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Polyanna Araújo Alves Bacelar
Licenciada em Ciências Biológicas
Caracterização citogenética em acessos de Allium sativum L.
Orientadora:
Profª. Drª. Ana Paula Peron
Coorientadores:
Drª. Lidiane de Lima Feitoza
Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho
Profª. Drª. Ângela Celis de Almeida Lopes
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Piauí como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de “Mestre”.
Teresina – PI
2014
Caracterização citogenética em acessos de Allium sativum L.
Polyanna Araújo Alves Bacelar
Aprovada em ____/____/______
Comissão julgadora:
Drª. Lidiane de Lima Feitoza – PPGM/UFPI
Profª. Dr. Reginaldo de Carvalho – UFRPE
Profª. Drª. Ângela Celis de Almeida Lopes – CCN/UFPI
Profª. Drª. Ana Paula Peron – CSHNB/UFPI
(Orientadora)
Aos meus queridos pais,
Maria do Socorro Bacelar e
Francisco Bacelar, que
sempre apoiaram,
incentivaram e aplaudiram em
cada sonho que conquistei.
À minha amada avó Altina
de Araújo, que segurou em
minhas mãos ajudando a
tracejar os rabiscos das
primeiras palavras que
escrevi.
Dedico!
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela proteção e bênçãos em minha vida;
Ao Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento pela oportunidade de
realização do Curso;
À Universidade Federal do Piauí, pelo afastamento concedido para minha
qualificação;
Ao Prof. Dr. José Baldin Pinheiro e ao Msc. João Paulo Gomes Viana, que
disponibilizaram os acessos de alho do Banco Ativo de Germoplasma da Escola
Superior de Agricultura ‘Luiz de Queiroz’- Universidade de São Paulo;
À Profª. Drª. Ana Maria Benko Iseppon, por permitir o uso do microscópio de
fluorescência do Laboratório de Biologia Vegetal da Universidade Federal de
Pernambuco;
À Profª. Drª. Ana Paula Peron, pela orientação, dicas, críticas, empenho e
contribuição para a realização deste trabalho;
À Profª. Drª. Ângela Celis de Almeida Lopes, pela coorientação e por agir sempre
com o carinho de mãe com os seus ‘filhos da pós-graduação’;
À pesquisadora Drª. Lidiane de Lima Feitoza pela coorientação, direcionamentos e
críticas no trabalho, por compartilhar um espaço em seu lar (Recife) e principalmente
pelos ensinamentos em citogenética;
Ao Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho pelos ensinamentos, valiosas sugestões e por
permitir que eu desenvolvesse as técnicas no Laboratório de Citogenética Vegetal
da Universidade Federal Rural de Pernambuco;
Aos professores Dr. Antônio Aécio de Carvalho Bezerra, Dr. Fabio Barros Brito, Dra.
Gleice Ribeiro Orasmo, Dr. Kaesel Jackson Damasceno e Silva, Dr. Sérgio Emílio
dos Santos Valente, Dr. Maurisrael de Moura Rocha, Dr. José Baldin Pinheiro
(ESALQ), Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho (UFG), Dr. Carlos Tadeu dos
Santos Dias (ESALQ), por proporcionarem um grande aprendizado através das
disciplinas ministradas;
Aos meus maravilhosos, tios, tias, primos, irmão, sobrinhos, madrinha, comadres,
afilhados e avôs (in memorian), especialmente para minha querida vozinha Altina
Araújo, pai Francisco Bacelar e ‘super mãe’ Socorro Bacelar, que acreditaram,
torceram e cujo amor é tão grande que não cabe em mim;
Á Mafalda Bacelar, Irenir Bacelar e Jardel Bacelar (Picos), que sempre me
acolheram com afago e em especial, um carinhoso agradecimento ao meu anjo
protetor, Jonatan Bacelar, que cuida de mim e me faz sentir cada vez mais aquilo
que um dia escreveste: a nossa relação é algo que está além dessa vida;
Ao meu namorado Lutyl Sousa, pela compreensão, incentivo, pela imensa paciência
de ter suportado minhas falhas e ausências durante o período de mestrado, em
especial por me fazer perceber o quanto preciso desse amor;
À querida Rosangela López e família por me receberem e ampararem nas inúmeras
sessões de estudo em sua casa;
Aos colegas Hendrie Nunes, José Ribamar Filho e João Viana, que ajudaram muito
nos estudos para ingressar no mestrado;
Ao César Viana, Joseane Silva, Danieles Guimarães, Iolly Galvão e aos demais
colegas de turma, pelos momentos de descontração e apoio durante o curso;
Aos amigos Rafael Almeida, Jéssica Lustosa, Josilane Penha, Larronne Silva,
Sérgio Menezes e Elisa Paiva, pessoas confiáveis e amáveis que admiro;
À Rosimere Xavier, por se tornar mais que um ombro amigo, parceira fundamental
em todas as etapas do mestrado, por me ouvir até nas horas impróprias e me incluir
em suas orações, amiga verdadeira para toda minha existência;
Á Fernanda Rocha e Rosiane Carvalho, amigas irmãs, o meu grande agradecimento
pelo incentivo, torcida e acima de tudo, pela forte amizade que nos une;
Aos colegas de trabalho da UFPI e EAD/PI pela compreensão e incentivo;
À turma de Picos e Oeiras, Sara Iolanda Silva, Naiety Barbosa, Daniela Silva, Anaila
Sales, Ronielson Carvalho, Ellifran Dantas, Terysdalva Costa, Odete Sarmento,
Luciane carvalho, Apoliana Carvalho, Luis carvalho e Junior Cavalcante, pela grande
ajuda e parceria no início do curso;
À turma de Recife, Angélica Marinho (referência em morfometria cromossômica),
Genialdo Ramos (literalmente o gênio), Viviane Moreira, Vanessa Oliveira, Maria
Luiza Silva, Emmanuelly Xavier, Lamonier Ramos, Silmar Silva, Bernarda Gregório
(Baiana), Prof. Dr. Edson Ferreira da Silva e Rafaela Araújo, pela aprendizagem,
momentos de descontração, companheirismo e por terem tornado leve os momentos
mais difíceis do mestrado;
A todos que contribuíram de alguma forma, o meu sincero obrigada!
A vida é uma peça de teatro que não permite
ensaios. Por isso, cante, chore, dance, ria e viva
intensamente, antes que a cortina se feche e a
peça termine sem aplausos.
Charles Chaplin
8
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................... 8
ABSTRACT.................................................................................................................9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES........................................................................................10
LISTA DE TABELAS.................................................................................................12
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................13
2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................15
2.1 Aspectos Gerais da Botânica e Distribuição do Allium sativum L. ............. 15
2.2 Propriedades Químicas e Terapêuticas do Alho ........................................ 17
2.3 Importância Socioeconômica ..................................................................... 18
2.4 Métodos para Caracterização Genética em Bancos de Germoplasma ...... 23
2.5 Citogenética Vegetal: Técnicas e Aplicações..............................................23
2.6 Citogenética em Allium sativum L................................................................25
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 27
3.1 Germoplasma ............................................................................................. 27
3.2 Obtenção das Raízes e Preparação da Lâmina para Análise
Citogenética....... .................................................................................................. 29
3.3 Coloração Convencional com Giemsa ....................................................... 30
3.4 Bandeamento com Fluorocromos CMA e DAPI. ........................................ 30
3.5 Fotodocumentação e Morfometria.............................................................. 30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 32
5 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 44
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 45
9
RESUMO
BACELAR, P. A. A. Caracterização citogenética em acessos de Allium sativum L. 52p. Dissertação (Mestrado/Genética e Melhoramento) – UFPI, Teresina, 2014.
Allium sativum L. é uma herbácea da família Alliaceae com sabor e aroma
peculiares, cujas propriedades medicinais e nutracêuticas o fazem ser amplamente
comercializado em diversos países. O Brasil é um dos maiores importadores de alho
do mundo, apesar de possuir capacidade de potencializar sua produção. No entanto,
torna-se necessário explorar a diversidade genética dos alhos comerciais,
principalmente os conservados em bancos de germoplasma. Para isso, uma
ferramenta adequada é a caracterização citogenética desses acessos. Assim, este
trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade citogenética em sete acessos
de alho do Banco Ativo de Germoplasma de Alho da Escola Superior de Agricultura
‘Luiz de Queiroz’ - Universidade de São Paulo (ESALQ-USP). Os cariótipos foram
obtidos pela coloração convencional com Giemsa e bandeamento com fluorocromos
CMA e DAPI. Os acessos analisados apresentaram número cromossômico 2n = 16,
fórmula cariotípica 6M+2SM, cariótipos simétricos, núcleos interfásicos do tipo
reticulado e cromossomos com padrão de condensação uniforme da prófase para
metáfase. No bandeamento CMA/DAPI, os acessos apresentaram pequenos
heteromorfismos de heterocromatina CMA+/DAPI- que variaram quanto à intensidade
do sinal emitido pelo fluorocromo CMA e distribuição nos cromossomos. Com base
no padrão de distribuição desses pequenos polimorfismos foi possível separar os
sete acessos em três grupos, sendo um deles formado pelos acessos do Piauí.
Também foi possível diferenciar alguns dos acessos individualmente. Observou-se
heteromorfismo de distensão da Região Organizadora de Nucléolo nas
prometáfases dos pares cromossômicos 6 ou 7. Sugeriu-se que o cromossomo
CMA+++/DAPI- do par seis do acesso Branco Mineiro Piauí pode ser usado como
marcador na identificação deste genótipo ou associado a algum caráter de interesse
econômico após estudos complementares.
10
Palavras-chave: bandeamento cromossômico, heteromorfismo, alho, banco de
germoplasma.
ABSTRACT
BACELAR, P. A. A. Cytogenetic characterization in accessions Allium sativum L. 52p. Dissertation (Master in Genetics and Breeding) – UFPI, Teresina, 2014.
Allium sativum L. is a herbaceous of the Alliaceae family with peculiar taste and
aroma, whose medicinal and nutraceutical properties do be widely marketed in
several countries. Brazil is one of the largest importers of garlic in the world, despite
having the ability to boost their production. However, is necessary to explore the
genetic diversity of commercial garlic, mainly preserved in germplasm banks. For this
purpose, a suitable tool is to characterize cytogenetic these accessions. This study
aimed to characterize the cytogenetic diversity in seven accessions of garlic Active
Germplasm Bank of Leek College of Agriculture ' Luiz de Queiroz ' - University of São
Paulo (USP - ESALQ). The karyotypes were obtained by conventional staining with
Giemsa and fluorochrome banding CMA and DAPI. All accessions analyzed showed
chromosome number 2n = 16 , karyotype formula 6M+2SM, symmetrical karyotypes,
reticulate interphase nuclei, chromosomes with continuous condensing patters from
prophase to metaphase. In banding CMA/DAPI, the accessions had small
heteromorphisms heterochromatin CMA+/DAPI- ranging as the intensity of the signal
emitted by the fluorochromes CMA and distribution in the chromosomes. Based on
the distribution pattern of these small polymorphisms was possible to separate the
seven hits in three groups, one consisting of accesses state of Piauí. It was also
possible to differentiate some of the hits individually. Observed heteromorphism
distension of the Nucleolar Organizer Region in prometaphases of chromosome pairs
6 or 7. It was suggested that chromosome CMA+++/DAPI- the pair six access Branco
Mineiro Piauí can be used as a marker to identify this genotype or associated with
some character of economic interest.
Keywords: Cytogenetic characterization, garlic, germplasm bank.
11
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Bulbo de alho (A). Bulbinho com raiz fasciculada (B). Escala em
centímetros.................................................................................................................15
Figura 2 - Mapa dos centros de diversidade do gênero Allium no mundo. Triângulo,
quadrado e círculo indicam o oeste da América do Norte, região do Mediterrâneo e
região do Paquistão, respectivamente.......................................................................16
Figura 3 - Bulbos dos acessos de Allium sativum L., Sussuapara – PI (A), Santo
Antonio de Lisboa – PI (B), Catetinho do Paraná 1254 (C), Branco Mineiro – PI (D),
Cateto Roxo 99 (E), Roxo de Minas (F) e Sergipe (G). Escala em
centímetros.................................................................................................................27
Figura 4 - Bulbos dos acessos de Allium sativum L. após triagem, identificados e
acondicionados no laboratório de citogenética vegetal da Universidade Federal Rural
de Pernambuco..........................................................................................................28
Figura 5 - Preparação dos bulbinhos de Allium sativum L. para a obtenção de raízes.
Corte da região basal do caule (A), contato com água (B-C), raiz em tamanho ideal
de coleta (D)...............................................................................................................29
Figura 6 - Dados citológicos de Allium sativum L., por coloração convencional com
Giemsa, evidenciando o núcleo interfásico reticulado (A, D e E), o padrão de
condensação (A, B e C), número e morfologia cromossômica (B e D). Prófase (A),
prometáfase (B) e metáfase (C) obtidas com uso de antimitótico, anáfase (D), final
da anáfase (E) e telófase (F). Pontilhado e seta vermelha indicam Região
Organizadora de Nucléolo (RON) distendida. Barra = 10µm.....................................33
Figura 7 - Cromossomos mitóticos com dupla coloração CMA/DAPI dos acessos
Sussuapara PI (A), Santo Antonio de Lisboa (B), Catetinho do Paraná 1254 (C),
Branco Mineiro PI (D), Cateto Roxo 99 (E), Roxo de Minas ESALQ (F) e Sergipe (G).
Insertos destacam as pequenas bandas CMA+/DAPI-. Setas em amarelo indicam as
bandas CMA+/DAPI- mais evidentes nos cromossomos e núcleo interfásico. Setas
em vermelho indicam banda CMA+ em cromossomo sobreposto (B). Setas em
branco indicam gaps formados pela condensação (D). Pontilhado indica Região
12
Organizadora de Nucléolo (RON) distendida (F). Barra representa 10m...............37
Figura 8 – Cariogramas e idiogramas dos acessos Sussuapara PI (A), Santo Antonio
de Lisboa (B), Catetinho do Paraná 1254 (C), Branco Mineiro PI (D), Cateto Roxo 99
(E), Roxo de Minas ESALQ (F) e Sergipe (G). Traço e circulo amarelo representam
banda CMA+/DAPI-. Ordem Cromossômica (OC), Tamanho Cromossômico (TC),
Metacêntrico (M) e Submetacêntrico (SM). Barra vertical no cariograma e idiograma
= 10µm.......................................................................................................................38
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Identificação dos acessos utilizados na caracterização citogenética de
Allium sativum L., conduzidas no laboratório de citogenética vegetal da Universidade
Federal Rural de Pernambuco, em 2013 ..................................................................28
Tabela 2 – Acessos, Número cromossômico diplóide, Intervalo do Tamanho
Cromossômico (ITC), média da razão entre os braços do cromossomo (r), Fórmula
Cariotípica (FC), Comprimento Total Cromossômico (CTC), Comprimento Médio
Cromossômico (CMC), Comprimento Total do Lote Haploide (CTLH), índices de
assimetria de Huziwara (1962), TF%, e de Romero Zarco (1986), A1 e A2
.................................................................................................................................35
Tabela 3 – Resumo da Análise da Variância para os caracteres comprimento total do
lote haplóide (CTLH), braço longo (BL) e braço curto (BC), referente às medias dos
parâmetros morfométricos obtidos para 5 repetições de metáfases dos acessos
Santo Antonio de Lisboa – PI, Catetinho do Paraná 1254, Branco Mineiro – PI,
Cateto Roxo 99, Roxo de Minas e Sergipe. Fonte de Variação (FV), Grau de
Liberdade (GL), Coeficiente de Variação (CV) ..........................................................36
Tabela 4 – Valores médios para o comprimento do Braço Longo, Braço Curto e
Comprimento Total, expressos em micrômetros (µm). Acessos seguidos da mesma
letra sobrescrita foram agrupados pelo teste de Tukey a 5% de
significância................................................................................................................36
Tabela 5 – Distribuição das bandas CMA+/DAPI- nos cromossomos e organização
dos acessos em grupos. Sinal + simboliza banda positiva, sinal – simboliza banda
negativa. A quantidade de sinal + simboliza a intensidade dos fluorocromos.
Cromossomo 1 (C1), Cromossomo 2 (C2) ................................................................43
14
1 INTRODUÇÃO
O alho (Allium sativum L.) é uma planta monocotiledônea de clima temperado
cultivada em todo o mundo e utilizado como especiaria no preparo de alimentos
(MOTA et al., 2012). No Brasil, esta olerícola é um condimento de ampla utilização
popular apreciada não somente por seu sabor e aroma, mas por suas propriedades
medicinais e nutracêuticas, tendo em sua composição fitoquímica alto teor de
proteínas, carboidratos, sais minerais e vitaminas (DALONSO et al., 2009). Também
possui importância socioeconômica sendo fonte de renda para muitas famílias de
pequenos e médios produtores rurais (SILVA et al., 2008).
Apesar de sua relevância, a produção do alho entrou em crise no país em
meados da década de 90 com o início da importação desta cultura da China e da
Argentina a preços bastante competitivos (FAO, 2014). Desde lá, os produtores
brasileiros se empenham em alcançar a autossuficiência no abastecimento desta
hortícola por meio de tecnologia adequada, aumento da área cultivada e,
principalmente, pela obtenção de novas cultivares (HONORATO et al., 2013).
A produção desta hortícola no estado do Piauí é realizada por pequenos
agricultores rurais que cultivam o tipo seminobre e estão a mais de um século
presentes principalmente na microrregião da cidade de Picos (SANTOS; GOMES,
2012). Até a década de 70 a produção nessa área supria a demanda regional,
porém o plantio diminuiu consideravelmente devido a concorrência com os alhos
importados e a inviabilidade do cultivo destes, do tipo nobre, nas condições
climáticas do estado (VIANA, 2013).
Além disso, a propagação de A. sativum ocorre exclusivamente por estruturas
vegetativas, onde a ausência de órgãos reprodutivos viáveis não permite a produção
de sementes verdadeiras e nem a utilização de métodos convencionais de
melhoramento genético (SILVA et al., 2010). Dessa forma, a falta de recombinação
meiótica e o acúmulo de mutações somáticas fazem com que a variabilidade
genética do alho seja bastante limitada, fato este que potencializa a disseminação
de doenças através das gerações ocasionando prejuízos aos clones comerciais e
consequentemente baixa produção (HONORATO et al., 2013). Assim, o êxito na
15
seleção de novas cultivares depende, quase que exclusivamente, dos materiais
existentes em bancos de germoplasma desta cultura que necessitam ser
caracterizados, como por exemplo, por meio de marcadores bioquímicos,
moleculares e citogenéticos, quanto a sua diversidade genética .
A caracterização citogenética tem proporcionado resultados importantes aos
melhoristas sobre a diversidade genética de acessos presentes em bancos de
germoplasma de diversas culturas (CARVALHO et al., 2009). Este tipo de análise
permite realizar o mapeamento físico cromossômico e identificar polimorfismos
cromossômicos numéricos e estruturais dentro e entre os cariótipos (GUERRA,
2000). Pode ser útil ainda para descrever cariotipicamente variedades possibilitando
um melhor gerenciamento do “pool” gênico e uma seleção mais eficiente dos
recursos genéticos presentes nestes materiais (BENKO-ISEPPON, 2001).
Comparado com outras espécies do gênero, para o alho são poucas as
informações disponíveis na literatura científica sobre sua caracterização cariotípica e
descrição detalhada do conjunto diplóide 2x = 2n = 16. Os estudos citogenéticos
para esta espécie se restringem apenas às técnicas mais simples tais como a
coloração convencional com Giemsa ou oreceína acética (KONVICKA; LEVAN,
1972; ORDÓÑEZ et al., 2002; MUKHERJEE; ROY, 2012).
Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a diversidade
genética existente em sete acessos de A. sativum cedidos pela Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz – Universidade de São Paulo (ESALQ-USP),
provenientes de coletas em diferentes localidades e intercambio entre bancos de
germoplasma. Essa avaliação foi realizada por meio da técnica de coloração
convencional e bandeamento cromossômico com fluorocromos CMA/DAPI, com o
intuito de gerar informações genéticas sobre os cultivares provenientes do estado
Piauí e demais regiões.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos Gerais da Botânica e Distribuição do Allium sativum L.
Há uma discordância entre os botânicos e taxonomistas quanto a
classificação do gênero Allium. Friesen et al. (2006) divide o gênero em 15
subgêneros e 72 seções. A classificação feita por Chase e Reveal (2009) na
Angiosperm Phylogeny Group III (APG III) coloca este gênero na tribo Alieae,
subfamília Allioideae, família Amaryllidaceae, ordem Asparagales e clado
Commelinídeas. Porém, a classificação mais utilizada é a de Fay e Chase (1996),
que o descreve como pertencente à família Alliaceae e subfamília Allioideae.
O alho é uma planta herbácea com altura variando de 40 a 60 cm, de folhas
lanceoladas estreitas ou largas, de superfície lisa, com diferentes graus de
cerosidade e limbo com 20 a 30 cm de comprimento. Sob condições climáticas
favoráveis, as gemas de seu caule desenvolvem-se formando cada uma um
bulbinho de formato ovoide arqueado envolto por brácteas provenientes do
crescimento das lâminas foliares e engrossamento da bainha. Estes bulbinhos se
organizam em anéis concêntricos e em seu conjunto formam o bulbo (Figura 1A). O
sistema radicular é do tipo fasciculado (Figura 1B) (BREWSTER, 2008).
17
Figura 1 - Bulbo de alho (A). Bulbinho com raiz fasciculada (B). Escala em centímetros.
O principal mecanismo reprodutivo do alho é a propagação vegetativa, por
meio dos bulbinhos (BLOCK, 2010). Porém, menos usualmente, pode ocorrer
apomixia obrigatória com a produção de sementes sem que ocorra a fertilização,
tendo como resultado sementes não verdadeiras, geneticamente idênticas à planta
mãe (BESPALHOK et al., 2007). Assim, devido à restrição reprodutiva, a
variabilidade genética do alho é limitada pela ocorrência de mutações somáticas e
alterações cromossômicas estruturais acumuladas ao longo das gerações
(PUITATTI; FERREIRA, 2005).
A família Alliaceae possui distribuição cosmopolita, com espécies oriundas de
áreas tropicais, subtropicais e temperadas, composta por ervas perenes ou anuais e
de caule subterrâneos geralmente em forma de bulbos aromáticos (SIMPSON,
2006). O gênero Allium abrange mais de 800 espécies (FRITSCH et al., 2010), onde
os maiores centros de diversidade destas plantas são a Ásia Central, com ênfase a
região do mediterrâneo e Paquistão, e o oeste da América do Norte (FRITSCH;
FRIESEN, 2002) (Figura 2). No Brasil, algumas dessas espécies foram introduzidas
pelos portugueses na época da colonização (MADEIRA et al., 2008).
18
Figura 2 – Mapa dos centros de diversidade do gênero Allium no mundo. Triângulo, quadrado e círculo indicam o oeste da América do Norte, região do Mediterrâneo e região do Paquistão,
respectivamente.
Algumas espécies do gênero Allium possuem ampla distribuição em vários
países e são usadas para diversos fins, como por exemplo, a espécie Allium cepa L.,
popularmente conhecida como cebola, apreciada na alimentação e para fins
terapêuticos (KUMARI; AUGUSTI, 2002); a espécie Allium aflatunense B.Fedtsch.,
usada para ornamentação (EVENOR et al., 1997); Allium porrum L., o alho poró,
comumente utilizado como condimento; e o Allium sativum L., o popular alho,
considerado uma das olerícolas mais cultivadas desde a antiguidade e difundido por
diversas regiões do mundo devido o seu uso na alimentação, tendo como
característica marcante o aroma e o sabor, além de suas propriedades medicinais
(KAMENETSKY; FRITSCH, 2002).
2.2 Propriedades Químicas e Terapêuticas do Alho
As propriedades nutricionais e medicinais do alho o torna bastante
comercializado e apreciado na culinária mundial. Anterior ás comprovações
científicas sobre a farmacologia desta hortaliça, os saberes e aplicações dos seus
benefícios provenientes do conhecimento empírico foram repassados por gerações
pela medicina tradicional (REVENE et al., 2008). Levantamentos etnobotânicos
relatam o uso do alho para fins terapêuticos em diversas regiões do Brasil e em
outros países (MONTELES; PINHEIRO, 2007; VALLEJO et al., 2008; SILVA;
BÜNDCHEN, 2011; CRISPIM et al., 2012).
No entanto, sabe-se que o alho é rico em vitamina A, B1, B2, B6 e C, cálcio,
carboidratos, cobre, enxofre, ferro, fibras, fósforo, iodo, lipídeos, magnésio, potássio,
proteínas, selênio, sódio e zinco (TABELA BRASILEIRA DE COMPOSIÇÃO DE
ALIMENTOS, 2006). Tais substâncias são fundamentais no crescimento e
metabolismo celular intervindo em funções básicas como o metabolismo, o equilíbrio
mineral do organismo e a conservação de estruturas moleculares e tecidos
(PINHEIRO et al., 2005). Dentre os componentes ativos estão os compostos
sulfurados, que são metabólitos secundários extremamente voláteis derivados da
cisteína que se subdivide em sulfóxidos de S-alilcisteína e γ-glutamil-S-alilcisteína
(SCHULZ; HÂNSEL; TYLER, 2002). Esses compostos possuem ação tóxica sobre
os nematoides, vírus, insetos e fungos (PREVIERO et al., 2010).
19
A alicina (alil 2-propenotiossulfinato ou dialil tiossulfinato) representa a maior
parte dos compostos sulfurados (YULI et al., 2007), sendo responsável pelo aroma,
ardor característico, maioria das suas propriedades medicinais (MARCHIORI, 2005)
e pela defesa da própria planta (SOUZA; SOARES, 2009). Estão presentes também
os bioflavonóides rutina, hesperidina e quercetina, que possuem a propriedade de
proteger as células contra radicais livres (BONTEMPO, 2007). Outros componentes
são a pectina, saponina esteroidal, ajoeno e a adenosina, esta quando proveniente
do alho in vitro, promove inibição da agregação plaquetária e é benéfica à pressão
arterial (ABIB JUNIOR, 2004).
A capacidade específica dos componentes químicos proporciona ao alho um
desempenho múltiplo e vários estudos corroboram com sua potencialidade
antimicrobiana (HARRIS et al., 2001), antioxidante (QUEIROZ et al., 2009; OTHMAN
et al., 2011), citotóxica às células tumorais (GORUNOVIC, 2001; WORLD CANCER
RESEARCH FUND/AMERICAN INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH, 2007),
reguladora da pressão arterial (DHAWAN; JIAN, 2004), fungicida e ativadora do
sistema imunológico (OTA et al., 2010). O efeito benéfico geralmente é obtido com o
consumo do bulbo in natura ou após seu esmagamento, visto que os compostos
orgânicos são instáveis quando submetidos ao aquecimento (ALMEIDA;
SUYENAGA, 2009).
2.3 Importância Socioeconômica
Quanto a comercialização, no Brasil são produzidos dois tipos de alho, o
nobre e o seminobre. O primeiro possui bulbos de alto valor comercial, com
bulbinhos grandes e uniformes, cultivados por médios e grandes produtores e
produção direcionada para o mercado formal. O segundo possui cultivares mais
rústicas, com bulbos menores e bulbinhos de variados tamanhos, formato e
aparência menos atrativa para o consumidor, o que torna produção restrita aos
agricultores familiares e direcionada para o mercado informal (MELO et al., 2011).
No entanto, a produção de alhos nobres no Brasil começou no final da década
de 70. Antes disso a produção era basicamente localizada no centro oeste brasileiro,
principalmente nos estados de Minas Gerais e Goiás, sendo restrita quase que em
sua totalidade ao plantio de bulbos pequenos, comuns, brancos e de baixo valor
comercial (LUCINI, 2008). O consumo nacional era maior que a produção,
necessitando anualmente da importação desta olerícola (ANAPA, 2009).
20
Atualmente o alho é comercializado em diversos países na forma in natura e em
subprodutos como o óleo, pó, fatiado, frito, pasta, entre outros.
Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística-IBGE (2013), a
produção nacional do alho no último ano foi de 107.054 toneladas e a área total do
plantio sofreu diminuição de 15.099 hectares em 2003 para 10.213 hectares em
2012. Essa quantidade supre apenas 33% do mercado interno, o restante é
importado principalmente da China e Argentina (LUCINI, 2013). Dessa forma, o
Brasil torna-se um dos maiores importadores de alho do mundo. Isso pode ser
reflexo do perfil dos consumidores que consideram as variedades nacionais,
principalmente as seminobres, inferiores às importadas (MARQUES, 2013).
Apesar do Brasil ser um dos maiores importadores da cultura, existe a
viabilidade de elevar a produção nacional podendo até suprir a demanda interna e
também tornar-se um potencial exportador. Isso não ocorre devido alguns fatores
como as peculiaridades do cultivo e a abertura de mercado sem análise de impacto
na produção local e nos produtores (ANAPA, 2009). Para contornar tal situação,
uma das vertentes são as pesquisas que identifiquem as cultivares e técnicas que
produzam bulbos com maior qualidade, além da avaliação do maior número possível
de cultivares visando estabelecer as melhores para cada região e época de cultivo
(TREVISAN et al., 1997).
O Piauí também sofreu o mesmo desfecho que o relatado em nível nacional.
Os municípios produtores neste estado estão todos na microregião da cidade de
Picos. Quiroga et al. (1975) relatam sobre o aspecto comercial, produtivo e o custo
da produção da cultura do alho semi-nobre nos municípios de Picos e Bocaina, no
ano de 1974. Segundo esses autores o plantio de alho era a atividade econômica de
maior expressão com produção de 87,7% do alho produzido no estado. Mesmo
assim, era considerada uma atividade altamente deficitária devido ao pouco
conhecimento dos produtores quanto à otimização dos lucros e diminuição dos
prejuízos.
Santos e Gomes (2012) destacam que a atividade perdeu importância
econômica devido à seleção negativa, a própria forma de cultivar a terra, a
construção da barragem de Bocaina, a exposição à concorrência com alhos vindos
de outras unidades da federação ou de outros países e a incompatibilidade climática
para o plantio do alho nobre. Dados do IBGE (2011) divulgaram a produção no Piauí
21
de 45 toneladas, o que corresponde a apenas 0,48% da produção na região
nordeste.
O decréscimo na cultura regional do alho seminobre pode ter favorecido a
diminuição da diversidade genética em relação ao alho que era produzido na década
de 1970. Aliado à limitação reprodutiva, isso pode ter acarretado uma erosão
genética e perda de germoplasma adaptado à região. Tais questões tornam
fundamental o estudo e caracterização da diversidade genética existente no alho
cultivado no Piauí (VIANA, 2013).
2.4 Métodos para Caracterização Genética em Bancos de Germoplasma
A conservação dos recursos genéticos é uma forma de preservar a
biodiversidade e pode ser realizada ex situ e in situ. A conservação ex situ é
realizada em bancos de germoplasma e a conservação on farm é um tipo de in situ
feita em cultivares manejadas por comunidades locais, indígenas ou pequenos
produtores (NASS et al., 2001). O conceito de germoplasma é explicado por Pereira
(2010) como sendo qualquer porção de material biológico ou de componente do
patrimônio genético, devidamente acompanhada de informações biológicas,
químicas ou documentais que permitam a identificação taxonômica e a procedência
do material, com capacidade de manter geração após geração as características
genéticas de uma população. As coleções de germoplasma são conjuntos de
genótipos representativos da variabilidade genética da espécie objeto da
conservação (BESPALHOK et al., 2007).
Com a necessidade de preservação da variabilidade genética existente,
diversos acessos são conservados ex situ em bancos ativos de germoplasma no
mundo. Países como o Reino Unido, Japão, Argentina, Chile, Brasil, Estados Unidos
e República Theca, tem mantido coleções de acessos de alho que se adaptaram a
diversos ambientes, visando a utilização dos recursos genéticos deste material
vegetal (STAVELÍKOVÁ, 2008).
Dentre o total de bancos brasileiros, os que mantêm coleções de
germoplasma de alho são o Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade
Federal de Viçosa-UFV, Empresa Brasileira de Pesquisa e Agropecuária Hortaliças-
EMBRAPA Hortaliças, Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de
Santa Catarina-Epagri, Escola Superior de Agricultura ‘Luiz de
22
Queiroz’/Universidade de São Paulo-ESALQ/USP e o Instituo Agronômico de
Campinas-IAC (CUNHA et al., 2012).
Destes bancos, a Embrapa Hortaliças mantem ininterruptamente um Banco
ativo de germoplasma (BAG) de alho no campo desde 1979. É válido ressaltar que
as atividades de melhoramento de hortaliças no Brasil iniciaram em 1938, no
município de Rio Grande-RS e nessa mesma época iniciou-se os programas do
Instituto Agronômico de Campinas-IAC. Os primeiros estudos com alho foram
realizados no IAC, feitos com as cultivares plantadas por pequenos agricultores,
citando-se o alho cateto, caiano branco, caiano roxo e branco mineiro (TRANI,
2009).
Diversas funções são atribuídas aos bancos de germoplasma que vão desde
a prospecção, coleta e introdução até a regeneração de germoplasma. Uma
atividade também desenvolvida é a caracterização, que consiste no estudo e
determinação das informações das espécies que serão conservadas, premitindo ao
melhorista conhecer as qualidades disponíveis sobre a potencialidade do material
(NASS et al., 2001). A caracterização pode ser feita a nível agronômico, morfológico,
molecular, bioquímico e citogenético.
O germoplasma coletado tem o potencial aproveitado de forma mais efetiva
com sua caracterização. As análises agronômicas, morfológicas, bioquímicas,
moleculares e citogenéticas devem identificar e descrever diferenças entre os
acessos, verificar duplicatas, determinar o grau de variabilidade, prospectar genes
de acessos com características relevantes e de interesse aos diversos programas de
melhoramento (COSTA et al., 2009). Desta forma, evita-se desperdício na
manutenção de recursos humanos e financeiros necessários para a manutenção dos
acessos além de beneficiar os agricultores, permitindo o uso racional e direcionado
dos genótipos (SANT’ANA, 2009).
Germoplasma de Allium sativum L. provenientes de coletas realizadas em
diferentes regiões da Índia foram analisados por 14 caracteres morfológicos
facilmente perceptíveis. Foi documentada a variabilidade quantitativa e qualitativa
encontrada, a qual tentou destacar a interação genótipo-ambiente, seu impacto
sobre a expressão de características morfológicas e avaliar as diferentes coleções
para filogenia intraespecífica. Identificaram correlação negativa entre o número de
bulbinhos por bulbo e circunferência, indicando a possibilidade de criar e produzir
uma variedade de alho maior, mas com menos bulbinhos (SINGH et al., 2013).
23
Os dados agromorfológicos podem ser combinados com os genéticos,
bioquímicos e/ou citogenéticos, para descrever e identificar melhor as diferenças
entre genótipos. As características morfológicas e genéticas de alho foram
estudadas e possibilitaram a identificação de um conjunto de cultivares na região
norte-central do México. Para tal, foram feitas avaliações de campo e análise com o
marcador RAPD. Alta diversidade genética foi encontrada entre todas as variedades,
que foram separados em dois grupos por meio da análise diferencial (HERNÁNDEZ
et al., 2008).
No Brasil, o grau de diversidade genética por meio de marcadores RAPD foi
avaliado em 20 cultivares de alho do Banco de Germoplasma da Empresa de
Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina - EPAGRI. Foram
observadas 57 bandas, das quais 35 (61,42%) revelaram polimorfismo. Os índices
de similaridade revelados pelos marcadores RAPD foram geralmente altos para a
maioria das cultivares o que indicou serem potencialmente duplicados ou com pouca
diferença genética (VIEIRA; NODARI, 2007).
A divergência genética baseada em avaliações fenotípicas quantitativas e
qualitativas foi estudada por análise multivariada entre 63 acessos de alho em
ambientes distintos do estado de São Paulo (Piracicaba e Monte Alegre do Sul). As
medidas de divergência utilizadas foram a Distância de Mahalanobis (D2) e o
complemento aritimético de Jaccard. Os acessos apresentaram maior variabilidade
qualitativa do que quantitativa e as estimativas da dissimilaridade foi mais
influenciada pelo tipo de variável do que o número de ambientes. Avaliações
fidedignas de acessos dessa cultura requerem escolha criteriosa das variáveis e dos
locais de avaliação (HOOGERHEIDE et al., 2009).
Um novo conjunto de marcador microssatélite (SSR) para alho foi
desenvolvido e otimizado em 16 loci, num total de 75 acessos utilizados. Dez loci
polimórficos foram encontrados e 44 alelos foram identificados. Essas informações
serão úteis para estudos de diversidade genética, mapeamento e estudos
associativos, na gestão e conservação de coleções de alho, para estudos genéticos
interespecíficos do gênero Allium e em programas de melhoramento (CUNHA et al.,
2012).
A diversidade genética existente em doze acessos de alho, quatro de origem
piauiense e oito do BAG da ESALQ – USP, foi caracterizada com base em
descritores agromorfológicos e genotipagem a partir de oito locos microssatélites.
24
Encontrou-se divergência genética entre os acessos e sugere-se que o material
oriundo da ESALQ – USP se trata de um germoplasma distinto do cultivado no
Piauí. Pode haver germoplasma adaptado no Piauí e que reúna outras
características de interesse agronômico, sendo possível a seleção de genótipos
superiores que aumentariam a competitividade do alho piauiense frente ao alho
importado (VIANA, 2013).
2.5 Citogenética Vegetal: Técnicas e Aplicações
A utilização de técnicas citogenéticas para o estudo cromossômico tem sido
observada em diversas áreas como a taxonomia e o melhoramento de animais e
plantas. Neste último, a citogenética passou a ser usada como uma ferramenta na
caracterização da diversidade dos recursos genéticos. Essa técnica é valiosa porque
pode ser aplicada na avaliação dos padrões de evolução cromossômica dentro e
entre táxons (CORREIA-DA-SILVA et al., 2013) e no estudo do cariótipo para a
identificação de alterações cromossômicas tanto numéricas quanto estruturais
(GUERRA; SOUZA, 2002). É útil na observação dos eventos meióticos (BIONDO et
al., 2005), no reconhecimento de híbridos e poliploides (BATTISTIN et al., 2013),
bem como o acompanhamento no cruzamento de indivíduos (CARDOSO et al.,
2009).
A visualização dos cromossomos mitóticos, para estudo do cariótipo e análise
do ciclo celular, é geralmente feita pela coloração convencional. A respeito dessa
técnica, o uso do corante Giemsa é um dos mais empregados para o estudo dos
cromossomos metafásicos, os quais são corados por igual sem nenhuma
preferência por determinado tipo de cromatina, composição de DNA ou de proteínas
(GUERRA; SOUZA, 2002). Essa técnica também mostra o tipo de núcleo interfásico
e o padrão de condensação profásico, conforme mostrou o estudo de Benko-
Iseppon e Morawetz (2000), que utilizaram essas informações para definir a
classificação taxonômica de 98 espécies pertencente à ordem Dipsacales.
Com a obtenção das imagens cromossômicas é possível a utilização de
softwares que implementam parâmetros morfometricos para auxiliar na identificação
de diferenças entre táxons e espécies vegetais, inclusive as de interesse econômico
(MIRZAIE-NODOUSHAN et al., 2006). Estas ferramentas foram utilizadas na
caracterização cariotípica de 33 espécies pertencentes a 20 famílias de
angiospermas ocorrentes no estado de Pernambuco. A análise foi realizada por
25
meio de coloração convencional, que evidenciou o número e morfologia
cromossômica, padrão de condensação profásico e estrutura do núcleo interfásico
(PEDROSA et al., 1999).
Em outros estudos, o número e morfologia de cromossomos corados
convencionalmente com Giemsa foram determinados para quatro espécies do
gênero Capsicum (SOUSA et al., 2013) e seis espécies de frutíferas nativas do
nordeste brasileiro (ÉDER-SILVA et al., 2007). A evolução cariotípica de 27 espécies
da subfamília Mimosoideae, ocorrentes principalmente no nordeste do Brasil, foi
examinada por meio do estudo dos cromossomos corados com Giemsa (SANTOS et
al., 2012).
Uma das metodologias empregadas para análise diferencial no cromossomo
é o bandeamento CMA/DAPI, que informa a constituição da heterocromatina
detalhando o padrão de distribuição de bases pelo uso dos fluorocromos
cromomicina A3 (CMA) e 4’6-diamidino-2-phenilindol (DAPI), que coram
preferencialmente regiões ricas em GC (CMA) e AT (DAPI). Essa técnica revela as
regiões heterocromáticas e possibilita a compreensão de eventos citogenéticos que
contribuem para o aumento da diversidade genética e evolução cariotípica
(GUERRA, 2000).
Na família Alliaceae, o uso de fluorocromos complementou o estudo para
ratificar a variação do número e morfologia cromossômica de 53 indivíduos no
gênero Nothoscordum (SOUZA et al., 2009). O bandeamento CMA/DAPI associado
às técnicas de morfometria e hibridação in situ com sondas 5S e 45S rDNA, foram
utilizados prara avaliar a circunscrição do gênero Ipheion e três espécies de
Nothoscordum (SOUZA et al., 2010). Em Allium cepa, uma pesquisa desenvolvida
por Kim et al. (2002) verificou os padrões de bandas coradas com CMA/DAPI e a
combinação destes com homólogos do CMA e iodeto de propídio (PI). A coloração
foi repetida após desnaturação e renaturação dos cromossomos, o que resultou na
alteração dos padrões de fluorescência com a revelação de bandas PI+ e o aumento
do contraste das bandas CMA+/DAPI-.
Fluorocromos CMA e DAPI foram utilizados para identificar padrões de
bandas altamente diferenciadas, classificando em 4 grupos os 93 indivíduos
pertencentes a 18 acessos de Citrus reticulata Blanco, seus híbridos e espécies
afins (CORNÉLIO et al., 2003). Essa coloração diferencial também foi usada para
estimar a variação citológica entre as espécies do gênero Tripogandra, o diploide T.
26
glandulosa, o hexaploide T. serrulata e o octoploide T. diuretica (MARQUES et al.,
2010). As espécies Cichorium endivia L. e Cichorium intybus L. apresentaram
conservadas a posição e número de bandas 5S e 45S rDNA, revelados em FISH, e
padrões de bandas distintos após coloração com fluorocromo CMA e DAPI,
sugerindo a ocorrência de rearranjo cromossômico (BERNARDES et al., 2013).
Com o desenvolvimento, aperfeiçoamento e combinação de técnicas para o
estudo dos cromossomos, inúmeras pesquisas científicas são desenvolvidas, tanto
básicas como aplicadas. Assim, a citogenética subsidia para o direcionamento e
seleção antecipada do material genético de uma determinada espécie (BRAMMER,
2008), ressaltando-se ainda, as suas contribuições na compreensão dos eventos
citológicos, taxonômicos e processos evolutivos.
2.6 Citogenética em Allium sativum L.
O gênero Allium possui variação em seus números cromossômicos,
apresentando número básico x = 7, 8, 10 e 11 (CUI et al., 2008). Em alho os
cromossomos são grandes, cariótipo simétrico, o número básico é x = 8 e o conjunto
diplóide é geralmente 2n = 2x = 16, mas pode apresentar variações com 2n = 2x =
12, 2n = 2x = 18 e poliploidia do tipo 4n = 4x = 32 (BOZZINI, 1991; YÜZBASIOGLU;
ÜNAL, 2004).
Quanto à caracterização citogenética desta espécie, é importante citar um
estudo pioneiro feito por Konvicka e Levan (1972), onde analisaram quatro grupos
de alho de proveniência diferentes e organizados em dois tipos morfologicamente
distintos. Houve diferenciação na morfometria entre os dois grupos morfológicos em
três parâmetros que foram o comprimento total de cromossomos, presença de
satélite, relação entre braço longo e curto. Na Turquia, alguns cultivares de alho
foram investigados demonstrando banda C nos cromossomos 1, 4 e 5, além de RON
presente nos cromossomo 5 e 7 e nos cromossomos 1 e 8 em algumas células
(YÜZBASIOGLU; ÜNAL, 2004).
No gênero Allium, cinco espécies e algumas variedades, A. cepa var. cepa, A.
cepa var. aggregatum, A. cepa var. viviparum, A. sativum, A. porrum, A. stracheyi e
A. tuberosum, tiveram suas metáfases estudadas. Os valores obtidos pela
morfometria, como o número e tamanho total cromossômico, foram analisados
estatisticamente. Com estes dados foi possível demonstrar no dendrograma o
agrupamento das diferentes espécies e variedades (MUKHERJEE; ROY, 2012).
27
Cariótipos foram investigados em oito diferentes espécies do gênero Allium
coletadas no leste de Azerbaijan e depositadas na coleção do Herbário Central da
Universidade de Tehran. As características cromossômicas foram determinadas
utilizando-se metáfases fotografadas e análise estatística. Os resultados
contribuíram para informação taxonômica e confirmou-se que o cariótipo pode ser
facilmente utilizado para a distinção entre os materiais analisados (MIRYEGANEH;
MOVAFEGHI, 2011).
A caracterização citogenética em alho limita-se geralmente ao uso de técnicas
mais simples, como a coloração convencional. É importante que se agregue
informações sobre o estudo dos cromossomos, a fim de caracterizar com maior
detalhe os recursos genéticos existentes (BRAMMER, 2008). Desta forma, vale
ressaltar a importância dos dados existentes em citogenética para a compreensão
da diversidade genética em acessos de alho conservados em bancos de
germoplasma.
28
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Germoplasma
Para realização deste trabalho foram utilizados sete acessos da coleção do
Banco Ativo de Germoplasma de Alho da Escola Superior de Agricultura ‘Luiz de
Queiroz’- Universidade de São Paulo (ESALQ-USP) (Figura 3). Quatro desses
acessos foram procedentes de intercâmbios entre bancos de germoplasma e três
foram provenientes do Piauí, que são o Branco Mineiro, Santo Antônio de Lisboa e
Sussuapara. O Branco Mineiro-PI foi disponibilizado pelo Centro Nacional de
Pesquisa de Hortaliças da Empresa Brasileira de Pesquisa e Agropecuária
(EMBRAPA – CNPH) para a ESALQ-USP e corresponde a um acesso oriundo de
coleta de germoplasma no Piauí em 1976. Os acessos Santo Antônio de Lisboa e
Sussuapara foram coletados junto aos agricultores em área de cultivo, feiras e
mercados populares na Microrregião de Picos-PI (Tabela 1).
Figura 3 - Bulbos dos acessos de Allium sativum L., Sussuapara – PI (A), Santo Antonio de Lisboa – PI (B), Catetinho do Paraná 1254 (C), Branco Mineiro – PI (D), Cateto Roxo 99 (E), Roxo de Minas (F)
e Sergipe (G). Escala em centímetros.
29
Tabela 1 – Identificação dos acessos utilizados na caracterização citogenética de Allium sativum L.,
conduzidas no laboratório de citogenética vegetal da Universidade Federal Rural de Pernambuco, em 2013.
Nº de Identificação Acesso Proveniência
1 Sussuapara - PI Piauí
2 Santo Antonio de Lisboa - PI Piauí
3 Catetinho do Paraná 1254 IAC
4 Branco Mineiro - PI CNPH
5 Cateto Roxo 99 IAC
6 Roxo de Minas ESALQ
7 Sergipe ESALQ
Do Banco de Germoplasma da ESALQ foram enviados dois bulbos de cada
acesso, que passaram por uma triagem mecânica para a retirada de possíveis
parasitas e bulbinhos podres. Em seguida foram devidamente identificados,
acondicionados em sacos de nylon e guardados em ambiente arejado no
Laboratório de Citogenética Vegetal da Universidade Federal Rural de Pernambuco
(Figura 4).
Figura 4 - Bulbos dos acessos de Allium sativum L. após triagem, identificados e acondicionados no laboratório de citogenética vegetal da Universidade Federal Rural de Pernambuco.
30
3.2 Obtenção das Raízes e Preparação da Lâmina para Análise Citogenética
Os bulbos de alho, separados em bulbinhos, foram cortados na região basal
e colocados em água para induzir o crescimento de raízes por, em média, três dias.
A água era trocada diariamente para evitar o apodrecimento rápido do bulbinho. O
tamanho ideal de coleta das raízes foi de 1,5 a 2,0 centímetros (Figura 5). Em
seguida, raízes jovens foram coletadas de cada genótipo às 17 horas, pré-tratadas
com colchicina a 0,2% a 10ºC por 18 horas, fixadas em solução de etanol e ácido
acético (3:1 v/v) e estocadas em freezer a -20ºC. Posteriormente, as raízes fixadas
foram lavadas em água destilada três vezes por cinco minutos e tiveram suas
regiões meristemáticas isoladas com auxílio de uma lupa.
Figura 5 - Preparação dos bulbinhos de Allium sativum L. para a obtenção de raízes. Corte da região basal do caule (A), contato com água (B-C), raiz em tamanho ideal de coleta (D).
Algumas raízes fixadas foram usadas para a coloração convencional com
Giemsa. As demais raízes tiveram o tecido isolado, colocado em solução enzimática
de celulase 2% (Onozuka) e pectinase 20% (Sigma) em câmara úmida a 37°C por
uma hora. Após este procedimento, cada lâmina foi preparada pelo método de
esmagamento em uma gota de ácido acético a 45% e as lamínulas retiradas com o
auxílio do vapor de nitrogênio líquido. As lâminas foram secas ao ar e envelhecidas
por três dias à temperatura ambiente.
31
3.3 Coloração Convencional com Giemsa
A metodologia utilizada foi a de Guerra (1983). As raízes fixadas em Carnoy
foram lavadas em água destilada, hidrolisadas com HCL 5N por 20 minutos e em
seguida lavadas novamente em água destilada três vezes por cinco minutos cada.
Com o auxílio de um microscópio estereoscópio (lupa), macerou-se o meristema das
raízes em ácido acético 45%. Visualizou-se o espalhamento das células no
microscópio óptico, em contraste de fase. Quando necessário, percorreu-se a lâmina
em movimento ziguezague com auxílio de uma seringa de agulha rombuda para
aumentar o espalhamento do material. Para o esmagamento, pressionou-se, entre
folhas de papel filtro, o conjunto lâmina e lamínula. Mergulhou-se a preparação no
vapor do nitrogênio líquido para a retirada da lamínula. Em seguida as lâminas foram
coradas com uma solução de Giemsa a 2% por cerca de 20 minutos, lavadas com
jato de água destilada, secas ao ar e montadas com Entellan.
3.4 Bandeamento com fluorocromos CMA e DAPI
O bandeamento CMA/DAPI foi realizado segundo o protocolo de Schweizer e
Ambros (1994), com modificações. As lâminas preparadas com enzima foram
coradas com 10 µL de CMA (0,5 mg/ml) e mantidas no escuro em câmara úmida por
uma hora. Após este período, foram lavadas com jatos de água destilada e seca
com bomba de ar. Posteriormente foram coradas com 10 µL DAPI (2 µg/ml) por 30
minutos, lavadas, secas e montadas em tampão McIlvaine-glicerol (1:1 v/v).
3.5 Fotodocumentação e Morfometria
Os resultados foram fotografados por meio de câmera digital Leica DFC345Fx
acoplado em microscópio de epifluorescência Leica DM2500. As imagens tiveram
alteração de brilho e contraste no programa Adobe Photoshop CS3 com o suporte
do Paint Shop Pro 5.
Para a morfometria foram utilizadas imagens de cinco metáfases provenientes
da sobreposição do bandeamento CMA/DAPI para cada acesso. O tamanho dos
cromossomos foi determinado por meio do programa Micromeasure 3.3,
complementado pelo Microsoft Excel 2010. Com os cariótipos mensurados foi
possível determinar os valores do comprimento total cromossômico (CTC) e sua
média (CMC); do comprimento total do lote haploide de cromatina (CTLH), obtido
32
pela somatória do cariótipo haploide; comprimento do braço longo (BL), curto (BC) e
da razão entre os braços longo e curto (r) de cada par cromossômico. Esses valores
foram aproveitados para os índices de assimetria cromossômica de Huziwara
(1962), TF%, e Romero Zarco (1986), A1 e A2:
TF%=
x 100 (1)
A1 = 1- ∑
A2 =
(2)
em que:
qi = comprimento médio do braço curto
pi = comprimento médio do braço longo
SCL= desvio padrão do comprimento cromossômico
XCL= média do comprimento cromossômico
Para a análise estatística foram considerados como variáveis os valores
médios, por metáfase, para o comprimento total e dos braços longo e curto,
adotando-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, com cinco
repetições. O modelo adotado foi:
Yij = m + ti + e(ij) (3)
em que:
Yij = observação do acesso i, na repetição j = 1, 2, ..., 5
m = média geral
ti = efeito do acesso i, com i = 1, 2, ... n
e(ij) = erro experimental
Em seguida foi efetuada a análise de variância e o teste Tukey ao nível de 5%
de significância. As análises foram realizadas utilizando-se o software Genes
(CRUZ, 2013).
33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todos os acessos analisados apresentaram número cromossômico 2n = 2x =
16, corroborando a contagem prévia realizada por Konvicka e Levan (1972). As
espécies do gênero Allium têm seus cromossomos descritos desde os estudos
pioneiros de Levan (1932) e Nichols (1940), que citam com igual número diploide
dos acessos de alho, por exemplo, A. albopilosum, A. ammophilum, A. nutans e A.
cepa. Para A. flavum e A. saxatile confirmou-se também 2n = 2x = 16 (DRAGHIA et
al., 2013). Variação cromossômica do tipo poliploidia foi descrita para A.
przewalskianum, com 2n = 2x = 32 (CUI et al., 2008). Em A. sativum, um estudo
expõe sobre algumas variantes do alho comum que apresentaram haploidia 2n = 2x
= 8, aneuploidia 2n = 2x = 6 e 10, e polipolidia com 2n = 2x = 28, 30 e 32
(ORDÓÑEZ et al., 2002).
O núcleo interfásico é do tipo reticulado, no qual a cromatina é densa e
uniformemente distribuída (BENKO-ISEPPON; MORAWETZ, 2002), com pequenos
cromocentros esferoides evidentes que são de heterocromatina ou eucromatina
densamente compactada (Figura 6E). Os cromossomos verificados em prófase,
prometáfase e metáfase apresentam padrão de condensação uniforme, com aspecto
homogêneo em toda a extensão dos braços longos e curtos, exceto nas constrições
primárias e secundárias (Figura 6A-C). Esse tipo de núcleo interfásico e padrão de
condensação cromossômico também foram relatados em Callisia fragrans, C.
repens, C. warszewicziana (ROA, 2007) e Tripogranda glandulosa (MARQUES et al.,
2010).
As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) do gênero Allium possuem a
denominaçao de ‘sativum’ e se caracterizam por serem maiores em tamanho que o
seus respectivos braços curtos (MATHEW, 1996; ÜNAL; DUMAM, 2002). Nas
prometáfases cromossômicas foi possível identificar duas RONs proximais
claramente distendidas, geralmente também vizualisadas na metáfase como
grandes gaps (Figura 6B e 6C). Uma dessas constrições secundárias observadas na
prometáfase se apresentou longamente mais distendida que no seu homólogo,
como nos acessos Roxo de Minas (Figura 7F), Branco Mineiro (PI) e Cateto Roxo
99. Esse tipo de heteromorfismo na distenção da RON foi semelhante ao encontrado
em Guazuma ulmifolia (ÉDER-SILVA et al., 2007).
O tamanho cromossômico do alho foi considerado grande, com o
34
comprimento médio variando de 8,46µm (acesso Sergipe) a 10,02µm (acesso Santo
Antonio de Lisboa-PI) e intervalo do tamanho cromossômico variando de 6,42µm a
12,40µm (Tabela 2). Esses valores são próximos ao intervalo encontrado por
Yüzbasioglu e Ünal (2004), diferindo no menor tamanho (7,32µm) e similar ao maior
tamanho (12,20µm). A pequena alteração encontrada na comparação do menor
tamanho pode ser pela diferente fase de condensação nas metáfases mensuradas
ou pelo uso das imagens de sobreposição da coloração CMA/DAPI na morfometria.
Figura 6 – Dados citológicos de Allium sativum L., por coloração convencional com Giemsa, evidenciando o núcleo interfásico reticulado (A, D e E), o padrão de condensação (A, B e C), número e morfologia cromossômica (B e D). Prófase (A), prometáfase (B) e metáfase (C) obtidas com uso de antimitótico, anáfase (D), final da anáfase (E) e telófase (F). Pontilhado e seta vermelha indicam Região Organizadora de Nucléolo (RON) distendida. Barra = 10µm.
A fórmula cariotípica encontrada, mediante valores da razão entre o braço
longo e curto (r) e parâmetros de Levan et al. (1964), foi 8M (metacêntrico) para
todos os acessos. Essa classificação morfológica considera que cromossomos com r
entre 1,0 e 1,7 são metacêntricos e r entre 1,7 e 3,0 são submetacêntricos (SM).
Entretanto, serão considerados nesse estudo os parâmetros de Guerra (1983), que
35
estabelece como metacêntrico r entre 1,0 e 1,49, e submetacêntrico r entre 1,5 e
2,99, os pares 5, 6 ou 7 da maioria dos acessos ficaram no limite entre metacêntrico
e submetacêntrico, principalmente o par 5, causando uma diferença na classificação
cromossômica dos acessos (Tabela 2). Konvicka e Levan (1972) também
encontraram mensuração de cromossomos no limiar entre as categorias de
classificação.
Para assimetria cariotípica foram avaliados os índices de Huziwara (1962),
TF%, e Romero Zarco (1986), A1 e A2. Esses índices são utilizados principalmente
entre táxons, para inferir sobre os aspectos taxonômicos e evolutivos (PASZKO,
2006). No presente estudo foram aplicadas para identificar diferenças na assimetria
entre os acessos avaliados. O índice TF% é expresso pela relação da soma dos
comprimentos dos braços curtos e o comprimento total do complemento haplóide,
varia de 0 a 0,5 de acordo com o aumento da simetria. O índice de assimetria
intracromossômica (A1) basea-se na razão entre os braços e a intercromossômica
(A2) pela razão entre a média e desvio obtidos no comprimento do conjunto haplóide,
variam de 0 a 1 de cordo com o aumento da assimetria.
Além disso, um cariótipo simétrico é caracterizado pela predominância de
cromossomos metacêntricos e submetacêntricos de aproximadamente o mesmo
tamanho (PASZKO, 2006). Considerando a fórmula cariotípica e os índices de
assimetria, todos os acessos aqui apresentados são simétricos e exibiram uma
variação pequena de 43,75 a 44,24 para TF%, 0,21 a 0,23 para A1 e 0,15 a 0,17
para A2 (Tabela 2). Esses valores são próximos aos apresentados em clones de
alho, por Ordóñez et al. (2002), sendo o A1 de 0,24 a 0,25 e diferindo mais em A2
que foi de 0,18 a 0,20.
A Análise de Variância (ANAVA) feita com as médias do comprimento total do
lote haplóide (CTLH), braço longo (BL) e braço curto (BC), foi significativa pelo deste
F ao nível de 1% de probabilidade (Tabela 3). No entanto, assim como os resultados
dos índices de assimetria, os valores das médias do comprimento total, braço longo
e curto, submetidas ao teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, não
apresentaram diferença significativa entre os acessos, exceto o acesso Roxo de
Minas que apresentou valores divergentes dos demais por estar com a cromatina
mais descondensada, na prometáfase (Tabela 4). Essa divergência identificada pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade foi o que resultou nos dados significativos da
ANAVA.
36
Tabela 2 – Acessos, Número cromossômico diplóide, Intervalo do Tamanho Cromossômico (ITC), média da razão entre os braços do cromossomo (r), Fórmula Cariotípica (FC), Comprimento Total Cromossômico (CTC), Comprimento Médio Cromossômico (CMC), Comprimento Total do Lote Haploide (CTLH), índices de assimetria de Huziwara (1962), TF%, e de Romero Zarco (1986), A1 e A2.
Acesso
2n ITC
m
r FC CTC
m
CMC
m
CTLH
m
TF% A1 A2
Guerra (1983)
Sussuapara - PI 16 6,77 – 11,14 1,41 6M+2SM 145,24 9,08 72,62 - - -
Santo Antonio de
Lisboa - PI
16 7,64 – 12,22 1,35 6M+2SM 160,39 10,02 80,20 43,94 0,22 0,15
Catetinho do
Paraná 1254
16 7,28 – 12,50 1,32 6M+2SM 159,48 9,97 79,74 44,19 0,21 0,17
Branco Mineiro -
PI
16 7,03 – 11,51 1,32 7M+1SM 149,29 9,33 74,65 44,24 0,21 0,16
Cateto Roxo 99 16 7,28 – 12,40 1,34 6M+2SM 158,64 9,91 79,32 43,75 0,23 0,17
Roxo de Minas 16 10,27 – 17,79 1,36 6M+2SM 227,47 14,22 13,73 43,82 0,23 0,17
Sergipe 16 6,42 – 10,41 1,33 7M+1SM 135,29 8,46 67,64 43,88 0,23 0,16
37
Tabela 3 – Resumo da Análise da Variância para os caracteres comprimento total do lote haplóide
(CTLH), braço longo (BL) e braço curto (BC), referente às medias dos parâmetros morfométricos
obtidos para 5 repetições de metáfases dos acessos Santo Antonio de Lisboa – PI, Catetinho do
Paraná 1254, Branco Mineiro – PI, Cateto Roxo 99, Roxo de Minas e Sergipe. Fonte de Variação
(FV), Grau de Liberdade (GL), Coeficiente de Variação (CV).
FV
GL
Quadrados Médios
CTLH BL BC
Acessos 5 20,00** 6,38** 3,80**
Resíduo 24 1,35 0,44 0,86
CV (%) - 11,28 11,48 11,21
**Significativo ao nível de 1% de probabilidade, pelo teste F.
Tabela 4 – Valores médios para o comprimento do Braço Longo, Braço Curto e Comprimento Total,
expressos em micrômetros (µm). Acessos seguidos da mesma letra sobrescrita foram agrupados pelo
teste de Tukey a 5% de significância.
Acessos Braço Longo Braço Curto Comprimento Total
Santo Antonio de Lisboa - PI 5,62b 4,41
b 10,02
b
Catetinho do Paraná 1254 5,56b 4,41
b 9,97
b
Branco Mineiro – PI 5,20b 4,13
b 9,33
b
Cateto Roxo 99 5,59b 4,34
b 9,91
b
Roxo de Minas 7,99a 6,23
a 14,22
a
Sergipe 4,75b 3,71
b 8,46
b
A dupla coloração com os fluorocromos cromomicina A3 e 4’,6-diamidino-2-
phenilindol revelou bandas CMA+/DAPI- bastante reduzidas. As bandas CMA
apresentaram diferentes intensidades de coloração, recebendo o símbolo + de
acordo com a potência do sinal emitido. Os menores blocos ficaram ainda mais
discretos em cromossomos com alto nível de compactação, que só pôde ser
confirmada observando-se os cromocentros formados nos núcleos interfásicos ou no
cromossomo mais distendido (Figura 7).
Os acessos de Allium sativum L. caracterizados apresentaram alguns
cromossomos similares e outros com variação na intensidade, distribuição e
quantidade de bandas CMA+/DAPI-. Alinhando os cromossomos no cariograma é
possível analisar essas diferenças entre pares e entre acessos. Para melhor
compreensão, o esquema do conjunto haploide foi desenhado no idiograma (Figura
8).
38
Figura 7 - Cromossomos mitóticos com dupla coloração CMA/DAPI dos acessos Sussuapara PI (A), Santo Antonio de Lisboa (B), Catetinho do Paraná 1254 (C), Branco Mineiro PI (D), Cateto Roxo 99 (E), Roxo de Minas ESALQ (F) e Sergipe (G). Insertos destacam as pequenas bandas CMA
+/DAPI
-.
Setas em amarelo indicam as bandas CMA+/DAPI
- mais evidentes nos cromossomos e núcleo
interfásico. Setas em vermelho indicam banda CMA+ em cromossomo sobreposto (B). Setas em
branco indicam gaps formados pela condensação (D). Pontilhado indica Região Organizadora de
Nucléolo (RON) distendida (F). Barra representa 10m.
39
Em todos os acessos, os pares 1, 2 e 3 não apresentaram bandas
CMA+/DAPI- e foram os maiores cromossomos, similares tanto no tamanho quanto
na morfologia. Nos demais cromossomos do complemento foi possível visualizar
discretos blocos de heterocromatina CMA+/DAPI-, na maioria localizados próximos
ao centrômero. Este padrão diferiu do encontrado em Allium subvillosum, que exibiu
bandas teloméricas em todos os braços curtos e bandas intersticiais em todos os
braços longos (GUERRA, 2000).
Figura 8 – Cariogramas e idiogramas dos acessos Sussuapara PI (A), Santo Antonio de Lisboa (B), Catetinho do Paraná 1254 (C), Branco Mineiro PI (D), Cateto Roxo 99 (E), Roxo de Minas ESALQ (F) e Sergipe (G). Traço e circulo amarelo representam banda CMA
+/DAPI
-. Ordem Cromossômica (OC),
Tamanho Cromossômico (TC), Metacêntrico (M) e Submetacêntrico (SM). Barra vertical no cariograma e idiograma = 10µm. (Continua).
40
Figura 8 – Cariogramas e idiogramas dos acessos Sussuapara PI (A), Santo Antonio de Lisboa (B), Catetinho do Paraná 1254 (C), Branco Mineiro PI (D), Cateto Roxo 99 (E), Roxo de Minas ESALQ (F) e Sergipe (G). Traço e circulo amarelo representam banda CMA
+/DAPI
-. Ordem Cromossômica (OC),
Tamanho Cromossômico (TC), Metacêntrico (M) e Submetacêntrico (SM). Barra vertical no cariograma e idiograma = 10µm. (Continuação).
41
Figura 8 – Cariogramas e idiogramas dos acessos Sussuapara PI (A), Santo Antonio de Lisboa (B), Catetinho do Paraná 1254 (C), Branco Mineiro PI (D), Cateto Roxo 99 (E), Roxo de Minas ESALQ (F) e Sergipe (G). Traço e circulo amarelo representam banda CMA
+/DAPI
-. Ordem Cromossômica (OC),
Tamanho Cromossômico (TC), Metacêntrico (M) e Submetacêntrico (SM). Barra vertical no cariograma e idiograma = 10µm. (Conclusão).
Em todos os acessos ocorreram bandas CMA+/DAPI- proximais nos pares
cromossômicos 6 e 7, que podem estar associados a RON (BESENDORFER et al.,
2002), mas a clara distinção de satélite foi possível observar em um dos pares, 6 ou
7, entre os acessos. Esses cromossomos são descritos com região satélite no braço
curto, sendo o par 6 mais assimétrico que o par 7 (KONVICKA; LEVAN 1972). A
intensidade dessas bandas CMA+/DAPI- variou entre os pares e entre acessos,
principalmente no Branco Mineiro PI, que apresentou a banda em um dos
cromossomos do par 6 como a mais intensa dos acessos avaliados, indicando maior
quantidade de sequências GC, podendo ser identificada facilmente como um grande
42
cromocentro no núcleo interfásico (Figura 7D e 8D). Desta forma, este cromossomo
pode ser utilizado como potencial marcador na identificação deste material.
Ainda no par 6, ocorreram pequenas bandas na região distal do braço curto
nos acessos Sussuapara e Santo Antonio de Lisboa PI (Figura 7A, 8A, 7B, 8B).
Discretas bandas CMA+/DAPI- foram encontradas próximas ao telômero no braço
longo de um dos cromossomos do par 4 nos acessos Catetinho do Paraná 1254 e
Sergipe (Figura 7C, 8C, 7G, 8G). Bandas similares foram identificadas no par 5 do
Acesso Cateto Roxo 99 sendo evidente em apenas um dos cromossomos no acesso
Roxo de Minas ESALQ (Figura 7F, 8F). O acesso Catetinho do Paraná 1254
apresentou blocos CMA+/DAPI- na região mediana do braço longo em um dos
cromossomos do par 8 e uma nítida diferença no comprimento do braço longo em
um dos homólogos do par 7, sugerindo perda de material genético (Figura 7C, 8C).
O acesso Cateto Roxo 99 apresentou heteromorfismo nas bandas CMA+/DAPI- nos
pares 6 e 7 (Figura 7E e 8E).
As variações na distribuição das pequenas bandas heterocromáticas
encontradas possibilitaram a organização dos acessos de alho em três grupos: 1º –
acessos Sussuapara PI, Santo Antonio de Lisboa e Branco Mineiro PI, são os que
apresentaram bandas CMA+/DAPI- apenas nos pares cromossômicos 6 e 7; 2º –
acessos Catetinho do Paraná 1254 e Sergipe, são os que apresentaram bandas
CMA+/DAPI- nos pares cromossômicos 4, 6 e 7; 3º – acessos Cateto Roxo 99 e Roxo
de Minas ESALQ, são os que apresentaram bandas CMA+/DAPI- nos pares
cromossômicos 5, 6 e 7 (Tabela 5).
No gênero Allium, algumas outras variações de bandas heterocromáticas
foram encontradas. Em A. sativum, Yüzbasioglu e Ünal (2004) identificaram bandas
C na região pericentromerica dos pares 1, 4 e na região próxima ao satélite do par 5,
diferindo do resultado apresentado por Cortes et al. (1983), que visualizaram bandas
C na região telomérica do par 4, na região proximal dos braços curtos nos pares 6 e
7, e bandas distais no braços longos dos pares 7 e 8. Em A. cepa, bandas de
heterocromatina CMA+ foram observadas apenas na extremidade dos cromossomos
(KIM et al., 2002). Eventos similares ocorrem em alguns grupos proximamente
relacionados com o gênero Allium, como em Echinodorus, Hydrocley e Limnocharis
que possuem algumas espécies com padrões de bandas diferentes entre si
(FEITOZA et al., 2010).
Acredita-se que as pequenas variações na quantidade e distribuição da
43
heterocromatina dos acessos de Allium sativum analisados nesse estudo se devem
ao acúmulo de diferentes eventos genéticos, como mutação, duplicação, deleção e
translocação, em genótipos que ocupavam ambientes distintos (PUITATTI;
FERREIRA, 2005). Esses polimorfismos também tem relação com a tendência para
o acúmulo de heterocromatina decorrente do processo evolutivo (GUERRA et al.,
2000). Portanto, a citogenética enquanto ferramenta possibilita inferir sobre o
processo evolutivo e a distinção, mesmo de forma discreta, de diferentes genótipos.
.
44
Tabela 5 – Distribuição das bandas CMA+/DAPI
- nos cromossomos e organização dos acessos em grupos. Sinal + simboliza banda positiva, sinal – simboliza
banda negativa. A quantidade de sinal + simboliza a intensidade dos fluorocromos. Cromossomo 1 (C1), Cromossomo 2 (C2).
Acessos
Par cromossômico
Grupo 1, 2 e 3 4 5 6 7 8
C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2
Sussuapara - PI - - - - - - CMA++
DAPI-
CMA++
DAPI-
CMA+
DAPI-
CMA+
DAPI-
- - 1
Santo Antonio
de Lisboa - PI
- - - - - - CMA++
DAPI-
CMA++
DAPI-
CMA++
DAPI-
CMA++
DAPI-
- - 1
Branco Mineiro
– PI
- - - - - - CMA+++
DAPI-
CMA++
DAPI-
CMA++
DAPI-
CMA+
DAPI-
- - 1
Catetinho do
Paraná 1254
- - CMA+
DAPI-
- - CMA++
DAPI-
CMA+
DAPI-
CMA+
DAPI-
CMA+
DAPI-
- CMA+
DAPI-
2
Sergipe - - - CMA+
DAPI-
- - CMA+
DAPI-
CMA+
DAPI-
CMA++
DAPI-
CMA+
DAPI-
- - 2
Cateto Roxo 99 - - - - CMA+
DAPI-
CMA+
DAPI-
CMA+
DAPI-
- CMA++
DAPI-
- - - 3
Roxo de Minas - - - - CMA+
DAPI-
- CMA++
DAPI-
CMA++
DAPI-
CMA+
DAPI-
CMA+
DAPI-
- - 3
45
5 CONCLUSÃO
Os acessos avaliados apresentaram cromossomos simétricos, quanto aos
índices de assimetria aplicados, e sem diferença significativa na análise estatística
utilizada para a comparação dos parâmetros morfométricos.
Nas prometáfases observadas foi possível confirmar a presença de
heteromorfismo na distenção da RON, variando do par 6 ou 7, no qual uma das
constrições secundárias se apresentou longamente mais distendida que no seu
homólogo.
Foram observados pequenos polimorfismos cromossômicos de
heterocromatina revelados na dupla coloração CMA+/DAPI- que puderam ser
utilizados para separar os sete acessos em três grupos e até mesmo diferenciar
alguns dos acessos individualmente. Enfatiza-se que, dessa forma, foi possível
distinguir os acessos oriundos do Piauí, pois estes revelaram bandas apenas nos
pares 6 e 7 diferindo dos demais acessos que apresentaram bandas nos pares 4 ou
5, além dos pares 6 e 7.
Sugere-se que o cromossomo CMA+++/DAPI- do par seis do acesso Branco
Mineiro Piauí seja utilizado como marcador na identificação deste material, podendo
ser até associado a algum caráter de interesse econômico.
46
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