aplicabilidade do Ppi-AB como sensor óptico e

ôhmico para pH.

Capítulo III – Caracterização do filme polimérico Parte I

23

Capítulo III

Caracterização do filme

polimérico


24

III. Caracterização do filme polimérico

III.1. Introdução

Durante o processo de dopagem de um PICe, ocorre a incorporação de íons

na matriz polimérica para que ocorra o balanceamento das cargas positivas geradas

ao longo da cadeia. Os polímeros podem ser sintetizados por processo químico ou

eletroquímico. Durante a síntese química normalmente são utilizados agentes

oxidantes, como (NH4)2(S2O7) ou FeCl3, sendo frequentemente usados para a

preparação de polímeros intrinsecamente condutores eletrônicos (PICe) em solução,

enquanto que a deposição eletroquímica é principalmente usada para a deposição

de filmes de PICe sobre substratos condutores. Algumas das vantagens deste último

método estão relacionadas ao controle da espessura do filme, o que é feito pelo

controle da carga que passa através da célula eletroquímica durante o crescimento

do filme; também é possível controlar o nível de dopagem do polímero através do

ajuste do potencial elétrico. Ao contrário, a dopagem química não proporciona a

mesma facilidade de controle do nível de dopagem e da espessura dos filmes,

resultando em filmes com pouca reprodutibilidade quantitativa.

A possibilidade de se utilizar diferentes dopantes durante a síntese de um

PICe permite o ajuste das propriedades do filme, possibilitando sua aplicação em

vários sensores químicos e biológicos. Materiais com propriedades crômicas podem

ser facilmente obtidos através da incorporação de corantes orgânicos no filme

polímerico. Muitos dos corantes têm pouca solubilidade em água devido à forte

interação intermolecular π-π e à estrutura planar. Entretanto, corantes ácidos

possuindo grupamentos sulfonato são mais solúveis e como consequência têm sido

usados como dopantes.116,117 O sistema conjugado de corantes pode interagir com o

sistema π dos polímeros condutores, como o Ppi, levando a sistemas híbridos com

novas propriedades ópticas e eletrônicas.66,118,119 Como a natureza do íon dopante

tem influência nas características estruturais, ópticas e elétricas dos PICe, estas

propriedades têm sido extensivamente estudadas120,121 por diferentes técnicas

espectroscópicas e eletroquímicas. Uma breve introdução sobre as técnicas

utilizadas neste capítulo será apresentada a seguir.


25

III.1.1. Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis)

A região do espectro eletromagnético correspondente ao ultravioleta fica entre

200 e 380 nm enquanto que o visível corresponde à faixa de comprimento de onda

() entre 380 e 780 nm, esta última é a responsável pela cor das substâncias e

objetos. A absorção da radiação ultra-violeta ou visível provoca a excitação de

elétrons da molécula, originando as transições eletrônicas, onde os elétrons de

valência são promovidos de seu estado fundamental para um estado de mais alta

energia (estado excitado). A energia total de uma molécula corresponde à soma de

sua energia eletrônica (Eelet), vibracional (Evib) e rotacional (Erot), sendo que a

magnitude destas energias diminui na seguinte ordem: Eelet > Evib > Erot. As principais

características de uma banda de absorção são: posição e intensidade. A posição

corresponde ao comprimento de onda da radiação cuja energia é igual àquela

necessária para ocorrer a transição eletrônica. Por sua vez, a intensidade da

absorção depende das regras de seleção para a transição eletrônica.122

Embora sejam os elétrons que sofram a excitação do estado fundamental

para o estado excitado, o núcleo ao qual esses elétrons são mantidos presos através

das ligações também tem sua importância na determinação do comprimento de onda

da absorção. Assim, a energia característica da transição é uma propriedade de um

grupo de átomos conhecido como cromóforo.

III.1.2. Espectroscopia Infravermelho e Espectroscopia Raman

A espectroscopia estuda a interação da onda eletromagnética com a matéria,

onde é feito o estudo dos níveis de energia de átomos ou moléculas. Geralmente, as

transições eletrônicas são situadas na região do ultravioleta ou visível, as

vibracionais na região do infravermelho e as rotacionais na região de microondas e,

em casos particulares, também na região do infravermelho longínquo (ou distante).

Em uma molécula, o número de vibrações e a descrição dos modos

vibracionais em cada tipo de espectroscopia vibracional (infravermelho e Raman)

podem ser previstas a partir da simetria da molécula e da aplicação da teoria de

grupo. Embora ambas as espectroscopias estejam relacionadas às vibrações

moleculares, os mecanismos básicos de sondagem destas vibrações são

essencialmente distintos em cada uma. Consequentemente, os espectros obtidos

apresentam diferenças significativas; quando ocorre a presença de um mesmo pico

nos espectros Raman e no infravermelho observa-se que o seu tamanho relativo nos


26

espectros é muito diferente. Em muitos casos, certo pico aparece em um espectro e

é totalmente ausente em outro. Devido a essas diferenças, a espectroscopia no

infravermelho é mais eficaz em alguns casos e em outros a espectroscopia Raman

oferece espectros mais úteis. De modo geral, pode-se dizer que as espectroscopias

Raman e infravermelho são técnicas complementares.

A condição para que ocorra absorção da radiação infravermelha é que haja

variação do momento de dipolo elétrico da molécula como resultado do seu

movimento vibracional ou rotacional (o momento de dipolo é determinado pela

magnitude da diferença de carga e a distância entre dois centros de carga). Somente

nessas circunstâncias, o campo elétrico alternante da radiação incidente interage

com a molécula, originando os espectros. De outra forma, pode-se dizer que o

espectro de absorção no infravermelho tem origem quando a radiação

eletromagnética incidente tem uma componente com freqüência correspondente a

uma transição entre dois níveis vibracionais. A vibração dos átomos no interior de

uma molécula apresenta energia coerente com a região do espectro eletromagnético

correspondente ao infravermelho (de 200 a 14290 cm-1).123 O espectro infravermelho

de um composto químico é considerado uma de suas propriedades físico-químicas

mais características e por conta disto, a espectroscopia na região do infravermelho

tem extensa aplicação na identificação dos compostos.

Em um experimento Raman, a amostra é irradiada com uma radiação laser

monocromática de alta potência, geralmente na região do visível do espectro

eletromagnético, sendo a frequência desta radiação muito maior que as frequências

das transições vibracionais. Quando uma molécula é irradiada por radiação

eletromagnética, a energia pode ser transmitida, absorvida ou espalhada. No efeito

Tyndall a radiação é espalhada por partículas enquanto que no efeito Rayleigh são

as moléculas que espalham a luz, porém em nenhum destes efeitos ocorre qualquer

alteração do comprimento de onda da luz. Diferentemente do espalhamento

Rayleigh, onde a frequência do fóton espalhado é a mesma do fóton incidente, no

espalhamento Raman ocorre alteração na energia da molécula (∆E). Se a molécula

ganha energia, a frequência do fóton espalhado é menor que a frequência do fóton

incidente, dando origem às linhas Stokes no espectro Raman. Quando a molécula

perde energia, a situação é inversa e neste caso são originadas as linhas anti-Stokes

(Figura 11).


27

Figura 11: Ilustração dos espalhamentos Rayleigh e Raman e da absorção no

infravermelho. As linhas 0 e 1 representam os níveis de energia vibracionais.

Na espectroscopia Raman convencional, a espécie analisada é transparente

ao feixe da radiação incidente, diferentemente do que ocorre na espectroscopia

Raman Ressonante, onde o fóton incidente é absorvido pela molécula, acarretando

um aumento da intensidade das bandas associadas com a espécie ressonante.

O emprego da espectroscopia Raman Ressonante tem sido muito útil em

estudos espectroeletroquímicos de polímeros conjugados,124-129 (já que o processo

redox destes leva à mudanças estruturais de segmentos da cadeia polimérica), pois

além de permitir a análise do material sobre qualquer eletrodo, os sinais do solvente

e do eletrólito suporte praticamente não interferem. Além disso, o emprego de

diferentes linhas de excitação, além de distintos potenciais, é um recurso bastante

utilizado para ressaltar diferentes segmentos da macromolécula que se têm

interesse.

III.1.3. Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS)

A utilização desta técnica permite, através do mapeamento dos raios-X

emitidos pela amostra e gerados pelo impacto do feixe de elétrons primários,

análises qualitativa e semiquantitativa sobre a distribuição dos metais na mesma.130

Quando o feixe de elétrons incide sobre um material, os elétrons mais externos dos

átomos são excitados, mudando de níveis energéticos. O decaimento destes

elétrons, liberam a energia adquirida que é emitida em comprimento de onda no

espectro de raios-X. Um detector instalado na câmara de vácuo do microscópio

eletrônico de varredura (MEV) mede a energia associada a esse fóton. Como os

elétrons de um determinado átomo possuem energias distintas, é possível, no ponto

de incidência do feixe, determinar quais elementos químicos estão presentes

vib

Anti-Stokes

h(+vib)h

Estado Virtual

Stokes

vib

h h(-vib)

Estado Virtual

Rayleigh

h

Estado Virtual

Infravermelho

h

Estado Virtual


28

naquele local e assim identificar em instantes que material está sendo observado. O

diâmetro reduzido do feixe permite a determinação da composição em amostras de

tamanhos muito reduzidos (< 2,5 µm), permitindo uma análise quase que pontual.131

III.1.4. Microscopia de Força Atômica (AFM)

AFM é uma técnica que permite a observação da topografia da superfície com

uma resolução da ordem de nanômetros. O princípio de funcionamento do AFM

baseia-se na varredura da superfície da amostra por um cantilever flexível de

comprimento entre 100 a 200 μm integrado com uma ponta piramidal (ponteira)

geralmente com menos de 20 nm de diâmetro. A sonda (ponteira + cantilever) é um

componente básico e, para alcançar a resolução atômica, a ponta tem que terminar

em um conjunto de átomos. A força de interação entre a ponta e a superfície da

amostra faz com que o cantilever se aproxime ou se afaste da superfície, e essa

deflexão é proporcional à força de interação. Quando a ponteira se aproxima da

amostra, é primeiramente atraída pela superfície, devido a uma gama de forças

atrativas existentes na região, como as forças de van der Waals. Esta atração

aumenta até que, quando a ponteira aproxima-se muito da amostra, os átomos de

ambas estão tão próximos que seus orbitais eletrônicos começam a se repelir. Esta

repulsão eletrostática predomina sobre a força atrativa e à medida que a distância

diminui, as forças se tornam mínima, correspondendo a distância entre os átomos

(na ordem de alguns ângstrons, na ordem da distância característica de uma ligação

química). Podemos dizer que os átomos da ponteira e da amostra estão em contato

quando as forças repulsivas predominam.

Um espelho presente na parte superior da haste, reflete a luz de um feixe de

laser. Após a reflexão, o feixe de laser passa por uma lente e incide sobre um

fotodetector (fotodiodo) de quatro quadrantes, que mede as variações de posição e

de intensidade da luz produzida pelas deflexões do cantilever. À medida que a ponta

varre a amostra ou a amostra é deslocada sob a ponta, os diferentes tipos de

“acidentes geográficos” encontrados sobre a superfície fazem com que a interação

mude. As variações das interações são os fatores que provocam as diferentes

deflexões. Essas diferenças, captadas no detector, são armazenadas e processadas

por um computador, que as transformam em imagens topográficas da superfície bi e

tridimensionais. A força mais comumente associada com a AFM na deflexão do

cantilever é a força de van der Waals.


29

A técnica de AFM pode ser operada em três modos diferentes: contato,

não-contato e contato intermitente (tapping). No modo contato, o cantilever é

mantido a poucos ângstrons da superfície da amostra e a força interatômica entre a

ponta e a amostra é repulsiva. Neste modo de operação, a ponta faz um leve

“contato físico” com a amostra, produzindo imagens com alta resolução, mas a

compressão e as forças geradas, entre a ponta e a superfície, podem causar danos

à amostra, o que é especialmente prejudicial às amostras biológicas, as quais são

sensíveis e nem sempre estão fortemente aderidas ao substrato. No modo de

não-contato, o cantilever é mantido entre dezenas a centenas de ângstrons da

superfície da amostra, e a força interatômica entre a ponta e a amostra é atrativa.

Neste caso, a ponta oscila em alta frequência (100 kHz a 1 MHz) acima da

superfície, e a força total entre a ponta e a amostra é muito baixa, geralmente em

torno de 10-12 N. Esta oscilação aumenta consideravelmente a sensibilidade do

microscópio, o que faz com que forças de van der Waals e forças eletrostáticas

possam ser detectadas. O modo de não contato não sofre os efeitos do atrito sobre a

amostra, causado pela ponta, conforme é observado no modo contato após diversas

varreduras. Por outro lado, este modo não tem encontrado aplicabilidade geral,

devido à instabilidade entre a ponta e as forças adesivas da superfície, e a resolução

reduzida pela distância ponta-amostra, que é relativamente grande. Esta limitação

tem sido contornada com a utilização do modo intermitente. Este modo é similar ao

de não-contato, exceto pelo fato de que a ponta vibrante fica mais próxima da

amostra, de forma que tenha um contato intermitente, e é utilizado para contornar as

limitações impostas pelo modo contato. A comparação das imagens nos modos

contato e intermitente mostra que as superfícies são menos modificadas no modo

intermitente.

III.1.5. Voltametria Cíclica

A voltametria é uma técnica eletroanalítica que se baseia nos fenômenos que

ocorrem na interface entre a superfície do eletrodo de trabalho e a camada fina de

solução adjacente a essa superfície. Essa técnica é classificada como dinâmica, pois

a célula eletroquímica é operada na presença de corrente elétrica (i > 0) que, por sua

vez, é medida em função da aplicação controlada de um potencial. Assim, nessa

técnica, as informações sobre o analito são obtidas por meio da medida da


30

magnitude da corrente elétrica que surge no eletrodo de trabalho ao se aplicar um

potencial entre um eletrodo de trabalho e um contra-eletrodo.

O experimento de voltametria cíclica (VC) consiste numa varredura cíclica de

potencial, controlada por um potenciostato, registrando-se a resposta de corrente.

Essa varredura é caracterizada por um potencial inicial (Figura 12), um potencial de

inversão e um potencial final com uma determinada velocidade de varredura. Para

conseguir isso, se aplica uma voltagem chamada onda triangular à célula eletrolítica.

A Figura 12 mostra o padrão típico da excitação do sinal para a técnica de

voltametria cíclica. A faixa de variação do potencial aplicado deve ser aquela onde a

espécie em análise é eletroativa e o solvente é estável. Dependendo do analito

pode-se fazer apenas um ciclo ou múltiplos ciclos. Um voltamograma cíclico é obtido

pela medida de corrente sobre o eletrodo de trabalho (E.T.) durante a variação de

potencial (gráfico de corrente em função do potencial). A corrente pode ser

considerada o sinal responsável pelo sinal de excitação do potencial.

Figura 12: Típica excitação do sinal para voltametria cíclica, potencial na forma de

onda triangular.

0 10 20 30 40

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

-0,2E

inversão

Ciclo 1

Efinal

E / V

(E

CS

)

Tempo / s

Einicial


31

A reação eletroquímica de interesse ocorre no eletrodo de trabalho e a

corrente elétrica devido à transferência de elétron a partir ou para o eletrodo é

controlado pelo potenciostato, contrabalanceando o processo faradaico que ocorre

no eletrodo de trabalho, com uma transferência de elétrons na direção oposta.

Finalmente, o voltamograma obtido é um gráfico de corrente em função do potencial

aplicado.


32

III.2. Objetivo específico

O objetivo do trabalho apresentado neste capítulo consistiu nas

caracterizações estrutural e morfológica do filme Ppi-AB (polipirrol dopado com o

indicador azul de bromofenol). Além disso, objetivou-se o estudo das interações

entre polipirrol e o azul de bromofenol em diferentes níveis de oxidação do polímero

e diferentes pH. Para isso, foram utilizadas medidas espectroeletroquímicas de

Raman e UV-Vis in situ. Voltametria cíclica também foi utilizada para verificar o

comportamento eletroquímico do filme Ppi-AB.


33

III.3. Parte Experimental

III.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos

Materiais

Eletrodos de trabalho: vidro recoberto com filme de óxido de estanho dopado com

flúor (FTO-vidro), Flexitec Ltda. (Brasil), resistência de 20 .cm-2 com espessura

total de 175 m e área delimitada de 1 cm2 e vidro recoberto com filmes de ouro com

espessura de 100 nm e 5 nm de cromo depositado entre ouro e vidro para ajudar na

aderência do filme de ouro ao substrato, EMF (Evaporated Metal Films, Ithaca, Nova

Iorque, EUA).

Eletrodo de referência: Ag|AgClCl-(sat) Aldrich Inc., diâmetro de 0,25 mm, pureza de

99,99% e calomelano saturado (ECS).

Contra-eletrodo: fio de platina, Degussa S. A., diâmetro de 0,5 mm, pureza de

99,99% e placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).

Reagentes

Pirrol (Pi) (Aldrich, p.a.), destilado sob vácuo e armazenado em atmosfera de nitrogênio

a T 4C.

Azul de bromofenol (AB) (Aldrich), usado como recebido.

Hidróxido de sódio (98%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.

Ácido fosfórico (85%, Merck), usado como recebido.

Ácido nítrico (70%, Synth), usado como recebido.

Ácido clorídrico (Synth, p.a.), usado como recebido.

Fosfato de potássio (99%, Nuclear), usado como recebido.

Fosfato monobásico de sódio (99,0%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.

Fosfato dibásico de sódio (99,99%, Aldrich), usado como recebido.

Água deionizada (18,1 Mcm, Barnstead) foi utilizada para a preparação das

soluções.

Equipamentos

Para a síntese do Ppi-AB, deposição de Pt e investigações eletroquímicas,

utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB, modelo PGSTAT-30. Para

termostatização da célula durante as sínteses, foi utilizado um acessório de controle


34

de temperatura Tecnal modelo TE-184. Na calibração das soluções tampão foi

utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321.

Para medidas de espessura utilizou-se um perfilômetro Veeco, modelo

Dektak 3.

Medidas de EDS foram feitas utilizando um Sistema Noran Six, modelo

6714A-1SUS-SN (Thermo Electron Corp.) acoplado a um microscópio eletrônico de

varredura Jeol JSM 6360-LV. A espectroscopia no infravermelho foi realizada

utilizando um espectrofotômetro FTIR-ATR BOMEM, modelo MB-100. Durante as

medidas in situ foi utilizado um espectrofotômetro miniaturizado com fibra óptica

USB2000 (Ocean Optics) e um microscópio Olympus BHSM.

Para os espectros Raman utilizou-se um laser He-Ne (Melles Griot) com

emissão em 633 nm e um laser diodo (Melles Griot) com emissão em 785 nm. Uma

lente de 50X com longa distância de trabalho e abertura numérica de 0,55 foi

utilizada para focar a luz sobre a amostra. Trabalhou-se no modo reflexão, desta

forma a mesma lente objetiva foi utilizada para incidir e coletar a radiação. Um filtro

notch Kaiser foi utilizado para filtrar a luz espalhada. A radiação restante foi

direcionada através de um espectrógrafo Kaiser Holospec f/1,4 acoplado a um

detector CCD Andor (modelo DV-401-BV). Uma célula eletroquímica de 3 eletrodos

com uma janela de vidro com 0,2 mm de espessura foi utilizada durante o

experimento. A luz incidente foi focada através da janela de vidro em direção ao

filme de polipirrol para as medidas in situ. Durante as medidas de UV-Vis, uma fonte

de halogênio foi utilizada, conforme o arranjo experimental mostrado na Figura 13.

O equilíbrio do sistema foi alcançado com a estabilização da corrente

correspondente a um potencial específico antes de cada espectro (Raman ou

UV-Vis).


35

Figura 13: Arranjo experimental para as medidas espectroeletroquímicas e Raman in

situ.

III.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de

platina

A modificação do eletrodo de FTO-vidro foi realizada após observar-se a

perda de estabilidade do filme de Ppi quando exposto a processos de

oxidação/redução sobre este substrato. De acordo com a literatura,132 essa perda de

estabilidade pode ocorrer devido à degradação do material durante os processos

redox e/ou perda de aderência do filme ao eletrodo de FTO-vidro por “estresse

mecânico”. Buscando a solução para este problema, previamente à

eletropolimerização dos filmes de Ppi-AB, realizou-se a modificação do eletrodo de

FTO-vidro por eletrodeposição de Pt, utilizando solução de H2PtCl6.6H2O (ácido

hexacloroplatínico) com a finalidade de aumentar a aderência do filme à superfície do

eletrodo, uma vez que o filme se desprendia após a aplicação de potenciais de

oxidação e redução.

O H2PtCl6.6H2O foi obtido da seguinte forma:133

Uma chapa de platina (1,0557 g) foi limpa com ácido nítrico concentrado a

quente (60°C) durante 2h. Posteriormente a platina foi enxaguada com água

deionizada e submetida à ignição usando um bico de Bunsen. A platina foi então

Fonte de halogênioLaser He-Ne

UV-VisRaman

Filtro Notch Fibra óptica

Lente objetiva

Plataforma de translação

Potenciostato


36

dissolvida, com agitação e aquecimento (60°C) em 20 mL de água-régia

(3:1 HCl:HNO3) utilizando um sistema de refluxo durante 7 dias. Após a dissolução, os

ácidos foram evaporados utilizando-se um rota-evaporador, sendo que o resíduo foi

lavado quatro vezes com porções de 20 mL de HCl concentrado. O resíduo final, um pó

marrom escuro é o ácido hexacloroplatínico. Este ácido foi então dissolvido em 100 mL

de água deionizada, guardado em frasco âmbar, fechado e vedado com parafilme.

Os eletrodos de FTO-vidro foram cortados de forma retangular (3 cm x 1 cm) e

limpos utilizando solução aquosa contendo detergente comercial em banho de

ultra-som por 25 min. Em seguida foram enxaguados com água deionizada e o banho

de ultra-som foi novamente utilizado para os eletrodos imersos em acetona.

Novamente foram enxaguados com água deionizada e finalmente secos em estufa a

80°C. Após a secagem realizou-se a eletrodeposição galvanostática de Pt com uma

corrente de -2,0 mA durante 60 s à temperatura ambiente (ca. 25°C) sobre uma área

delimitada com fita adesiva de 1,0 cm2. Posteriormente realizou-se a deposição de um

filme fino de Ppi com área delimitada de 1,0 cm2.

III.3.3. Síntese dos filmes de polipirrol

As eletropolimerizações dos filmes foram realizadas através de voltametrias

cíclicas entre -0,3 e 1,3 V (a 10°C) sobre a superfície do eletrodo de FTO-vidro e

Au-vidro de área 1,0 cm2. Para isto utilizou-se soluções aquosas contendo

0,05 mol.L-1 de pirrol (Pi) e 0,4 mmol.L-1 do corante azul de bromofenol (AB). Para

comparação, realizou-se a síntese do Ppi na presença de um eletrólito bastante

usado e conhecido, o LiClO4 (0,1 mol.L-1). A velocidade de varredura para as

sínteses foi de 20 mV.s-1 e a espessura dos filmes foi variada através do número de

ciclos de síntese. Na Figura 14 está o voltamograma cíclico de síntese do Ppi-AB,

onde uma solução aquosa contendo somente o monômero Pi e o dopante AB foi

utilizada como eletrólito.


37

Figura 14: Voltamograma cíclico durante a síntese do Ppi-AB. Velocidade de

varredura 20 mV.s-1. Segunda varredura.

-0,3 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

i /

A

E / V vs. ECS

B


38

III.4. Resultados e Discussão

III.4.1. Medidas de Espessura

A espessura do filme polimérico deve ser otimizada pois é um parâmetro que

afeta diretamente o tempo de resposta óptico do sensor. A Figura 15 apresenta as

espessuras medidas para os filmes de Ppi-ClO4 e Ppi-AB, as quais foram

controladas através do número de ciclos utilizados durante a eletropolimerização.

Comparando-se filmes sintetizados com o mesmo número de ciclos voltamétricos,

observa-se que os filmes Ppi-ClO4 são mais espessos que os de Ppi-AB. Esse fato

deve ser devido à maior mobilidade do dopante ClO4- comparado com o ânion AB

(Figura 10) durante o processo de síntese.

Figura 15: Espessura dos filmes Ppi-ClO4 e Ppi-AB variando o número de ciclos

utilizado durante a síntese eletroquímica por voltametria cíclica vs ECS.

Como esperado, observou-se que é possível ter um bom controle da

espessura do filme utilizando a síntese eletroquímica. Experimentos de variação de

absorbância ( = 584 nm) em função do pH do meio foram executados para os

1 2 3 4 5

0,21

0,24

0,27

0,30

0,33

5

10

15

20

Esp

essu

ra /

m

Número de Ciclos da Voltametria Cíclica

Ppi-ClO4

Ppi-AB


39

diferentes filmes (Figura 16), onde foi possível constatar que os filmes sintetizados

com 3 ciclos voltamétricos, com aproximadamente 0,23 μm de espessura

apresentam maior contraste de cor em função da mudança de pH. Por este motivo,

filmes sintetizados com 3 ciclos foram à partir deste ponto, utilizados para o

desenvolvimento do sensor.

Figura 16: Contraste óptico em função do pH para filmes de Ppi-AB sintetizados

eletroquimicamente com diferentes números de ciclos durante a voltametria cíclica.

Absorbâncias correspondentes a 584 nm.

III.4.2. FTIR-ATR e EDS-MEV

Com a finalidade de confirmar a inserção das moléculas de AB na matriz

polimérica do Ppi, foram realizadas análises de espectroscopia na região do

infravermelho com acessório de reflexão total atenuada (FTIR-ATR) dos filmes

Ppi-AB e Ppi-ClO4 depositados sobre FTO-vidro/Pt. (Obs.: para o indicador AB foram

preparadas pastilhas de KBr).

De acordo com a Figura 17, verifica-se a presença de algumas bandas

atribuídas ao polipirrol,134 dentre elas: 1700 cm-1 que ocorre devido à uma série de

2 4 6 8 10

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Ab

so

rbâ

ncia

/ u

ni. a

rb.

pH

1 ciclo

3 ciclos

5 ciclos


40

vibrações, como: deformações C-N-C no plano e deformação angular N-H do anel no

plano; 1040 cm-1 que é uma banda de natureza complexa de vibrações fora do

plano, podendo ser atribuída à deformação angular C-H do anel, deformação angular

do N-H do anel, deformação C-N-C do anel e, finalmente, em 930 cm-1 que é

relacionada ao estiramento da ligação C=C, estiramento C-C no anel, estiramento

C-N e deformação C=C-N no plano. Com relação ao indicador AB, a presença de

algumas bandas evidencia sua presença na matriz polimérica. Dentre estas bandas

estão:135 1476 e 810 cm-1, atribuídas aos benzenos vicinais substituídos e a

1290 cm-1, atribuída à ligação C-O do grupo hidróxi ligado ao anel aromático. No

espectro do filme polimérico contendo o corante AB, esta banda desloca-se para

região de maior energia, sugerindo uma interação química forte entre o polímero e o

indicador.

Figura 17: Espectros de FTIR-ATR para filmes de Ppi-ClO4, Ppi-AB e para o

indicador AB.

Visualizando os espectros, verificamos que as bandas características do

indicador não são tão intensas no espectro do Ppi-AB quanto no espectro do AB,

sugerindo que a quantidade de indicador presa na matriz polimérica é relativamente

1750 1500 1250 1000 750

O

S

OH

Br

BrO

O

BrBr

OH

H

HN

N

1040 930

8101290

1476

Tra

nsm

itância

/ u

ni.arb

.

Número de onda / cm-1

Ppi-ClO4

Ppi-AB

AB

1700


41

pequena quando comparada com a do polímero. Na tentativa de quantificar a

proporção destes materiais, foram realizadas análises de espectroscopia de energia

dispersiva por microscopia eletrônica de varredura (EDS-MEV).

A microssonda de raios-X acoplada ao microscópio eletrônico de varredura,

permitiu a análise da distribuição de átomos de nitrogênio (presente nos anéis

pirrólicos) e de átomos de bromo (presente nas moléculas de AB). Os mapeamentos

destes átomos para o filme Ppi-AB estão apresentados na Figura 18. Pode-se

observar que o polímero está distribuído uniformemente sobre o substrato e ainda

que a dopagem ocorre de forma homogênea, já que o bromo, presente no corante

(dopante), apresenta-se uniformemente distribuído.

Figura 18: a) Imagem por MEV para o filme Ppi-AB. Mapeamento por EDS da

superfície do filme Ppi-AB, sendo b) distribuição de átomos nitrogênio e

c) distribuição de átomos bromo.

Na Figura 19 estão as intensidades dos picos de cada átomo presente na

amostra Ppi-AB. Observa-se também a presença de átomos contituintes do FTO e

do vidro, como Si, In e Sn. A presença destes átomos no espectro indica que neste

caso, a técnica de EDS, apesar de ser um método de análise de superfície, pôde ser

utilizada para indicar a composição do bulk, pois a profundidade de penetração do

feixe (ca. 1 μm),136 é maior do que a espessura do filme Ppi-AB (0,23 μm).


42

Figura 19: Intensidades dos picos de N e Br no espectro de EDS da amostra de

Ppi-AB eletropolimerizado sobre FTO-vidro.

Através do espectro de EDS (Figura 19) obtiveram-se os resultados

quantitativos relacionados à composição atômica destes átomos para o filme Ppi-AB.

Esta análise (Tabela 1) mostrou uma proporção de ca. 15% de nitrogênio para 6%

de bromo (porcentagens atômicas). Considerando que cada molécula de AB possui

4 átomos de bromo, um cálculo simples mostra que existe 1 molécula de AB para

cada 9 unidades repetitivas de pirrol. Estes resultados sugerem que de fato, o

corante atua como um agente compensador de carga (dopante) no Ppi.

In

N

F

O

Br

SiSn

S

S

Cl

Cl

Sn

In

SnIn

In

In

In

0

100

200

300

400

500

600

700In

tensid

ade

/ uni. a

rb.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

keV


43

Tabela 1: Análise quantitativa por EDS dos átomos presentes no Ppi-AB

eletropolimerizado sobre FTO-vidro.

Elemento % Massa % Atômica Erro

N K 4,65 14,75 +/- 1,29

O K 19,15 53,15 +/- 1,62

F K 0,00 0,00 +/- 0,00

Si K 0,34 0,54 +/- 0,15

S K 0,66 0,91 +/- 0,16

Cl K 0,47 0,59 +/- 0,13

Br L 11,51 6,40 +/- 0,29

In L 0,82 0,32 +/- 0,31

Sn L 62,40 23,35 +/- 0,67

Total 100,00 100,00

III.4.3. Microscopia de Força Atômica (AFM)

Utilizando a microscopia de força atômica (AFM), investigamos a morfologia e

uniformidade das superfícies dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4, sintetizados sobre

FTO-vidro com Pt previamente depositada. As propriedades físicas e químicas dos

materiais poliméricos podem sofrer grandes alterações com a mínima variação em

seus processos de síntese e deposição, por exemplo, com a mudança do dopante

de ClO4- para AB.

A Figura 20 apresenta as imagens de AFM para o Ppi-AB e Ppi-ClO4. Com a

incorporação do indicador AB na matriz polimérica de Ppi, observou-se a

modificação do tamanho e forma dos grânulos, comparando-se com Ppi-ClO4,

apresentando diâmetros e formas variadas, que resultou na diminuição da

rugosidade média quadrática (Rms) na superfície, de 69 para 40 nm.

Apesar do Ppi-AB possuir grânulos menores que o Ppi-ClO4, o que poderia

favorecer o aumento da rugosidade, estes se encontram bem empacotados,

resultando em menor rugosidade.


44

Figura 20: Imagens de AFM na escala de 2,55 μm x 2,55 μm para o Ppi-AB e

2,81 μm x 2,81 μm para o Ppi-ClO4. Rms = rugosidade média quadrática.

A aderência do filme é um fator importante a ser considerado, sendo que o

desprendimento dos filmes pode acarretar um comportamento falho em seu

desempenho. A aderência depende bastante dos procedimentos de limpeza e da

rugosidade do substrato. Uma maior rugosidade pode aumentar a aderência de um

filme (maior área de contato) ou, por outro lado, pode gerar defeitos de cobertura

prejudicando a formação dos filmes. Experimentalmente, verificou-se que a

aderência do filme Ppi-AB foi melhorada em relação aos filmes de Ppi-ClO4. Como o

substrato utilizado é o mesmo para ambos os casos, podemos sugerir que esta

maior adesão esteja relacionada com a granulometria dos materiais obtidos, já que o

Ppi-AB possui granulometria de tamanho variado com aglomerados de partículas

menores comparadas com a do filme Ppi-ClO4, permitindo que haja uma maior área

de contato entre o filme polimérico e o substrato.

A Figura 21 apresenta as imagens de AFM correspondentes ao Ppi-AB e

Ppi-ClO4, onde é possível visualizar a diferença de fase na superfície da amostra.

Com relação ao Ppi-ClO4, praticamente não ocorre esta diferença de fase, que é

relativa à dureza da superfície, sendo a superfície bastante homogênea. Com

relação ao Ppi-AB é bem nítida a presença de diferentes fases na amostra, o que

pode estar associado com o processo de polimerização utilizando um íon dopante de

baixa mobilidade.

276.01

[nm]

0.001.00 um 2.55 x 2.55 um

ppi-bpb p83b-pt21

472.13

[nm]

0.001.00 um 2.81 x 2.81 um

ppi-clo4 p83b-pt71

Ppi-AB Ppi-ClO4

2,55 x 2,55 μm 2,81 x 2,81 μm1,00 μm 1,00 μm

Rms = 40,75 nm Rms = 69,05 nm

472,13

276,01

[nm]

0,00 0,002,81 x 2,81 μm


45

Figura 21: Imagens de AFM (diferença na dureza da superfície) na escala de

2,52 x 2,52 μm para Ppi-AB e 2,81 x 2,81 μm para Ppi-ClO4.

III.4.4. Voltametria Cíclica (VC)

Foram obtidos os voltamogramas cíclicos para os filmes de Ppi-ClO4 e Ppi-AB

sintetizados sobre ouro. A faixa de potencial foi variada entre -0,6 e 0,9 V com

velocidade de varredura de 20 mV.s-1. A Figura 22 mostra os voltamogramas para o

Ppi-ClO4 e Ppi-AB medidos em pH 1,5 e 7,5. O polipirrol apresentou comportamento

eletroquímico dependente do pH, com maior corrente faradaica em menores valores

de pH (note a alta corrente em pH 1,5 na Figura 22a). Esta dependência já foi

descrita na literatura,137 sendo atribuída principalmente à desprotonação do Ppi em

soluções alcalinas, que diminui o nível de oxidação e portanto o nível de dopagem

do polímero (diminuição da eletroatividade), consequentemente, com a

desprotonação do polímero, o contra-íon aniônico move-se da matriz polimérica em

direção ao eletrólito. Por outro lado, em soluções ácidas, as cadeias de Ppi estão

altamente protonadas, permitindo que o íon dopante mova-se para o interior da

matriz polimérica, restaurando a neutralidade de carga.138-140

-0.27

[V]

-6.171.00 um 2.52 x 2.52 um

ppi-bpb p83b-pt21

-2.74

[V]

-6.681.00 um 2.81 x 2.81 um

ppi-clo4 p83b-pt71

Ppi-AB Ppi-ClO4

1,00 μm 1,00 μm2,52 x 2,52 μm 2,81 x 2,81 μm-6,17 -6,68

-0,27

[V]

-2,74

[V]


46

Figura 22: Voltamogramas cíclicos do a) Ppi-ClO4 e b) Ppi-AB em pH 1,5 e 7,5. Em

detalhe: voltamograma cíclico do AB em pH 1,5. Solucão tampão fosfato foi utilizada

como eletrólito. Velocidade de varredura de 20 mV.s-1.

Outra característica interessante na Figura 22a é a diminuição constante do

potencial de oxidação do Ppi quando o filme é condicionado em meios mais

alcalinos, mudando de +0,0 V (pH 1,5) para -0,3 V (pH 7,5) no caso do Ppi-ClO4.

Durante o processo de oxidação, os íons presentes no eletrólito migram para o

interior da matriz polimérica com a finalidade de estabilizar as cargas geradas.140 A

alta atividade dos íons OH- em soluções alcalinas fornece uma contribuição extra

para a estabilização da forma oxidada do Ppi, abaixando o potencial de oxidação

(este comportamente será discutido com mais detalhes na discussão da Figura 22b).

Tendências similares à descrita acima foram obtidas para Ppi auto-dopado (poli(3-

carboximetilpirrol)).141 Também neste caso, uma diminuição do potencial de oxidação

foi observado com o aumento do pH (até pH 6).

De acordo com a Figura 22b, o Ppi-AB apresenta um comportamento

eletroquímico diferente do apresentado pelo Ppi-ClO4. Em pH baixo, o par redox em

0,7/0,6 V (destacado na Figura 22) é evidente no voltamograma do Ppi-AB. Os

voltamogramas do AB em solução tampão de pH 1,5, também apresentaram um par

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

-1,2

-0,6

0,0

0,6

1,2

1,8

2,4

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

i / m

A

E / V vs. Ag|AgCl

AB

- 0,3 V

pH 1,5

pH 7,5

i / m

A

E / V vs. Ag|AgCl

a) Ppi-ClO4

Eoxi

0,0 V

+ 0,6 V

+ 0,7 V

(i)

(ii)

(i)

b) Ppi-AB

pH 1,5

pH 7,5

(ii)


47

reversível em ca. 0,7/0,6 V (em detalhe na Figura 22), portanto, este par redox do

filme pode ser diretamente relacionada ao processo redox do AB. Além disso, dois

novos processos (i) e (ii) observados em 0,5/0,4 V e -0,2/-0,3 V, respectivamente,

não foram previamente observados para o Ppi e também não para o AB. Assume-se

que estes novos processos sejam resultados da interação entre o corante e o

polímero. O potencial de oxidação em -0,2 V podem resultar de uma estabilização

mais eficiente dos cátions na cadeia de Ppi pelas moléculas de corante presas na

matriz polimérica. As espécies negativamente carregadas do corante (Figura 10)

interagem com o Ppi oxidado (positivamente carregado), atuando como dopante e

esta interação estabiliza a cadeia polimérica no estado oxidado, diminuindo o

potencial de oxidação. Em pH 7,5 o processo redox relacionado ao AB (0,7/0,6 V) no

filme Ppi-AB (Figura 22b) não é tão evidente quanto em pH 1,5. Um pequeno

deslocamento para potenciais mais catódicos foi observado para o pico de oxidação

do AB em solução alcalina. As VCs do Ppi-AB em pH 7,0; 8,0 e 11,0, apresentaram

comportamento similar ao pH 7,5.

III.4.5. Caracterização in situ

Nesta seção, serão discutidos os resultados obtidos através das

caracterizações espectroeletroquímicas in situ. Para isso utilizou-se técnicas

espectroscópicas (Raman e UV-Vis) e eletroquímicas (cronoamperometria –

aplicação de potencial em função do tempo) objetivando a obtenção de informações

à nível molecular sobre as características do filme de Ppi dopado com AB.

III.4.5.1. UV-Vis

O espectro de absorção do AB e de suas formas desprotonadas (AB- e AB2-)

em solução, foram coletados em diferentes pHs (Figura 23). O espectro de absorção

do corante em solução apresenta duas bandas dependentes do pH, em 435 e

580 nm. A atribuição destas bandas não é bem descrita na literatura, já que uma só

banda tem sido relacionada a diferentes formas do corante AB.142-146


48

Figura 23: Espectros UV-Vis do corante AB solubilizado em solução tampão fosfato

de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0.

O corante AB possui diferentes colorações no espectro visível, quando está

solubilizado em soluções tamponadas de diferentes pHs. Baseando-se nesta

propriedade, utilizamos a roda de cores de Newton durante as atribuições das

bandas, já que a cor observada em uma espécie pode trazer informações sobre sua

correspondente faixa de comprimento de onda de absorção através de sua cor

complementar (maiores detalhes serão dados no Capítulo IV). Desta forma as

soluções amarela, vermelha e azul deveriam ter absorção entre 400 e 430 nm, entre

490 e 560 nm e entre 560 e 620 nm, respectivamente.147

A Figura 24 mostra os espectros obtidos durante as medidas in situ para o

Ppi-AB em pH 1,5; 3,0; 7,5 e 11,0. Os espectros apresentam dois picos principais em

ca. 600 e 700 nm. Esta banda em 700 nm é atribuída à transição do estado polaron

ligante para os estados polaron antiligantes do Ppi.20 A banda em ca. 600 nm é

atribuída à forma AB2-. Em ambos os pHs, (1,5 e 3,0, Figura 24a e b,

respectivamente), a absorção desta banda aumenta quando o potencial se torna

mais anódico. A absorção em ca. 700 nm é também dependente do potencial em

400 450 500 550 600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,011,0

8,0

7,5

7,0

3,0

Ab

so

rbâ

ncia

/ u

ni.a

rb.

Comprimento de onda / nm

1,5

a)

AB

AB-

AB2-


49

meio ácido, aumentando sua intensidade com o aumento do nível de oxidação do

Ppi. Esta banda em pH 1,5, é sempre mais intensa do que a banda relacionada à

forma AB2- do dopante, entretanto, em pH 3,0, a banda relacionada ao corante

(600 nm), se torna mais intensa do que a banda do Ppi (700 nm) na escala de

potencial entre -0,4 e + 0,2 V. Uma banda em 525 nm também é observada em

pH 3,0, podendo ser atribuída à transição da banda de valência para o estado

polaron antiligante no Ppi11 ou à forma mono carregada do corante (AB-), ou

provavelmente é resultante da sobreposição de ambas as absorções.

Comparando-se o comportamento do Ppi-AB em meio ácido, nota-se que ocorre

mudanças drásticas no seu comportamento óptico quando este é imerso em pH 7,5,

como mostrado na Figura 24c. A absorção do corante em 600 nm é muito forte e a

banda relacionada à matriz polimérica aparece como um ombro em 700 nm. Embora

ambas as bandas apresentem alguma dependência com o pH, a banda em 600 nm

não muda significantemente em pHs neutro e alcalino (Figura 24c e d). A

dependência dos espectros de UV-Vis do Ppi-AB com o potencial aplicado em pH

7,0; 8,0 (não mostrados) e 11,0 (Figura 24d) são similares aos observados para pH

7,5 (Figura 24c), onde a banda de absorção atribuída ao corante em ca. 600 nm

apresenta pouca dependência com o potencial.

As medidas de UV-Vis apresentadas na Figura 24 fornecem uma idéia sobre

a interação entre o corante e a matriz polimérica. Especificamente, é possível notar a

forte dependência da intensidade da banda em 600 nm (atribuída ao corante na

forma AB2-) com o potencial em soluções mais ácidas. Em baixos valores de pH, o

equilíbrio favorece a forma protonada da espécie, AB. No entanto, mesmo em pH 1,5

e 3,0 (Figura 24a e b), a absorção em 600 nm (devido à forma carregada do corante)

aumenta quando o potencial é variado em direção a valores mais positivos. Pode-se

explicar este comportamento considerando que à medida que o polipirrol é oxidado,

as formas carregadas do corante agem como contra-íons, estabilizando as cargas

positivamente carregadas presentes na cadeia polimérica. Assim, a oxidação do Ppi

afeta diretamente o equilíbrio de dissociação do corante (Figura 10), devido ao

aumento da demanda por contra-íons para a estabilização da cadeia polimérica

durante o processo de oxidação.


50

Figura 24: Espectros UV-Vis para o Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de pH

a )1,5; b) 3,0; c) 7,5 e d) 11,0.

A observação feita para estas medidas estão de acordo com a literatura, já

que estudos utilizando micro-balança de cristal de quartzo mostraram a difusão de

íons presentes no eletrólito em direção à matriz polimérica a fim de alcançar

eletroneutralidade.148,149 Em nosso trabalho, sugere-se que as espécies carregadas

do corante agem como contra-íons e, portanto o equilíbrio da Figura 10 se desloca

buscando compensar a demanda por contra-íons gerada durante a oxidação do Ppi.

Em altos valores de pH, o equilíbrio do corante favorece a forma AB2-, resultando em

uma alta absorção em 600 nm. Além disso, íons OH-, os quais desprotonam as

cadeias de Ppi estão também presentes no meio e contribuem significantemente

para a estabilização das cargas positivas do polímero após a oxidação do filme.

Nestes casos, (pH maior que 7,0), a banda em 600 nm não é significantemente

afetada pelo potencial aplicado, como mostrado na Figura 24c e d.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

550 600 650 700 750 800 850

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

550 600 650 700 750 800 850

+0,4V

-0,2V

-0,4V

+0,2V

Ab

so

rbâ

ncia

/ u

ni. a

rb.

0,0V

Ppi-AB_pH 1,5

a) b)

Ppi-AB_pH 3,0

+0,4V

-0,2V

-0,4V

+0,2V

0,0V

Ppi-AB_pH 7,5

c)

Comprimentos de onda / nm

+0,4V

-0,2V

-0,4V

+0,2V

0,0V

+0,4V

-0,2V

-0,4V

+0,2V

0,0V

Ppi-AB_pH 11,0

d)


51

Nath e cols.65 estudaram a dependência do pH no interior de microtubos de

Ppi-AB com potencial aplicado. Eles assumiram que a solução de monômero

contendo concentração de AB ≤ 8 x 10-4 mol.L-1 gera um filme com VCs similares à

do filme de Ppi-ClO4. Em outras palavras, a presença do AB no micro-ambiente não

afeta o processo redox do filme polimérico. Estas observações contrastam com os

nossos resultados (Figura 22), os quais mostram um claro efeito do corante no

comportamento redox do filme polimérico na superfície do ouro (neste caso,

utilizou-se uma solução do monômero contendo 4 x 10-4 mol.L-1 de AB).

III.4.5.2. Medidas por espectroscopia Raman

O comportamento do corante durante o processo redox do polímero também

foi avaliado por espectroscopia Raman in situ. A espectroscopia Raman é uma

técnica que tem uma maior especificidade molecular (transições vibracionais) que a

espectroscopia UV-Vis (transições eletrônicas).

A Figura 25 mostra os espectros Raman de soluções aquosas contendo

4,0 x 10-4 mol.L-1 do corante AB em solução tampão (STF) de diferentes pH (1,5; 3,0

e 8,0). Os espectros foram obtidos utilizando um laser com emissão em 785 nm para

evitar a interferência da fluorescência na resposta. As formas AB, AB- e AB2- do

corante foram unicamente caracterizadas, sendo que suas vibrações características

foram usadas como impressões digitais das moléculas, para em seguida confirmar a

presença destas formas específicas do corante preso no filme de Ppi, em um certo

pH e potencial aplicado. A banda em 860 cm-1 é atribuída à deformação angular

(bending) fora do plano da ligação CH do anel aromático,123 e se desloca para

maiores frequências, alcançando 893 cm-1 em pH 1,5. Em pH 3,0, a banda

vibracional relacionada ao estiramento assimétrico do grupo SO32- é observada em

1074 cm-1.150 Esta banda é também atribuída ao grupo PO43-, presente na solução

tampão. Em pH 7,5 e 8,0 esta banda ainda está presente, como esperado, e ainda é

observado uma forte banda em 989 cm-1 relacionada ao “modo de respiração” do

anel benzênico151 e estiramentos simétricos dos grupos SO32- e PO3

2-.

Consequentemente, os modos de vibração em 860, 882 e 893 cm-1 (atribuídos à

deformação angular fora do plano da ligação CH do anel aromático) serão usados

como marcadores para a presença das formas do dopante: AB2-, AB- e AB,

respectivamente.


52

Figura 25: Espectros Raman do corante AB (Azul de Bromofenol) solubilizado em

solução tampão fosfato com diferentes pH. Fonte com emissão em 785 nm.

Os espectros Raman dos filmes Ppi-AB em baixo pH e com diferentes

potenciais aplicados estão apresentados na Figura 26. Os espectros do Ppi-ClO4

com diferentes potenciais aplicados estão mostrados como em detalhe nesta figura

para futuras comparações. Em meio ácido, o espectro do filme Ppi-AB em +0,4 V

(Ppi altamente oxidado) é semelhante ao do Ppi-ClO4,129,152 apresentando duas

bandas intensas em 925 e 1620 cm-1, características do Ppi no estado oxidado. A

intensidade destas bandas diminui com o aumento do potencial catódico. As bandas

em 925 e 1620 cm-1 desaparecem quando valores de potencial mais negativos que

0,1 V são atingidos, sendo substituído por novas bandas em 987 e 1560 cm-1

atribuídos ao Ppi no estado reduzido. Os espectros em potenciais negativos

apresentam algumas diferenças interessantes comparando-se com o espectro do

Ppi-ClO4 no mesmo potencial.

A presença da banda em 1620 cm-1 no espectro do Ppi-AB em meio ácido em

potenciais negativos, sugere um maior nível de oxidação do Ppi no Ppi-AB do que no

Ppi-ClO4 nas mesmas condições.129 Esta observação pode também ser confirmada

800 1000 1200 1400 1600

989

1319

1305

1074

AB2-

AB-

AB

Azul de Bromofenol

Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb.

Deslocamento Raman / cm-1

860

882

893

pH 8,0

pH 3,0

pH 1,5


53

comparando-se a corrente obtida nas VCs do Ppi-ClO4 e Ppi-AB nas mesmas

condições (Figura 22). Além disso, a banda em 1560 cm-1, atribuída ao estiramento

C=C (característica da forma neutra do polímero), domina o espectro do Ppi-ClO4 em

-0,4 V, sendo muito mais fraca no espectro do filme do Ppi-AB.134,153 Outro

comportamento observado nos espectros do Ppi-AB está relacionado à presença da

banda em 882 cm-1 atribuída à forma AB- do corante (ver Figura 25). Com a

oxidação do Ppi, um novo modo vibracional aparece em 860 cm-1, o qual é

relacionado à forma AB2- do indicador. Um ombro em 893 cm-1 atribuído à forma

neutra AB aparece em +0,2 V. A demanda por cargas negativas na matriz polimérica

afeta o equilíbrio, diminuindo a concentração das espécies neutras no meio. Esta

dependência com o potencial corrobora as análises prévias por UV-Vis, onde foi

mostrado que o corante na forma carregada age como contra-íon, interagindo com a

cadeia polimérica e afetando a posição do equilíbrio ácido-base do corante (Figura

10).


detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emissão em 633 nm.

800 1000 1200 1400 1600

800 1000 1200 1400 1600

-0,4 V

-0,2 V

0,0 V

+0,2 V

+0,4 V

Inte

nsi

dade / u

ni.

arb

.


Ppi_pH 3,0

987

882

Ppi-AB_pH 3,0

Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb.


+0,4V

+0,2V

-0,2V

-0,1V

-0,4V

0,0V 860

925 990925 990

1560 16201560 1620

Ppi-ClO4 _pH 3,0


54

A Figura 27 apresenta os espectros do filme Ppi-AB em pH 7,0. Neste caso,

quantidades significantes de ambos, AB2- e AB, caracterizados respectivamente

pelas bandas em 860 cm-1 e 893-1, parecem coexistir para todos os potenciais

aplicados, de forma similar aos resultados obtidos por UV-Vis (Figura 24). Os

espectros Raman do filme imerso em meio tamponado neutro apresenta um

equilíbrio do corante independente do potencial aplicado, diferente do filme imerso

em meio ácido. Nos espectros Raman do Ppi-ClO4 imerso em pH 8,0 (Figura 27),

nota-se a diminuição da intensidade do modo vibracional relacionado ao estado

bipolaron (1080 cm-1) do polímero comparado com o do Ppi-ClO4 em meio ácido.

Este comportamento é consistente com o efeito de desprotonação no mecanismo de

desdopagem, como discutido nas VCs (Figura 22). Com relação ao Ppi-AB,

observa-se que seu nível de oxidação em meio alcalino não é tão dependente do

potencial aplicado quanto em meio ácido. Em pH > 7,0 o modo vibracional

característico do Ppi no estado intermediário de dopagem,129,154 ca. 950 cm-1, é

observado em todos os espectros do filme condicionado de +0,4 a -0,4 V, assim

como o modo de vibração em 1590 cm-1 (atribuída à forma polaron).129 Sugere-se

que em meio alcalino a presença das formas aniônicas do corante presas na matriz

polimérica mantém o filme em um nível intermediário de oxidação. Estes resultados

sugerem uma diminuição da entrada de íons presentes no eletrólito, na matriz

polimérica, como OH-, os quais podem desprotonar o polímero levando à diminuição

do nível de oxidação, como discutido anteriormente.


55



O filme imerso em pH = 8,0 também apresenta-se independente do potencial

aplicado com relação à razão entre as espécies AB- e AB2-. É interessante destacar

a presença da forma neutra do corante, caracterizado pela presença da banda em

893 cm-1 quando o Ppi-AB é imerso em meio alcalino (Figura 28). Esta forma do

corante (AB) desaparece completamente em soluções com pH > 4,81146 (Figura 23).

A presença desta banda em meio alcalino sugere que ocorre um deslocamento no

pKa155 do corante devido à interação deste com a matriz polimérica. Este é um

exemplo perfeito de como o equilíbrio ácido-base de um indicador é afetado pelo

ambiente que o cerca.

800 1000 1200 1400 1600

800 1000 1200 1400 1600

-0,4 V

-0,2 V

0,0 V

+0,2 V

+0,4 V

Ppi_pH 7,0

Inte

nsi

dade / u

ni.

arb

.


Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb.


Ppi-AB_pH 7,0

+0,4V

+0,2V

-0,2V

-0,1V

-0,4V

0,0V

860

893

Ppi-ClO4 _pH 7,0


56



A Figura 29 mostra a dependência da intensidade das bandas características

das formas do corante com o nível de oxidação do Ppi-AB em pH 3,0 e 8,0. O

Ppi-AB em pH 3,0 apresenta alta concentração da forma neutra AB no estado

reduzido, a qual diminui com a oxidação do Ppi. Ao mesmo tempo, a concentração

da forma AB2- (a qual não foi observada em -0,4 V) aumenta durante o processo de

oxidação. A comparação destes resultados por Raman com os obtidos por VC para o

Ppi-AB em meio ácido (Figura 22b), confirma que ocorrem mudanças drásticas na

concentração da forma AB dentro da região de potencial relacionada à formação de

cátions (polarons) na cadeia de Ppi.

O Ppi-AB em meio alcalino, em estado reduzido, apresenta bandas bem

definidas em 860 e 893 cm-1, atribuídas às formas AB2- e AB, respectivamente. É

observada uma diminuição sutil de ambas as bandas durante o processo de

oxidação, entretanto a razão entre as formas AB/AB2- praticamente não muda. Estes

resultados corroboram o mecanismo sugerido anteriormente pelos resultados de

UV-Vis (Figura 24), no qual a dependência do equilíbrio AB/AB2- com o potencial foi

800 1000 1200 1400 1600

860

Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb.


+0,4V

+0,2V

-0,2V

-0,1V

-0,4V

0,0V

860893

860

+0.4V

+0.2V

-0.2V

-0.1V

-0.4V

0.0V

860893

860

Ppi-AB_pH 8,0

+0.4V

+0.2V

-0.2V

-0.1V

-0.4V

0.0V

860893

860

+0.4V

+0.2V

-0.2V

-0.1V

-0.4V

0.0V

860893

860

+0.4V

+0.2V

-0.2V

-0.1V

-0.4V

0.0V

860893

800 1000 1200 1400 1600

-0,4 V

-0,2 V

0,0 V

+0,2 V

+0,4 V

Ppi_pH 8,0

Inte

nsi

dade / u

ni.

arb

.


860

+0.4V

+0.2V

-0.2V

-0.1V

-0.4V

0.0V

860893

Ppi-ClO4 _pH 8,0


57

explicada em termos do aumento da demanda por cargas durante a oxidação do Ppi.

Entretanto, em meio alcalino, devido à alta concentração de espécies aniônicas no

interior da matriz polimérica, a dependência da razão entre as formas do corante

com o potencial não é observada.

Figura 29: Dependência do equilíbrio do corante com o potencial aplicado em pH 3,0

e 8,0. As intensidades analisadas correspondem às bandas em 860 cm-1 (AB2-) e em

893 cm-1 (AB).

Considerando a interação entre as formas aniônicas do corante e a cadeia

polimérica positivamente carregada, seria esperado um aumento do Ka para o

equilíbrio do corante mostrado na Figura 10, diminuindo consequentemente o pKa do

-400 -200 0 200 400

pH 3,0

Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb.

E / mV

pH 8,0

E / mV vs. Ag|AgCl

AB

AB2-

AB2-

AB


58

sistema. O pKa foi determinado através das intensidades das bandas Raman

relacionadas às diferentes formas do corante AB (860, 882 e 893 cm-1). A razão

entre as formas neutra e monocarregada do corante foi calculada (IAB/IAB- e também

IAB-/IAB) com a finalidade de determinar o pKa para o equilíbrio AB/AB-. Similarmente,

o pKa para o equilíbrio AB-/AB2- foi determinado através das razões IAB-/IAB

2- e

IAB-2/IAB

- (em detalhe Figura 30).

A Figura 30 mostra a razão entre as espécies em função do pH para cada

potencial aplicado. A dependência do pKa com o potencial aplicado é observado

para ambos os equilíbrios. Entretanto, a partir de -0,2 até 0,0 V, a mudança do pKa

não é tão dependente quanto em meio ácido, ao aplicar-se potenciais catódicos.

Esta observação corrobora os dados obtidos através de VC (Figura 22), os quais

mostram o processo redox ocorrendo fora da faixa de potencial entre -0,2 e 0,0 V.

Figura 30: Dependência do pKa do Ppi-AB com o potencial aplicado para os

equilíbrios envolvendo as formas AB e AB- (curva em vermelho) e AB- e AB2- (curva

em azul). Em detalhe: intensidades relativas das bandas Raman atribuídas às

formas AB- e AB2- com potencial aplicado de -0,4 V.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4

3

4

5

6

7

8

2 3 4 5 6 7 8

0,98

0,99

1,00

1,01

1,02

0,98

0,99

1,00

1,01

1,02

IA

B- /

IA

B2-

I AB

2- /

IA

B-

pH

pK

a

E / V vs. Ag|AgCl

Br

BrBr

O

OH

SO3

-

Br

Br

BrBr

O

SO3

-

-O

Br

O

S

OH

Br

BrO

O

BrBr

OH

H+H+

BPB BPB-

BPB2-

pKa = 4.6pKa = 3.0

AB AB-

Br

BrBr

O

OH

SO3

-

Br

Br

BrBr

O

SO3

-

-O

Br

O

S

OH

Br

BrO

O

BrBr

OH

H+H+

BPB BPB-

BPB2-

pKa = 4.6pKa = 3.0

AB- AB2-


59

Levando em conta sensores baseados em polímeros condutores, várias

considerações têm sido feitas com relação ao efeito e transporte de íons no

desempenho do sensor.156,157 Nesse sentido, nosso estudo mostra novas

perspectivas para o desenvolvimento de um sensor eficiente, onde a demanda para

o transporte dos íons presentes na solução pode ser aliviado através das diferentes

formas do corante AB presente na matriz polimérica.


60

III.5. Conclusões Parciais

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho, concluímos que a

presença do indicador AB exerceu um efeito significativo sobre as propriedades do

Ppi, sendo que a presença do AB foi evidenciada através das análises de FTIR-ATR,

EDS-MEV, Raman e também por espectrofotometria UV-Vis. Através da análise por

EDS-MEV, foi possível sugerir uma proporção entre dopante e polímero sendo de

uma molécula de AB para cada 9 unidades pirrólicas. A presença do dopante AB

modificou a morfologia do material, permitindo a obtenção de filmes menos rugosos

e mais aderentes. Além disto, o método de deposição eletroquímica permitiu a

obtenção de filmes uniformes com o controle da espessura do filme sintetizado.

Pode-se dizer ainda, que o fato do material ser sintetizado eletroquimicamente

facilitaria a industrialização do sistema, já que fornece um bom controle durante a

síntese, podendo-se obter materiais com propriedades reprodutíveis, sem correr o

risco de obter materiais com características indesejadas.

Adicionalmente, os resultados obtidos por Raman in situ com eletroquímica

mostram uma dependência significante da interação entre corante e polímero tanto

com o pH quanto com o potencial aplicado, onde o equilíbrio de ionização do AB

desloca-se em busca da estabilização das cargas positivas geradas no Ppi oxidado.

Sistemas como esse podem ser usados para minimizar a interferência causada por

íons presentes no eletrólito, minimizando a migração destes íons em direção à matriz

polimérica. Além disso, conhecimentos sobre o ambiente interno do polímero na

química do dopante fornecem novas perspectivas para o desenvolvimento de

sensores de pH baseados em polímeros.

61

Capítulo IV

Caracterização óptica

para aplicação em

sensor de pH

Capítulo IV – Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH Parte I

62

IV. Caracterização óptica para aplicação em sensor de pH

IV.1. Introdução

A pesquisa envolvendo sensores ópticos é uma área que tem crescido muito

nas últimas três décadas. Como consequência, durante os últimos anos houve um

avanço significativo no desenvolvimento de sensores e biosensores ópticos para

determinação de espécies de interesse químico e biológico. Além disso, muitos livros

e revisões foram publicados, onde se destacam as vantagens da sensibilidade óptica

comparadas com os outros métodos de transdução.158-162

Trabalhos recentes no campo dos sensores ópticos têm focado a busca por

materiais com baixo custo, o desenvolvimento de dispositivos optoeletrônicos

miniaturizados (fontes de luz e detectores) e a detecção de multi-analitos. Novas

tecnologias têm surgido particularmente na área de biosensores devido aos avanços

na tecnologia de microfluídos e imagens.163 Embora os princípios ópticos usados

nestes sensores não mudaram substancialmente com os anos, em muitos casos as

plataformas de transdução sofreram consideráveis mudanças, gerando sensores

com melhores propriedades, incluindo sensibilidade, estabilidade e seletividade. A

melhora destas propriedades ocorre devido ao design da plataforma, o qual busca o

desenvolvimento de um sensor óptico integrado altamente eficiente que combine a

forma como a luz atinge a amostra e a funcionalidade intrínseca do sensor.

O primeiro sensor com transdução química óptica foi baseado na medida de

mudanças no espectro de absorção e foi desenvolvido para determinação de CO2 e

O2.164 Desde então, uma variedade de sistemas ópticos de detecção estão sendo

utilizados em sensores e biosensores, incluindo entre outros, elipsometria,

espectroscopia (luminescência, fosforescência, fluorescência, Raman),

interferometria (interferometria de luz branca, interferometria modal) e a ressonância

de plasmón de superfície (SPR). Nestes sensores, a quantificação da espécie de

interesse é realizada por medidas do índice de refração, quantidade de luz

absorvida, propriedades fluorescentes das moléculas analisadas ou por um meio de

transdução químico-óptico.165

Medidas de pH são usualmente realizadas utilizando um eletrodo

potenciométrico (eletrodo de vidro), no entanto, em algumas circunstâncias, a


63

determinação de pH utilizando sensores ópticos (optodos) é mais viável.166,167 O

conceito básico do método óptico para medidas de pH consiste no fato que o feixe

de luz incidente passa através do sensor e portanto, interage com o indicador

químico, o qual altera a intensidade do feixe de luz, normalmente por absorção ou

por fluorescência.96 O sinal óptico modificado é guiado para o detector e um

indicador é normalmente confinado no sensor óptico, que pode ser chamado de

optodo.168

Os optodos de pH oferecem vantagens devido a algumas de suas

características favoráveis, como tamanho, imunidade a interferências elétricas,

ausência da necessidade de um sensor de referência, possibilidade de

monitoramento remoto, dentre outras.169-172 Estas características dos sensores

baseados em polímeros condutores explicam o porquê de eles serem os mais

utilizados em conjuntos sensoriais, podendo ser facilmente fabricados com baixo

consumo de energia, podendo também operar em temperatura ambiente.

Apesar das boas características dos optodos de pH, uma limitação é sua

estreita faixa de operação. Isto ocorre porque o optodo não mede diretamente o pH,

mas usualmente, a concentração de um corante indicador em suas formas ácida ou

básica. Deste modo, as medidas dependem do pKa do corante e a escala de pH é

restrita a cerca de 3 a 4 unidades. Então, esforços têm sido empregados para se

desenvolver sensores para um extensa faixa de operação (de pH). Os corantes que

apresentam mudança de coloração com o pH são os indicadores ácido-base mais

comuns, sendo utilizados inicialmente nas titulações volumétricas clássicas.173

Corantes orgânicos como vermelho de fenol,174 vermelho de cresol,175 azul de

bromofenol e outros98,176 têm sido apresentados como indicadores de pH

absorventes ou fluorescentes, enquanto a fluorosceinamina,177 piranina,178 assim

como corantes azo,179 são indicadores de pH tipicamente fluorescentes.

Os indicadores de pH são ácidos fracos com propriedades espectrais distintas

associadas com suas formas protonadas (HInd) e desprotonada (Ind-). As

concentrações das formas HInd e Ind- são relacionadas através da equação de

Henderson-Hasselbach (Equação 3), onde Ka é a constante de dissociação, pKa é

-log Ka, e os colchetes indicam a concentração das respectivas formas.180

Equação 3

𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log

𝐼𝑛𝑑−

𝐻𝐼𝑛𝑑


64

Vários materiais foram estudados para permitir a imobilização de indicadores.

Aqueles considerados úteis na imobilização do corante incluem vidros sinterizados

com porosidade controlada,181 materiais poliméricos hidrofóbicos,99 e materiais

hidrofílicos como a celulose182 e a poliacrilamida.183,184 O método de imobilização

que parece ser mais eficiente é aquele onde ocorre ligações covalentes do corante

com uma matriz adequada, proporcionando membranas quase isentas de lixiviação

do corante.174-177 Embora bons resultados foram obtidos com a maioria destes

optodos de pH, eles requerem um método de preparação longo e tedioso, o qual

envolve tratamento da matriz e imobilização do corante.

Polímeros condutores que mudam de cor em função do pH podem ser

empregados no desenvolvimento de optodos com uma extensa faixa de pH.185 Isto é

possível porque esses polímeros são basicamente polieletrólitos com múltiplos

valores de pKa. Existem vários tipos de polímeros, incluindo uma grande variedade

de derivados e, além disso, um grande número de polímeros novos surge todos os

anos. Recentemente, polímeros como o polipirrol, têm sido usados na preparação de

plataformas para sensores ópticos.186 O espectro do polipirrol obtido por oxidação

química é dependente do pH entre pH 6 e pH 12, com pKa em torno de 8,6. De

acordo com a literatura,156 filmes de polipirrol dopado com ânions bissulfato

apresentam resposta à mudança de pH. Em outro trabalho, Tamm e cols.187

verificaram o comportamento sensível a cátions dos filmes de polipirrol dopado com

sulfato e naftalenosulfonato.187,188

Polímeros conjugados podem ser também associados a diferentes

mecanismos de transdução. Por exemplo, sensores ópticos podem ser fabricados

com PICe uma vez que estes polímeros apresentam mudanças espectrais na região

do UV-Vis quando sofrem processos de dopagem e desdopagem.189 Recentemente,

foram desenvolvidos sensores ópticos que incorporam polímeros condutores

sensíveis à amônia,67 umidade, pH e ácido acético.68 Além disso, polímeros

condutores proporcionam uma superfície que pode imobilizar elementos biológicos

como enzimas ou anticorpos, possibilitando-se assim sua aplicação em biosensores.

Saoudi e cols. propuseram um monitoramento dielétrico para estudar o processo de

adsorção de biomoléculas em PICe, tais como DNA em polipirrol.69 Outros exemplos

de aplicações incluem medidas de pH fisiológico,98,70,71 monitoramento do pH da

água do mar,72,73 monitoramento de processos industriais,74 dentre outros.99,190


65

Destacando as aplicações como sensores, o Ppi pode ser aplicado na

detecção de pH, já que suas propriedades ópticas e elétricas são afetadas pelo pH

do meio. O pH tem um efeito significante nas reações químicas, deste modo o

controle e as medidas desta propriedade se tornam importantes em diferentes áreas,

incluindo química, bioquímica e ciência ambiental. Rotineiramente estas medidas

são feitas utilizando o convencional eletrodo de vidro, devido à sua confiabilidade,

boa precisão, medidas não destrutivas, rápidas e reversíveis. A ampliação de seu

uso para outras áreas, entre elas as biomédicas, ambientais e industriais, tem sido

limitada devido a fatores como tamanho, falta de flexibilidade, dependência de um

dispositivo de referência, conexões elétricas, entre outros.191,192 Desta forma, em

algumas circunstâncias é necessária a determinação do pH usando sensores

ópticos,166 incluindo a aplicação em medidas de pH fisiológico,105 monitoramento do

pH da água do mar,98,73 controle de processos industriais,99 entre outras.99 Nestes

casos, o optodo de pH oferece vantagens devido à algumas de suas características

favoráveis, como tamanho, segurança intrínseca, imunidade à interferência elétrica,

entre outras.169,170


66

IV.2. Objetivo específico

O objetivo do trabalho apresentado neste capitulo foi o estudo e

desenvolvimento de um sensor opticamente sensível ao pH. Foi utilizado o polipirrol

como matriz hospedeira e o indicador ácido-base azul de bromofenol. A imobilização

do corante foi realizada durante a polimerização eletroquímica do pirrol. As

propriedades ópticas do material obtido foram estudadas buscando a aplicabilidade

deste material como sensor óptico para pH.


67

IV.3. Parte Experimental

IV.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos

Materiais

Eletrodo de trabalho: FTO-vidro (preparado como descrito no Capítulo III)

Eletrodo de referência: calomelano saturado (ECS).

Contra-eletrodo: placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).

Reagentes

Os mesmos descritos no Capítulo III, além de:

Perclorato de lítio (95%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.

Pirofosfato de sódio decahidratado (99%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.

Cloreto de sódio (99,5%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.

Nitrato de sódio (99,0%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.

Bissulfito de sódio (Nuclear p.a.), usado como recebido.

Soro fisiológico comercial (JP Indústrias Farmacêuticas).

Equipamentos

Para a eletrodeposição de platina (Pt) e síntese eletroquímica dos filmes

sintetizados sobre FTO-vidro utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB,

modelo PGSTAT-30. Para termostatização da célula durante as sínteses, foi utilizado

um acessório de controle de temperatura Tecnal modelo TE-184. Na calibração das

soluções tampão, foi utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321.

Todas as medidas efetuadas nesta etapa foram realizadas em circuito aberto.

IV.3.2. Modificação do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposição de

platina e Síntese dos filmes de polipirrol

A modificação do eletrodo de FTO-vidro com platina foi realizada da mesma

forma como descrita na seção III.3.2 (Capítulo III). A síntese dos filmes de Ppi está

descrita na seção III.3.3 (Capítulo III).


68

IV.4. Resultados e Discussão

IV.4.1. Sensibilidade Óptica ao pH

Apesar do Ppi ser bem conhecido como material sensível a mudanças de pH,

suas propriedades podem ser afetadas pelas condições de síntese como tipo de

dopante e concentração do mesmo. Baseando-se nestas informações, filmes de

Ppi-ClO4 foram sintetizados nas mesmas condições de síntese dos filmes de Ppi-AB

para futuras comparações.

Na Figura 31a estão mostrados os espectros de absorção dos filmes de

Ppi-ClO4 imersos em soluções tampão com diferentes valores de pH. Os espectros

foram coletados em temperatura ambiente (ca. 25°C). O filme de Ppi-ClO4 apresenta

mudanças na intensidade da banda de absorção em função do pH de forma similar

ao trabalho previamente publicado na literatura para filmes de Ppi quimicamente

sintetizados.186 Esta banda de absorção que começa em 550 nm é atribuída às

transições interbandas (modelo polaron-bipolaron), a qual possui o máximo

deslocado para menores comprimentos de onda ao ser exposto a pH > 7. De acordo

com a literatura193 este deslocamento para menores comprimentos de onda é devido

a processos de desdopagem, que ocorre quando o filme de Ppi é exposto a pH > 6.

Durante este processo os íons ClO4- são lentamente trocados por íons hidróxido. A

sensibilidade a mudanças de pH observada para o Ppi pode ser em parte explicada

através da dissociação de hidroxilas ligadas aos anéis de pirrol, além disso a

presença de íons hidróxido pode levar à desprotonação da cadeia polimérica,

resultando em diminuição do nível de oxidação do polímero. Esta observação pôde

também ser feita através das análises por Raman e VC (Capítulo III).

A curva de calibração para o Ppi-ClO4 imerso em soluções de diferentes pHs

está mostrada na Figura 31b. Através desta curva de calibração, estimamos o valor

de pKa do Ppi igual a 7,4, o qual pode ser comparado com valores obtidos para Ppi

sintetizados quimicamente186 (pKa = 8,6). Esta diferença mostra que o polipirrol

sintetizado eletroquimicamente neste trabalho possui maior acidez, podendo ser

desprotonado com maior facilidade.


69

Figura 31: a) Espectros de absorção do filme Ppi-ClO4 imerso em solução tampão

fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0; e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva de

calibração para Ppi-ClO4 imerso em solução tampão de diferentes pH para valores

de absorbância em 680 nm.

O corante utilizado como dopante, AB, possui três formas estruturais no

intervalo de pH estudado, cuja distribuição relativa obedece ao equilíbrio ácido-base

mostrado na Figura 10. De acordo com a literatura, o pKa do AB é 4,0,194 sendo que

a coloração da solução muda de amarelo (meio ácido) para azul (meio alcalino).

A Figura 32 mostra os espectros de absorção UV-Vis das diferentes formas

do indicador AB em soluções com diferentes pH. Como mencionado anteriormente

na seção III.4.5.1, utilizou-se as cores específicas de cada solução com a finalidade

de determinar a absorção característica de cada forma do indicador AB. Para isto,

uma simples relação foi feita com a roda de cores desenhada por Newton em 1666

(Figura 32b).195 A porção do espectro eletromagnético entre 380 e 780 nm é

correspondente a região do visível. Ondas de luz com comprimentos de onda nesta

faixa são coloridas aos olhos humanos. Quando a luz branca é difratada por um

prisma, resulta em um arco-íris, sendo violeta em um extremo e vermelha no outro.

Entretanto, o fenômeno da cor em compostos coloridos não é tão simples. Quando

um material é iluminado por luz branca, possui uma coloração específica, sendo

branco quando não absorver nenhuma faixa de comprimento de onda da luz visível,

ou colorido quando absorver parte desta luz. Diferentemente de fontes coloridas,

como os lasers por exemplo, os compostos que absorvem luz na região visível do

500 550 600 650 700

0,50

0,52

0,54

0,56

0,58

0,60

0,62

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

b) A

bso

rbâ

ncia

/ u

ni.a

rb.

pH 11,0

pH 1,5

a)


pH

pKa = 7,4


70

espectro não possuem a cor correspondente ao comprimento de onda da luz

absorvida. Ao contrário, existe uma relação inversa entre a cor observada (cor

característica do material) e a cor absorvida (comprimento de onda de absorção).

Quando observamos a luz emitida de uma fonte, como em uma lâmpada ou

laser, observamos a cor correspondente ao comprimento de onda da luz sendo

emitida. Uma fonte de luz que emite na cor violeta, emite luz correspondente ao

extremo mais energético do espectro visível, enquanto que uma fonte que emite

vermelho corresponde à região de mais baixa energia no espectro visível.

Entretanto, quando observamos a cor de um objeto ou substância, esta coloração

não é resultante de emissão, já que o material não permanece com a mesma

coloração no escuro.

Figura 32: a) Espectros de absorção do indicador AB solubilizado em solução

tampão fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. Em

detalhe: imagem das soluções de pH 1,5; 3,0 e 7,0 com suas respectivas colorações.

b) Roda de cores desenhada por Newton.

Quando o material colorido é iluminado por luz branca, uma faixa de

comprimento de onda é absorvida e a porção restante é refletida. Essa porção

restante dá a cor característica do material, a qual se assume como sendo a cor

complementar do comprimento de onda absorvido. As cores complementares estão

localizadas diametricamente em lados opostos na Figura 32b. Desta forma, as

soluções coloridas podem indicar a faixa de comprimento de onda onde a banda de

absorção correspondente deve aparecer no espectro de absorção. Portanto, as

400 450 500 550 600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,011,0

8,0

7,5

7,0

3,0

Ab

so

rbâ

ncia

/ u

ni.a

rb.


1,5

a) b)

1,5 3,0 7,0


71

soluções amarela, vermelha e azul deveriam apresentar uma banda de absorção

característica destas cores na região do violeta/azul (de 400 a 430 nm), verde

(de 490 a 560 nm) e alaranjado (de 580 a 620 nm), respectivamente. A banda de

absorção em 435 nm é a dominante no espectro em pH 1,5; sendo que desaparece

para pH > 4,81.146 De acordo com a roda de cores de Newton, essa banda é

resultante da solução amarela e portanto é característica da forma neutra AB. A

banda de absorção em 580 nm se torna mais intensa para meios mais alcalinos,

como resultado a solução alcalina é azul e portanto atribuída a forma AB2- do

indicador. Finalmente, a solução vermelha é o resultado do ombro em cerca de

525 nm presente na banda de absorção em 580 nm (Figura 32).

Na Figura 33 estão os espectros de absorção do filme Ppi-AB imerso em

soluções tampão com diferentes pHs. Comparando estes espectros com os

espectros da Figura 31 e Figura 32, nota-se a maior semelhança do espectro do

Ppi-AB com a resposta óptica do dopante AB, sugerindo que: (i) a concentração do

corante na matriz polimérica é maior que a concentração de Ppi, ou (ii) que a

resposta do Ppi esteja sendo mascarada pela resposta do indicador AB. No entanto,

as análises de EDS (Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X) discutidas

no Capítulo III, evidenciaram 15% de nitrogênio para 6% de bromo (porcentagem

atômica), que leva à proporção de 1 molécula de AB para cada 9 unidades

repetitivas de Pi. Portanto, descarta-se a primeira hipótese, podendo-se afirmar que

o corante está atuando como dopante para o Ppi e, portanto, está presente em

menor quantidade. Com relação à segunda hipótese, nota-se que apesar do Ppi-AB

e do indicador AB possuírem bandas de absorção na mesma região, é notável a

diferença de sensibilidade em relação ao pH. Neste ponto é importante destacar a

presença da banda em 439 nm mesmo em pH alcalino (pH 8,0), já que como

mencionado antes, esta banda desaparece para pH > 4,81146 quando a espécie AB

está em solução. Este fato pode ser devido a dois fatores: (i) a absorção pode ser

resultante do indicador com uma contribuição da absorção do polímero, já que em

níveis intermediários de oxidação, este apresenta bandas de absorção nesta

região20 e (ii) a interação do indicador com a matriz polimérica, favoreceria o

deslocamento da reação mostrada na Figura 10 para a forma neutra do indicador

(cor amarela), favorecendo uma maior estabilização da forma ácida AB. Se isto

realmente for verdade, significa que ocorre uma diminuição da acidez do corante,


72

sendo esperado um aumento no valor aparente do pKa do material. O interessante é

que este comportamento poderia ser usado eficientemente na aplicação do possível

sensor no monitoramento de pequenas variações de pH em amostras ambientais e

fisiológicas.

Figura 33: a) Espectros de absorção do filme Ppi-AB imerso em solução tampão

fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 à temperatura ambiente. b) Curva de

calibração para Ppi-AB imerso em solução tampão de diferentes pH.

Na Figura 33b estão mostradas as duas curvas de calibração para os

comprimentos de onda em 439 e 594 nm. Como a absortividade das espécies AB e

AB2- são diferentes, optou-se em determinar o pKa do sistema através do método

por cálculos. Para um equilíbrio ácido-base do tipo representado na Figura 10, a

relação entre as concentrações das espécies para cada valor de pH varia de acordo

com a expressão de Henderson-Hasselbach. De acordo com a lei de Beer,196,197 a

concentração da espécie absorvente é proporcional à sua absorbância (A) segundo

a relação A = ε.b.C, onde ε é a absortividade (molar, quando C é a concentração da

espécie em mol.L-1) e b é o caminho óptico. Portanto, a equação de

Henderson-Hasselbach pode ser reescrita em termos de absorbância (Equação 4),

onde Aác é a absorbância somente da forma ácida, Abás é a absorbância somente da

forma básica e Ai é a absorbância total da mistura (formas ácida + básica) para um

dado pH.

400 450 500 550 600 650 2 4 6 8 10

1,2

1,0

0,8

0,6

soro fisiológico

11,0

1,5

11,0

8,0

7,5

7,0

3,0

soro

fisiológico

Absorb

ância

/ a

.u.


1,5

a)

0,4

439 nm

594 nm

b)

pH

pH 7,4

Absorb

ância

/ u

ni. a

rb.


73

ibás

áci

aAA

AApHpK log

Equação 4

Desta forma a Equação 4 pode ser usada diretamente para cada uma das

soluções e uma vez conhecido o pH e o termo logarítmico, obtém-se algebricamente

os valores de pKa. Substituindo-se os valores obtidos dos dados

espectrofotométricos na Equação 4, obtêm-se o valor de pKa em cada solução

tampão para os comprimentos de onda 435 e 584 nm. Tomando-se a média entre os

valores, obteve-se como pKa aparente, o valor de 7,7. Este valor é bem próximo do

pKa obtido para Ppi-ClO4 (7,4), o que corrobora a hipótese de que o polímero

contribui para a sensibilidade do material, facilitando a estabilização da forma neutra

do indicador (AB), diminuindo a acidez aparente e consequentemente aumentando o

pKa do sistema. O aumento do pKa é resultante do estado de oxidação do polímero,

como mostrado nas medidas in situ (seção III.4.5). Desta forma, o pKa observado

sugere que o polímero está parcialmente reduzido nas condições do experimento.

Esse estado parcialmente reduzido é resultante do processo de síntese utilizado

neste trabalho. Como descrito na seção experimental (seção III.3.3), os filmes de Ppi

foram sintetizados por VC, sendo -0,3 V o potencial final de síntese. De acordo com

as VC mostradas no Capítulo III, em -0,3 V o polímero está reduzido, possuindo

menor número de estados polaronicos/bipolaronicos na cadeia polimérica,

resultando em menor demanda por cargas negativas do dopante. Como resultado,

ocorre a diminuição da acidez do indicador AB, resultando em um aumento do pKa

do sistema, o qual é próximo de optodos sensíveis ao pH baseados em Ppi (8,6).186

Desta forma, assume-se que ambos Ppi e AB participam da sensibilidade ao pH, e

portanto, a resposta do material é resultado de um efeito sinérgico. Ao se aumentar o

pH, os íons hidróxido afetam ambas as espécies individualmente, assim como o

sistema Ppi-AB de forma geral. Com relação ao indicador em solução, os íons

hidróxido provocam a desprotonação da molécula, deslocando o equilíbrio (Figura

10) em direção às formas aniônicas do indicador. Considerando o Ppi, os íons

hidróxido podem estabilizar as cargas positivas presentes na cadeia polimérica

parcialmente oxidada, e podem ainda desprotonar o polímero, levando à diminuição

do nível de oxidação do Ppi. Todos os efeitos do pH sobre as moléculas do dopante

AB, sobre o Ppi e sobre as interações entre moléculas do corante presas na cadeia

polimérica, afetam o equilíbrio do indicador AB.


74

De fato, o Ppi e o indicador AB são individualmente materiais sensíveis ao pH,

possuindo pKa bem específicos, sendo alcalino para o Ppi e ácido para o AB. Para o

material apresentado neste trabalho (Ppi-AB), o pKa foi observado em cerca de 7,7.

Este efeito sinérgico aumenta a faixa de trabalho do sensor onde o material é

sensível, comparando-se com a faixa sensível à mudanças de pH dos materiais

individualmente, possibilitando a sua aplicação no monitoramento de variações do

pH de amostras biológicas e ambientais.

Buscando a aplicação do material obtido neste trabalho como sensor de pH

para amostras reais, coletou-se o espectro de absorção para o Ppi-AB imerso em

soro fisiológico. Esta amostra é comumente usada para infusão intravenosa,

enxague de lentes de contato, entre outras aplicações. De acordo com a Figura 33a,

o pH da amostra de soro fisiológico analisada possui pH próximo a 7,5 (linha

vermelha pontilhada). Ao graficar os valores de absorbância obtidos para a amostra

na curva de calibração (Figura 33b), obtêm-se um valor de pH em torno de 7,4. Este

resultado é consistente com medidas experimentais usando pHmetro (igual a 7,43).

IV.4.2. Histerese

Na Figura 34 estão os valores de absorbância medidos para Ppi-AB após a

imersão em solução tampão fosfato de pH 1,5 a 11,0 e de pH 11,0 a 1,5 (o filme

Ppi-AB ficou imerso durante 3 min em cada solução tampão para que ocorresse o

condicionamento inicial do filme). Este experimento foi realizado em ciclo com a

finalidade de analisar a histerese do material. A histerese é um fenômeno observado

em alguns materiais, no qual certas propriedades, em determinado estado,

dependem de estados anteriores. O estudo desta propriedade é importante para a

caracterização de um sensor devido à confiabilidade das medidas, já que a resposta

depende da amostra analisada anteriormente, para materiais que apresentem

histerese.

De acordo com a Figura 34, os filmes de Ppi-AB apresentam uma pequena

histerese no comportamento óptico. A histerese observada na resposta óptica pode

ser relacionada à desprotonação das cadeias de Ppi, a qual rapidamente ocorre

após a imersão em meio alcalino. De fato, quando a medida foi realizada novamente

com o mesmo filme em um segundo ciclo, observou-se uma histerese similar,


75

entretanto a absorbância registrada foi menor quando comparada com o primeiro

ciclo.

Figura 34: Curva de histerese para Ppi-AB imerso em solução tampão fosfato de

pH 1,5 a 11,0 e pH 11,0 a 1,5.

Essa observação sugere que a desprotonação da cadeia polimérica, que

possivelmente causa a histerese do comportamento óptico do Ppi-AB, também leva

à perda de reprodutibilidade. Em meio muito alcalino, as ligações N-H são rompidas,

levando à desprotonação do Ppi.138,139 A desprotonação da cadeia polimérica diminui

o comprimento de conjugação , já que os íons OH- podem se ligar covalentemente

à cadeia polimérica,198 levando à diminuição dos portadores de carga e

consequentemente diminuição da condutividade do filme. O fato de filmes de Ppi

apresentarem histerese após imersão em meio alcalino foi previamente estudado,

sendo que a resposta do filme após imersão apresentou maiores valores de

resistência ôhmica.199

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Absorb

ância

/ u

ni. a

rb.

439nm

pH

594nm


76

IV.4.3. Tempo de resposta

O tempo de resposta é definido como o tempo necessário para que ocorra a

mudança de um sinal.200 Um tempo de resposta de 100% é definido como o tempo

necessário para atingir uma mudança total do sinal. No entanto, como na maioria

das vezes o tempo de resposta apresenta um perfil exponencial, a determinação

exata de 100% da variação do sinal é difícil. Consequentemente, usualmente o

tempo de resposta é analisado em termos de somente 63% a 90% da mudança do

sinal.201 O tempo de resposta depende da temperatura, da quantidade de indicador

imobilizado, da espessura do sensor, do material usado e do procedimento de

fabricação. Para optodos em geral, têm sido relatados tempos de resposta flutuando

desde poucos segundos,202 até vários minutos.203

O tempo de resposta para o filme Ppi-AB foi analisado através de medidas de

absorbância do filme de Ppi-AB ao ser variado o pH do meio. Para isso, utilizou-se

uma cubeta conectada a duas seringas. Uma das seringas foi utilizada para sugar a

solução, enquanto que a outra foi usada para injetar a solução tampão dentro da

cubeta. A Figura 35 mostra o tempo de resposta para o filme Ppi-AB, onde as

absorbâncias em 594 nm foram normalizadas (variação de absorbância de

1 unidade). O filme apresenta tempo de resposta mais curto quando próximo ao pKa

(ca. 1,0 s). De fato, a mudança de cor (Figura 33) pode ser facilmente visualizada,

ocorrendo com a mesma velocidade que a mudança de cor do corante em solução.

No entanto, o tempo de estabilização requerido para meio ácido é ca. 35 s, sendo

mais curto do que o observado para meio alcalino. Este longo tempo de

estabilização em meio alcalino pode ser devido ao processo de desprotonação que

ocorre neste meio.186 Um comportamento similar foi observado para filmes de

PANI.204

Uma das grandes vantagens do material estudado (Ppi-AB) em relação a

sensores convencionais49 está relacionado ao tempo de resposta. Para que ocorra a

mudança de coloração no Ppi-AB (Figura 33a) é necessário um tempo muito curto,

(< 1,0 s, sendo estimado visualmente†), pois o sensor mantém o tempo de resposta

do indicador, ou seja, semelhante ao seu tempo de conversão da forma ácida para a

† O tempo para que ocorra a mudança de coloração é muito curto, sendo difícil de ser registrado

experimentalmente, pois está abaixo do limite de detecção do equipamento. No entanto, pode-se

determinar experimentalmente o tempo para a estabilização da mudança de cor no material.


77

forma básica. Desta forma, o tempo de resposta do material é uma das propriedades

que o viabiliza para a aplicação comercial, já que é muito rápido, até mesmo quando

se compara com sensores de pH baseados em Ppi recentemente obtidos, cujo

tempo de resposta é na ordem de 2 a 6 min.157,205

Figura 35: Tempo de resposta do filme Ppi-AB em 594 nm para diferentes pH.

IV.4.4. Estabilidade Óptica

A estabilidade de um material é um requisito importante para a aplicação

como dispositivo. Com a finalidade de testar a estabilidade óptica dos filmes de

Ppi-AB, espectros de absorção dos filmes mantidos em solução tampão com

diferentes pHs (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0) foram coletados por um período de 16

dias (Figura 36). A absorbância foi monitorada em função do tempo em 439 nm para

meio ácido e 584 nm para meio alcalino, todos em função do tempo.

De acordo com a Figura 36, observa-se que o filme é bastante estável em

meio ácido, sendo que sua absorbância praticamente não muda durante os 16 dias

em que esteve imerso nas soluções tampão. Com relação aos demais (exceto

pH 11,0) verifica-se que o filme possui um comportamento inicial similar, ocorrendo


78

aumento da absorbância, a qual permanece constante até cerca de 2 dias e depois

diminui gradualmente.

Figura 36: Estabilidade óptica dos filmes Ppi-AB imersos em solução tampão fosfato

de diferentes pH. O desvio padrão foi calculado utilizando diferentes filmes de

Ppi-AB.

O aumento inicial da absorbância pode ser devido ao “condicionamento” do

filme, um fenômeno bastante conhecido e que está associado ao tempo necessário

para homogeneização da distribuição de carga e/ou transporte de massa no

material.206 Com relação à desestabilização do material caracterizada pela

diminuição gradual da absorbância, pode-se sugerir que esta desestabilização

ocorre devido ao efeito de desdopagem,193,207 onde as moléculas de dopante (AB)

0 50 100 150 200 250 300 3500,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0 b)

c)

Tempo / horas

607 nm 595 nm

pH 8,0 pH 11,0

a)

435 nm

pH 1,5

pH 3,0

Absorb

ância

/ u

ni. a

rb.

607 nm

pH 7,0

pH 7,5


79

são lentamente trocadas por íons hidróxido. Este processo foi evidenciado pela

mudança de coloração da solução tampão, observada principalmente para pH 11,0;

sendo espectroscopicamente medida durante os experimentos. Desta forma, os

diferentes comportamentos ópticos observados para Ppi-AB imerso em meio ácido,

neutro e alcalino podem ser relacionados principalmente ao processo de

desdopagem das cadeias de Ppi. Em meio neutro o processo de desprotonação é

muito sutil, entretanto, quando o filme permanece imerso neste meio por mais de

100 horas, o corante começa a sair da cadeia polimérica para a solução (lixiviação).

Em meios fortemente alcalinos, a desprotonação leva à diminuição do comprimento

de conjugação, o qual afeta as propriedades ópticas do filme antes mesmo de

ocorrer o condicionamento inicial.138,139

O material sintetizado neste trabalho (Ppi-AB) possui boa estabilidade,

principalmente em meio ácido, semelhante a sensores baseados em compósitos de

polipirrol N-substituído dopados com azul da prússia,208 os quais são estáveis em ar

e em soluções de HCl por 150 dias e por 14 dias quando estocados em soluções

etanólicas. Além disso, são materiais obtidos com facilidade, baixo custo e com boa

estabilidade ambiental, a qual é semelhante a materiais baseados neste polímero

condutor.207

IV.4.5. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica

Na Figura 37 estão os dados referentes à reprodutibilidade e reversibilidade

da resposta óptica medidas por espectrofotometria UV-Vis do Ppi-AB. As

absorbâncias em 584 nm foram sucessivamente registradas após 2 min de contato

com as soluções tampão em diferentes pH. A absorbância foi primeiramente medida

para o filme imerso em pH 1,5; o filme foi então enxaguado com água deionizada e

posteriormente imerso na próxima solução tampão, pH 3,0; pH 7,0; pH 7,5; e então

pH 8,0. Finalizando o ciclo, após a medida em pH 8,0, enxaguou-se o filme e

voltou-se a imergi-lo na solução tampão de pH 1,5 e nas demais soluções. Este

experimento realizado desta maneira permite a caracterização simultânea da

reversibilidade e da reprodutibilidade do sistema.208 Somente após 70 ciclos, o filme

de Ppi-AB foi testado em pH 11,0, já que sensores ópticos de pH apresentam

irreversibilidade, perdendo completamente a sensibilidade ao pH quando mantidos

em soluções com alto valor de pH.186 Como as medidas em pH 3,0 e 7,5 possuem o


80

mesmo comportamento que as medidas em pH 1,5 e 7,0, respectivamente, optou-se

em não mostrar estas curvas buscando um gráfico com a visualização mais fácil dos

resultados, Figura 37.

Após o condicionamento do filme, a resposta é reprodutível e reversível entre

o 20 o e o 70 o ciclo. Entretanto, após imergir o filme na solução tampão com pH 11,0

o sistema torna-se irreversível, tendo sua reprodutibilidade afetada. Este

comportamento era esperado uma vez que já foi mostrado que ocorre a expulsão do

corante da matriz polimérica em meios extremamente alcalinos (seção IV.4.2) devido

ao processo de desdopagem provocado pela presença dos íons hidróxido na

solução tampão. Além disso, a diminuição da absorbância sugere que esteja

ocorrendo uma redução irreversível com parcial degradação e perda da

eletroatividade,209,210 já que o Ppi pode ser dopado ou desdopado reversivelmente

somente na escala de pH de 2 a 10.211,212

Figura 37: Absorbância em 584 nm para Ppi-AB imerso em soluções tampão de

diferentes pH em função do número de medidas para determinação da

reprodutibilidade e reversibilidade do filme. Os desvios padrão foram calculados

utilizando diferentes filmes de Ppi-AB.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0,34

0,36

0,38

0,40

0,42

0,44

Absorb

ância

/ u

ni. a

rb.

pH 1,5

pH 7,0

pH 8,0

pH 11,0

Número de medidas


81

Resultados similares foram obtidos para um compósito de Ppi N-substituído

dopado com azul da prússia, sendo que este torna-se irreversível quando imerso em

pH maior que 9,0.208

IV.4.6. Efeito da Temperatura

Para os estudos do efeito da temperatura sobre a determinação óptica do pH,

foram realizadas medidas de absorbância do filme Ppi-AB em diferentes

temperaturas (15, 25 e 35 ºC). Na Figura 38a, estão os espectros correspondentes a

estas temperaturas para o filme imerso em pH 3,0. De acordo com o resultado

obtido, verifica-se que a temperatura praticamente não afeta a resposta do sensor

em meio ácido.

Na Figura 38b está mostrada a variação da absorbância em 584 nm do

Ppi-AB em diferentes temperaturas para os pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0. A interferência

causada pela temperatura não é tão significativa em meio ácido quanto em meio

neutro/alcalino.

Figura 38: (a) Espectro UV-Vis do filme Ppi-AB imerso em pH 3,0 em diferentes

temperaturas e (b) efeito da temperatura na resposta óptica do Ppi-AB em 584 nm

imerso em diferentes pH.

15 20 25 30 35

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

400 450 500 550 600

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

pH 8,0

pH 7,5

pH 7,0

pH 3,0

pH 1,5

b)

Temperatura / ºCComprimento de onda / nm

Ab

so

rbâ

ncia

/ u

ni.a

rb.

15 ºC

25 ºC

35 ºC

a)


82

A resposta do material em meio ácido praticamente não sofre alteração,

enquanto que a interferência torna-se significativa acima de pH 7,0. Acima deste pH,

o aumento da temperatura induz o aumento da absorbância da banda em 580 nm.

Este comportamento pode ser explicado baseando-se na dissociação do indicador

AB. Como a dissociação é endotérmica, ocorre aumento da concentração da forma

aniônica do indicador (AB2-). Com relação ao polímero, ocorre o aumento da

mobilidade intercadeia dos portadores de carga (hopping), favorecido pelo aumento

de temperatura, contribuindo assim para as transições interbandas.213,214

IV.4.7. Efeito de Interferentes

Para os estudos de interferência de íons na resposta óptica do sensor, foram

preparadas diferentes soluções contendo os íons bissulfito (HSO3-), cloreto (Cl-),

potássio (K+), nitrato (NO3-) e pirofosfato (P2O7

4-) com concentrações 0,01 e

0,15 mol.L-1 em diferentes pH. A análise da interferência foi realizada nos

comprimentos de onda de máxima absorção (584 nm) utilizando como base para a

comparação entre as medidas a Equação 5, onde C.I. é o coeficiente de

interferência, Ax é a absorbância do filme imerso na solução tampão contendo o íon

interferente e A0 é a absorbância coletada na ausência do interferente.

0

0 )(..

A

AAIC x

Equação 5

Na Tabela 2 estão mostrados os resultados obtidos para a análise de

interferência. Com relação a 0,01 mol.L-1, o comportamento do material na presença

dos interferentes foi semelhante, sendo que as interferências mais significativas

foram observadas na presença de íons nitrato e bissulfito. Este fato pode ser

explicado pelo comportamento redox dos íons nitrato e bissulfito, que alteram o nível

de oxidação do Ppi, levando a mudanças das propriedades ópticas do filme Ppi-AB.

Em 584 nm os íons cloreto e potássio praticamente não interferiram, o que

torna o material interessante já que esses íons são comumente encontrados em

amostras como leite, plasma sanguíneo e água do mar. Ao aumentar a concentração

do interferente 15 vezes, ocorre interferência praticamente para os mesmos íons.

Esta observação sugere que a força iônica praticamente não interfere na resposta do

sensor Ppi-AB.


83

Tabela 2: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medidas de absorção do

Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de

interferentes.

0,01 mol.L-1 0,15 mol.L-1

pH P2O74- Cl- K+ NO3

- HSO3- P2O7

4- Cl- K+ NO3- HSO3

-

1,5 0,01 0,03 0,03 0,03 0,25 0,01 0,05 0,05 0,09 0,30

3,0 0,06 0,03 0,03 0,00 0,25 0,06 0,05 0,06 0,08 0,25

7,0 0,05 0,05 0,00 0,14 0,20 0,04 0,06 0,04 0,27 0,24

7,5 0,04 0,00 0,04 0,32 0,16 0,06 0,06 0,04 0,32 0,25

8,0 0,03 0,03 0,03 0,30 0,23 0,01 0,07 0,07 0,30 0,31

Estes resultados podem ser comparados com a literatura, onde estudos de

interferência para o Ppi na presença de metais pesados resultaram em C.I. de 0,16 e

0,18.186 Em outro trabalho, a interferência do NaCl, LiCl e NaClO4 foi investigada

para sensores baseados em poli(o-metoxianilina), onde foram obtidos C.I. de 0,01;

0,13 e 0,31, respectivamente, para soluções contendo 0,15 mol.L-1 dos

interferentes.215


84

IV.5. Conclusões Parciais

O método para a preparação do Ppi-AB descrito neste trabalho é simples,

reprodutível e ainda possui um baixo custo. O filme obtido responde sensivelmente

ao pH na escala de 1,5 a 11,0 com mudança reversível da coloração em

comprimentos de onda fixos. Entretanto ocorre perda da reversibilidade quando o

material é exposto a pH 11,0, contudo esta desvantagem não desvaloriza a

aplicabilidade do material, já que é um material obtido com baixo custo. Uma das

vantagens deste material é a maior faixa de detecção obtida quando comparado com

outros sensores ópticos de pH,216 os quais usualmente são sensíveis a somente

3 unidades de pH. Outra vantagem do material proposto se baseia na resposta

desde meio ácido até meio alcalino, incluindo pH de amostras fisiológicas, enquanto

que outros optodos apresentam sensibilidade somente em meio ácido ou

alcalino.186,217

85

Capítulo V

Caracterização ôhmica

para aplicação em

sensor de pH

Capítulo V – Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH Parte I

86

V. Caracterização ôhmica para aplicação em sensor de pH

V.1. Introdução

Muitos processos e reações químicas são dependentes do pH, portanto, o

desenvolvimento de dispositivos que forneçam medidas rápidas e precisas do pH é

uma linha de pesquisa bastante explorada.218-220 Como mencionado anteriormente, o

procedimento padrão para medidas de pH é feito utilizando o eletrodo de vidro, o

qual apresenta muitas vantagens, como resposta Nernstiana de pH 2 a pH 12, alta

reprodutibilidade, alta seletividade a íons hidrogênio, longo tempo de vida e, além

disso, interferentes redox não alteram sua sensibilidade.221 Por outro lado, os

eletrodos de vidro apresentam desvantagens relacionadas à instabilidade em meios

fortemente ácidos ou alcalinos, alto preço e dificuldade para a miniaturização, sendo

inconveniente quando se trabalha com amostras fisiológicas, por exemplo.106 Desta

forma, existe uma clara necessidade na obtenção de métodos alternativos para

medidas de pH, principalmente na busca por um dispositivo capaz de trabalhar com

pequenas quantidades de amostra. Neste sentido, muitos sensores de pH têm sido

desenvolvidos, sendo alguns deles baseados em membranas, óxidos metálicos,

fibras ópticas, entre outros.103,104 No entanto, muitos destes dispositivos são

instáveis, precisando de constantes re-calibrações. Estudos recentes mostram que

os eletrodos modificados eletroquimicamente com polímeros condutores são bons

candidatos para a substituição dos populares eletrodos de vidro.222

Vários trabalhos têm mostrado a aplicação de polímeros condutores

eletroativos no desenvolvimento de células solares,223,224 dispositivos emissores de

luz,225,226 e dispositivos eletroquímicos e eletrocrômicos.227-230 Entre esta variedade

de aplicações, o uso desta classe de material em sensores de pH têm sido foco de

muitos trabalhos na última década,231,232 podendo ser utilizados na produção de

sensores condutimétricos devido à suas propriedades elétricas. A

eletropolimerização de compostos heteroaromáticos em superfícies de eletrodos é

um dos muitos modos efetivos para produção de eletrodos quimicamente

modificados com alta condutividade elétrica.233 Como exemplos de sensores

químicos de pH usando eletrodos cobertos com filmes poliméricos, além dos obtidos

por eletropolimerização do pirrol, têm-se os baseados em anilina, tiofeno, e


87

derivados de benzeno.42,199,204,234,235 Heineman e cols.236 foram os primeiros a usar

um eletrodo de platina recoberto com poli-(1,2-diaminobenzeno) eletropolimerizado

para aplicação em um sensor de pH. Oyama e cols.237 estudaram as respostas

potenciométricas de eletrodos de platinas recobertos com polifenol, polianilina,

poli(1,2-diaminobenzeno) e poli(4,4’-diaminodifeniléter) obtidos por polimerização

eletroquímica dos respectivos monômeros. Em outros eletrodos obtidos por

eletropolimerização também foi possível observar a sensibilidade ao pH.238,239

Também podem ser encontrados alguns estudos da resposta potenciométrica dos

eletrodos de polipirrol frente a soluções contendo diferentes ânions.240-242Como uma

propriedade inerente dos polímeros conjugados, no estado oxidado ele é um cátion

poliradical e atrai eletrostaticamente ânions para o interior da matriz polimérica. Além

disso, o Ppi apresenta distribuição de carga e de tamanho de poros, possuindo

portanto, certa funcionalidade para a identificação de ânions e estes requisitos

estéricos podem também controlar possíveis interferências de outros íons.156 Neste

sentido, sensores baseados em polímeros com propriedades extras para a

identificação de analitos, podem melhorar a seletividade do sensor quando

comparado com sensores de troca iônica.156

Muitos polímeros condutores possuem grupamentos ácidos e/ou básicos, os

quais podem ser protonados ou desprotonados. A PANI e o Ppi são alguns dos

polímeros que pertencem a esta família. A desprotonação destes polímeros

conjugados resulta na diminuição dos portadores de carga ao longo da cadeia

polimérica, a qual é acompanhada de mudanças nas propriedades redox do

polímero. A protonação aumenta a condutividade do Ppi, enquanto que a

desprotonação leva à diminuição da condutividade.139

O efeito do pH no polipirrol dopado com íons cloreto (Ppi-Cl) e ácido

polivinilssulfônico (Ppi-PVS) foi anteriormente descrito.199 Sensores potenciométricos

miniaturizados para pH baseados em filmes de polipirrol eletroquimicamente

sintetizados foram recentemente desenvolvidos por Lakard e cols.231 Esses eletrodos

de pH consistem em 2 microeletrodos interdigitados, fabricados por fotolitografia,

como mostrado na Figura 39.


88

Figura 39: Esquema mostrando eletrodos com microarranjos interdigitados.168

Outros exemplos de eletrodos cobertos com polímeros sensíveis ao pH, são

os baseados em pirrol (Pi), 3-(2,5-dihidroxibenzil) pirrol (PiQH), anilina (An) e

o-fenilenodiamina (oPD).75 Os polímeros são sintetizados utilizando como dopante

perclorato e albumina de soro bovino (BSA). As propriedades potenciométricas do

filme resultante apresentaram resposta aproximadamente Nernstiana. Obtiveram-se

as seguintes sensibilidades para estes sensores: -43,2 mV.pH-1 para o Ppi,

-46,0 mV.pH-1 para o PpiQH, -42,1 mV.pH-1 para a Pan e -50,7 mV.pH-1 para PoPD.

Todos se apresentaram sensíveis à faixa de pH entre 3 e 10 e foi obtido um tempo

de resposta médio de 3 a 5 min. Em um outro trabalho107 foi estudado o efeito do

dopante e do eletrólito na sensibilidade e tempo de resposta do Ppi através de

mudanças de pH da solução. Foi observado que a resposta do Ppi dopado com

ânions comuns (Cl-, NO3-, ClO4

-) é lenta. Em contraste, filmes de polipirrol

depositados na presença de ânions de ácidos fracos, como ftalatos, oxalatos e

salicilatos, foram caracterizados por resposta instantânea à mudança de pH (< 1 s).


89

V.2. Objetivo

Esta etapa do trabalho teve como objetivo a síntese de um material cuja

resistência elétrica seja afetada por mudanças do pH do meio. O material foi obtido

por polimerização do pirrol como matriz hospedeira e o indicador ácido-base azul de

bromofenol. A imobilização do corante foi realizada durante a polimerização

eletroquímica do pirrol. As propriedades ôhmicas do material obtido foram estudadas

buscando a aplicabilidade deste material como sensor ôhmico para pH.


90

V.3. Parte Experimental

V.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos

Materiais

Eletrodo de trabalho: Vidro coberto com filme de ouro digitalizado com área de ca.

10 mm2 e separados por um intervalo de 10 m (fornecido pela Escola Politécnica da

Universidade de São Paulo).

Eletrodo de referência: calomelano saturado (ECS).

Contra-eletrodo: placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).

Reagentes

Os mesmos descritos na seção IV.3.1 (Capítulo IV).

Equipamentos

Para a síntese dos filmes sobre o eletrodo de ouro digitalizado (Figura 40),

utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB, modelo PGSTAT-30. Para

termostatização da célula durante as sínteses foi utilizado um acessório de controle

de temperatura Tecnal modelo TE-184. Para calibração das soluções tampão foi

utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321. Durante as medidas de

resistência utilizou-se um eletrodo programável Keithley, modelo 617 interfaceado a

um computador.

V.3.2. Síntese dos filmes de polipirrol sobre eletrodos de ouro

digitalizado

As eletropolimerizações dos filmes foram realizadas de forma similar à

descrita anteriormente (seção III.3.3 – Capítulo III) sobre a superfície do eletrodo de

ouro digitalizado (dedos de ouro, Figura 40). O filme foi depositado com 15 ciclos de

VC, sendo equivalente à espessura necessária para fechar o contato elétrico entre

os dedos de ouro. Após a síntese, o sensor foi seco a 45oC por 2 h e mantido em

dessecador sob vácuo.


91

Figura 40: a) Eletrodo digitalizado de ouro e b) com o filme de Ppi-AB depositado

eletroquimicamente. Dimensão do substrato de vidro 2,5 cm2.


92

V.4. Resultados e Discussão

V.4.1. Sensibilidade Ôhmica ao pH

Os filmes Ppi-AB (Figura 40b) foram imersos durante 5 min em soluções

tampão de diferentes pH (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0). A resistência elétrica medida

durante estas imersões foi convertida para sensibilidade ôhmica (S%) utilizando a

Equação 6, onde Rx é a resistência obtida após a imersão do sensor na solução

tampão e R0 é a resistência antes da imersão.221

𝑆% = 𝑅0 −𝑅𝑥

𝑅0 × 100 Equação 6

Na Figura 41 estão os valores de sensibilidade ôhmica (S%) do filme Ppi-AB

em função do pH. Observa-se que a sensibilidade aumenta ao condicionar o filme de

meio ácido a meio neutro, e que de acordo com a Equação 6, é um resultado da

diminuição da resistência do filme. Este comportamento é esperado já que a

concentração das espécies com cargas negativas (corante AB) aumenta de pH 1,5 a

pH 7,5.146 Entretanto, a sensibilidade começa a diminuir após a imersão em pH 7,5

até pH 11,0.

As medidas espectrofotométricas mostradas no Capítulo IV para filmes de

Ppi-AB mostram um deslocamento do pKa para 7,7243 quando comparado com o

corante em solução (pKa 4,0).194 Desta forma, a inversão do comportamento da

sensibilidade mostrada na Figura 41 ocorre próxima ao pKa do sistema Ppi-AB.

Portanto, sugere-se que parte das mudanças na condutividade do filme polimérico

ocorra devido ao deslocamento do equilíbrio apresentado na Figura 10 juntamente

com a desprotonação da cadeia polimérica do Ppi.

No pH correspondente ao pKa, as concentrações das espécies alcalinas e

ácidas são as mesmas para um equilíbrio simples. De acordo com os resultados

apresentados no Capítulo IV, o pKa do Ppi-AB ocorre em 7,7, portanto em pH ácido

a concentração da forma neutra é maior do que a concentração da forma aniônica

(AB2-). Aumentando-se o pH do meio, o equilíbrio se desloca no sentido de aumentar

a concentração da forma carregada do corante, resultando em um maior nível de

dopagem do polímero, e consequentemente levando a um aumento na

condutividade do Ppi-AB. Baseando-se nesta explicação, esperaríamos um


93

comportamento linear para a sensibilidade versus pH (Figura 41). Entretanto, em

pH 7,5 é observada uma inversão do comportamento, onde a sensibilidade começa

então a diminuir. Este comportamento pode ser explicado levando em consideração

que ocorre uma ruptura das ligações N-H, em resultado do processo de

desprotonação em meio alcalino.138,139 Como discutido no Capítulo IV, a

desprotonação diminui o comprimento de conjugação , levando à diminuição da

mobilidade dos portadores de carga e consequentemente diminuição da

condutividade (aumento da resistência). De fato, durante as medidas em pH alcalino,

observou-se a saída do corante da matriz polimérica em direção ao eletrólito. Apesar

de ocorrer um aumento da concentração das formas aniônicas do indicador em

meios mais alcalinos, ocorrem também processos de desprotonação e desdopagem,

impedindo que o filme alcance maiores condutividades que a obtida em pH 7,5.

Figura 41: Sensibilidade ôhmica (resistência relativa) ao pH dos filmes Ppi-AB.

A inversão do comportamento da curva de sensibilidade dos filmes de Ppi-AB

em relação ao pH mostra uma desvantagem do sensor ôhmico quando comparado

ao sensor óptico (Capítulo IV), já que o Ppi-AB com resposta ôhmica apresenta

menor faixa de detecção, sendo de pH 1,5 a pH 7,5 ou 7,5 a 11,0 (desde que se

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

10

12

14

16

18

20

22 Aum

ento da resistência

Dimin

uição d

a resis

tência

S /

%

pH


94

conheça previamente se o meio é ácido ou básico). As faixas de detecção

encontradas nesse trabalho podem ser comparadas a dados da literatura,64,175 onde

foram estudados materiais baseados em Ppi dopado com Cl- e diferentes

indicadores, os quais apresentaram faixa de detecção entre pH 2 e 12.

V.4.2. Tempo de resposta

O tempo de resposta do filme Ppi-AB foi medido através das medidas de

resistência versus tempo em meio alcalino e ácido (Figura 42). Para essas medidas,

o Ppi-AB foi removido da solução tampão de pH 8,0 após 40 segundos e então

imerso em meio ácido (pH 3,0).

Figura 42: Dinâmica da resposta ôhmica do Ppi-AB entre meio alcalino (pH 8,0) e

meio ácido (pH 3,0).

O comportamento do Ppi-AB mostrado na Figura 42 corrobora os resultados

apresentados na Figura 41, onde o valor de resistência para o filme imerso em meio

ácido (pH 3,0) é maior quando comparado com o mesmo filme imerso na solução

com pH próximo ao pKa do sistema (pH 8,0).


95

Um resultado muito interessante obtido para este sistema é o curto tempo de

resposta quando comparado com dados da literatura. 244-246 As mudanças nos

valores de resistência foram observadas dentro de um intervalo de 10 segundos,

partindo de meio ácido para meio básico e vice-versa. Grant e Glass244 trabalharam

com o corante seminaftorodamina-1-carboxilado encapsulado por sol-gel, o qual

resultou em um sensor de pH com tempo de resposta de 15 s. Tempos de resposta

de 3 a 5 min foram obtidos para sensores de pH baseados em polímeros

sintetizados eletroquimicamente, como Ppi e polianilina.245 Porém, tempos de

resposta mais curtos, menores que 1 s, também foram obtidos para Ppi sintetizado

eletroquimicamente sobre eletrodos de platina.246

V.4.3. Estabilidade Ôhmica

A estabilidade de um material é um dos requisitos mais importantes para a

aplicação de um sensor. Neste trabalho a estabilidade foi analisada através de

medidas de resistência dos filmes Ppi-AB imersos em soluções tampão de diferentes

pHs (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0). A Figura 43 mostra a variação da resistência dos

filmes imersos em pH 3,0; 7,0 e 8,0 durante um período de ca. 225 horas.

De acordo com os resultados obtidos, o filme Ppi-AB pode ser considerado

estável em meio ácido e neutro, sendo pouco estável em meio alcalino,

principalmente em pH 11, o qual perde a estabilidade durante os primeiros minutos

da medida (por este motivo os resultado não estão mostrados). A perda de

estabilidade ocorre principalmente devido à perda de aderência do filme ao

substrato. Para pH 7,0 e 8,0, a resistência do filme diminui após um certo tempo de

condicionamento. Este comportamento foi previamente explicado (seção IV.4.1) em

termos da maior disponibilidade de ânions presentes neste meio, favorecendo o nível

de dopagem e portanto a diminuição da resistência.

As medidas em pH 1,5 e 7,5 apresentaram comportamentos similares às

medidas em pH 3,0 e 7,0, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos

para sensores ópticos de pH baseados em Ppi,186 o qual possui maior estabilidade

em meio ácido. É importante ressaltar que o sensor obtido (Ppi-AB) possui maior

área de trabalho (ca. 10 mm2) em relação à espessura, e de acordo com a literatura,

esta maior área pode ser favorável para a estabilidade.204


96

Figura 43: Estabilidade ôhmica do filme Ppi-AB imerso em tampão fosfato de pH 3,0,

7,0 e 8,0.

V.4.4. Reprodutibilidade e Reversibilidade Óptica

Durante este experimento, o mesmo filme foi imerso em soluções de pH 1,5;

3,0; 7,0; 7,5 e 8,0, sucessivamente. A leitura da resistência elétrica foi realizada após

5 minutos de imersão do filme nas respectivas soluções tampão. O filme foi então

enxaguado com água deionizada e imerso na próxima solução tampão fosfato (STF).

Como as medidas em pH 1,5 e 7,5 possuem o mesmo comportamento que as

medidas em pH 3,0 e 7,0, respectivamente, optou-se em não mostrar estas curvas

buscando um gráfico com a visualização mais fácil dos resultados, que estão

mostrados na Figura 44.

No início das medidas foi observada uma queda drástica da resistência,

sendo este comportamento associado com o tempo de condicionamento do filme,206

o qual é necessário para que ocorra a distribuição e homogeneização das cargas na

matriz polimérica. Após o tempo de condicionamento, o filme pode ser considerado

reversível e reprodutível entre a 25 o e a 59 o medida. Com a finalidade de avaliar se

o filme mantinha suas propriedades ôhmicas após ser seco, um intervalo de 24 h foi

0,0 0,8 1,6 2,4 75 150 225

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

pH 3,0

pH 7,0

pH 8,0

R

(R

tam

pã

o -

Ra

r) /

Tempo / h


97

usado entre a 59 o e a 60 o medida para secar o sensor Ppi-AB. Os resultados

indicaram um comportamento reprodutível, já que o sistema retorna à sua resistência

inicial, se recondiciona, e então se tornar estável, reprodutível e reversível

novamente. No entanto, a resistência do filme em meio ácido e neutro foi mais

reversível do que aquela para os filmes em pH 8,0. Este comportamento pode ser

resultado do processo de desprotonação, que de acordo com a Figura 41, já ocorre

neste meio.

Figura 44: Reversibilidade e reprodutibilidade do filme Ppi-AB imerso em solução

tampão fosfato com pH 3,0; 7,0 e 8,0.

Estes resultados podem ser comparados com os da literatura,231,247 onde

foram estudados filmes de polipirrol sintetizados com diferentes dopantes, os quais

se apresentaram reversíveis e reprodutíveis. Esta característica pode ser decorrente

da forte influência dos processos de oxidação/redução destes materiais, a qual

permite mudanças conformacionais reversíveis no polímero.

0 20 40 60 80 100 120

650

700

750

800

850

900

950

pH 3,0

pH 7,0

pH 8,0

Re

sis

tên

cia

/

Número de medidas


98

V.4.5. Efeito da Temperatura

A Figura 45 mostra a resistência relativa do filme Ppi-AB imerso em solução

tampão de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0 em função da temperatura (15, 25, e 35 °C). A

resistência diminui com o aumento da temperatura, sendo que as curvas

correspondentes em todos os pH apresentam aproximadamente a mesma

inclinação. A resistividade de um semicondutor convencional, como silício, diminui

exponencialmente com o aumento da temperatura (T). Este mesmo fenômeno

também pode ser observado para polímeros conjugados, visto que são considerados

também semicondutores (dependendo do grau de dopagem podem ser considerados

desde isolantes até metais). Especificamente para polímeros conjugados a

resistividade diminui com o aumento da temperatura, variando relativamente à

T-1/4.248

A diminuição da resistência com o aumento da temperatura pode ser

explicado pelo aumento na excitação térmica dos elétrons da banda de valência, que

são então transferidos para a banda de condução, tendo, portanto, maior mobilidade

e conseqüentemente favorecendo o aumento da condutividade (que neste caso pode

ser traduzido em diminuição de resistência elétrica).213-249 Poderíamos esperar um

comportamento diferente em pH alcalino, já que este meio afeta a cadeia polimérica

devido ao processo de desprotonação. Entretanto, a cadeia polimérica mesmo após

a desprotonação, permanece parcialmente dopada, possuindo bandas polarônicas e,

portanto, possibilita a migração dos elétrons das bandas ligantes para as bandas

antiligantes.


99

Figura 45: Efeito da temperatura sobre a resistência elétrica do filme Ppi-AB imerso

em soluções tampão fosfato de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0.

V.4.6. Efeito de Interferentes

Os efeitos de diferentes íons na resposta ôhmica do filme Ppi-AB foram

estudados adicionando-se 0,01 e 0,15 mol.L-1 dos íons pirofosfato (P2O74-), cloreto

(Cl-), potássio (K+), nitrato (NO3-), e bissulfito (HSO3

-) nas soluções tamponadas. Os

valores obtidos foram normalizados utilizando a Equação 7. Os coeficientes de

interferência (C.I.) foram calculados a partir da resistência do Ppi-AB imerso em

solução tampão contendo o interferente (Ri) comparado com a resistência do Ppi-AB

imerso em solução tampão sem interferente (Rx). Valores de C.I. próximos de zero

equivalem a interferência irrelevante.

x

xi

R

RRIC

)(.(%).

Equação 7

Os resultados obtidos estão mostrados na Tabela 3. De acordo com os

valores calculados, a resposta ôhmica do Ppi-AB foi afetada somente pela presença

dos íons nitrato e bissulfito a 0,15 mol.L-1, assim como observado para o efeito de

15 20 25 30 35

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

(R

tam

pã

o-R

ar)

/ R

ar

Temperatura / oC

pH 1,5

pH 3,0

pH 7,0

pH 7,5

pH 8,0


100

interferentes na resposta óptica do sensor. Estas mudanças podem ser relacionadas

às propriedades redutoras e oxidantes destes íons, respectivamente, já que eles

podem modificar o nível de oxidação do Ppi e, portanto a resistência do filme.

Entretanto, esta interferência foi relativamente pequena quando comparada com

valores da literatura.186

Os íons cloreto e potássio não afetaram a resposta do sensor de forma

significativa. Considerando que estes íons estão normalmente presentes no leite,

soro e água do mar, o filme Ppi-AB pode ser aplicado para analisar esse tipo de

amostra. Além disso, a variação da concentração dos íons interferentes não foi

significativa, sugerindo que a força iônica do meio não interfere na resposta ôhmica

do Ppi-AB.

Tabela 3: Coeficientes de interferência (C.I.) obtidos por medida de resistência para

o Ppi-AB imerso em soluções tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de

interferentes.

0,01 mol.L-1 0,15 mol.L-1

pH P2O74- Cl- K+ NO3

- HSO3- P2O7

4- Cl- K+ NO3- HSO3

-

1,5 0,00 0,04 0,06 0,05 0,07 0,00 0,03 0,10 0,15 0,17

3,0 0,01 0,00 0,01 0,06 0,08 0,00 0,00 0,01 0,08 0,15

7,0 0,00 0,04 0,00 0,03 0,08 0,00 0,02 0,01 0,12 0,10

7,5 0,00 0,00 0,07 0,01 0,13 0,01 0,08 0,09 0,08 0,18

8,0 0,00 0,02 0,05 0,02 0,10 0,00 0,04 0,11 0,15 0,17


101

V.5. Conclusões Parciais

O filme obtido através da dopagem eletroquímica do Ppi com AB responde a

mudanças de pH possuindo sensibilidade de 1,71 ± 0,20 M.pH-1. Além disso,

apresenta mudanças reversíveis da resistência na faixa de pH entre 1,5 e 7,5. O

Ppi-AB é um material promissor para aplicação como sensor de pH, já que possui

importantes características de um sensor eficiente, como tempo de resposta curto,

estabilidade, reversibilidade, reprodutibilidade e adicionalmente à estas

propriedades, ele pode ser usado como um sensor miniaturizado para pH, permitindo

análises em pequenos volumes de amostras.

Conclusões Gerais Parte I [Year]

102

VI. Conclusões Gerais

Obteve-se um material com potencial aplicação para sensor de pH

utilizando-se um método fácil, reprodutível, eficiente e de baixo custo. O material foi

obtido através da dopagem eletroquímica do polipirrol com um indicador ácido-base

(azul de bromofenol). Os filmes de Ppi-AB obtidos eletroquimicamente foram

caracterizados por diferentes técnicas, as quais mostraram que as propriedades do

Ppi são afetadas de forma significante na presença do AB. Medidas de Raman

ressonante in situ permitiram a análise do comportamento do corante no interior da

matriz polimérica de Ppi imerso em soluções tampão de diferentes pH (eletrólito),

aplicando-se diferentes potenciais. Tanto as propriedades ópticas, quanto ôhmicas

do Ppi-AB apresentaram-se como dependentes do pH do meio, desta forma,

estudou-se estas propriedades para a possível aplicação do filme como sensor de

pH. De acordo com as análises destas propriedades o sensor apresenta um bom

potencial de aplicação, já que ambos os comportamentos óptico e ôhmico

apresentam boa estabilidade, reversibilidade, reprodutibilidade e tempo de resposta.

No entanto, o sensor óptico apresenta uma vantagem sobre o ôhmico, apresentando

sensibilidade para uma maior faixa de pH, a qual inclui a faixa de pH de meios

fisiológicos. O sensor ôhmico de pH apresentou inversão do comportamento da

curva de sensibilidade ao pH, acarretando na diminuição da faixa de sensibilidade.

103

Parte II

Sensor biológico baseado

em filmes de ouro

nanoestruturado

Introdução Parte II [Year]

104

Parte II

I. Considerações Iniciais

I.1. Introdução

I.1.1. Câncer

A palavra câncer tem origem no latim, cujo significado é caranguejo. A doença

tem esse nome, pois as células doentes atacam e se infiltram em células sadias

como se utilizassem as garras de um caranguejo para isso.250 Esta doença tem um

período de evolução inconstante, podendo muitas vezes, levar anos para evoluir até

ser descoberta. Atualmente, foram identificados mais de cem tipos de câncer, sendo

que a maioria tem cura, desde que tratados em um estágio inicial de

desenvolvimento. Esse conjunto de mais de cem doenças tem em comum o

crescimento desordenado (maligno) de células que invadem tecidos e órgãos,

podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo. Estas células

tendem a ser muito agressivas e incontroláveis quando dividem-se rapidamente,

levando à formação de tumores (acúmulo de células cancerosas) ou neoplasias

malignas. Por outro lado, um tumor benigno significa simplesmente uma massa

localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu

tecido original, raramente constituindo um risco de vida.251

A Agência Internacional de Pesquisa do Câncer aponta para este ano a

descoberta de 12 milhões de novos casos, e mais de 7 milhões de mortes

decorrentes da doença, sendo que a previsão só no Brasil, corresponde a mais de

460 mil novos casos de câncer. A projeção para 2030 é de 20 a 26 milhões de

diagnósticos e de 13 a 17 milhões de óbitos.252 As causas que levam ao câncer são

variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo, estando ambas inter-

relacionadas. As causas externas estão relacionadas ao meio ambiente e aos

hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural. Dentre todos os

casos de câncer, cerca de 80% a 90% estão associados a fatores ambientais.253 As

causas internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas e estão

ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Esses

fatores causais podem interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de


105

transformações malignas nas células normais. Alguns deles são bem conhecidos: o

tabagismo pode causar câncer de pulmão, de boca e de garganta; a exposição

excessiva ao sol pode causar câncer de pele, e distúrbios hormonais podem levar à

geração de câncer de mama. O envelhecimento traz mudanças nas células que

aumentam sua suscetibilidade à transformação maligna. Além disso, as células das

pessoas idosas foram expostas por mais tempo aos diferentes fatores de risco para

o câncer,253 explicando em parte a razão de o câncer ser mais freqüente nesses

indivíduos. Outros fatores como alguns componentes dos alimentos que ingerimos,

ainda estão em fase de estudo, além de vários outros fatores que infelizmente ainda

são desconhecidos. São raros os casos de câncer que se devem exclusivamente a

fatores hereditários, apesar de o fator genético exercer um papel importante na

oncogênese.

Desde o início do século a postura da sociedade em geral é acreditar que o

câncer é sempre sinônimo de morte e, portanto o seu tratamento raramente leva à

cura. Atualmente, muitos tipos de câncer podem ser curados, na verdade mais da

metade dos casos de câncer tem cura, desde que tratados em estágios iniciais. Esta

dependência da chance de cura com o tratamento da doença na fase inicial

demonstra a importância do diagnóstico precoce. Um dos principais desafios no

diagnóstico precoce é que não há um marcador comum para os mais de 100 tipos de

câncer. Portanto, os médicos não podem simplesmente utilizar um sensor para

detectar a presença de uma forma específica de câncer. Devido a falta de sistemas

que proporcionem detecção eficiente e rápida, o diagnóstico e prognóstico de câncer

atualmente dependem de análises que patologistas têm usado por mais de

100 anos.254 Estima-se que apenas nos Estados Unidos, cerca de R$ 206 bilhões

são gastos anualmente em tratamentos, em geral, para melhorar a chance daqueles

que estão nas fases avançadas. No Brasil, esse número gira em torno de R$ 1,2

bilhão, de acordo com uma pesquisa realizada pelo Instituto Nacional de Câncer em

2007.252 Infelizmente, todo este investimento em muitos casos, aumentam apenas

marginalmente o tempo de sobrevida do paciente, ao custo de muito sofrimento. A

detecção precoce de câncer significa um avanço muito importante na luta contra a

doença, possibilitando a aplicação de tratamento no estágio inicial do seu

desenvolvimento, aumentando assim a taxa de sobrevivência dos pacientes.


106

I.1.1.1. Marcadores de Câncer

Marcadores de câncer são substâncias produzidas por células cancerígenas e

por outras células do corpo em resposta ao câncer ou a tumores benignos.‡ Estas

substâncias podem ser encontradas no sangue, na urina, no tecido do tumor ou em

outros tecidos.255

Atualmente já foram identificados mais de 100 tipos de substâncias que

podem ser encontradas em concentrações alteradas no organismo de pacientes

portadores de algum tipo câncer. Pesquisadores já encontraram marcadores para

todos os tipos de câncer, mas embora a medida de concentrações anormais destas

substâncias sugira a presença de câncer, somente esta medida não é suficiente para

o diagnóstico da doença. Desta forma, medidas das concentrações dos marcadores

são combinadas com outros testes, como a biópsia, para um diagnóstico indubitável

do câncer.256 Além disso, a medida da variação da concentração destes marcadores

pode ser utilizada para checar a evolução do paciente em resultado a um tratamento.

O desafio tecnológico que separa os cientistas dos testes de diagnóstico

precoce bem-sucedidos, não está mais relacionado com a procura de potenciais

marcadores genéticos da doença, mas da dificuldade de detecção destes no

organismo, pois existe um abismo entre as quantidades que precisam ser detectadas

e a sensibilidade das técnicas atuais.252

I.1.2. Sensores biológicos

O estudo e desenvolvimento de biosensores para detecção de compostos

químicos e biológicos tem atraído pesquisadores da área de química, física e de

materiais. Estes sensores têm se mostrado ferramentas muito importantes para a

análise de produtos químicos e biológicos que contaminam o meio ambiente,

agentes patogênicos presentes em alimentos, vírus, etc.257-260 Os biosensores

apresentam uma série de vantagens quando comparados aos métodos

convencionais de cromatografia e bioquímicos como cromatografia gasosa acoplada

a espectrometria de massa (CG-MS) e Análise-Enzima-Imuno-Adsorvida (ELISA,

enzyme-linked imunosorbent assay). Utilizando biosensores o tempo necessário

para as análises é menor, os dispositivos são encontrados em tamanhos

‡ Tumores benígnos podem crescer muito, mas são localizados, não se espalham para outras partes

do corpo.


107

miniaturizados, com instrumentação compacta; são fáceis de manusear, são

portáteis, facilitando análises de campo e ainda apresentam baixo custo. Uma

grande variedade de métodos ópticos tem sido investigada para uso em

biosensores, incluindo SPR (ressonância de plasmón de superfície),

quimioluminescência, interferometria e elipsometria.261-264 Levando-se em

consideração a grande quantidade de novos casos de câncer somada a limitada

disponibilidade de dinheiro do sistema de saúde, fica clara a necessidade de um

sistema de detecção precoce da doença. Um biosensor integrado é uma tecnologia

que tem grande potencial para resolver este problema. O sistema integrado pode ter

multiplicidade de resposta, possibilitando a detecção de várias formas de câncer pelo

mesmo sensor e pode ser pequeno e de baixo custo. Esta é uma grande vantagem

já que para proporcionar aos médicos um perfil de biomarcadores, é necessário

produzir um conjunto de biosensores. O sistema de microfluídos chamado

lab-on-chip tem sido adequadamente aplicado para este tipo de análise. Também

chamados de sistemas completos de microanálise, estes dispositivos apresentam

muitas vantagens sobre aqueles em macro escala em termos de velocidade de

análise, custo, eficiência e quantidade de reagente e amostras consumidas durante a

análise.265 Uma vantagem a mais destes sistemas que usam microcanais é a

possibilidade de serem integrados a biosensores baseados em ressonância de

plasmón de superfície, e que exploram este efeito através de um conjunto de

nanoburacos.266

I.1.3. Ressonância de plasmón de superfície (SPR)

O fenômeno da difração em grades devido à excitação de plasmóns de

superfície (SP) foi primeiramente descrito no início do século XX por Wood.267 No

final dos anos 60, a excitação óptica dos plasmóns de superfície foi demonstrada por

Kretschmann268 e Otto.269 Desde então, os SP têm sido extensivamente

estudados.270,271

O SPR é a oscilação de densidade de carga que pode existir na interface

entre dois meios com constantes dielétricas de sinais opostos, por exemplo, um

metal e um dielétrico. A densidade de carga é associada a uma onda

eletromagnética, cujo vetor de onda é máximo na interface e decai

exponencialmente com a distância (campo evanescente). Desta forma, o SPR pode


108

ser afetado e afetar as regiões próximas à interface. De acordo com Hanken e

cols.272 o vetor de onda do campo evanescente é dado pela Equação 8.

𝜅𝑝𝑎𝑟𝑎 = 𝑛𝑝 𝜔

𝑐 𝑠𝑒𝑛𝜃 Equação 8

Onde kpara é o vetor de onda do fóton paralelo ao plano de incidência, np é o

índice de refração do prisma, θ é o ângulo de incidência do prisma, ω é a frequência

da luz incidente, c é a velocidade da luz no vácuo. A constante de propagação do SP

na interface dielétrico|metal é dada pela Equação 9, onde ksp é o vetor de onda do

fóton que entra em ressonância com os elétrons livres na superfície

(induz plasmóns), e εm e εa são as constantes dielétricas do metal e do meio

dielétrico (ar ou água), respectivamente.

𝜔 = 𝑐𝜅𝑠𝑝 1

𝜀𝑚 +

1

𝜀𝑎 Equação 9

É importante ressaltar a necessidade dos dois meios da interface terem

constantes dielétricas (ε) de sinais opostos (como o ouro de sinal negativo e a água

de sinal positivo) para que ocorra a ressonância plasmônica. Quando kpara se iguala

a ksp, o campo elétrico entra em ressonância com os elétrons livres da superfície

metálica (por isso o nome ressonância plasmônica) e plasmóns de superfície são

criados, aumentando a intensidade do campo evanescente.

Geralmente, utiliza-se ouro como metal devido a sua grande resistência à

oxidação e boa condutividade elétrica. A incidência de uma fonte luminosa com um

certo ângulo de incidência faz com que os elétrons livres do metal oscilem,

absorvendo energia luminosa, gerando ondas evanescentes que se propagam

paralelamente à interface metal|dielétrico (Figura 46). Nesta situação tem-se a

ressonância de plasmón de superfície, detectada pela diminuição na intensidade da

luz refletida (portanto, com máximo de condição ressonante). O ângulo de incidência

no qual ocorre este fenômeno é denominado ângulo de SPR (θSPR) e é utilizado para

quantificar a variação no índice de refração causado pela presença de diferentes

moléculas na superfície metálica.

Como mencionado anteriormente, a intensidade da onda evanescente decai

exponencialmente com a distância da superfície do ouro (Figura 46), sendo que a

extensão do decaimento varia conforme a espécie que está sendo analisada,


109

correspondendo a cerca de 25 a 50% do comprimento de onda da luz utilizada,273

que em equipamentos comerciais varia de 600 a 850 nm.

Figura 46: Decaimento exponencial da onda evanescente relacionada com a

distância da superfície metálica.

O decaimento é obtido em nanômetros pela Equação 10,274 onde é o

comprimento de onda utilizado pelo equipamento, neff é o valor do índice de refração

monitorado pelo equipamento de SPR e ε é a constante dielétrica do ouro

(-23,124)275 ou de outro metal utilizado. O valor do decaimento pode também ser

estimado em 0,4 ± 0,1 (ou aproximadamente 25 a 50%) do comprimento de onda.274

𝐼𝑑 = 𝜆

2𝜋 /

−𝑛𝑒𝑓𝑓4

𝑛𝑒𝑓𝑓2 +𝜀𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙

12

Equação 10

O ângulo em que ocorre o máximo de ressonância depende do índice de

refração do meio que está em contato com o metal, e varia proporcionalmente com a

concentração de moléculas na região de propagação da onda evanescente. É,

portanto, uma ferramenta de extrema utilidade para detectar a associação e

dissociação de biomoléculas em tempo real. Contudo, a técnica de SPR

convencional apresenta uma grande desvantagem: trabalhar com o modo de

aquisição por reflexão experimentalmente é muito difícil, principalmente devido à

dificuldade de se alinhar o sistema óptico para encontrar o ângulo apropriado de


110

incidência de luz. Apesar da grande sensibilidade dos sensores baseados em SPR,

a dificuldade experimental da análise é um grande inconveniente que tem que ser

levada em consideração.

I.1.3.1. SPR através de filme de ouro com nanoburacos

O aumento no interesse em SP é também devido aos avanços em métodos

de nanofabricação, que têm permitido estruturar e caracterizar metais em escala

nanométrica, resultando em materiais com propriedades químicas e físicas

incomuns. Estes materiais podem controlar as propriedades do SP, possibilitando

sua aplicação em óptica, microscopia, células solares, assim como em sensores

para marcadores biológicos.276

No século XX começou o interesse pela tecnologia envolvendo buracos de

sub-comprimento de onda§ (subwavelength). Com o aumento da importância da

tecnologia de microondas nos anos 40, Bethe277 fez um estudo teórico das

propriedades de difração de um buraco que ele idealizou como tendo diâmetro de

sub-comprimento de onda, em um filme metálico perfeitamente condutor com

espessura próxima de zero. Através destas observações ele concluiu que a

transmissão de luz através deste buraco seria mínima. Com estas considerações,

ele chegou a uma equação simples para expressar a eficiência de transmissão ηB

(normalizada para a área de abertura), Equação 11, onde k = 2π/ é o comprimento

do vetor de onda da luz incidente de comprimento de onda e r é o raio do buraco.

𝜂𝐵 =64 𝑘𝑟 4

27𝜋2 Equação 11

De acordo com esta equação, seria esperado que a transmissão óptica caísse

rapidamente conforme se torna maior que r, como mostrado na Figura 47.

§ Buracos com diâmetro nanométrico, sendo menores que o comprimento de onda da luz incidente


111

Figura 47: Difração e espectro de transmissão típico de luz visível através de um

buraco com sub-comprimento de onda em um filme metálico perfeito infinitamente

fino.278

No entanto, a luz transmitida pode ter um comportamento completamente

inesperado.279 Através de alguns experimentos, Ebbesen278 mostrou que uma

abertura circular simples, como a mostrada na Figura 48 apresenta um espectro de

transmissão com uma banda que não era prevista pela teoria de Bethe.277

Figura 48: Transmissão óptica através de um único buraco em um filme metálico de

prata. a) Buraco circular de 270 nm de diâmetro em um filme com 200 nm de

espessura e b) seu espectro de transmissão.278

O comportamento apresentado na Figura 48 revela a presença de um

fenômeno ressonante, o qual melhora a transmissão de luz através do nanoburaco,

ou seja, a geração de plasmóns de superfície ligada às propriedades físicas do

nanoburaco aumentam muito a quantidade de luz transmitida. Esta transmissão

pode ser definida como extraordinária (EOT – Extraordinary Optical Transmission)


Inte

nsid

ade

/ un

i. ar

b.In

ten

sid

ad

etr

an

smiti

da

/ un

i. a

rb.



112

quando a eficiência de transmissão é maior que 1, em outras palavras, quando o

fluxo de fótons por unidade de área transmitidos é maior do que o fluxo incidente.

A teoria de Bethe é muito idealizada para tratar de situações onde são

envolvidos modos de superfícies e onde modos evanescentes e de propagação

podem ser excitados dentro da abertura.280 Uma abertura real é caracterizada por

uma profundidade e, portanto possui propriedades de um guia de ondas. A

transmissão de luz através deste guia de ondas é bem diferente da propagação da

luz em um espaço vazio.

O espaço confinado modifica a dispersão do campo eletromagnético. As

dimensões laterais do guia de ondas definem o comprimento de onda no qual a luz

não se propaga através do buraco, conhecido como comprimento de onda de corte

c. Quando o comprimento de onda da luz incidente for maior que o comprimento de

onda de corte ( > c), a transmissão é exponencialmente pequena, caracterizando o

regime de não propagação como mostrado na Figura 49. Com metais reais, o

comprimento de onda de corte não pode ser exatamente definido, pois com o

aumento do comprimento de onda ocorre a contínua conversão do regime de

propagação para o regime evanescente.

Figura 49: Guia de ondas cilíndrico com raio r muito menor que o comprimento de

onda do campo eletromagnético incidente, perfurado em um filme metálico de

espessura h. A diminuição exponencial representa a atenuação do regime de

sub-comprimento de onda.278

O espectro de transmissão de luz através de um único buraco é definido

somente pelo diâmetro do buraco e pela espessura do filme metálico. Contudo ao

preparar-se um filme metálico com um arranjo de buracos periodicamente ordenados


113

pode-se controlar o espectro de luz transmitida, controlando-se a periodicidade dos

buracos (distância centro-centro).

Figura 50: Imagens (esquerda) e espectros (direita) de transmissão com incidência

normal de luz branca através de arranjos quadrados contendo buracos com

sub-comprimento de onda. Para os arranjos azul, verde e vermelho, foram utilizadas

periodicidades de 300, 450 e 550 nm, respectivamente, os diâmetros dos buracos

são 155, 180 e 225 nm e o comprimento de onda para máxima transmissão ocorre

em 436, 538 e 627 nm. Os arranjos foram fabricados em um filme de prata de

300 nm de espessura.276

Entre outras aplicações, estes arranjos podem atuar como filtros de luz, como

mostra a Figura 50, onde os arranjos de nanoburacos estão sendo irradiados por

trás com uma fonte de luz branca. O espectro é dominado pelos modos de SP

devido à periodicidade dos arranjos como mostrado na Figura 50. O formato e

dimensões dos buracos no arranjo também influenciam o espectro de

transmissão.281,282

Os arranjos de nanoburacos foram caracterizados tanto teoricamente283-293

quanto experimentalmente.292-299 O conjunto de nanoburacos age como uma grade

de difração bidimensional que converte os fótons incidentes em plasmóns de

superfície. Embora os mecanismos de como a luz é transmitida através dos

nanoburacos ainda não sejam completamente conhecidos, geralmente aceita-se a

idéia de que os fótons incidentes acoplam com os elétrons da superfície metálica.309

Esta interação resulta em plásmons de superfície, que acoplam através do filme

metálico, sendo re-irradiados do lado oposto ao incidente. Em outras palavras, a luz

incidente é espalhada pelos conjuntos de nanoburacos produzindo ondas

I/I 0

(un

i. a

rb.)

770670570470370

Comprimento de onda (nm)


114

evanescentes que tunelam através dos nanoburacos. O plasmón de superfície

intensifica o campo eletromagnético associado com as ondas evanescentes,

resultando num aumento da transmissão.276

A posição max das bandas de transmissão (Figura 50) para um ângulo normal

de incidência pode ser estimada pela Equação 12, onde P é a periodicidade do

arranjo, εm e εd são, respectivamente, as constantes dielétricas do metal e do

material dielétrico em contato com o metal e i,j são os coeficientes de difração do

arranjo geométrico.

𝜆𝑚𝑎𝑥 =𝑃

43 𝑖2+𝑖𝑗 +𝑗 2

𝜀𝑚 𝜀𝑑

𝜀𝑚 +𝜀𝑑 Equação 12

Como esta equação não leva em consideração a presença dos buracos e as

perdas associadas com a difração, ela negligencia a interferência que origina o

deslocamento do pico de ressonância.290,291

As condições de ressonância definidas pela Equação 12 são relacionadas à

simetria do arranjo. Portanto, os SPs gerados nos arranjos se propagarão nos eixos

de simetria definidos com sua própria polarização dependendo de (i,j). Isto resulta

em um comportamento fortemente dependente da polarização.300

Ambas as superfícies dos dois lados dos buracos podem sustentar os modos

de SP de forma independente devido à diferença na εa do material próximo à

superfície metálica (normalmente vidro e ar), como previsto pela Equação 12. Assim,

o espectro de transmissão das estruturas assimétricas contém dois picos de

ressonância, onde cada pico pertence a uma interface. Quando as constantes

dielétricas entram em ressonância (valores próximos), obtém-se um pico de

transmissão mais intenso. Em muitas aplicações, arranjos de buracos de tamanho

finito são usados por razões práticas. Se o arranjo possui pequena quantidade de

buracos, então a periodicidade não é bem definida e a contribuição das

extremidades se torna significante, mudando o espectro e levando a re-emissões

não usuais.301

Como o efeito da transmissão ressonante ocorre através da excitação e

propagação de SP próximo à interface metal|dielétrico, este efeito é sensível a

mudanças de índice de refração próximo à interface, da mesma forma que ocorre em

sensores SPR convencionais baseados em um prisma.302,303


115

A sensibilidade (S) da superfície em detectar diferentes índices de refração é

definida pela variação do comprimento de onda () em função da variação do

índice de refração. Durante a adsorção de moléculas sobre a superfície do sensor

ocorrem mudanças no índice de refração, o qual passa a ser chamado neff e

admite-se como valor de nb o índice de refração atingido após a injeção de uma

solução tampão (eg. STF), correspondente ao branco da medida.

∆𝜆 = 𝑆 𝑛𝑒𝑓𝑓 − 𝑛𝑏 Equação 13

Considerando o decaimento exponencial característico do campo

eletromagnético evanescente, a intensidade da luz decai em função da distância z

acima da superfície do metal como o quadrado de uma exponencial, tal qual a

equação [exp(-z/Id)]2, o que implica no fator de ponderação a ser utilizado no cálculo

do índice de refração neff ser igual a exp(-2z/Id) (Equação 14), na qual n(z) é o índice

de refração a uma distância z.

𝑛𝑒𝑓𝑓 = 2

𝐼𝑑 𝑛 𝑧 𝑒𝑥𝑝

−2𝑧

𝐼𝑑 𝑑𝑧

∞

0 Equação 14

O uso desta equação não está restrito a estruturas de bicamadas,274 podendo

ser empregado em sistemas de multicamadas. As multicamadas podem ser

consideradas como tendo n(z) = na para valores de z compreendidos entre 0 e d

(espessura dos filmes), e n(z) = nb para os valores de z compreendidos entre d e o

infinito, pode-se então simplificar a integral da Equação 14. Obtém-se desta forma a

Equação 15, que substituída na Equação 13, fornece a Equação 16.

𝑛𝑒𝑓𝑓 = 𝑛𝑏 + 𝑛𝑎 − 𝑛𝑏 1 − 𝑒𝑥𝑝 −2𝑑

𝐼𝑑 Equação 15

𝜆 = 𝑆 𝑛𝑎 − 𝑛𝑏 1 − 𝑒𝑥𝑝 −2𝑑

𝐼𝑑 Equação 16

O deslocamento espectral devido às ligações das moléculas sobre a

superfície sensorial é então dado por = S(η) onde S é a sensibilidade espectral

e depende dos parâmetros geométricos das matrizes de nanoburacos e das funções

dielétricas do meio. No caso de imagens SPR para detecção múltipla, pode ser mais


116

útil a medida em tempo real da variação da intensidade transmitida IT em um

comprimento de onda fixo, o qual é dado por:

∆𝐼𝑇 = − d𝐼𝑇 dλ . S∆η Equação 17

A dimensão da EOT depende de muitos parâmetros, incluindo o índice de

refração do meio sobre a superfície do filme metálico, o comprimento de onda da luz

incidente, a geometria do buraco e a periodicidade. Em 2002, foi apresentado a

possibilidade em se explorar a EOT e os arranjos de nanoburacos como sensores

biológicos.304

I.1.3.2. Aplicação de sensores baseados em SPR

A EOT pode ser utilizada para monitorar a mudança do índice de refração

próximo à superfície, resultante, por exemplo, da modificação desta superfície com

uma monocamada, pois é dependente do índice de refração do meio em contato

com a superfície do filme metálico. Este conceito induziu muitas pesquisas no estudo

de reações químicas ou interações físicas com filmes metálicos, acerca da

intensidade305 ou a respeito do espectro306-308,309 da EOT através de arranjos de

nanoburacos. A utilização de plataformas com estes arranjos de nanoburacos tem

vantagens únicas, como:

i) área extremamente pequena, o que viabiliza a obtenção de um sensor para

detecção múltipla, facilitando a integração com microcanais e outros sistemas

miniaturizados para a detecção em tempo-real;

ii) em contraste ao modo de detecção por luz refletida, como nos sensores

convencionais que não utilizam moléculas marcadas, como prismas e grades

de difração, este material detecta EOT, ou seja, luz transmitida através dos

nanoburacos. Esta mudança simplifica a integração da instrumentação e a

miniaturização;

iii) a EOT através dos arranjos de nanoburacos é afetada por muitos parâmetros,

incluindo a forma e a periodicidade dos buracos. Estes parâmetros podem ser

usados para moldar o sinal do sensor de acordo com várias aplicações;

iv) os arranjos de nanoburacos podem ser produzidos em massa com alta

reprodutibilidade.


117

Dispositivos baseados em SPR foram desenvolvidos para ser empregados em

vários campos, incluindo diagnose médica, monitoramento ambiental e análise de

alimentos.309-311 Sensores baseados em SPR já estão disponíveis comercialmente,

sendo usados na pesquisa biomédica e bioquímica para o monitoramento de

ligações na superfície de substratos,312 análises biomédicas,313 detecção da

sequência genômica de DNA,314 e detecção de materiais e organismos que

contaminam o ambiente.315 Liu e cols.311 demonstraram que conjuntos de

nanoburacos podem ser integrados em um sistema simples para uso como

biosensor óptico. Brolo e cols.309 demonstraram o uso de matrizes de nanoburacos

periodicamente organizados em filmes de ouro, como um sensor SPR para a

adsorção de biomoléculas (operado no modo de transmissão). O mecanismo

explorado consistiu na mudança do índice de refração na interface ouro|solução, o

qual resulta em um deslocamento do espectro de transmissão para maiores

comprimentos de onda. Conjuntos de nanoburacos também mostraram-se

promissores para a aplicação em biosensores na detecção com fluorescência316 e

para SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy).309

I.1.3.3. Aplicação de sensores baseados em SPR para detecção de câncer

O diagnóstico de câncer é uma das áreas mais pesquisadas em química

bioanalítica. Uma grande variedade de métodos de detecção foram investigada.317 O

método mais comumente utilizado em biosensores emprega a detecção de

marcadores tumorais que se ligam a anticorpos imobilizados sobre a superfície do

sensor. A detecção da ligação é geralmente feita através de vários métodos,

podendo-se utilizar moléculas marcadas com fluoróforos ou bioconjugados de

nanopartículas. A estratégia mais comum é através do ELISA. Neste sistema, a

ligação anticorpo-antígeno (AC-AG) é indicada por um anticorpo, que acoplado a

uma enzima produz um sinal que é então detectado.254 Um grande desafio nesta

área é desenvolver um método que não precise de moléculas marcadas e que ao

mesmo tempo possibilite um alto grau de sensibilidade e baixo limite de detecção.

Os biosensores baseados em SPR são utilizados para monitorar interações

biomoleculares que ocorrem próximas à superfície do metal transdutor, sem a

necessidade de se marcar as biomoléculas. Através desta técnica, medidas em

tempo real podem ser realizadas para se estudar a ligação entre uma molécula

imobilizada sobre a superfície do metal com um analito específico presente em


118

solução (eg. anticorpo-antígeno). A resposta é obtida através de medidas da

mudança do índice de refração, que é alterado devido a ligação entre as espécies

imobilizadas e o analito.318-321 A literatura descreve vários estudos onde biosensores

baseados em SPR foram eficientemente aplicados na detecção de marcadores de

câncer de pâncreas, mama, colo-retal, pulmão e gastrointestinal.322-327

O desenvolvimento de um circuito integrado contendo biosensores baseados

em SPR com análise de diferentes analitos acoplado a um leitor contendo um

controle de fluxo e equipamentos ópticos, proporcionaria um sistema de detecção

eficiente e de fácil manuseio.266,328

I.1.3.4. Tecnologia de sensores baseados em SPR

Modificação química da superfície do metal

Em sensores baseados em SPR a superfície do sensor é geralmente ouro ou

prata.329 Nesta superfície, ocorrem interações biomoleculares e ligações são

convertidas em sinais óptico-elétricos. A seletividade de um teste imunológico

baseado em SPR é obtida através de reconhecimento biológico do sistema

imobilizado sobre a superfície do metal (detecção por interação chave-fechadura). A

superfície do sensor é modificada com moléculas onde os analitos se ligam,

proporcionando resultados reprodutíveis e consistentes. Para se obter superfícies

altamente sensíveis, é necessária a formação de uma camada de moléculas

receptoras que seja organizada, de maneira a proporcionar sítios de ligação, sem

restrições de impedimento estérico. Diversos métodos de imobilização adequados

para testes imunológicos baseados em SPR têm sido publicados. Os anticorpos são

imobilizados através de suas cadeias glicol oxidadas,330 ou através de suas ligações

dissulfito.331 Os grupamentos ésteres N-hidroxisuccinimida (NHS) são usados em

monocamadas de alcanotióis de cadeia longa para a imobilização de anticorpos e

proteínas. Assim, estes alcanotióis possuem em uma extremidade grupos reativos

adequados para a imobilização de biomoléculas e em outra extremidade grupos tióis

que se ligam à superfície do ouro.332,333 Processos de silanização utilizando

3-aminopropiltrietoxisilano (3-APTES) também têm sido usados para ligar anticorpos

à superfície de ouro através do ligante glutaraldeído.334 Contudo, para a ligação de

receptores mais específicos, o complexo biotina-estreptavidina tem sido amplamente

utilizado (Figura 51).335,336


119

Figura 51: Esquema de imobilização e detecção por bioafinidade das moléculas

biotina e estreptavidina.

Biomolécula de Interação

A escolha da espécie a ser imobilizada sobre a superfície do sensor depende

do método de detecção que será empregado. Quando se aplica o modo de detecção

direto, sanduíche e competitivo, a molécula a ser imobilizada é o elemento de

bio-reconhecimento; enquanto que no modo de detecção por inibição, a molécula a

ser imobilizada é o analito, ou seja, a espécie alvo. A escolha do elemento de

bio-reconhecimento e do método de imobilização apropriado é crucial para a

montagem de um sistema eficiente, afetando diretamente as características do

sensor como o limite de detecção, a sensibilidade e a especificidade.

Vários tipos de elementos de bio-reconhecimento são empregados em

biosensores baseados em SPR. Os anticorpos são sem dúvida os mais

freqüentemente utilizados, pois apresentam alta afinidade e especificidade em

relação a molécula alvo. Além disso, anticorpos que apresentam afinidade com

várias moléculas alvo estão disponíveis comercialmente. Contudo, o processo de

desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade é muito caro e trabalhoso.337

cisteaminabiotina

estreptavidina

anticorpo

antígeno


120

Recentemente, fragmentos de anticorpos têm sido usados como elementos de

bio-reconhecimento.338 Estudos mostram que estes fragmentos de anticorpos

biotinilados (ligados a moléculas de biotina) presentes em processo de fermentação,

podem ser detectados diretamente da solução sem a necessidade de purificação da

amostra. Para tal detecção é utilizado um sensor contendo estreptavidina imobilizada

sobre a superfície.339 Os peptídeos são outros tipos de elementos de

bio-reconhecimento que têm sido amplamente utilizados. Em comparação com os

anticorpos, os peptídeos são geralmente baratos, mais estáveis e mais fáceis de

manipular. Entretanto, nem sempre apresentam alta afinidade e especificidade em

relação a molécula alvo. Em biosensores baseados em SPR, os peptídeos são

principalmente aplicados para a detecção de anticorpos, por exemplo de

Hepatite G,340 herpes tipo 1 e tipo 2.341 Recentemente, aptâmeros**,342 têm sido

também aplicados em biosensores baseados em SPR.343,344

Imobilização de moléculas biológicas

A superfície do sensor, ou seja, a superfície do metal deve possibilitar a

imobilização de um número suficiente de elementos de bio-reconhecimento, evitando

ligações não específicas. Além disso, os elementos de bio-reconhecimento devem

ser imobilizados na superfície do sensor sem que esta imobilização afete a sua

atividade biológica. A princípio, as moléculas podem ser imobilizadas diretamente

sobre a superfície ou em uma matriz tridimensional. A imobilização direta sobre a

superfície é mais simples, contudo o número de elementos de bio-reconhecimento

que podem se ligar à superfície é limitado e ainda, se a densidade de elementos de

bio-reconhecimento é alta demais, a resposta do sistema pode ser prejudicada pelo

impedimento estérico. Por outro lado, um sistema tridimensional geralmente

proporciona um maior número de sítios de ligação para a imobilização das

moléculas.345 O sistema tridimensional mais comumente usado é obtido através de

dextran carboximetilado.332 Para a imobilização em duas dimensões sobre

superfícies de ouro, os métodos mais comuns envolvem o uso de camadas auto

montadas (SAMs) de alcanotiolatos ou dissulfitos.346

** Aptâmeros são moléculas de DNA ou RNA que agem como anticorpos, ligando-se com alta

afinidade a um particular alvo.


121

As proteínas representam a classe de moléculas mais comumente usada

como elementos de bio-reconhecimento. O método mais utilizado para imobilização

de proteínas é via ligação covalente formada entre grupos funcionais nucleofílicos

presentes nos aminoácidos das proteínas e grupos eletrofílicos presentes na

superfície do sensor.332,347 A imobilização através de ligação covalente é estável,

contudo a grande quantidade de grupos funcionais presentes nas proteínas resulta

em imobilização de orientação randômica, a qual pode bloquear os grupamentos

ativos da proteína.

Outro método utilizado para a imobilização de proteínas é baseado na

afinidade bioquímica das espécies. O exemplo mais comum deste método é a

reação estreptavidina-biotina (Figura 51). Através deste método de imobilização, a

proteína estreptavidina é imobilizada sobre a superfície do sensor (imobilizada

covalentemente ou via biotina pré-imobilizada) proporcionando sítios de ligação para

subseqüente ligação de proteínas conjugadas com a biotina. A proteína pode ser

biotinilada através de vários métodos objetivando a detecção de diferentes grupos

funcionais presentes nas proteínas. A orientação das proteínas imobilizadas

depende da orientação das moléculas de estreptavidina, do método de biotinilação

empregado e das propriedades da proteína.347

I.1.4. Estratégias para a melhora da sensibilidade

I.1.4.1. Fatores Geométricos

Vários fatores geométricos influenciam as propriedades ópticas dos

nanoburacos: simetria da estrutura, razão entre o diâmetro e a profundidade do

buraco, área, e periodicidade. Estas variáveis determinam a distribuição do campo

eletromagnético sobre a superfície do metal, as dinâmicas de propagação das ondas

sobre a superfície e a eficiência com que elas se espalham. O tamanho do

nanoburaco, a periodicidade e a organização do arranjo afetam a posição e a

intensidade do pico de ressonância. A profundidade dos buracos, ou seja, a

espessura do filme metálico, é importante devido a diversas razões: se o filme

metálico for muito fino ele é parcialmente transparente à luz incidente e, portanto, a

transmissão de luz não ocorre preferencialmente pelos nanoburacos, especialmente

se a superfície é rugosa e esta rugosidade propicie a ressonância da luz.348,349 O


122

metal deve ser opaco, (opticamente espesso), para se obter um grande contraste

entre a luz que passa através dos nanoburacos e a luz que passa através do metal.

Isto implica no fato de que a espessura do filme deve ser várias vezes maior que a

profundidade de penetração da luz no metal. Mesmo em filmes espessos, os modos

de energia em ambos os lados do filme metálico podem interagir, se desacoplar e

originar novos modos de energia. Este efeito pode ser observado através de estudos

onde conjuntos periodicamente ordenados de nanoburacos são obtidos em filmes

metálicos com várias espessuras. Observa-se que o aumento da espessura dos

filmes leva os modos de energia em ambos os lados do filme a se desacoplarem.286

I.1.4.2. Métodos de imobilização

A adsorção de proteínas sobre a superfície do sensor é um dos fatores mais

importantes no desenvolvimento de biosensores para aplicações biológicas e

biomédicas. Vários estudos mostram que os processos de adsorção não específica

de proteínas sobre a superfície é um problema chave e que deve ser corrigido para

melhorar a interação entre a molécula imobilizada e o analito presente na

solução.350,351 A formação de ligações não específicas é um inconveniente ainda

maior quando se analisa amostras de sangue e fluídos com partes de células

destruídas.352,353 Em biosensores é extremamente importante a obtenção de

superfícies com alta organização e que proporcionem um grande número de sítios

de ligação para imobilização de elementos de bio-reconhecimento. Durante a

imobilização é importante evitar processos de modificação da superfície que

possibilitem a adsorção não específica sobre o sensor (fouling), levando à

diminuição da quantidade de sítios de ligação e podendo ainda gerar um

falso-positivo.

Vários métodos têm sido aplicados no desenvolvimento de superfícies:

polímeros hidrofílicos como o poli(etileno glicol) (PEG) e seus derivados são

empregados no desenvolvimento de superfícies resistentes a proteínas, ou seja,

superfícies que não permitem que as moléculas de proteína se liguem com a

monocamada e que não “se deitem” sobre a superfície. Os fatores que influenciam

as propriedades de organização geradas por superfícies cobertas com PEG incluem

a barreira estérica e o alto grau de hidratação.354 Pasche e cols.355,356 utilizaram

poli(L-lisina) enxertada em PEG para minimizar adsorções não específicas de


123

proteínas sobre a superfície. Através deste sistema eles observaram a adsorção de

soro sanguíneo em concentração menor que 2 ng/cm2. A imobilização de elementos

de bio-reconhecimento nestas amostras foi possível através da ligação de biotina à

superfície. As superfícies biotiniladas se mostraram muito resistentes a adsorções

não específicas de moléculas presentes na amostra de soro, permitindo a ligação da

proteína correspondente ao seu sítio ativo (estreptavidina) e posteriormente a

ligação de moléculas biotiniladas.357-359

I.1.5. Microcanais para fluxo de soluções

A litografia soft, particularmente usando poli(dimetilsiloxano) (PDMS), é uma

técnica muito utilizada em fabricação de microcanais de fluxo na montagem de

sensores biológicos.360,361

O PDMS apresenta propriedades físico-químicas como durabilidade, baixa

reatividade e transparência óptica, que o tornam um material adequado para a

fabricação de microestruturas moldadas.362 Além disso, é possível fazer o selamento

reversível da peça de PDMS, contendo os microcanais, com o substrato. A natureza

elástica do PDMS permite que ele se ajuste a imperfeições da superfície planar

através de forças de van der Waals.363 O selamento reversível suporta fluxos com

baixa pressão, (até 5 psi)360 e permite o re-selamento sem danos ao PDMS ou à

superfície ao qual está selado.

Objetivos Parte II [Year]

124

I.2. Objetivos

O objetivo nesta parte do trabalho foi o desenvolvimento de um sensor

biológico para a detecção de marcadores biológicos de câncer de ovário, baseado

em filmes finos de ouro nanoestruturado com arranjos de nanoburacos. O dispositivo

explorou o fenômeno de Transmissão Óptica Extraordinária (EOT) resultante da

ressonância de plasmóns de superfície (SPR) e foi integrado a microcanais com

funcionamento automatizado. O método de detecção utilizado foi baseado em

medidas de transmissão utilizando uma câmera CCD e um espectrofotômetro

UV-Vis.

Neste estudo, o foco foi o desenvolvimento de dois tipos de sensores:

1) Os métodos de detecção para sensores baseados em SPR normalmente

utilizam espectros de transmissão para a análise. Neste trabalho, utilizou-se o

modo por detecção de imagens, o qual detecta a mudança na intensidade da

luz transmitida através dos nanoburacos em resultado da imobilização de

moléculas sobre a superfície do sensor. Este método viabiliza a aplicação do

sensor para a detecção múltipla (eg. de vários marcadores tumorais) durante

uma medida em tempo real.

2) Até o momento, a imobilização em todos os biosensores baseados em SPR

utilizando nanoburacos é feita sobre toda a superfície de ouro, já que os

plasmóns de superfície se propagam em toda a região do arranjo de

nanoburacos (dentro dos nanoburacos e ao redor deles, Figura 52). Neste

trabalho, objetivou-se o desenvolvimento de algo novo, para isto, cobriu-se o

filme de ouro com uma camada isolante (SiOx) e posteriormente os arranjos

de nanoburacos foram fabricados. Este procedimento foi realizado com o

objetivo de se obter uma plataforma sensível que confinasse tanto os

plasmóns de superfície quanto as moléculas biológicas dentro dos

nanoburacos.

Resultados e Discussão Parte II [Year]

125

I.3. Parte Experimental

I.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos

Materiais

Lâmina de vidro coberto com filme de ouro de 100 nm de espessura (uma camada

de 5 nm de cromo foi previamente depositado sobre o vidro para ajudar na aderência

do filme de ouro ao substrato), EMF (Evaporated Metal Films, Ithaca, Nova Iorque,

EUA).

Reagentes

Anticorpo para câncer de ovário PAX8 (Pared Box Gene 8) (Instituto de Câncer de

British Columbia, Canadá).

Antígeno para câncer de ovário r-PAX8 (recombinant Pared Box Gene 8) (Instituto

de Câncer de British Columbia, Canadá).

Albumina de Soro Bovino (BSA, Sigma-Aldrich).

Álcool isopropílico (99,5%, Sigma).

Acetona (p.a., Aldrich).

Biotina éster N-hidróxi succinimidil (BNHS, 95%, Fluka).

Cisteamina (98%, Sigma-Aldrich).

Cloreto de potássio (99%, ACP).

Cloreto de sódio (99%, ACP).

Ditiobis (succinimidil undecanoato) (DSU, 92,7%, Laboratórios Dojindo).

Dimetil sulfóxido (DMSO, 99,9%, Caledon).

Etanol anidro (99,5%, Sigma-Aldrich).

Estreptavidina de Streptomyces avidinii (Sigma-Aldrich).

Fosfato dibásico de sódio (99%, ACP).

Fotoresiste SU-8 50 e revelador (Microchem, Newton, MA).

Glicose (99,5%, Sigma-Aldrich).

3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS, 95%, Sigma-Aldrich).

Polidimetilsiloxano e agente de cura Sylgard 184 (PDMS, Dow Corning).

Poli (tereftalato de etileno) (PET, SK Chemicals).

Wafer de silício (Silicon Quest International, Santa Clara, CA).


126

Água nanopura (18,1 Mcm, Barnstead) foi utilizada para a preparação das

soluções.

Equipamentos

Fabricação e imagem dos nanoburacos: FIB (feixe de íons (gálio) focado), e

Microscopia eletrônica de varredura (MEV).

Fabricação dos microcanais: Spincoater SCG/G3P-8 (Specially coating systems,

Coakson Electronics Equipments), expositor à luz UV OAI Hybralign Series 200 e

controles de exposição (Tamarack Scientific Co), câmara de vácuo e limpador com

plasma PDC-32G (Harrick) e forno Isotemp modelo 280A, (Fisher Scientific).

Experimentos: Bomba de seringa (Havardi), microscópio Leica (Microsystems

(DMLM)), com lente objetiva de 50X de longa distância de trabalho, acoplado a uma

fibra óptica e espectrofotômetro UV-Vis (USB2000), câmera CCD (Photometrics

HQ2), refratômetro portátil (ATAGO, modelo 3850).

I.3.2. Fabricação dos nanoburacos

Vários arranjos de nanoburacos foram empregados em diferentes estágios

deste trabalho. As micrografias obtidas por MEV de alguns arranjos de nanoburacos

estão mostradas na Figura 52. Neste trabalho dois tipos de amostras foram

fabricados:

1) os arranjos de nanoburacos foram fabricados for FIB através de um filme

de ouro de 100 nm de espessura depositado sobre uma lâmina de vidro. Estas

amostras foram usadas para detecção de marcadores tumorais de câncer de ovário

através de imagens obtidas por uma câmera CCD. Os nanoburacos foram fabricados

com aproximadamente 200 nm de diâmetro. O tamanho dos arranjos foi de

aproximadamente 15 µm x 15 µm.

2) os arranjos de nanoburacos foram fabricados por FIB em um filme de SiOx

e de ouro (Figura 67). O filme de SiOx (50 nm de espessura) foi depositado sobre o

filme de ouro (100 nm de espessura) e este sobre uma lâmina de vidro.†† Esta

amostra foi usada para medidas onde tanto as moléculas quanto os plasmóns se

encontravam confinados dentro dos nanoburacos, já que a superfície de ouro é

exposta somente dentro dos nanoburacos. A fabricação e micrografias (MEV) dos

††

Os nanoburacos foram perfurados através de ambos filmes de SiOx e ouro.


127

arranjos de nanoburacos foram realizadas na Simon Fraser University, Vancouver,

Canadá. O feixe de íons gálio foi programado para 30 keV com uma taxa de

remoção de ouro de 1,6 nm/µs, e a corrente do feixe foi de 300 nA. Os nanoburacos

foram fabricados com aproximadamente 170 nm de diâmetro. O tamanho dos

arranjos foi de aproximadamente 8 µm x 8 µm, correspondendo a uma área de

detecção muito pequena, viabilizando o uso do substrato para a montagem de um

dispositivo miniaturizado.

Figura 52: Micrografias obtidas por MEV de a) arranjos de nanoburacos

periodicamente ordenados, fabricados por FIB em um filme de ouro de 100 nm de

espessura. b) Imagem ampliada mostrando o tamanho do arranjo de nanoburacos.

c) Imagem ampliada mostrando a dimensão dos nanoburacos. Esta amostra foi

utilizada durante as medidas por aquisições de imagens (seção I.4.1).

I.3.3. Fabricação dos microcanais

Os microcanais foram fabricados em uma peça de PDMS através da técnica

de litografia soft360,361 (Figura 53). O primeiro passo foi a obtenção de uma

fotomáscara da estrutura dos microcanais, sendo criada usando o AutoCAD 2006.

Posteriormente foi impressa em filmes de PET (poli (tereftalato de etileno)),

utilizando-se uma impressora com alta resolução (Islands Graphics, Victoria, BC). O

fotoresiste SU-8 50 foi depositado por spin coating sobre um wafer de silício sob

rotação de 500 rpm em 5 s, mantendo por 8 s. Em seguida, aumentou-se a

velocidade para 2000 rpm em 5 s, mantendo por 25 s. Este procedimento produz

filme com espessura uniforme de 50 µm. A espessura do fotoresiste determina a

altura dos microcanais resultantes.364 Os wafers de silício foram usados devido a sua

superfície extremamente plana, onde o fotoresiste adere facilmente. O wafer de

a) b) c)


128

silício coberto foi pré-aquecido a 65 ºC por 6 min, e então a 95 ºC por 25 min para

eliminar o solvente, deixando o fotoresiste mais denso. A fotomáscara foi

posicionada sobre o wafer de silício. Ambos foram então expostos a luz UV colimada

(320 a 380 nm), durante 45 s. A função da máscara é proteger determinadas partes

do substrato contra a luz UV. Este passo foi seguido por aquecimento da amostra,

sendo primeiramente em 65 ºC por 1 min e a 95 ºC por 5 min para promover a

polimerização do fotoresiste. O sistema foi então imerso no revelador de SU-8 até

todo fotoresiste, não exposto a luz UV, ser removido. Em seguida, o wafer de silício

foi imerso em álcool isopropílico para remover o excesso do revelador. Depois disto,

o wafer de silício contendo a microestrutura foi limpo rapidamente em acetona e

seco em seguida. Sendo assim, um molde foi criado.

Figura 53: Esquema e descrição do método de fabricação de microestruturas por

litografia soft.

Passo 1:Exposição do fotoresiste (SU-8) usandoluz UV que passa através de umatransparência com o desenho daestrutura desejada.

Passo 2:O fotoresiste não exposto é dissolvido,levando a um modelo positivo dodesenho em um substrato.

Passo 3:Sobre o modelo positivo é colocado opolímero PDMS e levado para cura emuma câmara de vácuo.

Passo 4:A remoção do molde leva a estruturanegativa, onde os canais estãopresentes no PDMS.


129

Os microcanais foram criados através da cura do PDMS sobre o molde.

Aproximadamente 30 g de PDMS e agente de cura foram misturados em uma razão

10:1 (m:m) respectivamente. A mistura foi então espalhada sobre o molde e o

sistema foi colocado na estufa a 900C por 30 minutos. A peça de PDMS, já no

estado sólido e flexível, foi removida do molde criando-se assim um sistema de micro

canais. Os 30 g de PDMS foram usados para criar uma peça com espessura de

aproximadamente 4 mm. Esta peça foi então alinhada aos arranjos de nanoburacos

para orientar o fluxo das soluções sobre estes.

I.3.4. Deposição de SiOx

Filmes finos de SiOx foram preparados sobre os filmes de ouro de 100 nm de

espessura, os quais foram previamente depositados sobre lâminas de vidro. A

lâmina de vidro coberta com filme de ouro, foi montada em uma célula de teflon® de

ca. 15 mL, com área exposta de 1 cm2. Uma camada de MPTMS

(3-mercaptopropiltrimetoxisilano) foi aplicada entre o ouro e o SiOx para servir de

adesivo. Foi adicionada solução 1 mmol.L-1 de MPTMS na célula, o qual

permaneceu por 24 h sem agitação. A adsorção inicial é rápida, levando apenas

alguns minutos. No entanto, o sistema foi deixado em repouso por 24 horas para se

obter um alto nível organizacional da monocamada. Após a montagem da

monocamada, uma solução contendo 0,54% de silicato de sódio, com pH em torno

de 9,5 foi adicionada à célula de teflon® e deixado em repouso por 120 h.365-367

Figura 54: (a e b) Imagens MEV de arranjos de nanoburacos perfurados através do

filme de SiOx (50 nm de espessura) e de ouro (100 nm de espessura). Os

nanoburacos foram fabricados com 170 nm de diâmetro e periodicidade de 500 nm.


130

Após a obtenção da camada de 50 nm de SiOx, os nanoburacos foram obtidos

por FIB seguindo o mesmo procedimento descrito na seção I.3.2, amostra 2 (Figura

54).

I.3.5. Teste de sensibilidade

A sensibilidade dos arranjos de nanoburacos foi estudada utilizando soluções

de glicose com índices de refração conhecidos, variando entre 1,320 e 1,358.

Durante estas medidas utilizou-se uma célula de fluxo simples, contendo uma

entrada e uma saída para a solução. Esta célula é construída em teflon®, possuindo

uma câmara de 2,54 cm x 2,54 cm, onde a amostra contendo nanoburacos, foi

colocada para que as soluções fluíssem sobre sua superfície.

I.3.6. Prova de conceito – detecção de proteína dentro do nanoburaco

A detecção da proteína dentro do buraco envolve um procedimento de

3 passos.306 Primeiramente, o substrato é imerso em uma solução aquosa contendo

6,2 mmol.L-1 de cisteamina por 72 horas. Esta molécula contém grupamentos tiol, os

quais se ligam fortemente ao ouro, além disso possui grupos amino que se ligam

covalentemente à grupos NHS. Desta forma, após a montagem da monocamada

dentro dos buracos, a amostra foi enxaguada com água nanopura e etanol para a

retirada das moléculas que não foram adsorvidas sobre a superfície de ouro. A

amostra foi então colocada em uma célula de fluxo e através de uma bomba

peristáltica, injetou-se STF (pH 7,5) sobre o arranjo de nanoburacos. O espectro

UV-Vis foi então registrado (ver esquema na Figura 55). Após esta etapa, uma

solução contendo 6 mg.mL-1 de biotina modificada com grupos NHS em DMSO foi

injetada sobre a amostra, mantendo o fluxo por 45 min. A amostra foi então

enxaguada com STF e o espectro UV-Vis foi em seguida registrado. Finalmente,

fluiu-se uma solução contendo 0,25 mg.mL-1 de estreptavidina (proteína) em STF

sobre a amostra por 15 min, o espectro UV-Vis foi registrado enquanto a amostra era

enxaguada com STF.

I.3.7. Medidas Ópticas e Sistema de Fluxo

Uma bomba de injeção com controle fino de fluxo foi utilizada para fluir as

soluções, a um fluxo constante de 20 μL.min-1, sobre a superfície do arranjo de

nanoburacos. As amostras foram caracterizadas utilizando luz branca de uma fonte


131

de halogênio, a qual foi direcionada perpendicularmente sobre o arranjo de

nanoburacos utilizando um microscópio com lente objetiva de longa distância de

trabalho . Coletou-se a luz transmitida através nos nanoburacos utilizando-se um

cabo de fibra óptica, que é conectado a um espectrofotômetro UV-Vis (Figura 55).

Figura 55: Arranjo experimental para as medidas de transmissão de luz através dos

arranjos de nanoburacos.

Obtenção de imagens de SPR

Para a obtenção das imagens de SPR montou-se um circuito integrado

contendo a amostra de ouro com nanoburacos selada com a peça de PDMS

contendo microcanais. Estes microcanais foram alinhados com os arranjos de

nanoburacos (Figura 61). Utilizou-se como fonte de excitação um laser de He-Ne

(emissão em 633 nm). O feixe de luz foi expandido e espalhado uniformemente

sobre o arranjo de nanoburacos através de lentes plano-convexas. A luz transmitida

foi coletada por um microscópio, sendo direcionada para uma câmera CCD. As

imagens foram então registradas em um computador (Figura 56), utilizando um

tempo de aquisição de 20 ms. As imagens obtidas foram analisadas,

Espectrofotômetro UV-Vis

Fibra óptica

Lente objetiva

Plataforma de translação

Luz branca


132

quantificando-se a intensidade da luz transmitida através dos nanoburacos através

do software Image J (desenvolvido por National Institutes of Health).

Figura 56: Esquema experimental para a aquisição de imagens por transmissão de

luz através dos arranjos de nanoburacos usando uma câmera CCD.

He-NeLaser

CCDMicroscópio

Resultados e Discussões Parte II [Year]

133

I.4. Resultados e Discussão

I.4.1. Detecção por imagens

Utilizou-se os arranjos de nanoburacos perfurados através do filme de ouro

para a detecção da presença de anticorpo e antígeno do câncer de ovário. Para isso,

imagens da superfície do dispositivo foram adquiridas através de uma câmera

CCD.368 O CCD, ou dispositivo de carga acoplado, é extremamente sensível à luz. A

exibição dos dados de uma determinada imagem é realizada pela transformação da

luz refletida em sinais elétricos, que são convertidos em bites, através de um

conversor analógico-digital. Este tipo de câmera permite a obtenção de imagens da

luz transmitida através dos nanoburacos.

A quantidade de luz transmitida é dependente do índice de refração próximo à

superfície do ouro. A presença das moléculas muda o índice de refração efetivo,

acarretando o deslocamento do máximo de transmissão para maiores comprimentos

de onda (Figura 57). Considerando um determinado comprimento de onda

(eg. 633 nm, fonte He-Ne), a variação do índice de refração leva à mudanças na

intensidade da luz transmitida através dos nanoburacos. Um fator interessante do

método de detecção por imagens, é a possibilidade de se obter a visualização de

uma extensa área da superfície do sensor contendo os vários arranjos de

nanoburacos. Estes arranjos podem ser modificados diferentemente, através da

funcionalização diferenciada em cada um dos conjuntos. A variação na transmissão

devido à interação molecular (ou biomolecular) em cada um dos conjuntos é então

registrada pela câmera CCD através de uma fotografia da superfície.

Neste trabalho utilizou-se uma amostra com arranjos de nanoburacos de

200 nm de diâmetro os quais foram fabricados através de um filme de ouro de

2,54 cm x 2,54 cm com 100 nm de espessura. Esta espessura é cerca de duas

vezes maior que a profundidade de penetração do SP no filme de ouro, o que

significa que os SP de um dos lados do filme tem mínima comunicação com os SP

do outro lado do filme.305 Cada arranjo possui uma área de 15 x 15 μm2 e a distância

entre os nanoburacos é de 420 nm (periodicidade). Esta periodicidade foi

previamente determinada para que a transmissão através dos nanoburacos

estivesse em ressonância com a fonte monocromática utilizada (laser He-Ne)

durante as medidas (Figura 57). Trabalhou-se com luz vermelha porque nesta região


134

não ocorre significante fluorescência de amostras biológicas. Além disto, este

comprimento de onda é compatível com muitos materiais, facilitando a construção do

dispositivo.

Figura 57: Espectros de transmissão para um arranjo de nanoburacos ilustrando a

diminuição da intensidade da luz transmitida no comprimento de onda equivalente a

633 nm.

Previamente às medidas de detecção por imagens, analisou-se a

sensibilidade da amostra frente a variações do índice de refração do meio. Durante

este experimento, utilizou-se soluções de glicose com diferentes concentrações.

Como resultado, obteve-se os valores de intensidade de luz transmitida mostrados

na Figura 58. A Figura 58b mostra a curva de calibração obtida através destas

medidas, a qual resultou em uma sensibilidade de 316 UIR-1, sendo semelhante à

obtida por espectroscopia UV-Vis.306

500 550 600 650 700 750 800 850

0,15

0,30

0,45

0,60

0,75

0,90

1,05

Diminuição da

Intensidade

em 633 nm

Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb


Aumentando o

índice de refração


135

Figura 58: a) Intensidade da luz transmitida através de arranjos de nanoburacos para

diferentes índices de refração. b) Curva de calibração obtida através do gráfico em

a) Fonte utilizada: He-Ne.

A Figura 59b mostra uma imagem por MEV dos arranjos de nanoburacos, os

quais se encontram organizados em 7 colunas e 4 linhas. Esta organização foi

estabelecida com o objetivo de possibilitar a realização de um experimento em

tempo real para a detecção de anticorpos e antígenos presentes em diferentes

concentrações na amostra.

Figura 59: Micrografias obtidas por MEV das matrizes de nanoburacos criadas em

um filme de ouro. a) Imagem dos buracos com 200 nm de diâmetro e periodicidade

de 420 nm. b) Imagem da configuração da amostra com matrizes de nanoburacos

organizadas em 7 colunas espaçadas por 150 μm, contendo 4 linhas de arranjos

espaçados por 60 μm.

Para a distribuição da amostra em diferentes concentrações sobre a

plataforma sensível, utilizou-se um sistema de microcanais (Figura 60), o qual

3

6

9

12

15

18

21

24

Pixel

In

ten

sid

ad

e /

un

i. a

rb.

1,3324

1,3331

1,3350

1,3444

1,3568

1,3778

a)

1,3377 1,3468 1,3559 1,3650 1,3741

0

3

6

9

12

15

I

/ u

ni. a

rb.

Índice de Refração

Coeficiente angular = 316

b)

a) b)


136

consiste de 7 canais diferentes. Cada canal foi alinhado com uma coluna de arranjos

de nanoburacos (Figura 59 e Figura 61). Este sistema de microcanais é chamado de

sistema de diluição, pois 6 (seis) dos 7(sete) canais são alimentados por duas

câmaras de entrada (Figura 60). Na câmara 1, uma solução contendo o analito

(antígeno, por exemplo) com concentração conhecida é injetada ao mesmo tempo

em que na câmara 2 é injetada uma solução tampão.

Figura 60: Sistema de microcanais utilizado para a determinação da concentração de

um analito através de uma curva de calibração adquiridos durante experimento em

tempo real.

O sistema de microcanais funciona de forma a misturar as soluções injetadas

em ambas as câmaras, resultando em soluções com diferentes concentrações

NanoburacosSaída

Amostra

Solução STF1 2

3


137

fluindo em cada canal. A concentração de antígeno em cada canal ou sobre cada

coluna de arranjo de nanoburacos será diferente. Através de uma imagem da

superfície da amostra, pode-se analisar a intensidade de luz transmitida através de

cada arranjo de nanoburacos. Esta imagem fornece dados suficientes para se

graficar uma curva de calibração, que mostra a variação da intensidade transmitida

em função da concentração do analito. Na câmara 3, tem-se um microcanal

independente, o qual não faz parte do sistema de diluição. Esta câmara é utilizada

para injetar a amostra contendo concentração desconhecida do analito. A idéia final

é determinar a concentração do marcador tumoral de câncer de ovário, através da

curva de calibração obtida durante uma medida em tempo-real.

Os arranjos de nanoburacos foram limpos em banho de ultra-som por 3 min,

enxaguados com etanol, água e então secos com N2. Após a limpeza do substrato,

uma monocamada de DSU (ditiobis (succinimidil undecanoato) foi montada sobre a

superfície de ouro através da imersão da amostra em uma solução contendo

2 mmol.L-1 de DSU em DMSO, ficando em repouso por 72 horas. Após a montagem

da monocamada, a amostra foi enxaguada para eliminar as moléculas não

adsorvidas e só então foi alinhada com a peça de PDMS contendo microcanais.

Estes foram previamente modificados com BSA (albumina de soro bovino) para

evitar adsorções não específicas das moléculas analisadas. Para isso, fluiu-se

solução 0,1 mmol.L-1 de BSA em STF com velocidade de fluxo de 10 μL.min-1 por

2 horas (Figura 61).

Figura 61: Imagem fotográfica (lente objetiva 10X) das matrizes quadradas

(15 x 15 μm2) de nanoburacos alinhadas com os microcanais de 100 μm de largura.


138

Detecção do Anticorpo PAX8

Trabalhou-se com o anticorpo PAX8 porque recentemente o Instituto de

Tecnologia de Câncer de Ovário de Atlanta descobriu que esta proteína, PAX8, está

envolvida no desenvolvimento das trompas falopianas e está presente nas células

cancerígenas do ovário, não estando presente nos tecidos normais deste.369

O sistema de microcanais foi utilizado para diluir uma solução contendo

27 μg.mL-1 de PAX8 em STF. A Figura 62 apresenta a imagem obtida através do

esquema experimental mostrado na Figura 56. A amostra foi iluminada no lado

oposto ao ouro utilizando uma fonte de luz monocromática em 633 nm (laser He-Ne).

É nítida a mudança na intensidade da luz transmitida através dos nanoburacos

presentes nas diferentes colunas (Figura 62), o que é resultante de diferentes

quantidades de espécies detectadas. De acordo com a literatura,303,370 a diminuição

da intensidade transmitida seria esperada devido ao aumento do índice de refração

para amostras com a periodicidade maior que 405 nm. Portanto, o resultado

mostrado na Figura 62 sugere que esteja ocorrendo um aumento do índice de

refração a partir da coluna 1 em direção à coluna 6. Como a solução de PAX8 é uma

solução diluída, o índice de refração do meio (STF) e da solução contendo o

anticorpo (PAX8 em STF) é o mesmo (1,3333 a 22,1 oC). Assim, assume-se que as

mudanças que ocorreram na intensidade de luz transmitida através dos arranjos de

nanoburacos sejam decorrentes da imobilização do anticorpo sobre a plataforma do

sensor.


alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados para a

detecção do anticorpo PAX8.

1 2 3 4 5 6 AmostraA

B

C

D


139

A Figura 63 mostra as intensidades de luz transmitida através dos arranjos de

nanoburacos para uma das linhas presentes na Figura 62, a qual contém matrizes

presentes em diferentes microcanais (de 1 a 6 e a amostra). O último pico na Figura

63a é referente à amostra analisada. O máximo de intensidade transmitida

normalizada é observado para o microcanal 1, no qual flui a solução mais diluída

sobre os nanoburacos e, portanto, o máximo de intensidade transmitida observada é

resultante do menor índice de refração efetivo.

Na Figura 63b estão apresentadas as intensidades médias obtidas para os

arranjos presentes em cada coluna em função da diluição. Através das intensidades,

obtém-se uma curva de calibração (Figura 63b), a qual permite a determinação em

tempo-real, da concentração da espécie presente na amostra. Utilizando a curva de

calibração obtida e, sabendo que a maior e menor intensidades de luz transmitida

correspondem respectivamente a STF e a solução de marcador biológico de partida

(de concentração conhecida), estimou-se a concentração de PAX8 presente na

solução como sendo 16,50 μg.mL-1 ± 0,05, o qual é próximo da concentração real da

amostra (15,70 μg.mL-1).

Figura 63: a) Intensidades normalizadas da luz transmitida para a linha B de arranjos

de nanoburacos após a detecção do anticorpo PAX8. b) Intensidade média

transmitida em função da diluição (calculada para os arranjos em cada microcanal).

Detecção do Antígeno r-PAX8

Para a detecção do antígeno foram seguidos os mesmos passos, descritos

para detecção do anticorpo PAX8. Entretanto, toda a superfície da amostra foi

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

EO

T N

orm

aliza

da

/ u

ni. a

rb.

Pixel

Amostra

a)

1 2 3 4 5 6

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Amostra

EO

T N

orm

aliza

da

/ u

ni. a

rb.

Microcanal

b)


140

homogeneamente modificada com o anticorpo para só então ser feita a detecção do

correspondente antígeno.

O sistema de microcanais foi utilizado na diluição de uma solução contendo

8,5 μg.mL-1 de r-PAX8 em STF, a qual fluiu sobre a amostra em uma velocidade de

10 μL.min-1. Como descrito anteriormente para a detecção do anticorpo, utilizou-se o

arranjo experimental da Figura 56 para a detecção do antígeno. A Figura 64 mostra

a imagem adquirida com uma câmera CCD do dispositivo integrado, onde ocorreu a

diluição da solução a partir da coluna 6 até a coluna 1. A amostra que consiste de

uma solução contendo “concentração desconhecida” do marcador biológico fluiu

sobre a última coluna com arranjos de nanoburacos (à direita). Embora as mudanças

de intensidade sejam visíveis, elas não foram tão intensas quanto aquelas obtidas

para o anticorpo PAX8. Este comportamento pode ser relacionado a dois fatores: i) a

concentração do AG é menor do que a do AC e ii) o AG consiste em uma molécula

pequena quando comparada com o AC, e portanto a imobilização do AC sobre o

biosensor tem maior efeito no índice de refração efetivo, resultando em maiores

mudanças na intensidade.


alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados para a

detecção do antígeno r-PAX8.

A Figura 65 apresenta as intensidades normalizadas da luz transmitida pelos

nanoburacos dentro do microcanal. O último pico (à direita na Figura 65a) é

relacionado à amostra analisada de “concentração desconhecida”. De fato,

observam-se intensidades diferentes para cada microcanal. O máximo de

intensidade normalizado para 1,0 (ca. 50 pixels), da mesma forma que para o AC,

possui a solução mais diluída fluindo, resultando em menor índice de refração

1 2 3 4 5 6 AmostraA

B

C

D


141

efetivo. Além disso, através da Figura 65 verifica-se que o biosensor é capaz de

detectar diferentes concentrações de r-PAX8, sendo que uma amostra menos

concentrada foi detectada na Figura 65a e outra mais concentrada na Figura 65b.

Através destes resultados, pode-se afirmar que o método apresentado neste

experimento permite uma análise quantitativa da amostra.

Figura 65: Intensidades normalizadas de luz transmitida para a linha B de arranjos

de nanoburacos após a detecção do antígeno r-PAX8. a) amostra diluída e

b) amostra concentrada de r-PAX8.

A partir das imagens obtidas para a detecção do r-PAX8, plotou-se uma curva

de calibração para a detecção quantitativa do AG (Figura 66). Comparando esta

curva de calibração com a obtida para o AC (Figura 63b), observam-se

comportamentos diferentes. Este fato pode ser explicado levando-se em

consideração o tamanho das moléculas. Como os AC são maiores do que o AG,

seria mais fácil detectar uma pequena mudança da concentração do AC do que do

AG, já que o tamanho da molécula é levado em consideração durante os cálculos do

índice de refração efetivo.

A concentração do AG na amostra pode ser então estimada utilizando a curva

de calibração presente na Figura 66. Como foi utilizada uma solução contendo

8,5 μg.mL-1 de AG para a construção da curva de calibração e, sabendo que a maior

e menor intensidades de luz transmitida correspondem respectivamente a STF e a

esta solução com 8,5 μg.mL-1 de AG, pode-se estimar que a amostra diluída de

r-PAX8 contém 2,53 μg.mL-1 ± 0,08, enquanto que para a amostra concentrada

0 200 400 600 800 1000 1200

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0Amostra diluída

EO

T N

orm

aliza

da

/ u

ni. a

rb.

Pixel

a)

0 200 400 600 800 1000 1200

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Amostra concentrada

EO

T N

orm

aliza

da

/ u

ni. a

rb

Pixel

b)


142

obteve-se 4,73 μg.mL-1 ± 0,09. Estes valores obtidos através da medida óptica

experimental são próximos da concentração real das amostras, sendo 2,10 e

5,30 μg.mL-1, respectivamente. Estas concentrações são muito maiores do que a

presente no paciente com a doença. No entanto, tanto o dispositivo para microfluído

quanto a plataforma sensorial foram eficientes. O primeiro na distribuição da amostra

em vários canais contendo diferentes concentrações e o segundo na detecção não

somente do marcador tumoral, mas também das diferentes concentrações deste.

Desta forma, neste ponto avanços devem ser feitos para melhorar tanto a

sensibilidade quanto o limite de detecção do chip.

Figura 66: Intensidade média transmitida em função da diluição (calculada para os

arranjos de nanoburacos presentes em cada microcanal).

I.4.2. Detecção dentro dos nanoburacos por espectrofotometria UV-Vis

Os resultados aqui apresentados são provenientes de um dispositivo para

sensor SPR baseado em EOT através de arranjos de nanoburacos periodicamente

organizados. Neste dispositivo, a sensibilidade é baseada na detecção dentro do

nanoburaco. A Figura 67 mostra o esquema do sensor utilizado, onde os

1 2 3 4 5 6

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Amostra concentrada

EO

T N

orm

aliz

ad

o /

un

i. a

rb.

Pixel

Amostra diluída


143

nanoburacos foram perfurados através do filme de SiOx e de ouro, confinando a área

sensível somente no interior do nanoburaco.

Figura 67: a) Representação de um nanoburaco, ilustrando a camada de ouro de

100 nm (amarelo) entre o substrato de vidro e uma camada de SiOx de 50 nm de

espessura. b) Esquema ilustrando a detecção das três camadas de moléculas

confinadas dentro do buraco. Os experimentos foram realizados utilizando arranjos

de 8 μm x 8 μm, contendo nanoburacos com 170 nm de diâmetro e periodicidade de

500 nm.

A eficiência do filme de SiOx em bloquear a superfície de ouro foi testada

através de medidas de voltametria cíclica (VC), utilizando solução 1 mmol.L-1 de

K3[Fe(CN)6] e velocidade de varredura de 20 mV.s-1. A Figura 68 mostra os

voltamogramas utilizando o eletrodo de ouro não coberto por SiOx (a) e o eletrodo de

ouro coberto com o filme de SiOx (b). A curva (a) mostra o processo redox do

K3[Fe(CN)6] com os picos característicos de oxidação em 0,34 V e redução em

0,18 V. Quando o filme de SiOx é depositado sobre o eletrodo de ouro (b), a corrente

faradaica diminui drasticamente devido à difusão limitada das espécies Fe(CN)63- em

direção à superfície do ouro. De acordo com a curva (b), o processo redox do

K3[Fe(CN)6] foi praticamente bloqueado pela camada de SiOx. O pequeno efeito de

capacitância de fundo na curva é relacionado à capacitância formada entre o ouro e

a solução eletrolítica. Além disso, a curva (b) não apresenta ondas de forma

sigmoidal como anteriormente mostrado na literatura, este comportamento é uma

forte indicação de um filme compacto, ou seja, com poucos defeitos.371,372

De acordo com os resultados de VC, foi possível confirmar que o filme de

SiOx cobre eficientemente a superfície do ouro.373 Isto significa que após a obtenção

dos nanoburacos através dos filmes de SiOx e ouro, somente a superfície de ouro no

interior dos nanoburacos estará disponível para a imobilização de moléculas. A

170 nm 100 nm

50 nm

a) SiOx

Au

Substrato de vidro

b)


144

grande vantagem deste sistema é que a quantidade de analito a ser detectada é

5 vezes menor do que em sistemas onde a superfície do ouro não está bloqueada,

(para os parâmetros mostrados na Figura 67), devido à área limitada de ouro

exposta. Esta é uma estimativa feita sem considerar o fato de que as ondas de SP

se propagam (e, portanto, são sensíveis) além da área das matrizes de nanoburacos

para o substrato não coberto.374,375

Figura 68: Voltamogramas em solução aquosa de K3[Fe(CN)6] utilizando como

eletrodo de trabalho: a) eletrodo de ouro sem modificação e b) eletrodo de ouro

coberto com filme de SiOx obtido após 120 h de deposição.

Sensibilidade

A sensibilidade do sensor em detectar variações de índice de refração

próximas à superfície foi analisada através de medidas de transmissão de luz do

sensor em contato com soluções de glicose com índices de refração diferentes

(Figura 69). A banda em 600 nm (Figura 69a) é relacionada ao modo de ressonância

(1,1) que ocorre devido à interface ouro|vidro, e a banda em cerca de 730 nm (Figura

69b) é relacionada ao modo (1,0) que ocorre devido à interface ouro|solução dentro

do buraco. O mínimo de absorção observado em todos os espectros ocorre devido à

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6-150

-100

-50

0

50

100

Densid

ade d

e c

orr

ente

/

A.c

m-2

E / V vs. Ag|AgCl

a

b


145

anomalia de Wood,376 sendo resultante da luz difratada que emerge paralelamente à

superfície do metal. Como previsto para sensores baseados em SPR, ocorre um

deslocamento do máximo de transmissão para maiores comprimentos de onda ao

aumentar o índice de refração próximo à superfície.

Como a superfície do ouro encontra-se bloqueada pela camada de SiOx, a

resposta do sensor é resultante das mudanças de índice de refração dentro dos

nanoburacos. O deslocamento para maiores comprimentos de onda da banda (1,1) é

semelhante à resposta de outros arranjos, estando de acordo com a conhecida

teoria da luz transmitida através de nanoburacos.306 No entanto, o deslocamento da

banda (1,0) presente na Figura 69 b, representa uma melhora da sensibilidade

quando comparada com a detecção onde a imobilização é feita sobre toda a

superfície, ou seja, em torno dos buracos e dentro deles.

Figura 69: Espectros de transmissão normalizados empregando soluções de glicose

com índices de refração conhecidos. Bandas relacionadas aos modos de

ressonância a) (1,1) e b) (1,0).

Através dos espectros apresentados na Figura 69 plotou-se curvas de

calibração para a amostra, referente às duas bandas de transmissão (Figura 70).

Através do gráfico de variação da posição do máximo de transmissão (comprimento

de onda) versus índice de refração, variando de 1,3320 a 1,3584 (variação de

0 a 2%), obteve-se um deslocamento da banda para maiores comprimentos de onda,

correspondendo a 10 nm para a banda (1,1). A sensibilidade pode ser obtida através

do coeficiente angular da curva, resultando em 360 nm/UIR. Como a banda é muito

560 580 600 620 640 660 680

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Banda (1,1)

1,3320

1,3331

1,3371

1,3447

1,3584

Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb.


a)

680 700 720 740 760 780 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 b)

Banda (1,0)

1,3320

1,3331

1,3371

1,3447

1,3584

Inte

nsid

ad

e /

un

i. a

rb.



146

larga, optou-se por medir o deslocamento usando o lado curva (em menores

comprimentos de onda), ao invés de utilizar o máximo de transmissão para o cálculo

do deslocamento. Com relação à banda (1,0), a mudança no máximo de

transmissão, para a faixa de índice de refração que se trabalhou (de 0 a 2% de

variação), foi calculada como sendo 19 nm, caracterizado por uma sensibilidade de

650 nm/UIR, a qual pode ser comparada com experimentos sem o filme de SiOx

(ca. 400 nm/UIR).306

Os resultados mostram que a deposição de SiOx sobre o ouro não diminuiu a

sensibilidade do sensor em comparação com a superfície não coberta. Este efeito

não esperado será discutido posteriormente ao se considerar a influência do índice

de refração da camada adsorvida nas propriedades de guia de onda de menor

ordem dentro do buraco.

Figura 70: Curvas de calibração resultantes dos deslocamentos dos máximos de

transmissão para a) banda (1,1) e b) banda (1,0).

Utilizou-se simulações através do método das Diferenças Finitas no Domínio

de Tempo (FDTD)377 para a avaliação das mudanças efetivas de índice de refração

devido à presença de diferentes espécies, sendo feita através de cálculos do campo

elétrico dentro do nanoburaco. A Tabela 4 mostra os valores correspondentes ao

máximo de transmissão obtidos experimentalmente e através de cálculos por FDTD

para diferentes índices de refração.

1,335 1,340 1,345 1,350 1,355

0

2

4

6

8

10

/ n

m

Índice de Refração


= 10 nm

Banda (1,1)

a)

1,335 1,340 1,345 1,350 1,355

0

5

10

15

20b)

n

m

Índice de refração


= 19nm

Banda (1,0)


147

Tabela 4: Comprimentos de onda referentes ao máximo de transmissão obtidos

através de cálculos por FDTD, comparado a valores experimentais onde foram

utilizadas soluções de glicose com diferentes índices de refração.

Dados Experimentais (nm) Simulação FDTD (nm)

Índice de Refração Banda (1,1) Banda (1,0) Banda (1,1) Banda (1,0)

1,3320 564 720 601 732

1,3331 565 724 601 732

1,3371 567 727 603 734

1,3447 569 731 604 737

1,3584 574 739 607 743

Para as medidas de detecção dentro dos buracos utilizou-se a ligação entre

as moléculas de biotina e estreptavidina devido à sua alta constante de bioafinidade

(Ka 1013M-1).378 Esta propriedade é uma das principais razões para a aplicação deste

esquema na detecção de biosensores, já que ele permite a utilização de condições

mais severas durante a análise bioquímica. Além disso, a especificidade da

interação permite a imobilização da proteína de forma uniformemente orientada,

fornecendo uma importante vantagem sobre outros métodos de imobilização.379 O

sistema biotina-estreptavidina tem sido estudado com detalhes por espectroscopia

SPR.380,381 A estreptavidina é uma proteína tetramérica, podendo ser ligada a quatro

moléculas biotiniladas (por exemplo, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) com mínimo

impacto em sua atividade biológica.382 Desta forma, este esquema fornece uma

plataforma pronta para a detecção de analitos dentro do buraco (ver Figura 51). A

Figura 71 apresenta os resultados relacionados à imobilização das proteínas no

biosensor.


148

Figura 71: a) Espectro de transmissão para arranjos de nanoburacos periodicamente

organizados, obtidos através de um filme de 50 nm de SiOx e um filme de 100 nm de

ouro, quando a superfície do ouro foi modificada sequencialmente por uma

monocamada de cisteamina, BNHS e estreptavidina. b) Medidas dos deslocamentos

do máximo de transmissão após a adição de BNHS e estreptavidina, relativos à

superfície modificada com cisteamina.

O espectro de transmissão para cada passo no processo de montagem foi

medido durante o fluxo de STF sobre a amostra, através da célula de fluxo. Como a

banda relacionada ao modo (1,0) é mais sensível e mais estreita, optou-se em

trabalhar com esta banda para a detecção das diferentes camadas de moléculas

sobre o sensor. Os deslocamentos do máximo de transmissão () foram calculados

usando o espectro de transmissão da superfície de ouro modificada com a

monocamada de cisteamina como referência. O processo de imobilização de todas

as camadas de moléculas sobre a superfície (cisteamina-BNHS-estreptavidina)

corresponde a um deslocamento para maiores comprimentos de onda de ca. 10 nm,

indicando um aumento no índice de refração efetivo, como esperado para a

adsorção de proteínas.383 Com relação à banda (1,1) ocorreu um deslocamento total

de ca. 7 nm. Os resultados foram analisados para 16 arranjos de nanoburacos com

as mesmas características (diâmetro do buraco e periodicidade) em 4 experimentos

separados. As barras de erro presentes na Figura 71b correspondem ao desvio

padrão calculado para as medidas. A reprodutibilidade para cada arranjo de

nanoburaco, estimada para o deslocamento do comprimento de onda relacionado à

imobilização da proteína, foi de cerca de 20%.

700 725 750 775 800

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 Cisteamina

Biotina

Estreptavidina

Inte

nsid

ad

e /

un

i.a

rb.


a)

Biotina Estreptavidina0

2

4

6

8

10

12

/n

m

b)


149

Considerando que cada molécula de estreptavidina cobre uma área de

25 nm2, é possível estimar que somente 2000 moléculas foram detectadas em cada

buraco. Como cada arranjo contém 900 buracos (30 x 30 nanoburacos), os 10 nm de

deslocamento do comprimento de onda visualizados na Figura 71 foram resultante

de cerca de 3 attomols (3 x 10-18 mols) de proteína. A detecção desta pequena

quantidade de amostra só foi possível devido ao fato de que o filme de SiOx não

diminuiu a sensibilidade dos arranjos investigados. A quantidade de proteína

detectada pode ainda ser diminuída através da redução do tamanho dos arranjos

(diminuição do número de nanoburacos), sem afetar a sensibilidade do dispositivo.305

Experimentos de controle negativo‡‡ foram empregados para verificação de

ligação não específica da estreptavidina sobre o filme de SiOx. O espectro de

transmissão dos arranjos não modificados antes e após imersão em solução de

estreptavidina não apresentaram nenhum deslocamento relativo ao STF.

O fato de que a camada de SiOx não afete a sensibilidade da amostra pode

ser explicado através da análise do campo elétrico dentro do buraco, comparando-se

uma mudança uniforme do índice de refração dentro do buraco com a mudança no

índice de refração resultante das camadas do sistema cisteamina-BNHS e

estreptavidina. Resolvendo-se a equação de Helmholtz384 para o campo longitudinal

do modo de menor ordem, encontrou-se índice de refração efetivo de 1,3518 para as

multicamadas de cisteamina-BNHS-estreptavidina com 7 nm de espessura (η = 1,45)

e STF (η = 1,3376). Estes cálculos teóricos corroboram nossos experimentos. O

modo de menor ordem foi o único modo considerado durante os cálculos já que ele

domina o processo de transmissão óptico nestas condições.385 É óbvia a alta

sensibilidade do modo dentro do buraco em relação à adsorção de espécies na

superfície, a qual resulta da componente do alto campo longitudinal na superfície.

Resumidamente, o isolamento da superfície de ouro buscando a detecção

confinada dentro do nanoburaco permitiu a obtenção de uma plataforma com boa

sensibilidade e detecção de poucas moléculas dentro dos nanoburacos (na ordem

de attomols). A sensibilidade do dispositivo foi de 650 nm/UIR, sendo comparável a

valores previamente descritos na literatura para detecção em toda a superfície.306 No

‡‡

Controle negativo: consiste em um experimento para verificação de mudanças na resposta em

função de ligações não específicas, o termo negativo é utilizado pois espera-se que não ocorram

mudanças na resposta.


150

entanto, o conceito de detecção dentro do buraco permite a detecção de uma menor

quantidade de moléculas devido à redução (5 vezes) da área sensível e ao

confinamento do plasmón na região onde as moléculas foram imobilizadas. Como as

medidas de EOT através de menores arranjos de nanoburacos são simples, o

processo descrito aqui pode ser facilmente aplicado para a detecção de quantidades

sub-attomolares de proteínas, principalmente se for integrado a um sistema de

microfluído para fluxo através dos nanoburacos. Sendo assim, a quantidade de

amostra analisada também seria reduzida, facilitando a detecção de marcadores

tumorais presentes em amostras de pacientes com câncer no estágio inicial de

evolução da doença.

Conclusões Parte II [Year]

151

I.5. Conclusões

O substrato baseado no modo de detecção por EOT permite que seja utilizado

um arranjo experimental simples e de fácil alinhamento. O método de detecção por

aquisição de imagens é uma opção que viabiliza a aplicação do material para a

detecção múltipla e em diferentes concentrações, de forma similar ao ELISA, método

comumente utilizado na detecção de marcadores biológicos. Neste trabalho foi

possível a detecção quantitativa tanto do anticorpo (PAX8) quanto do antígeno

(r-PAX8) através de uma medida em tempo real, a qual é realizada pela aquisição de

imagens fotográficas do substrato. A detecção destes marcadores biológicos é de

suma importância já que eles são relacionados ao câncer de ovário e sua detecção

na fase inicial da doença diminuiria os riscos de morte de forma significativa. Além

disso, a detecção quantitativa dos marcadores tumorais permite a aplicação do

dispositivo para a verificação da eficiência do tratamento de câncer utilizado no

paciente. Um tratamento adequado resultaria em diminuição da concentração destes

marcadores tumorais. O método desenvolvido neste trabalho possui a vantagem de

não trabalhar com moléculas marcadas, o que acontece no caso do ELISA.

Os resultados referentes à amostra onde os plasmóns de superfície foram

confinados dentro dos nanoburacos, mostraram que esta possui semelhante

eficiência quando comparado com sensores cuja detecção é dada por toda a

superfície. O dispositivo integrado foi aplicado com sucesso na detecção de

mudanças do índice de refração, apresentando sensibilidade de 360 nm/UIR e

650 nm/UIR para as bandas de ressonância (1,1) e (1,0), respectivamente. Esta

última amostra consiste em excelente melhora ao se comparar com valores

previamente descritos,306 principalmente ao se levar em conta a área sensível da

plataforma. Além disso, o substrato plasmônico desenvolvido neste trabalho foi

aplicado com sucesso na detecção de multicamadas de moléculas, o qual resultou

em um dispositivo que permitiu a detecção de quantidades attomolares da proteína

estreptavidina em resultado da diminuição da área sensorial da plataforma e

confinamento do plasmón de superfície.

Referências Bibliográficas

152

VII. Referências Bibliográficas

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