UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA – ANÁLISES CLÍNICAS

Caracterização molecular da resistência aos carbape nêmicos

em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileir os

Mónica Alejandra Pavez Aguilar

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE Orientadora: Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka

São Paulo

2009

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA – ANÁLISES CLÍNICAS

Caracterização molecular da resistência aos carbape nêmicos

em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileir os

Mónica Alejandra Pavez Aguilar

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE Orientadora: Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka

São Paulo

2009

Mónica Alejandra Pavez Aguilar

Caracterização molecular da resistência aos carbapenêmicos em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileiros

Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka

orientador/presidente

____________________________ 1o. examinador

____________________________ 2o. examinador

São Paulo, _________ de _____.

……Agradeço a Deus, pela minha vida.

Á minha família, na distancia, por apoiar todos meus sonhos. Ao Álvaro por caminhar de meu lado em nossa escolha de vida.

AGRADECIMENTOS

Á professora Elsa Masae Mamizuka, minha orientadora, pelo apoio e dedicação constantes. Minha sincera gratidão. Ao Professor Nilton Lincopan, pela dedicação no desenvolvimento deste trabalho. Minha sincera gratidão Aos professores Luis Salazar e Sergio Bravo Escobar da Universidad de La Frontera, pela constante orientação e apoio na minha formação profissional e científica. Á Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, em nome de seu diretor, Prof. Tit. Jorge Mancini Filho Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, em nome de seu chefe, Profa. Tit. Ana Campa. Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), pela bolsa concedida a partir de Setembro de 2007. Aos professores, funcionários e auxiliares do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Aos centros hospitalares que aportaram as cepas para a realização deste estudo. Hospital Servidor Público de São Paulo, Centro Oncológico Infantil Boldrini de Campinas-SP, Laboratório Médico Análises Clínicas de São Paulo, Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, Hospital da Beneficência Portuguesa, Laboratório Richet de Rio de Janeiro e Laboratório Clínico Endomed Ltda. de São Paulo. Aos diversos laboratórios de rotina e pesquisa que colaboraram na realização deste trabalho. Aos membros da banca de qualificação, Dr. Jorge Sampaio, Dr. Marcelo Brochhi e a Dra. Elsa Masae Mamizuka, pela importante contribuição na realização desta dissertação. As minhas colegas do Laboratório de Microbiologia Clínica, pelo apoio, compreensão e amizade. Aos meus amigos Lara Mendes de Almeida e Carlos Pires, pela revisão do texto e comentários na elaboração deste trabalho.

SUMÁRIO

Pag.

RESUMO.................................................................................................

1

ABSTRACT..............................................................................................

2

LISTA DE ABREVIATURAS.....................................................................

3

LISTA DE TABELAS................................................................................

4

LISTA DE FIGURAS................................................................................

5

1. Introdução ..........................................................................................

6

2. Objetivos .............................................................................................

35

3. Material e Métodos 3.1 Amostras Bacterianas........................................................................ 36 3.2 Condições de cultura......................................................................... 37 3.3 Confirmação fenotípica da resistência............................................... 37 3.4 Análise fenotípica de porinas da membrana externa (OMP)............. 41 3.5 Extração de DNA bacteriano.............................................................. 43 3.6 Confirmação molecular dos determinantes de resistência e estudo do contexto genético..............................................................

44

3.7 Tipagem molecular............................................................................. 48 3.8 Transferência dos genes de resistência............................................

51

4. Resultados 4.1 Estudo da sensibilidade antimicrobiana............................................. 54 4.2 Triagem de β-lactamases................................................................... 58 4.3 Análises das porina (OMP)................................................................ 60 4.4 Confirmação molecular dos genes de resistência............................. 63 4.5 Tipagem molecular............................................................................. 66 4.6 Transferência dos genes de resistência............................................

72

5. Discussão ...........................................................................................

75

6. Conclusões .........................................................................................

94

7. Referências .........................................................................................

96

ANEXOS...................................................................................................

114

1

RESUMO__________________________________________________________ PAVEZ, M. Caracterização molecular da resistência aos carbapenêmicos em enterobactérias isoladas em hospitais brasileiros.125 f. Dissertação (mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo , São Paulo, 2009. Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão : A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. Palavras chaves: Resistência aos carbapenêmicos. β-lactâmicos. Carbapenemases. AmpC. Proteínas de membrana externa (OMPs). Impermeabilidade de membrana.

2

Abstract___________________________________________ ______________

PAVEZ, M. Molecular characterization of carbapenem resistance in enterobacteria isolated in Brazilian hospitals.125p. Dissertation (Master Degree) – School of Pharmace utical Sciences, Universidade de São Paulo , São Paulo, 2009.

Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods : 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results : 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTX-M enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

Key words: Carbapenem resistance, β-lactams, carbapenemases, AmpC, outer membrane proteins (OMPs), membrane impermeability.

3

LISTA DE ABREVIATURAS______________________________ _____________

SENTRY Programa de vigilância epidemiológica

MYSTIC Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection

ESBL β-lactamases de espectro estendido

PBP Proteínas ligadoras de Penicilina

CAZ Ceftazidima

FOX Cefoxitina

IMP Imipenem

Bla Gene β-lactamases

MBL Metalo-β-lactamases

OMP Proteína de membrana externa

CIM Concentração inibitória mínima

UFC Unidade Formadora de Colônia

APB Ácido Fenil-Borónico

PBS Tampão de fosfato de Sódio

PMSF Fenil-Metil-Sulfonil-Fluoreto

SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

LB Luria-Bertani

MR Multiresistência

CS Regiões conservadas

DNA Acido desoxirribonucléico

Tn Transposons

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

IS Seqüência de inserção

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

ATCC American Type Culture Collection

ERIC-PCR Enterobactérial Repetitive Intergenic Consensus PCR

PFGE Electroforese de Campo Pulsado

PCR Reação em cadeia polimerase

ITU Infeção do tratto urinario

4

LISTA DE TABELAS___________________________________ ______________

Tabela 1. Classificação das β-lactamases segundo Bush, Jacoby, Medeiros (1995) e Ambler (1980).................................. p. 17

Tabela 2. Origem de AmpC Cromossômicas e Plasmidiais e taxa de similiraridade dos diferentes grupos a que pertencem ..................................................................... p. 21

Tabela 3. Amostras bacterianas .................................................... p. 36

Tabela 4. Seqüência dos primers, temperatura de anelamento e tamanho de produtos de PCR para a identificação das β-lactamases ................................................................. p. 46

Tabela 5. Primers para a identificação e caracterização de integrons ....................................................................... p. 47

Tabela 6. Sensibilidade antimicrobiana de 28 isolados de Enterobactérias a doze antimicrobianos isolados ou combinados .................................................................... p. 55

Tabela 7. Concentração Inibitória Mínima dos antibióticos β-lactâmicos com e sem a adição dos inibidores EDTA e APB frente as 28 amostras de Enterobactérias ......... p. 57

Tabela 8. Bioensaio e Triagem de β-lactamases nas 28 amostras de enterobactérias ......................................................... p. 59

Tabela 9. Avaliação da presença ou ausência da proteína de membrana externa OMP de 36kDa ............................... p. 62

Tabela 10. Avaliação dos genes de β-lactamases das 28 amostras: carbapenemases, ESBL e AmpC e o tamanho aproximado dos integrons carregados ............ p. 65

Tabela 11. Transformação por choque térmico para os representantes de cada determinate de resistência identificado .................................................................... p. 73

5

LISTA DE FIGURAS___________________________________ ______________

Figura 1 Representação esquemática de um integron de classe 1 ........................................................................ p. 32

Figura 2 Screening AmpC. Teste de dupla difusão e de disco combinado com APB ..................................................... p. 60

Figura 3 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Perfil de Porinas de membrana externa (OMP) ............ p. 61

Figura 4 Eletroforese em gel de agarose dos perfis de amplificação pela técnica de ERIC-PCR ....................... p. 67

Figura 5 Perfil de restrição XbaI de 27 isolados estudados, obtidos pela técnica de PFGE ....................................... p. 68

Figura 6 Diversidade genética mostrada no dendrograma gerados por ERIC-PCR (a) e PFGE (b) das cepas de K. Pneumoniae, E. aerogenes e E. coli provenientes dos diversos centros hospitalares ........... p. 71

Figura 7 Extração de plasmideo dos transformantes .................. p. 74

6

1. INTRODUÇÃO

1.1 Infecções causadas por espécies da Família Enterobacteriaceae

Nas últimas décadas, as bactérias Gram-negativas têm adquirido um papel

importante nas infecções hospitalares, sendo consideradas como um dos

principais agentes etiológicos e um problema para a Saúde Pública devido a sua

prevalência e altos índices de resistência associados à mortalidade. Estudos

multicêntricos realizados pelo SENTRY (programa de monitoramento de

patógenos e resistência em infecções hospitalares e adquiridas na comunidade)

ou MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) têm

destacado a participação de alguns gêneros da família Enterobacteriaceae,

definindo assim os grupos CESP (Citrobacter, Enterobacter, Serratia e

Providencia) e os produtores de β- lactamases de espectro ampliado (ESBL) (i.e.,

Klebsiella pneumoniae, Escherichia. coli) como uma urgência clínica e

epidemiológica (Kiffer et al., 2005; Bell et al., 2007; Jones 2003), porém,

atualmente, novos grupos tem sido definidos para incluir espécies produtoras de

novas β-lactamases adquiridas como as carbapenemases e AmpC plasmidial

(Deshpande et al., 2006a, Deshpande et al., 2006b).

Tanto o SENTRY como o programa MYSTIC têm mostrado que, em

pacientes da unidade de cuidados intensivos na América do Sul, Escherichia coli e

Klebsiella pneumoniae são os agentes mais prevalentes desta família sendo

descritos como segundo e quarto patógenos mais freqüentemente isolados no ano

de 2002, respectivamente, seguidos pelo gênero Enterobacter (Kiffer et al., 2005,

Fedler et al., 2006).

7

Klebsiella pneumoniae é uma importante causa de infecção hospitalar (IH)

principalmente associada à pneumonia decorrente da colonização de pacientes

hospitalizados, diretamente proporcional aos dias de internação, podendo ser

isolada de nasofaringe, mãos e fezes com uma freqüência de 20%, 42% e 77%,

respectivamente (Podschun & Ullman, 1998). No Brasil tem sido relatado que

12,1% – 16,9% das infecções em unidades de cuidados intensivos (UCI) são

causadas por K. pneumoniae (Oplustil et al., 2005; Kiffer et al., 2005), sendo a

segunda enterobactéria mais prevalente depois da Escherichia coli (Sader, et al.,

2004) ocupando o quarto lugar na ocorrência de infecções hospitalares. Por outro

lado, relatos do programa SENTRY têm mostrado que K. pneumoniae está entre

os cinco patógenos mais freqüentes na América Latina, sendo a segunda, terceira

e quarta causa de infecção do trato urinário (ITU), trato respiratório inferior e

septicemias, respectivamente, em pacientes internados em hospitais brasileiros

(Sader, et al., 2001).

Membros do gênero Enterobacter são considerados patógenos emergentes

nas infecções hospitalares, ocupando o terceiro lugar de prevalência na família

Enterobacteriaceae no mundo (Fedler, et al., 2006, Turner 2009). Na América

latina, o gênero Enterobacter ocupa o quinto lugar dentre os patógenos mais

isolados em pacientes pediátricos (Fedler, et al., 2006). Por outro lado, no Brasil,

este gênero é responsável por 6% - 8,5% das infecções hospitalares em pacientes

pertencentes à unidade de cuidados intensivos, sendo a terceira enterobactéria

mais prevalente em infecções do trato urinário, tecidos moles e septicemias

(Sader, 2001).

8

Dentre as enterobactérias, Escherichia coli tem sido a espécie mais

prevalente em infecções hospitalares no mundo ocupando o segundo lugar depois

de Staphylococcus aureus. Contudo, na América Latina, E.coli ocupa o primeiro

lugar na lista dos patógenos mais freqüentes em infecção hospitalar (Fedler et al.,

2006) principalmente associada à ITU (infecção do trato urinário). No Brasil, este

patógeno é responsável por 48% das ITUs; 11,2% das infecções de corrente

sangüínea e 7,2% das infecções de tecidos moles (Sader et al., 2001).

Além da alta prevalência em casos de infecções, a aquisição de

mecanismos de resistência aos novos antimicrobianos tem levado estes

microrganismos, principalmente K. pneumoniae e Enterobacter spp., a alcançar

notoriedade como patógenos causadores de surtos de infecção hospitalar

(Ardanuy et al., 1998). Assim, a seleção de cepas multirresistentes tem

ocasionado o predomínio destas espécies nas infecções hospitalares (Kiffer et al.,

2005). Atualmente, o principal problema é a emergência e disseminação de β-

lactamases de espectro estendido (ESBL), AmpC plasmidiais e a hiperprodução

de AmpC cromossômicas, o que tem restringido o uso de cefalosporinas de amplo

espectro e cefamicinas (Turner, 2009, Deshpande, 2006b).

A freqüência de isolados produtores de ESBL varia muito de região para

região, sendo mais alta na América Latina (Kiffer et al., 2005, Fedler et al., 2006).

Por exemplo, nos Estados Unidos a prevalência de amostras de K. pneumoniae

produtoras de ESBL não ultrapassa 5%, na Europa varia entre 20 e 25 % e na

América Latina a prevalência varia entre 35 e 40% (Fedler et al., 2006).

Apesar de sua alta prevalência, E. coli não apresenta muitos determinantes

de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, principalmente aos carbapenêmicos,

9

o que é confirmado pela baixa porcentagem de isolados resistentes a este grupo

de antibiótico (Deshpande, et al., 2006). De fato, tem sido relatada uma baixa

prevalência de ESBL (< 5 %) nesta espécie (Fedler et al. 2006). Ao contrário, a

freqüência de isolamento de K. pneumoniae produtora de ESBL tem sido

alarmante, principalmente no Brasil, onde alguns estudos têm relatado que a

porcentagem de isolamento desse patógeno é de 50% (Sader et al., 2001).

Além da alta prevalência de ESBL, a presença da enzima AmpC diminui

ainda mais as opções terapêuticas contra estes isolados. A freqüência de isolados

produtores desta enzima tem sido atualmente descrita na Europa em baixa

porcentagem (5,9%), sendo o Enterobacter spp. um exemplo clássico de

hiperprodutor de AmpC cromossomoal (Turner 2009). Em relação à presença de

AmpC plasmidial, Deshpande e colaboradores (2006) reportaram a ocorrência

apenas para E. coli em uma porcentagem de 1,8% (Deshpande, et al., 2006b),

porém, não existem relatos que demostrem a incidência real deste determinante

de resistência.

Desta forma, no tratamento de infecções causadas por enterobactérias

produtoras de ESBL e AmpC, os únicos antibióticos ativos são os

carbapenêmicos, considerados a última alternativa terapêutica, uma vez que

resistem à degradação da maioria das enzimas β-lactamases, incluindo ESBL e

AmpC, apresentam elevada afinidade pelas proteínas ligadoras de penicilina

(PBPs) e uma excelente permeabilidade na membrana externa (Woodford et al.,

2000). Para enterobactérias, índices de sensibilidade têm sido associados a uma

porcentagem de 97% a 100% (Sader, et al., 2004, Deshpande et al. 2006, Turner

2009).

10

Em contrapartida, nos últimos anos, o isolamento de bactérias Gram-

negativas resistentes aos antibióticos carbapenêmicos vem sendo descrito em

diversas partes do mundo (Nordmann & Poirel, 2002). No Brasil, em abril de 2003,

identificou-se o primeiro isolado de metalo-β-lactamase produzida por Klebsiella

pneumoniae (Lincopan et al., 2005), sendo o primeiro relato de diversos isolados

que apresentaram um padrão de resistência similar, mostrando, dessa forma, o

surgimento de novos determinantes de resistência em hospitais brasileiros

(Lincopan et al., 2006, Peirano et al., 2009, Pavez et al., 2008, Zavazcki, et al.,

2009).

1.2 Antibióticos Carbapenêmicos

Os carbapenêmicos são antibióticos β-lactâmicos com amplo espectro de

atividade e desenvolvidos para atender as necessidades médicas na terapia de

doenças infecciosas. Assim como todo antibiótico β-lactâmico, esses agem

inibindo a síntese da parede bacteriana pela sua ligação e inativação das

proteínas ligadoras de penicilinas - PBPs. Estes antibióticos atuam na fase extra-

citoplasmática da síntese da parede bloqueando a transpeptidação, ligação

covalente das cadeias lineares de fragmentos precursores do peptidoglicano

catalisada pelas transpeptidases (também chamadas PBPs). O antibiótico β-

lactâmico é um análogo estereoquímico do segmento ativo das PBPs, o que torna

essas enzimas indisponíveis para o funcionamento, desestruturando a camada de

peptidoglicano da célula bacteriana e predispondo a bactéria à lise celular

(Sampaio, 2007 In. Neto et al., 2007).

11

Nas Enterobactérias, existem diversas proteínas ligadoras de penicilina com

atividade transpeptidase (PBP1a, PBP1b, PBP2, PBP3) e duas com atividade D-

alanina carboxipeptidase (PBP4 e PBP5). O efeito do antibiótico sobre a bactéria

varia de acordo as afinidades do antimicrobiano pelas diferentes PBPs. Os

antibióticos carbapenêmicos inibem a atividade transpeptidase das PBP1a, PBP1b

e PBP2 e a atividade das D-alanina carboxipeptidases PBP4 e PBP5, levando à

formação de um esferoplasto com uma subseqüente plasmólise e morte

bacteriana. Uma diferença dos antibióticos carbapenêmicos dos demais β-

lactâmicos é a pouca afinidade pela PBP3, o que não induz o crescimento

filamentoso septado das bactérias, seguido de uma lenta lise celular (Rodloff

2006). A terapia com imipenem também permite reduzir a quantidade de

lipopolisacarideos liberados durante a lise bacteriana, efeito clinicamente relevante

quando comparado à terapia com ceftazidima. Os pacientes que receberam

imipenem apresentaram níveis menores de endotoxinas e uma tendência à

normalização mais rápida dos níveis de citocinas (Prins et al., 1995).

Os antibióticos carbapenêmicos atualmente usados são o imipenem,

meropenem, ertapenem e, mais recentemente, o doripenem. O imipenem,

primeiro antibiótico carbapenêmico descoberto, apresenta uma estrutura de

amidina derivada da tianomicina com substituições de grupos metila para

incrementar a atividade bactericida e fornecer estabilidade contra as enzimas β-

lactamases. Uma desvantagem desse antibiótico é a sua rápida degradação pela

enzima dehidropeptidase-1 (DHP-1) localizada nos túbulos renais, necessitando,

portanto, da administração combinada com um inibidor de DHP-1 como a

cilastatina em proporção de 1:1. Mais tarde, os antibióticos meropenem e

12

ertapenem demonstraram maior estabilidade para DHP-1, permitindo a

administração sem a cilastatina (Zhanel et al., 2007).

Os antibióticos do grupo dos carbapenêmicos tais como imipenem e

meropenem possuem um amplo espectro de ação in vitro, o que inclui atividade

contra cocos Gram-positivos, bacilos Gram-negativos e bactérias anaeróbias, com

exceção de Enterococcus faecium, Staphylococcus meticilina resistentes e

Stenotrophomona maltophila (Zhanel et al., 2007, Mohr, 2008). O seu uso é

direcionado para uma variedade de infecções, incluindo infecção intra-abdominal

complicada, infecção de pele e partes moles, pneumonia adquirida na

comunidade, pneumonia nosocomial e infecção complicada do trato urinário.

Atualmente, o antibiótico meropenem foi aprovado pelo FDA (US Food and Drug

Administration) para o tratamento de outras doenças além das relatadas, como

meningites bacterianas em crianças maiores de três meses e para a terapia de

febre neutropênica (Mohr 2008). Quanto ao ertapenem, esta droga apresenta um

espectro de ação mais limitado que o imipenem e meropenem, tendo uma

eficiência limitada contra os bacilos Gram-negativos não fermentadores,

principalmente contra Pseudomona aeruginosa, o que restringe seu uso para

tratamentos de infecções adquiridas na comunidade.

Por último, Doripenem, novo antibiótico carbapenêmico que se encontra

em fase final de estudo, combina os espectros de ação de imipenem e

meropenem com uma atividade mais potente contra Pseudomona aeruginosa

(Zhanel et al., 2007).

Os antibióticos carbapenêmicos têm sido considerados terapia de escolha

pela sua estabilidade, espectro de ação e poucos relatos de resistência, além de

13

serem drogas bem toleradas pelos pacientes, sendo os efeitos adversos mais

comuns, complicações no sítio da infusão e toxicidade gastrintestinal (Nicolau,

2008). Na última década, porém, os índices de resistência têm aumentado de

forma proporcional ao seu uso, como uma resposta adaptativa das bactérias e,

muitas vezes, como conseqüência do seu uso indiscriminado (Neto et al., 2007).

1.3. Mecanismos de resistência aos antibióticos car bapenêmicos na família

Enterobacteriaceae

A resistência aos antibióticos carbapenêmicos tem surgido lentamente em

membros da família Enterobacteriaceae, com taxas inferiores a 1% para a maioria

das espécies pertencentes a essa família, mesmo após 20 anos de uso de

imipenem. Porém, esse perfil de sensibilidade está começando a mudar nas

Enterobactérias, pois essas têm desenvolvido sofisticados mecanismos de

resistência contra os antibióticos β-lactâmicos. As três maiores estratégias de

resistência relatadas para os carbapenêmicos são: I) limitação do acesso

intracelular da droga através da sua membrana externa, por meio da

impermeabilidade ao antibiótico associada a uma produção de enzimas de tipo

AmpC e ou ESBL, II) a degradação do antibiótico por meio de enzimas

hidrolisadoras da droga como a produção de carbapenemases do tipo serina e

metalo-β-lactamases, e III) proteção dos alvos da droga por meio da alteração das

PBPs (Davin-Regli et al., 2008).

14

1.3.1. Impermeabilidade de membrana associada à pr odução de enzimas

β-lactamases.

Na família Enterobacteriaceae, a permeabilidade de membrana é a chave

na sensibilidade aos antibióticos. A membrana externa é a primeira linha de

defesa contra compostos tóxicos, na qual o ingresso de substâncias na célula é

controlado pelas porinas de membrana externa (OMPs), proteínas capazes de

formar canais constituídos de água no seu interior, o que permite a difusão

passiva de solutos hidrofílicos através da membrana externa (Nikaido 2003).

As OMPs das bactérias Gram-negativas têm sido classificadas e

caracterizadas segundo a atividade, estrutura funcional e sua regulação e

expressão (Pagès et al. 2008). A primeira caracterização da membrana externa foi

feita em Escherichia coli e serve como padrão de comparação para as OMPs

caracterizadas em diferentes espécies da família Enterobacteriaceae. As

enterobactérias produzem três porinas maiores com importância na resistência

bacteriana: OmpC e seu homólogo OmpK36 de 36 kDa em K. pneumoniae e

Enterobacter spp. e Omp1 em Serratia marcescens, OmpF e seu homólogo

OmpK35 de 35 kDa em Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. e Omp2 em S.

marcescens e, uma terceira proteína, denominada OmpA que atua fracamente na

resistência bacteriana. Estas porinas são caracterizadas como canais de natureza

não específica com leve preferência a cargas positivas (Nikaido 2003, Pagès et

al., 2008).

Diversos estudos clínicos têm demonstrado que a resistência a

antimicrobianos está relacionada com modificações no perfil das OMPs tanto no

tamanho como na redução dos níveis de expressão ou à presença de porinas

15

mutadas. Estas mudanças na proteína têm sido relacionadas à presença de

sequências de inserção no gene que codifica a OMP, o que leva à produção de

proteínas com atividade funcional diminuída, a uma conformação diferente da

porina ou a uma deleção dessa (Doumith, et al., 2009) o que restringe a entrada

do antibiótico, diminuindo assim a sua concentração interna, o que pode conferir a

resistência aos antibióticos β-lactâmicos (Pagès et al., 2008).

A resistência aos antibióticos carbapenêmicos por perda ou diminuição de

expressão da porina tem sido relatada em diversas regiões do mundo e em

diferentes espécies da família Enterobacteriaceae, principalmente em Klebsiella

pneumoniae, Enterobacter spp. e Escherichia coli. A seleção in vivo de mutantes

deficientes de porina são originadas de espécies produtoras de AmpC ou ESBL

que foram expostas a terapias prévias com antibióticos carbapenêmicos (Crowley

et al., 2002, Bradford et al., 1997, Poirel et al., 2004, Kaczmarek et al., 2006,

Palasubramaniam et al., 2007, Pavez et al., 2008, Elliot et al., 2006).

1.3.1.1 Enzimas β-lactamases

A produção dessas enzimas, em geral, é o mecanismo de resistência aos β-

lactâmicos mais prevalente e importante na família Enterobacteriaceae. Diferentes

tipos de β-lactamases já foram descritos e inúmeras tentativas de estabelecer um

sistema de classificação foram propostas. Atualmente, têm sido consideradas

duas classificações (Tabela 1):

- Classificação de Ambler com base na estrutura molecular e na homologia na

seqüência de aminoácidos resultando em quatro grandes grupos, A- ESBL,

16

penicinilases e carbapenemases de tipo serina, B- Metalo-β-lactamase, C- AmpC

ou cefalosporinases, D- Oxacilinases (Ambler 1980).

- Classificação de Bush com base na atividade enzimática resultando em quatro

grupos com vários subgrupos, principalmente no grupo 2, que relaciona substrato

preferencial, características estruturais e propriedades inibitórias (Bush et al.,

1995).

17

Tabela1. Classificação das β-lactamases segundo Bush, Jacoby, Medeiros (1995) e Ambler

(1980).

NOTA: Adaptado de Bush, 2001. ND: Não determinadas

1.3.1.2 Enzimas β-Lactamases de espectro estendido - ESBL

As ESBL pertencem à classe A de Ambler e estão distribuídas no grupo 2

de Bush, são enzimas capazes de hidrolisar a maioria dos β-lactâmicos com

Classificação Bush, Jacoby, Medeiros, 1995

Classificação Ambler, 1980

Características Grupo

Funcional Subgrupos

maiores Classe

molecular

1 C

Enzimas cromossômicas e plasmidiais produzidas por bactérias Gram-negativas.Conferem resistência a todos os β-lactâmicos, exceto carbapenêmicos. Não são inibidas pelo ác. clavulânico.

2 2a A

Penicinilases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus spp.. Conferem altos níveis de resistência à penicilina.

2b A β-lactamases de amplo espectro de bactérias Gram-negativas. Inclui TEM-1 e SHV-1.

2be A

β-lactamases de espectro estendido. Conferem resistência às penicilinas, cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos (ESBLs).

2br A

β-lactamases resistentes aos inibidores de β-lactamases derivadas de TEM (IRT) e uma enzima derivada de SHV.

2c A Enzimas que hidrolisam carbenicilina.

2d D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina). São levemente inibidas pelo ác. clavulânico.

2e A Cefalosporinases inibidas pelo ác. clavulânico.

2f A

Enzimas que hidrolisam carbapenêmicos. Possuem uma serina no seu sítio ativo e são inibidas inibidas pelo ác. clavulânico.

3 3a, 3b, 3c B

Metalo-β-lactamases que conferem resistência aos carbapenêmicos e todos os tipos de β-lactâmicos com exceção de monobactâmicos. Não são inibidas pelo ác. clavulânico.

4 ND Penicilinases miscelâneas não seqüenciadas, não categorizadas em nenhum dos grupos detalhados.

18

exceção das cefamicinas, carbapenêmicos e inibidores (Bush, 2001). Essas

enzimas foram derivadas de mutações nos genes blaTEM-1 e blaSHV-1 que resultam

na substituição de aminoácidos, alterando o substrato específico delas. O primeiro

relato de ESBL ocorreu no ano 1982 em Liverpool, Inglaterra, em uma amostra de

Klebsiella oxytoca (Payne et al. 1990). Atualmente estão descritas mais de 200

ESBL conhecidas (www.lahey.org/studies) e essa alta prevalência epidemiológica

das ESBL é refletida na expansão clonal, sua localização plasmidial e em

repetidos eventos mutacionais (Livermore & Woodford, 2006).

Recentemente, um grupo crescente de enzimas vem contribuindo com a

epidemiologia das ESBL, as β-lactamases de tipo CTX-M. Estas enzimas

apresentam como substrato preferencial a cefotaxima e a ceftriaxona e são

codificadas pelo gene blaCTX-M, localizado em plasmídios (Denton, 2007). Em um

estudo realizado no Rio de Janeiro, Brasil, constatou-se que a enzima CTX-M é a

segunda ESBL mais freqüente entre as espécies da família Enterobacteriaceae,

estando em primeiro lugar, a ESBL do tipo SHV (Bonnet et al., 2000). Ao contrário,

um estudo direcionado para avaliar a freqüência de ESBL em isolados de

enterobactérias causadoras de ITU na comunidade relatou uma baixa freqüência

de amostras produtores de ESBL (1,48%) com um predomínio de TEM > SHV >

CTX-M (Minarini et al., 2007).

1.3.1.3. β-lactamases de tipo AmpC

A expressão de β-lactamase de tipo AmpC tem tido impacto clínico, uma

vez que espécies intrinsecamente produtoras dessa enzima apresentam alta

resistência para a maioria dos antibióticos β-lactâmicos com exceção das

cefalosporinas de quarta geração (e.g., cefepime) e carbapenêmicos, porém,

19

essas enzimas têm contribuído com a seleção de mutantes resistentes ao

imipenem, as quais exibem fraca atividade hidrolítica combinada com uma deleção

de porina do tipo OmpC ou OmpF, consideradas a principal via de ingresso deste

antibiótico na célula bacteriana (Thomson & Smith, 2000, Thomson & Bonomo,

2005). Esta classe de β-lactamases, produzidas exclusivamente por bactérias

Gram-negativas, pertencem ao grupo funcional 1 da classificação de Bush e são

descritas como cefalosporinases não inibidas por ácido clavulânico. Na

classificação de Ambler pertencem ao grupo C (Bush 2001).

A atividade das enzimas do tipo AmpC inclui oxyminocefalosporinas, assim

como, penicilinas e monobactâmicos e algumas dessas enzimas são fracas

hidrolisadoras de imipenem quando expressas em grandes quantidades (Poirel et

al. 2008). A principal diferença quando comparadas às ESBL é que enzimas do

tipo AmpC hidrolisam as cefamicinas (i.e., cefoxitina) como conseqüência da

geometria de seu sítio ativo. As enzimas do tipo AmpC não são sensíveis aos

inibidores de β-lactamases comercialmente disponíveis como o ácido clavulânico,

sulbactam ou tazobactam, porém são inativadas por oxacilinas e inibidas de forma

reversível pelo ácido borônico (Bavuvois, Wouters. In:Bonomo, Tolmasky., 2007).

Inicialmente as β-lactamases de tipo AmpC foram relatadas como enzimas

de origem cromossômica constitutivas para diversas espécies pertencentes à

família Enterobacteriaceae, incluindo Enterobacter cloacae, Enterobacter

aerogenes, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia marcescens, Hafnia

alvei e Escherichia coli, sendo essa última espécie produtora de baixos níveis

basais. A diferença de E.coli produtora de AmpC cromossômica dos demais

membros da família Enterobacteriaceae é que a produção desta enzima constitui

20

uma expressão não induzível. Nos últimos anos, a produção de enzimas de tipo

AmpC tem contribuído com o alto índice de resistência aos β-lactâmicos em

espécies que apresentam altos níveis de expressão constitutiva, devido a uma

derepressão das AmpC cromossômicas ou pela aquisição de AmpC mediadas por

plasmídios (Yagi et al., 2005, Perez-Perez & Hanson, 2002).

As AmpC plasmidiais (AmpCp) surgiram a partir de diversas AmpC

cromossômicas. A primeira AmpCp descrita foi a enzima MIR-1, originada da β-

lactamase AmpC de Enterobacter cloacae. Desde esse primeiro relato, a

descrição de AmpC plasmidial tornou-se mais prevalente (Bradford, et al., 1997).

A classificação das enzimas AmpC plasmidiais está baseada na codificação de

origem cromossômica, diferenciando-se seis grupos com similaridade genética.

Estes grupos incluem ACC (originado de H. alvei), FOX (origem desconhecido),

MOX (origem desconhecido), DHA (originada de M. morganii), CIT (originada de

C. freundii) e EBC (originada de E. cloacae) presentes na tabela 2 (Perez-Perez &

Hanson, 2002).

21

Tabela 2. Origem de AmpC Cromossômicas e Plasmidiais e taxa de similiraridade dos

diferentes grupos a que pertencem.

Grupos (% Similaridade)

Origem bacteriana AmpC cromossômico AmpC plasmidiais

ACC (94,3) Hafnia alvei ACC-1, ACC-2

FOX (94,2) ND FOX-1, FOX-2, FOX-3, FOX-4,

FOX-5

MOX (89,4) ND CMY-1, CMY-8, CMY-9, CMY-10, CMY-11, , MOX-1, MOX-2

DHA (95,7) Morganella morganii DHA-1, DHA-2

CIT (98,6) Citrobacter freundii

LAT-1, LAT-2, LAT3, LAT-4, CMY-2, CMY-3., CMY-4, CMY-

5, CMY-6, CMY-7, BIL-1

EBC (84,2) Enterobacter cloacae ACT-1, MIR-1

Adaptado de Perez-Perez et al. 2002. ND, não determinado.

Os genes de AmpC de origem plasmidial são encontrados majoritariamente

em isolados nosocomiais de K. pneumoniae e E. coli e relatados em diversas

regiões da Europa, Ásia e América do Norte. Na América do Sul, o primeiro relato

de uma enzima AmpC plasmidial ocorreu no ano 1994, na Argentina, isolada de

uma amostra de Klebsiella pneumoniae produtora de FOX-1. Anos depois, foi

relatada a enzima CMY-2 na Argentina e, mais recentemente, identificada em uma

E. coli isolada em São Paulo, Brasil (Gonzalez et al., 1994, Rapaport et al., 2007,

Pavez et al., 2008).

Finalmente, a resistência por impermeabilidade de membrana é atribuída

também ao mecanismo de efluxo, caracterizado pela expulsão da droga do interior

da bactéria como conseqüência de uma hiperexpressão de sistemas de bombas

de efluxo. As bombas de efluxo, associadas à resistência aos antimicrobianos de

22

importância clínica, geralmente pertencem às famílias RND (resistence-nodulation

division) e MFS (major facilitator superfamily) (Piddock, 2006, Davin-Regli et al.,

2008). Este mecanismo de efluxo contribui para a resistência intrínseca e

adquirida em Enterobactérias.

Os sistemas de efluxo são normalmente formados por três proteínas de

membrana: i) bomba de efluxo presente na membrana citoplasmática ii) canal

expulsador presente na membrana externa e iii) proteína de fusão que liga os

outros dois componentes. (Piddock, 2006). Em P. aeruginosa, o sistema Mex tem

sido descrito como mecanismo de resistência a diversos antimicrobianos, entre

eles, ao meropenem. Porém, em enterobactérias, nenhum sistema de efluxo

descrito contribui com a expulsão dos antibióticos β-lactâmicos (Ogawa, 2006).

1.3.2.Carbapenemases

Dentre as diferentes classes de β-lactamases, as carbapenemases

pertencem à família mais versátil pela ampla atividade hidrolítica à maioria dos

antibióticos β-lactâmicos, além de apresentar uma fraca inibição por inibidores de

β-lactamases comercias (Queenan & Bush, 2007).

As carbapenemases pertencem, na sua maioria, a duas classes

moleculares, distinguíveis pela conformação de seu sítio ativo, as

carbapenemases de classe A e as metalo-β-lactamases de classe B de Ambler.

As oxacilinases, β-lactamases de classe D, também hidrolisam antibióticos

carbapenêmicos, porém sua prevalência em Enterobactérias é baixa, sendo

freqüentemente relatadas em Acinetobacter spp. (Gülmez, et al. 2008,Walther-

Rasmussen & Høiby 2007).

23

1.3.2.1 Carbapenemases de classe A

As serino-carbapenemases do grupo funcional 2f de Bush têm aparecido de

forma esporádica nos isolados clínicos, desde a primeira descoberta há 20 anos.

Estas β-lactamases apresentam uma serina na posição 70 de seu sítio ativo e têm

sido detectadas em Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia

marcescens e Klebsiella spp., como isolados únicos ou em pequenos surtos.

As três grandes famílias de serino-carbapenemases de classe A incluem as

enzimas NMC/IMI, SME e KPC que se caracterizam por hidrolisar uma variedade

de antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenêmicos, cefalosporinas, penicilinas

e aztreonam e podem ser inibidas pelo ácido clavulânico e tazobactam. O quarto

tipo de enzima desta classe são as GES, originalmente denominadas como ESBL,

porém as novas variantes descobertas demonstraram uma leve hidrólise de

imipenem (Queenan & Bush. 2007).

Carbapenemases NMC, IMI e SME são enzimas codificadas por genes de

localização cromossômica que apresentam um perfil de resistência para

carbapenêmicos, mas estranhamente são sensíveis às cefalosporinas. Estas β-

lactamases podem ser induzidas em resposta ao uso de imipenem e cefoxitina.

Estes mecanismos têm sido descritos em isolados muito esporádicos,

particularmente em duas espécies de enterobactérias, Serratia marcescens (SME)

e Enterobacter cloacae (NMC e IMI) (Queenan et al., 2006, Pottumarthy et al.,

2003, Rasmussen et al., 1996). Sua baixa prevalência está relacionada com a sua

localização, sem apresentar nenhuma associação com elementos móveis

(Queenan & Bush. 2007).

24

A enzima KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) é a serino-

carbapenemase de maior importância. O primeiro relato dessa enzima ocorreu em

2001 nos Estados Unidos, seu nome refere-se à espécie na qual a KPC-1 foi

identificada, tempos depois uma variante KPC-2 foi descrita em Klebsiella sp e

Salmonella entérica, porém uma recente correção da seqüência KPC-1 indicou

que blaKPC-1 e blaKPC-2 são idênticas (Yigit et al., 2008). Mutações do gene

estrutural da enzima KPC-2 têm resultado em três novas variantes blaKPC-3, blaKPC-

4 e blaKPC-5 (Woodford et al. 2004, Wolter et al., 2008), as quais apresentam

diferentes perfis de hidrólise. As enzimas KPC-2 e KPC-3 são altamente

eficientes em hidrolisar nitrocefin, cefalotina e cefaloridina, porém são menos

eficientes contra carbapenêmicos e cefotaxima (Alba et al., 2005). As enzimas

KPC-5 e KPC-4 apresentam melhor eficiência contra ceftazidima e uma maior

inibição pelo ácido clavulânico, mas a hidrólise de carbapenêmicos é menor do

que em KPC-2 (Wolter et al., 2008).

As enzimas KPCs têm sido freqüentemente encontradas em K.

pneumoniae, porém, depois de uma rápida expansão pela costa da América do

Norte, diversos relatos em diferentes regiões do mundo começaram a aparecer,

sendo identificadas em diversas enterobactérias nos Estados Unidos, Escócia,

Colômbia, China e Israel e transmitidas à Ps. aeruginosa (Yigit et al., 2001,

Villegas et al., 2006, Walther-Rasmussen & Høiby 2007, Villegas et al., 2007). No

Brasil, a produção de KPC tem sido recentemente relatada na cidade do Rio de

Janeiro, Recife e São Paulo, o que confirma uma disseminação desta enzima

pelas Américas (Peirano et al., 2009, Monteiro et al., 2009, Pavez et al., 2009).

25

Estes relatos indicam que os determinantes de KPC apresentam uma

grande capacidade de disseminação, associada a sua localização plasmidial ou à

presença de elementos móveis de resistência. Um estudo realizado por Naas e

colaboradores descreveu uma associação entre KPC-2 e o transposon derivado

do Tn3, identificado como Tn4401, composto por seqüências repetitivas invertidas

imperfeitas de 39pb, um gene de transposase, um gene de resolvase e duas IS

novas denominadas ISKpn6 eISKpn7, além do gene da KPC-2. O Tn4401

apresenta duas isoformas que diferem em uma deleção de 100pb no upstream do

gene estrutural da KPC-2, porém esta deleção não tem afetado a expressão da

enzima. (Naas et al., 2008, Gootz, et al., 2009).

Finalmente, a presença de isolados bacterianos produtores de KPC pode

ser clinicamente subestimada, devido a perfis de resistência categorizados como

sensíveis na presença do gene blaKPC, o que afeta a sensibilidade de detecção

dos métodos convencionais (CLSI, 2009). Na ausência de outro mecanismo que

contribua com a resistência aos antibióticos carbapenêmicos, a concentração

inibitória mínima (CIM) dos isolados para o antibiótico imipenem apresenta apenas

uma sensibilidade diminuída e, em alguns testes fenotípicos, principalmente nos

automatizados, são erroneamente identificados como ESBL. Estas dificuldades

impedem uma boa identificação deste mecanismo, o que pode gerar resultados

equivocados com conseqüências fatais ao paciente (Walther-Rasmussen & Høiby

2007).

As últimas serino-carbapenemases de classe A relatadas são as enzimas

de tipo GES. Esta família contém nove enzimas, das quais apenas quatro GES-1,

-2, -4 e -5 têm alguma atividade mensurável para os carbapenêmicos, porém a

26

atividade carbapenemase de GES-1 é dificilmente reconhecível, sendo

frequentemente considerada como ESBL. Estas β-lactamases hidrolisadoras de

antibióticos carbapenêmicos têm sido relatadas de forma esporádica,

principalmente em P. aeruginosa, no entanto, em 2005 na Coréia foi descrito um

isolado de K. pneumoniae produtora de GES-5 (Walther- Rasmussen & Høiby

2007, Jeong et al., 2005).

1.3.2.2 Metalo-β-lactamases (MBLs)

As MBLs são β-lactamases pertencentes à classe B de Ambler ou classe 3

de Bush, hidrolisam todos os β-lactâmicos, com exceção dos monobactâmicos

(Aztreonam) e são resistentes aos inibidores de β-lactamases, mas sensíveis à

inibição por quelantes. O mecanismo de hidrólise destas enzimas é dependente

de dois íons zinco divalentes no sítio ativo da enzima, o que resulta na sua

característica inibição por EDTA ou compostos derivados do ácido tiólico que tem

a propriedade de quelar o cátion zinco divalente (Queenan & Bush 2007).

As enzimas MBLs são produzidas intrinsecamente por determinados

patógenos, tais como Stenotrophomonas maltophila, Bacillus cereus,

Chryseobacterium meningosepticum, Legionella gormaniie e Aeromonas spp.

(Queenan & Bush 2007). Em contraste a essas MBLs cromossômicas, com uma

prevalência diretamente relacionada à freqüência da espécie, a detecção e

disseminação de MBLs transferíveis ou adquiridas têm aumentado nos últimos

anos. As famílias de MBLs mais comuns relatadas em isolados clínicos incluem

as subclasses VIM, IMP, SPM, GIM e SIM e se encontram relacionadas a um

integron de classe 1, com exceção da SPM-1(Queenan & Bush. 2007, Poirel et al.

2004).

27

Desde o início da década de 90, as MBLs têm sido descritas em patógenos

clinicamente importantes, tais como Pseudomonas spp. Acinetobacter spp.e

membros da família Enterobacteriaceae (Riccio et al., 2000, Poirel et al., 2000,

Yan et al., 2001).

O primeiro relato de MBL adquirida ocorreu em 1994 no Japão, em uma

cepa clínica de S. marscescens, onde foi descrita a subclasse denominada IMP-

1(Osano et al., 1994). Desde então, novas variantes dessa subclasse foram

relatadas em diferentes microrganismos isolados em diferentes regiões

geográficas (Queenan & Bush. 2007). Atualmente, têm sido relatados mais de 20

variantes de IMP (http://www.lahey.org/studies/).No entanto, no continente

americano, a primeira variante IMP, denominada IMP-7, foi descrita por Gibb e

colaboradores em 2002, seguida de outra variante IMP-1, na América Latina,

relatada em 2003 (Gibb et al., 2002, Gales et al., 2003).

A segunda subclasse mais prevalente de MBL associada a integron é

composta pelas enzimas VIM. A enzima VIM-1 foi descrita pela primeira vez em

Verona, Itália e, atualmente, existem 22 variantes descritas dessa enzima isoladas

principalmente em P. aeruginosa (http://www.lahey.org/studies/). A subclasse VIM é

prevalente em países da comunidade européia, entretanto, também tem sido

relatada na Ásia e, mais recentemente, nos Estados Unidos, Chile e Venezuela

(Yan et al., 2001, Toleman et al., 2004, Mendes et al., 2004).

Recentemente, três novas MBLs transferíveis foram descritas. SPM-1 foi

isolada de uma amostra clínica de P. aeruginosa em São Paulo, Brasil (Toleman

et al., 2002). O gene que codifica a SPM-1 está relacionado apenas a espécie P.

aeruginosa, uma vez que essa enzima tem sido detectada apenas nesta espécie,

28

provocando alta mortalidade entre os pacientes hospitalizados no Brasil (Poirel et

al., 2004b, Zavascki, et al., 2005). Análises genéticas das regiões próximas do

gene blaSPM-1 revelaram que esta enzima não é parte de um integron, porém foi

localizada em um plasmídio, associada a regiões comuns que contém um tipo de

estrutura transponível, com uma recombinase em potencial e seqüências

promotoras (Poirel, et al., 2004b).

GIM-1 foi isolada na Alemanha no ano 2002. Esta subclasse de MBL,

localizada dentro de um integron de classe 1, foi isolada de cinco cepas de P.

aeruginosa (Castanheira et al., 2004). Finalmente, a mais nova subclasse de MBL

foi a enzima SIM-1, descrita em 2005, na Coréia em uma amostra de

Acinetobacter sp. (Lee et al., 2005).

Desde seus relatos iniciais, as enzimas MBLs SPM, GIM e SIM têm-se

mantido restritas a seus países de origem. Porém, as enzimas VIM e IMP se

encontram disseminadas geograficamente no mundo, principalmente entre as

espécies de P. aeruginosa e membros da família Enterobactériaceae (Queenan &

Bush. 2007). Na América do Sul, segundo estudos do SENTRY, os isolados

envolvendo MBL têm sido caracterizados pelo predomínio de VIM e SPM, esta

última restrita ao Brasil (Jones et al., 2005 Sader, et al., 2005).

1.3.2.3. Oxacilinases de Classe D (OXA)

As OXA são β -lactamases pertencentes à classe D de Ambler e ao grupo

2d de Bush. Similarmente às carbapenemases de tipo A, as enzimas de tipo OXA-

carbapenemases apresentam resistência às cefalosporinas, monobactâmicos,

penicilinas e carbapenêmicos, porém seu substrato preferencial é a oxacilina e

são fracamente inibidas pelo ácido clavulânico (Danel et al., 1999).

29

O primeiro relato de β-lactamase de tipo OXA ocorreu em 1993 no Reino

Unido, isolada de uma amostra de Acinetobacter baumanii produtora da enzima

ARI-1, hoje conhecida como OXA-23. Atualmente, existem 121 variantes de β-

lactamases de classe D, das quais 45 apresentam uma atividade hidrolítica frente

aos carbapenêmicos, denominadas OXA-carbapenemases (Walther & Høiby.

2006). A grande maioria das OXA hidrolisadoras de carbapenêmicos, até o

momento, foram encontradas em espécies não pertencentes à família

Enterobacteriaceae, principalmente em Acinetobacter baumanii.

No entanto, uma OXA-carbapenemase denominada OXA-48 foi identificada

em K. pneumoniae na Turquia em 2001 (Poirel et al., 2004c) com alta atividade

contra os carbapenêmicos. Essa enzima é codificada por genes inseridos em

plasmídio. Embora a disseminação desta enzima tenha sido restrita a surtos na

Turquia, recentemente, sua presença foi descrita também na Bélgica (Carrër et al.,

2008, Cuzon et al., 2008).

1.3.3. Alteração das PBPs

As PBPs são sítios alvos para atividade dos antibióticos β-lactâmicos. A

resistência a estes antimicrobianos pela alteração no sítio de ligação do antibiótico

(PBPs) é pouco pesquisada devido às dificuldades no seu estudo. Este

mecanismo já foi demonstrado em Haemophilus influenzae e em Escherichia coli,

nas quais a modificação da PBP3 foi associada à resistência à cefalexina e outras

cefalosporinas (Mendelman et al., 1990).

Resistência aos carbapenêmicos, relacionada com a alteração de PBPs,

tem sido escassamente relatada em enterobactérias, sendo descritas apenas em

30

Proteus mirabilis conferindo-lhe uma sensibilidade reduzida ao imipenem atribuída

a dois fatores: i) a diminuição na expressão da PBP-1A e ii) queda na afinidade da

PBP-2 para o antibiótico (Neuwirth et al., 1995). Porém, a presença desse

mecanismo não pode ser descartada pela possibilidade da sua contribuição na

emergência de resistência.

1.4. Contexto genético de aquisição e disseminação de determinantes

de resistência aos carbapenêmicos

A aquisição de genes necessários para a resistência aos antimicrobianos é

atribuída a uma variedade de sistemas de transferências de genes, tais como

plasmídios conjugativos, transposons e integrons (Bennett, 2008).

Os elementos genéticos móveis podem ser classificados em:

i) elementos que se movem de uma bactéria a outra, denominados plasmídios

conjugativos ou elementos de transferência horizontal e ii) elementos que se

mobilizam no genoma de uma mesma célula através de recombinação por meio

dos transposons, denominados genes cassete (Bennett, 2008).

Na ultima década, tem sido demonstrado que uma parte significativa dos

genes de resistência presentes nos plasmídios encontram-se inseridos nos

integrons (Hall & Collis 1998). Estes elementos contêm diversos genes que

conferem resistência a uma variedade de antibióticos, (e.g., aminoglicosídeos, β-

lactâmicos e sulfas) conferindo o fenótipo de multiresistência (MR) (Jacoby &

Munoz-Price, 2005).

Os integrons são elementos potencialmente móveis que contêm um sistema

de recombinação sítio específico capaz de integrar e expressar os genes contidos

31

nas estruturas do cassete. O integron é constituído por regiões conservadas (CS)

localizadas em cada uma de suas extremidades (Figura 1). A extremidade 5CS é

composta por três elementos: 1) o gene da integrase, o qual codifica uma

recombinase sítio específico, 2) um sítio de recombinação attl, reconhecido pela

integrase, que atua como receptor e integrador dos genes cassete e 3) um

promotor denominado Pant, constituído por duas seqüências de seis bases nas

posições -35 e -10 intercaladas por 17 pb. Este promotor regula a expressão dos

genes de resistência que compõem o integron (Leverstain-van Hall et al., 2002,

Partridge et al., 2002). Alguns integrons de classe 1 podem também apresentar

um segundo promotor, localizado em posição subseqüente de Pant. (Figura1)

(Leverstain-van Hall et al., 2002).

32

Figura 1. Representação esquemática de um integron de classe 1. NOTA: As setas representam os genes do integron e o sentido da transcrição dos genes.; O segmento conservado 5CS, com seus três elementos: Integrase Intl1, o sitio de recombinação attl e o promotor Pant com as seqüências localizadas nas caxas -35 e -10. No gene cassete é representado o sitio de recombinação especifico attC. O segmento conservado 3CS com os genes quacE∆1 e sul 1.

A extremidade 3CS é geralmente composta de um gene quacE∆1 que

confere resistência a compostos de amônio quaternário, seguido pelo gene sul1

que confere resistência a sulfonamidas. Ao final da extremidade 3CS, dois outros

genes podem ser designados, o orf5 e orf6. As extremidades CS flanqueiam uma

região variável que contém os genes cassete de resistência (Bennett 2008).

Os genes cassete inseridos no integron têm normalmente entre 500 a 1000

pb e apresentam características estruturais específicas, contendo um gene de

resistência e um sítio de recombinação de 59 pb reconhecido pela integrase,

denominado attc (Mazel 2006). Genes cassete podem ser encontrados como parte

do conteúdo genético de um integron ou com a sua forma circular livre, porém

33

incapazes de promover sua mobilização ou replicação. Também não possuem

promotores, portanto, sua expressão gênica e mobilização são dependentes do

integron, especificamente da integrase (Mazel 2006).

Atualmente, os genes cassete conhecidos conferem resistência aos

aminoglicosideos, penicilinas, cefalosporinas, trimetoprim, cloranfenicol,

rifampicina, eritromicina e carbapenêmicos. Este último antibiótico, devido ao fato

de os genes codificadores de MBL estarem localizados nestes elementos

(Leverstain-van Hall et al., 2002).

Existem cinco classes de integrons, sendo o integron de classe 1

freqüentemente relatado em isolados clínicos, principalmente em amostras

produtoras de MBL. A integrase do integron classe 1 é codificada pelo gene intl1 e

possui como substrato dois sítios de ação, o attl e attc. Sendo assim, esta enzima

promove o rearranjo dos genes cassete (Partridge et al., 2000).

Devido a sua incapacidade de mobilização própria, os integrons estão

associados a transposons para o seu movimento. O integron de classe 1 está

associado a transposons derivados de Tn402.

O integron de classe 2 está exclusivamente relacionado a transposons

derivados de Tn7, porém este integron tem sido associado a poucos genes

cassete, daí sua menor contribuição aos mecanismos de resistência. Esta ação

limitada pode estar vinculada ao gene da integrase intl2, o qual contém uma

mutação sem sentido no códon 179 que codifica uma proteína defeituosa (Hall &

Collis, 1998).

Recentemente, uma nova terminologia “integron classe 1 complexo” tem

sido introduzida para descrever um elemento genético que associa o integron de

34

classe 1 com outra região variável, que pode acomodar vários genes incluindo

blaCMY, blaCTX, variantes de qnrA, dfrA, seguido por uma repetição da região 3CS

(Toleman, et al., 2006). Esses elementos genéticos são denominados ISCR

(insertion sequence common region) e derivam das seqüências de inserção (IS)

IS91, IS801 e IS1294 (Bennett, 2008).

Finalmente, no Brasil, a resistência ao imipenem e aos demais antibióticos

carbapenêmicos constitui um importante desafio no tratamento de infecções

hospitalares causadas por bactérias multiresistentes, o que é considerado uma

urgência clínica e epidemiológica. Ao contrário dos dados publicados em estudos

multicêntricos realizados no Brasil, o fenótipo de resistência em isolados clínicos

de Klebsiella pneumoniae parece estar mudando, já que cepas que se

consideravam sensíveis ao imipenem, infelizmente surgiram provocando fracassos

terapêuticos com altos índices de mortalidade (Lincopan et al., 2006).

Elucidar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos incluindo sua

mobilização genética é o primeiro passo para garantir um controle epidemiológico

efetivo para este tipo de isolado, assim como sua associação com surtos fatais,

particularmente em pacientes com baixa imunidade.

35

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Caracterizar os mecanismos de resistência aos antibióticos

carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras de

enterobactérias resistentes ao imipenem isoladas em diversos hospitais.

2.2. Objetivos específicos:

2.2.1. Identificar fenotípica e genotipicamente os determinantes de resistência aos

carbapenêmicos.

2.2.2. Identificar os principais mecanismos de resistência envolvidos nas amostras

estudadas.

2.2.3. Identificar elementos de mobilização e sua associação com genes de

resistência aos antibióticos carbapenêmicos por meio da localização dos integrons

de classe 1.

2.2.4. Investigar a diversidade genética dos isolados resistentes aos antibióticos

carbapenêmicos por meio de tipagem molecular, utilizando-se as técnicas de

ERIC-PCR e PFGE.

2.2.5. Caracterizar a mobilização dos determinates de resistência para os

carbapenêmicos por técnicas de conjugação e transformação.

36

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Amostras bacterianas

Foram estudados 28 isolados clínicos de enterobactérias, sendo 12

Klebsiella pneumoniae, 11 Enterobacter aerogenes, 4 Escherichia coli e 1

Enterobacter gergoviae, todos previamente identificados como imipenem

resistentes (Tabela. 3), obtidos de diversos materiais clínicos e coletados em oito

centros hospitalares do Brasil no período de 2003 a 2008.

Tabela 3. Amostras bacterianas

Nº Interno

Identificação bacteriana

Centros Hospitalares

Amostra clínica

Data de isolamento

Kp-1 K. pneumoniae LAMAC Secr.abdominal Maio 2005 Eg-2 E. gergoviae HC urina Março 2005 Kp-3 K. pneumoniae COB sangue Março 2007 Ea-4 E. aerogenes LAMAC sangue Junho 2007 Ea-5 E. aerogenes LAMAC urina Março 2007 Kp-9 K. pneumoniae HU sangue Março 2003 Kp-11 K. pneumoniae HSPE sangue Fevereiro 2005 Kp-12 K. pneumoniae HSPE sangue Novembro 2005 Kp-13 K. pneumoniae LCE sangue Maio 2005 Kp-14 K. pneumoniae LAMAC Secr.abdominal Maio 2006 Kp-15 K. pneumoniae COB sangue Março 2007 Kp-16 K. pneumoniae LR sangue Junho 2005 Ea-18 E. aerogenes LAMAC urina Julho 2007 Ea-20 E. aerogenes LAMAC urina Maio 2007 Ea-21 E. aerogenes LAMAC urina Abril 2007 Kp-22 K. pneumoniae COB sangue Março 2007 Ea-23 E. aerogenes HSPE urina Maio 2007 Ea-25 E. aerogenes HSPE urina Maio 2007 Ea-34 E. aerogenes HSPE sangue Outubro 2007 Ec-1 E.coli HBP sangue Julho 2007 Ec-2 E.coli HBP sangue Julho 2007 Ec-3 E.coli HBP sangue Agosto 2007 Ec-4 E.coli HBP cateter Agosto 2007

Kp-35 K. pneumoniae LAMAC sangue Novembro 2007 Ea-36 E. aerogenes LAMAC sangue Novembro 2007 Ea-37 E. aerogenes LAMAC sangue Novembro 2007 Kp-38 K. pneumoniae HBP Liq.ascítico Janeiro 2008 Ea-39 E. aerogenes HBP urina Janeiro 2008

NOTA: Kp: Klebsiella pneumoniae , Eg: Enterobacter gergoviae, Ea:Enterobacter aerogenes, Ec: Escherichia coli, LAMAC: Laboratório Médico Análises Clínicas São Paulo SP, HC: Hospital das Clinicas FMUSP - São Paulo, COB: Centro Ontológico Infantil Boldrini, Campinas SP, HSPE: Hospital Servidor Público Estadual, São Paulo, LCE: Laboratório Clínico Endomed Ltda. São Paulo, LR: Laboratório privado Richet R.J.., HBP: Hospital Beneficência Portuguesa SP.

37

Como controles de qualidade nos testes de sensibilidade foram utilizadas

as cepas padrão Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e Escherichia coli ATCC

25922. Para o controle da produção de MBL foram utilizadas P. aeruginosa 48-

1997A produtora de SPM-1 , Enterobacter cloacae 75-10433 produtora de VIM-1,

K. pneumoniae Br-1 produtora de IMP-1, obtidas da Escola Paulista de Medicina

UNIFESP e da FCF-USP.

3.2 Condições de cultura

As amostras e cepas de referência foram semeadas em 2 mL de caldo

Müller-Hinton e incubadas a 37°C por 24 horas sob a gitação constante em shaker

rotativo à 150 rpm, sendo em seguida cultivadas em ágar Mac Conkey com disco

de imipenem de 10 µg e incubadas por 24 horas em estufa controlada a 37°C. As

culturas desta semeadura foram utilizadas para a extração de DNA e para sua

preservação a -20º C com 20% de glicerol.

Todas as culturas para a realização dos testes fenotípicos foram feitas em

estufa microbiológica controlada a 37º C, durante 18 a 22 horas.

3.3 Confirmação fenotípica da resistência

3.3.1 Teste de sensibilidade a antimicrobianos

Foram realizados os antibiogramas utilizando o método de Kirby-Bauer,

estabelecido pelo CLSI 2006, para obter o perfil de resistência aos antibióticos

gentamicina, amicacina, imipenem, ertapenem, meropenem, ceftazidima,

amoxicilina/ácido clavulânico, ceftriaxona, aztreonam, cefepime,

38

piperacilina/sulbactam, cefoxitin, ciprofloxacino e trimetoprim (OXOID, Cambridge,

UK) (CLSI 2006a). Os testes de concentração inibitória mínima (CIM) foram

realizados pela técnica de diluição em ágar, seguindo as padronizações

estabelecidas pelo CLSI para os antibióticos β-lactâmicos de interesse como

imipenem, meropenem, ertapenem, cefoxitina e ceftazidima ( CLSI 2006b).

Os agentes antimicrobianos foram testados em uma faixa de concentração

entre 0,03 – 512 µg/mL. As diluições seriadas foram realizadas a partir de uma

solução estoque em tubos contendo 19 mL de ágar Mueller-Hinton (Merck,

Darmstad- Alemanha) previamente esterilizados e estabilizados a uma

temperatura entre 45º a 50ºC. Uma vez estabilizados, 1 mL da solução do

antimicrobiano com concentração 20 vezes superior para cada diluição testada foi

adicionado aos 19 mL de ágar Mueller- Hinton. Após homogeneização, o conteúdo

foi depositado em placas de Petri estéreis de 90 x 15 mm.

Para cada amostra, 10 µL de cultura crescida overnight foram cultivados em

2 mL de caldo Mueller-Hinton (DIFCO, Lawrence, KS. USA) e incubadas a 37º C

durante duas a três horas para atingir uma turbidez equivalente a 0,5 na escala de

MacFarland na fase de crescimento exponencial da bactéria, a qual foi confirmada

no espectrofotômetro Spectronic 20 (ThermoSpectronic, Rochester, NY, USA) a

uma absorbância entre 0,8 e 1,0 em um comprimento de onda de λ 625 nm. Este

método de crescimento foi utilizado para todos os testes fenotípicos.

Para o teste de diluição em ágar, a suspensão bacteriana já atingida com

turbidez equivalente ao 0,5 da escala de Mcfarland foi diluída em caldo Mueller-

Hinton estéril na proporção 1:10, resultando em um inóculo de aproximadamente

107UFC/ml. A seguir, 300 µL dessa suspensão foram transferidos para o

39

inoculador de Steers. Desse modo, 1 a 3 µL de cada amostra foram inoculados

simultaneamente em ágar Mueller-Hinton com uma concentração bacteriana final

de 104 UFC/mL (CLSI 2006b) e as placas incubadas por 18 a 20 horas. A CIM foi

definida como a menor concentração de cada antimicrobiano capaz de inibir o

crescimento bacteriano e foram interpretadas de acordo com os critérios de

sensibilidade estabelecidos pela CLSI para a família Enterobacteriaceae (CLSI

2008).

A determinação da CIM também foi realizada com inibidores de β-

lactamases. Como inibidor de AmpC foi utilizado o ácido Fenil-Borônico (APB)

(SIGMA-Aldrich, Stenheim, Alemanha) em uma concentração fixa de 400 µg/mL

para os antibióticos cefoxitina, ceftazidima e imipenem (Coudron 2005). Para a

inibição das MBLs foi utilizado o quelante EDTA (Merck, Darmstad, Alemanha) em

uma concentração fixa de 320 µg/mL, apenas com o antibiótico imipenem

(Arakawa et al., 2000).

3.3.2 Triagem de β-lactamases

Para confirmação fenotípica, os isolados imipenem resistentes foram

submetidos ao bioensaio de acordo com o protocolo descrito por Lincopan, et al.,

2005 para demonstrar a hidrólise do imipenem. Foram preparadas quatro placas

de Petri (150 x 15 mm), sendo duas sem o antibiótico e duas com 0,06 e 0,12

µg/ml de imipenem, respectivamente. A cepa indicadora Micrococcus luteus

ATCC 9341 foi suspensa em caldo Mueller-Hinton utilizando o mesmo método de

crescimento descrito nos testes de sensibilidade. Após atingir a escala 0,5 de

Mcfarland, a cepa foi semeada nas placas com antibiótico e em outra sem para

controle de crescimento. As culturas bacterianas que atingiram a turbidez

40

correspondente à escala 0,5 de Mcfarland foram inoculadas sobre a superfície das

placas com antibiótico previamente inoculadas com cepa indicadora de M. lateus

e, na quarta placa livre de antibiótico, empregada como controle de crescimento.

As culturas foram incubadas por 18 a 20 horas a 37°C (Lincopan et al., 2005).

A triagem para a produção de MBL foi realizada mediante sinergismo com o

teste de dupla difusão com disco seguindo-se as recomendações do CLSI 2006

para os métodos de disco difusão. As amostras bacterianas suspendidas em caldo

Mueller-Hinton, ao atingir a escala 0,5 de Mcfarland, foram semeadas em ágar

Mueller-Hinton. Os discos contendo imipenem (10 µg) e ceftazidima (30 µg) foram

alinhados a uma distância de dois cm de cada disco de filtro branco contendo 5 µL

de cada um dos inibidores enzimáticos: EDTA (0.5 M), ácido 2-mercaptoacético e

acido 2-mercaptopropiônico, ambos em uma solução não diluída (Arakawa et al.,

2000, CLSI 2006a).

Para avaliar a presença de ESBL foi feita uma triagem por meio do teste de

dupla difusão com disco utilizando-se como substrato ceftazidima (30 µg),

cefotaxima (30 µg), ceftriaxona (30 µg) e aztreonam (30 µg). Os discos contendo

antibióticos foram alinhados a uma distância de dois cm de um disco único com o

inibidor ácido clavulânico em uma concentração de 4 µg/mL (Pellegrino et al.,

2006). Por último, para a triagem de AmpC, foram utilizados os métodos de dupla

difusão com disco e a técnica de disco combinado descrito por Coudron no ano

2005. Para o teste de dupla difusão com disco, os antibióticos ceftazidima (30 µg)

e cefoxitina (30 µg) foram alinhados com uma distância de 2 cm do disco de papel

filtro contendo o inibidor APB em uma concentração de 400 µg. No método de

41

disco combinado, 20 µL de uma solução de APB (20 mg/mL) foram inoculados

sobre os disco de ceftazidima (30 µg) e cefoxitina (30 µg) (Coudron, 2005).

3.4 Análises fenotípica de porinas de membrana exte rna

3.4.1 Extração de porinas da membrana externa

Células bacterianas crescidas overnight foram cultivadas em 120 ml de

caldo BHI. Após incubação de 20 horas foram concentradas por centrifugação a

2.300 g por 15 minutos. O sedimento foi ressuspenso em 1,5 mL de tampão

fosfato de sódio (PBS) a 10 mM, pH 7,0, acrescido com o inibidor de protease

fluoreto fenil-metil-sulfonila (PMSF) na concentração de 1mM e as células foram

rompidas com o auxílio de um sonicador (Sonifier 450 Bronson-USA) utilizando-se

3 pulsos de 1 minuto cada, com intervalos de 1 minuto de resfriamento em banho

de gelo entre cada pulso para preservação das proteínas. Os restos celulares

foram removidos por meio de centrifugação a 1.800 g durante 15 minutos e o

resultado do sobrenadante foi submetido à ultra centrifugação a 30.000 rpm

(Sorvall®. Ultraspeed Centrifuge Pro 80. USA) durante 120 minutos a 4°C para a

coleta das frações de membrana. O sedimento resultante foi resuspendido em 150

µL de solução tampão PBS 10mM (pH 7) acrescido de PMSF 1mM; 100 µL deste

volume final foi tratado com 800 µL de solução de sarcosil a 2% por 20 minutos à

temperatura ambiente. Finalmente, a membrana externa foi obtida após a última

centrifugação com rotação de 16000 g durante 60 minutos a 4ºC. O sobrenadante

foi descartado e o pellet ressuspenso em 50 µl de solução tampão PBS 10mM (pH

7,0) acrescido de PMSF 1mM e mantido sob refrigeração (4ºC) durante 24 horas

42

para solubilização. O produto da extração foi estocado a -20º C para posterior

análise por SDS-PAGE (Achtman et al., 1983; Fumg-Tonc, 1995).

3.4.2 Análise das porinas de membrana externa

A análise das proteínas de membrana externa foi realizada por meio de

eletroforese SDS-PAGE. O material obtido da extração conforme descrito

anteriormente foi preparado segundo a metodologia de Laemmli para sua análise.

As proteínas de membrana externa foram levadas à fervura por 10 minutos com

tampão de amostra (Tris-HCl 0,5M, SDS 10%,Glicerina 20% e azul de bromofenol

0,01%) previamente acrescido de 20 µL de beta-mercapto-etanol (Laemmli, 1970).

As proteínas extraídas das amostras foram aplicadas nos géis de dodecil sulfato

de sódio contendo 12% de acrilamida no gel de separação e 5% no gel de

empilhamento em um volume de 10 µL de amostra por poço e corridas a 70V

durante 30 minutos, tempo estimado de passagem pelo gel de empilhamento,

sendo depois ajustado para 120V durante 1 h e 30 minutos. Após a eletroforese, o

gel foi corado durante duas horas com Coomassie blue (Brilliant Blue 0,1%, 25%

metanol, 5% ácido acético) e descorado com ácido acético a 10%.

Como controle foram utilizadas as cepas de Klebsiella pneumoniae

ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 25922 e Escherichia coli K12, conhecidas

previamente como sensíveis ao imipenem (cepas portadoras das porinas de 35 e

36 kDa). O peso molecular das respectivas proteínas de membrana foi estimado

empregando-se padrão de massa molecular (SM#0431 Unstained Protein

Molecular Weigth marker, Fermentas®, Burlington, Canadá). Paralelamente, a

identificação do gene responsável pela expressão da proteína foi realizada por

43

PCR utilizando-se os primers OmpC Fw: 5-GTTAAAGTACTGTCCCTCCTG-3 Rw:

5-GAACTGGTAAACCAGACCCAG-3 descritos previamente (Poirel et al., 2004).

3.5. Extração de DNA bacteriano

Para a extração do DNA total foi utilizado o método da fervura descrito por

Lincopan, et al., 2005. A partir de uma cultura overnight em caldo LB, alíquotas de

1 mL foram submetidas a centrifugação durante 1 minuto a 16.000 g, o

sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100 µL de água,

milli-Q, estéril. Posteriormente, a suspensão celular foi fervida durante 10 minutos

e mantidos num banho de gelo por outros 5 minutos. Finalmente, após 15 minutos

de centrifugação a 7500 g, 100 µL de cada sobrenadante foi transferido para um

microtubo estéril e congelado a - 20 ˚C (Lincopan et al. 2005). Foi realizada uma

reação de amplificação por PCR para o gene 16s, como controle das

amplificações do DNA.

Para extração do DNA plasmidial, foi utilizado o método de lise alcalina de

Birnboim-Dolly (1979). A partir de 3 mL de cultura overnight em caldo LB,

alíquotas de 0,5 mL foram submetidas à centrifugação de 9000 g por 15 s, o

sobrenadante foi removido cuidadosamente e o sedimento resuspenso em 100 µL

de solução I (glicose 50mM, Tris-HCl 25mM, EDTA 10Mm, Lisozima 20mg/mL).

Após incubação a 0°C por 30 min foram adicionados 2 00 µL da solução II (0.2N

NaOH, SDS 1%) e misturados cuidadosamente em vórtex, após 5 min de

incubação a 0°C, 150 µL da solução III (Acetato de sódio 3M, pH4,8) foram

adicionados e misturados por inversão para a precipitação do DNA cromossômico.

O tubo foi incubado a 0°C por 60 min. Após a centri fugação a 9000 g por 5

44

minutos, 400 µL do sobrenadante foram transferidos para um novo microtubo e

precipitados com 1 mL de etanol gelado. Após uma incubação a -20°C por 30 min,

o precipitado foi colectado por centrifugação a 9000 g por 2 min. Posteriormente, o

sedimento foi resuspenso em 100 µL de acetato de sódio 0,1M/Tris 0,05M e

novamente precipitado com 200 µL de etanol gelado e incubado a -20°C por 10

min para ser coletado por centrifugação. Esta etapa foi repetida mais uma vez

para, finalmente, o sedimento ser suspendido em 40 µL de água milli-Q (Birnboim-

Doly, 1979).

Para controlar a eficiência da extração de DNA plasmidial, foi utilizada a

cepa E. coli 39R861 com plasmideos conhecidos. A concentração do DNA

plasmidial foi quantificada utilizando-se Nanodrop (NanoDrop® Technologies INC,

Wilmington, DE, EUA).

3.6 Confirmação molecular dos determinantes de resi stência e estudo do

contexto genético

A confirmação genotípica de β-lactamases foi realizada pela técnica da

reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers específicos para

amplificar os genes de MBL: blaIMP-1, blaIMP like, blaVIM like e blaSPM,

carbapenemases: blaKPC , ESBL: blaTEM, blaSHV e blaCTX e AmpC: FOX, DHA-1,

DHA-2, DHA-2, CMY-1, CMY-2, ACT-1 e MIR/ACT. Os ensaios de PCR foram

realizados no termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Applied Byosistems,

Foster City, EUA). As condições de corrida foram: desnaturação de 94ºC por 10

min, 30 ciclos de 94ºC por 30 s, 52ºC por 30 s. e 72ºC por 30 s. seguidos de uma

45

extensão final de 72ºC por 5 min. As seqüências dos iniciadores, tamanho dos

produtos e a temperatura de anelamento otimizadas esão descritos na tabela 4.

46

Tabela 4. Seqüência dos primers, temperatura de ane lamento e tamanho de produtos de PCR para a identificação das β-lactamases .

Primers Genes alvo Seqüências (5’-3’) Tº de

anelamento

Tamanho do

amplicon Referência

Carbapenemases IMP-1 Fw

blaIMP-1 like CTACCGCAGCAGAGTCTTTGC

50ºC 590 pb Loli, et al,.

2006 IMP-1 Rv GAACAACCAGTTTTGCCTTACC

IMP Fw blaIMP like

GGAATAGRRTGGCTTAAYT 50°C 232 pb

Balsalobre,

et al., 2009 IMP Rv GGTTTAAYAAARCAMCCACC

VIM Fw blaVIM like

GTTTGGTCGCATATCGCAAC 40ºC 590 pb

Balsalobre,

et al., 2009 VIM Rv GAGCAAKTCYAGACCGCCC

SPM-1 Fw blaSPM-1

CCTACAATCTAACGGCGACC 50ºC 648 pb

Gales, et al.,

2003 SPM-1 Rv TCGCCGTGTCCAGGTATAAC

KPC Fw blaKPC like

TGTCACTGTATCGCCGTC 58ºC 1009 pb

Tenover,

et al., 2006 KPC Rv TCAGTGCTCTACAGAAAACC

ESBL SHV Fw

blaSHV like ATGCGTTATATTCGCCTGTG

52ºC 862pb Jiang,

et al., 2006 SHV Rv GTTAGCGTTGCCAGTGCTCG

TEM Fw blaTEM like

ATGAGTATTCAACATTTCCGTG 52ºC 861pb

Jiang,

et al., 2006 TEM Rv TTACCAATGCTTAATCAGTGAG

CTX-M Fw blaCTX-M like

CGCTTTGCGATGTGCAG 52ºC 550 pb

Jiang,

et al., 2006 CTX-M Rv ACCGCGATATCGTTGTG

AmpC MIR/ACT Fw blaMIR like

blaACT like

TCGGTAAAGCCGATGTTGCCG 56ºC 302 pb

Pérez-Pérez &

Hanson 2002 MIR/ACT Rv CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT

DHA-1 Fw blaDHA-1

TCTGCCGCTGATAATGTCC 52ºC 262 pb

Yum, et al.,

2005 DHA-1 Rv GCCGCCGGATCATTCAGCGC

DHA-2 Fw blaDHA-2

TCTGCCGCTGATAATGTCG 52ºC 298 pb

Yum, et al.,

2005 DHA-2 Rv TCTGCCGGGTCATTCAACAT

CMY-1 Fw blaCMY-1 like

blaMOR-1

TGAGCAAGACCCTGACTGC 52ºC 654pb --a

CMY-1 Rv GGAATGTCTGCTCGGTGAC

CMY-2 Fw blaCMY-2 like

CTATGGCGTGAAATCCAGC 58ºC 366 pb --a

CMY-2 Rv TTGTTTGCCAGCATCACGATG

FOX Fw blaFOX like

AACATGGGGTATCAGGGAGATG 52ºC 190 pb

Pérez-Pérez &

Hanson 2002 FOX Rv CAAAGCGCGTAACCGGATTGG

Nota : bla: gene β-lactamase, pb: pares de base, --a: primers desenhados .

47

Os produtos de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de

agarose ao 1,5%, utilizando tampão TBE 1x (Tris Base 90mM, ácido bórico 90mM,

EDTA 20mM pH 8,0). Como referência foi utilizado um marcador de tamanho

molecular de DNA de 100 pb (GeneRuler SM# 0321, Fermentas, Burlington,

Canada ). Após eletroforese, o gel foi corado com brometo de etidio (10 µg/mL) e

visualizado sob luz ultravioleta.

3.6.1 Caracterização de Integrons

Os DNAs das amostras foram analisados para estudar a presença de

integrons de classe 1 na bactéria empregando-se primers dos segmentos

conservados desse elemento (Tabela. 5). Para determinar os genes de

resistência para as β-lactamases que o integron carrega na região variável, foram

utilizados os primers de cada gene de β-lactamases em combinação com os do

segmento conservado (Intl1 e quacE∆1). A caracterização da região variável foi

estudada apenas para os integrons que carregam os genes de resistência para as

β-lactamases.

Tabela 5. Primers para a identificação e caracterização de integrons .

Genes Seqüência Primers (5’- 3’) Tamanho

Fragmento Referência

Int1 CCGTAGAAGAACAGC -a Sandvang, et al., 1997.

qacE∆1 GTTGCGATTACTTCG - a Sandvang, et al, 1997.

NOTA: a: Fragmento variável entre os primers Intl1 e qacE∆1

48

3.6.2 Reação de seqüenciamento

Os produtos de PCR obtidos foram excisados do gel de agarose após

eletroforese e purificados com o Kit “ GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit”

(Qiagen, Buckinghamchire,UK) conforme as instruções do fabricante. O DNA foi

quantificado por espectrofotometria a 260 nm (Sambrook &Russell. 2001) no

espectrofotômetro Nanodrop (NanoDrop® Technologies INC, Wilmington, DE,

EUA). Os produtos foram enviados para seqüenciamento para posterior análise de

sua conformação genética e comparação com as bases de dados disponíveis na

Internet (BLAST http:/www.ncbi.nlm.nhi.gov/blast/).

3.7 Tipagem molecular

3.7.1 ERIC-PCR

A análise de ERIC PCR é um método de tipagem baseado na

amplificação de segmentos conservados presentes no DNA das Enterobactérias.

As regiões conservadas do DNA das cepas em estudo foram amplificadas pela

técnica de PCR a partir de um primer único ERIC-2 5´-

AAGTAAGTGACTGGGGTGAGC-3’ (Aydin et al., 2007), específico para estes

segmentos. A reação de amplificação constou de uma etapa de desnaturação

inicial a 940C por 10min seguida da etapa de amplificação com 30 ciclos de

desnaturação a 940C por 1 min, anelamento a 520C por 1 min e etapa de extensão

a 720C por 8 min seguida de uma extensão final a 720C por 16 minutos. A

separação dos segmentos foi obtida por eletroforese em gel de agarose a 2.5% e

este corado com brometo de etídio para posterior visualização em transluminador

de luz UV.

49

3.7.2 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Para a realização da eletroforese em campo pulsado, o DNA bacteriano foi

preparado segundo o protocolo descrito pela Centers for Disease Control and

Prevention (Gautom, 1997) com algumas modificações necessárias para a

otimização da técnica. As cepas foram semeadas inicialmente em placas de ágar

MacConkey e incubadas por 18 a 24 horas a 37ºC. Uma única colônia de cada

cepa foi semeada em 30mL de caldo LB e novamente incubada a 37ºC por 20

horas sob agitação mecânica.

As culturas foram então centrifugadas a 3000g por 15 min. a 20ºC e o

sobrenadante totalmente desprezado. As células bacterianas foram padronizadas

por peso e diluídas mantendo-se igualmente a proporção peso/volume. Para tanto,

o precipitado foi ressuspenso em 1 mL de TE estéril (10 mM Tris /1mM EDTA pH

8.0) e transferido para tubos eppendorfs pré-pesados, sendo centrifugados a

12000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi completamente desprezado e os tubos

novamente pesados.

Adicionou-se em cada tubo o volume em µL do tampão TE correspondente

ao peso obtido do sedimento. Um volume de 5 µL desta ressuspenssão foi

transferido para outro tubo eppendorf, no qual foram adicionados 300 µL de

tampão TE. A esta suspensão foi adicionada 340 µL de agarose a 2% aquecida a

55ºC e, em seguida, dispensados em moldes de acrílico (Bio-Rad Laboratories),

sendo três por amostra e incubados por 15 min. a 4ºC. Os plugs solidificados

foram então colocados em 2mL de uma solução de lise (EDTA 0,5M pH 9,3 N-

laurosylsarcosine 1%, Proteinase K 0,1 mg/mL) e incubados a 55ºC por 16 horas

50

sob agitação mecânica. Após incubação, foram realizadas duas lavagens dos

plugs com água milli-Q e 4 lavagens com tampão TE pré-aquecido a 50ºC, com

intervalos de 15 min. a 55ºC sob agitação mecânica. Os plugs foram então

estocados em 2 mL de TE a 4ºC até o momento de uso.

Para a etapa de digestão do material genético com enzima de restrição,

os plugs previamente tratados foram lavados com solução DNS (Tris0,1M, MgCl2

0,005M pH 8.0) 4 vezes com intervalos de 1 hora a temperatura ambiente sob

agitação mecânica.

A enzima de restrição utilizada foi a XbaI (#ER0681, Fermentas,

Burlington, Canada) e para cada corrida foi utilizada apenas um plug por amostra.

Cada plug foi transferido para um novo microtubo e a este foram adicionados 200

µL do tampão especifico da enzima em uma concentração 1x, segundo instruções

do fabricante. Os tubos então foram incubados durante 30 min. a 4ºC para a

otimização da enzima de restrição no interior do plug. Após este período, a

solução tampão foi removida e 200 µL do tampão, agora contendo a enzima XbaI

(40U), foram adicionados e incubados durante a noite a 37ºC (Gautom,1997,

Dropa, 2007).

Depois de submetido o DNA à ação da endonuclease, os fragmentos de

restrição obtidos no interior do plug foram submetidos à eletroforese em campo

pulsado (CHEF DRIII, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). O plug foi inserido no

gel de agarose a 1% (Invitrogen corporartion, CA, EUA), preparado com tampão

TBE 0,5x (Tris-Base 45mM, ácido bórico 45mM, EDTA 10mM pH 8,0). As

condições utilizadas na corrida foram: voltagem 6 V/cm, a 14ºC por 20 horas, com

intervalos de pulso de 3,5 a 30,8 seg. Um marcador de peso molecular (Lambda

51

Ladder PFG Marker - New England Biolabs Inc., Beverly, MA, EUA) foi corrido em

conjunto para a estimativa do tamanho dos fragmentos formados. Após a corrida,

o gel foi corado com brometo de etidio (20 µg/mL) e posteriormente visualizado

com luz UV.

3.7.3 Análises comparativas dos isolados bacteriano s

A avaliação da clonalidade foi realizada a partir do perfil de amplificação e

de restrição respectivamente para ERIC-PCR e PFGE, utilizando o coeficiente

Dice (CD), com tolerância de 2 e 3% (Darini et al.,1998).

CD:Coeficiente Dice

na=b: N° de fragmentos localizados na mesma posição em ambas as amostras.

na + nb, N° total de fragmentos apresentados por ambas as amostras.

As porcentagens de similaridade assim como os cálculos de cluster e a

subseqüente geração de dendrograma foram realizadas no software Bionumerics

(Applied Maths NV©, Sint-Martens-Latem, Belgium).

3.8 Transferência dos genes de resistência

As linhagens que apresentaram elementos de resistência sejam de

origem plasmidial ou cromossômico foram submetidas à conjugação e

transformação para o estudo de sua mobilidade. A partir de um cultivo overnight

de cada amostra e da linhagem receptora Escherichia coli K12 em ágar

McConkey, foi realizada uma subcultura com colônias puras em caldo LB (Luri

52

Bertani) e incubada a 37ºC por 3 a 4 horas para atingir uma fase de crescimento

exponencial. Posteriormente alíquotas de 0,5mL das culturas das linhagens

doadora e receptora em fase logarítmica foram misturadas e adicionadas a 4mL

de caldo LB, sendo incubadas a 37ºC por 18 horas. Os transconjugantes foram

selecionados em ágar McConkey contendo estreptomicina (300 µg/mL,

Sigma,EUA) e imipenem (2µg/mL) ou ceftazidima (1µg/ml, Sigma, EUA).

Para transformação, foi utilizada a cepa E. coli DH10B como linhagem

receptora e foram estudados representantes de cada cluster das cepas

estudadas.

A preparação das células competentes foi realizada pelo método de

CaCl2 (50mM), a partir de uma cultura de 3 mL incubada overnight, 1 mL da

suspensão de E. coli DH10B foi transferido para 100 mL de caldo LB e incubado

por 2-3 horas até alcançar uma concentração bacteriana > 109 bactérias/mL. A

suspensão de bactérias foi transferida para 2 tubos Falcon de 50mL e mantida no

gelo por 10 min. Após centrifugação a 2700g por 10 min. a 4ºC, o sobrenadante foi

descartado e o sedimento ressuspenso em 30 mL de MgCl2 80 mM / CaCl2 20mM

gelado e novamente centrifugado. Após essa etapa, as células competentes foram

ressuspensas em 2 mL de CaCl2 gelado (0,1M) e aliquotadas em 100 µL para

transformação (Sambrook &Russell 2001).

A transformação foi realizada utilizando o método do choque térmico

descrito por Mandel & Higa (1970) modificado. À suspensão de E. coli DH10B

competente (100 µL) foram adicionados 10 µL do DNA plasmidial. Após 30 min.

de incubação no gelo, a suspensão da célula receptora com o DNA foi transferido

para banho termo regulado a 42ºC por 90 seg. e levada novamente ao gelo por 2

53

minutos. Foram adicionados 1000 µL de caldo LB à suspensão transformada e

esta incubada por 90 min. a 37ºC (Mandel & Higa 1970). Dessa cultura, 300 ul

foram transferidos para 3 placas de Muller-Hinton contendo ampicilina a 64 µg/mL,

imipenem a 1,5 µg/mL e ceftazidima a 2 µg/mL, respectivamente. Para os

transformantes dos isolados produtores de AmpC, foi semeada uma quarta placa

com cefoxitina a 20µg/mL.

Para confirmar a transferência genética, os transformantes foram semeados

novamente na superfície das placas contendo ágar Mueller-Hinton com os

antibióticos previamente mencionados, logo depois foram extraídos os plasmideos

para fazer a triagem de β-lactamases.

54

4. RESULTADOS

4.1 Estudo da sensibilidade antimicrobiana

4.1.1 Antibiograma

Em geral, os isolados apresentaram um perfil de multiresistência segundo

os critérios de interpretação da CLSI, com sensibilidade apenas à gentamicina em

89% dos isolados estudados (Tabela 6). Embora apenas 32% das cepas tenham

mostrado sensibilidade à amicacina, 25% dos isolados apresentaram sensibilidade

intermediária a este antibiótico.

Quanto aos carbapenêmicos, das 28 amostras estudadas, as amostras

Kp-12, Kp-3 e Kp-15 mostraram sensibilidade a este antibiótico, sendo as duas

últimas sensíveis à maioria dos antimicrobianos testados, porém estes isolados

mostraram uma sensibilidade diminuída para alguns antibióticos β-lactâmicos

como a cefoxitina (Tabela 6).

55

Tabela 6. Sensibilidade antimicrobiana de 28 isolad os de Enterobactérias a doze antimicrobianos isolad os ou combinados.

NOTA: CN, gentamicina; IMP, imipenem; MER, meropenem; ERT, ertapenem; CIP, ciprofloxacino; AK, amicacina; CAZ, Ceftazidima; Amox/Clav, amoxicilina + Ac. Clavulânico; CRO, ceftriaxona; AZT, aztreonam; CEP, cefepime; FOX, cefoxitina; SXT, sulfa-trimetropim; Pip/Taz, piperacilina + tazobactam. R, resistente; S, sensível; I, intermédio; ND, não determinado. 13883, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; 25922, Escherichia coli ATCC 25922; %, porcentagem.

Cepas

Antibiograma

CN (R≤12,S≥15)

AK (R≤14,S≥17)

CIP (R≤15,S≥21)

SXT (R≤10,S≥16)

Amox/Clav (R≤13,S≥18)

Pip/taz (R≤17,S≥21)

CAZ (R≤14,S≥18)

CRO (R≤13,S≥21)

AZT (R≤15,S≥22)

CEP FOX (R≤14,S≥18)

IMP MER (R≤13,S≥16)

ERT (R≤15, S≥19)

Kp-1 S R R R R I R R ND R R I I I Eg-2 S R R R I I R R I R R I R R Kp-3 S R R R S S S I S ND I S S S Ea-4 S I R R R I R R R R R R R R Ea-5 S S R I R S S S S S R R R R Kp-9 S I R R R S R R R R R R R R

Kp-11 S R R R R R R R R R R R R R Kp-12 S R R R R R R R R R I S S S Kp-13 R R R R R R R R R R R R R R Kp-14 S R R R R S R R S R R I I R Kp-15 S S R R S S S S S S R S S S Kp-16 R R R R R R R R R R R R R R Ea-18 S R R R R R R R R R R R R R Ea-20 S I R R R ND R R R ND R R R R Ea-21 S R R R R R R R R R R R R R Kp-22 R R R R R I R R R R R I R R Ea-23 S I R R R I R R R R R R R R Ea-25 S I R S R R R R R R R R R R Ea-34 S I R R R I R R R R R R I R Ec-1 S S R R R I R R R R R R R R Ec-2 S S R R R I R R R R R R R R Ec-3 S S R R R I R R R R R R R R Ec-4 S S R R R I R R R R R R R R

Kp-35 S S S R R R R R R R R R R R Ea-36 S S R R R R R R R R R R R R Ea-37 S I R R R R R R R R R R R R Kp-38 S R R R R R R R R R R R R R Ea-39 S S S I R ND S S S S R R R R 13883 S S S S S S S S S S S S S S 25992 S S S S S S S S S S S S S S S% 89 32 7 4 7 19 14 11 18 11,5 - 11 11 11 I% - 25 - 7 4 38,5 - 4 4 - 7 14 11 4 R% 11 43 93 89 89 42,5 86 85 78 88,5 93 75 78 85

56

4.1.2 Concentração inibitória mínima

Em relação à cefoxitina, todas as amostras apresentaram um perfil de

resistência similar (64 - > 512 µg/mL), porém, em relação à ceftazidima, os

valores da CIM foram mais amplos variando entre 32 e > 512 µg/mL, com

exceção das amostras Ecl-39 e Ea-5 que apresentaram uma CIM de 2 µg/mL e

1 µg/ml, respectivamente (Tabela 7). Os isolados sensíveis aos

carbapenêmicos confirmaram a alta susceptibilidade quantitativa (IMP, CIM ≤

2,0 µg/mL), com exceção de Kp-12 que apresentou uma sensibilidade

diminuída, exclusivamente para o ertapenem (CIM 16 ug/mL).

Os valores da CIM dos carbapenêmicos confirmaram a resistência

destes isolados, apresentando concentrações de inibição acima de 32 µg/mL.

As cepas Kp-1, Kp-14 e Kp-16, Kp-22 e Ecl-39 foram as únicas a apresentar

valores intermediários de resistência apenas ao imipenem. Quanto aos perfis

de resistência, as CIM do imipenem e meropenem foram menores que os

descritos para o ertapenem na maioria das cepas estudadas (Tabela.7).

A adição de inibidores de β-lactamases na determinação da CIM

permitiu avaliar a presença e grau de participação destas enzimas na

resistência aos carbapenêmicos. A combinação de EDTA com o antibiótico

imipenem, nas amostras Kp-1, Eg-2, Kp-9, Kp-11 e Kp-14, produziu uma queda

de três diluições ou mais nos valores da CIM deste antibiótico, sendo sugestivo

da produção de MBL. Por último, foi testado o inibidor APB para avaliar a

produção de AmpC nos principais substratos destas enzimas, além do

imipenem (i.e., ceftazidima e cefoxitina). Das 28 amostras, 15 apresentaram

uma diminuição dos valores da CIM em pelo menos um dos dois antibióticos

testados, porém, o melhor substrato para a deteção de AmpC foi a

57

ceftazidima. A adição de APB ao antibiótico imipenem diminuiu os valores da

CIM nas mesmas 15 amostras, além da cepa Ea-18, o que sugere a presença

de AmpC com forte indicação da participação desta enzima na resistência ao

Imipenem. Os resultados da concentração inibitória mínima para cada

antibiótico se encontram detalhados na tabela 7.

Tabela 7. Concentração Inibitória Mínima dos antibi óticos β-lactâmicos com e sem a adição dos inibidores EDTA e APB frente as 28 amost ras de Enterobactérias.

Cepas

CIM µg/Ml

IMP IMP/EDTA IMP/APB MER ERT FOX FOX/APB CAZ CAZ/APB Kp-1 8 1 4 16 8 >512 >256 512 512 Eg-2 32 0,5 16 128 256 >512 >256 256 256 Kp-3 1 2 1 0,25 0,06 8 16 0,5 0,5 Ea-4 32 16 4 64 128 >512 64 32 8

Ea-5 32 16 2 16 32 >512 64 1 0,5 Kp-9 128 1 128 256 256 >512 >256 256 256 Kp-11 64 2 32 128 512 >512 >256 256 256 Kp-12 2 2 2 4 16 32 32 32 8 Kp-13 32 32 4 256 256 256 128 128 8 Kp-14 4 0,5 4 16 8 >512 >256 512 512 Kp-15 0,125 0,5 0,25 0,25 0,125 32 32 0,5 0,5 Kp-16 8 4 4 128 512 64 32 32 8 Ea-18 32 32 4 64 128 >512 >256 32 8 Ea-20 64 16 4 64 256 >512 64 64 8

Ea-21 32 32 4 64 256 >512 128 64 8 Kp-22 16 8 4 128 256 256 128 128 16 Ea-23 32 16 4 64 256 >512 64 32 16 Ea-25 32 32 2 64 256 >512 128 64 1 Ea-34 16 8 2 32 128 >512 32 32 4 Ec-1 32 16 16 128 512 >512 >256 >512 16 Ec-2 32 8 16 128 256 >512 >256 >512 16 Ec-3 32 32 8 128 512 >512 256 256 8 Ec-4 32 8 8 128 512 >512 256 512 8

Kp-35 128 64 0,5 512 >512 256 32 64 1 Ea-36 32 32 8 128 256 >512 >256 64 16 Ea-37 32 16 8 128 256 >512 >256 64 16 Kp-38 128 32 64 128 256 64 64 128 16 Ea-39 16 8 1 32 64 >512 8 2 1 13883 2 2 4 0,25 0,06 16 16 1 1

25922 0,25 0.25 1 0,125 0,03 8 4 0,13 0,5 NOTA: CIM, concentração inibitória mínima; IMP, imipenem; MER, meropenem; ERT, ertapenem; FOX, cefoxitina; CAZ, Ceftazidima; IMP/EDTA, imipenem + EDTA; IMP/APB, imipenem + Acido fenil-Borônico; FOX/APB, cefoxitina + Acido fenil-Borônico; CAZ/APB, Ceftazidima +Acido fenil-Borônico. 13883, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; 25922, Escherichia coli ATCC 25922.

58

4.2 Triagem β-lactamases

O bioensaio confirmou a hidrólise de imipenem em 7 isolados. Os

resultados obtidos no bioensaio mostraram boa correlação, com os resultados

da CIM do IMP na presença de EDTA em cinco isolados (Tabela 7),

confirmando assim a presença de MBL. Os outros dois isolados, que também

mostraram hidrólise de imipenem, apresentaram uma queda da CIM na

presença de APB , mas não na presença de EDTA (Tabela 8).

O sinergismo para MBL é coerente com as atividades já descritas para as

amostras Kp-1, Eg-2, Kp-9, Kp-11 e Kp-14, todas elas com um forte efeito

inibitório frente aos ácidos derivados de compostos tiólicos, porém o EDTA não

apresentou esse efeito em dois destes isolados e, fraca inibição, nas outras

três amostras. Além das cepas sugestivas de MBL, os isolados Kp-16, Kp-22 e

Ea-23 apresentaram uma pequena inibição com os ácidos acima citados

(Tabela 8).

59

Tabela 8. Bioensaio e Triagem de β-lactamases nas 28 amostras de enterobactérias.

Cepas Bioensaio

Screening MBLa

Screening ESBLa

Screening AmpC

Imipenem (µg/ml) EDTA MPP MPA Amox/clav

Sinergismo a (APB) FOX CAZ

Diâmetro >4 mm b FOX/APB CAZ/APB

Kp-1 + (0,12) - + + + - - - - Eg-2 + (0,12) - + + - - - - - Kp-3 - - - - - - - - - Ea-4 - - - - - - + + +

Ea-5 - - - - - + - + -

Kp-9 + (0,12) + + + + - - - - Kp-11 + (0,12) + + + + - - - - Kp-12 - - - - + - - - - Kp-13 + (0,12) - - - - + + - + Kp-14 + (0,12) + + + + - - - - Kp-15 - - - - - - - - - Kp-16 - + - - + + - - + Ea-18 - - - - - - + - + Ea-20 - - - - - - + - +

Ea-21 - - - - - + + + +

Kp-22 - + - - - - + + + Ea-23 - - + + - + + + + Ea-25 - - - - - - + - + Ea-34 - - - - + - - + + Ec-1 - - - - - - - - + Ec-2 - - - - - - - + + Ec-3 - - - - - - + - + Ec-4 - - - - - - + - +

Kp-35 + (0,12) - - - - - + + + Ea-36 - - - - - - - - + Ea-37 - - - - - - + + - Kp-38 - - - - - - - - - Ea-39 - - - - - - + + +

NOTA: a : teste de dupla difusão de disco; b : teste de disco combinado. MBL Metalo-β-lactamases, ESBL β-lactamases de espectro estendido, MPP Acido mercaptopropionico, MPA Acido mercaptoacetico, Amox/clav amoxicilina + ác.clavulânico, APB Acido fenil-Borónico, FOX cefoxitina, CAZ Ceftazidima. + positivo, - negativo.

Conforme esperado, a triagem de ESBL não foi muito eficiente devido à

presença de AmpC nos isolados (Tabela 9), uma vez que só 7 amostras

mostraram sinergismo sob a presença de ác. clavulânico, entre estas, as

produtoras de MBL (Tabela 8). Nossos resultados são concordantes com o

relatado na literatura, uma vez que as ESBL são prevalentes em

enterobactérias e o efeito de falsa negatividade para ESBL é produzido pela

presença das enzimas AmpC (Coudron, 2005, Brenwald et al., 2005).

60

Por último, a triagem de AmpC também foi coerente com os resultados

anteriores que apresentaram uma queda da CIM nas 16 amostras com um ou

mais dos três substratos estudados (i., IMP, CAZ, FOX), denotando um

aumento da atividade antibacteriana na presença do APB. Os isolados Ea-37,

Ea-36 e Kp-16 mostraram um resultado positivo no sinergismo para AmpC,

porém seu CIM não diminuiu para nenhum dos antibióticos testados com APB

(Tabela 7). Um resultado positivo foi considerado quando houve um aumento

do halo de inibição > 4 mm no teste de disco combinado e quando houve a

presença de zona fantasma no teste de dupla difusão. Nos dois métodos

fenotípicos o melhor substrato foi novamente a ceftazidima em comparação à

cefoxitina (Fig.2).

2.a 2.b 2.c

DC (caz + APB) DDD DC (fox + APB) Figura 2. Screening AmpC. Teste de dupla difusão e de disco combinado com APB. NOTA: 2.a : teste negativo, cepa Kp-1; 2.b: teste positivo para Ceftazidima e cefoxitina, cepa Kp-35; 2.c: Teste positivo apenas para Ceftazidima, cepa Ec-3. DC: disco combinado, DDD: dupla difusão de disco, caz: Ceftazidima, fox: cefoxitina, APB: Acido fenil- Borónico.

4.3 Análises das porinas (OMPs)

O perfil fenotípico das proteínas de membrana externa foi pesquisado

em todos os isolados. As amostras sensíveis aos carbapenêmicos

apresentaram um perfil de três porinas maiores de pesos moleculares entre 34

e 37 kDa que correspondem às porinas OmpA, OmpK35 e OmpK36 (Fig.3).

61

3.a Ec-1 Ec-2 Ec-3 CP Ec atcc PM 40 kDa OmpC 35 kDa. OmpF OmpA 25 kDa. 3.b Kp-1 Kp-11 Kp-12 Kp-9 Kp-13 Kp-35 3.c Ea-4 Ea-21 Ea-23 Ea-20 Kp atcc OmpK36 OmpK 35 Omp A

Figura 3. Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS -PAGE.Perfil de Porinas de membrana externa (OMP). NOTA: 3.a Perfil OMPs Escherichia coli. CP: Escherichia coli K-12, sensível ao Imipenem, apresenta as três porinas, OmpC, OmpF e OmpA, superposta em OmpF no gel. Ec ATCC: E.coli ATCC 25922, sensível ao Imipenem. Ec-1,Ec-2 e Ec-3, resistente ao Imipenem, sem a porina OmpC. 3.b Perfil K. pneumoniae hidrolisadoras de imipenem. Kp-1 e Kp-13 resistente ao Imipenem, com porina de 36KDa, Kp-11 e Kp-12 com expressão diminuída da porina Omp36KDa e Kp-9 Kp-35, resistentes ao imipenem sem a porina Omp36KDa. 3.c Perfil E. aerogenes com triagem positiva para AmpC. Todas as amostras sugestivas de AmpC apresentaram perda da porina Omp36KDa. Kp atcc: K. pneumoniae ATCC 13883, sensível ao Imipenem. PM : Marcador De peso molecular de proteina

Nos isolados clínicos todas as amostras apresentaram as porinas

OmpA e a porina de 35 kDa, porém a porina de 36 kDa esteve presente

apenas em 7 isolados. Curiosamente, as 21 amostras que apresentaram perda

da porina OmpK36 ou ausência do seu homólogo relatam uma alta resistência

ao ertapenem (CIM ≥ 128 µg/mL), com exceção da Ea-39 e Ea-5, que tiveram,

respectivamente, CIM de 64 e 32 µg/mL (tabela.9).

62

Tabela 9. Avaliação da presença ou ausência da prot eína de membrana externa OMP de 36kDa.

NOTA: a : análises de porinas por SDS-PAGE. Omp: porina de membrana externa, +b : fragmento com tamanho > 2000pb , + : positivo, - : negativo. 13883 : Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, 25922 : Escherichia coli ATCC 25922.

No estudo de determinantes genéticos para a proteína de membrana

externa de 36 kDa, 27 amostras amplificaram o DNA. A amostra Eg-2 foi a

única que não amplificou o gene, não apresentando também expressão da

proteína, o que sugere a presença de mutações na seqüência complementar

dos iniciadores ou a deleção desse fragmento do DNA, eventos que podem

impedir a amplificão do gene (Doumith, et al., 2009). Os isolados Kp-35, Ea-37

e Kp-38 apresentaram um aumento no tamanho dos fragmentos amplificados,

sugerindo a presença de IS (Doumith, et al., 2009). As 24 amostras restantes

apresentaram fragmentos amplificados similares aos das cepas padrão.

Cepas

Porinas

OmpC/36kDa a PCR

OmpC/36KDa (1104pb)

Kp-1 Presente + Eg-2 Ausente - Kp-3 Presente + Ea-4 Ausente + Ea-5 Ausente + Kp-9 Ausente + Kp-11 Presente + Kp-12 Presente + Kp-13 Presente + Kp-14 Presente + Kp-15 Presente + Kp-16 Ausente + Ea-18 Ausente + Ea-20 Ausente + Ea-21 Ausente +

Cepas

Porinas

ompC/36kDa a PCR

OmpC/36KDa (1104pb)

Kp-22 Ausente + Ea-23 Ausente + Ea-25 Ausente + Ea-34 Ausente + Ec-1 Ausente + Ec-2 Ausente + Ec-3 Ausente + Ec-4 Ausente +

Kp-35 Ausente + b

Ea-36 Ausente + Ea-37 Ausente + b Kp-38 Ausente + b Ea-39 Ausente + 13883 Presente + 25922 Presente +

63

4.4 Confirmação molecular dos determinantes de resi stência

4.4.1. Produção de MBL e de Carbapenemases do tipo serina

Os perfis de resistência sugeridos pela identificação fenotípica para as 5

cepas produtoras de MBL (Kp-1, Eg-2, Kp-9, Kp-11 e Kp-14) foram confirmados

pela amplificação do gene blaIMP-1like. Nenhuma outra amostra apresentou um

produto de amplificação associado a outras subclasses de MBL.

Na procura de carbapenemases de tipo serina, as cepas Kp-13 e Kp-35

que também mostraram um perfil de hidrólise do imipenem foram positivas para

o gene blaKPC like. O seqüenciamento parcial deste produto de amplificação

confirmou a presença da enzima KPC-2 (Genbank FJ641197, FJ641196).

Os 7 isolados que apresentaram algum grau de hidrólise de imipenem

confirmaram a produção de carbapenemases sendo em grande medida

coerente com os resultados fenotípicos obtidos (Tabela. 10).

4.4.2 Produção de ESBL e AmpC

Uma vez que a impermeabilidade da membrana externa se encontra

relacionada à produção de β-lactamases de tipo ESBL e AmpC (Martinez-

Martinez, et al., 1999), foi feita a pesquisa para este tipo de enzima. Como

esperado, a presença das ESBL foi confirmada na maioria dos isolados (Tabela

10). Esse resultado se mostra concordante com os estudos realizados no Brasil

e América Latina sobre a alta prevalência das ESBLs nas enterobactérias

(Sader et al., 2001).

A produção de AmpC foi confirmada para 17 isolados, dos quais 11

apresentaram a amplificação positiva para os primers MIR/ACT. Em um

primeiro momento o produto da amplificação sugeriu a presença de blaMIR o

blaACT like plasmidial, mas o seqüenciamento dos fragmentos revelaram a

64

presença da AmpC cromossômica do Enterobacter aerogenes com 100% de

similaridade, obtendo assim uma amplificação cruzada com os primers da

família MIR/ACT provenientes da AmpC cromossômica de E. cloacae.

Os isolados de Escherichia coli Ec-1, Ec-2, Ec-3 e Ec-4 carregaram o

gene blaCMY-2 like, confirmado por seqüenciamento com similaridade de 99%

para CMY-2 (GenBank EU531728.1). Finalmente, as amostras Kp-3 e Kp-9,

esta última já identificada como produtora de IMP-1, apresentaram um produto

de amplificação para o gene blaDHA-1. A enzima DHA-1 na amostra Kp-3 sugere

uma participação mínima na resistência aos β-lactâmicos uma vez que este

isolado é totalmente sensível a esses antibióticos, com exceção da

sensibilidade diminuída para cefoxitina e ceftriaxona. No entanto, K.

pneumoniae Kp-9 apresenta múltiplos mecanismos que contribuem para alta

resistência aos carbapenêmicos (CIM de imipenem, 128 µg/ml). As onze

amostras restantes, foram negativas para todos os genes relacionados à

expressão de AmpC pesquisados neste estudo (Tabela 10).

65

Tabela 10. Avaliação dos genes de β-lactamases das 28 amostras: carbapenemases, ESBL e AmpC e o tamanho aproximado dos integrons ca rregados.

Cepas Produção de β-lactamases Tamanho aprox.

Integrons Carbapenemases ESBL AmpC

Kp-1 blaIMP-1 like blaSHV like blaTEM like - 1200pb, 3000pba

Eg-2 blaIMP-1 like - - -

Kp-3 - blaSHV like blaDHA-1 1500 pbb, 3000pb

Ea-4 - blaTEM like blaCTX-M like blaMIR/ACT like 700 pb, >1200pb

Ea-5 - - blaMIR/ACT like -

Kp-9 blaIMP-1 like blaSHV like blaCTX-M like blaDHA-1 1500pbb,3000pba

Kp-11 blaIMP-1 like blaSHV like blaCTX-M like - 1200pb, 3000pba

Kp-12 - blaSHV like blaTEM like

blaCTX-M like - 3000pb

Kp-13 blaKPC-2 like blaSHV like blaCTX-M like - 3000pb

Kp-14 blaIMP-1 like blaSHV like - 1200pb, 3000pba

Kp-15 - blaSHV like - -

Kp-16 - blaSHV like blaTEM like

blaCTX-M like - -

Ea-18 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb

Ea-20 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb

Ea-21 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 2500pb

Kp-22 - blaCTX-M like - -

Ea-23 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb

Ea-25 - - blaMIR/ACT like -

Ea-34 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb

Ec-1 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -

Ec-2 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -

Ec-3 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -

Ec-4 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -

Kp-35 blaKPC-2 like blaSHV like - 3000pb

Ea-36 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb

Ea-37 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb

Kp-38 - blaSHV like blaTEM like

blaCTX-M like - 1000pb, 2000pb

Ea-39 - - blaMIR/ACT like -

NOTA: ESBL β-lactamases de espectro estendido. – : negativo, bla β-lactamases, pb: pares de bases, a: integron carregando blaIMP-1,

b: integron carregando blaDHA-1 .

66

4.4.3. Presença de Integrons

Com o intuito de determinar a localização dos genes de resistência, foi

estudada a presença de integrons mediante a amplificação dos fragmentos

alvo por PCR. Das 28 cepas, 17 apresentaram produtos de amplificação para a

combinação dos primers de Intl1 e qac∆E1, com tamanhos variáveis entre 600

a 3000 pb (tabela.10). As amostras Kp-1, Kp-3, Kp-9, Kp-11, Kp-14 e Kp-38

mostraram dois produtos de amplificação.

Dentre os genes codificantes para carbapenemases, o blaIMP-1 foi o único

gene que se mostrou inserido em um integron de classe 1, denominadao In86,

o qual tem sido previamente caracterizado por Penteado e colaboradores

(2008) em enterobactérias produtoras de IMP-1 disseminadas na cidade de

São Paulo. Quanto aos genes codificantes de AmpC e ESBL, apenas o blaDHA-1

encontrou-se inserido em um pequeno integron de classe 1 (Tabela 10).

4.5. Tipagem molecular

A técnica de ERIC-PCR mostrou uma diversidade genética entre as

linhagens de K. pneumoniae, um perfil clonal para a espécie Enterobacter

aerogenes, exceto a amostra Ea39, e um único perfil para Escherichia coli. O

perfil molecular da espécie de Enterobacter gergoviae não foi avaliado no

dendrograma devido à presença de um único isolado representante desta

espécie (Fig.4).

67

4.a 4.b

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 PM PM 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 PM

4.c 4.d PM 19 20 21 22 23 PM PM 24 25 26 27 28 29 PM

Figura 4. Eletroforese em gel de agarose dos perfi s de amplificação pela técnica de

ERIC-PCR.... NOTA: Fig.4a : linha 1: Kp-15, linha 2: Kp-16, linha 3: Kp-12, linha 4: Kp-1, linha 5: Kp-14, linha 6: Kp-9, linha 7: Kp-11, linha 8: Kp-38. Fig. 4b ; linha 9: Ea-20, linha 10: Ea-18, linha 11: Ea-23, linha 12: Ea-25, linha 13: Ea-5, linha 14: Ea-4, linha 15: Kp-22, linha 16: Ea-21, linha 17: Ea-36, linha 18: Ea-37. Fig. 4c ; linha 19: Ec-1, linha 20: Ec-2, linha 21: Ec-3, linha 22: Ec-4, linha 23: atcc E. Coli 25922 Fig.4d ; linha 24: Ea-39, linha 25: Ea-34, linha 26: Kp-3, linha 27: Kp-13, linha 28, Kp-35, linha 29: atcc K pneumoniae 13883.

A técnica de PFGE, método padrão em tipagem molecular, confirmou os

diferentes perfis previamente mencionados, apresentando maior poder

discriminativo (Fig. 5).

68

λ 1 2 3 4 5 λ 6 7 8 λ λ 9 10 11 12 13 λ 14 15 16 17 18 λ λ 19 20 21 22 23 λ 24 25 26 27 28 29 λ 5a 5b 5c Figura 5: Perfil de restrição XbaI de 27 dos isolados estudados, obtidos pela tecnica de PFGE. NOTA: 5a: λ: DNA lambda, linha1: Kp-16, linha 2: Ea-36, linha 3: Ea-20, linha 4: Ea-23, linha 5: Ea-37, linha 6: Ea-5, linha 7: Ea-25, linha 8: K. pneumoniae ATCC 13883 5.b: linh 9: Kp-15, linha 10: Ec-3, linha 11: E. coli ATCC 25922, linha 12: Ec-4, linha 13: Kp12, linha 14: Ec-1, linha 15: Ec-2, linha 16: Ea-39, linha 17: Ea-34, linha 18: Kp- 3. 5c: linha 19: Kp-9, linha 20: Ea-18, linha 21: Kp-14, linha 22: Kp-11, linha 23: Ea-4, linha 24: Kp-35, linha 25: Kp-13, linha 26: Kp-1, linha 27: Kp-22, linha 28: Ea-21, linha 29: Kp-38.

69

Em relação à avaliação de similaridade genética feita por análises de

cluster segundo o coeficiente DICE, entre as cepas de Klebsiella pneumoniae,

identificou-se nove perfis diferentes. As cepas produtoras de MBL Kp-1, Kp-9, Kp-

11 e Kp-14, recuperadas de três centros hospitalares entre os anos 2003 e 2006,

apresentaram o mesmo perfil genético, denominado clone A. Pela técnica de

PFGE, o cluster A não apresentou 100% de similaridade, sendo a cepa Kp9,

isolada no ano 2003, a que mostrou maior diferença no perfil de restrição com

similaridade de 94 % (Fig. 6). A cepa Kp-9 foi o primeiro isolado de MBL na

América Latina, descrito por Lincopan e colaboradores (Lincopan et al., 2005), e

foi incluída neste estudo com o intuito de caracterizar sua resistência e sua

relação genética com as amostras de Klebsiella pneumoniae pertencentes a este

estudo.

As demais 8 espécies de Klebsiella pneumoniae pesquisadas neste

estudo não apresentaram um agrupamento genético definido, sendo

consideradas de linhagens diferentes (Fig.6).

Quanto as 11 cepas de Enterobacter aerogenes produtoras de AmpC

cromossômica, isoladas durante os meses de abril a novembro do ano 2007

nos centros hospitalares do HSPE e LAMAC, observou-se a ocorrência de um

único perfil clonal, denominado clone B, com 100% de similaridade nos perfis

de amplificação do ERIC-PCR das cepas Ea-4, Ea-5, Ea-20, Ea-21, Ea-23, Ea-

25 e Ea-18, porém as cepas Ea-36 e Ea-37 pertencentes a este cluster

apresentaram uma similaridade genética de 95 % e 98% com o clone B,

respectivamente (Fig.6). Com o perfil de restrição XbaI obteve-se uma

similaridade menor entre as cepas pertencentes ao cluster B (92,48%) sendo

100% de similaridade entre as cepas Ea-4, Ea-20 e Ea-23 e entre as cepas

70

Ea-5 e Ea-25. A cepa Ea-34 teve uma similaridade em torno de 88,56% com o

cluster B, não mostrando uma origem clonal quando consideramos 90% de

similaridade como critério de clonalidade, baseado na interpretação sugerida

por Tenover e col. (Tenover, et al., 1995). Na cepa Ea39 não foi observada

relação clonal com os perfis mencionados (Fig. 6).

Em relação às cepas de Escherichia coli produtoras de CMY-2, foi

possível identificar um mesmo perfil de amplificação com uma similaridade

genética >94%, denominado perfil C. Esta diferença dada pela técnica de

ERIC-PCR não foi observada com o perfil de restrição XbaI das amostras Ec-1,

Ec-2, Ec-3, e Ec-4, tendo 100% de similaridade, denominando-se clone C (Fig.

6).

71

Ea-39 – blaMIR/ACT – perfil L

Kp-12 - (-) - perfil D

Ec-1 – blaCMY-2 – perfil C

Ec-2 – blaCMY-2 – perfil C

Ec-3 – blaCMY-2 – perfil C

Ec-4 – blaCMY-2 – perfil C

Kp-11 – blaIMP-1 – perfil A

Kp-14 – blaIMP-1 – perfil A

Kp-1 – blaIMP-1 – perfil A

Kp-9 – blaIMP-1,DHA--1 – perfil A

Kp-38 – blaCTX-M,SHV,TEM - perfil H

Kp-13 – blaKPC-2 – perfil F

Kp-16 - blaCTX-M – perfil J

Kp-35 - blaKPC-2 – perfil I

Ea-25 – blaMIR/ACT – perfil B

Ea-5 – blaMIR/ACT – perfil B

Ea-20 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B

Ea-23 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B

Ea-4 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B

Ea-18 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B

Ea-36 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B

Ea-37 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B

Ea-21 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B

Ea-34 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil M

Kp-15 - (-) - perfil G

Kp-22 – blaCTX-M –perfil K

Kp-3 - blaDHA-1 - perfil E

Figura 6. Diversidade genética mostrada no dendrograma gerado s por ERIC-PCR (a) e PFGE (b) das cepas de K. Pneumoniae, E. aerogenes e E. coli provenientes dos diversos centros hospitalares.

NOTA: (a) O porcentagem de corte para o análises dos cluster foi de > 90%. Dice: Coeficiente DICE, Tol: Tolerância, (ano de isolamento) (b) O porcentagem de corte para o análises dos cluster foi de > 90%. Dice: Coeficiente DICE, Tol: Tolerância, - bla: β-lactamase producida-. Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec: Escherichia coli, HSPE: Hospital Servidor Público, São Paulo; COB: Centro Oncológico Infantil Boldrini, Campinas-SP; LAMAC: Laboratório Médico Análises Clínicas de São Paulo SP; HU: Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, SP; HBP: Hospital da Beneficência Portuguesa, SP.; LR: Laboratório Richet, RJ. LPSP: Laboratório Clínico Endomed Ltda., São Paulo, SP.

Kp-12– HSPE (2005) – perfil D

Kp-3 – COB (2007) – perfil E

Kp-1 – LAMAC (2005) – perfil A

Kp-11 – HSPE (2005) – perfil A

Kp-14 – LAMAC (2006) – perfil A

Kp-9 – HU (2003) – perfil A

Kp-13 – LCE (2005) – perfil F

Kp-15 – COB (2007) – perfil G

Kp-38 – HBP (2008) – perfil H

Kp-35 – LAMAC (2007) – perfil I

Ea-18 – LAMAC (2007) – perfil B

Ea-20 – LAMAC (2007) – perfil B

Ea-21 – LAMAC (2007) – perfil B

Ea-23 – HSPE (2007) – perfil B

Ea-25 – HSPE (2007) – perfil B

Ea-4 – LAMAC (2007) – perfil B

Ea-5 – LAMAC (2007) – perfil B

Ea-37 – LAMAC (2007) – perfil B

Ea-36 – LAMAC (2007) – perfil B

Kp-16 – LR (2005) – perfil J

Kp-22 – COB (2007) – perfil K

Ec-3 – HBP (2007) – perfil C

Ec-4 – HBP (2007) – perfil C

Ec-1 – HBP (2007)- perfil C

Ec-2 – HBP (2007) – perfil C

(a) ERIC-PCR - Dice (Tol 3,0%) (b) PFGE – Dice (Tol. 2,0%)

72

4.6 Transferência dos genes de resistência

A transferência genética de resistência aos antibióticos β-lactâmicos,

principalmente carbapenêmicos, avaliada pela conjugação em E. coli K12, não foi

possível em nenhum dos isolados estudados.

A transferência realizada pela transformação da cepa de E.coli DH10B foi

realizada com sucesso em sete isolados estudados, dois pertencentes ao perfil C,

dois pertencentes ao perfil B e as amostras Kp22, Kp38 e Kp13. Os

transformantes cresceram apenas nas placas contendo o antibiótico ampicilina (64

µg/mL) e ceftazidima (2 µg/mL) (Tabela 11). A CIM de cada cepa transformante

teve um aumento ≥ 4 diluições para ceftazidima. Na presença do antibiótico

imipenem, as cepas Ec2t, Ec4t, Kp38t, Kp13t, tiveram um aumento de apenas duas

diluições, diferente do antibiótico ertapenem que promoveu um aumento da CIM

≥4 diluições para estes transformantes, levando a uma sensibilidade diminuída.

No perfil de resistência para o antibiótico cefoxitina, as cepas Ec2t e Ec4t

mostraram um aumento da CIM > 4 diluições, sendo assim, essas duas cepas

apresentaram maior mudança no perfil de resistência para os antibióticos β-

lactâmicos (Tabela11).

O determinante de resistência transferido para a linhagem receptora

correspondentes às cepas Ec2t, Ec4t foi o gene blaCMY-2, na cepa Kp13t foi

transeferido o gene blaKPC-2 e a cepa Kp22t, apresentou o gene blaCTX-M. As cepas

transformadas Ea4t e Ea34t pertencentes aos isolados Ea-4 e Ea-34 do perfil B

apresentaram o determinante de ESBL blaCTX-M. Por último, a cepa transformante

Kp38t apresentou, nos testes fenotípicos, um perfil de enzima β-lactamase da

73

classe A sendo possivelmente uma ESBL, porém não foi possível identificar o

gene mobilizado (Tabela11).

Tabela 11. Transformação por choque térmico para os representantes de cada determinate de resistência identificado.

Cepa Crescimento CIM (µg/mL)

Produto de PCR AMP

64µg/mL CAZ

2µg/mL IMP ERT FOX CAZ CTX

DH10B

(-) (-) 0,125 0,125 8 0,25 0,06 (-)

Kp1t (-) (-) -- -- -- -- -- NA

Eg2t (-) (-) -- -- -- -- -- NA

Kp9t (-) (-) -- -- -- -- -- NA

Kp16t (-) (-) -- -- -- -- -- NA

Kp22t (-) + 0,125 0,5 16 8 64 blaCTX-M

Kp38t + + 0,5 2 16 32 8 NI

Ec2t + + 0,5 4 >128 >64 64 blaCMY-2

Ec4t + + 0,5 8 >128 >64 64 blaCMY-2

Ea4t + (-) 0,25 0,125 8 4 32 blaCTX-M

Ea25t (-) (-) -- -- -- -- -- NA

Ea34t + (-) 0,25 0,125 8 4 32 blaCTX-M

Ea39t (-) (-) -- -- -- -- -- NA

Kp13t + (-) 0,5 2 16 2 0,25 blaKPC-2

Kp35t (-) (-) -- -- -- -- -- NA

Controlet + (-) -- -- -- -- -- NA

25922 NA NA 0,125 0,125 8 0,25 0,03 NA

NOTA: AMP: ampicilina, CAZ; ceftazidima, IMP: imipenem, ERT: ertapenem, FOX: cefoxitina, CTX: cefotaxima, CIM: concentração inbitorio mínima, DH10B: Cepa receptora E. coli DH10B, +: positiva, (-): negaitivo,NA: não aplica, --: não determinado, NI: não identificado.

74

G1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 G2 KPC-2

CTX-M 23,13 Kb

10Kb CMY-2

Figura 7: Extração de plasmideos dos transformantes. Nota: G1:Gene ruler 1Kb (500-10000 pb), 1:Ec2t, 2:Ec4t, 3: E. coli ATCC 25922,4: Ea34t, 5: Kp13t, 6: Kp38t, 7: Kp22t, 8: E. coli DH10B, 9: Control positivo transformação, G2: Lambda DNA/Hind III (125-23130pb).

O perfil plasmidial dos transformantes demonstrou que os genes das β-

lactamases são carregados por plasmideos ≥ 23 Kb. O gene blaCTX-M foi localizado

em plasmideos de diversos tamanhos (Figura7).

75

5. Discussão

Os resultados fenotípicos obtidos mostram um comportamento diversificado

das bactérias com relação à resistência aos carbapenêmicos. Em geral, uma das

principais características exibidas por todos os isolados foi o perfil de

multiresistência. Excepcionalmente, a resistência à gentamicina foi pouco

freqüente, sendo encontrada uma sensibilidade de 89 % a esse antibiótico, no

entanto, houve reduzida sensibilidade para a amicacina (32%). Esta diferença de

susceptibilidade para a mesma classe de antibióticos pode estar relacionada com

a presença de enzimas específicas codificadas por genes carregados

principalmente por integrons. De fato, os isolados Ea-5, Kp-15, Ec-1, Ec-2, Ec-3,

Ec-4 e Ea-39, sensíveis aos dois aminoglicosideos, não carregam este elemento.

Por outro lado, estudos de caracterização de integrons carregando múltiplos

determinantes de resistência têm mostrado esta resistência direcionada para um

tipo de aminoglicosideo específico (Mendes et al., 2004).

A resistência aos β-lactâmicos foi alta na maioria dos isolados com exceção

das cepas que mostraram um fenótipo de sensibilidade aos carbapenêmicos, Kp-

3, Kp-15 e Kp-12. É importante mencionar a diminuição de sensibilidade à

cefoxitina encontrada nestas bactérias, o que pode estar relacionado à alta

pressão seletiva existente em um ambiente hostil. Um estudo realizado por

Martinez-Martinez e colaboradores no ano 1999 demonstrou que a perda da

porina de 36 kDa contribui para a resistência aos β-lactâmicos, principalmente às

cefamicinas, porém não é determinante para a expressão de um alto nível de

resistência, conforme mostrado pela CIM desses isolados (8 e 32 µg/mL) quando

76

comparados aos produtores de enzimas hidrolisadoras deste antibiótico (CIM

>512µg/Ml) (Martinez-Martinez et al., 1999).

A impermeabilidade das porinas diminui a sensibilidade para cefalosporinas

e carbapenêmicos e outros antibióticos não relacionados, como as quinolonas.

Dentre as porinas, a OmpK36 é a principal proteína relacionada com a resistência

ao imipenem, além de contribuir para a resistência à cefoxitina, uma vez que esta

porina é a via de ingresso para essas drogas (Pages et al., 2008). Esta

impermeabilidade de membrana externa impediu a obtenção de uma boa

correlação entre os produtores de AmpC com a cefoxitina nos testes de inibição

enzimática com APB, já que 9 dos 15 isolados produtores não apresentaram uma

diminuição da CIM frente ao APB (Anexo 1). Neste trabalho, a resposta ao APB

com ceftazidima permitiu a realização de uma identificação mais definida, mesmo

assim, duas cepas ESBL positivas com impermeabilidade de membrana

apresentaram falsa positividade para AmpC. Estes resultados diferem dos

relatados por Coudron em 2005, no qual o autor cita tanto a cefoxitina e a

ceftazidima como indicadores de AmpC, porém as cepas estudadas no trabalho

de Coudron não apresentaram uma ausência de porina (Coudron, 2005, Brenwald

et al., 2005).

A triagem de ESBL foi freqüentemente mascarada pela presença de

enzimas do tipo AmpC. Todos os isolados produtores de AmpC co-produziram

algum tipo de ESBL, mas o triagem deste foi negativo para todos eles. Este relato

de falsos negativos para ESBL é devido à inibição nula do ác. clavulânico para a

enzima AmpC. Esta dificuldade é relatada em diversos estudos que procuram uma

77

identificação mais correta, principalmente na obtenção de testes mais fidedignos a

serem empregados nos laboratórios de rotina (Netzel et al., 2007, Coudron 2005).

Em relação ao tipo de gene responsável pela expressão de ESBL foi

encontrada uma alta incidência do gene blaCTX-M, carregado por um plasmídeo

transferível. A presença desse gene foi confirmada tanto em cepas de Klebsiella

como Enterobacter, o que denota a importância dos plasmideos na disseminação

desta resistência independente do gênero bacteriano e clonalidade.

Quanto ao perfil de resistência aos carbapenêmicos, os métodos

fenotípicos podem até prever os mecanismos presentes nos isolados, porém

quando há mais de um mecanismo envolvido, esses mascaram e dificultam a

interpretação fenotípica dos resultados e a sua caracterização.

A detecção de carbapenemases em enterobactérias é caracterizada por

uma CIM relativa para os carbapenêmicos, principalmente MBLs (Quennan &

Bush 2007), porém no estudo de triagem de carbapenemases de todas as cepas

que apresentaram CIM entre 8 e 128 µg/mL, apenas sete mostraram algum grau

de hidrólise do imipenem e, dessas, cinco mostraram resultados concordantes

com MBL ao apresentar sinergismos positivos com os inibidores dessas enzimas.

Os ácidos derivados de compostos tiólicos foram os melhores inibidores

para o substrato imipenem. As cepas Kp-16, Kp-22, e Kp-23 apresentaram falsa

positividade no teste de dupla difusão de disco com o inibidor EDTA e os ácidos

derivados de compostos tiólicos. A produção de falsos positivos nesta metodologia

já havia sido descrita anteriormente por Picão e colaboradores (Picão, et al.,

2008).

78

A identificação fenotípica dos isolados produtores das carbapenemases do

tipo KPC foi caracterizada pela inibição da enzima na presença do APB. Este foi

relatado pela primeira vez em 1983 como inibidor reversível de β-lactamases de

classe C (Beesley, et al., 1983). Diversos métodos para a identificação desse tipo

de enzima têm sido relatados desde então, sendo o APB considerado um inibidor

específico. Em 2008, Pasteran e colaboradores relataram a inibição da

carbapenemase KPC-2 por APB em um isolado de K pneumoniae, utilizando

como substrato o antibiótico imipenem. Este relato foi confirmado meses depois

por Tsakris e colaboradores, em um estudo feito com 57 cepas produtoras de

KPC, no qual foi descrito que a inibição do APB para o substrato imipenem era

específica para enzimas de tipo KPC (Pasteran et al., 2008, Tsakris et al., 2008).

Pasteran e colaboradores no ano 2009 pesquisaram a efetividade desse método

para a deteção de todas as carbapenemases de classe A, obtendo novas

recomendações para a triagem destas enzimas (Pasteran, et al., 2009).

Assim, no presente estudo, os dois isolados restantes que apresentaram

hidrólise do imipenem, as cepas Kp-13 e Kp-35, carregando o gene blaKPC-2,

mostraram uma diminuição significativa da CIM do antibiótico imipenem com a

presença do inibidor APB, de três ou mais diluições.

A queda da CIM do imipenem, na presença de APB, foi observada também

em todas as cepas produtoras de β-lactamases do tipo AmpC. A CIM para os

carbapenêmicos diminuiu a valores limites de sensibilidade de 2 e 4 µg/mL, com o

emprego do inibidor APB e a maioria apresentou diferença na CIM ≥3 diluições

(anexo 1). É importante citar que os resultados descritos por Pasteran et al., 2009,

que recomendam um limite de corte para carbapenemases de CIM ≥ 3 diluições,

79

não relatam a possibilidade de falso positivo decorrente da presença de AmpC.

Assim, os resultados obtidos sugerem que a hiperexpressão destas enzimas

induzíveis estariam contribuindo fortemente no desenvolvimento da resistência ao

imipenem (Poirel et al., 2008, Thomson & Bonomo 2005). Os isolados produtores

de MBL não apresentaram mudanças em suas CIM na presença deste inibidor, o

que demonstra a especificidade do APB para as enzimas AmpC e KPC.

A CIM do antibiótico imipenem não apresentou valores muito altos em

nenhum dos isolados, quando comparados aos resultados obtidos para

meropenem e ertapenem que são de 16 a 512 µg/mL e 8 a >512 µg/mL,

respectivamente. Este perfil característico de resistência, descrito entre os

antibióticos carbapenêmicos, está relacionado a mecanismos como

impermeabilidade da membrana externa por perda de porina associada à

produção de β-lactamases do tipo ESBL e AmpC (Livermore & Woodford 2006).

Todos os isolados produtores de AmpC, no presente trabalho, apresentaram este

perfil de resistência. Os isolados Eg-2, Kp-9 e Kp-11, produtores de MBL, também

apresentaram o mesmo perfil de resistência, mas, na análise de porinas, estas

cepas mostraram expressão diminuída da porina de 36 kDa, o que explica os

valores altos da CIM do ertapenem obtidos (Tabela 9).

As serino carbapenemases do tipo KPC apresentaram também um perfil

diferenciado para imipenem, ertapenem e meropenem, com valores de CIM do

imipenem entre 4 e 32 µg/mL. O antibiótico ertapenem, por sua vez, apresentou

valores mais altos de CIM, podendo estar relacionado diretamente à enzima ou à

presença de outros mecanismos que diminuem a sensibilidade a este antibiótico

de forma específica (Yigit et al., 2003, Wolter, et al., 2008, Girlich et al., 2008,

80

Woodford et al., 2007). A cepa Kp-13 teve este comportamento característico

associado à presença da enzima KPC, porém a cepa Kp-35 apresentou uma

resistência maior para o imipenem (CIM = 128 µg/mL), ertapenem e meropenem

(CIM ≥512 µg/ml). Este comportamento foi justificado pela ausência da porina

OmpK36 que contribuiu para os altos valores de resistência.

A resistência aos carbapenêmicos ainda é rara em espécies pertencentes à

família Enterobactériaceae (Livermore & Woodford 2006). Porém, o uso

indiscriminado dos carbapenêmicos tem acarretado no desenvolvimento de

resistência em bactérias Gram-negativas nos últimos anos, em decorrência de

diversos fatores, entre estes, a pressão seletiva (Nordmann & Poirel 2002). Assim,

relatos de carbapenemases em espécies da família Enterobacteriaceae ainda são

pouco frequentes, principalmente na América Latina. Deshpande e colaboradores

em 2006 concluíram, dos estudos realizados pelo programa SENTRY (2000 -

2004), que a prevalência das carbapenemases em enterobactérias, era baixa

naquele período, mas já se encontrava disseminada pelo mundo, com exceção da

América Latina (Deshpande et al., 2006).

No entanto, o primeiro relato na América Latina deste mecanismo de

resistência ocorreu em 2003, no Brasil, em uma amostra de Klebsiella

pneumoniae produtora de IMP-1. Desde então, nessa região, os membros da

família Enterobactériaceae têm sido relacionados apenas com esta MBL e à

presença da serino carbapenemase KPC-2 (Lincopan et al., 2005, Villegas et al.,

2006 e Pasteran et al. 2008, Peirano et al., 2009, Monteiro et al., 2009), dados

coerentes com o encontrado no atual estudo, uma vez que os sete isolados que

apresentaram hidrólise significativa foram confirmados para estas enzimas.

81

As MBLs têm uma alta prevalência na Europa e Oriente Médio e têm

emergido nas áreas onde P. aeruginosa produtoras destas enzimas são

endêmicas, como Turquia, Grécia e Itália (Castanheira et al., 2008), o que sugere

uma disseminação dessas enzimas a partir destas bactérias. No Brasil, o primeiro

relato de IMP-1 foi feito por Gales e colaboradores em 2003 em uma amostra de

A. baumanni isolada do complexo Hospital São Paulo/UNIFESP (Gales et al.,

2003). Depois deste estudo, diversos surtos foram relatados neste hospital, entre

eles, o primeiro de K. pneumoniae produtora de MBL, IMP-1 no Brasil (Grinbaum

et al., 2004) e, no ano 2005, o relato de uma cepa de K. pneumoniae produtora

de IMP-1 no Hospital Universitário da USP isolada em 2003. Esses dados indicam

um comportamento similar ao descrito por Castanheira em razão da presença de

MBL em enterobactérias isoladas em nosso país (Lincopan et al., 2005, Lincopan

et al., 2006).

No presente estudo, as quatro cepas de K pneumoniae produtoras de IMP-

1 foram limitadas a três centros hospitalares de São Paulo em um período de três

anos, o que sugere uma disseminação mais restrita deste determinante entre as

bactérias dessa família. Os três isolados de K. pneumoniae, Kp-1, Kp-11 e Kp-14,

pertencentes ao hospital Servidor Público Estadual e ao laboratório médico

Análises Clínicas, foram clonalmente relacionadas com o primeiro isolado de IMP-

1, descrito por Lincopan e colaboradores em 2005, denominado neste estudo

como Kp-9, o que indica uma origem comum desses isolados e das amostras

relatadas no ano seguinte por este mesmo autor. A amostra de Enterobacter

gergoviae, pertencente ao Hospital das Clínicas da USP, foi isolada no mesmo

ano que as cepas de K. pneumoniae, o que sugere uma transferência horizontal

82

desse determinante de resistência a partir dos isolados apresentados nos demais

hospitais da cidade de São Paulo (Penteado, 2007, Lincopan et al., 2006;

Grimbaum, et al., 2004 ), no entanto, não foi confirmada a localização do gene no

plasmideo, uma vez que a transformação de DH10B e o DNA plasmidial extraído

das cepas produtoras de IMP-1 não foi realizada com êxito.

A localização genética da enzima IMP-1 encontra-se associada a integrons

de classe 1, os quais carregam adicionalmente outros genes codificadores de

determinantes de resistência a outros antibióticos (Poirel & Nordmann 2002;

Penteado et a., 2009) . Em uma publicação recente, Penteado e colaboradores

descreveram o integron de classe 1 específico de 2,5 Kb denominado In86 que

carrega o gene blaIMP-1, nas cepas de K. pneumoniae provenientes do HSPE e na

primeira cepa produtora de IMP-1 no Brasil. O gene blaIMP-1 situa-se na primeira

posição com mais dois genes cassetes aacA30 e aadA1 que conferem resistência

aos aminoglicosídeos, (Penteado, et al., 2009). Este tipo de integron já havia sido

descrito anteriormente em Acinetobacter spp e Pseudomona putida isoladas de

outro hospital da cidade de São Paulo (Mendes et al., 2007), localizando-se no

cromossomo bacteriano, porém, nas amostras de Klebsiella pneumoniae, o

integron foi localizado em um plasmideo, o que sugere que o In86 foi

recentemente mobilizado por plasmidios, disseminando para espécies isoladas em

três hospitais de São Paulo (Penteado et al., 2009). Uma vez que os resultados

aqui apresentados, assim como o já publicado por Penteado e colaboradores,

demostram clonalidade entre as cepas produtoras de IMP-1, tendo em comum a

primeira cepa relatada aqui no Brasil, podemos concluir que a localização genética

83

do gene de IMP-1 na cidade de São Paulo está fortemente relacionado ao

integron de classe 1 In86 (Penteado, et al., 2009).

Diferente das MBLs, prevalentes na Europa e Ásia, as publicações do

SENTRY correspondentes aos anos 2000 e 2005 mostraram que as serino

carbapenemases são mais prevalentes na América, especificamente na América

do Norte, onde a presença da enzima KPC tem sido confirmada em bactérias

hospitalares da cidade de Nova York, constituindo um sério problema

epidemiológico (Castanheira et al., 2008). Atualmente, as serino-carbapenemases

têm sido descritas na América Latina com uma diversidade relativamente maior

que as MBLs. Dentre essas ezimas, GES-1 e GES-5 têm sido descritas na

Argentina e no Brasil; NMC-A na Argentina e KPC na Colômbia e Argentina

(Walther-Rasmussen & Høiby 2007, Villegas et al., 2006, Pasteran et al., 2008).

Recentemente, no Brasil, têm sido relatada a presença da enzima KPC-2 em

amostras de K. pneumoniae provenientes de Pernambuco, Rio de Janeiro e São

Paulo, assim como em Enterobacter cloacae no Rio grande do Sul, o que confirma

uma disseminação dessa enzima na América Latina e também no Brasil (Peirano

et al., 2009, Monteiro et al., 2009, Dinato, et al., 2008, Zavascki, et al., 2009 ;

Pavez et al., 2009).

Os resultados deste trabalho contribuem com o estudo da prevalência da

enzima KPC, já que os dois isolados produtores de KPC-2, aqui descritos, são os

primeiros casos relatados em São Paulo. Curiosamente, a cepa Kp-13,

proveniente do centro hospitalar laboratório clínico Endomed Ltda., foi isolada em

2005, um ano antes da cepa relatada em Pernambuco por Monteiro e

colaboradores, o que sugere que o surgimento dessa enzima no Brasil data do

84

ano 2005, sendo aparentemente o primeiro isolado da cidade de São Paulo

(Monteiro, et al., 2009, Pavez, et al., 2009).

A localização do gene blaKPC tem sido observada em plasmideos de

diversos tamanhos podendo apresentar mais de uma cópia do gene,

demonstrando alta capacidade de mobilização (Gootz, et al., 2009).

Recentemente, Naas e colaboradores descreveram o entorno genético do gene

blaKPC-2, o qual revelou a inserção dentro de um transposon denominado Tn4401.

Até o momento, este elemento tem sido o único relacionado ao gene blaKPC, não

sendo localizado em cromossomo ou em integron (Naas, et al., 2008). Nosso

estudo confirmou a presença de blaKPC em plasmideos maiores de 23 kb. Embora

as cepas Kp13 e Kp35 tenham apresentado plasmideos, a transferência do gene

só foi confirmada quando usamos a cepa Kp-13 como doadora do plasmídio.

Apesar das carbapenemases serem o determinante de resistência mais

prevalente e amplamente disseminado, o primeiro mecanismo de resistência ao

imipenem, descrito na espécie Klebsiella pneumoniae, foi associado com

impermeabilidade da membrana e presença da enzima AmpC (Thomson &

Bonomo 2005).

Na América Latina, a resistência aos carbapenêmicos tem sido

esporadicamente associada à perda da porina de 36 kDa (Mendes et al. 2004;

Pavez et al., 2008), sendo a presença de enzimas hidrolisadoras de imipenem o

mecanismo mais prevalente em Enterobacteriaceae (Lincopan et al., 2005,

Villegas et al., 2005, Mendes et al., 2004, Pasteran et al., 2008, Peirano et al.,

2009; Pavez et al., 2009).

85

Nosso estudo descreve uma prevalência maior de impermeabilidade da

membrana, evento pouco relatado na América Latina, sugerindo que a resistência

ao imipenem nos isolados estudados tem sido um mecanismo de adaptação da

bactéria decorrente da pressão seletiva conferida pelo amplo uso dos

carbapenêmicos.

O perfil de expressão das porinas de membrana externa mostrou uma única

ausência da porina OmpK36 ou seu homólogo OmpC na maioria dos isolados

estudados. Este determinante contribuiu para a resistência aos carbapenêmicos,

principalmente naquelas cepas com altos níveis de resistência para o antibiótico

ertapenem, o que foi característico destes isolados.

A ausência da expressão da OmpK36/OmpC deve-se a diversos

mecanismos moleculares que interferem na seqüência codificante do gene da

OMP e a outros que interferem apenas na expressão da proteína (Doumith, et al.,

2009, Pages, et al., 2008). Das 23 cepas caracterizadas pela ausência da porina,

4 apresentaram sinais compatíveis com a presença de IS. De fato, em um estudo

recente realizado por Doumith sobre os mecanismos moleculares que interferem

na expressão de proteínas, foram descritos quatro IS diferentes que

interromperam a região codificante da proteína OmpK36 (Doumith, et al., 2009).

As cepas Kp-38, Kp-35 e Ea-37 apresentaram um aumento maior que 1500pb no

tamanho esperado do produto de PCR obtido usando primers específicos para

amplificar o gene ompC/ompK36. No estudo de Doumith, também foi observada a

ausência de amplificação do gene de OmpK36 em um dos isolados estudados,

situação encontrada na cepa Eg2 de nosso estudo, indicando a deleção desse

86

fragmento de DNA ou mutações diversas que afetam a seqüência dos partidores

(Doumith, et al., 2009).

Existem diversos relatos sobre a contribuição da impermeabilidade da

membrana externa na resistência aos carbapenêmicos e há, também,

controvérsias, uma vez que a análise do mecanismo de resistência por

impermeabilidade é uma área relativamente nova de pesquisa (Poirel et al. 2004,

Kim et al. 2007, Bradford et al. 1997, Kackzmarek et al. 2006).

O mecanismo de resistência que envolve a impermeabilidade da membrana

externa está associada à perda das duas principais porinas de 36 e 35 kDa

(Pages, et al., 2008). A ausência da porina OmpK36 ou seu homólogo OmpC

confere maior resistência aos β-lactâmicos, incluindo o imipenem, sendo mais

relatada em comparação com a perda da porina OmpK35 ou seu homólogo OmpF

(Pages et al., 2008, Martinez-Martinez et al., 1999). A perda dessas duas porinas

maiores contribui para a extensão do perfil de resistência a outras classes de

antibióticos (e.g., ciprofloxacina) e para um aumento do nível de expressão da

resistência aos β-lactâmicos. A perda das duas porinas não tem sido descrita com

freqüência, pois essa ausência leva a uma menor sobrevida da bactéria

similarmente aos casos de respostas adaptativas extremas (Davin-regli et al.,

2008). Nesta situação, como alternativa, a bactéria pode compensar a restrição de

nutrientes decorrentes das perdas das porinas OmpK35/OmpK36, mediante a

produção de uma nova proteína (OmpK37), a qual permite a entrada normal de

nutrientes, mas não a entrada de β-lactâmicos, isto devido à conformação de seu

canal. Portanto, a presença desta nova proteína está relacionada com altos níveis

de resistência para estes antibióticos (Pages et al., 2008).

87

A co-produção de β-lactamases na perda da permeabilidade de membrana

externa foi a principal característica dos isolados estudados. Em um trabalho feito

no ano 1999, os autores Martinez- Martinez e colaboradores demonstraram essa

participação sinérgica entre β-lactamases (ESBL e AmpC) e ausência de porina

como mecanismo de resistência ao imipenem.

A resistência aos carbapenêmicos pela produção de enzimas do tipo

AmpC e ESBL associadas à impermeabilidade de membrana tem sido descrita em

diversos lugares do mundo, porém o entendimento desse mecanismo não está

totalmente elucidado. Alguns autores (Caio et al. 2000) confirmaram o

envolvimento dessas β-lactamases com a resistência aos carbapenêmicos,

descrito previamente por Martinez (Martinez-Martinez, et al., 1999), verificando a

necessidade da combinação da ausência da porina e produção de enzima para a

resistência aos carbapenêmicos, uma vez que uma fraca atividade de

carbapenemase é produzida pelas enzimas AmpC e algumas ESBL, contribuindo

para essa resistência (Thomson & Bonomo, 2005, Girlich et al., 2008).

Assim, a caracterização de resistência aos carbapenêmicos realizada no

presente trabalho mostrou que esse fenômeno de impermeabilidade de membrana

externa está sendo emergente nos membros da família Enterobacteriaceae

isolados nos hospitais da cidade de São Paulo, uma vez que 18 cepas

correspondentes a 64% dos isolados estudados apresentaram alguma associação

entre enzimas β-lactamases do tipo AmpC e ESBL e perda de porina, sendo 83%

produtoras de enzimas do tipo AmpC e 17% de enzimas ESBL.

A presença de AmpC nos isolados da América Latina não tem sido relatada

com freqüência. Em 2008, no Rio de Janeiro, foram identificadas fenotipicamente

88

cepas sugestivas de AmpC, mas sem uma confirmação genética. No mesmo

período, na Argentina, Rapaport e colaboradores descreveram a enzima CMY-2

em Shigellla flexneri (Da Silva et al. 2008, Rapaport et al. 2008). O primeiro relato

confirmado de AmpC no Brasil foi realizado por nosso grupo de pesquisa,

coincidindo com o primeiro relato na América Latina sobre a resistência aos

carbapenêmicos mediada por impermeabilidade de membrana descrita em uma

espécie de Escherichia coli produtora da enzima CMY-2 like. Os quatro isolados

desta espécie apresentaram alta resistência a todos os carbapenêmicos em

função da perda da porina OmpC associada à produção dessa enzima. A

presença de este isolado confirma a emergência da enzima CMY-2 like na

América Latina e sua prevalência no mundo (Pavez et al. 2008 Poirel et al. 2004,

Liu et al. 2008). A localização plasmidial da enzima CMY-2 tem contribuído com a

disseminação mundial desta β-lactamase. As cepas de E. coli confirmaram a

localização plasmidial por meio da transformação de um plasmideo > 23 Kb que

carregava o gene blaCMY-2 e este gene não foi relacionado a nenhum outro

elemento de mobilidade como o integron.

As 11 cepas positivas para a triagem de enzimas de classe C do tipo

MIR/ACT-like foram seqüenciadas e confirmadas como AmpC cromossômicas

intrínsecas de Enterobacter aerogenes com uma similaridade de 100%.

Curiosamente, dentre os isolados, a cepa Ea-39 mostrou um comportamento

diferente quanto ao perfil fenotípico de resistência, na qual a indução da enzima

AmpC pelos antibióticos ceftriaxona e aztreonam foi clara. Segundo Perez-Perez e

Hanson, a positividade cruzada do produto de PCR da AmpC cromossômica com

AmpC plasmidial da família MIR/ACT ocorre apenas com AmpC cromossômica de

89

E. cloacae, uma vez que a família MIR/ACT deriva da AmpC desta espécie, porém

em nosso estudo a enzima cromossômica de Enterobacter aerogenes levou a

uma positividade cruzada sugerida pelo gênero comum das espécies, evento não

descrito por Perez-Perez e Hanson (Perez- Perez & Hanson 2002). A super

expressão dessa AmpC cromossômica, possivelmente contribui para a

resistência ao imipenem associada a uma impermeabilidade de membrana

(Jacoby, 2009). A localização de uma AmpC do tipo plasmidial foi também

descartada pelo resultado negativo da transformação.

A enzima AmpC, DHA-1 encontrada nas cepas Kp-9 e Kp-3, teve um papel

pouco significativo no perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, uma vez

que a expressão dessa enzima está ligada ao gene AmpR , sendo então uma das

poucas enzimas AmpC plasmidiais induzíveis, frente a pressão seletiva do

antibiótico (Jacoby 2009). Além da localização plasmidial da enzima, o gene

blaDHA-1 encontra-se inserido em pequenos integrons complexos de classe 1

(Jacoby 2009). De fato, nos isolados estudados, o gene blaDHA-1 foi observado em

integrons de classe1.

Finalmente, os isolados Kp-16, Kp-22 e Kp-38 foram relacionados à

impermeabilidade associada à produção de ESBL. Os três isolados produziram

enzimas de diferentes famílias, tendo em comum apenas a família CTX-M. Um

dos indicativos para a sugestão desse mecanismo foi o comportamento fenotípico

dos isolados. Os isolados apresentaram uma sensibilidade diminuída para o IMP

de 8 µg/mL, em comparação com as produtoras de AmpC, que apresentaram uma

CIM de 32 µg/mL para imipenem, com exceção da amostra Kp-38. Os diversos

trabalhos que relatam impermeabilidade de membrana acoplada à enzima do tipo

90

ESBL confirmam um perfil de alta resistência a todas cefalosporinas e uma

sensibilidade diminuída para imipenem com CIM entre 4 e 8 µg/mL. Essa

diminuição de sensibilidade fica ainda mais acentuada para meropenem e

ertapenem em forma seqüencial, este último com alta resistência (Martinez-

Martinez et al., 1999, Kim et al., 2007, Crowley et al., 2002, Livermore &

Woodford, 2006).

Outra característica encontrada nesses isolados associados à produção de

ESBL foi o comportamento frente ao inibidor de AmpC, conjugado com o

antibiótico imipenem. As três amostras não diminuíram sua CIM de forma

significativa, demonstrando que a resistência a esse antibiótico era devido à

ausência de porina e que a contribuição das enzimas ESBL é menor para a

resistência aos carbapenêmicos do que a descrita para as enzimas do tipo AmpC.

Esse resultado da CIM é coerente, uma vez que a hidrólise de imipenem pelas

enzimas ESBL é muito fraca ou nula (Walther-Rasmussen & Hølby 2007,

Martinez-Martinez et al., 1999).

Embora a localização genética das ESBL seja muito versátil, a enzima

CTX-M tem sido freqüentemente relacionada a plasmideos e elementos de

mobilização como o integron, porém das três cepas estudadas, nas cepas Kp-16 e

Kp38 não foi possível relacionar o gene de ESBL blaCTX-M com nenhum dos dois

elementos de mobilização citados. Observou-se uma transformação positiva para

um plasmideo de 23 Kb pertencente à cepa Kp-22 que carregava a enzima CTX-

M, mas a sensibilidade aos carbapenêmicos da cepa transformada não foi

mudada. A transformação da cepa Kp-38 foi positiva, mas o gene transferido não

foi relacionado com nenhuma enzima ESBL estudada e não foi identificado

91

nenhum plasmideo na cepa transformada (Figura 7), porém esta cepa apresentou

resistência à ceftazidima, cefotaxima e sensibilidade diminuída para ertapenem,

perfil possivelmente relacionado a algumas enzimas de classe A que não foram

estudadas neste trabalho.

Curiosamente, cepas de Enterobacter aerogenes produtoras de AmpC

cromossômica co-produziram ESBL do tipo CTX-M, cujo gene blaCTX-M foi

transferido com êxito para a cepa receptora E. coli DH10B, confirmando a

mobilização plasmidial da enzima nesta espécie.

Em relação ao estudo de similaridade genética entre os isolados estudados,

as duas técnicas de tipagem molecular realizadas tiveram uma boa correlação,

demonstrando alta eficiência para o estudo epidemiológico, no entanto, a técnica

de PFGE apresentou maior poder discriminativo entre as cepas de um mesmo

perfil ou cluster, quando comparada ao ERIC-PCR, permitindo uma análise mais

acurada na definição de clones ou clusters das cepas estudadas (Figura 6).

Assim, a técnica de ERIC-PCR permitiu a realização de uma análise geral da

diversidade genética entre as cepas estudadas, servindo como um teste de

triagem pela facilidade e rapidez e a técnica de PFGE contribuiu para uma análise

mais detalhada e discriminatória dos dados previamente analisados.

A tipagem molecular realizada para o estudo de diversidade gênica sugere

que o mecanismo de disseminação dos principais determinantes de resistência

deva ter ocorrido por uma disseminação clonal dentro de cada espécie,

evidenciada, principalmente, em dois centros hospitalares da cidade de São

Paulo.

92

Assim, o determinante de resistência IMP-1 foi encontrado em um clone de

K. pneumoniae denominado clone A, sugerindo que a partir da amostra Kp-9,

cepa proveniente do HU, houve disseminação para os demais centros

hospitalares HSPE e LAMAC, uma vez que essa primeira cepa relatada no Brasil

apresentava um perfil de restrição XbaI de menor similaridade quando comparada

às demais linhagens de K. pneumoniae. Este cluster não foi relacionado com

nenhum outro tipo de mecanismo de resistência para imipenem, com exceção da

cepa original Kp-9 que produziu em conjunto uma enzima de tipo AmpC, DHA-1

com ausência da porina de 36 kDa. Assim, neste isolado, esse mecanismo de

resistência adicional resultou em um perfil de resistência diferente das demais

cepas do mesmo clone (Anexo 1).

Os únicos isolados produtores de carbapenemases que não apresentaram

relação clonal foram as K. pneumoniae produtoras de KPC-2. Essas amostras

foram recuperadas de períodos e centros hospitalares diferentes, o que sugere

distintas origens ou, o fato mais provável neste caso, a ocorrência de uma

transferência horizontal dos genes de resistência.

Por outro lado, todos os isolados de Enterobacter aerogenes foram

clonalmente relacionados, pertencentes à linhagem B, com exceção das cepas

Ea-34 e Ea-39 que apresentaram maior diversidade genética, com resultados

semelhantes tanto pelo método de ERIC-PCR como por PFGE. Porém, estas

amostras geneticamente relacionadas provenientes de dois centros distintos,

HSPE e LAMAC, coletadas durante o ano 2007 confirmaram uma disseminação

entre esses dois centros hospitalares, além de sugerir a presença de um surto do

cluster B.

93

O determinante de resistência da enzima AmpC CMY-2 foi descrito apenas

na espécie de Escherichia coli proveniente do centro hospitalar HBP, denominado

clone C, em isolados de um mesmo paciente.

Os isolados Kp-16, Kp-22 e Kp-38, associados também a uma

impermeabilidade de membrana na sua resistência aos carbapenêmicos, não

foram relacionados a nenhum perfil predominante, o que sugere que esses

isolados possuem uma resistência do tipo adaptativa regulada por mecanismos

intrínsecos da bactéria induzidos pela pressão produzida pelos antibióticos

(Chevalier et al., 2008 ).

A caracterização molecular da resistência ao imipenem relatada neste

estudo permitiu identificar e confirmar individualmente perfis e comportamentos

das bactérias para os diversos determinantes de resistência, além de apresentar

associações e vínculos entre diferentes isolados, o que permitiu entender a sua

disseminação, informação fundamental para o êxito dos tratamentos e o

entendimento de falhas terapêuticas. Estudos epidemiológicos, assim como

pesquisas aprofundadas nos mecanismos envolvidos na impermeabilidade de

membrana são fundamentais para contribuir não só para a compreensão da

emergência de novos mecanismos de resistência, mas também com o controle da

sua disseminação .

94

6. Conclusões

6.1. A presença de um perfil de multiresistência foi identificada em todas as

amostras de enterobactérias resistentes aos antibióticos carbapenêmicos

(CIM entre 8 - 128 µg/mL), apresentando, ainda, uma elevada taxa de

resistência para a cefoxitina.

6.2. Foram identificados três principais mecanismos de resistência:

produção da MBL, produção da serino carbapenemase e impermeabilidade

de membrana associada à produção de β- lactamases.

6.3 A enzima IMP-1 foi a única MBL envolvida na resistência ao imipenem

na família Enterobactériaceae e a presença de KPC-2 foi detectada em

apenas duas amostras, sendo o primeiro relato na cidade de São Paulo,

confirmando uma disseminação desta enzima pela América Latina

6.4 A impermeabilidade de membrana pela perda da porina de 36 kDa

associada a uma co-produção de β-lactamases do tipo AmpC e ESBL foi o

determinante de resistência mais freqüente nas amostras estudadas.

6.5 A produção de AmpC tanto cormossômico como plasmidial dos isolados

estudados mostrou uma contribuição importante para a resistência aos

antibióticos carbapenêmicos .

95

6.6 A presença de integron foi identificada em 17 das 28 cepas de

enterobactérias, demonstrando que esta família apresenta alta capacidade

de disseminação. Porém, a localização de determinantes de resistência ao

imipenem em integron foi identificada apenas para a MBL IMP-1.

6.7 A mobilização dos genes determinantes de resitência ao imipenem foi

confirmada apenas para CMY-2 e KPC-2, com uma localização plasmidial

destes genes.

6.8 A tipagem molecular identificou uma disseminação clonal importante

para a maioria dos determinantes detectados, demonstrando uma baixa

incidência de transferência horizontal para a resistência aos

carbapenêmicos, com exceção da KPC-2 que não apresenta relação clonal

entre os isolados produtores desta enzima.

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*Referencias segundo associação Brasileira de Normas Tecnicas (ABNT) – NBR6023

113

114

ANEXOS

115

Cepa Perfil

PFGE

Concentração inibitória mínima (CIM) µg/ml Triagem β-lactamases IMP IMP/EDTA IMP/APB MER ERT FOX FOX/APB CAZ CAZ/APB Bioensaio MBL AmpC ESBL

Ea-39 L 16 8 1 32 64 >512 8 2 1 (-) (-) + (-)

Kp-12 D 2 2 2 4 16 32 32 32 8 (-) (-) (-) +

Ec-1 C 32 16 16 128 512 >512 >256 >512 16 (-) (-) + (-)

Ec-2 C 32 8 16 128 256 >512 >256 >512 16 (-) (-) + (-)

Ec-3 C 32 32 8 128 512 >512 256 256 8 (-) (-) + (-)

Ec-4 C 32 8 8 128 512 >512 256 512 8 (-) (-) + (-)

Kp-11 A 64 2 32 128 512 >512 >256 256 256 + + (-) +

Kp-14 A 4 0,5 4 16 8 >512 >256 512 512 + + (-) +

Kp-1 A 8 1 4 16 8 >512 >256 512 512 + + (-) +

Kp-9 A 128 1 128 256 256 >512 >256 256 256 + + (-) +

Kp-38 H 128 32 64 128 256 64 64 128 16 (-) (-) (-) (-)

Kp-13 F 32 32 4 256 256 256 128 128 8 + (-) (-) (-)

Kp-16 J 8 4 4 128 512 64 32 32 8 (-) + + +

Kp-35 I 128 64 0,5 512 >512 256 32 64 1 + (-) (-) (-)

Ea-25 B 32 32 2 64 256 >512 128 64 1 (-) (-) + (-)

Ea-5 B 32 16 2 16 32 >512 64 1 0,5 (-) (-) + (-)

Ea-20 B 64 16 4 64 256 >512 64 64 8 (-) (-) + (-)

Ea-23 B 32 16 4 64 256 >512 64 32 16 (-) + + (-)

Ea-4 B 32 16 4 64 128 >512 64 32 8 (-) (-) + (-)

Ea-18 B 32 32 4 64 128 >512 >256 32 8 (-) (-) + (-)

Ea-36 B 32 32 8 128 256 >512 >256 64 16 (-) (-) + (-)

Ea-37 B 32 16 8 128 256 >512 >256 64 16 (-) (-) + (-)

Ea-21 B 32 32 4 64 256 >512 128 64 8 (-) (-) + (-)

Ea-34 M 16 16 2 32 128 >512 32 32 4 (-) (-) + +

Kp-15 G 0,125 0,5 0,125 0,25 0,125 32 32 0,5 0,5 (-) (-) (-) (-)

Kp-22 K 16 8 4 128 256 256 128 128 16 (-) + + (-)

Kp-3 F 1 2 1 0,25 0,06 8 16 0,5 0,5 (-) (-) (-) (-)

Anexo 1a.

116

D

Cepa Perfil

PFGE Amostra clinica Data de

isolamento

Centro

Hospitalar

Screening PCR β-lactamases OmpC/OmpK36

SDS-PAGE Carbapenemases AmpC ESBL

Ea-39 L Urina Janeiro-2008 HBP blaMIR/ACTlike (-)

Kp-12 D Sangue Novembro-2005 HSPE blaSHVlike, blaTEMlike, blaCTX-Mlike +

Ec-1 C Sangue Julho-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)

Ec-2 C sangue Julho-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)

Ec-3 C Sangue Agosto-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)

Ec-4 C Cateter Agosto-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)

Kp-11 A Sangue Fevereiro-2005 HSPE blaIMP-1 blaSHVlike, blaCTX-Mlike +

Kp-14 A Sec. Abdominal Maio-2006 LAMAC blaIMP-1 blaSHVlike +

Kp-1 A Sec. Abdominal Maio-2005 LAMAC blaIMP-1 blaSHVlike, blaTEMlike +

Kp-9 A Sangue Março-2003 LAMAC blaIMP-1 blaDHA-1 blaSHVlike, blaCTX-Mlike (-)

Kp-38 H Liq. Ascitico Janeiro-2008 HBP blaSHVlike, blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)

Kp-13 F Sangue Maio-2005 LCE blaKPC-2 blaSHVlike, blaCTX-Mlike +

Kp-16 J Sangue Julho-2005 LR blaSHVlike, blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)

Kp-35 I Sangue Novembro-2007 LAMAC blaKPC-2 blaSHVlike (-)

Ea-25 B Urina Maio-2007 HSPE blaMIR/ACTlike (-)

Ea-5 B Urina Março-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike (-)

Ea-20 B Urina Maio-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)

Ea-23 B Urina Maio-2007 HSPE blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)

Ea-4 B Sangue Junho-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)

Ea-18 B Urina Julho-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)

Ea-36 B Sangue Novembro-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)

Ea-37 B Sangue Novembro-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)

Ea-21 B Urina Abril-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)

Ea-34 M Sangue Outubro-2007 HSPE blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)

Kp-15 G Sangue Março-2007 COB blaSHVlike +

Kp-22 K Sangue Março-2007 COB blaCTX-Mlike (-)

Kp-3 F Sangue Março-2007 COB blaDHA-1 blaSHVlike +

Anexo 1b .

117

Nota anexo 1: Ea: Enterobacter aerogenes, Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec: Escherichia coli, IMP: imipenem, IMP/EDTA: imipenem com inibidor EDTA, IMP/APB: imipenem com inibidor Acido fenil Boronico, MER: meropenem, ERT: ertapenem, FOX: cefoxitina, MBL: metalo-β-lactamase, ESBL: β-lactamase de espectro estendido, HBP: Hospital da Beneficiência Portuguesa - SP, HSPE: Hospital Servidor Público Estadual - SP, LAMAC: Laboratório Médico Analises Clínicas - SP, LCE: Laboratório Clínica Endomed Ltda. -SP, LR: Laboratório privado Richet –RJ, COB: Centro Oncológico Boldrini, Campinas –SP, bla: gene β-lactamase, +: positivo/presença, (-): negativo/ausença

118

Anexo 2

119

120

121

Anexo 3

122

Anexo 4. Curriculum Lattes Dados pessoais

Nome Mónica Alejandra Pavez Aguilar

Nome em citações bibliográficas

PAVEZ, M.

Endereço profissional

Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Av. Prof Lineu Prestes 580, Bloco 17, Laboratorio de Microbiologia Clinica Butanta 05508-900 - Sao Paulo, SP - Brasil Telefone: (11) 30913636

Formação acadêmica/Titulação

2007 Mestrado em andamento em Farmácia (Análises Clínicas) . Universidade de São Paulo, USP, Brasil. Título: Caracterização molecular da resistência ao Carbapenens em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileiros, Orientador: Elsa Masae Mamizuka. Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.

2001 - 2006 Graduação em Licenciatura em Tecnología Medica . Graduação em Licenciatura em Tecnología Medica. Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.

2001 - 2006 Graduação em Tecnologia Médica Menção Laboratório Clínico, Hema . Graduação em Tecnologia Médica Menção Laboratório Clínico, Hema. Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.

Formação complementar

2008 - 2008 Treinamento de PCR em tempo real. (Carga horária: 32h). Applied Biosystems do Brasil.

2005 - 2005 Sistemas de Gestión de la Calidad Aplicados al Lab. (Carga horária: 22h). Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.

2004 - 2004 Sistemas de Gestión de la Calidad Aplicados al Lab. (Carga horária: 16h). Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.

Atuação profissional

Universidade de São Paulo, USP, Brasil.

Vínculo institucional

2008 - 2008 Vínculo: livre, Enquadramento Funcional: Monitoria, Carga horária: 6

02/2008 - 07/2008 Ensino, Microbiologia clínica, Nível: Graduação.

Programa de Aperfeiçõamento de Ensino (PAE) FBC0502 - Microbiologia clínica

123

Hospital Intercultural de Nueva Imperial, HI, Chile .

Vínculo institucional

2007 - 2007 Vínculo: Servidor Público, Enquadramento Funcional: Tecnologo Medico(substituiçao de cargo)., Carga horária: 44

Laboratório Clínico Antumalal, LA, Chile.

Vínculo institucional

2006 - 2007 Vínculo: Privado, Enquadramento Funcional: Tecnólogo Médico Director Técnico, Carga horária: 20

Hospital Regional de Temuco ,Hernan Henriquez Arave na, HT, Chile.

Vínculo institucional

2006 - 2006 Vínculo: Servidor Público, Enquadramento Funcional: Auxiliar paramedico (substituição de cargo), Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva.

Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.

Vínculo institucional

2004 - 2004 Vínculo: Livre, Enquadramento Funcional: Ayudantia Parasitologia, Carga horária: 4

Atividades

10/1999 - 06/2006 Extensão universitária , Dirección de Extensión y Formación Continua de la Universidad de La Frontera

10/2004 - 12/2004 Extensão universitária , Projeto de Extensão e Comunicações de Acreditação Permanente N 041/2004, .

Atividade de extensão realizada Promoción de Salud en Escuela Básica. Satisfacción de una Necesidad y Aporte al Entorno Social . Temuco, Chile.

01/2004 - 12/2004 Pesquisa e desenvolvimento , Projeto Rüpü Grant 1014- 1000, .

04/2004 - 04/2004 Outras atividades técnico-científicas , Universidad de La Frontera e Governo do Chile - Ministério da Saúde.

Atividade realizada Coordenação e desenvolvimento das XII Jornadas Multidisciplinarias de Medicina Interna.

124

Áreas de atuação

1. Grande área: Ciências da Saúde / Área: Farmácia / Subárea: ANALISES CLINICAS.

2. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Bioquímica.

3. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Microbiologia.

4. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Parasitologia.

5. Grande área: Ciências da Saúde / Área: Farmácia / Subárea: ANALISES CLINICAS / Especialidade: Hematologia.

Idiomas

Espanhol Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem.

Português Compreende Bem, Fala Razoavelmente, Lê Bem, Escreve Razoavelmente.

Inglês Compreende Razoavelmente, Fala Razoavelmente, Lê Bem, Escreve Razoavelmente.

Prêmios e títulos

2008 Menção honrosa por trabalho apresentado na XIII semana Farmaceutica de ciência e tecnologia, Faculdade de Ciência Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

2008 Menção Honrosa por trabalho apresentado no 1º Simposio Internacional de Microbiologia clínica, Sociedade Brasileira de Microbiologia.

2006 Prêmio Colegio de Tecnólogos Médicos de Chile A.G Melhor Aluna da Menção Laboratório Clínico, Hematologia e Banco de Sangue da Carreira de Tecnología Médica, Universidad de La Frontera Promoção 2006, Colegio de Tecnologos de Chile A.G..

2006 Priemeira colocada da turma dos formandos do ano 2006 na Carreira de Tecnologia Medica, Universidad de La Frontera.

Produção em C,T & A

Produção bibliográfica

Artigos completo s publicados em periódicos

1. PAVEZ, M. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Early dissemination of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 53, p. 2702-

2702, 2009.

2. PAVEZ, M. ; NEVES, P. ; DROPA, M. ; MATTE, M. H. ; GRINBAUM, R. ; DE ARAUJO, M. R. E. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Emergence of carbapenem-resistant Escherichia coli producing CMY-2-type AmpC beta-lactamase in Brazil. Journal of Medical Microbiology, v. 57, p.

1590-1592, 2008.

125

Resumos publicados em anais de congressos

1. PAVEZ, M. ; NEVES, P. ; DROPA, M. ; MATTE, M. H. ; GRINBAUM, R. ; DE ARAUJO, M. R. E. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Escherichia coli produtora de beta-lactamase ampC tipo CMY-2 resistente a antibiótico carbapenêmico, no Brasil. In: 1º Simposio internacional de microbiologia clínica, 2008, Gramado-RS. anais 1º Simposio internacional de microbiologia clínica. São Paulo-SP : sociedade brasileira de microbiogia, 2008.

2. NEVES, P. ; Silva, M.T. N. ; Antonio, C.S ; PAVEZ, M. ; NORONHA, M.C.A ; ATOBE, J. ; CASSETARI, V.C. ; MARTINEZ, M. B. ; LEVY, C. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Co-produção de metilases rRNA 16S e metalo-beta-lactamases em isolados clínicos multirresistentes de Pseudomonas aeruginosa disseminados em São Paulo, Brasil. In: 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2007, Brasilia. XXIV Congresso Brasileiro de Microbiologia,, 2007.

Apresentações de Trabalho

1. PAVEZ, M. ; NEVES, P. ; DROPA, M. ; MATTE, M. H. ; GRINBAUM, R. ; DE ARAUJO, M. R. E. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Escherichia coli produtora de beta-lactamase tipo CMY-2 resistente a antibiótico carbaoenêmico, no Brasil. 2008. (Apresentação de Trabalho/Simpósio).

2. PAVEZ, M. ; Coñoman J ; Opazo M ; Salazar, L.A . Evaluación del efecto de la suplementación oral con Monohidrato de Creatina sobre marcadores biológicos de salud, en adolescentes que practican deporte de alto rendimiento. 2005. (Apresentação de Trabalho/Congresso).

Produção artística/cultural

1. Pavez, M.A. ; PAVEZ, M. . Las Manos de mi Madre. 2006. (Apresentação de obra artística/Musical).

Eventos

Participação em eventos

1. 1º Simposio Internacional de Microbiologia Cínica.Escherichia coli produtora de beta-lactamse AmpC tipo CMY-2 resistente a antibiótico carbapenênmico, no Brasil. 2008. (Simpósio).

2. XIII semana Farmacêutica de Ciência e tecnologia.Emergence of CMY-2-type ampC beta-lactamase producing carbapenems resistant Escherichia coli in Brazil. 2008. (Encontro).

3. XIII semana farmauceutica de Ciência e tecnologia.Produção de Carbapenemases em Enterobactérias isoladas em hospitais de São Paulo:Emergência da variante KPC-2 no Brasil. 2008. (Encontro).

4. 2º Congreso Científico de Estudiantes de Tecnología Médica del Sur y IV Jornadas de Estudiantes de Tecnología Médica - Universidad de La Frontera.Evaluación del efecto de la suplementación oral con Monohidrato de Creatina sobre marcadores biológicos de salud, en adolescentes que practican deporte de alto rendimiento. 2005. (Congresso).

5. XII Congreso Chileno de Tecnología Médica. 2004. (Congresso).

6. XII Jornadas Multidisciplinarias de Medicina Interna. 2004. (Outra).

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Anexo 5. Ficha Aluno

Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Documento sem validade oficial

9136 - 5842691/1 - Mónica Alejandra Pavez Aguilar

Email: monicapavez@usp.br

Data de Nascimento: 26/05/1983 Cédula de Identidade: RNE - V504287-L - DF Local Nascimento: Chile Nacionalidade: Chilena Graduação: Licenciado en Tecnologia Medica - Universidad de La Frontera - - Chile

– 2006

Curso: Mestrado em Farmácia Área: Análises Clínicas Data da Matrícula: 05/07/2007 Início da Contagem de Prazo: 05/07/2007 Data Limite: 05/01/2010 Orientador(es): Prof(a). Dr(a). Elsa Masae Mamizuka - 05/07/2007 a -- E.Mail:

mamizuka@usp.br Proficiência em Línguas:

Exame de Qualificação: Aprovado em 05/02/2009 Data do Depósito do Trabalho:

Data máxima para aprovação da Banca: Título do Trabalho:

Data de Aprovação da Banca:

Data Máxima para Defesa:

Data da Defesa:

Resultado da Defesa:

Ocorrência: Última matrícula em 05/02/2009

Sigla Nome da Disciplina Início Término Carga Hor. Cred. Freq. Conc. Exc.

Sit. Matric.

FBC5757-1 Seminários em Análises Clínicas II 06/08/2007 18/11/2007 30 2 75.00 A N Concluída

FBC5717-4 Tópicos Avançados Sobre Imunoquímica de Antígenos

20/08/2007 10/09/2007 75 0 0.00 - N Matrícula cancelada

BMM5734-7 Genética de Microrganismos 01/10/2007 05/11/2007 150 10 100.00 A N Concluída

FBC5707-5 Infecção hospitalar: 05/11/2007 26/11/2007 75 5 100.00 A N Concluída

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recursos laboratoriais tradicionais e avançados na investigação, epidemiologia, profilaxia e controle

BMM5826-1

Análise crítica de métodos de detecção de expressão gênica em bactérias de interesse médico e odontológico

04/03/2008 08/04/2008 60 4 100.00 A N Concluída

FBC5793-8 Seminários em Análises Clínicas 11/03/2008 23/06/2008 30 2 80.00 A N Concluída

FBA5728-2 Aprimoramento Didático 06/05/2008 02/06/2008 60 4 100.00 A N Concluída

MIP5726-3

Avaliação de Sensibilidade aos Antimicrobianos e Caracterização Molecular dos Diferentes Mecanismos de Resistência

08/09/2008 28/09/2008 60 4 100.00 A N Concluída

Créditos mínimos exigidos Para Exame de Qualificação

Para Depósito de Dissertação/Tese Créditos obtidos

Disciplinas: 25 25 Disciplinas: 31 Atividades Programadas: 0 0 Atividades Programadas: 0 Seminários: 0 0 Seminários: 0 Estágios: 0 0 Estágios: 0 Total: 25 25 31

Créditos Atribuídos à Dissertação : 71

Conceito até 31/12/1996: A - Excelente, com direito a crédito; B - Bom, com direito a crédito; C - Regular, com direito a crédito; D - Insuficiente, sem direito a crédito; E - Reprovado, sem direito a crédito; I - Incompleto; J - Abandono

Justificado; T - Transferência.

Conceito a partir de 02/01/1997: A - Excelente, com direito a crédito; B - Bom, com direito a crédito; C - Regular, com direito a crédito; R -

Reprovado; T - Transferência.

Um(1) crédito equivale a (15) horas de atividade programada.

Situação em: 20/07/2009 19:41