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DEJANILDO JORGE VELOSO
Ação de fitoterápicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos
sulfurados voláteis: estudo in vitro .
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIAUNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIAPROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
JOÃO PESSOA2006
DEJANILDO JORGE VELOSO
Ação de fitoterápicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos
sulfurados voláteis: estudo in vitro .
Tese apresentada ao ProgramaIntegrado de Pós-Graduação em Odontologia
da Universidade Federal da Paraíbaem cumprimento às exigências
para a obtenção do título de Doutor em Odontologia. Área de concentração:
Estomatologia.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio.Co-orientadora: Profª. Dr.ª Jane Sheila Higino.
JOÃO PESSOA
2
2006DEJANILDO JORGE VELOSO
Ação de fitoterápicos antimicrobianos sobre microrganismos bucais produtores de compostos
sulfurados voláteis: estudo in vitro .
DATA DA DEFESA: 27/07/2006.
_______________________________Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio.Orientador.
________________________________Profª. Dra. Célia Maria M. B. de CastroExaminadora.
_________________________________Profª. Dra. Brenda Paula F. D. A. GomesExaminadora.
__________________________________Profª. Dra. Margareth de Fátima F. M. DinizExaminadora.
__________________________________Prof. Dr. Eduardo de Jesus OliveiraExaminador.
3
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio, um verdadeiro orientador.
A Profª. Dra. Jane Sheila Higino, da UFPE pela orientação e produção dos
extratos usados neste trabalho.
A Profª. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, da FOP-
UNICAMP, Piracicaba pela orientação e ajuda indispensáveis com os testes
realizados no laboratório em Piracicaba.
Ao Prof. Carlos Henrique Gomes Martins, da Universidade de Franca, SP
pela orientação e amizade.
A Profª. Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira,
A Proª. Dra. Nikeila Chacon Oliveira Conde,
A Profª. Dra. Laurylene C. S. Vasconcelos,
A Profª. Fábia Daniele S. C. M e Silvia,
Ao Dr. Frederico Canato Martins, pelo laborioso trabalho e ajuda em
Piracicaba,
A Coordenação e Funcionários do Programa Integrado de Pós-Graduação,
Aos meus Mestres,
Aos meus amigos, um pequeno e estimado grupo de heróis.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho... Como bem lembrou minha querida Mãe.
4
E porque me faltam as palavras... Obrigado!
“Quando chegarmos ao final da linha, perceberemos que
nossa obsessão egoísta não nos oferece esperança,
e estaremos abertos para nos tornarmos
obcecados por Deus”.
Larry Crabb.
5
RESUMO
A produção de compostos sulfurados voláteis por
microrganismos da cavidade bucal é a principal causa da halitose. O objetivo
deste estudo foi de avaliar in vitro a atividade dos extratos de Caesalpinia
ferrea Mart. (Jucá), Cinnamomun cássia B. (Canela), Malva sylvestris L.
(Malva), Punica granatum L (Romã), Rosmarinus officinalis L. (Alecrim),
Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (Macassá), Sysygium aromaticum L
(Cravo) e Tamarindus indica L. (Tamarindo) sobre microrganismos da
cavidade bucal produtores de compostos sulfurados voláteis (CSV) utilizando
diferentes testes de sensibilidade microbiana e um modelo de sedimento
salivar. A atividade dos estratos foi avaliada sobre os microrganismos
Fusobacterium nucleatum, Peptostreptoccocus micros, Porphyromonas
gingivalis e Prevotella intermedia isolados da cavidade bucal. Para o teste de
difusão em agar foram utilizados os extratos puros depositados sobre o meio
de cultura em cilindros de aço (8,0 X 10,0 mm com diâmetro interno de 6,0
mm) e medidas as zonas de inibição. Foi também realizado o teste para
determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) em meio líquido pelo
método da microdiluição com a resazurina como revelador da presença ou
ausência de atividade bacteriana. A quantidade de polifenóis totais dos
extratos foi medida pelo método Azul da Prússia modificado por Graham.
Para o teste com o sedimento salivar foi utilizado o método de Kleimberg e
Codipilly e o sedimento salivar foi exposto aos extratos de jucá e romã
seguindo-se a incubação e realizadas medidas organolépticas e com um
6
monitor de gases (Halimeter®) em intervalos pré-estabelecidos. Ao teste de
difusão os diferentes extratos demonstraram resultados variados com
diferentes zonas de inibição ou ausência destas. O extrato de romã foi o
único extrato que apresentou capacidade inibitória sobre todos os
microrganismos testados. Os valores de CIM demonstraram também uma
variação quanto a ação dos extratos sobre os diversos microrganismos. Os
extratos usados para o teste de sedimento salivar determinaram uma menor
formação de CSV quando comparado ao controle negativo. O uso de
fitoterápicos pode representar uma alternativa para a abordagem
antimicrobiana nos casos de halitose de origem bucal.
7
ABSTRACT
The production of volatile sulfur compounds (VSC) by oral
microorganisms is the main cause for halitosis. This in vitro study evaluated
the antibacterial activity of plant extracts from Caesalpinia ferrea Mart.,
Cinnamomun cassia B. , Malva sylvestris L., Punica granatum L ,
Rosmarinus officinalis L. , Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. , Sysygium
aromaticum L e Tamarindus indica L. The bacteria tested were Fusobacterium
nucleatum, Peptostreptoccocus micros, Porphyromonas gingivalis e
Prevotella intermedia obtained from clinical trials. The antibacterial activity
was determined by means of agar diffusion and broth microdilution test..
Stainless-steel cylinders (8.0 x 10 mm – inside dia. of 6.0 mm) were placed on
the agar plates and the test extracts were applied inside the cylinders. Zones
of inhibition of bacteria growth around the cylinders were measured and
recorded after incubation time. Resazurin was used as an indicator of
bacteria growth in the microdilution test. In order to test for bactericidal or
bacteriostatical effect from the extract on bacteria, 20 µL from the well
indicating the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and three more wells
were dispensed in agar plates. Results for growing of bacteria were recorded
after appropriated incubation time. Determination of total polyphenols in the
plant extracts was carried out by the Prussian blue method as described by
Graham. The extracts of Punica granatum L. and Caesalpinia ferrea Mart.
showed the highest values for total polyphenols and were chosen for the test
with the suspended salivary system (SSS) method. The salivary sediment
8
were exposed to the extracts and the amount of odor was measured both with
organoleptic test and by a sulfide monitor (Halimeter®) after appropriated
periods. The agar diffusion and the microdilution tests demonstrated different
results with the Punica granatum extract being able to inhibit the growth from
all the bacteria tested by the diffusion method. The results from the test with
the SSS method show that when the extracts were exposed to the extracts
the production of VSC was smaller than the production from the negative
control. The results suggest that some plant extracts may be useful for the
antibacterial approach for the treatment of oral halitosis.
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
10
LISTA DE TABELAS
11
LISTA DE ABREVIATURAS
12
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. HALITOSE
2.1.1. CONCEITO DE HALITOSE
2.1.2. AVALIAÇÃO DO HÀLITO
2.1.3. PEVALÊNCIA DA HALITOSE
2.1.4. ETIOLOGIA DA HALITOSE
2.2. ABORDAGEM ANTIMICROBIANA NA HALITOSE
2.3. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS
2.3.1. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS NA
ODONTOLOGIA
2.3.2. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS NO
TRATAMENTO DA HALITOSE
2.4. POLIFENÓIS
3. PROPOSIÇÃO
4. METODOLOGIA
4.1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DAS PLANTAS
4.1.1. EXTRAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS
4.1.2. CONCENTRAÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATIVA
4.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
4.2.1. TESTE DA DIFUSÃO EM AGAR
13
4.2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)
E EM MEIO LÍQUIDO
4.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS
EXTRATOS
4.4. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE INIBITÓRIA DOS EXTRATOS
SOBRE A FORMAÇÃO DE COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTEIS
(CSV) E OUTROS ODORES
4.4.1. PREPARAÇÃO DOS SEDIMENTOS
4.4.2. COLETA DOS DADOS
4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
5. RESULTADOS
5.1. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
5.2. CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS EXTRATOS
5.3. AÇÃO DOS EXTRATOS DE JUCÁ E ROMÃ NA FORMAÇÃO DE
COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTÉIS E OUTORS ODORES.
6. DISCUSSÃO
7. CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS
14
1. INTRODUÇÃO.
Foi na década de 70 que J. Tonzetich usando cromatografia gasosa,
demonstrou que era possível identificar e quantificar os compostos sulfurados
voláteis (CSV) a partir de amostras de ar cavidade bucal, estabelecendo a
importância destas substâncias na formação do mau odor bucal. Como
principais componentes foram identificados: sulfidreto (H2S), metilmercaptana
(CH3SH), e com uma participação menor o dimetilsulfeto [CH3]2S.
Os compostos sulfurados voláteis já haviam sido identificados como
resultantes de processos putrefativos da saliva através de análise por
espectrometria de massa, contudo este método não era sensível o suficiente
para a avaliação do ar no interior da boca. Em seu estudo Tonzetich, 1971
mostrou que a concentração de compostos sulfurados voláteis na boca varia
para o mesmo indivíduo, quando examinado em diferentes horários num
mesmo dia. Os níveis mais altos de concentração destas substâncias
correspondem aos níveis de maior intensidade do mau hálito. Foi verificado
ainda que a aplicação de métodos de higiene bucal reduz significativamente
a quantidade de compostos sulfurados na boca, concluindo-se que a
formação destas substâncias se deve aos processos putrefativos ocorrendo
no interior da cavidade bucal.
Após os achados de Tonzetich os estudos foram desenvolvidos para
detectar os mecanismos de produção dos compostos sulfurados voláteis e a
importância da cavidade bucal como a principal fonte de produção destas
15
substâncias. De acordo com Delanghe et al (1999), num grupo de 260
pacientes atendidos na clínica de odores bucais, foram encontrados
aproximadamente 87% dos casos de halitose com origem bucal, 8%
apresentava mau odor originário da região de ouvido, nariz e garganta, e em
5% dos casos a origem não pode ser determinada. No caso dos pacientes
com halitose de origem bucal, 41% apresentavam saburra lingual, 31%
tinham gengivite, e 28% periodontite.
São diversos os estudos que descrevem que os compostos sulfurados
voláteis (CSV) são produzidos principalmente por bactérias anaeróbias gram-
negativas encontradas não somente em áreas de progressão de gengivite e
periodontite como também na superfície lingual, na assim chamada saburra
lingual. São vários os microrganismos relacionados como produtores de CSV:
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatun,
Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Peptostreptococcus. Essas
bactérias produzem compostos sulfurados voláteis a partir do metabolismo de
células, incluindo células descamadas da mucosa bucal e células sanguíneas
assim como proteínas da saliva (WALER, 1997; LOESCHE e KAZOR, 2002;
MORITA e WANG, 2001; MILAZZO et al, 2003; SCULLY e ROSEMBERG,
2003).
O uso do fluoreto estanhoso foi utilizado num estudo realizado por
Quirynen et al (2002), mostrando-se eficaz na redução do mau hálito matinal,
assim como na redução de bactérias na saliva e retardando a formação do
biofilme bacteriano bucal.
Realizando revisão sistemática das diversas abordagens no controle
da halitose, Roldán et al (2003) relatam que o controle mecânico do biofilme
16
lingual mostra uma redução transitória nas concentrações dos diversos
componentes do mau odor bucal. A abordagem antimicrobiana conta com
um diverso número de agentes que são utilizados isoladamente ou em
conjunto com a limpeza mecânica da língua. Contudo, o uso prolongado
desses agentes não deve promover o desequilíbrio da microflora bucal ou
contribuir para o surgimento de bactérias resistentes.
Pratten, Barnet e Wilson (2003) verificaram a eficácia da clorexidina e
do acetato de zinco num estudo in vitro, verificando sua capacidade em
reduzir a formação de CSV num modelo com biofilme multiespécie chamado
fermentador de imersão constante (CDFF – constant deph film fermentor).
Com as diversas aplicações foi observada a redução da produção de CSV e
simultaneamente uma alteração no biofilme com redução das bactérias
produtoras de H2S.
Neste contexto, a abordagem antimicrobiana no tratamento da halitose
tem se mostrado como uma opção fundamental. Substâncias como
clorexidina, cloreto de cetilpiridínio, triclosan, peróxido de hidrogênio, dióxido
de cloro, assim como óleos essenciais e cloreto de zinco têm sido estudados
no combate a halitose, com benefícios, mas também restrições. Embora
existam relatos do uso de plantas medicinais no combate da halitose, faltam
ainda evidências confiáveis (SCULLY e ROSEMBERG, 2003).
O uso de fitoterápicos já está incorporado à pratica da Medicina e da
Odontolotogia. Em todo o mundo são desenvolvidas pesquisas que avaliam
o potencial do uso de produtos obtidos de vegetais incluindo o isolamento de
substâncias específicas na busca de novos medicamentos usados na
17
prevenção e tratamento das mais diversas enfermidades (SILANO et al,
2004; SILVA e ANDRADE, 2005; VASCONCELOS et al, 2003).
Nesta pesquisa avaliamos a ação antimicrobiana de extratos
fitoterápicos sobre microrganismos relacionados à produção de CSV na
cavidade bucal através de testes de sensibilidade microbiana por difusão em
agar e microdiluição em caldo. Utilizamos também um modelo de sedimento
salivar que simula as condições do meio bucal e que permite a quantificação
de CSV através do uso de um monitor de gases.
Como justificativa para o desenvolvimento desta pesquisa deve-se
considerar a importância da halitose como uma condição com implicações na
saúde e também trazendo severas restrições sociais. Uma abordagem
fitoterápica pode mostrar-se adequada na busca de agentes antimicrobianos
para uso nos casos em que se deseje a redução dos CSV na cavidade bucal,
preenchendo assim a lacuna hoje existente em termos de pesquisa nesta
área específica.
18
2. REVISÃO DA LITERATURA.
2.1. HALITOSE
2.1.1. CONCEITO DE HALITOSE.
Halitose é o termo genérico usado para descrever um odor
desagradável e repugnante que emana da cavidade bucal. Embora inúmeras
localizações fora da cavidade bucal tenham sido relacionadas à halitose,
sabe-se que em até 90% dos casos a boca é a origem principal do mau odor
(Rosemberg,1997; Delanghe, 1999).
As implicações da halitose na saúde e com interferência nos
aspectos sociais, colocam esta condição numa área de abrangência que
envolve a Odontologia, a Medicina e a Psicologia. Nas culturas mais antigas
pode-se encontrar referências a halitose, a exemplo da cultura Hebraica que
há mais de dois mil anos esclarece no Talmud que um casamento poderia
ser legalmente anulado caso um dos cônjuges apresentasse mau hálito.
Outras referências podem ser encontradas nas culturas Grega e Romana.
Contudo, a halitose só foi cientificamente estudada no século XX,
demonstrando-se que a halitose poderia ser fisiológica ou patológica e que a
fonte do mau odor poderia estar localizada na boca, nasofaringe, ou outras
partes do corpo (SANZ , ROLDÁN e HERRERA 2001).
Diversas terminologias são empregadas para descrever a
presença de odores desagradáveis que emanem do ar expirado. Assim,
19
halitose, fetor ex ore, fetor oris, mau odor oral ou mau hálito podem ser
termos encontrados descrevendo as alterações do hálito (TOUYZ, 1993).
Uma primeira tentativa de classificação da halitose, associando as
diferentes categorias com a necessidade de tratamento foi publicada em
Japonês por Miazaki et al em 1999 sob o título: Tentativa de classificação da
halitose e suas indicações de tratamento (Tentative classification of halitosis
and its treatment needs. Niigata Dent J, 1999; 32:7-11. Japonese).
Posteriormente, Yaegaki e Coil (2000) difundiram os conceitos de Miazaki et
al ao descrever um protocolo para exame, classificação e tratamento da
halitose, que segundo os autores, deve ser utilizado para que se evite o
inadequado tratamento dos portadores de pseudo-halitose ou halitofobia.
Ao se receber para tratamento um paciente com queixa de halitose é
de fundamental importância fazer-se a distinção entre a halitose verdadeira e
a pseudo-halitose. A halitose verdadeira descreve a situação na qual o mau
odor é um problema real que pode ser facilmente diagnosticado usando-se
testes organolépticos ou meios físico-químicos. O termo pseudo-halitose é
usado quando o mau odor não existe de fato, mas o paciente insiste que seja
portador de tal alteração. Se após o adequado tratamento para halitose
verdadeira ou pseudo-halitose o paciente ainda insistir que possui alteração
do hálito, esta condição será classificada como halitofobia. A halitose
verdadeira, por sua vez, apresenta a subclassificação em halitose fisiológica
e halitose patológica, podendo ser esta última de origem bucal ou extra-bucal
(YAEGAKI e COIL, 2000; MURATA et al, 2002).
20
2.1. 2. AVALIAÇÃO DO HÀLITO.
A halitose pode ser mensurada por métodos organolépticos e
instrumentais. Os métodos instrumentais incluem a cromatografia gasosa,
monitores sulfídricos e nariz biônico ou eletrônico.
A investigação quanto a presença de halitose geralmente começa com
a queixa de um paciente que se diz portador do problema ou que tenha sido
informado por outro indivíduo (LOESCHE e KAZOR, 2002). A partir deste
momento a investigação quanto a presença de alteração do hálito se dará por
uma medida organoléptica ou com a utilização de um monitor de gases.
O desenvolvimento das técnicas de análise dos odores da cavidade
bucal apresenta duas fases distintas. Uma primeira fase onde os
instrumentos são utilizados para facilitar a avaliação organoléptica, e uma
fase onde os odores passam a ser mensurados através de testes físico-
químicos.
Brening, Sulser e Fosdick (1939) desenvolveram um aparelho
chamado de crioscópio, que permitiu a avaliação dos odores do hálito de três
fontes primárias (boca, pulmões e cavidade nasal) de forma isolada. O
crioscópio foi utilizado em conjunto com um outro aparelho desenvolvido em
1934 por Fair e Wells, o osmoscópio, inicialmente utilizado para a verificação
da qualidade da água através da olfação.
Sulser, brening e Fosdick (1939) utilizaram o crioscópio e o
osmoscópio e avaliaram algumas condições que afetam a concentração dos
21
odores no hálito. Os autores concluíram que algumas variáveis devem ser
consideradas na produção dos odores bucais: presença de piorréia1
gengivite, cáries , tempo decorrido desde a última refeição, sexo e idade.
Para o diagnóstico e estudo da halitose encontram-se referências a
diferentes escala de odores. Assim, escalas com variações de 0 a 5, 0 a 4 e
0 a 9 podem ser encontradas, onde os números mais elevados
correspondem a uma maior intensidade do odor percebido pelo examinador
(PITTS et al, 1981; IWAKURA et al, 1994). Uma escala comumente utilizada
é aquela descrita por Allisson e Katz (1919) com variação de 0 a 5, criada
para o controle de qualidade da água e posteriormente utilizada para a
avaliação organoléptica do hálito por Rosemberg et al (1991a).
O uso de cromatografia gasosa na avaliação do ar da cavidade bucal
foi introduzido por Tonzetich (1971) ao realizar um estudo onde o ar da
cavidade bucal de 15 indivíduos foi avaliado quanto a concentração de
compostos sulfurados voláteis. Amostras de saliva dos mesmos indivíduos
foram incubadas e avaliadas pelo mesmo método. Um cromatógrafo gasoso
equipado com uma coluna de teflon. As amostras de ar da cavidade bucal
foram colhidas através de seringa e imediatamente injetadas na coluna do
cromatógrafo.
Em 1975 Solis-Gafar et al realizaram um estudo clínico onde a
cromatografia gasosa foi utilizada para analisar a eficácia de um colutório
contendo agente antibacteriano (quaternário de amônia ). Uma modificação
quanto a técnica descrita no parágrafo anterior foi introduzida. Um sistema de
válvulas foi conectado a tubos de teflon de forma que uma extremidade do
1 Naquele período da evolução da Periodontia, utilizava-se o termo piorréia para a descrição da Doença Periodontal.
22
tubo era introduzida na cavidade bucal do indivíduo e a outra extremidade era
conectada a entrada do cromatógrafo. O estudo mostrou a redução de
compostos sulfurados voláteis (CSV) com o uso do antimicrobiano. Os
autores concluíram também que o uso da cromatografia gasosa estava
indicada para a avaliação da eficácia de colutórios quanto a redução de CSV
na cavidade bucal.
Com a evolução dos estudos na área de detecção dos odores do
hálito foram desenvolvidos monitores que pudessem ser utilizados no
consultório odontológico. Em 1991a, Rosemberg et al utilizaram um monitor
de gases (compostos sulfurados) até então usado para o controle ambiental
na indústria. O estudo incluiu 75 voluntários que tiveram os odores bucais
avaliados através do monitor de gases e organolepticamente por 5
examinadores. Para o teste organoléptico foi utilizada uma escala de 0 a 5.
Foi observada uma significante correlação entre os dois métodos utilizados.
Rosemberg et al (1991b) avaliaram a reprodutibilidade e a
sensibilidade de um monitor portátil de compostos sulfurados envolvendo 42
sujeitos durante 12 semanas. Além das medidas realizadas com o monitor
de gases, foram realizados testes organolépticos, índice de placa dentária,
índice de sangramento gengival e medição de bolsa periodontal. Solução de
clorexidina 0,2% foi utilizada e a mudança no odor bucal de cada indivíduo foi
avaliada, encontrando-se uma redução de 47% na concentração de
compostos sulfurados. Os testes estatísticos aplicados mostraram maior
reprodutibilidade e sensibilidade nos resultados obtidos com o monitor
quando comparado ao teste organoléptico, mostrando a utilidade deste
monitor em testes clínicos.
23
Furne et al (2002) compararam as medidas na concentração de
compostos sulfurados voláteis obtidas utilizando um monitor portátil
(Halimeter®) e cromatografia gasosa. Embora algumas diferenças tenham
sido encontradas, as leituras com o monitor mostram uma correlação positiva
com aquelas obtidas na avaliação por cromatografia gasosa.
Em 2004, Tanaka et al utilizaram pela primeira vez um nariz eletrônico
(FF-1 Odor discrimination analyzer) na avaliação da halitose. Os resultados
foram comparados com os achados dos testes organolépticos e
cromatografia gasosa mostrando similaridade entre os métodos de avaliação
da halitose.
Outros monitores portáteis para a análise de compostos sulfurados
voláteis foram desenvolvidos nos últimos anos a exemplo do OralChroma™
- Ability,Japan (AIZAVA et al, 2005) e Breathtron™ - New Cosmos Eletric
Company, Osaka, Japan (SOPAPORNAMORN et al, 2006).
2.1. 3. PEVALÊNCIA DA HALITOSE.
Segundo Loesche e Kazor (2002) poucos estudos documentaram a
prevalência da halitose a partir de uma amostra que representasse uma
determinada população. Em um estudo na Suécia com uma amostra
aleatória de 1.681 indivíduos, somente 2,4 % foram classificados como
portadores de halitose. A presença de halitose foi definida como a presença
de odor emanado da cavidade bucal do paciente e que surtia um efeito no
examinador a ponto de tornar o exame martirizante. Em um estudo
24
desenvolvido na França, 4.815 indivíduos de 15 anos de idade responderam
a um questionário e 22% relataram ser portadores halitose. Os autores
concluíram que esta prevalência está provavelmente superestimada
considerando-se a questionável confiabilidade da auto-percepção da halitose.
Em uma amostra com 2.672 indivíduos no Japão, com idade entre
18 e 64 anos, 28% da amostra apresentou halitose. Neste estudo, os
indivíduos com halitose foram definidos como aqueles apresentando valores
≥75 ppb para compostos sulfurados voláteis medido com o Halimeter®
(MIYAZAKY et al, 1997).
Mais recentemente, Liu et al (2006) avaliaram a correlação entre os
níveis de mau odor bucal e condições de saúde bucal em 2000 indivíduos na
China, com igual número de indivíduos das zonas urbanas e rurais. A
amostra foi dividida de forma que continha o mesmo número de indivíduos do
gênero masculino e feminino, entre 15 e 64 anos de idade. Ao teste
organoléptico, 27,5% dos indivíduos apresentaram halitose. Na medida com
um monitor de gases (Halimeter®) 20,3% apresentaram medidas acima de
110 ppb e 35,4 % apresentaram medidas acima de 75 ppb. Não foram
verificadas diferenças significantes nos valores médios medidos com o
Halimeter® para as diferentes faixas etárias ou para os grupos da zona
urbana ou rural.
2.1. 4. ETIOLOGIA DA HALITOSE.
25
Os primeiros estudos que avaliaram odores associados às alterações
do hálito buscaram relacionar a produção destes odores com os processos
putrefativos da saliva.
Em 1943 Law, Berg e Fosdick verificaram que as proteínas salivares
de indivíduos com doença periodontal sofriam putrefação e hidrólise mais
rapidamente do que proteínas oriundas da saliva de indivíduos sadios.
Berg e Fosdick (1946) desenvolveram o primeiro estudo onde a saliva
foi utilizada como um meio para o crescimento de microrganismos bucais em
culturas isoladas. Os autores observaram que a introdução de uma maior
quantidade do microrganismo testado resultava em um aumento do processo
putrefativo. Observaram também que uma microbiota mista produzia
putrefação mais rapidamente do que quando da presença de espécies
isoladas. Os resultados quanto a produção de odores não mostraram
diferença quando a saliva foi incubada em condições de aerobiose ou
anaerobiose.
Berg, Burril e Fosdick (1947) observaram que a saliva de indivíduos
sadios possuía a capacidade de gerar odores desagradáveis após 1 hora de
incubação. Ao final de 3 horas de incubação estes odores tornavam-se
intensos ao ponto impedir uma medição acurada. A saliva de indivíduos com
doença periodontal apresentava uma maior velocidade de putrefação.
Posteriormente, estudos de Ballantyne et al (1951), Clegg e Rae
(1956) e Rae e Clegg (1956) demonstraram as alterações na produção de
amônia por microrganismos bucais quando ocorrem alterações no pH da
saliva. Shiota e Kunkel Jr. (1958) mostraram que estas mudanças no pH
26
também são responsáveis pelo maior ou menor crescimento de determinadas
espécies de microrganismos.
O trabalho de McNamara et al (1972) demonstrou que a geração de
mau odor na cavidade bucal ocorre devido a presença de microrganismos.
Quando a saliva livre de microrganismos foi incubada isoladamente ou
adicionada a caldo para cultura, nenhum odor foi produzido. Este trabalho
também mostrou que nem todos os microrganismos tem a mesma
capacidade de produzir estes odores, sendo os gram-negativos os principais
responsáveis. O pH foi também avaliado e amostras com pH 6,5 inibiram a
formação de odor enquanto amostras com pH 7,2 mostraram presença de
mau odor. A presença de glicose inibiu a formação de mau odor bucal e
manteve o equilíbrio na quantidade de microrganismos gram-positivos e
gram-negativos.
A capacidade de bactérias da bolsa periodontal em produzir
compostos sulfurados voláteis (CSV) foi avaliada por Persson, Claesson e
Carlsson (1989). Bactérias foram colhidas de bolsas periodontais de 9
pacientes e cultivadas em soro humano. A medida de CSV foi realizada
através de cromatografia gasosa e a quantidade de compostos sulfurados
presente no soro após a incubação foi determinada com espectrometria por
emissão de plasma. Os resultados mostraram que as bactérias colhidas das
bolsas periodontais tinham uma alta capacidade de produzir CSV quando
cultivadas no soro humano, sendo o sulfidreto a principal composto sulfurado
formado. Quantidades significantes de metilmercapitana e dimetilsulfeto
foram também encontradas.
27
Persson et al (1990) verificaram a capacidade de diferentes espécies
bacterianas em produzir compostos sulfurados voláteis. A capacidade de
formação de CSV foi medida por cromatografia gasosa a partir de bactérias
isoladas de bolsas periodontais e amostras padronizadas (ATCC). Um total
de 163 amostras representando 75 espécies, além de 7 bactérias até então
não classificadas, mostraram significativa capacidade de produzir CSV
quando cultivadas no soro humano ou a partir da adição de L-cisteína ou L-
metionina em solução salina. Segundo os autores, os resultados
encontrados ampliaram a lista de bactérias bucais capazes de produzir CSV.
Kleinberg e Kodipilly (1997) estudaram as bases biológicas para a
formação da halitose. Utilizando diversos microrganismos da cavidade bucal
encontrados na placa bacteriana e introduzindo diversos aminoácidos ao
meio de cultura, os autores identificaram os microrganismos responsáveis
pela produção do mau hálito usando teste organoléptico. Verificaram ainda
que as bactérias anaeróbias gram-negativas são as principais responsáveis
pela produção dos odores.
Em 1999 Kleinberg e Codipilly utilizaram um modelo de sedimento
salivar (Suspended Salivary Sediment - SSS) e avaliaram alguns parâmetros
relacionados a formação do mau odor bucal. Demonstraram a funcionalidade
do SSS para testar a eficácia de substâncias usadas em colutórios quanto a
sua atividade antibacteriana e inibitória sobre a formação de compostos
sulfurados voláteis e outras substâncias.
Kato et al (2005) utilizaram a reação da cadeia de polimerase em
tempo real para a análise quantitativa de microrganismos bucais produtores
de compostos sulfurados voláteis (CSV). Vinte e dois pacientes forneceram
28
amostras da saliva, biofilme lingual e da placa subgengival. Estes pacientes
foram avaliados quanto a produção de compostos sulfurados voláteis por
cromatografia gasosa a partir de amostras de ar da cavidade bucal Os
testes de PCR foram realizados para a análise de Porphyromonas gingivalis,
Fusobacterium nucleatum, Treponema denticola e Bacteroides forsythus. De
acordo com os autores, esta metodologia pode ser usada para a análise
quantitativa de bactérias bucais produtoras de CSV.
Algumas das bactérias diretamente relacionadas com as alterações do
hálito estão também estão associadas às alterações periodontais e
endodônticas (GOODSON, 1994; GOMES et al, 2005; SAKAMOTO et al,
2006; SEOL et al, 2006).
Segundo Lee et al (2003) aceita-se a idéia de que a causa principal
da halitose seja devido a presença de compostos sulfurados voláteis. Deve-
se considerar, contudo a presença de outras substâncias compondo o grupo
de substâncias que produzem os odores do hálito como cadaverina e
putrescina, indol, escatol, piridina, entre outros (GOLDBERG et al, 1994;
KLEIMBERG e CODIPILLY, 1997; CODIPILLY, KAUFMAN e KLEIMBERG,
2004).
2. 2. ABORDAGEM ANTIMICROBIANA NA HALITOSE.
A abordagem antimicrobiana no tratamento na redução dos odores
bucais está diretamente relacionada à abordagem antimicrobiana utilizada na
doença periodontal, uma vez que existem bactérias comuns a ambos os
processos.
29
Baker at al (1987) avaliaram o efeito da clorexidina e uma série de
análogos onde o clorofenil foi substituído por cadeias do tipo alquil. A
clorexidina mostrou atividade antimicrobiana sobre baterias gram-negativas
e gram-positivas. Os melhores resultados foram obtidos com o uso dos
agentes hexidecidine, hexhexidine e alexidine que apresentaram um largo
espectro e boa ação sobre patógenos da cavidade bucal.
Uma comparação quanto a substantividade de 9 produtos para higiene
bucal, incluindo 2 dentifrícios, foi avaliada por Elworthy et al (1996). A
substantividade foi definida como a persistência da ação antibacteriana ao
longo de intervalos de 30, 60, 180, 300, e 420 minutos. A ação
antibacteriana foi medida a partir da contagem de unidades formadoras de
colônias obtidas da coleta de saliva estimulada , incubada em anaerobiose
por 72 horas. A clorexidina (0,12%) mostrou o melhor resultado com máxima
eficácia após 3 a 5 horas e mantendo o melhor resultado até o intervalo de
7 horas, quando comparada as demais substâncias testadas.
Herrera et al (2003) realizaram estudo in vitro e in vivo de 4
enxaguantes bucais contendo clorexidina a 0,12%. Teste de contato direto in
vitro mostrou que Lactocacillus casei, Straptococcus mitis e Streptococcus
micros foram sensíveis a associação de clorexidina + cetilpiridínio e
resistentes as associações clorexidina + álcool, clorexidina + fluoreto de
sódio e a clorexidina 0,12% de forma isolada. No estudo in vivo a contagem
bacteriana mostrou uma maior redução para as associações clorexidina +
cetilpiridínio e clorexidina + álcool, independentemente de se tratarem de
bactérias aeróbicas ou anaeróbicas.
30
Sreenivasan (2003) realizou um ensaio clínico para avaliar a eficácia
de um dentifrício contendo triclosan associado a um copolímero ( PVM/MA -
polyvinyl methyl ether/maleic acid ) sobre bactérias bucais produtoras de
sulfidreto. O efeito do dentifrício testado foi comparado a um outro dentifrício
sem triclosan ou copolímero, em um modelo de estudo duplo cego e
cruzado. Para a avaliação do efeito antibacteriano, amostras de saliva foram
coletadas e devidamente processadas para crescimento em trypticase soja
agar (TSA) e um meio específico contendo acetato de chumbo para o
crescimento de bactérias produtoras de sulfidreto. Os resultados mostraram
que o uso do dentifrício contendo triclosan e o copolímero levaram a uma
redução significativa de todas as bactérias, incluindo aquelas produtoras de
sulfidreto, corroborando resultados previamente obtidos com o uso deste
dentifrício na redução do mau odor bucal.
A redução de compostos sulfurados voláteis (CVS) com o uso de um
colutório foi avaliada por Winkel et al (2003). O estudo clínico duplo cego
envolveu 40 voluntários que utilizaram um colutório teste contendo
clorexidina, cetilpiridínio e lactato de zinco e um colutório placebo. Os
parâmetros foram avaliados através de: teste organoléptico ( 0 – 5 ), nível de
CSV, índice de Winkel para saburra lingual e manchamento lingual e
manchamento dentário. O uso do colutório teste levou a uma significante
redução do teste organoléptico de 2,8 para 1. A média de CSV caiu de 292
ppb para 172 ppb no grupo teste enquanto nenhuma redução foi observada
no grupo controle. Em ambos os grupos não foi observada redução
significativa no índice de saburra lingual. O manchamento lingual foi um
31
efeito adverso observado apenas no grupo teste. Concluíram os autores que
o colutório testado foi eficaz no tratamento da halitose.
Uma redução na contagem de microrganismos anaeróbios
subgengivais foi encontrada por Santos et al (2004) ao avaliarem a eficácia
do uso da clorexidina (0,05%) associada ao cloreto de cetilpiridínio (0,05%)
usado por um período de 15 dias. Um ensaio clínico aleatório utilizando
placebo foi realizado com 33 portadores de periodontite crônica previamente
tratados. Observou-se uma redução significativa da microbiota e na
freqüência de detecção de Porphyromonas gingivalis no grupo teste. A
formulação antisséptica testada demonstrou uma atividade inibitória de curto
prazo na formação de biofilme dental.
Um estudo de Carvalho et al (2004) avaliou o impacto de colutórios
sobre o hálito matinal. Usando um modelo duplo cego, aleatório e cruzado, os
autores avaliaram 4 diferentes marcas comerciais de colutórios disponíveis
no Brasil, em um grupo de 12 indivíduos, por um período de 4 dias. Os
produtos continham respectivamente: triclosan (0,03%), gluconato de
clorexidina (0,12%), cloreto de cetilpiridínio e óleos essenciais. Foram
utilizados controle positivo e negativo, e se avaliou: níveis de compostos
sulfurados voláteis (CSV) com Halimeter®, índice de gengivite e índice de
placa dentária. O gluconato de clorexidina (0,12%) foi o produto que se
mostrou mais eficaz na redução de CSV.
Roldán et al (2004) desenvolveram um estudo duplo cego, cruzado
utilizando controle negativo com 10 indivíduos para comparar a eficácia de 5
diferentes colutórios contendo clorexidina, com relação ao seu efeito sobre a
concentração de compostos sulfurados voláteis e contagem de bactérias na
32
saliva (aeróbias e anaeróbias). As formulações continham: clorexidina
0,12% (CHX + NO); clorexidina 0,12% + álcool (CHX + ALC); clorexidina
0,12% + cetilpiridínio 0,05% (CHX + CPC); clorexidina 0,12% + fluoreto de
sódio (CHX + NaF); e clorexidina 0,05%, + cetilpiridínio 0,05% + acetato de
zinco 0,14% (CHX + Zn). As medidas de CVS com Halimeter®, teste
organoléptico, índice de saburra lingual e contagem bacteriana na saliva
foram realizadas antes do uso dos produtos seguindo-se novas avaliações
com 1 e 5 horas após o uso dos mesmos. Com relação aos CSV o melhor
resultado em 1 hora ocorreu com o uso de CHX + NO e CHX + Zn. Após 5
horas os melhores resultados foram obtidos com o uso de CHX + CPC e CHX
+ Zn. Com relação a contagem bacteriana CHX + CPC mostrou o melhor
desempenho tanto sobre bactérias aeróbicas como anaeróbicas. Concluem
os autores que diferenças importantes podem ser observadas com o uso de
diferentes formulações contendo clorexidina.
Sekino et al (2004) avaliaram o uso da clorexidina na formação do
biofilme dental através de um ensaio clínico duplo cego. Além do uso de
colutório com clorexidina (0,2%), os voluntários da pesquisa utilizaram
clorexidina gel (1,0%) para escovação da língua. Exames foram realizados do
1º ao 4º dia. Observou-se que o uso da clorexidina na forma de bochechos
associado ao uso do gel reduziu a formação de novo biofilme bacteriano,
diminuindo o número de microrganismos do biofilme o número de
microrganismos na saliva.
Colutórios contendo baixas concentrações de clorexidina foram
avaliados quanto a ação antimicrobiana sobre bactérias produtoras de
sulfidreto e relacionadas à halitose. Sreenivasan e Gittins (2004) realizaram
33
um ensaio clínico aleatório para comparar a eficácia de colutórios contendo
clorexidina nas concentrações de 0,03% , 0,06% e 0,12% , com relação ao
colutório controle sem clorexidina. Bactérias produtoras de sulfidretos
mostraram significativa redução pós-tratamento para ambas as
concentrações de clorexidina quando comparadas ao controle .
Recentemente, um dentifrício em forma líquida contendo
triclosan/copolímero foi testado in vitro por Sreenivasan et al (2005) quanto a
sua ação antimicrobiana sobre 13 espécies de microrganismos da cavidade
bucal, incluindo Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis e
Prevotella intermedia. Adicionalmente, testes microbiológicos ex vivo
avaliaram sua eficácia a partir de saliva coletada de indivíduos que utilizaram
o dentifrício e compararam seus efeitos com outras duas amostras de
dentifrícios contendo ingredientes típicos (flavorisantes, humectantes,
abrasivos, sufactantes e fluoreto de sódio). Em ambos os testes o uso do
dentifrício contendo triclosan/copolímero resultou em uma significante
redução no número de bactérias cultiváveis quando comparado aos demais
dentifrícios.
Quirynen et al (2005) realizaram um estudo duplo cego, aleatório de
longa duração (6 meses) e avaliaram a eficácia de colutórios contendo
clorexidina 0,05% + cloreto de cetilpiridínio 0,05% em formulações com ou
sem álcool, comparando-as com um placebo (sem álcool). Depois de 1, 3 e 6
meses uma série de parâmetros clínicos e microbiológicos foram avaliados.
Dentre estes parâmetros, foi avaliado o efeito dos colutórios sobre bactérias
anaeróbias, inclusive Fusobacterium nucleatum. Efeitos adversos também
foram avaliados. As formulações com ou sem álcool foram igualmente
34
eficazes na redução das bactérias na placa bacteriana dental e na saliva.
Concluem os autores que as formulações testadas são efetivas enquanto
agentes inibidores do biofilme bucal a longo praso, apresentando reduzidos
efeitos colaterais.
Um colutório contendo benzidamida 0,15% + cetilpiridinio 0,05% foi
testado por Herrera et al (2005) quanto a sua eficácia na prevenção da
recolonização da placa bacteriana num período de 4 dias. Um colutório
contendo cloreto cetilpiridinio e um placebo foram usados para comparação.
Dentre os microrganismos testados estavam incluídos: Fusobacterium
nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e
Prevotella intermedia. Resultados demonstraram que houve uma ação
inibitória da associação benzidamida 0,15% + cetilpiridinio 0,05% sobre
Fusobacterium nucleatum e Prevotella intermedia, quando comparada ao
placebo.
Lakhssassi et al (2005) estudaram a susceptibilidade antimicrobiana
de 50 patógenos anaeróbicos colhidos de 20 sujeitos adultos e com
diagnóstico de doença periodontal agressiva. Foram isoladas amostras de
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia,
Fusobacterium nucleatum e Peptostreptococcus micros. Foram testados 10
antibióticos utilizando-se as técnicas de microdiluição e difusão em agar
(discos). Os resultados da difusão mostraram que, nas amostras estudadas,
os antibióticos amoxicilina, ampicilina, amoxicilina/clavulanato, doxiciclina, e
clindamicina mostraram-se efetivos. Ciprofloxacina e clindamicina
apresentaram baixa eficácia contra os microrganismos estudados.
35
Um estudo sobre o efeito antimicrobiano de dentifrício contendo
triclosan/copolímero (triclosan 0,3%, gantrez 2%) e de colutório contendo
diferentes concentrações de clorexidina (0,12% e 0,06%) foi desenvolvido por
Yang e Sreenivasan (2005). Foi utilizado um modelo ex vivo onde amostras
bacterianas colhidas a partir da saliva e do dorso da língua foram expostas as
substâncias testes e depois cultivadas em meios apropriados, incluindo meio
de cultura específico para o crescimento de bactérias produtoras de
sulfidreto. A exposição ao dentifrício mostrou efeito antimicrobiano dose
dependente , sobre bactérias anaeróbias e facultativas O efeito dos
colutórios bucais contendo clorexidina sobre bactérias produtoras de
sulfidreto mostrou uma redução de 82% e 69% para as concentrações do
colutório de 0,12% e 0,06%, respectivamente. Contudo, não foi observada
uma significante resposta dose dependente.
2. 3. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS.
Os produtos naturais obtidos diretamente de vegetais ou
microrganismos são uma importante fonte de compostos que orientam a
indústria farmacêutica na busca de novos medicamentos (HASLAN, 1996).
Populações em todos os continentes têm experimentado o poder de cura das
plantas e utilizado milhares destas plantas desde a pré-história (COWAN,
1999).
Desde a antiguidade a humanidade tem usado as plantas para o
tratamento de doenças. Na verdade, muito antes da descoberta das
bactérias, aceitava-se que certas plantas apresentavam o potencial para
36
curar diversas enfermidades. Alguns dos medicamentos de origem vegetal
chamados atualmente de medicamentos tradicionais são ainda utilizados
(RIOS e RECIO, 2005).
Em diversos continentes cresce o número de estudos que procuram
comprovar o que é divulgado como conhecimento popular sobre a atividade
de determinadas plantas no combate às doenças (STICKEL, PATSENKER e
SCHUPPAN, 2005; FUNARI e FERRO, 2005; MICHELIN et al, 2005;
MELÉNDEZ e CAPRILES, 2006).
De acordo com Lorenzi e Matos (2002) diversas partes das plantas
são empregadas nas chamadas práticas caseiras do uso de plantas
medicinais. São usadas as folhas, cascas, raízes, o látex, frutos e sementes.
As formas de utilização são variadas e podem incluir: chás, inalação,
xaropes, tinturas, entre outras.
Neste contexto, a atividade antimicrobiana de diversas espécies de
plantas tem sido avaliada. Na Guatemala, Cáceres et al (1987) realizaram
uma pesquisa entre vendedores e curandeiros e detectaram o uso de pelo
menos 200 plantas usadas para o tratamento de lesões da pele e mucosas.
Numa seleção de 21 plantas usadas com propósitos medicinais na
África do Sul, Rabe e Staden (1997) verificaram que 12 das espécies
testadas apresentaram atividade antibacteriana sobre bactérias Gram-
positivas.
Na Nigéria, Kudi et al (1999) avaliaram a atividade antimicrobiana de 8
espécies de plantas tradicionalmente utilizadas no tratamento de infecções
tanto em humanos como em animais. A maioria dos extratos apresentou
atividade inibitória sobre bactérias Gram-positivas. Duas espécies
37
(Angeiossus schimperi e Anacardium occidentali) apresentaram atividade
inibitória sobre bactérias Gram-negativas, as quais sejam, Escherichia coli e
Pseudomonas aeruginosa.
No norte da Argentina, Salvat et al (2001) avaliaram a atividade
antimicrobiana de 25 espécies de plantas. Entre outros resultados, a
Vassobia breviflora apresentou atividade bacteriostática sobre
Staphylococcus aureus e Enterococcus faecium.
No estudo de Geyid et al (2005) no qual foram avaliados extratos de
44 plantas usadas no tratamento de doenças infecciosas na Etiópia, verificou-
se que de modo geral, quanto maior o número de substâncias constituintes
apresenta uma determinada espécie de planta, maior a diversidade de
microrganismos sobre os quais esta planta terá atividade inibitória.
Segundos os autores, pode-se explicar este fenômeno por um possível efeito
de sinergismo entre os diversos componentes presentes no extrato.
Holetz et al (2002) realizaram um estudo e avaliaram a atividade
antimicrobiana de 13 plantas usadas popularmente no Brasil para o
tratamento de doenças infecciosas. Dez dos extratos produzidos a partir das
plantas testadas mostraram variados níveis de atividade antibacteriana. Por
exemplo, o extrato de Piper regnelli (Pariparoba) presentou boa atividade
sobre Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis. O extrato de Punica
granatum (Romã) mostrou boa atividade sobre Staphylococcus aureus.
Silva e Andrade (2005) verificaram as diferentes formas de utilização
da vegetação por parte de comunidades da Zona do Litoral e da Mata do
Estado de Pernambuco – Brasil. Dentre as diversas formas de uso verificou-
se que o uso medicinal apresentou o maior número de espécies em todas as
38
comunidades estudadas, correspondendo a quase a metade (169) do total de
plantas indicadas pelos participantes na pesquisa. As ervas foram descritas
como mais frequentemente utilizadas, com pouca utilização das arbóreas e
arbustivas.
De acordo com Maciel et al (2002) o uso das plantas medicinais é o
único recurso de que dispõem algumas comunidades e grupos étnicos. No
Brasil o uso de plantas com finalidade terapêutica ocorre nas regiões mais
pobres do país assim como nas grandes cidades e diversas plantas são
comercializadas em feiras-livres, mercados populares e até encontradas
cultivadas em quintais residenciais.
Dois aspectos importantes devem ser considerados no uso dos
fitoterápicos: a possibilidade de toxicidade e a possibilidade de interação
medicamentosa. Segundo Calixto (2000), no Brasil, a despeito da imensa
diversidade botânica e o largo uso de ervas medicinais, poucos esforços tem
sido feito no sentido de se estabelecer a qualidade, segurança e eficácia
destes produtos. Sabe-se que as plantas em geral contem centenas de
constituintes sendo alguns destes muito tóxicos. Segundo o autor:
“ a idéia de que produtos naturais são seguros e livres de
efeitos colaterais é falsa”.
Existe um senso comum de que produtos obtidos a partir de plantas
são intrinsecamente inofencíveis, uma vez que são naturais. Todavia, seus
efeitos derivam de suas características farmacológicas e dos níveis de
ingredientes ativos. Efeitos tóxicos podem também ser atribuídos a toxicidade
39
de seus constituintes, contaminação por pesticidas, microrganismos ou
metais pesados (CAPASSO et al, 2000).
Sabe-se que fatores intrínsecos e extrínsecos incluindo diferenças de
espécies, variação durante diferentes estações do ano, ambiente, coleta,
cultivo, contaminação, substituição e processamento podem afetar a
qualidade botânica do material utilizado na produção de medicamentos e
consequentemente a sua eficácia e segurança (REICHLING e SALLER,
1998; FONG, 2002).
Muitos medicamentos naturais são utilizados como auto-medicação
por adultos e algumas vezes em doses excessivas ou misturas com até 10
plantas diferentes, as vezes associados a vitaminas e minerais. Pode ocorrer
então efeito tóxico proveniente de uma das plantas utilizadas ou decorrente
da interação entre elas. São ainda desconhecidas as conseqüências da
exposição em longo prazo e não se deve excluir a carcinogenicidade,
mutagenicidade, efeito tóxico sobre o feto ou a criança ( WOOLF, 2003).
Fugh-Berman (2000) alerta para o perigo das interações entre certos
medicamentos alopáticos e fitoterápicos. Pacientes em uso de ciclosporina
ou digoxina devem evitar o uso de Hypericum perforatum L. (Erva de São
João) e misturas de ervas chinesas que podem potencializar o efeito de
corticosteróides.
Sparreboom et al (2004) revisaram a literatura científica publicada
sobre a interação de medicamentos fitoterápicos usados concomitantemente
com medicamentos alopáticos no tratamento do câncer. Verificaram que
Allium sativum, Gingko bliloba, Echinacea purpúrea, Panax ginseng,
40
Hipericum perforatum e Piper methysticum podem atuar na modulação de
enzimas e interferir tanto na absorção por via oral quanto no metabolismo
hepático de medicamentos alopáticos usados em oncologia.
As plantas incluídas neste estudo já foram previamente avaliadas
quanto a sua atividade antimicrobiana ou apontadas como úteis para o
tratamento de diferentes doenças por diferentes populações, através de
estudos de etnofarmacologia. Das espécies aqui estudadas, Caesalpinia
ferrea Mart. (jucá) e Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (macassá) foram
encontradas na literatura científica em pesquisas envolvendo sua atividade
antiinflamatória e anticonvulsivante. Contudo, substâncias que apresentam
atividade antimicrobiana são encontradas em sua composição, a exemplo da
presença de taninos e linalol no macassá (CARVALHO et al, 1996; COSTA-
LOTUFO et al, 2004; LIMYATI e JUNIAR,1997; LÓPEZ et al, 2005; MAU,
CHEN e HSIEH, 2001; SANTOYO et al, 2004; SOUZA et al, 2004;
VASCONCELOS et al, 2003).
2. 3. 1. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS
NA ODONTOLOGIA.
O uso de plantas medicinais na Odontologia segue o padrão para o
uso de plantas medicinais em geral. O conhecimento popular da ação de
determinada planta é disseminado entre a população e o seu uso passa a ser
empregado nas afecções bucais.
Xavier, Ramos e Xavier Filho (1995) realizaram estudo bibliográfico e
entrevista com raizeiros no Estado da Paraíba e descreveram diversas
41
plantas e suas indicações nas afecções bucais, como no combate a aftas,
abscessos, gengivite, ulcerações por próteses mal adaptadas, entre outras.
Um estudo duplo-cego de 9 meses de duração foi conduzido por
Gordon et al (1985) para avaliar a eficácia de um colutório contendo óleos
essenciais (Listerine®) em inibir o desenvolvimento do biofilme dental e da
gengivite. O estudo incluiu 127 sujeitos com idade entre 18 e 54 anos.
Quando comparado ao uso do controle, o uso da substância teste mostrou
uma redução de 12,1%, 18,3% e 18,0% na formação de biofilme dental, nas
avaliações realizadas nos intervalos de 1, 3 e 6 meses, respectivamente.
Redução significativa foi também observada para o índice de gengivite aos
nove meses de uso do produto.
DePaola et al (1989) a inibição da formação do biofilme dental e da
gengivite em um estudo duplo-cego conduzido em 107 indivíduos adultos. O
estudo teve duração de 6 meses e comparou a eficácia do Listerine® ao uso
de um controle com solução hidroalcoólica a 5%. Ao final do estudo não foi
observado manchamento extrínseco dos dentes ou tecidos moles, e a
substância teste levou à redução de 34% nos índices de formação de biofilme
dental e gengivite.
O efeito antimicrobiano sobre microrganismos do biofilme dental do
extrato hidroalcoólico da Punica Granatum Linn. foi avaliado por Pereira
(2002) em uma pesquisa in vitro e também numa avaliação clínica de um
dentifrício contendo este mesmo extrato. Observou-se que o extrato atividade
bactericida sobre Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus, Streptococcus sanguis e Lactobacillus casei. O extrato de Punica
granatum Linn. inibiu a aderência ao vidro de todos os microrganismos
42
testados. O estudo clínico demonstrou a redução na contagem de S. mutans
em 54,8 % dos indivíduos após 30 dias de uso do creme dental contendo o
extrato teste.
Vasconcelos et al (2003) compararam o gel de Punica Granatum Linn.
e o miconazol quanto a sua eficácia no tratamento da candidose bucal
associada a estomatite protética. Resultados clínicos e laboratoriais
apresentaram uma resposta semelhante entre as duas substâncias utilizadas
indicando a possibilidade do uso do gel de Punica Granatum no tratamento
da enfermidade estudada.
A ação da Camelia sinensis (Oolong tea) foi avaliada sobre
Streptococcus mutans. Os resultados demonstraram um efeito inibidor sobre
a enzima glicosiltransferase que permite a síntese de glucanos, responsáveis
pela aderência destes microrganismos à superfície dentária (NAKAHARA et
al, 1993).
Gebara, Zardetto e Mayer (1996) estudaram a ação antimicrobiana in
vitro de produtos naturais sobre Streptococcus mutans e Streptococcus
sobrinus. Foram avaliadas tinturas de cacau, camomila, malva, salva e
tomilho e estabelecidas as concentrações inibitórias mínimas e
concentrações inibitórias mínimas de aderência. Cacau e tomilho
apresentaram tanto ação antibacteriana como inibição da aderência ao vidro
dos microrganismos testados.
Pan et al (2000) utilizaram um método de coloração bacteriana
(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, Molecular Probes, Inc., Eugene,
OR – USA) para verificar a eficácia de um colutório contendo óleos
43
essenciais (Listerine®). Dezessete sujeitos participaram do estudo do tipo
aleatório e cruzado. Todos os participantes usaram o colutório e o controle,
observando-se um período de uma semana de intervalo. Trinta minutos após
a realização de bochechos de 30 segundos com a substância teste ou com
uma solução salina como controle, realizou-se a contagem de bactérias
viáveis e não viáveis presentes no biofilme dental. Os resultados foram
comparados com os resultados das coletas de biofilme dental obtidos
previamente a realização do uso das substâncias teste e controle. O uso do
colutório contendo óleos essenciais determinou a destruição de 78,7% das
bactérias enquanto o controle de terminou a destruição de 27,9% das
bactérias.
O óleo essencial de Cymbopogon citratus (capim-santo) foi avaliado
em um estudo in vivo por Santos (2000) e demonstrou eficácia na redução da
colonização de fungos do gênero Candida na mucosa do palato e na base de
dentaduras.
De acordo com Matsumoto, Hamada e Ooshima (2003) polifenóis
presentes no extrato de Camelia sinensis (Oolong tea) apresentaram
atividade inibitória sobre as enzimas glicosiltransferase B e D de
Streptococcus mutans . A velocidade de síntese de glucano foi diminuida
quando da presença de polifenol (OTF6) quando comparada a velocidade de
síntese na ausência desta substância. Isto sugere que o polifenol testado
reduz a síntese do glucano por inibição enzimática e não por competitividade.
O extrato de Camelia sinensis (Oolong tea) foi testado quanto a sua
atividade antibacteriana sobre Streptococcus mutans e Streptococcus
sobrinus. Nenhuma atividade inibitória sobre os microrganismos foi
44
observada no cultivo em caldo (BHI- Brain- Heart Infusion Broth). A atividade
antibacteriana foi observada numa suspensão de solução salina tamponada e
foi mais acentuada para frações monoméricas dos polifenóis. Os resultados
sugerem que a atividade antibacteriana da Camelia sinensis seja
conseqüência do efeito sinérgico de polifenóis monoméricos que se ligam a
proteínas (SASAKI et al, 2004).
Charles et al (2004) compararam o efeito da clorexidina e óleos
essenciais (Listerine®) usados como colutório num ensaio clínico com 6
meses de duração. O Listerine® foi descrito com a seguinte composição:
0,064% de timol, 0,092% de eucaliptol, 0,060% de metilsalicilato e 0,042% de
mentol. Uma solução hidroalcoólica a 5% foi usada como controle negativo.
108 sujeitos foram aleatoriamente distribuídos em 3 grupos. Os resultados
dos índices de sangramento gengival, biofilme dental, cálculo dental e
manchamento dental foram comparados com os índices obtidos no início do
experimento. Após 6 meses ambos os colutórios mostraram resultados
semelhantes quanto ao efeito sobre o biofilme dental e a gengivite. O grupo
que usou a clorexidina mostrou uma maior quantidade de cálculo dental e
manchamento dental quando comparado ao grupo que usou o colutório com
óleos essenciais ou controle negativo.
O efeito inibitório do extrato da casca da semente da Theobroma
cacao (cacau) sobre Streptococcus mutans foi avaliado por Matsumoto et al
(2004). O estudo foi dividido em um experimento in vitro e um ensaio clínico
onde indivíduos utilizaram bochechos com o extrato estudado e forneceram
amostras de saliva para contagem bacteriana. No estudo in vitro o extrato
reduziu de forma significativa a aderência do S. mutans a discos de
45
hidroxiapatita cobertos com saliva, a formação do biofilme dental artificial e a
contagem bacteriana. No estudo in vivo constatou-se a redução da formação
do biofilme dental mensurado pelo índice de placa bacteriana e a redução na
contagem de S. mutans na saliva.
Nostro et al (2004) estudaram a ação do extrato de Helichrysum
italicum sobre Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius e
Streptococcus sanguis. O estudo avaliou ainda: a ação do extrato sobre a
hidrofobicidade do S. mutans, um importante fator relacionado a capacidade
de aderência a estrutura dentária; a aderência ao vidro; e a agregação
celular. O extrato estudado mostrou atividade antimicrobiana sobre os 3
microrganismos testados. Concentrações menores que a concentração
inibitória mínima apresentaram atividade redutora na aderência do S. mutans
a superfície do vidro e na hidrofobicidade e ainda interferência na agregação
bacteriana.
A associação de clorexidina e óleos essenciais foi avaliada quanto a
sua atividade antibacteriana sobre Streptococcus mutans e Lactobacilus
plantarum . Os resultados revelaram que quando a clorexidina foi associada
a óleos essenciais, a quantidade de clorexidina necessária para inibir o
crescimento bacteriano foi reduzida de 4 a 10 vezes (FILOCHE, SOMA e
SISSONS, 2005).
2. 3. 2. USO DE PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS NO
TRATAMENTO DA HALITOSE.
46
Descreveremos a seguir alguns estudos que utilizaram a abordagem
antimicrobiana relacionada à redução da halitose com uso de óleos
essenciais e outros fitoterápicos. Também foram incluídos neste tópico
estudos que fazem referência direta a micorganismos reconhecidamente
produtores de compostos sulfurados voláteis.
Em 1949 Morris e Read avaliaram a variação da intensidade do odor
bucal e do odor decorrente da putrefação da saliva quando da ação de um
colutório contendo mentol, timol, eucaliptol, salicilato de metila, ácido
benzóico e ácido bórico. Os resultados mostraram que a diluição da saliva
com 6% do antisséptico impediu a completamente a formação de odores. O
uso do colútório levou a redução dos odores do hálito medidos com
osmoscópio.
Pianotti e Pitts (1978) verificaram a eficácia na redução do número de
bactérias Gran-negativas relacionadas a halitose após o uso de Listerine®
como colutório. Os resultados mostraram a redução estatisticamente
significante dos microrganismos colhidos do sulco gengival de 5 indivíduos
após 15, 60 e 120 minutos da realização de bochecho com o colutório
testado. Contudo, a redução do número de microrganismos após 180
minutos não mostrou diferença estatisticamente significante quando
comparada as medidas realizadas antes do uso do colutório.
Pitts et al (1983) realizaram um estudo aleatório, duplo-cego do tipo
cruzado que incluiu 30 voluntários. A eficácia do Listerine® ( Warner- Lambert
Co, USA) foi comparada a de um colutório placebo (formulação sem a
presença dos óleos essenciais) e um colutório contendo apenas água. Foram
avaliados: a população de microrganismos a partir de amostras da língua e
47
sulco gengival; intensidade do odor bucal a partir de testes organolépticos;
medida de compostos sulfurados voláteis (CSV) com cromatografia gasosa.
O efeito do uso das substancias foi avaliado após 30, 60 e 180 minutos. O
colutório teste foi efetivo em reduzir todos os determinantes do mau odor
bucal analisados. Destacam os autores que o efeito mascarador se mostrou
importante apenas nos primeiros 30 minutos. Os resultados em 60 e 180
minutos foram atribuídos ao efeito antibacteriano do colutório.
O controle da halitose, gengivite e formação do biofilme dental foi
avaliado por um período de 6 semanas por Kozlovsky et al (1996), utilizando
um colutório contendo cloreto de cetilpiridínio e óleo (Assuta®, 2 phase
oil:water mouthrinse, Sherman Soad Industries – Israel) . O Listerine® foi
usado como controle positivo. A redução na formação de compostos
sulfurados voláteis foi medida com um monitor portátil (Model 1170, Interscan
Corp. Ca, USA). Outros parâmetros foram avaliados: teste organoléptico,
índice de biofilme dental, índice de sangramento gengival, nível de
microrganismos na saliva. Houve uma redução da halitose de 80% e 70%
para o TPM e Listerine®, respectivamente. O Listerine® contudo, mostrou-se
mais eficaz quanto a redução do índice de formação do biofilme dental.
Os efeitos antimicrobianos da Arnica montana e da própolis sobre
diversos microrganismos da cavidade bucal, incluindo Porphyromonas
gingivalis, foram avaliados por Koo et al (2000). A atividade antimicrobiana
foi determinada pela difusão em ágar. A própolis mostrou melhor resultado.
O resultado do extrato de Arnica montana sobre a bactéria P. gingivalis foi
discreto, sem uma diferença estatisticamente significante ao resultado do
controle (solução hidroalcoólica de etanol a 80%, v/v ).
48
A eficácia na redução de compostos sulfurados voláteis de 4 colutórios
foi avaliada em um estudo clínico por Rösing, Jonski e RØlla (2002) utilizando
cromatografia gasosa. Um dos colutórios utilizados foi descrito como
contendo produtos derivados de ervar, contudo não especificadas. Os
resultados mostraram que o colutório contendo acetato de zinco (0,1%)
mostrou o melhor resultado. O colutório contendo ervas, juntamente com
colutórios contendo triclosan, flúor e bicarbonato de sódio apresentaram um
baixo nível de redução na formação de compostos sulfurados voláteis sem
diferença estatisticamente significante entre eles.
Borden et al (2002) verificaram a redução do odor bucal através de
teste organoléptico e medida de compostos sulfurados voláteis com um
monitor de gases (Halimeter®) num grupo de 99 sujeitos em um estudo de 4
semanas. Foi realizado um estudo aleatório, duplo-cego e longitudinal onde
foram avaliados 3 diferentes colutórios: óleos essenciais (Listerine® ), cloreto
de cetilpiridínio e outro contendo a associação de dióxido de cloro e zinco.
Um placebo também foi utilizado. Os resultados domonstraram que as 4
substâncias reduziram o mau odor bucal por um período de 4 horas após o
uso, sendo a maior redução produzida pelo uso do cloreto de cetilpitidínio e a
menor pelo placebo. O cloreto de cetilpiridínio mostrou o melhor resultado
também nos períodos de 2 e 4 semanas.
O óleo de Melaleuca alternifolia, uma árvore Australiana, foi testado
in vitro quanto a sua ação sobre bactérias orais por Hammer et al (2003).
161 amostras de bactérias incluindo Fusobacterium ssp. e Prevotella
intermedia foram utilizadas. Foram utilizados os métodos de microdiluição e
macrodiluição em caldo. Dado o grande número de gêneros e espécies
49
utilizados uma grande variação foi encontrada nos resultados. Para as
diferentes espécies de estreptococos a concentração inibitória mínima (CIM)
variou de 0,12% a 2%. Alguns das bactérias de outros gêneros foram
consideradas mais susceptíveis ao óleo estudado, com bactérias do gênero
Prevotella e Veillonella apresentando CIM para concentrações de 0,016%.
O efeito antimicrobiano de um colutório contendo óleos essenciais em
associação com zinco (0,09%) foi testado por Fine et al (2005). Foram
usadas amostras de biofilme dental supragengival e do dorso da língua. As
amostras foram cultivadas de forma que se pode mensurar a redução de
bactérias anaeróbias e também foi utilizado meio de cultura específico para
bactérias produtoras de compostos sulfurados voláteis (CSV). O estudo
contou com 17 sujeitos e foi usado um modelo aleatório, duplo cego e
cruzado. As avaliações foram feitas 12 horas após a realização de um único
bochecho com o colutório, e 12 horas após um período de 14 dias de uso
diário do colutório. As médias de reduções encontradas no número de
bactérias variaram de 56,3% a 95,3% para o biofilme dental e 61,1% a 96,1%
para o biofilme lingual. O uso do colutório teste mostrou um efeito positivo na
redução do número de anaeróbios e bactérias produtoras de CSV.
2. 4. POLIFENÓIS.
Os Polifenóis representam o grupo mais comum de substâncias
encontradas nos vegetais. São descritos como metabólitos secundários sem
uma função específica para o metabolismo intracelular. Nos vegetais, estas
substâncias assumem importante função de proteção seja por sua ação
50
antimicrobiana ou na proteção da integridade da planta ao conferir um sabor
desagradável, e evitando a ingestão da mesma por espécies animais
(BENNICK, 2002).
O grupo de antioxidantes mais abundantes na dieta humana é
constituído pelos polifenóis. Seus efeitos enquanto antioxidantes, absorção
biodisponibilidade, riscos e segurança incluindo a interação com
medicamentos são estudados por diversas áreas incluindo a Nutrição
(KROON et al, 2004; MENNEN et al, 2005; SCALBERT, JOHNSON e
SCALMARSH, 2005). No escopo deste trabalho, destaca-se a ação
antimicrobiana dos polifenóis.
Estima-se que o número de metabólitos secundários nos vegetais
ultrapasse 100.000 e são 3 os principais grupos conhecidos: terpenos, fenóis
e alcalóides. Todavia, a definição destes grupos não é muito rígida uma vez
que, entre outras reações, alguns precursores da biossíntese de fenóis
podem originar alcalóides. Os fenóis possuem pelo menos um grupo hidroxila
ou derivado funcional ligado a um sistema de anel aromático e podem ser
identificados como diversas substâncias: arbutina, hidroquinona, ácido gálico,
ácido cinâmico, cumarina, lignina, flavonas e antocianidinas (CARVALHO,
2004).
Segundo Haslam (1995) tanino é o nome genérico usado para
descrever um grupo de fenóis poliméricos capazes de curtir o couro ou
precipitar gelatina em suspensão, uma propriedade conhecida como
adstringência. Podem ser encontrados com a variação de peso molecular
entre 500 e 3000. Como outros polifenóis, apresentam uma variedade de
propriedades, tais como: ação bactericida, moluscocida, antihelmíntica e
51
capacidade de inibição viral. A ação dos taninos se dá por mecanismos
diversos e inclui: a ligação com íons metálicos, atividade antioxidante, a
capacidade de ligação com outras moléculas incluindo macromoléculas do
tipo proteínas e polissacarídeos.
Os mecanismos de ação dos taninos sobre os microrganismos são
estudados há décadas. Esta ação é estudada a partir de estudos in vitro que
avaliam o crescimento de micelos de fungos filamentosos, contagem de
colônias bacterianas em placas e testes de difusão em disco. Parâmetros
bioquímicos do metabolismo de certos microrganismos são utilizados nestes
estudos a exemplo da degradação da celulose, produção de metano ou
etanol e síntese de glucano, esta última usada na avaliação da ação sobre
Streptococcus mutans ( SCALBERT, 1991).
Cowan (1999) realizou uma extensa revisão sobre as propriedades
antimicrobianas dos constituintes de plantas medicinais.. Os elagitaninos
aparecem como o grupo com o maior número de possíveis mecanismos de
ação: A – ligação com proteínas (ligação com adesinas, inibição enzimática,
inibição do substrato, formação de complexos com a parede celular, ruptura
de membrana, ligação com íons metálicos) e B – Interação com o DNA (ação
antiviral). A seguir podemos ver um quadro que destaca algumas plantas e
a atividade dos polifenóis.
Kahanbabaee e Ree (2001) chamam a atenção para o fato de que
classificação dos taninos em hidrolisáveis e condensados está bem
estabelecida na literatura e é frequentemente utilizada. Todavia, entre os
hidrolisáveis inclui-se os galotaninos e elagitaninos. Segundo os autores,
sabe-se que alguns elagitaninos não são hidrolisáveis e por isso propuseram
52
a classificação dos taninos em 4 grupos : galotaninos, elagitaninos, taninos
complexos e taninos condensados.
NOME CIENTÍFICO NOME POPULAR ATIVIDADE
Rhamnus purshiana Cáscara sagrada Vírus, bactérias fungos
Eucalyptus globulus Eucalipto Bactéria, vírus
Melissa officinalis Limão Vírus
Onobrychis viciifolia Bactérias de ruminantes
Artemísia dracumculus Artemísia Vírus
Thymus vulgaris Tomilho Vírus, bactérias e fungos
Quadro 1. Atividade antimicrobiana de taninos extraídos de algumas plantas.Fonte: Adaptado de Cowan, 1999.
Kahanbabaee e Ree (2001) chamam a atenção para o fato de que
classificação dos taninos em hidrolisáveis e condensados está bem
estabelecida na literatura e é frequentemente utilizada. Todavia, entre os
hidrolisáveis inclui-se os galotaninos e elagitaninos. Segundo os autores,
sabe-se que alguns elagitaninos não são hidrolisáveis e por isso propuseram
a classificação dos taninos em 4 grupos : galotaninos, elagitaninos, taninos
complexos e taninos condensados.
Os taninos podem se ligar a proteínas salivares, em especial histatinas
e proteínas ricas em prolina. Acredita-se ser este um mecanismo de defesa
53
direcionado a reduzir a absorção de taninos, considerando-se a sua potencial
toxicidade sobre humanos e animais (YAN e BENNICK, 1995; LU e
BENNICK, 1998).
Joiner et al (2004) estudaram as características da adsorção de
polifenóis sobre películas de proteínas salivares formadas sobre discos de
hidroxiapatita. Utilizando elipsometria, observou-se que os polifenóis
determinam uma alteração nas características da película protéica e leva a
modificação no mecanismo de interação desta película com novas camadas
de proteínas. Este mecanismo explica a formação de manchas sobre a
superfície dentária quando da presença de polifenóis.
54
3. PROPOSIÇÃO.
É proposição deste trabalho avaliar in vitro a atividade dos extratos de
Caesalpinia ferrea Mart. (Jucá), Cinnamomun cássia B. (Canela), Malva
sylvestris L. (Malva), Punica granatum L (Romã), Rosmarinus officinalis L.
(Alecrim), Aeolanthus suaveolens (Als.) Spreng. (Macassá), Sysygium
aromaticum L (Cravo) e Tamarindus indica L. (Tamarindo) sobre
microrganismos da cavidade bucal produtores de compostos sulfurados
voláteis (CSV) utilizando-se diferentes testes de sensibilidade microbiana.
55
4. MATERIAIS E MÉTODOS.
Trata-se de um estudo experimental realizado em 2 etapas sendo a 1ª
etapa do estudo sobre a atividade antimicrobiana in vitro e a 2ª em um
modelo ex vivo com sedimento salivar.
4.1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DAS PLANTAS.
Extratos de Cinnamomun cassia B (Canela ), Malva sylvestris L
(Malva), Punica granatum L (Romã), Rosmarinus officinalis L (Alecrim),
Aeolanthus suaveolens (Als.)Spreng.L (Macassa , Sysygium aromaticum L
(Cravo) e Tamarindus indica L (Tamarindo) foram preparados no
departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de
Pernambuco em Recife (PE) após a devida identificação botânica no
Laboratório de Toxicologia da mesma instituição.
O Extrato de Caesalpinia ferrea Mart. (Jucá), foi preparado na
Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas. O preparo do
extrato foi realizado utilizando-se a mesma metodologia utilizada para os
demais extratos.
4. 1 .1. EXTRAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS.
Após lavagem e secagem em estufa a 33° C por uma semana para
eliminação de umidade e estabilização do conteúdo enzimático o material foi
56
triturado a pó em moinho elétrico seguindo-se a extração dos princípios
ativos.
Foi empregado o método de lixiviação ou percolação em fluxo
contínuo à temperatura ambiente. Neste processo existe a renovação
constante da solução extratora durante um período de 24 horas. Decorrido
este tempo ocorre então a total extração dos marcadores ou princípios ativos.
Para o processo são utilizados 8 litros de solução hidroalcoólica para cada
quilo de matéria prima pulverizada, visando o completo esgotamento da
extração. Recuperou-se aproximadamente 6.600 ml de cada extrato que
após filtração para retirada de impurezas, foram acondicionados em fracos
âmbar e estocados em câmara fria.
Especificamente no caso do Tamarindo (Tamarindus indica L. ) o
processo de extração se deu por maceração fracionada devido ao teor de
açúcar e pectina, evitando-se assim a produção de um extrato
excessivamente turvo. Na primeira maceração a parte da fruta utilizada foi
lavada e cortada em pequenos pedaços, colocada em um balão de fundo
chato e recoberta pela solução extrativa (solução hidroalcoólica a 80%). Após
uma semana realizou-se uma filtração com a obtenção do primeiro filtrado
chamado de extrato A, que foi acondicionado em refrigeração. O material
colhido pelo aparato filtrante foi recolocado em um balão de fundo chato e
recoberto com uma nova solução extrativa, na mesma concentração. Após
uma semana realizou-se filtração para obtenção do extrato B, que foi
acondicionado em refrigeração. Repetiu-se o processo para obtenção do
extrato C, após o qual se deu o completo esgotamento do marco. Na etapa
57
final os extratos A, B e C foram misturados e concentrados em
rotavaporização.
4.1. 2. CONCENTRAÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATIVA.
Após a extração dos marcadores químicos foi realizada a
concentração em nível de extrato fluido 1:1 ( p/v). Este processo foi realizado
em aparelho rota-vapor (Modelo Ika – Werk) a uma temperatura constante de
40°C.
O quadro 2 mostra o detalhamento da parte da planta utilizada,
substância extratora e concentração final do extrato obtido.
PLANTA NOME CIENTÍFICO
PARTE UTILIZADA
SUBSTÂNCIA EXTRATORA
CONCENTRAÇÃO FINAL
ALECRIN Rosmarinus officinalis L.
Folha Etanol 70% 1000 mg/ml
CANELA Cinnamomum cassia Breyn.
Casca Etanol 70% 321 mg/ml
CRAVO Syzygium aromaticum
L.
Pedúnculo floral
Etanol 70% 396 mg/ml
JUCÁ Caesalpinia ferrea Mart
Vargem completa
Metanol 80% 500 mg/ml
MALVA Malva sylvestris L.
Folha Etanol 80% 1000 m g/ml
MACASSÁ Aeolanthus suaveolens
(Als.)Spreng.
Folha, caule e sumidade
florais
Etanol 80% 125 mg/ml
TAMARINDO Tamarindus indica L.
Fruto sem semente
Etanol 70% 411 mg/ml
ROMÃ Punica granatum L.
Casca do fruto
Etanol 80% 540 mg/ml
Quadro 2. Descrição do material fitoterápico utilizado: nome popular, nome científico, parte utilizada, substância extratora e concentração final do extrato obtido.
58
4.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.
Os ensaios antimicrobianos foram realizados no Laboratório de
Anaeróbios, Disciplina de Endodontia da FOP- Unicamp, Piracicaba, SP.
Foi testada a atividade antimicrobiana dos extratos sobre cepas
selvagens previamente cultivadas. Foram utilizadas cepas de: Fusobacterium
nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e
Prevotella intermedia. Como controle positivo foi utilizado o gluconato de
clorexidina 2% (líquido).
4.2.1. TESTE DA DIFUSÃO EM AGAR.
Foi utilizado o método de difusão em meio sólido. 100 µL de meio
FAB (Fastidious Anaerobe Broth - LAB M - Lancashire – UK) contendo
inóculo correspondente ao padrão 1 da escala de McFarland ajustado por
espectrofotômetro (Mod. 432, FEMTO, Brasil- comprimento de onda de 800
nm) foram semeados em placas contendo FAA (Fastidious Anaerobe Agar -
LAB M - Lancashire – UK) enriquecido com sangue de carneiro ( Newprov,
Brasil). A escolha do padrão 1 de McFarland para o inoculo está de acordo
com as características de crescimento das bactérias estudadas. Cilindros
de aço (8,0 X 10,0 mm - com diâmetro interno de 6,0 mm ) foram
colocados sobre os meios FAA previamente semeados. Utilizados nas
59
concentrações mostradas no quadro 2, 50 µL dos extratos testados e o
antimicrobiano (gluconato de clorexidia 2%) foram colocados no interior dos
cilindros. As placas foram então incubadas em câmara de anaerobiose (Don
Whitley Scientific, Bradford, UK ) numa atmosfera contendo 5-10% H2, 10 %
de CO2 e 80-85% de N2 por 72 horas.
Zonas de inibição foram medidas após o período de incubação. Foi
considerada como zona de inibição a menor distância (mm) medida da
margem externa do cilindro até o ponto inicial do crescimento microbiano.
Foram feitas triplicatas para cada substância testada sobre os diferentes
microrganismos.
Após o período de incubação e leitura das zonas de inibição foram
retirados os cilindros e feitas coletas de material sobre o meio sólido que
esteve em contato direto com a substância testada. Este material foi
semeado em placas com FAA e incubado nas mesmas condições
anteriormente descritas. Após o período de incubação foi feita a leitura para
verificar a inibição por contato direto, representada pela ausência de
crescimento bacteriano.
4.2.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
(CIM) E EM MEIO LÍQUIDO.
A concentração inibitória mínima (CIM) foi estabelecida em meio
líquido usando-se o método da microdiluição. Diluições das substâncias
testadas foram preparadas de forma que para os extratos foram utilizadas
concentrações entre 50 e 400 µg/mL, com um total de 20 diferentes
60
concentrações. Para a clorexidina foram utilizadas concentrações entre
0,0115 e 5,9 µg/mL, com um total de 10 diferentes concentrações. Os
inóculos foram preparados e ajustados por espectrofotômetro (800 nm)
correspondendo ao padrão 1 da escala de McFarland.
Foram dispensados na microplaca controles contendo: apenas o meio
líquido (FAB); o meio líquido (FAB) mais o extrato; e o meio líquido (FAB)
mais o inoculo.
Após incubação em câmara de anaerobiose por 72 horas foi realizada
a leitura utilizando-se coloração com resazurina (Sigma, USA) na
concentração de 0,02%. Foram adicionados 30µL da solução de resazurina
em cada poço da microplaca contendo o inóculo e a substância testada,
como também nos poços contendo os controles. Foi interpretada como CIM a
menor concentração correspondente ao poço teste que manteve a coloração
azul da resazurina. A alteração da coloração para a cor rosa –violácea ou
rosa indicou a redução da resazurina implicando na presença de
crescimento bacteriano. A leitura foi realizada após 20 minutos da aplicação
do corante.
As diferentes concentrações foram distribuídas nas microplacas em
duplicata de forma que após a leitura da CIM, uma alíquota de 20µL foi
retirada e semeada em placas com meio FAA. A alíquota foi retirada do poço
correspondente a leitura da CIM, e mais três poços consecutivos com
concentração maior dos extratos. Após a incubação foi feita a leitura quanto
à presença ou não do crescimento bacteriano.
61
Esquema 1. Esquema ilustrativo dos procedimentos para a CIM por microdiluição.
Cultura em placa Meio líquido
Extrato Clorexidina
Preparo da placa.
62
Grau 1 deMcFarlandESPECTROFOTÔMETRO
De acordo com a concentração do extrato é preparada a solução mãe (SM) para ser colocada na microplaca. Também é preparada a clorexidina.
FAB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Preparada a SM esta é distribuída de forma que se obtenha as diferentes concentrações que variaram de 400µg/mL até 50µg/mL, ocupando os poços A 1 a 12 e B 1 a 8. Linhas C e D representam a duplicata. Na linha F é colocada a clorexidina. Nos mesmos poços são acrescentados o inóculo e o meio FAB. Controles colocados na linha H.
PLACAS SÃO INCUBADAS EM ANAEROBIOSE
Resazurina 0,02%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Leitura da placa após 20min da aplicação da resazurina. Último poço azul (esquerda para direita) representa CIM. Poço com cor rosa-violáceo ou rosa indica atividade bacteriana com redução do corante. Linha H controles. Linhas C e D usada para repique em meio sólido.
4.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS
EXTRATOS.
A quantificação de polifenóis totais dos extratos foi realizada pelo
método Azul da Prússia segundo modificação proposta por Graham (1992).
Uma Solução Blank foi preparada com 3 mL de água deionizada
adicionando-se 100 µL do mesmo solvente utilizado para o preparo do
extrato. Após agitação se acrescentou 1 mL da Solução de Ferrocianido de
Potássio (Solução 2) e 1 mL de Cloreto Férrico (Solução 1). Após 15 minutos
se acrescentou 5mL da solução estabilizadora (30 mL de água destilada, 10
mL de H3PO4 e 10mL de goma arábica a 1%). Subseqüente a preparação da
Solução Blank, preparou-se uma Solução Padrão com 3 mL de ádua
deionizada adicionando-se 100µL de solução de ácido gálico a 0,01M
seguindo-se os demais procedimentos para a preparação da solução Blank.
Em seguida, as amostras foram preparadas, utilizando-se 3 mL de água
deionizada acrescidos de 100µL do extrato teste em diluição apropriada,
seguindo com a seqüência de adição dos reagentes usados na preparação
das soluções Blank e Padão.
Após a preparação as soluções Blank, padrão e amostras foram
levadas para leitura em Espectrofotômetro (Beckman – DU640, USA) em luz
visível, em comprimento de onda de 700nm.
63
4.4. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE INIBITÓRIA DOS
EXTRATOS SOBRE A FORMAÇÃO DE COMPOSTOS SULFURADOS
VOLÁTEIS (CSV) E OUTROS ODORES.
A concentração de CSV foi medida em tubos contendo cultura total de
saliva incubada após a exposição aos dois extratos que apresentaram a
maior concentração de polifenóis. Cada extrato foi usado separadamente.
Cultura total de saliva não exposta a nenhum dos extratos foi utilizada como
controle. O gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard ®) foi usado como
controle positivo. A concentração de 0,12% é a concentração usual presente
nos enxaguantes bucais. O estudo foi desenvolvido com amostras em
duplicata.
4.4.1. PREPARAÇÃO DOS SEDIMENTOS.
O método descrito por Kleinberg e Codipilly (1999) foi utilizado
para a preparação do sistema de sedimento salivar: saliva total foi coletada
de dois indivíduos que se mantiveram sem realização de higiene bucal por 24
horas e com período de jejum de 12 horas antecedendo a coleta. A saliva foi
coletada em tubos de ensaio tipo Falcon (15 mL), pelo método estimulado,
utilizando-se hiperbolóide.
Após coleta, as amostras de saliva foram centrifugadas em 3500 rpm
(centrífuga QUIMIS) por 15 minutos. O sobrenadante foi removido e estocado
em freezer a 4 C. Um volume de 41,75 µl de sedimento foi colocado em 10
tubos Falcon. O sedimento presente em cada tubo foi lavado com um volume
64
de 1 mL de água de deionizada por 3 vezes por 30 segundos. Cada ciclo de
lavagem foi realizado acrescentando-se 1ml de água deionizada ao
sedimento presente em cada tubo, que foi agitado e após 30 segundos foi
feita a centrifugação por 1 minuto. O excesso de água foi retirado,
permanecendo o sedimento em cada tubo.
Foram testadas 3 diferentes concentrações dos extratos,
correspondendo a diluições 1:1, 1:2, e 1:4. As amostras-teste foram exposta
(por 30 segundos) a 1 mL do extrato seguindo-se centrifugação por mais 1
minuto. Após exposição foi realizada outra sessão de lavagem por mais 30
segundos. Os tubos contendo o controle positivo foi exposto a 1ml da
solução de clorexidina a 0,12% e os tubos contendo o controle foram
expostos a água deionizada, por 1 minuto. Em seguida, para simular o
cllearence pela saliva, todas as amostras de sedimento foram centrifugadas,
lavadas com 1ml de água deionizada e mais uma vez centrifugadas,
retirando-se a água de forma que cada tubo permaneceu com o sedimento.
Em cada um dos tubos Falcon contendo o sedimento, foi preparado o
SSS sendo formado por 250 µl de sedimento salivar a 16,7% (v/v) , 250µl de
sobrenadante a 33,3% (v/v) e 250 ul de L-cisteína (6 mM). As amostras
controle e teste foram incubadas por 24 horas a 37 C. As leituras
organolépticas e por Halimeter® foram realizadas nos seguintes momentos:
após 1 , 2, 4 e 24 horas de incubação.
65
Fotografia 1. Saliva distribuída em tubos antes da centrifugação.
Fotografia 2. Saliva distribuída em tubos após a centrifugação. Detalhe a esquerda.
66
4.4.2. COLETA DOS DADOS
Foi realizado teste organoléptico para verificação de mau odor,
utilizando-se uma escala de 0 a 4, com o método da verificação ao bastão de
vidro esterilizados , onde 0 representa a ausência de odor e 4 o odor mais
intenso. Imediatamente após a abertura de cada tubo, um bastão de vidro
com 0,5 cm de diâmetro e 30 cm de comprimento foi introduzido no tubo
Falcon contendo a cultura salivar tendo sua extremidade mergulhada no sis
tema de sedimento e realizando-se movimentos circulares de forma a fazer a
agitação do conteúdo do tubo. Em seguida o bastão foi posicionado
horizontalmente a 10 cm das narinas do examinador, sendo estabelecido o
valor correspondente da escala de acordo com a intensidade do odor.
Para a medição da concentração dos CSV foi utilizado o aparelho
Halimeter (Interscan Corporation), um monitor de CSV. Para tal foi adaptada
uma tampa para o tubo Falcon, contendo duas perfurações. Em uma das
perfurações foi instalado o canudo que foi acoplado ao Halimeter®, que no
momento da medida foi ajustado de forma que a extremidade fosse
posicionada a uma distância de 5 mm da superfície do sedimento salivar. Na
outra perfuração foi acoplado um segmento de canudo plástico com o mesmo
diâmetro do que foi acoplado ao Halimeter®, de forma a permitir a entrada de
ar, compensando o volume de ar retirado pelo aparelho. Essas medidas
foram realizadas imediatamente após a medida organoléptica do conteúdo de
cada tubo.
67
Medidas de pH foram realizadas com eletrodo (Orion, USA) acoplado a
um potenciômetro 710A (Orion, USA). Calibrações foram realizadas com
padrões de pH 4 e 7 e slope de 95%. As leituras foram realizadas após a
última leitura de CSV.
Fotografia 3. Tubos Falcon. A esquerda tubo para incubação. Adireita tubo com tampa e canudosacoplados para medida com Hali-meter®. Detalhe acima.
68
Fografia 4. Halimeter® ( Interscan Co. USA).
4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.
Os dados obtidos nas diferentes etapas deste estudo foram tabulados em programa Excel (versão x) e SPSS (versão 11.0). Nestes programas foram calculados médias, desvios padrão e valores em percentual quando apropriado. Os resultados são apresentados em tabelas simples e quadros.
69
5. RESULTADOS.
5.1. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.
A tabela 1 mostra o resultado do teste de difusão em agar dos
diferentes extratos testados. Na mesma tabela pode-se verificar a presença
ou ausência de crescimento bacteriano do material retirado da área de
contato direto com a substância testada.
Tabela 1. Média da zona de inibição (mm) e ação por contato direto de extratos hidroalcoólicos e clorexidina sobre microrganismos da cavidade bucal.
MICRORGANISMO
EXTRATO / DROGA
Peptostreptococcus micros
Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas gingivalis
Prevotellaintermedia
ALECRIM 1,6 ( - ) * ( - ) 3 ( - ) * ( - )CANELA * ( - ) * ( - ) * ( + ) * ( - )CRAVO 3 ( - ) * ( + ) * ( + ) * ( - )
MACASSÁ * ( - ) * ( + ) * ( - ) * ( - )MALVA * ( + ) * ( + ) * ( + ) * ( + )
JUCÁ 6,3 ( - ) * ( + ) * ( + ) * ( - )ROMÃ 10,3 ( - ) 5 ( + ) 3 ( - ) 3,6 ( - )
TAMARINDO 2,6 ( - ) 2 ( + ) * ( - ) * ( - )
70
CLOREX. LIQ. 2%
9,3 ( - ) 8,6 ( - ) 8 ( - ) 9,6 ( -)
* Sem inibição. (-) Ausência de crescimento bacteriano após inoculação em meio sólido, de material retirado da área de contato direto do extrato/droga com microrganismo. (+) Presença de crescimento bacteriano após inoculação em meio sólido, de material retirado da área de contato direto do extrato/droga com microrganismo.
A maior média de inibição observada entre os extratos foi a da romã
sobre o Peptostreptococcus micros. A romã foi o único extrato que produziu
zona de inibição sobre todos os microrganismos testados, inclusive com
média superior a da clorexidina para o Peptostreptococcus micros. O extrato
de jucá mostrou um halo de inibição significativa sobre o Peptostreptococcus
micros, contudo, este extrato não mostrou zona de inibição sobre os demais
microrganismos testados Os extratos de canela, macassá e malva não
produziram zona de inibição sobre nenhum dos microrganismos testados. O
extrato de cravo produziu zona de inibição apenas sobre o
Peptostreptococcus micros. O alecrim por sua vez, mostrou zona de inibição
sobre Peptostrptococcus micros e Porphyromonas gingivalis. A clorexidina
mostrou zona de inibição sobre todos os microrganismos testados.
71
1
2
3
4
Fotografia 5. MIC por difusão em agar de extratos fitoterápicos sobre Fusobacterium nucleatum. 1: Malva ; 2: Jucá; 3: Macassá; 4: Tamarindo; Central: Romã.
Na tabela 1 vemos ainda que o Peptostreptococcus micros colhido da
zona de contato direto com os extratos de alecrim, canela, cravo, macassá,
jucá , romã e tamarindo, não apresentou crescimento quando semeado em
meio sólido (FAA). O extrato de malva ,por sua vez , não impediu o
crescimento desta bactéria quando retirada da área de contato direto e
semeada em meio sólido. A bactéria Fusobacterium nucleatum não
apresentou crescimento quando retirada da área de contato direto com os
extratos de alecrim e canela. Todavia, mostrou crescimento quando
semeada a partir das áreas de contato direto com os extratos de cravo,
macassá, malva, jucá, romã e tamarindo.
Na fotografia 2 podemos observar a formação de halos de inibição no
teste de difusão em agar. Pode ser visto o resultado dos extratos de malva,
jucá macassá tamarindo e romã numa placa com crescimento do
Fusobacterium nucleatum.
Os resultados do teste de CIM por microdiluição podem ser vistos na
tabela 2 mostrada a seguir. Cada valor expresso em µg/mL mostra a
concentração inibitória mínima dos diversos extratos sobre os
microrganismos utilizados, identificado pela coloração com a resazurina. Os
resultados da clorexidina também podem ser vizsualizados.
Todos os extratos estudados mostraram valores de CIM presentes nas
concentrações utilizadas, sobre no mínimo dois dos microrganismos
72
estudados. Contudo, nenhum dos extratos apresentou CIM sobre todos os
quatro microrganismos testados.
O extrato da romã foi o único extrato a não apresentar valor da CIM
sobre o Peptostreptococcus micros. Contudo, foi o único extrato a apresentar
valor de CIM (160µg/mL) sobre a Prevotella intermedia para as
concentrações estudadas.
Do ponto de vista da sensibilidade dos microrganismos frente aos
extratos testados, o Peptostreptococcus micros foi o microrganismo a
apresentar o maior número de valores de CIM na concentração abaixo de
50 µg/mL para os diversos estratos utilizados. Por outro lado, a Prevotella
intermedia apresentou o maior número de valores > 400 µg/mL para a CIM
frente aos extratos estudados.
Tabela 2. Valores da Concentração Inibitória Mínima * por microdiluição de extratos hidroalcoólicos sobre microganismos da cavidade bucal.
MICRORGANISMO
EXTRATO / DROGA
Peptostreptococcus micros
Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
ALECRIM ≤ 50 > 400 190 > 400
CANELA ≤ 50 > 400 190 > 400
CRAVO ≤ 50 ≥ 400 ≥ 400 > 400
MACASSÁ ≤ 50 > 400 ≤ 50 > 400
MALVA ≥ 400 > 400 ≤ 50 > 400
JUCÁ ≤ 50 ≥ 400 120 > 400
ROMÃ > 400 ≥ 400 170 160
TAMARINDO 190 > 400 250 > 400
CLOREX LIQ. 2%
0,1844 0,3688 0,3688 0,1844
* Valores da CIM expressos em µg/mL.
73
Fotografia 6 . Detalhe de microplaca. MIC do Tamarindo sobre P. Gingivalis.
74
Tabela 3. Crescimento de microrganismos em meio sólido após a determinação da Concentração Inibitória Mínima por microdiluição.
MICRORGANISMO
Extrato/Droga Peptostreptococcus micros
CIM
Fusobacterium nucleatum
CIM
Porphyromonas gingivalis
CIM
Prevotella intermedia
CIMAlecrim 80 60 70 ≤ 50 >400 100 90 80 70 >400
- - - - - - - -Canela 80 70 60 ≤ 50 >400 300 250 200 190 >400
+ + + + - - - -Cravo 80 70 60 ≤ 50 > 400 ≥400 >400
+ + + + -Macassá 80 70 60 ≤ 50 >400 80 70 60 ≤50 >400
- - - - - - - -Malva ≥400 >400 80 70 60 ≤50 >400
- - - - -Jucá 80 70 60 ≤ 50 ≥400 150 140 130 120 >400
+ + + + - - - - +Romã >400 ≥400 200 190 180 170 190 180 170 160
+ + + + + + + + +Tamarindo 300 250 200 190 >400 400 350 300 250 >400
+ + + + + + + +Clorexidina 1,475 0,7375 0,3688 0,1844 2,95 1,475 0,7375 0,3688 2,95 1,475 0,7375 0,3688 1,475 0,7375 0,3688 0,1844
- - - - - - - - - - - - - - - - CIM ( Concentração inibitória mínima- µg/mL); ( + ) Crescimento bacteriano; ( - ) Ausência de crescimento bacteriano.
A tabela 3 apresentada na página anterior, mostra o resultado da
presença ou ausência de crescimento bacteriano sob a ação dos diversos
extratos, das alíquotas retiradas dos poços correspondentes aos valores da
CIM e de mais três poços consecutivos representando concentrações mais
elevadas.
O Peptostreptococcus micros apresentou crescimento em meio sólido
após exposição aos extratos de canela, cravo, jucá e tamarindo para os valores
da CIM e concentrações mais elevadas. Quando exposto aos extratos de
alecrim e malva, este microrganismo não apresentou crescimento em meio
sólido para as concentrações da CIM. Especificamente no caso do extrato de
alecrim tambémm não houve crescimento bacteriano para concentrações acima
da CIM.
Podemos observar que quanto ao Fusobacterium nucleatum não houve
crescimento bacteriano após o repique em meio sólido quando da exposição ao
extrato de jucá. O repique realizado quando este microrganismo foi exposto ao
estrato da romã apresentou crescimento. Para os demais extratos a CIM
apresentou valor >400 µg/mL e portanto não foi realizado o repique em meio
sólido.
O microrganismo Porphyromonas gingivalis não apresentou crescimento
em meio sólido para os valores da CIM ou concentrações mais elevadas
quando exposto aos extratos de alecrim, canela, cravo, macassá ou malva.
Contudo, apresentou crescimento para a CIM e valores mais elevados, quando
exposto aos extratos de romã e tamarindo. Quanto à exposição ao extrato de
jucá, este microrganismo apresentou crescimento quando repicado após a
exposição ao valor da CIM, contudo, não mostrou crescimento para
concentrações mais elevadas do extrato.
O microrganismo Prevotella intermedia foi semeado em meio sólido
somente após a exposição ao extrato de romã mostrando crescimento para o
valor da CIM e valores mais elevados. Quando exposto aos demais extratos
apresentou valores da CIM >400 µg/mL , não sendo realizado o repique em
meio sólido.
Para todos os microrganismos estudados não foi observado crescimento
bacteriano quando da exposição à clorexidina, tanto para a CIM quanto para as
concentrações mais elevadas.
5.2. CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DOS EXTRATOS.
Fotografia 7. Foto ilustrativa de soluções preparadas para a quantificação de polifenóis. Da esquerda para a direita: Blank, Padrão, Extrato de Malva, Extrato de Romã.
77
Tabela 4. Concentração de polifenóis de extratos hidroalcoólicos obtidas por
espectofotometria.
Planta Diluição Médiada
Leitura
Ácidido
gálico
ug/mL
Mg de fenóisem quivalentede ácido gálico
por mL deextrato
Concentraçãoda solução de
trabalho(mg/mL)
Polifenóis
do extrato
(%)
Padrão Etanol 80%
1,175 190,00
Jucá 01:32 2,5954 568,73 36,39 500 7,3
Romã 01:64 1,8382 329,73 21,10 540 3,9
Canela 01:08 1,6223 290,92 04,65 321 1,5
Malva 01:04 0,3773 67,65 0,54 1000 0,1
Macassa EP 0,5911 143,07 0,14 125 0,1
Padrão Etanol70%
1,175
Alecrin 01:04 1,3932 225,28 1,80 1000 1,3
Tamarindo 01:04 0,4404 71,21 0,56 411 0,1Comprimento de onda de 700 nm. Método azul da Prússia (GRAHAM, 1992).
A tabela 4 mostra a concentração de polifenóis dos extratos utilizados
neste trabalho. O extrato de jucá apresentou a maior concentração seguindo
do estrato de romã.
5.3. AÇÃO DOS EXTRATOS DE JUCÁ E ROMÃ NA FORMAÇÃO DE
COMPOSTOS SULFURADOS VOLÁTÉIS E OUTORS ODORES.
As tabelas apresentadas a seguir mostram os resultados da ação dos
extratos de jucá e romã na formação de CVS e outros odores utilizando-se o
sintema de sedimento salivar, tomando-se as medidas organolépticas e com o
Halimeter®. São apresentadas também as tabelas com o resultado das
78
medidas de pH realizadas ao final do período de incubação e leituras de
concentração dos odores presentes no sistema de sedimento salivar.
Tabela 5. Efeito do extrato de Jucá na formação de compostos sulfurados voláteis e outros odores utilizando-se o sistema de sedimento salivar.
D1ORG HAL
D2ORG HAL
D3ORG HAL
CONT. POSITIVOORG HAL
CONTROLEORG HAL
1h 0 30 0 30 0 33 0 48 1 9002h 0 37 0 34 0 37 0 50 2 9114h 0 38 0 39 0 46 0 50 3 1250 24h 0 27 0 40 0 70 0 33 4 1500 ORG : Teste organoléptico; HAL: Leitura com Halimeter®
Tabela 6. Leitura de pH do sistema de sedimento salivar sob ação do extrato de Jucá após 24 h de incubação.
AMOSTRAS pH D1 – A 6.003
D1 - B 6.005
D2 - A 4.621
D2 - B 4.791
D3 – A 3.047
D3 – B 4.420
CONT. POSIT. - A 7.321
CONT. POSIT. – B 6.800
CONTROLE – A 6.197
CONTROLE - B 6.029
Tabela 7. Efeito do extrato de Romã na formação de compostos sulfurados voláteis e outros odores utilizando-se o sistema de sedimento salivar.
D1ORG HAL
D2ORG HAL
D3ORG HAL
CONT. POSITIVOORG HAL
CONTROLEORG HAL
1h 0 30 1 1200 1 1200 0 40 1 1500
2h 0 30 2 800 2 1000 0 42 2 1320
4h 0 43 1 950 1 1000 0 50 3 1400
24h 0 35 2 560 3 1400 0 33 4 1500
ORG : Teste organoléptico; HAL: Leitura com Halimeter®
79
Tabela 8 .Leitura de pH do sistema de sedimento salivar sob ação do extrato de Romã após 24 h de incubação.
AMOSTRAS pHD1 – A 5.713
D1 - B 7.100
D2 - A 6.320
D2 - B 6.787
D3 – A 5.638
D3 – B 5.249
CONT. POSIT. - A 6.605
CONT. POSIT. – B 5.640
CONTROLE – A 5.906
CONTROLE - B 5.974
80
6. DISCUSSÃO.
A descoberta da participação bacteriana na formação dos odores bucais
trouxe uma grande contribuição ao estudo da halitose. Os primeiros passos
foram dados com o estabelecimento da cavidade bucal como fonte primária dos
odores do hálito na maioria das situações clínicas encontradas.
Primeiro com os estudos de cultura de saliva total e depois de culturas
com microrganismos isolados, diversas bactérias foram identificadas como
produtoras de substâncias de odor desagradável e como tal, responsáveis pela
formação do mau hálito (LAW, BERG e FOSDICK , 1943; BERG e FOSDICK,
1946; CLEGG e RAE, 1956; PERSSON, CLAESSON e CARLSSON , 1989;
KLEINBERG e CODIPILLY, 1999; KATO et al , 2005).
Neste estudo se utilizou bactérias reconhecidamente relacionadas à
formação de compostos sulfurados voláteis (CSV): Fusobacterium nucleatum,
Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia.
Sabe-se que existe uma maior contribuição das bactérias Gram-negativas
(LOESCHE e KAZOR, 2000; MORITA e WANG, 2001). Embora a bactéria
Peptostreptococcus micros seja Gram-positiva, sua capacidade de produzir
CSV a partir de aminoácidos (L-glutadiona e L-cisteína) foi comprovada por
Carlsson, Larsen e Edlund (1993). Esta constatação demonstrou que várias
espécies bacterianas da cavidade bucal participam na formação de CSV e
apontou para a importância de se pesquisar a ação de antimicrobianos tanto
sobre bactérias Gram-negativas quanto Gram-positivas.
Vale ressaltar que o número total de espécies envolvidas na produção de
CSV ou outras substâncias que participam na formação da halitose é ainda
desconhecido. O trabalho de pesquisa de Persson et al (1990) demonstrou a
81
existência de bactérias bucais até então não classificadas que apresentaram a
capacidade de produzir CSV.
Uma comparação direta entre os resultados encontrados neste estudo
com os resultados de outras pesquisas não poderá ser realizado uma vez que
não conseguimos resgatar na literatura publicada e indexada, estudos que
utilizaram os mesmos extratos fitoterápicos sobre as bactérias aqui estudadas.
Ainda que estudos com as mesmas espécies vegetais e bactérias sejam
citados, devemos considerar que extratos de plantas medicinais apresentam
uma variação na quantidade de seus constituintes. Esta variação pode estar
relacionada com os tipos de métodos de extração e substâncias utilizadas
(RABE e STADEN, 1997; NOSTRO et al, 2000) com a parte da planta utilizada,
variações sazonais durante o crescimento e coleta e ainda provocados pelo
solo e ambiente (REICHLING e SALLER, 1998; ARRIGONI-BLANK et al, 2002).
Especificamente no nordeste do Brasil, Monteiro et al (2006) detectaram
variações na concentração de taninos durante as estações chuvosas e secas
em amostras de aroeira do sertão (Myracroduon urundueva) e angico
(Anadenathera colubrina).
Na Tabela 1 observa-se as variações ao teste de dIfusão quanto a
atividade dos extratos sobre as bactérias utilizadas neste estudo. Quando da
utilização de discos impregnados com agentes antimicrobianos, sabe-se que ao
contato do disco com o meio de cultura, a água é absorvida pelo disco e ocorre
a difusão do agente antimicrobiano. À medida que aumenta a distância a partir
da borda do disco, diminui a concentração do agente antimicrobiano (WINN et
al, 2006). Este conceito é extrapolado para o uso de extratos fitoterápicos
aplicados diretamente sobre o meio sólido. Todavia, não devemos excluir a
82
possibilidade de interações físico-químicas entre o meio de cultura e o extrato
que possam, por exemplo, reduzir a capacidade de difusão dos constituintes do
extrato. Alterações do pH tanto do extrato como do meio podem também
ocorrer. A influencia do pH do meio sobre a atividade antimicrobiana é um fator
considerado relevante nos testes de susceptibilidade antimicrobiana (NCCLS,
2003).
Os resultados na tabela 1 demonstram que a ausência de formação de
halo de inibição não exclui a possibilidade de atividade antimicrobiana. Isto se
considerarmos a ação por contato direto do extrato avaliada pelo cultivo de
material retirado da área sobre o meio de cultura onde foi depositado o extrato.
Por exemplo, não houve crescimento da Prevotella intermedia quando do
cultivo de amostras retiradas da área de contato dos extratos de alecrim,
canela, cravo e macassá, mesmo não havendo a formação de zona de inibição
ao teste de difusão. Por outro lado, mesmo com uma zona média de inibição
de 5 mm produzida pela romã, houve crescimento de Fusobacterium nucleatum
quando o material da área onde foi depositado o extrato sobre o meio de cultura
foi cultivado. Pode-se inferir que estas variações se devam a diferenças de
atividade bactericida ou bacteriostática dos diferentes extratos; ou diferenças
quanto a possíveis interações entre o extrato e o meio de cultura, como
anteriormente mencionadas.
Para os testes de sensibilidade antimicrobiana com substâncias
alopáticas são estabelecidos os padrões de concentração que devem ser
internacionalmente utilizados pelos laboratórios de análises clínicas (CLSI,
2005). Em nosso estudo uma faixa de concentração foi arbitrada para a
realização do teste de microdiluição em caldo.
83
O teste da microdiluição em caldo tem como vantagem a necessidade de
pequenas quantidades de reagentes podendo-se avaliar a atividade de vários
agentes sobre diversos microrganismos. A desvantagem está no tempo
envolvido quando não se utiliza métodos automatizados (WNN et al, 2006). Os
resultados da microdiluição encontrados neste estudo mostram a dinâmica da
interação entre o agente antimicrobiano e as bactérias testadas. Podemos ver,
por exemplo, que o extrato de canela não produziu zona de inibição sobre o
Peptostreptococcus micros ao teste de difusão em agar. Contudo ao teste de
microdiluição este extrato apresentou concentração inibitória mínima com valor
abaixo de 50 µg/ml para esta mesma bactéria. Novamente, devemos considerar
a possibilidade de que o teste em meio líquido permita uma interação entre os
constituintes do extrato e as bactérias que seja diferente daquela que ocorre no
teste em meio sólido.
Podemos então considerar que a ausência de efeito antimicrobiano de
determinado extrato ao teste de difusão em agar deve ser interpretado com
cautela uma vez que este mesmo extrato pode apresentar atividade
antimicrobiana ao teste de microdiluição.
Neste estudo utilizamos a resazurina como revelador do crescimento
bacteriano. Este corante apresenta a vantagem de uma fácil interpretação e já
foi utilizado em testes de atividade antimicrobiana com óleos essenciais e
extratos hidroalcoólicos (MANN e MARKHAM, 1998; UMEH, OLUMA e IGOLI,
2005). A utilização da resazurina nos controles quando adicionada ao meio de
cultura e ao meio de cultura contendo o extrato teste nos permite afirmar que a
presença do extrato não interferiu na leitura utilizando-se o corante. As
84
diferentes colorações observadas nos poços após a adição da resazurina de
fato comprovam a presença ou ausência de atividade microbiana.
O resultado do subcultivo de alíquotas retiradas dos valores de CIM
apresentados na tabela 3 mostra a diversidade da atividade dos extratos
testados sobre os diferentes microrganismos. O crescimento de
microrganismos no subcultivo em meio sólido indica uma ação bacteriostática
enquanto a ausência de crescimento indica uma ação bactericida.
A importância do efeito bactericida ou bacteriostático é ainda motivo de
discussão no tratamento das doenças infecciosas de um modo geral. O órgão
atingido, imunidade do hospedeiro, os níveis séricos da substância, entre outros
fatores, podem ser critérios para a escolha do antibiótico (FINBERG et al,
2004). Para o uso de colutórios, a importância da ação bactericida ou
bacteriostática não é conclusiva. Os testes com agentes antimicrobianos são
em sua maioria voltados para o estabelecimento da CIM em microrganismos
em sua forma planctônica. Em nossa opinião, estes testes têm a sua
importância como um passo inicial na avaliação do potencial antimicrobiano de
novas substâncias.
Existe contudo a necessidade de que sejam desenvolvidos modelos
experimentais que se aproximem ao máximo das condições encontradas na
cavidade bucal. Pratten, Barnett e Wilson (1998) comprovaram o já bem
conhecido efeito refratário dos biofilmes bucais aos agentes antimicrobianos. O
uso de clorexidina a 0,2% sobre um modelo de biofilme durante 1 minuto não
apresentou uma significativa redução no números de bactérias. Uma redução
substancial foi alcançada somente quando o biofilme foi exposto a clorexidina
85
por 60 minutos. Isto demonstra a importância da substantividade do agente
antimicrobiano.
A realização do teste com o sistema de sedimento salivar mostrou a
atividade dos extratos de romã e jucá num ambiente que se assemelha aquele
encontrado na cavidade bucal (KLEINBERG e CODIPILLY, 1999).
A consistência dos extratos de romã e jucá mostrou-se imprópria para o
uso no sistema de sedimento salivar e por isso foram utilizadas diluições a 50%
(D1), 25% (D2) e 12,5% (D3).
Com a exposição do sedimento salivar aos extratos de romã e jucá
observou-se uma menor formação de CSV. Neste estudo, os sedimentos foram
expostos aos extratos em diferentes concentrações e em seguida lavados para
simular a remoção dos extratos que ocorreria na cavidade bucal com a
presença da saliva. Em seguida cisteína foi adicionada aumentando a
disponibilidade de substrato para o metabolismo bacteriano. Podemos então
inferir que a menor formação de CSV observada se deu pela ação
antibacteriana dos extratos. Neste contexto, não devemos deixar de considerar
a importância do pH no sistema de sedimento. Um pH ácido leva a inibição na
formação de CSV. Segundo Kleinberg e Codopilly (1999) as concentrações de
CSV caem acentuadamente com valores de pH em torno de 4,0. Os resultados
da leitura de pH na tabela 6 mostra valores próximos de 4,0 para as diluições
D2 e D3 do estrato de jucá, indicando uma possível influência quanto a
formação de CSV e leitura ao teste organoléptico.
Por outro lado os valore de pH do jucá para a diluição D1 é um valor não
leva a redução de formação de CSV podendo-se então atribuir a menor
formação de odores ao efeito inibitório do extrato sobre as bactérias.
86
Os valores de leitura organoléptica obtidos também mostram a
capacidade de inibição da formação de odores no sistema de sedimento
quando da exposição aos extratos de romã e jucá, quando comparado ao
controle. Ao teste organoléptico são percebidos pelo examinador não somente
os odores representados por CSV, mas também outros odores de outras
substâncias que estão presentes nos odores bucais (GOLDBERG et al, 1994;
KLEIMBERG e CODIPILLY, 1999; CODIPILLY, KAUFMAN e KLEIMBERG,
2004).
A redução do pH pode ocorrer como resultado direto da presença dos
extratos ou por alterações decorrentes da ação sobre diferentes bactérias.
Processos fermentativos relacionados à presença de glicoce no sistema de
sedimento salivar permite um aumento no número de bactérias sacarolíticas o
que reduz o pH. A redução dos odores com origem em outras substâncias
(indol, escatol) medidas ao teste organoléptico pode resultar da maior
degradação de cisteína em relação a outros aminoácidos. Um efeito oposto
pode ocorrer quando ocorre menor degradação de cisteína e um aumento da
degradação de outros aminoácidos (KLEINBERG e CODIPPILY, 1999).
Na tabela 7 que mostra o efeito do extrato de romã sobre o sistema de
sedimento salivar. Podemos ver que para a diluição D2 os valores do teste
organoléptico aumentam enquanto os valores de CSV diminuem nas leituras de
1h e 2h. Como já discutido anteriormente, ao teste organoléptico são
percebidos simultaneamente odores de outras substâncias juntamente com os
CSV.
87
Os dados de CSV obtidos com a leitura pelo Halimeter® sobre sedimento
salivar controle (Tabelas 5 e 7) mostram valores elevados e que representam
clinicamente casos extremos de concentração de CSV na cavidade bucal. Do
mesmo modo estes dados também indicam que a inibição proporcionada pela
exposição do sistema de sedimento salivar ao extrato ocorreu em um meio com
condições ideais para a produção de CSV, dada a adição de cisteína ao
sistema. No estudo in vivo de Liu et al (2006) medidas acima de 75 ppb foram
utilizadas na inclusão dos indivíduos no grupo de portadores de halitose.
Um outro fator precisa ser considerado na avaliação organoléptica que
é a possibilidade da presença de um odor mascarador. O estudo in vivo de
Pitts et al (1983) demonstrou a presença de um efeito mascarador que foi
observado até 30 minutos após o uso de um colutório. Em nosso estudo, não
foram percebidos odores mascaradores apresentados pelos extratos quando da
análise organoléptica do teste com sedimento salivar. A quantidade de extrato
utilizada, o tempo de exposição do sedimento ao extrato e a lavagem do
sedimento explicam a ausência da interferência de odores próprios do extrato.
Os testes de sensibilidade antimicrobiana realizados previamente ao
teste com sedimento salivar também colaboram para a interpretação de que a
redução na formação de CSV foi decorrente do efeito antimicrobiano dos
extratos. Ainda que o sedimento salivar seja composto por um número de
espécies bem maior do que o número testado por difusão e microdiluição,
devemos considerar: A – o possível efeito antimicrobiano sobre outras espécies
produtoras de CSV; B – que o efeito antimicrobiano sobre determinada espécie
leva ao desequilíbrio do meio, impedindo o desenvolvimento de espécies
88
bacterianas produtoras de CSV mesmo que estas não sejam sensíveis ao
agente antimicrobiano presente no extrato.
Bradshaw et al (1998) demonstraram a importância da bactéria
Fusobacterium nucleatum na coagregação bacteriana e observaram que a
presença deste microrganismo facilitou a sobrevivência de Porphyromonas
gingivalis e Prevotella nigrescens quando cultivos contendo estes
microrganismos foram expostos ao oxigênio. O oposto também foi observado
de forma que na ausência de Fusobacterium nucleatum o crescimento destes
outros microrganismos foi perturbado.
Sabe-se que Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola são
frequentemente encontradas em associação na doença periodontal. Estudo in
vitro demonstrou um efeito sinérgico na formação de biofilme quando estes
dois microrganismos foram cultivados em associação. Por outro lado, quando
Treponema denticola foi incubada com Fusobacterium nucleatum ou Tannerella
forsythia, nenhum aumento na formação do biofilme foi observado quando
comparado ao cultivo destes dois microrganismos na ausência da Treponema
denticola (YAMADA, IKEGAMI e KURAMITSU, 2005). Não somente a presença
de determinada bactéria é importante no fenômeno de coagregação, no caso
do envolvimento de Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum.
Estudo utilizando medidas automatizadas com espectrofotometria indicou que a
quantidade de bactérias presentes influência de tal forma o fenômeno de
coagregação que este pode não ocorrer se uma proporção ideal entre o número
de bactérias for alterado (METZGER et al 2001).
A utilização o sedimento salivar de Kleinberg e Codopilly (1999) não
inclui testes para verificação da viabilidade das bactérias após a última medida
89
de CSV. Se considerarmos as interações entre as bactérias descritas
anteriormente, o cultivo para verificação do crescimento e identificação das
bactérias viáveis poderia trazer informações adicionais sobre a influência da
presença do agente antimicrobiano presente no sistema.
A quantificação de polifenóis em produtos de origem vegetal é bastante
utilizada dada a importância destes componentes por suas propriedades
antioxidantes e antimicrobianas. Diferentes métodos são utilizados e na sua
maioria fazem uma equivalência com a quantidade de ácido gálico presente na
amostra estudada (GRAHAM, 1992; SELLAPPAN, AKOH e KREWER, 2002;
LEE et al, 2003; KIM et al, 2003; GIAMPERI et al, 2004; ROMANI et al, 2006;
MILLER et al, 2006). O ácido gálico já foi apontado como o responsável pela
ação antimicrobiana em estudo que realizou avaliação de componentes
isolados da planta Rubus ulmifolius (PANIZZI et al 2002).
Fizemos a opção pelo método Azul da Prússia modificado por Grahan
(1992) que apresenta como vantagem a estabilidade da cor após a adição dos
reagentes e utilizamos os resultados na escolha de dois extratos com as
maiores concentrações de polifenóis para a realização dos testes com
sedimento salivar. Dada a literatura revisada e os resultados encontrados neste
estudo, podemos inferir que o efeito antimicrobiano está relacionado à presença
de polifenóis nos extratos estudados. No entanto não podemos descartar a
participação de outros compostos presentes nos extratos como aminoácidos,
proteínas, ácidos graxos esteróides, entre outros (CARVALHO, 2004).
Não foi objetivo deste trabalho a quantificação de componentes isolados
presentes nos extratos. Não estamos alheios a importância da identificação
destas substâncias quando consideramos o potencial encontrado nos extratos
90
utilizados quanto a sua capacidade de inibição de bactérias produtoras de
CSV. Todavia, este aspecto deve ser considerado tendo-se em vista dois
fatores destacados por Chan (2003) quanto ao uso de produtos de origem
vegetal: substâncias isoladas podem ser demasiadamente tóxicas ou podem
não apresentar atividade terapêutica. Este fenômeno é observado tanto
quando do estudo da atividade antimicrobiana como da atividade antioxidante
dos polifenóis (CHATTOPADHYAY et al, 2002; SEERAM et al, 2005; KUET et
al, 2006).
Verificamos que são poucos os estudos com fitoterápicos na
Odontologia. Seymour (2003) realizou revisão bibliográfica quanto as
propriedades e uso dos óleos essenciais quanto ao seu efeito bactericida, uso
na irrigação em casos de gengivite, bochechos em fase pós-cirúrgica,
manutenção de implantes, redução de bacteremia e redução de bactérias pelo
aerosol das turbinas odontológicas. Em todos os estudos revisados, o
Listerine® foi o colutório contendo óleos essenciais utilizado. Outros estudos
tem surgido nas últimas décadas incluindo, por exemplo, Cymbopogon citratus,
Arnica montana Melaleuca alternifolia, Camelia simensis, e Punica granatum,
como visto na revisão da literatura (SANTOS, 2000; KOO et al, 2000;
HAMMER, 2003; VASCONCELOS et al, 2003; MATSUMOTO et al, 2003).
Observamos que na literatura publicada sobre a abordagem
antimicrobiana com produtos fitoterápicos na halitose, o seu uso em estudos in
vivo está restrito aos óleos essenciais e praticamente aos estudos com
Listerine®. Como exceções temos: o estudo de Koslovsky et al (1996) que não
descreve a composição de um colutório com a combinação água/óleo e o
91
estudo de Rösing, Jonski e RØlla (2002) que não especifica as substâncias de
origem vegetal presentes no colutório testado.
Vimos em nosso estudo Nesta pesquisa vimos que existe um potencial
para a utilização de fitoterápicos no combate a microrganismos relacionados a
halitose. A realização de ensaios clínicos são reconhecidamente os melhores
modelos de estudo (LOESCHE e KAZOR, 2000) e inclusive são exigidos pela
American Dental Association (ADA) para os produtos indicados para o
tratamento da halitose para os quais se solicite a aprovação daquele Conselho
(WOZNIAK, 2005).
De forma geral, o uso de popular de produtos vegetais com finalidade
terapêutica tem seu uso legitimado pela prática do consumo baseado nas
informações acumuladas durante os séculos. Ainda que o uso de plantas
medicinais ocorra como uma prática comum em todo o mundo, as pesquisas
nesta área específica são indispensáveis tanto para a descoberta de novos
medicamentos como para avaliação quanto aos riscos e benefícios destes
produtos (CALIXTO 2000; CAPASSO et al, 2000; WOOLF, 2003;
SPARREBOOM et al, 2004).
Um fato interessante pode ser observado no Brasil. Podemos nos
“alimentar” com extratos de plantas medicinais que têm o seu registro no
Ministério da Agricultura, que compramos nas farmácias, estão acondicionados
em frascos com atomizadores ou sprays, e no rótulo têm a observação:
“ melhor não ingerir nada após o uso”.
O crescente interesse pelos medicamentos de origem vegetal não é um
fenômeno social desvinculado de um forte componente de interesse
econômico. Somente nos mercados dos Estados Unidos e Europa foram
92
alcançados valores em torno de cinco e sete bilhões de dólares no ano de
1999, respectivamente. No Brasil contamos com uma legislação específica
quanto ao uso de produtos fitoterápicos que, não obstante, sofre oposição por
parte de algumas companhias farmacêuticas (CALIXTO, 2000).
Utilizamos modelos in vitro como um passo inicial na investigação de
alguns extratos e demonstramos sua atividade antimicrobiana. Vimos ao teste
de difusão, microdiluição e com a utilização do sistema de sedimento salivar
que os extratos testados apresentam potencial utilidade no tratamento da
halitose uma vez que mostram atividade antimicrobiana sobre microrganismos
diretamente responsáveis pela produção de CSV. Como esses microrganismos
estão envolvidos na doença periodontal e endodôntica, estas áreas da
Odontologia podem também ser beneficiadas. Estudos pré-clínicos e clínicos
precisam ser realizados até que se obtenha o tão necessário binômio eficácia e
segurança.
7. CONCLUSÕES.
Extratos fitoterápicos demonstraram atividade inibitória sobre
microrganismos bucais produtores de compostos sulfurados voláteis e portanto
93
apresentam uma potencial utilidade na abordagem antimicrobiana para o
tratamento da halitose de origem bucal.
Os extratos fitoterápicos de jucá (Caesalpinia ferrea) e romã
(Punica granatum) inibiram a formação de compostos sulfurados voláteis em
um modelo de sedimento salivar mostrando potencial utilização na cavidade
bucal para a redução das principais substâncias relacionadas a halitose de
origem bucal.
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