96
Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz Centro de Pesquisas René Rachou Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Triatoma infestans e Triatoma brasiliensis: avaliação da resistência ao piretróide deltametrina e análise intraespecífica da variabilidade genética por Ivan Vieira Sonoda Belo Horizonte maio/2009 TESE DBCM-CPqRR I.V. SONODA 2009

toma infestans Triatoma brasiliensis

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Page 1: toma infestans Triatoma brasiliensis

Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisas René Rachou

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Triatoma infestans e Triatoma brasiliensis: avaliação da resistência ao

piretróide deltametrina e análise intraespecífica da variabilidade genética

por

Ivan Vieira Sonoda

Belo Horizonte

maio/2009

TESE DBCM-CPqRR I.V. SONODA 2009

Page 2: toma infestans Triatoma brasiliensis

II

Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisas René Rachou

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Triatoma infestans e Triatoma brasiliensis: avaliação da resistência ao

piretróide deltametrina e análise intraespecífica da variabilidade genética

por

Ivan Vieira Sonoda

Tese apresentada com vistas à obtenção

do Título de Doutor em Ciências na área

de concentração Biologia Celular e

Molecular

Orientação: Dra. Liléia Gonçalves

Diotaiuti

Co-orientação: Dr. Alvaro José Romanha

e Dr. João Carlos Pinto Dias

Belo Horizonte

maio/2009

Page 3: toma infestans Triatoma brasiliensis

III

Catalogação-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975 S698t 2009

Sonoda, Ivan Vieira.

Triatoma infestans e Triatoma brasiliensis: avaliação da resistência ao piretróide deltametrina e análise intraespecífica da variabilidade genética / Triatoma infestans and Triatoma brasiliensis: evaluation of the resistance to pirethroid deltamethrin and intraspecific analysis of the genetic variability / Ivan Vieira Sonoda. – Belo Horizonte, 2009.

XVI, 80 f: il. ; 210 x 297mm. Bibliografia: f. 83 - 96 Tese – Tese para obtenção do título de Doutor em

Ciências pelo Programa de Pós - Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de concentração: Biologia Celular e Molecular.

1. Doença de Chagas/prevenção & controle 2. Triatoma/crescimento & desenvolvimento 3. Triatoma/genética 4. Inseticidas/efeitos adversos I. Título II. Diotaiuti, Liléia Gonçalves (Orientação). III. Romanha, Alvaro José (Co-orientação). IV. Dias, João Carlos Pinto (Co-orientação)

CDD – 22. ed. - 616.936 3

Page 4: toma infestans Triatoma brasiliensis

IV

Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisas René Rachou

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Triatoma infestans e Triatoma brasiliensis: avaliação da resistência ao

piretróide deltametrina e análise intraespecífica da variabilidade genética

por

Ivan Vieira Sonoda

Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:

Dra. Liléia Gonçalves Diotaiuti (Presidente)

Dra. Roberta Lima Caldeira

Dra. Silvane Maria Fonseca Murta

Dra. Dalva Mascarenhas

Dr. Evandro Marques de Menezes

Suplente: Dr. Nilton Barnabé Rodrigues

Tese defendida e aprovada em: 21/05/2009

Page 5: toma infestans Triatoma brasiliensis

V

Às minhas filhas, Marina e Joana,

que tanto me inspiram...

Page 6: toma infestans Triatoma brasiliensis

VI

Agradecimentos

Agradeço acima de tudo à minha família por todo o apoio e amor. Em

especial à minha esposa Lucineide que sempre me apoiou em todos os momentos;

Agradeço à minha orientadora, Dra. Liléia Diotaiuti, pela oportunidade de

trabalho, por todos os ensinamentos nestes quatro anos e principalmente pela

paciência, respeito e amizade;

Agradeço aos meus co-orientadores, Dr. Alvaro Romanha e Dr. João Carlos

por toda ajuda durante o trabalho;

Agradeço à Fapemig e Fiocruz pelo apoio financeiro para a realização deste

estudo;

Agradeço às Secretarias de Saúde do Rio Grande do Sul e do Ceará pela

disponibilidade de triatomíneos para a realização deste estudo, em especial a Célia

Lammerhist e Cláudia Menezes;

Agradeço à Bayer pela disponibilidade de inseticidas piretróides que foram

utilizados no estudo;

Agradeço à Letícia e Grazielle por toda ajuda do desenvolvimento deste

estudo;

Agradeço a todos os meus colegas de laboratório pelos momentos felizes.

Em especial a João Paulo e Marcos pela amizade, que certamente será duradoura;

Agradeço à Inês Mascarenhas por toda ajuda no dia-a-dia;

Agradeço a todos os colegas do Centro de Pesquisas René Rachou pela

amizade. Em especial a Simone, Flávio, Elisângela, Rômulo e Nilton;

Agradeço às ex-coordenadoras do Programa de Pós-Graduação, Dra.

Virginia Schall e Dra. Cristiana Ferreira, bem como ao novo coordenador Dr. Paulo

Pimenta pelo esforço e organização do curso;

Agradeço às secretárias do Programa de Pós-Graduação, Cristiane Gomes

e Andréa Dias, pela atenção em todos os momentos necessários;

Agradeço à Biblioteca do CPqRR em prover acesso gratuito local e remoto à

informação técnico-científica em saúde custeada com recursos públicos federais,

integrante do rol de referências desta tese, também pela catalogação e

normalização da mesma;

A todos, muito obrigado!

Page 7: toma infestans Triatoma brasiliensis

VII

Sumário

Lista de figuras IX

Lista de tabelas XI

Lista de abreviaturas e símbolos XIII

Resumo XV

Abstract XVI

1 INTRODUÇÃO 17

2 OBJETIVOS 21

2.1 Geral 21

2.2 Específicos 21

3 REVISÃO DA LITERATURA 22

3.1 Doença de Chagas 22

3.1.1 Epidemiologia 23

3.2 Trypanosoma cruzi 23

3.3 Biologia de triatomíneos 24

3.4 Triatoma infestans 25

3.4.1 Variabilidade genética de Triatoma infestans 26

3.5 Triatoma brasiliensis 28

3.5.1 Variabilidade genética de Triatoma brasiliensis 29

3.6 Controle da doença de Chagas 31

3.7 Resistência de triatomíneos a inseticidas 33

4 MÉTODOS 36

4.1 Triatomíneos estudados 36

4.1.1 Triatoma infestans 36

4.1.2 Triatoma brasiliensis 37

4.2 Ensaios biológicos 38

4.2.1 Inseticida utilizado 38

4.2.2 Procedimentos no ensaio 39

4.2.3 Avaliação da resistência 40

4.3 Estudo da variabilidade genética de Triatoma infestans e Triatoma

brasiliensis 40

4.3.1 Extração de DNA e PCR 40

4.3.2 Sequenciamento e genotipagem 42

Page 8: toma infestans Triatoma brasiliensis

VIII

4.3.3 Genética de populações 42

5 RESULTADOS 45

5.1 Ensaios com Inseticida 45

5.1.1 Triatoma infestans 45

5.1.2 Triatoma brasiliensis 46

5.2 Variabilidade genética de Triatoma infestans 47

5.2.1 Variabilidade genética do gene cytB 47

5.2.2 Variabilidade genética dos loci de microssatélites 53

5.3 Variabilidade genética de Triatoma brasiliensis 57

6 DISCUSSÃO 62

6.1 Resistência de triatomíneos a deltametrina 62

6.2 Variabilidade genética de Triatoma infestans 65

6.3 Variabilidade genética de Triatoma brasiliensis 71

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÕES 74

8 ANEXO 76

9 REFERÊNCIAS 83

Page 9: toma infestans Triatoma brasiliensis

IX

Lista de figuras

Figura 1: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. a) tripomastigota em lâmina de

sangue; b) epimastigota em meio de cultura e c) amastigotas no interior de célula

muscular. Fonte: WHO/TDR (www.who.int/tdr - acessado dia 15/04/2009). 24

Figura 2: Principais triatomíneos de importância epidemiológica na doença de

Chagas nas Américas: a) Triatoma infestans, b) Triatoma brasiliensis, c) Triatoma

sordida, d) Triatoma pseudomaculata, e) Triatoma dimidiata, f) Panstrongylus

megystus e g) Rhodnius prolixus. Fonte: Msc. Angélica de Oliveira

(CPqRR/FIOCRUZ). 25

Figura 3: Formas cromáticas descritas para Triatoma brasiliensis. a) brasiliensis, b)

melanica, c) macromelasoma e d) juazeiro. Fonte: Instituto Oswaldo Cruz

(www.fiocruz.br/ioc - Acessado dia 15/04/2009). 30

Figura 4: Mapa do Estado do Rio Grande do Sul evidenciando as localidades de

obtenção dos Triatoma infestans: 1 - Doutor Maurício Cardoso (27º30'21"S /

54º21'39"W), 2 - Três de Maio (27º46'24"S / 54º14'24"W), 3 - Guarani das Missões

(28º08'27"S / 54º33'29"W), e 4 - Mato Queimado (28º15'21"S / 54º36'57"W). Fonte:

Wikipedia (www.wikipedia.org – acessado dia 15/04/2009). 36

Figura 5: Mapa do Estado do Ceará evidenciando o município de Tauá (em cinza).

Fonte: Wikipedia (www.wikipedia.org – acessado dia 15/04/2009). 38

Figura 6: DL50 e RR observadas para as amostras de Triatoma infestans estudadas.

Os valores também são mostrados na tabela 2. 46

Figura 7: DL50 e RR observadas para as amostras de Triatoma brasiliensis

estudadas. Os valores também são mostrados na tabela 3. 47

Figura 8: Network dos haplótipos do gene mitocondrial cytB observados nos

Triatoma infestans do Brasil, Argentina e Bolívia. As elipses representam os

haplótipos, e a área delas a freqüência dos haplótipos. Os círculos menores

Page 10: toma infestans Triatoma brasiliensis

X

representam haplótipos perdidos ou não amostrados, necessários para a correta

conexão dos haplótipos estudados. 52

Figura 9: Network dos haplótipos do gene mitocondrial cytB observados nos

Triatoma brasiliensis do município de Tauá, Estado do Ceará. As elipses

representam os haplótipos e os pontos representam haplótipos perdidos ou não

amostrados, necessários para a correta conexão dos haplótipos estudados. a)

Network representando os números de cada haplótipo. b) Representação dos

ambientes de obtenção dos exemplares. Verde: ambiente silvestre; Amarelo:

ambiente peridomiciliar e; Vermelho: ambiente intradomiciliar. 60

Figura 10: Dendrograma neighbor-joining dos haplótipos do gene mitocondrial cytB

de Triatoma brasiliensis do município de Tauá comparados com haplótipos

previamente descritos para os quatro fenótipos de T. brasiliensis (brasiliensis,

macromelasoma, juazeiro e melanica). Triatoma infestans foi utilizado como grupo

irmão e Rhodnius prolixus como grupo externo. Os números representam os 50

haplótipos descritos neste trabalho. As letras são os haplótipos previamente

descritos (Monteiro et al., 2004). 61

Figura 11: Esquema da proteína Canal de Sódio evidenciando os quatro domínios

constituídos cada um por seis hélices transmembrana. Os domínios se dobram para

formar um poro na membrana celular. Fonte: Soderlund e Knipple (2003). 68

Page 11: toma infestans Triatoma brasiliensis

XI

Lista de tabelas

Tabela 1: Iniciadores utilizados para amplificação dos 10 loci de microssatelite em

Triatoma infestans. 41

Tabela 2: Valores de DL50, Slope e RR para Triatoma infestans do Rio Grande do

Sul, Montes Claros, Posse e Yacuiba. 45

Tabela 3: Valores de DL50, Slope e RR para populações de Triatoma brasiliensis do

Estado do Ceará, Nordeste do Brasil. 46

Tabela 4: AMOVA para as amostras de Triatoma infestans estudadas calculadas

com base nas sequências do gene mitocondrial cytB. 48

Tabela 5: Variabilidade genética de sequências do gene mitocondrial cytB em

populações de Triatoma infestans do Brasil, Argentina e Bolívia. 50

Tabela 6: Testes de neutralidade calculados para as populações de Triatoma

infestans do Brasil, Argentina e Bolívia, através de sequências do gene mitocondrial

cytB. 50

Tabela 7: Freqüência dos haplótipos do gene mitocondrial cytB observados nas

populações de Triatoma infestans estudadas. 51

Tabela 8: FST pareado entre as amostras de Triatoma infestans estudadas,

calculados através das sequências do gene mitocondrial cytB. 53

Tabela 9: Variabilidade genética de 10 loci de microssatélites em populações de

Triatoma infestans do Brasil, Argentina e Bolívia. 53

Tabela 10: Variação genética apresentada pelos 10 loci de microssatélite nas

populações de Triatoma infestans estudadas. 54

Page 12: toma infestans Triatoma brasiliensis

XII

Tabela 11: Relação dos alelos observados nos 10 loci de microssatélite nas

populações de Triatoma infestans estudadas. 55

Tabela 12: AMOVA para as amostras de Triatoma infestans estudadas através dos

10 loci de microssatélite. 56

Tabela 13: FST pareado entre as amostras de Triatoma infestans estudadas,

calculados através dos 10 loci de microssatélite. 57

Tabela 14: AMOVA para as amostras de Triatoma brasiliensis do município de Tauá,

Estado do Ceará, calculada através das sequências do gene mitocondrial cytB.

58

Tabela 15: Variabilidade genética do gene mitocondrial cytB em Triatoma brasiliensis

do município de Tauá, Estado do Ceará. 58

Tabela 16: Testes de neutralidade calculados para as populações de Triatoma

brasiliensis do Município de Tauá, através de sequências do gene mitocondrial cytB.

59

Page 13: toma infestans Triatoma brasiliensis

XIII

Lista de abreviaturas e símbolos

- Número Médio de Diferenças Pareadas;

n - Diversidade de Nucleotídeos;

S - Número de Singletons;

AMOVA - Analysis of Molecular Variance (Análise de Variância Molecular);

AVAI - Anos de Vida Ajustados à Incapacidade;

HCH – Hexaclorobenzeno (BHC);

Bti - Toxina Botulínica;

CGLAB - Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública;

CIPEIN - Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas;

CPqRR - Centro de Pesquisas René Rachou;

cytB - Gene mitocondrial do citocromo B;

DDT - Dicloro-Difenil-Tricloroetano;

DL50 - Dose Letal 50%;

EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético);

F1 - Primeira Geração;

F2 - Segunda Geração;

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz;

FSC, FCT e FST - Índices de Endocruzamento;

Ĥ - Diversidade Genética;

H - Número de Haplótipos;

He - Heterozigosidade Esperada;

Ho - Heterozigosidade Observada;

kdr - Knockdown Resistance (Resistência Knockdown).

LATEC - Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas;

MS - Ministério da Saúde;

Na - Número de Alelos;

OPAS - Organização Panamericana da Saúde;

PCDCH - Programa de Controle da Doença de Chagas;

PCR - Polimerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase);

RAPD - Randon Amplified Polimorphic DNA (DNA polimórfico amplificado

aleatoriamente);

RR - Razão de Resistência;

Page 14: toma infestans Triatoma brasiliensis

XIV

RT-PCR - Reverse Transcriptase PCR (Reação em Cadeia da Polimerase após

Transcrição Reversa);

S - Número de Sítios Polimórficos;

SES-CE - Secretaria de Estado de Saúde do Ceará;

SES-RS - Secretaria do Estado de Saúde do Rio Grande do Sul;

SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde;

UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro;

UV - Ultra Violeta;

WHO - World Health Organization (Organização Munidal da Saúde);

Page 15: toma infestans Triatoma brasiliensis

XV

Resumo

O Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCh) teve suas atividades

iniciadas por volta da década de 1960 em âmbito nacional. Em 1991, com a

Iniciativa dos Países do Cone Sul, o PCDCh passou a priorizar as áreas de

ocorrência do Triatoma infestans, enquanto a vigilância epidemiológica era

implantada nas áreas já sob controle da transmissão vetorial. A utilização de

inseticidas piretróides nas atividades de controle permitiram ao PCDCh obter

resultados satisfatórios, como a interrupção da transmissão vetorial da doença de

Chagas em amplas áreas. A preocupação atual refere-se á possibilidade de

desenvolvimento de resistência aos inseticidas utilizados devido à existência de uma

região abrangendo o norte da Argentina e o sul da Bolívia onde T. infestans

apresenta-se resistente aos piretróides. Além disso, outras espécies de triatomíneos

já foram descritas com resistência inicial a estes inseticidas (ex. Rhodnius prolixus

na Venezuela e Triatoma sordida em Minas Gerais). Estas informações nos

impulsionaram a avaliar as populações remanescentes de T. infestans do Rio

Grande do Sul, comparando-as com amostras resistentes da Argentina e Bolívia, e

amostras de Triatoma brasiliensis do Ceará, através de ensaios com o piretróide

deltametrina. Complementarmente, foi estudada a variabilidade genética das

populações através de sequências do gene mitocondrial cytB e microssatélites. Os

resultados dos ensaios com deltametrina demonstraram que todas as amostras de

T. infestans e T. brasiliensis do Brasil apresentaram-se suscetíveis ao inseticida. A

variabilidade genética para T. infestans foi baixa, com valores muito inferiores aos

observados em T. brasiliensis. Também foi verificado que a variabilidade genética

demonstrada através dos loci de microssatélites em T. infestans foi muito maior que

a apresentada pelas sequências do gene cytB. Apesar disso, a análise das

sequências deste gene se mostrou adequada para avaliar a diferenciação genética

das populações. Em nosso trabalho foram observados valores de resistência

menores dos já descritos para T. infestans do Rio Grande do Sul e da Bolívia. Estas

diferenças indicam que o fenômeno de resistência é muito mais complexo do que se

imaginava, e por isso merece maior atenção.

Page 16: toma infestans Triatoma brasiliensis

XVI

Abstract

Chagas disease control program (CDCP) had its activities started about 1960´s. In

1991, based on the Southern Cone Initiative, the CDCP prioritized the areas of

Triatoma infestans, while the epidemiologic vigilance was established on areas under

controlled vectorial transmission. The use of pyrethroids insecticides on control

campaign allowed the CDCP to get great results, like the interruption of vectorial

transmission of Chagas disease in wide areas. The current concern is related to the

possibility of development of resistance to the used insecticides, due to the existence

of a region including the northern Argentine and southern Bolivia, were T. infestans

present high resistance to pyrethroids. Moreover, other triatomine species were

already described having initial resistance to these insecticides (ex. Rhodnius

prolixus from Venezuela and Triatoma sordida from Minas Gerais). These information

stimulate us to evaluate the remainder T. infestans populations from Rio Grande do

Sul, comparing them against the insecticide resistant samples from Argentina and

Bolivia, and samples from Triatoma brasiliensis from Ceara, through bioassays using

the pyrethroid deltamethrin. Complementarily, was studied the genetic variability

through mitochondrial cytB gene sequences and microsatelites. The results were

encouraging, demonstrating that all evaluated samples of T. infestans and T.

brasiliensis from Brazil presented susceptibility to tested insecticides. The observed

genetic variability to T. infestans were little, very lesser then that observed to T.

brasiliensis. It was also observed that the genetic variability of the microsatelite loci

from T. infestans was very bigger than demonstrated by cytB gene sequences. In

spite of this, the analysis of the cytB sequences was more indicated to analyze the

genetic differentiation among populations. In this work was observed lower

resistance ratios in T. infestans from Rio Grande do Sul and Bolivia, in comparison to

the already observed. These differences indicated that the phenomenon of

resistance is much more complex, and due to this it needs to have more attention.

Page 17: toma infestans Triatoma brasiliensis

17

1 INTRODUÇÃO

A doença de Chagas é uma antropozoonose endêmica na América Latina

que afeta aproximadamente 9 milhões de pessoas com outras 40 milhões em risco

de contraí-la (Schofield et al., 2006). Ela é causada pelo protozoário flagelado

Trypanosoma cruzi, que é transmitido ao homem através das fezes dos hemípteros

triatomíneos infectados (WHO, 2002). A doença afeta o tecido nervoso autônomo e

os tecidos musculares lisos do coração, esôfago e cólon, além de comprometer o

sistema nervoso periférico. Estas lesões desencadeiam diversas complicações do

sistema circulatório e digestivo (revistas por Moncayo, 1999, Punukollu et al., 2004).

As principais estratégias para o controle da doença de Chagas são

baseadas na interrupção da transmissão vetorial, principalmente pelo combate aos

triatomíneos vetores utilizando inseticidas residuais aplicados nas residências onde

tenha sido encontrada alguma espécie de triatomíneo. As atividades de controle no

Brasil foram iniciadas por volta de 1950, pelo então Serviço Nacional de Malária,

mas só tiveram um alcance nacional a partir de 1975 (Vinhaes e Dias, 2000). Estas

atividades alcançaram o máximo da operacionalidade nos anos 80, mas a partir de

1986 o Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCH) sofreu redução das

suas atividades devido ao surgimento de epidemias de dengue, sendo, porém,

mantidas as atividades de borrifação das residências infestadas em amplas áreas do

país. Em 1991, com a Iniciativa dos Países do Cone Sul (Argentina, Brasil, Bolívia,

Chile, Paraguai e Uruguai), o PCDCH passou a priorizar as áreas de ocorrência do

Triatoma infestans, principal espécie domiciliada, enquanto a vigilância

epidemiológica era implantada nas áreas já sob controle da transmissão vetorial

(Dias et al., 2002; WHO, 2002).

As características biológicas e epidemiológicas das diferentes espécies de

triatomíneos são fatores decisivos para o sucesso do controle da doença de Chagas.

Tais características foram revisadas por Silveira (2000) e servem para orientar as

operações de controle e explicar os quadros epidemiológicos nas diferentes regiões.

São elas: (1) capacidade de adaptação ao ambiente domiciliar: as espécies

estritamente domiciliares, tais como T. infestas no Brasil, são as principais

responsáveis pela transmissão da doença ao homem, uma vez que realizam repasto

sanguíneo constante neste hospedeiro; (2) antropofilia: apenas as espécies de

triatomíneos que se alimentam no homem seriam responsáveis pela transmissão da

doença; (3) infectividade e/ou tempo entre repasto e dejeção: nas áreas onde a taxa

Page 18: toma infestans Triatoma brasiliensis

18

de triatomíneos infectados é muito baixa, quase nula, é muito difícil ocorrer a

transmissão da doença ao homem. O tempo entre o repasto sanguíneo e a dejeção

também é importante para a transmissão da doença, uma vez que as fezes com os

parasitas devem ter contato com o hospedeiro, assim, aquelas espécies que

defecam quase imediatamente ao repasto seriam as mais importantes na

transmissão; (4) área de origem das espécies: os triatomíneos podem ser

considerados como nativos ou introduzidos. As espécies nativas são aquelas

autóctones daquele ecossistema natural e podem reinvadir e/ou recolonizar as

residências que sofreram tratamento com inseticidas. As espécies introduzidas são,

ao contrário, estranhas àquele ambiente silvestre e estão naquela área devido ao

transporte passivo. Estas são passíveis de eliminação, uma vez que as populações,

por não estarem no ambiente silvestre, não serão capazes de reinfestar as moradias

tratadas com inseticidas.

O uso de inseticidas residuais no combate a triatomíneos foi demonstrado

pela primeira vez no final da década de 40 (Dias e Pellegrino, 1948) com a utilização

do inseticida organoclorado hexaclorobenzeno (HCH ou BHC). A partir da

disponibilidade técnica deste produto, foi possível elaborar programas de controle

em larga escala. Os resultados destas atividades se mostraram excelentes, tendo-se

obtido com este produto a interrupção da transmissão vetorial da doença de Chagas

em amplas áreas. Em meados da década de 80 o uso agrícola do BHC foi proibido,

devido a sua grande toxicidade ao meio ambiente, inviabilizando sua produção para

fins comerciais. Felizmente, neste momento, a eficácia de vários piretróides havia

sido comprovada no combate aos triatomíneos, e estes inseticidas passaram a ser

utilizados na rotina do PCDCH (Diotaiuti et al., 1994; Dias, 2002).

Os primeiros países a se declararem livres da transmissão vetorial foram o

Uruguai e o Chile em 1997 e 1999, respectivamente (WHO, 2002). Em 9 de Junho

de 2006 o Brasil foi formalmente declarado ser livre da transmissão vetorial,

promovida pelo T. infestans, e da transmissão transfusional da doença de Chagas

(Schofield et al., 2006). Com o controle do T. infestans, outras espécies de

triatomíneos consideradas até então de importância secundária na transmissão do

T. cruzi passaram a ganhar maior atenção (Costa et al., 2003; Dias et al., 2002),

principalmente aquelas espécies nativas que ocupam predominantemente o

peridomicílio, dificultando o seu controle (Noireau et al., 2005).

O Triatoma brasiliensis é a espécie autóctone de triatomíneo mais

importante no Nordeste do Brasil, sendo encontrada principalmente na região do

Page 19: toma infestans Triatoma brasiliensis

19

semi-árido (Dias et al., 2000; Silveira e Vinhaes, 1999). Este triatomíneo é nativo

desta região do país, sendo seu controle complicado (Diotaiuti et al., 2000), uma vez

que populações silvestres invadem constantemente as residências próximas que

foram tratadas com inseticidas (Diotaiuti et al., 2000).

Os dados atuais sobre a incidência da doença de Chagas são muito

animadores. Ao longo de pouco mais de 15 anos foi conseguida a redução da

prevalência da doença nas Américas, de aproximadamente 18 milhões para atuais 9

milhões de infectados (Schofield et al., 2006). Outra grande conquista foi a redução

da área de ocorrência do T. infestans no Brasil a focos restritos na Bahia e Rio

Grande do Sul.

Apesar das medidas de controle terem sido baseadas nas características

biológicas e ecológicas do T. infestans, uma espécie bem adaptada ao ambiente

domiciliar, espécies autóctones que apresentam comportamento ubiquista exigem

estratégias de controle adaptadas a diferentes condições, uma vez que estes

vetores podem reinfestar as moradias a partir de populações silvestres.

Outra preocupação no combate aos triatomíneos refere-se ao

desenvolvimento de resistência a inseticidas, uma vez que foram descritas mais de

500 espécies de insetos e ácaros com resistência a uma ou mais classes de

inseticida (Feyereisen, 1995; Brogdon e McAllister, 1998).

Poucos estudos sobre resistência a inseticidas foram realizados com

triatomíneos. A primeira evidência de resistência a inseticida nestes insetos foi

relatada na Venezuela, na década de 70, em áreas de ocorrência de Rhodnius

prolixus tratadas seguidamente com dieldrin (Rocha e Silva, 1979). Apesar deste

trabalho pioneiro, os primeiros resultados de resistência aos inseticidas piretróides,

que são utilizados no controle destes insetos, foram obtidos pelo Centro de

Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CIPEIN), em Buenos Aires, na década de

1990 (Vassena et al., 2000). Neste trabalho foram estudados R. prolixus oriundos da

Venezuela e T. infestans do Brasil, especificamente do Estado do Rio Grande do

Sul. Os autores encontraram valores de razão de resistência (RR) que

caracterizaram as populações como possuindo resistência inicial. Com a realização

destes estudos aumentou ainda mais o interesse de investigar a ocorrência de

resistência a piretróides em triatomíneos, especificamente em T. infestans.

Atualmente a resistência a inseticidas em T. infestans é encontrada na

Argentina e na Bolívia (Zerba e Picollo, 2007). No primeiro país os T. infestans

resistentes são encontrados principalmente na Província de Salta, e no segundo

Page 20: toma infestans Triatoma brasiliensis

20

país, nos Departamentos de Potosí, Chuquisaca, Cochabamba e Tarija, e uma vez

que não são avaliadas populações de T. infestans, e outras espécies, em outros

países, existe a necessidade de estudos complementares que possam melhor definir

a freqüência com que a resistência a piretróides ocorre em diferentes regiões e

espécies de triatomíneos. Recentemente, Pessoa et al. (2007) avaliaram populações

de Triatoma sordida de Minas Gerais, encontrando valores para algumas amostras

que a caracterizaram como possuindo resistência inicial ao piretróide deltametrina.

Com esse estudo, ficou ainda mais evidente que o uso prolongado desta classe de

inseticidas (piretróides) no controle de triatomíneos no Brasil (mais de 20 anos),

pode ter selecionado populações com resistência ou suscetibilidade alterada a estes

inseticidas. A ampliação da área de ocorrência destas populações pode

comprometer severamente o sucesso do PCDCh.

Nosso trabalho pretende analisar estas possibilidades, através de dupla

abordagem, qual seja o estudo da resistência de duas espécies de triatomíneos de

importância epidemiológica na epidemiologia da doença de Chagas no Brasil, o

Triatoma infestans e o Triatoma brasiliensis, e avaliação, em paralelo, da

variabilidade genética das mesmas populações utilizando um fragmento do gene

mitocondrial cytB e 10 loci de microssatélites.

Page 21: toma infestans Triatoma brasiliensis

21

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Estudar a resistência de Triatoma infestans e Triatoma brasiliensis ao

piretróide deltametrina e avaliar a variabilidade genética destas populações.

2.2 Específicos

Avaliar amostras de T. infestans do Rio Grande do Sul, Minas Gerais e

Goiás quanto à resistência e/ou suscetibilidade ao piretróide deltametrina;

Avaliar amostras de T. brasiliensis do Ceará quanto à resistência e/ou

suscetibilidade ao piretróide deltametrina;

Aprimorar a técnica de monitoramento da resistência e/ou suscetibilidade de

triatomíneos a inseticidas;

Estudar a variabilidade genética das amostras de T. infestans através de

análises de um fragmento do gene mitocondrial cytB e 10 loci de microssatélites;

Estudar a variabilidade genética das amostras de T. brasiliensis através de

análises de um fragmento do gene mitocondrial cytB;

Tentar correlacionar a variabilidade genética das amostras de T. infestans e

T. brasiliensis com a resistência e/ou suscetibilidade ao piretróide deltametrina;

Determinar marcadores moleculares exclusivos para T. infestans obtidos em

países vizinhos ao Brasil (Argentina e Bolívia), que são conhecidamente resistentes

ao piretróide deltametrina.

Page 22: toma infestans Triatoma brasiliensis

22

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Doença de Chagas

A doença de Chagas é uma zoonose endêmica na América Latina, causada

pelo protozoário flagelado T. cruzi, que é transmitido ao homem através das fezes

dos hemípteros triatomíneos infectados (WHO, 2002). A doença apresenta uma

diversidade de sinais e sintomas os quais foram agrupados em duas fases: aguda e

crônica (Massad, 2008). No início da fase crônica a doença se apresenta

assintomática com sorologia positiva e nenhuma evidência clínica do envolvimento

de órgãos. Este período é conhecido como forma crônica indeterminada, e seu

tempo de duração não é fixo, podendo variar de 10 a 30 anos (Punukollu et al.,

2007).

A fase aguda da doença pode ser caracterizada por febre e taquicardia,

mialgia, dor muscular, transpiração, hepatomegalia, esplenomegalia (Punukollu et

al., 2007), edema orbital unilateral, linfangite e aumento de ganglio satélite, os quais

são conhecidos como sinal de Romaña, um eletrocardiograma pode apresentar

alterações na repolarização ventricular, isquemia subepicardica e bloqueio

atrioventricular de primeiro grau (Massad, 2008).

Na fase crônica da doença de Chagas, além da forma crônica

indeterminada, pode-se distinguir outras duas formas clínicas: doença crônica do

coração e forma digestiva da doença (revistas por Teixeira, 2007). A cardiomiopatia

é a manifestação mais comum da doença e é caracterizada por arritmias cardíacas e

tromboembolismo venoso e arterial. Incompetência valvular também é uma das

manifestações cardíacas, e é causada pela dilatação cardíaca que pode também

evoluir para aneurisma apical.

Na forma digestiva da doença ocorre uma dificuldade progressiva na

deglutição, podendo chegar a uma constipação crônica (Massad, 2008). Essas

alterações ocorridas no tubo digestivo são devidas a perda de coordenação e

alteração do controle da mobilidade das paredes da víscera. Tais alterações são

resultado dos danos sobre as fibras musculares lisas da parede do tubo digestivo,

como consequencia de lesões dos neurônios parassimpáticos intramurais (Teixeira,

2007).

Com todas estas alterações fisiológicas e morfológicas dos tecidos do

coração e tubo digestivo, os pacientes chagásicos desenvolvem incapacidade

progressiva. Estudos realizados em 1993 comparando os “Anos de Vida Ajustados à

Page 23: toma infestans Triatoma brasiliensis

23

Incapacidade” (AVAI, que seriam os anos perdidos devido à incapacidade), entre

várias doenças foi observado que a doença de Chagas só era superada pela soma

das doenças respiratórias, diarréia e AIDS, e que estava à frente de outras doenças

parasitárias, tais como malária, esquitossomose e leishmanioses (World Bank, 1993

apud Silveira, 2002).

3.1.1 Epidemiologia

Com a Iniciativa dos Países do Cone Sul, que, entre outras coisas, priorizou

as áreas de ocorrência do T. infestans, a doença de Chagas apresentou uma

redução significativa em sua incidência: ao longo de pouco mais de 15 anos foi

conseguida a redução da prevalência da doença de aproximadamente 18 milhões

para atuais 9 milhões (Schofield et al., 2006). Outras conquistas foram o aumento do

monitoramento da infecção por T. cruzi no sangue de doadores, que atualmente está

sendo realizado na maioria dos países das Américas, e a marcada redução da

infestação dos triatomíneos domésticos, não apenas do T. infestans, levando à

consequente interrupção da transmissão vetorial da doença em amplas áreas.

3.2 Trypanosoma cruzi

O T. cruzi é um protozoário pertencente à ordem Kinetoplastida, família

Trypanosomatidae com uma enorme diversidade molecular, que é capaz de

parasitar diversas células nucleadas de mamífero. Apesar do ciclo do T. cruzi já

estar elucidado a quase um século (Chagas, 1909), estudos de biologia celular e

molecular têm demonstrado detalhes não observados anteriormente (Burleigh e

Andrews, 1995).

No sangue de mamíferos infectados por T. cruzi existem as formas

tripomastigotas (figura 1a). Quando o triatomíneo se alimenta nesse mamífero, ele

ingere essas células que vão parar no seu intestino médio. Neste ponto as formas

tripomastigotas se transformam em formas epimastigotas (figura 1b), que são

replicantes, e migram para o intestino posterior (Tyler e Engman, 2001).

Page 24: toma infestans Triatoma brasiliensis

24

a) b) c)

Figura 1: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. a) tripomastigota em lâmina de sangue;

b) epimastigota em meio de cultura e c) amastigotas no interior de célula muscular. Fonte: WHO/TDR

(www.who.int/tdr - acessado dia 15/04/2009).

As formas epimastigotas se ligam à parede do intestino do triatomíneos para

se diferenciar em formas tripomastigotas metacíclicas. Este processo é denominado

metaciclogênese, e uma vez formadas, as formas metacíclicas se destacam da

parede do intestino e são excretadas juntamente com as fezes. Estas fezes

contaminadas quando entram em contato com a pele ou mucosas de um novo

mamífero permitem a entrada do T. cruzi neste hospedeiro, sendo iniciada a

infecção pela invasão das formas tripomastigotas nas células fagocíticas no local de

entrada (Teixeira e Hecht, 2007). Dentro destas células, as formas tripomastigotas

se diferenciam em formas amastigotas (figura 1c), multiplicam-se, e podem se

diferenciar em formas tripomastigotas novamente, estourar a célula e invadir novas

células do mamífero, ou serem ingeridas, quando no sangue, por um novo

triatomíneo, ao realizar repasto sanguíneo, onde iniciará novamento todo o ciclo.

Em todos os momentos do ciclo de vida do T. cruzi ocorrem interações entre

moléculas de superfície do parasito com moléculas do tubo digestivo (quando no

triatomíneo) e moléculas das células invadidas (quando no mamífero). Estas

moléculas e suas funções foram revistas amplamente (Burleigh e Andrews, 1995;

Tyler e Engman, 2001). Aparentemente quase todas as espécies de triatomíneos

são capazes de transmitir o T. cruzi, entretanto a implicação da espécie na

epidemiologia da doença de Chagas vai depender grandemente de sua ecologia e

distribuição geográfica (Schofield, 1994).

3.3 Biologia de triatomíneos

Os triatomíneos são insetos hemimetábolos pertencentes à ordem

Hemiptera, sub-ordem Triatominae, que apresentam cinco estádios imaturos de

desenvolvimento após a eclosão do ovo (Diotaiuti, 2007). Diferentemente dos

Page 25: toma infestans Triatoma brasiliensis

25

culicídeos e flebotomíneos, todos os estádios de desenvolvimento dos triatomíneos

(ninfas de I a V e adulto), e ambos os sexos, são hematófagos exclusivos, e

necessitam de pelo menos um repasto sanguíneo para desencadear a ecdise nos

estádios imaturos (Lent e Wygodzinsky, 1979; Schofield, 1994; Diotaiuti, 2007).

Este grupo de insetos é distribuído amplamente (Lent e Wygodzinsky, 1979),

sendo encontrado nos mais variados ecosistemas, principalmente nas Américas.

Atualmente são reconhecidas 140 espécies pertencentes a 18 gêneros de 6 tribos

(Galvão, 2007; Patterson et al., 2008). Apesar dessa grande diversidade de

espécies, os triatomíneos mais importantes na epidemiologia da doença de Chagas

são as espécies T. infestans, T. brasiliensis, Triatoma pseudomaculata, Triatoma

sordida, Triatoma dimidiata, Panstrongylus megystus e Rhodnius prolixus (figura 2)

(WHO, 2002).

Figura 2: Principais triatomíneos de importância epidemiológica na doença de Chagas nas

Américas: a) Triatoma infestans, b) Triatoma brasiliensis, c) Triatoma sordida, d) Triatoma

pseudomaculata, e) Triatoma dimidiata, f) Panstrongylus megystus e g) Rhodnius prolixus. Fonte:

Msc. Angélica de Oliveira (CPqRR/FIOCRUZ).

3.4 Triatoma infestans

T. infestans é encontrado quase exclusivamente em ambientes domésticos e

peridomésticos, se abrigando em buracos e fendas das moradias humanas e locais

de criação de animais (Forattini, 1980). Acreditava-se que esta espécie só era

encontrada em ambiente silvestre nos vales andinos de Cochabamba e Sucre, na

Bolívia (Bermúdez et al., 1993). Entretanto, mais recentemente focos de T. infestans

Page 26: toma infestans Triatoma brasiliensis

26

silvestres foram encontrados em Caracato (Departamento de La Paz), Cotapachi

(Departamento de Cochabamba) e Urilica (Departamento de Potosí), todos estes a

uma altitude acima de 2.500 m (Rojas Cortez et al., 2007). Outro foco silvestre

também foi observado a uma altitude mediana (1.750 m) em Mataral (Cochabamba)

(Noireau et al., 2005). Estes insetos foram encontrados em associação a pequenos

roedores e marsupiais, em afloramentos rochosos. Em Cotapachi, vale baixo de

Cochabamba, zona endêmica da doença de Chagas, é conhecido um ciclo ativo de

transmissão silvestre de T. cruzi sustentado basicamente por pequenos mamíferos

silvestres (Cortez et al., 2006), onde nas épocas chuvosas, quando as populações

destes pequenos animais silvestres estão maiores, novas colônias de triatomíneos

se desenvolvem.

Também na província de Santa Cruz (Bolívia) exemplares de T. infestans

foram capturados em ninhos de papagaios (Myiopsitta monachus), em bromélias e

principalmente ocos de árvores (Noireau et al., 1997; Noireau et al., 2000). Estes

espécimes se diferenciavam de outras populações de T. infestans por sua coloração

negra ou muito escura. Devido a estas características cromáticas, estes insetos

foram denominados “dark morph”. Outra característica destes insetos é possuir um

habitat arbóreo, diferentemente dos T. infestans andinos. Recentemente T. infestans

“dark morph” foram coletados ao norte do Paraguai e na Província do Chaco na

Argentina (Rojas Cortez et al., 2007). Estes trabalhos sugerem que a população

“dark morph” não se restringe ao Chaco boliviano, mas estaria presente em todo o

Grande Chaco, o qual abrange partes da Bolívia, Paraguai, Brasil e Argentina, sendo

caracterizado por bosques e savanas. Apesar desta grande distribuição de T.

infestans “dark morph”, estes nunca foram observados colonizando casas.

3.4.1 Variabilidade genética de Triatoma infestans

Segundo Schofield (1988 apud Giordano et al., 2005), T. infestans tem sua

origem geográfica e epicentro de distribuição no Vale de Cochabamba (Bolívia).

Essa dedução se deu principalmente devido ao conhecimento, até a década de

1990, de focos silvestres desta espécie apenas nessa região (Bermudez et al., 1993;

Panzera et al., 2007a). Recentemente Dujardin et al. (1998) estudou T. infestans

proveniente de Chuquisaca (Bolívia), comparando-os com outros espécimes

provenientes de regiões andinas e não-andinas, através de marcadores

isoenzimáticos, e determinaram que o centro de origem e dispersão desta espécie

está em Chuquisaca, também na Bolívia. Este mesmo resultado foi observado por

Page 27: toma infestans Triatoma brasiliensis

27

Giordano et al. (2005) utilizando seqüências do gene mitocondrial cytB. Estes

estudos determinaram estas origens de distribuição comparando a variabilidade

genética das populações estudadas, uma vez que as populações mais antigas são

as que apresentam os maiores índices de variabilidade (Schofield & Dias, 1999).

Apesar dos diferentes resultados entre estes trabalhos, não resta dúvida de que T.

infestans é originário da Bolívia.

Após a adaptação do T. infestans ao ambiente doméstico, que está estimado

que tenha ocorrido há 3.500 anos (Schofield, 1988 apud Panzera et al., 2007b), o

principal mecanismo de dispersão desta espécie de triatomíneo, que o permitiu

ampliar tanto a sua área de dispersão, se deu através das migrações humanas, uma

vez que sua capacidade de vôo é reduzida (Schofield, 1994; Dujardin et al., 1998).

Reconstruções históricas sobre a dispersão do homem indicam que T. infestans

doméstico se dispersou nos últimos dois ou três séculos, partindo do sul da Bolívia

até o resto de sua área de distribuição (Panzera et al., 2007b).

A dispersão de T. infestans da Bolívia para o restante do Cone Sul resultou

em grandes mudanças genéticas, principalmente evidenciadas pela perda de DNA

dos espécimes não-andinos (Panzera et al., 2004). Neste trabalho os autores

observaram mais de 35% de perda de DNA, principalmente material

heterocromático, nas populações não-andinas. Variações nos padrões de

bandeamento C também foram observadas entre exemplares de T. infestans: os

espécimes da região andina apresentam maior número de bandas C que os da

região não-andina. Devido a estas grandes diferenças genéticas, T. infestans pode

ser agrupado em dois grandes grupos alopátricos, andino e não-andino (Bargues et

al., 2006; Panzera et al., 2004). A existência de populações geneticamente distintas

pode indicar variações também no seu comportamento, capacidade de dispersão e

capacidade vetorial.

Estudos procurando determinar a magnitude de diferenças genéticas entre

T. infestans da Bolívia e Argentina foram realizados, empregando análises de

sensilas antenais e sequências do gene mitocondrial cytB (Catalá & Dujardin, 2001;

Catalá et al., 2007). Nestes estudos foram observadas diferenças no número e tipo

de sensilas entre as amostras, e não foi observado nenhum haplotipo, do gene cytB,

em comum em ambos os países. Na Argentina também foram observados

haplótipos exclusivos para as regiões andinas e não-andinas dentro do país, apesar

de também terem sido observados alguns haplótipos em comum.

Page 28: toma infestans Triatoma brasiliensis

28

Entre as populações de T. infestans bolivianas e brasileiras também são

observadas grandes diferenças. Como descrito por Panzera et al. (2004) as

populações do Brasil apresentam menos DNA e bandas C que as populações da

Bolívia. Em estudos utilizando marcadores isoenzimáticos (Dujardin et al., 1998;

Schofield et al., 1999) também foi observada uma maior variabilidade genética nos

insetos provenientes da Bolívia. Também foram observadas variações morfológicas

nos órgãos sexuais masculinos entre insetos destes países (Pires et al., 1998), mas

que aparentemente não ocasionavam isolamento reprodutivo entre os espécimes.

Os estudos de variações apresentadas por sequências de genes nucleares

(Bargues et al., 2006) e mitocondriais (Garcia et al., 2003) entre amostras de T.

infestans da região não-andina demonstram uma maior variabilidade genética nas

amostras oriundas no norte da Argentina, comparada com amostras do Brasil,

Paraguai e Uruguai. Estes resultados indicam a ocorrência de uma segunda

expansão populacional de T. infestans, tendo o norte da Argentina como centro de

dispersão (Panzera et al., 2007).

Com todos estes estudos sobre a variabilidade genética de T. infestans,

empregando os mais diversos marcadores moleculares e fenotípicos (Garcia et al.,

2003; Monteiro et al., 1999; Pérez de Rosas et al., 2007; Pérez de Rosas et al.,

2008; Schachter-Broide et al., 2004), fica claro, hoje, que T. infestans apresenta de

baixos a moderados índices de variabilidade genética intra-populacional e de

moderada a grande diferenciação genética inter-populacional. Talvez este perfil seja

fruto da grande dispersão desta espécie na América Latina, por regiões de

diferentes características ambientais e também das constantes intervenções dos

programas de controle, através da aplicação de inseticidas, que promovem seleção

das populações desta espécie, com a conseqüente redução da variabilidade

genética local.

3.5 Triatoma brasiliensis

O T. brasiliensis é encontrado principalmente na região do semi-árido do

Nordeste do Brasil (Dias et al., 2000; Silveira e Vinhaes, 1999), se estendendo até o

norte de Minas Gerais (Schofield, 1994). Nesta área de distribuição este triatomíneo

é observado nos ambientes doméstico e silvestre, sendo que no último é encontrado

principalmente associado a tocas de roedores, entre pedras, onde se alimentam e

procriam (Forattini et al., 1981; Diotaiuti et al., 2000; Diotaiuti, 2007).

Page 29: toma infestans Triatoma brasiliensis

29

Segundo Dias et al. (2000), o Nordeste brasileiro apresentou três cenários

históricos em relação à ocorrência de triatomíneos: (1) até a década de 1950, os

autores acreditam que a transmissão da doença de Chagas ocorreu principalmente

por meio de P. megistus e T. brasiliensis; (2) Entre a década de 1950 e final da

década de 1980, T. infestans invadiu amplas áreas da região Nordeste onde passou

a ser a principal espécie responsável pela transmissão da doença; (3) a partir de

1990, T. infestans foi controlado, restando apenas focos residuais na Bahia. Outra

espécie de grande importância, o P. megistus, também teve sua densidade

reduzida. Assim, o T. brasiliensis se manteve (e se mantem) como principal vetor.

Outra espécie também do semiárido, o T. pseudomaculata, vem ampliando sua área

de ocorrência e se instalando nos ecótopos artificiais, passando a ser considerado

como outra espécie de grande importância epidemiológica na transmissão da

doença de Chagas no Brasil (Dias et al., 2000).

Por ser uma espécie nativa no Nordeste do Brasil e apresentar

comportamento ubiquista (podendo se adaptar a diferentes ambientes), o controle

do T. brasiliensis é difícil. Trabalhos realizados no Estado do Ceará demonstram que

a partir do quarto mês após tratamento das residências infestadas com inseticida de

ação residual, esta espécie de triatomíneo já pode ser encontrada, principalmente no

ambiente peridomiciliar (Diotaiuti et al., 2000; Oliveira Filho et al., 2000), devido a

sucessivas reinvasões a partir das populações silvestres da espécie. Uma vez que é

virtualmente impossível controlar estas populações silvestres, também fica

impossível evitar as constantes invasões (Diotaiuti et al., 2000).

3.5.1 Variabilidade genética de Triatoma brasiliensis

Poucos estudos foram realizados com o intuito de avaliar a variabilidade

genética de T. brasiliensis. Atualmente esta espécie é descrita como possuindo

quatro populações alopátricas com diferenças cromáticas, denominadas:

brasiliensis, melanica, macromelasoma e juazeiro (figura 3) (Costa e Felix, 2007).

Page 30: toma infestans Triatoma brasiliensis

30

a) b) c) d)

Figura 3: Formas cromáticas descritas para Triatoma brasiliensis. a) brasiliensis, b)

melanica, c) macromelasoma e d) juazeiro. Fonte: Instituto Oswaldo Cruz (www.fiocruz.br/ioc -

acessado dia 15/04/2009).

Estudos anteriores utilizando marcadores isoenzimáticos (Costa et al., 1997)

demonstraram moderada variabilidade genética de amostras pertencentes às quatro

formas cromáticas de T. brasiliensis, obtidas nos Estados do Rio Grande do Norte

(brasiliensis), Pernambuco (macromelasoma), Bahia (juazeiro) e Minas Gerais

(melanica). Neste estudo foram observados valores de distância genética variando

de 0,295 a 1,128, o que demonstra moderadas a grandes distâncias. Apesar destes

resultados, os autores não calcularam índices de endocruzamento (ex. FST), que são

os melhores parâmetros para avaliar diferenciação genética entre populações, por

permitirem uma comparação objetiva do efeito total da subdivisão da população sem

entrar em detalhes acerca das frequências alélicas ou heterozigosidades

observadas, entre outras coisas (Hartl e Clark, 1997).

Posteriormente, Costa (2000) aprofundou as análises nas mesmas amostras

avaliadas anteriormente (Costa et al., 1997), e mais quatro novas amostras

coletadas na Bahia, avaliando morfometria dos genitais externos dos machos,

microscopia eletrônica de varredura dos ovos, cruzamentos entre os diferentes

padrões cromáticos e análise de marcadores isoenzimáticos. Neste estudo foram

observadas diferenças significativas entre os padrões cromáticos, nas análises de

morfometria e microscopia eletrônica. Através das análises de isoenzimas, foi

observada baixa variabilidade genética intrapopulacional, e moderada diferenciação

genética interpopulacional, sendo a forma melanica (Minas Gerais) a mais distinta

dentre as demais. Nos cruzamentos para a F1 não foi observada incompatibilidade

genética (Costa, 2000), porém nos cruzamentos da F2 foi observada alta

porcentagem de ovos estéreis, período de desenvolvimento maior e alta taxa de

mortalidade em ninfas de quinto estádio, nos cruzamentos entre machos do padrão

brasiliensis com fêmeas do padrão melanica (Costa, 1999).

Page 31: toma infestans Triatoma brasiliensis

31

Na tentativa de esclarecer ainda mais estas diferenças genéticas entre os

padrões cromáticos de T. brasiliensis, Panzera et al. (2000) estudaram as variações

cromossômicas apresentadas por amostras dos quatro padrões, obtidos nos

Estados do Ceará, Piauí, Pernambuco (município de Terra Nova), Rio Grande do

Norte (todos do padrão brasiliensis), Pernambuco (município de Petrolina, padrão

macromelasoma), Bahia (padrão juazeiro) e Minas Gerais (padrão melanica).

Contrariamente ao descrito anteriormente, não foram observadas diferenças

citogenéticas entre as amostras, com todos os padrões apresentando um número

diploide 2n = 20A + XY, XX. Também nos padrões de bandas C não foram

observadas diferenças significativas, e estas análises evidenciaram uma variação de

heterocromatina nos autossomos de 25 a 32 %.

Estudos utilizando sequências do gene mitocondrial cytB também foram

empregados nas análises de populações de T. brasiliensis dos quatro padrões

cromáticos (Monteiro et al., 1999; Monteiro et al., 2004). Foram observados baixos

valores de variabilidade genética intrapopulacional, com variando de 0,0044 a

0,0096. Talvez esta baixa variabilidade genética seja fruto do baixo número amostral

de algumas amostras. Nestes mesmos trabalhos foram observadas de moderadas a

grandes distâncias genéticas, porém as amostras pertencentes aos padrões

brasiliensis e macromelasoma apresentaram haplótipos em comum, além de

indivíduos coletados em campo com características aparentemente intermediárias

entre as duas formas, no Estado de Pernambuco. Este achado sugere a existência

de híbridos naturais no campo, com a conseqüente ausência de isolamento

reprodutivo entre eles.

Marcadores RAPD foram utilizados na análise de amostras dos Estados do

Piauí e Ceará (Borges et al., 2000a; Borges et al., 2000b; Borges et al., 2005). Com

uso destes marcadores foi possível observar pouca variabilidade genética nas

amostras estudadas, e moderada diferenciação genética entre as amostras dos dois

Estados. Recentemente, os marcadores RAPD se mostraram eficientes na

identificação e diferenciação de T. brasiliensis obtidos nos ambientes domésticos e

silvestres (Borges et al., 2005).

3.6 Controle da doença de Chagas

A estratégia para controle da doença de Chagas consiste basicamente na

interrupção da transmissão vetorial, pelo combate aos triatomíneos domésticos, e

Page 32: toma infestans Triatoma brasiliensis

32

maior controle nos bancos de sangue, através de monitoramento da infecção por T.

cruzi (revisto por Massad, 2008).

O combate aos triatomíneos encontrados em ambiente doméstico é

realizado com a aplicação de inseticidas de ação residual. Atualmente são utilizados

inseticidas do grupo dos piretróides, mas anteriormente eram utilizados inseticidas

clorados (ex. BHC e dieldrin) e fosforados (ex. fenitrotion) (Rocha e Silva, 1979).

Essas atividades, voltadas ao controle dos triatomíneos, tiveram início, no Brasil, por

volta dos anos 1950 pelo então Serviço Nacional de Malária. A partir de 1975 essas

atividades se tornam programa de controle nacional (Vinhaes e Dias, 2000), porém

só alcançaram toda a área endêmica entre 1983 e 1986.

Em 1986, com o surgimento de epidemias de dengue, o PCDCH sofreu

reduções de suas atividades, sendo, porém, mantidas as atividades de borrifação

das residências infestadas em amplas áreas do país (Vinhaes e Dias, 2000).

Em 1991, os países da América Latina, endêmicos para a doença de

Chagas, decidiram juntar esforços contra a doença, firmando uma cooperação

internacional denominada Iniciativa dos Países do Cone Sul, envolvendo Argentina,

Brasil, Bolívia, Chile, Paraguai e Uruguai (WHO, 2002). Com isso o PCDCH passou

a priorizar áreas de ocorrência do T. infestans, e a vigilância epidemiológica teve sua

instalação ampliada para as áreas já sob controle da transmissão vetorial (Dias et

al., 2002; WHO, 2002).

Após mais de 30 anos de ação do PCDCH, mudanças operacionais para o

controle da doença de Chagas foram propostas (Dias, 2007):

- Introduzir o conceito de eliminação da transmissão para as áreas ou sub-

regiões com nenhuma ou mínima infestação e soroepidemiologia negativa em

crianças;

- Dar atenção e melhorar o monitoramento da tolerância dos triatomíneos

aos inseticidas, prevenindo possíveis situações de resistência;

- Dar atenção aos triatomíneos considerados de importância secundária,

principalmente no Brasil;

- Melhorar a qualidade e sensibilidade na detecção de triatomíneos nas

situações de baixa densidade populacional;

- Melhorar as estratégias e ferramentas para o controle dos triatomíneos em

ambientes peridomésticos;

Page 33: toma infestans Triatoma brasiliensis

33

- Desenvolver e melhorar as atividades de educação em saúde, tendo o

objetivo de ter participação da comunidade permanentemente nas situações de

vigilância epidemiológica;

- Aceitar o resultado de apenas uma técnica sorológica para o

monitoramento de bancos de sangue, desde que o laboratório responsável seja

considerado como serviço de referência e seja equipado com o maior padrão de

qualidade;

- Estimular todos os países envolvidos a realizar monitoramento sorológico

de rotina em crianças de áreas tratadas, para medir o impacto das ações e mesmo

determinar e explorar focos de transmissão residuais;

- Criar um subprograma regular para tratamento específico de indivíduos

soropositivos de até 15 anos;

- Estimular a avaliação epidemiológica do risco de doença de Chagas

congênita em todos os países, e implementar um subprograma para gerência da

doença congênita;

- Dar total suporte ao projeto “The Benefit Trial” e a pesquisas em casos

crônicos correlacionados, procurando disponibilidade e possíveis benefícios do

tratamento específico, em longo prazo;

- Disseminar e estimular cursos regulares e qualificações técnicas.

3.7 Resistência de triatomíneos a inseticidas

A primeira evidência de resistência a inseticida nos triatomíneos foi

observada na Venezuela, na década de 70, em áreas de ocorrência de R. prolixus

tratadas seguidamente por dieldrin, inseticida organoclorado (Rocha e Silva, 1979).

Apesar deste trabalho, os primeiros resultados de resistência aos inseticidas

piretróides foram obtidos pelo Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas

(CIPEIN), de Bueno Aires na década de 1990 (Vassena et al., 2000). Neste trabalho

pioneiro foram estudados R. prolixus oriundos da Venezuela e T. infestans do Brasil,

do Estado do Rio Grande do Sul. Os autores encontraram valores de razão de

resistência (RR) que caracterizaram as populações como possuindo resistência

inicial. R. prolixus apresentou os maiores valores de resistência: RR = 12,4 para

cypermetrina e 11,4 para deltametrina, e T. infestans do Rio Grande do Sul

apresentou um valor menor (RR = 7,0 para deltametrina), apesar de ser considerado

como resistência inicial.

Page 34: toma infestans Triatoma brasiliensis

34

Em meados de 2002 o CIPEIN passou a receber exemplares de T. infestans

coletados nas proximidades do município Salvador Mazza, Província de Salta,

Argentina (Zerba e Picollo, 2007). Estes insetos foram submetidos à dose

discriminante (a dose DL99 da linhagem suscetível, a qual se espera matar 99% da

amostra) e os autores ficaram surpresos com a baixa mortalidade observada. Neste

trabalho, foram avaliadas quatro localidades, e os espécimes coletados em Salta

apresentaram os maiores valores para resistência (RR = 7,89) (Gonzáles Audino et

al., 2004).

A partir destes dados foram investigadas outras localidades da Província de

Salta: El Chorro, La Toma, El Sauzal e Salvador Mazza, onde o Serviço Nacional de

Chagas daquele país (Argentina) vinha advertindo falhas no controle de T. infestans

(Zerba e Picollo, 2007). Foram, então, estabelecidas as razões de resistência para

estas localidades (Picollo et al., 2005), e os dados se mostraram alarmantes, com as

RR variando de 99 (El Chorro) a 133,1 (Salvador Mazza). Para estas localidades

também foram avaliados outros inseticidas, e os resultados mostraram que a

resistência que inicialmente foi detectada para deltametrina cruzava com todos os

inseticidas piretróides utilizados no estudo (Betaciflutrina, Betacipermetrina,

Lambdacialitrina e Cispermetrina). Para outras classes de inseticidas, a resistência

não se manteve: Fenitrotion (organofosforado), Bendiocarb (carbamato) e Fipronil

(fenilpirazol) (Zerba e Picollo, 2007).

Após a observação da ocorrência de T. infestans resistentes a piretróides na

Argentina e sucessivas falhas de controle no campo, no norte da Argentina e Sul da

Bolívia (Vassena et al., 2007), foram investigadas amostras provenientes dos

Departamentos de Tarija (Yacuiba, El Palmar, Villamontes e Entre Rios), Chuquisaca

(Sucre-Rural) e Cochabamba (Mataral) (Orihuela et al., 2008), todos pertencentes à

Bolívia. Neste estudo, a aplicação de dose discriminante evidenciou que todas as

amostras eram resistentes. Na determinação das DL50 para Yacuiba, utilizando

quatro inseticidas diferentes (deltametrina, fenitrotion, fipronil e bendiocarbe) foi

observado que esta população só apresentou resistência ao piretróide testado

(deltametrina), com uma DL50 de 28,42 (ng/inseto) e RR de 154,4 (Vassena et al.,

2007).

Os resultados sobre resistência de T. infestans a piretróides demonstraram a

existência de uma área crítica, com elevados valores de RR, que abrange o norte da

Argentina e o Sul da Bolívia. Estas informações são, entretanto, consideradas

insuficientes para a delimitação da área de resistência para T. infestans, sendo

Page 35: toma infestans Triatoma brasiliensis

35

necessário avaliar outras áreas de ocorrência desta espécie, já que todos estes

trabalhos foram restritos à Argentina e Bolívia, e ampliar este tipo de estudo para

outras espécies de triatomíneos de importância epidemiológica na doença de

Chagas.

Com a necessidade de estudos sobre a resistencia a inseticidas em

triatomíneos do Brasil, o Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de

Chagas (LATEC/CPqRR/FIOCRUZ) estruturou um grupo para estudos desta

natureza. Com isso, recentemente Pessoa et al. (2007) estudando 14 amostras de

Triatoma sordida de Minas Gerais, através de bioensaios com deltametrina,

conseguiu observar valores de RR acima de 5 (RR>5) em cinco das amostras

estudadas. Segundo a OPAS (2005), os valores de RR superiores a 5 indicam

resistência inicial ao inseticida testado. Com estes resultados, o estudo da

resistencia a inseticidas em triatomíneos de outras áreas além das já descritas para

a Argentina e Bolívia se tornou ainda mais importante.

Esta necessidade se torna mais preocupante devido ao uso prolongado de

inseticidas piretróides no controle de triatomíneos no Brasil (há mais de 20 anos), o

que pode ter selecionado várias populações com resistência ou suscetibilidade

alterada a estes inseticidas. A ampliação da área de ocorrência destas possíveis

populações pode comprometer severamente o sucesso do PCDCh.

Page 36: toma infestans Triatoma brasiliensis

36

4 MÉTODOS

4.1 Triatomíneos estudados Os triatomíneos utilizados neste trabalho são mantidos no Laboratório de

Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas (LATEC) do Centro de

Pesquisas René Rachou (CPqRR/FIOCRUZ) sob condições de temperatura e

umidade controladas.

4.1.1 Triatoma infestans

Os exemplares de T. infestans do Brasil utilizados neste estudo foram

provenientes do Estado do Rio Grande do Sul (Sul do Brasil), Estado de Minas

Gerais (Sudeste do Brasil) e Estado de Goiás (Centro-Oeste do Brasil). Também

foram utilizados exemplares provenientes de Salvador Mazza (Provincia de Salta,

Argentina) e Yacuiba (Departamento de Tarija, Bolívia). As amostras do Rio Grande

do Sul foram obtidas com auxílio da Secretaria do Estado de Saúde do Rio Grande

do Sul (SES-RS). Estas amostras são oriundas dos municípios: Doutor Maurício

Cardoso, Guarani das Missões, Mato Queimado e Três de Maio (figura 4), os quais

estão presentes nas áreas dos últimos resíduos de T. infestans no Rio Grande do

Sul.

Figura 4: Mapa do Estado do Rio Grande do Sul evidenciando as localidades de obtenção

dos Triatoma infestans: 1 - Doutor Maurício Cardoso (27º30'21"S / 54º21'39"W), 2 - Três de Maio

(27º46'24"S / 54º14'24"W), 3 - Guarani das Missões (28º08'27"S / 54º33'29"W), e 4 - Mato Queimado

(28º15'21"S / 54º36'57"W). Fonte: Wikipedia (www.wikipedia.org – acessado dia 15/04/2009).

Page 37: toma infestans Triatoma brasiliensis

37

A SES-RS também nos enviou T. infestans provenientes dos municípios

Alegria, Augusto Pestana, Santo Cristo e Coronel Barros, porém destas amostras só

foi possível estabelecer colônia de Coronel Barros, e esta não se desenvolveu

adequadamente. Os insetos destes municípios não foram utilizados neste trabalho.

As colônias de T. infestans de Minas Gerais e Goiás se encontram mantidas

em laboratório sem contato com inseticida há mais de 10 gerações. A linhagem de

Minas Gerais é oriunda de Montes Claros e a linhagem de Goiás é oriunda do

município de Posse. Esta última foi cedida gentilmente pelo Dr. Alfredo Martins de

Oliveira Filho (UFRJ). Estas populações remanescentes de T. infestans de Minas

Gerais e Goiás já foram eliminadas no campo, e estes exemplares de laboratório

são considerados suscetíveis a inseticidas.

As amostras provenientes dos municípios Salvador Mazza (Salta) e Yacuiba

(Tarija) já estão caracterizadas como resistentes a piretróides e apresentam razões

de resistência (RR) de 133,1 (Salvador Mazza, Picollo et al., 2005) e 154,4 (Yacuiba,

Vassena et al., 2007). A amostra de Salvador Mazza foi cedida gentilmente pelo

CIPEIN, através do Dr. Eduardo Zerba, e estes insetos foram obtidos no campo em

meados de 2006. A amostra proveniente de Yacuiba foi avaliada nos ensaios

biológicos juntamente com as amostras do Rio Grande do Sul, Minas Gerais e Goiás

para servir como um controle positivo dos ensaios biológicos. Estes exemplares

foram obtidos no campo em meados de 2008, capturados por integrantes do LATEC.

4.1.2 Triatoma brasiliensis

As amostras de T. brasiliensis utilizadas neste estudo foram obtidas no

município de Tauá (figura 5), Estado do Ceará, com auxílio da Secretaria de Estado

de Saúde do Ceará (SES-CE). As amostras foram obtidas nas localidades

Cachoeira do Júlio, Cachoeira dos Pedrosas, Dormideira, Mutuca, Morada Nova do

Thomas e Milagres, em dois momentos: antes de borrifação das residências com

inseticida piretróide e um ano depois. Devido à eliminação de insetos em algumas

residências após a borrifação, não foi possível obter amostras dos mesmos locais

nos dois momentos de captura. Na primeira captura foram obtidos T. brasiliensis

apenas no ambiente intradomiciliar nas localidades: Cachoeira do Júlio, Cachoeira

dos Pedrosas, Dormideira e Mutuca. Na segunda captura foram obtidos insetos nos

ambientes peridomiciliar e silvestre nas localidades: Cachoeira dos Pedrosas (peri),

Dormideira (peri), Milagres (peri), Morada Nova do Thomas (peri), Mutuca (peri) e

Cachoeira dos Pedrosas (silvestre). A colônia de Milagres não foi utilizada nos

Page 38: toma infestans Triatoma brasiliensis

38

ensaios biológicos com deltametrina devido ao número reduzido de insetos, sendo

apenas utilizada nas análises de variabilidade genética.

Uma linhagem laboratorial de T. brasiliensis, proveniente de Crateús (CE),

mantida em insetário há mais de 10 gerações, sem contato com inseticidas, foi

utilizada como suscetível, para o cálculo das razões de resistência das amostras

estudadas.

Figura 5: Mapa do Estado do Ceará evidenciando o município de Tauá (em cinza). Fonte:

Wikipedia (www.wikipedia.org – acessado dia 15/04/2009).

4.2 Ensaios biológicos

4.2.1 Inseticida utilizado

Para o estudo de resistência a inseticida foi escolhido o piretróide

deltametrina (99,1 %, Bayer), uma vez que o PCDCh utiliza piretróides em suas

ações de controle do vetor em todo o país há mais de 30 anos (Dias et al., 2002), e

dentre os piretróides existentes, é o que reúne maior quantidade de informações

técnicas. Isso nos possibilita fazer comparações dos nossos resultados com a

literatura.

O inseticida originariamente em pó era diluído em acetona [PA] em

concentrações seriadas formando um gradiente variando na potência de 10. Após os

Page 39: toma infestans Triatoma brasiliensis

39

primeiros testes para cada localidade, e com os dados de mortalidade para essas

concentrações iniciais, eram criadas concentrações intermediárias do inseticida para

estabelecer uma curva de mortalidade onde se encontrasse valores variando de 0%

a 100%. Estas soluções eram mantidas a -20oC até o máximo de duas semanas,

sendo descartadas após este período e refeitas. Este procedimento tinha o objetivo

de eliminar erro nos ensaios devido à alteração das concentrações das soluções

promovida pela evaporação da acetona.

Antes da utilização das soluções nos ensaios as mesmas eram mantidas em

temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos ou até que sua temperatura

se igualasse com a do meio, evitando assim os danos causados pela baixa

temperatura das soluções aos triatomíneos testados.

4.2.2 Procedimentos no ensaio

O ensaio biológico consistia na aplicação de 0,5 L da solução de

deltametrina na região dorsal de ninfas de primeiro estádio com cinco dias de vida,

em jejum. A aplicação das soluções era realizada com auxílio de microseringa

Hamilton provida de dispensador de repetição (50 repetições). Este instrumento é

extremamente preciso no volume manuseado.

Nestes ensaios eram utilizadas pelo menos oito concentrações de

deltametrina que determinassem taxas de mortalidade variando de 0% a 100%. Para

cada concentração eram utilizadas 30 ninfas, assim o número total de ninfas

utilizadas era, pelo menos, 240 por linhagem (localidade) estudada.

Após a aplicação do inseticida, as ninfas tratadas eram mantidas em estufa

bacteriológica a uma temperatura de 24oC ( 2oC) com umidade de 75% ( 5%). A

mortalidade das ninfas era avaliada 72 horas após a aplicação do inseticida. Neste

momento as ninfas eram caracterizadas como normais (quando não apresentavam

nenhuma alteração de locomoção), intoxicadas (quando apresentavam leves

sintomas de desequilíbrio ao se locomover), ou nocauteadas (quando apresentavam

fortes sintomas de desequilíbrio ao se locomover ou não conseguiam se locomover).

No cálculo da dose letal 50 (DL50) as ninfas normais foram consideradas

como vivas, e as ninfas intoxicadas e nocauteadas foram agrupadas como mortas.

Este procedimento é necessário para a utilização do programa que calcula os

valores de doses letais (DL).

Page 40: toma infestans Triatoma brasiliensis

40

4.2.3 Avaliação da resistência

Os dados de mortalidade, obtidos nos ensaios biológicos, foram utilizados

em análise probit para o cálculo da dose letal 50 (DL50) para cada linhagem

(localidade). Foi utilizado o programa Probit Analisys (Raymond, 1985) nesta etapa

do trabalho. Nesta análise também foi possível definir o Slope das amostras, o qual

representa sua homogeneidade. Posteriormente os valores de DL50 foram

agrupados em planilhas, e a razão de resistência (RR) definida pela divisão dos

valores deste parâmetro entre as amostras de campo e as linhagens de laboratório

(Razão de Resistência RR = DLcampo / DLlaboratório).

4.3 Estudo da variabilidade genética de Triatoma infestans e Triatoma

brasiliensis

A variabilidade genética das amostras de T. infestans do Brasil, Argentina e

Bolívia foi avaliada por duas maneiras, através da análise de um fragmento de 448

nucleotídeos do gene mitocondrial cytB e análises de 10 loci de microssatélites. Já a

variabilidade genética das amostras de T. brasiliensis do município de Tauá (CE) foi

avaliada apenas através de sequências do gene cytB.

4.3.1 Extração de DNA e PCR

O DNA dos exemplares de T. infestans e T. brasiliensis estudados foi

extraído com o uso de STE [1X] (NaCl 0,01M; Tris-HCl 0,1M e EDTA 1M), baseado

nos procedimentos descritos por Balbino et al. (2006), com pequenas alterações.

Para isso, ninfas de primeiro estádio foram separadas individualmente em tubos de

1,5 mL e maceradas. Após isso eram acrescentados 50 L de STE [1X] e os tubos

eram mantidos em banho-maria a 90oC por 10min. Em seguida as amostras eram

centrifugadas a 13.000 rpm por 1min e o sobrenadante recolhido e diluído 2X em

água ultra pura (Gibco). Esta solução era então mantida a -20oC até o momento do

seu uso em PCR.

As reações de PCR foram específicas para cada marcador estudado. Para o

gene mitocondrial cytB, foi amplificada uma região de 448 nucleotídeos, com os

iniciadores CitBF (5’ - GGA CAA ATA TCA TGA GGA GCA ACA G - 3’) e CitBR (5’

ATT ACT CCT CCT AGC TTA TTA GGA ATT G - 3’) (Lyman et al., 1999),

correspondente em T. dimidiata ao fragmento do nucleotídeo 425 ao nucleotídeo

872 na sequência completa do gene. Este fragmento se posiciona na porção

próxima à extremidade 3’ do gene. A PCR teve um volume final de 25 L contendo

Page 41: toma infestans Triatoma brasiliensis

41

os seguintes reagentes: 1,5 unidades de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), 3 mM de

MgCl2, 200 M de cada dNTP, 10 mol de cada primer e 1 L da solução de DNA

(as amostras de DNA não foram quantificadas). A amplificação consistiu de um

passo inicial de desnaturação a 95 ºC por 5 min e 35 ciclos a 95 oC por 30 seg, 47 oC por 30 seg e 72 oC por 1 min, seguidos por um passo de extensão final a 72 ºC

por 5 min.

Para os microssatélites, foram utilizados dez pares de iniciadores, descritos

por Garcia et al. (2004) (tabela 1). Todos os iniciadores forward foram marcados com

fluoresceína na extremidade 5´. As reações foram feitas com volume final de 10 L

contendo os seguintes reagentes: 1 unidade de Taq DNA Polimerase (Invitrogen),

1,5 mM de MgCl2, 200 M de cada dNTP, 5 mol de cada iniciador e 1 L da solução

de DNA. O ciclo desta PCR consistiu de desnaturação inicial a 95 oC por 5 min e 30

ciclos a 95 oC por 20 seg, 55 oC por 30 seg e 72 oC por 40 seg, seguidos por uma

amplificação final a 72 oC por 5 min.

Tabela 1: Iniciadores utilizados para amplificação dos 10 loci de microssatelite em Triatoma

infestans.

Locus Sequência dos iniciadores

(5´- 3´) Repetição

Tamanho do menor fragmento possível

F: GGAAACTCATGTTATGGACACG TiA02

R: AAACCTTATTGTTAGTTCGTTTTGG (GT)nG(GT)nAT(GT)n 169 pb

F:CTCTGGGGATCATCGTTCTG TiC02

R: TTTAGGATTCATACCGCCTTT (GT)n 141 pb

F: TTACTGCCACATTGCGTCAT TiC08

R: TCGTGATTGCAAGGAGGAAT (GT)nATGTATT(GT)n 181 pb

F: TTTGCCACATTTACCATTTCC TiC09

R: TCAAGAGAAGCCGTCCAACT (GT)n 123 pb

F: TGGACATAAGCCCCCTGTAA TiD09

R: GGATCCTACTGTGCGGATGT (GT)n(ATGT)n 174 pb

F: AGCACGGTTTGCAACTTTTC TiE02

R: TGTGGAATTGAAGGAGCACA (GT)nCTGCCT(GTGC)n 119 pb

F: CCTTTAATTTCCCTTTGCCATC TiE12

R: CCTACACGAAATGCCCAAGT (GT)nGGGA(GT)n 269 pb

F: AAAATGGCGGACAAACATTC TiF03

R: TTCCTCAACACAAACACAAACC (GT)n 148 pb

F: TCAATAAAACGAAAATGCGACTT TiF11

R: GCGGGATCTAAGCCAACAGT (GT)n 176 pb

F: CGGAAATGCAAAATTTTTTAGGCG TiG03

R: ATTCTGATCGTGGCAATTTT (TA)nCATAT(GT)nGC(GT)nAT(GT)n 190 pb

Nota: Estes loci foram identificados e caracterizados por Garcia et al. (2004).

Page 42: toma infestans Triatoma brasiliensis

42

4.3.2 Sequenciamento e genotipagem

O tratamento posterior à PCR foi diferente para cada marcador. Os produtos

de PCR do cytB foram separados em gel de agarose 1%, corado com brometo de

etídio 10% e visualizados em transiluminador UV. As bandas referentes ao

fragmento estudado (~450 pb) eram então cortadas do gel e colocadas em tubos de

1,5 mL. A purificação do DNA contido nas bandas foi realizada através do kit

QIAquick Gel Extraction (QIAgen), seguindo as recomendações do fabricante. Em

seguida o DNA puro foi utilizado em PCR de sequenciamento.

Na PCR de sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET DYE Terminator

(Amersham) e os iniciadores CitBFint (5´ - ATT GCC GCA TTA ACA ATA ATT CAT

C – 3´) e CitBRint (5´ - GTA ATT GAT ACT CCT ATT AAG TC – 3´) que são

direcionados a regiões mais internas do fragmento amplificado. A utilização de

iniciadores mais internos teve o objetivo de promover o sequenciamento, com boa

qualidade, das pontas do fragmento estudado. Estes iniciadores foram desenhados

com base no alinhamento de seqüências deste gene de vários insetos, incluindo os

triatomíneos. Os produtos destas PCRs foram seqüenciados duas vezes para cada

iniciador, em seqüenciador MegaBACE500, e as seqüências produzidas avaliadas

quanto à qualidade e montadas através do programa Phred (Ewing et al., 1998),

sendo considerados apenas os sítios que exibiram qualidade acima de 20.

Os produtos de PCR dos microssatélites foram diluídos 10 vezes e 2 L

desta solução foram misturados individualmente, em placas de PCR com 96 poços,

com 0,25 L do marcador de peso molecular ET-400R (Amersham) mais 8 L de

Tween20 a 0,1%. Estes produtos sofreram choque térmico, consistindo no

aquecimento da placa a 95oC e logo em seguida colocando a mesma em caixa

contendo gelo, para que os fragmentos amplificados se desnaturassem, e foram,

então, genotipados no mesmo seqüenciador descrito acima. Os produtos resultantes

desta genotipagem foram analisados no programa Fragment Profiler (Amersham),

sendo considerados apenas aqueles picos com altura acima de 100 e que

apresentassem tamanho de acordo com o locus avaliado, que foram caracterizados

por Garcia et al. (2004), apresentados na tabela 1.

4.3.3 Genética de populações

Nas análises do gene cytB as populações de T. infestans aqui avaliadas

foram comparadas com haplótipos do gene cytB de T. infestans provenientes de

Page 43: toma infestans Triatoma brasiliensis

43

Chuquisaca, Bolívia (Giordano et al., 2005), disponíveis no site do GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) sob números de acesso de AY702018 a AY702024.

As amostras de T. brasiliensis do município de Tauá aqui estudadas,

também foram comparadas com populações de T. brasiliensis previamente

estudadas (Monteiro et al., 2004). Foram utilizados haplótipos do gene cytB de T.

brasiliensis dos quatro padrões cromáticos: brasiliensis, macromelasoma, juazeiro e

melanica, obtidos no GenBank sob os números de acesso: AY336524-AY336527 e

AY494140-AY494170.

As seqüências foram alinhadas usando uma versão do programa Clustal X

(Thompson et al., 1997) integrada ao pacote Seqtools v. 8.2.085

(http://www.seqtools.dk). O polimorfismo das seqüências estudadas foi avaliado

através dos parâmetros número médio de diferenças pareadas ( ), diversidade de

nucleotídeos ( n), número de sítios polimórficos (S), número de singletons ( s),

número de haplótipos (H) e diversidade genética (Ĥ). Estes parâmetros foram

calculados através do programa Arlequin v. 2 (Schineider et al., 2000), exceto o

número de singletons que foi calculado através do programa DnaSP v.4 (Rozas et

al., 2003). A hipótese da evolução neutra (Kimura, 1968) foi avaliada através de três

testes de neutralidade: teste D de Tajima (Tajima, 1989), teste D* de Fu e Li (Fu e Li,

1993) e teste F* de Fu e Li (Fu e Li, 1993). Todos estes parâmetros foram

calculados através do programa DnaSP v. 4 (Rozas et al., 2003).

Na análise dos 10 loci de microssatélites foram calculados os parâmetros

número médio de diferenças pareadas ( ), diversidade genética média por loci ( n),

número de sítios polimórficos (S), número de haplótipos (H) e diversidade genética

(Ĥ). Estes parâmetros foram calculados através do programa Arlequin v. 2

(Schineider et al., 2000). Também foram calculadas as heterozigosidades

observadas e esperadas para cada locus por população.

A diferenciação genética entre as populações foi avaliada através do método

AMOVA (Excoffier et al., 1992), calculado pelo programa Arlequin v. 2.000

(Schineider et al., 2000). Para T. infestans foram consideradas três regiões

geográficas: (1) Estado do Rio Grande do Sul, (2) Brasil e (3) América do Sul. Para a

primeira região (Rio Grande do Sul) foi considerada uma hierarquia: um grupo,

formado por todas as amostras provenientes do Estado. Na segunda região (Brasil)

foram consideradas duas hierarquias: um grupo, formado por todas as amostras do

Brasil (Rio Grande do Sul, Minas Gerais e Goiás), e três grupos, (I) Rio Grande do

Sul, (II) Montes Claros e (III) Goiás. Na América do Sul também foram consideradas

Page 44: toma infestans Triatoma brasiliensis

44

duas hierarquias: um grupo, constituído por Brasil, Salvador Mazza (Argentina) e

Yacuiba (Bolívia), e três grupos, (I) Brasil, (II) Salvador Mazza e (III) Yacuiba.

Para T. brasiliensis foram consideradas quatro hierarquias: (1) um grupo,

formado por todas as amostras descritas; (2) dois grupos, (I) intradomicilio e

peridomiciliar, (II) ambiente silvestre; (3) três grupos, (I) intradomicilio, (II)

peridomicilio e (III) ambiente silvestre; e (4) seis grupos, (I) Cachoeira do Júlio, (II)

Cachoeira dos Pedrosas, (III) Dormideira, (IV) Milagres, (V) Morada Nova e (VI)

Mutuca.

Além da AMOVA, também foram calculados os FST pareados entre todas as

amostras, através do programa Arlequin v.2 (Schineider et al., 2000).

Os dendrogramas foram construídos através do programa MEGA v. 3.1

(Kumar et al., 2004) com base no algoritmo neighbor-joining (Saitou e Nei, 1987)

utilizando as distâncias genéticas pareadas das populações estudadas. No intuito de

compreender as relações entre os haplótipos do gene cytB observados nas

amostras estudadas, foram construídos network de haplótipos usando o critério de

95% de parsimônia, através do programa TCS 1.21 (Clement et al., 2000).

Page 45: toma infestans Triatoma brasiliensis

45

5 RESULTADOS

5.1 Ensaios com Inseticida

5.1.1 Triatoma infestans

Na determinação das DL50 entre as linhagens laboratoriais de T. infestans

foi observado o menor valor para a linhagem de Montes Claros, 0,36 (ng/ninfa),

sendo esta linhagem então selecionada para calcular as razões de resistência (RR)

das amostras de T. infestans do Rio Grande do Sul e Yacuiba aqui estudadas

(tabela 2). O Slope desta linhagem foi 2,09. A linhagem de Posse apresentou DL50

de 0,42 e Slope de 2,68. A RR desta linhagem foi 1,17.

Tabela 2: Valores de DL50, Slope e RR para Triatoma infestans do Rio Grande do Sul,

Montes Claros, Posse e Yacuiba.

Triatoma infestans DL50 IC 95% Slope IC 95% RR (DL50) Montes Claros 0,36 0,24 0,41 2,09 ± 0,33 -

Posse 0,42 0,32 0,52 2,68 ± 0,47 1,17 Mato Queimado 0,53 0,35 0,71 1,80 ± 0,38 1,47

Guarani das Missões 0,35 0,24 0,55 1,35 ± 0,22 0,97 Três de Maio 0,67 0,52 0,93 1,99 ± 0,31 1,86

Doutor Maurício Cardoso 0,26 0,20 0,36 1,93 ± 0,28 0,72 Yacuiba 10,84 7,71 14,64 1,52 ± 0,19 30,11

Nota: Montes Claros é a linhagem laboratorial escolhida para se calcular as RR das demais

populações. As DL50 estão representadas como nanograma do inseticida por ninfa tratada (ng/nt).

Montes Claros (MG); Posse (GO); Yacuiba (Bolívia).

Os valores de DL50 para as amostras do Rio Grande do Sul variaram de

0,26 (Doutor Maurício Cardoso) a 0,67 (Três de Maio), gerando RR que variaram de

0,72 a 1,86 (tabela 2 e figura 6). Duas localidades estudadas (Doutor Maurício

Cardoso e Guarani das Missões) apresentaram valores de DL50 menores que a

linhagem de laboratório (Montes Claros). A DL50 observada para a linhagem de

Yacuiba foi a maior neste estudo (DL50 = 10,84) e gerou uma RR de 30,11 (tabela 2

e figura 6). Os valores de slope das amostras do Rio Grande do Sul variaram de

1,35 (Guarani das Missões) a 1,99 (Três de Maio). Este parâmetro define a

inclinação da reta no gráfico, e representa a homogeneidade da amostra analisada.

Assim, Guarani das Missões é a amostra mais homogênea quanto a variação na

mortalidade avaliada nos ensaios com deltametrina, e Três de Maio é a mais

heterogênea.

Page 46: toma infestans Triatoma brasiliensis

46

Figura 6: DL50 e RR observadas para as amostras de Triatoma infestans estudadas. Os

valores também são mostrados na tabela 2.

5.1.2 Triatoma brasiliensis

Para T. brasiliensis uma única linhagem foi utilizada como suscetível,

Crateús (CE), e esta apresentou DL50 de 0,19 (ng/ninfa) e Slope de 2,92 (tabela 3).

Tabela 3: Valores de DL50, Slope e RR para populações de Triatoma brasiliensis do Estado

do Ceará, Nordeste do Brasil.

Captura População DL50 IC 95% Slope IC 95% RR (DL50) Crateús 0,19 0,16 0,23 2,92 ±0,27 -

Cachoeira do Júlio (I) 0,33 0,29 0,38 2,82 ±0,38 1,74 Cachoeira dos Pedrosas (I) 0,22 0,18 0,26 2,83 ±0,41 1,16

Dormideira (I) 0,34 0,27 0,39 3,26 ±0,56 1,79 I

Mutuca (I) 0,30 0,26 0,39 2,29 ±0,34 1,58 Cachoeira dos Pedrosas (P) 0,24 0,20 0,30 3,23 ±0,63 1,26 Morada Nova do Thomas (P) 0,33 0,27 0,44 3,58 ±0,73 1,74

Mutuca (P) 0,30 0,24 0,46 2,58 ±0,61 1,58 II

Cachoeira dos Pedrosas (S) 0,19 0,17 0,22 4,35 ±0,68 1,00 Nota: Crateús é a linhagem laboratorial escolhida para se calcular as razões de resistência

das demais populações. As DL50 estão representadas como nanograma do inseticida por ninfa

tratada (ng/nt). I: intradomicílio, P: peridomicílio e S: silvestre. I – primeira captura; II – segunda

captura, realizada um ano após borrifação das residências com piretróides.

As DL50 das amostras provenientes do município de Tauá variaram de 0,19,

Cachoeira dos Pedrosas (S) a 0,34 Dormideira (I). Estes valores geraram RR que

Page 47: toma infestans Triatoma brasiliensis

47

variaram de 1,00 a 1,79 (tabela 3 e figura 7). Os valores de Slope para estas

amostras variaram de 2,29, Mutuca (I) a 4,35 Cachoeira dos Pedrosas (S). Na figura

7 são observadas as RR para as amostras de T. brasiliensis de Tauá estudadas

neste trabalho.

Figura 7: DL50 e RR observadas para as amostras de Triatoma brasiliensis estudadas. Os

valores também são mostrados na tabela 3.

5.2 Variabilidade genética de Triatoma infestans

O estudo da variabilidade genética das amostras de T. infestans foi realizado

utilizando-se dois marcadores moleculares: um “alvo” mitocondrial, o gene do

citocromo B (cytB) que foi seqüenciado e as sequências obtidas utilizadas nas

análises, e um “alvo” nuclear, 10 loci de microssatélites que foram amplificados com

iniciadores descritos por Garcia et al. (2004) (tabela 1).

5.2.1 Variabilidade genética do gene cytB

Uma vez que tivemos o interesse de avaliar a variabilidade genética das

amostras de T. infestans aqui estudadas, inicialmente foi verificada a estrutura

genética destas amostras através da AMOVA (análise de variância molecular) para

definir as populações diferenciadas geneticamente. Nesta etapa do estudo foram

avaliadas as amostras do Rio Grande do Sul (municípios Mato Queimado, Guarani

das Missões, Três de Maio e Doutor Maurício Cardoso), as de Montes Claros (MC) e

Page 48: toma infestans Triatoma brasiliensis

48

Posse (PO) (linhagens suscetíveis a inseticidas), uma amostra de Salvador Mazza

(Província de Salta, Argentina), que apresenta RR para deltametrina de 133,1

(Picollo et al., 2005), e uma amostra de Yacuiba (Departamento de Tarija, Bolívia),

que apresentou uma RR de 30,11 (tabela 2).

Tabela 4: AMOVA para as amostras de Triatoma infestans estudadas calculadas com base

nas sequências do gene mitocondrial cytB.

Região geográfica Hierarquia Categoria % Variação Índice de

endocruzamento Entre populações 5,58

Rio Grande do Sul Um Grupo Dentro da população 94,42

FST = 0,056

Entre populações 7,41 Um Grupo

Dentro da população 92,59 FST = 0,074

Entre grupos 5,06 FCT = 0,051 Entre populações dentro dos

grupos 4,22 FSC = 0,044

Brasil Três Grupos

Dentro dos grupos 90,72 FST = 0,093 Entre populações 8,90

Um Grupo Dentro da população 91,10

FST = 0,089

Entre grupos 2,71 FCT = 0,027 Entre populações dentro dos

grupos 7,51 FSC = 0,077

América do Sul Três Grupos

Dentro dos grupos 89,78 FST = 0,102 Nota: Foram avaliadas três regiões geográficas (Rio Grande do Sul, Brasil e América do

Sul). As hierarquias foram avaliadas em um e três grupos, e as porcentagens de variação definidas

para cada categoria, como também os índices de endocruzamento.

Na tabela 4 é encontrada a AMOVA para todas as amostras de T. infestans

aqui estudadas. No Rio Grande do Sul foi observada 5,58% de variação entre as

populações, e o valor de FST para esta análise foi de 0,056. Este valor indica pouca

diferenciação genética entre as amostras do Rio Grande do Sul, e, portanto, estes T.

infestans fazem parte de apenas uma única população genética. Assim, a partir de

então, estas amostras serão consideradas, para as demais análises, como uma

única população denominada Rio Grande do Sul (RS).

Considerando o Brasil como um grupo foi observado 7,41% de variação

entre as populações, com um FST para esta análise de 0,074. Nas análises para o

Brasil separado em três grupos foi observado 5,06% de variação entre os grupos, e

4,22% de variação entre as populações dentro dos grupos. Nesta análise é

observada pouca diferenciação genética entre amostras de mesmo grupo (FSC =

0,044) e uma diferenciação um pouco maior entre os grupos (FCT = 0,051), o que

contribuiu para a diferenciação entre todas as populações (FST = 0,093) (tabela 4).

Page 49: toma infestans Triatoma brasiliensis

49

Considerando a América do Sul como um grupo foi observado 8,90% de

variação entre as populações, o que gerou um FST de 0,089. Nas análises para a

América do Sul separada em três grupos foi observado 2,71% de variação entre os

grupos e 7,51% de variação entre as populações dentro dos grupos. Nesta análise

foi observada pouca diferenciação genética entre os grupos (FCT = 0,027) e

moderada diferenciação genética entre as populações de mesmo grupo (FSC =

0,077). Aqui observamos que as diferenças entre populações de mesmo grupo são

mais importantes que as variações entre os grupos para a diferenciação genética de

todas as amostras (FST = 0,102) (tabela 4).

Com a análise AMOVA foram definidas cinco populações geneticamente

distintas para T. infestans: Montes Claros (MC), Posse (PO), Rio Grande do Sul

(RS), Salvador Mazza (SM) e Yacuiba (YC). Além destas amostras, também foram

acrescentadas amostras de Chuquisaca (Bolívia), para a análise filogenética, na

construção do network. A variabilidade genética foi definida apenas para as

populações de T. infestans obtidas neste trabalho.

Entre os 80 T. infestans analisados foram detectados 42 haplótipos

(seqüências ainda não depositadas no GenBank), o que correspondeu a uma

diversidade genética (Ĥ) de 0,848 (tabela 5). A análise dos haplótipos demonstrou

que 72 (16,07%) dos 448 sítios eram polimórficos, sendo 34 parsimônio-

informativos. Foram observados 38 singletons nestes 72 sítios. As substituições do

tipo transição ocorreram em 43 das mutações, enquanto que as transversões foram

as mais freqüentes, ocorrendo em 45 substituições. Na análise das seqüências de

aminoácidos preditas, correspondentes aos haplótipos, foram observadas 32

substituições (21,48%) nos 149 aminoácidos.

Para as populações separadas, os maiores números de sítios polimórficos

(S = 33) e singletons ( S = 21) foram observados em RS (tabela 5). Apesar disso, os

maiores valores para número médio de diferenças pareadas, (5,636), e diversidade

de nucleotídeos, n (0,013), foram observados em YC. O maior número de

haplótipos foi observado em RS (H = 17) e o menor número ocorreu em SM (H = 4).

A diversidade genética variou de 0,533 (SM) a 0,978 (MC). Os valores obtidos

através dos três testes de neutralidade (teste D de Tajima, teste D* de Fu e Li, e

teste F* de Fu e Li) demonstram que a variabilidade genética das populações MC,

PO e YC se mostram estatisticamente dentro da neutralidade (tabela 6). Já para as

populações RS e SM, inclusive a população total, estes testes de neutralidade

apresentaram valores estatisticamente fora da neutralidade, sendo estes valores

Page 50: toma infestans Triatoma brasiliensis

50

negativos. Estes resultados indicam a ocorrência de expansão populacional nestas

populações.

Tabela 5: Variabilidade genética de sequências do gene mitocondrial cytB em populações

de Triatoma infestans do Brasil, Argentina e Bolívia.

Localidades Código n n S S H Ĥ

Montes Claros MC 10 4,800 0,011 17 11 9 0,978 Posse PO 10 4,313 0,010 19 16 7 0,867

Rio Grande do Sul RS 40 2,549 0,006 33 21 17 0,767 Salvador Mazza SM 10 2,220 0,005 11 11 4 0,533

Yacuiba YC 10 5,636 0,013 17 5 8 0,933 Total 80 4,161 0,009 72 38 42 0,848

Nota: n: número amostral; : número médio de diferenças pareadas; n: diversidade de

nucleotídeos; S: número de sítios polimórficos; s: número de singletons; H: número de haplótipos; e

Ĥ: diversidade genética.

Tabela 6: Testes de neutralidade calculados para as populações de Triatoma infestans do

Brasil, Argentina e Bolívia, através de sequências do gene mitocondrial cytB.

Localidade Código Teste D de Tajima Teste D* de Fu e Li Teste F* de Fu e Li Montes Claros MC -0,97010 -1,22552 -1,30945

Posse PO -1,70890 -1,77423 -1,98161 Rio Grande do Sul RS -2,3428* -4,57623* -4,51535* Salvados Mazza SM -1,94429* -2,27595* -2,46830*

Yacuiba YC -0,35107 0,38608 0,22867 Total - -2,57555* -4,44933* -4,42579* Nota: * Valores estatisticamente significantes (P<0,05).

Na tabela 7 é mostrada a freqüência dos haplótipos de acordo com as

populações/localidades estudadas. O haplótipo mais freqüente e encontrado em

mais de uma população é o número 1, o qual já está depositado no site do GenBank

sob o número de acesso AY062165. Devido à elevada frequência deste haplótipo

podemos concluir que ele é o mais antigo dentre os demais haplótipos encontrados

no Brasil, Argentina e Bolívia. Interessantemente, este haplótipo não foi observado

em Montes Claros (MC), nem em Chuquisaca (Bolívia).

Page 51: toma infestans Triatoma brasiliensis

51

Tabela 7: Freqüência dos haplótipos do gene mitocondrial cytB observados nas populações

de Triatoma infestans estudadas.

MC 10 PO 10 RS 40 ST 10 YC 10 CHU 7 - 1 (0,4) 1 (0,38) 1 (0,7) 1 (0,1) -

4 (0,2) 14 (0,1) 2 (0,1) 26 (0,02) 34 (0,1) 3 (0,3) A (0,68) 6 (0,1) 15 (0,1) 5 (0,04) 27 (0,02) 35 (0,1) 37 (0,1) B (0,18) 7 (0,1) 16 (0,1) 20 (0,02) 28 (0,02) 36 (0,1) 38 (0,1) C (0,08) 8 (0,1) 17 (0,1) 21 (0,02) 29 (0,02) - 39 (0,1) D (0,02) 9 (0,1) 18 (0,1) 22 (0,02) 30 (0,02) - 40 (0,1) E (0,02)

10 (0,1) 19 (0,1) 23 (0,02) 31 (0,02) - 41 (0,1) F (0,02) 11 (0,1) - 24 (0,02) 32 (0,02) - 42 (0,1) G (0,02) 12 (0,1) - 25 (0,02) 33 (0,02) - - - 13 (0,1) - - - - - -

Nota: Os haplótipos da Bolívia (Chuquisaca) estão disponíveis no site do GenBank sob os

números de acesso: AY702018 a AY702024. O haplótipo 1 está depositado no GenBank sob número

de acesso AY062165.

Interessantemente Yacuiba e Chuquisaca, que estão no mesmo país

(Bolívia), não apresentaram haplótipos em comum. Em Yacuiba o haplótipo mais

freqüente foi o 3, enquanto que em Chuquisaca foi o A (já descrito por Giordano et

al., 2005). Nenhum dos haplótipos encontrados em Chuquisaca foi identificado no

Brasil ou Argentina. No network da figura 8 podemos notar a existência de alguns

loops entre os haplótipos encontrados em RS, o que representa homoplasia e

ocorrência de mutações reversas/paralelas (Posada & Crandall, 2001). Em todo

network são observados poucos haplótipos perdidos/não amostrados e, como

descrito acima, Chuquisaca e Montes Claros se encontram isoladas por não

apresentarem nenhum haplótipo em comum com as demais amostras.

Page 52: toma infestans Triatoma brasiliensis

52

Figura 8: Network dos haplótipos do gene mitocondrial cytB observados nos Triatoma

infestans do Brasil, Argentina e Bolívia. As elipses representam os haplótipos, e a área delas a

freqüência dos haplótipos. Os círculos menores representam haplótipos perdidos ou não amostrados,

necessários para a correta conexão dos haplótipos estudados.

De acordo com Wright (1978), os valores de FST podem ser interpretados da

seguinte forma: 0 a 0,05 indica pouca diferenciação genética; de 0,05 a 0,15 indica

moderada diferenciação genética; de 0,15 a 0,25 indica grande diferenciação

genética e acima de 0,25, diferenciação genética muito grande. Baseado nesta

Page 53: toma infestans Triatoma brasiliensis

53

forma de interpretação pode-se observar moderada diferenciação genética entre MC

e PO, entre MC e SM, entre PO e YC, e entre RS e YC. Grande diferenciação

genética foi observada entre MC e SM e entre SM e YC (tabela 8).

Tabela 8: FST pareado entre as amostras de Triatoma infestans estudadas, calculados

através das sequências do gene mitocondrial cytB.

MC PO RS SM YC

MC -

PO 0,078* -

RS 0,144* -0,004 -

SM 0,244* 0,028 0,012 -

YC 0,044 0,063 0,120* 0,211* -

Nota: * Valores estatisticamente significantes (P = 0,05; 3.024 permutações).

5.2.2 Variabilidade genética dos loci de microssatélites

As análises da variabilidade dos 10 loci de microssatélite nas amostras de T.

infestans do Brasil, Argentina e Bolívia foram realizadas considerando as cinco

populações definidas anteriormente: Montes Claros, Posse, Rio Grande do Sul,

Salvador Mazza e Yacuiba.

Na análise dos 130 exemplares de T. infestans foram identificados 227

haplótipos, com todos os 10 loci polimórficos. Isto gerou uma diversidade genética

de 0,998 (tabela 9). Nesta análise foi observado um valor para número médio de

diferenças pareadas ( de 6,197, o que correspondeu a uma diversidade genética

média por loci ( n) de 0,620.

Tabela 9: Variabilidade genética de 10 loci de microssatélites em populações de Triatoma

infestans do Brasil, Argentina e Bolívia.

Localidades Código n n S H Ĥ Montes Claros MC 30 3,656 0,366 9 51 0,993

Posse PO 30 3,064 0,306 10 43 0,980 Rio Grande do Sul RS 30 4,391 0,439 10 56 0,997 Salvador Mazza SM 10 4,047 0,405 8 19 0,995

Yacuiba YC 30 5,319 0,532 10 58 0,999 Total - 130 6,197 0,620 10 227 0,998

Nota: n: número amostral; : número médio de diferenças pareadas; n: diversidade

genética média por loci; S: número de loci polimórficos; H: número de haplótipos; e Ĥ: diversidade

genética.

A análise das populações separadamente demonstrou que o número de

haplótipos variou de 19 (SM) a 58 (YC). Todas as populações apresentaram elevada

Page 54: toma infestans Triatoma brasiliensis

54

diversidade genética, sendo a maior observada em YC (Ĥ = 0,999). As populações

PO, RS e YC apresentaram todos os loci polimórficos, mas em MC foi observado um

locus monomórfico e SM dois monomórficos (tabela 9). Número médio de diferenças

pareadas ( variou de 3,064 (PO) a 5,319 (YC), o que resultou em diversidade

genética média por loci ( n) variando de 0,306 (PO) a 0,532 (YC).

O número médio de alelos por locus detectado por população variou de 2,7

(MC) a 4,8 (YC) (tabela 10). Os menores valores de heterozigosidade média

observada e esperada foram observados em PO (HO = 0,187; HE = 0,329), enquanto

os maiores valores foram observados em YC (HO = 0,350; HE = 0,548). A população

MC apresentou o locus TiC09 monomórfico, e a população SM os locus TiC08 e

TiD09 monomórficos (tabela 10).

Desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram observados em

pelo menos um dos 10 loci analisados em todas as populações (tabela 13), devido à

ocorrência de excesso de homozigotos nas amostras.

Tabela 10: Variação genética apresentada pelos 10 loci de microssatélite nas populações

de Triatoma infestans estudadas.

Locus Localidade TiA02 TiC02 TiC08 TiC09 TiD09 TiE02 TiE12 TiF03 TiF11 TiG03 Média

NA 3 5 2 1 3 3 2 3 2 3 2,7 HO 0,367* 0,367* 0,167* 0 0,133* 0,267* 0,300 0,167* 0,100* 0,200* 0,207 MC HE 0,428 0,699 0,345 0 0,273 0,568 0,463 0,375 0,210 0,434 0,380 NA 4 2 2 5 3 8 4 3 4 6 4,1 HO 0,233* 0,133 0,167 0,133 0,067 0,300* 0,200* 0,400 0,067* 0,167 0,187 PO HE 0,668 0,126 0,186 0,130 0,098 0,459 0,729 0,460 0,247 0,191 0,329 NA 5 7 2 5 6 5 6 2 2 6 4,6 HO 0,433 0,233* 0,067* 0,067* 0,600* 0,533* 0,367 0,133 0,067* 0,300* 0,280 RS HE 0,394 0,519 0,216 0,668 0,689 0,643 0,535 0,213 0,213 0,555 0,465 NA 2 2 1 3 1 3 2 4 3 3 2,4 HO 0,200 0,200 0 0,500 0 0,400 0,400 0,200* 0,300 0,400 0,260 SM HE 0,574 0,510 0 0,558 0 0,416 0,537 0,784 0,632 0,558 0,457 NA 5 5 4 5 5 5 3 8 3 5 4,8 HO 0,333* 0,700* 0,200* 0,133* 0,633 0,467 0,400 0,267* 0,167* 0,200* 0,350 YC HE 0,399 0,634 0,462 0,385 0,605 0,604 0,485 0,794 0,473 0,634 0,548

Nota: NA: número de alelos, HO: heterozigosidade observada, HE: heterozigosidade

esperada. * Desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P<0,05).

Page 55: toma infestans Triatoma brasiliensis

55

Tabela 11: Relação dos alelos observados nos 10 loci de microssatélite nas populações de

Triatoma infestans estudadas.

Locus Alelo MC PO RS YC SM Locus Alelo MC PO RS YC SM

169 X 121 X

173 X X 145 X

183 X X 149 X X

185 X 151 X X X

189 X 153 X

191 X 155 X X X

193 X 157 X X

197 X X 159 X X

199 X X X X 161 X X X

213 X X 171 X

225 X 185 X

TiA02

245 X 189 X

147 X 271 X

153 X 273 X

155 X

TiE02

275 X

161 X X

163 X 269 X

165 X 271 X

167 X 273 X

169 X X X X 303 X X X

175 X X 309 X

177 X 315 X X X X X

191 X 321 X X X

199 X 325 X

201 X

TiE12

345 X

203 X 162 X X

205 X 168 X

TiC02

217 X 170 X X X

199 X 172 X X

201 X 174 X

203 X 176 X X X

205 X X X X 178 X

207 X 180 X

211 X 182 X

217 X 186 X

TiC08

245 X 192 X

133 X 196 X

135 X 204 X

137 X

TiF03

230 X

139 X X

141 X X X X 197 X X X X

151 X 215 X

157 X 223 X

163 X 229 X X X X

177 X 233 X

211 X 249 X

217 X

TiF11

283 X

233 X

235 X 190 X

241 X 194 X

TiC09

255 X 202 X

190 X 214 X

192 X 224 X

202 X 228 X

208 X X 232 X X

210 X X X X 234 X

214 X 240 X X X X X

224 X 242 X X

234 X 250 X

244 X 254 X

270 X 258 X

272 X 262 X X

274 X 266 X

TiD09

278 X

TiG03

270 X

Nas análises dos 10 loci de microssatélite em T. infestans foram

identificados 64 alelos exclusivos do Brasil, onde todas as amostras avaliadas foram

caracterizadas como suscetíveis a deltametrina; 34 alelos exclusivos de Salvador

Page 56: toma infestans Triatoma brasiliensis

56

Mazza e/ou Yacuiba, cujos insetos são resistentes a deltametrina; e 26 alelos

pertencentes às populações dos três países (tabela 11).

Os 34 alelos exclusivos das populações resistentes (SM e/ou YC) foram:

TiA02-185, TiA02-189, TiA02-245, TiC02-199, TiC02-201, TiC02-205, TiC02-217,

TiC08-199, TiC08-203, TiC08-211, TiC09-133, TiC09-151, TiC09-157, TiC09-211,

TiC09-217, TiC09-241, TiD09-192, TiD09-214, TiD09-234, TiE02 – 171, TiE12-325,

TiF03-162, TiF03-168, TiF03-174, TiF03-178, TiF03-180, TiF03-186, TiF03-192,

TiF11-233, TiF11-249, TiG03-190, TiG03-202, TiG03-234, e TiG03-266 (tabela 14).

Na tabela 12 é apresentada a AMOVA realizada para os 10 loci de

microssatélites dos T. infestans estudados. O Brasil apresentou 0,98% de variação

entre populações, o que gerou um FST = 0,010, que indica pouca diferenciação

genética segundo as definições de Wright (1978).

Considerando a América do Sul como um único grupo foi observada 0,74%

de variação entre populações, gerando um FST de 0,007. Já quando são

considerados três grupos, é observado um valor negativo para a proporção de

variação (-0,40) entre os grupos, o que pode ser interpretado como um valor nulo.

Nesta análise foi observada pouca diferenciação genética entre as populações de

mesmo grupo (FSC = 0,010) e também pouca diferenciação genética entre os grupos

(FCT = -0,004) (tabela 15). O valor de FST para esta análise também demonstra a

existência de pouca diferenciação entre todas as populações (FST = 0,006).

Tabela 12: AMOVA para as amostras de Triatoma infestans estudadas através dos 10 loci

de microssatélite.

Região Geográfica Hierarquia Categoria %

Variação Índice de Fixação

Entre populações 0,98 Brasil Um Grupo

Dentro das populações 99,02 FST = 0,010

Entre populações 0,74 Um Grupo

Dentro das populações 99,26 FST = 0,007

Entre Grupos -0,40 FCT = -0,004 Entre populações dentro dos

grupos 0,98 FSC = 0,010

América do Sul Três

Grupos Dentro dos grupos 99,42 FST = 0,006

Nota: Foram avaliadas duas regiões geográficas (Brasil e América do Sul). As hierarquias

foram avaliadas em um e três grupos, e as porcentagens de variação definidas para cada categoria,

como também os índices de endocruzamento.

Também foram calculados os FST pareados entre as populações estudadas,

e todos os valores se mostraram baixos, corroborando com os resultados da

AMOVA e demonstrando pouca diferenciação genética entre as populações de T.

Page 57: toma infestans Triatoma brasiliensis

57

infestans estudadas com estes loci de microssatélites (tabela 13), segundo o critério

de Wright (1978).

Tabela 13: FST pareado entre as amostras de Triatoma infestans estudadas, calculados

através dos 10 loci de microssatélite.

MC PO RS SM YC

MC -

PO 0,013* -

RS 0,005* 0,011* -

SM 0,006* 0,013* 0,004* -

YC 0,004* 0,010* 0,002* 0,003* -

Nota: * Valores estatisticamente significantes (P = 0,05; 3.024 permutações)

5.3 Variabilidade genética de Triatoma brasiliensis

Uma vez que tivemos o interesse de avaliar a variabilidade genética das

amostras de T. brasiliensis aqui estudadas, inicialmente foi verificada a estrutura

genética destas amostras através da AMOVA para definir as populações

geneticamente diferentes. Uma vez que ainda não se encontra na literatura

descrição de microssatélites para esta espécie de triatomíneo, a variabilidade

genética foi avaliada apenas com uso de sequências do gene cytB.

Na tabela 14 é encontrada a AMOVA para todas as amostras de T.

brasiliensis aqui estudadas. Para todas as hierarquias estabelecidas, as proporções

de variação observadas entre as populações dentro dos grupos não passaram de

2.04% (Seis grupos), gerando valores de FST variando entre 0,013 e 0,014. Estes

valores são característicos de uma única população, composta por todas as

localidades estudadas. Estes resultados não evidenciam a formação de sub-

populações.

Entre os 52 exemplares de T. brasiliensis analisados foram detectados 50

haplótipos (seqüências não depositadas no GenBank), o que correspondeu a uma

diversidade genética (Ĥ) de 0,998 (tabela 15). A análise dos haplótipos demonstrou

que 91 (25,85%) dos 352 sítios eram polimórficos, sendo 86 parsimônio-

informativos. Foram observados 5 singletons nestes 91 sítios. As substituições do

tipo transição foram as mais freqüentes, ocorrendo em 50 das mutações. Já as

transversões foram observadas em 38 substituições. Também ocorreram 3

substituições mistas, aquelas onde eram encontradas substituições dos dois tipos.

Na análise das seqüências de aminoácidos preditas, correspondentes aos

haplótipos, foram observadas 34 substituições (29,31%) nos 116 aminoácidos.

Page 58: toma infestans Triatoma brasiliensis

58

Tabela 14: AMOVA para as amostras de Triatoma brasiliensis do município de Tauá, Estado

do Ceará, calculada através das sequências do gene mitocondrial cytB.

Hierarquia Categoria % Variação Índice de Fixação Entre Populações 1,44

Um Grupo Dentro das Populações 98,56

FST = 0,014

Entre Grupos -0,32 FSC = 0,016Entre Populações dentro dos

Grupos 1,57 FST = 0,013Dois Grupos

Dentro das Populações 98,75 FCT = -0,003Entre Grupos -0,10 FSC = 0,015

Entre Populações dentro dos Grupos

1,56 FST = 0,014Três Grupos

Dentro das Populações 98,59 FCT = -0,001Entre Grupos -0,70 FSC = 0,020

Entre Populações dentro dos Grupos

2,04 FST = 0,013Seis Grupos

Dentro das Populações 98,66 FCT = -0,007Nota: Foram consideradas quatro hierarquias: um grupo (todas as amostras), dois grupos (I.

intradomicilio + peridomicilio; II. ambiente silvestre), três grupos (I. intradomicilio; II. peridomicilio; III.

ambiente silvestre), e seis grupos (I. Cachoeira do Júlio; II. Cachoeira dos Pedrosas; III. Dormideira;

IV. Milagres; V. Morada Nova do Thomas; VI. Mutuca). P = 0,05 (1.023 permutações).

Tabela 15: Variabilidade genética do gene mitocondrial cytB em Triatoma brasiliensis do

município de Tauá, Estado do Ceará.

Amostras Código n n S S H Ĥ Cachoeira do Júlio (I) CJI 4 13,00 0,037 26 26 4 1,000

Cachoeira dos Pedrosas (I) CPI 9 7,19 0,020 21 11 8 0,972 Dormideira (I) DMI 5 18,40 0,052 33 7 5 1,000

Mutuca (I) MUI 6 8,93 0,025 21 13 6 1,000 Cachoeira dos Pedrosas (P) CPP 5 5,20 0,015 10 4 5 1,000 Morada Nova do Thomas (P) MNP 6 7,87 0,022 20 16 6 1,000

Mutuca (P) MUP 5 1,40 0,004 3 2 4 0,900 Cachoeira dos Pedrosas (S) CPS 7 13,05 0,037 25 2 7 1,000

Milagres (S) MLS 5 11,60 0,033 25 17 5 1,000 Todas as amostras Total 52 21,52 0,061 91 5 50 0,998

Nota: n: número amostral; : número médio de diferenças pareadas; n: diversidade de

nucleotídeos; S: número de sítios polimorficos; S: número de singletons; H: número de haplotipos e

Ĥ: diversidade genética.

As análises das amostras separadamente demonstraram que os maiores

números de sítios polimórficos (S = 33) foram observados em DMI (tabela 15), onde

também foi observado o maior valor para diversidade de nucleotídeos ( n = 0,052).

O maior número de singletons ( S = 26) foi observado em CJI e o maior número de

haplótipos foi observado em CPI (H = 8), gerando uma diversidade genética (Ĥ) de

0,972.

Os valores obtidos através dos três testes de neutralidade, teste D de Tajima

(Tajima, 1989), teste D* de Fu e Li (Fu & Li, 1993) e teste F* de Fu e Li (Fu & Li,

Page 59: toma infestans Triatoma brasiliensis

59

1993), demonstram que a variabilidade genética de todas as amostras estudadas se

encontra estatisticamente dentro da neutralidade (tabela 16), exceto o resultado do

teste D* de Fu e Li que evidenciou a população total fora da neutralidade, com valor

positivo, o que representa a ocorrência de seleção balanceadora.

Tabela 16: Testes de neutralidade calculados para as populações de Triatoma brasiliensis

do Município de Tauá, através de sequências do gene mitocondrial cytB.

Amostras Código Teste D de

Tajima Teste D* de

Fu e Li Teste F* de

Fu e Li Cachoeira do Júlio (I) CJI -0,859 -0,859 -0,859

Cachoeira dos Pedrosas (I) CPI -0,340 -0,598 -0,600 Dormideira (I) DMI 1,211 1,211 1,306

Mutuca (I) MUI -0,180 -0,302 -0,301 Cachoeira dos Pedrosas (P) CPP 0,596 0,596 0,629 Morada Nova do Thomas (P) MNP 0,637 -0,886 -0,907

Mutuca (P) MUP -0,175 -0,175 -0,175 Cachoeira dos Pedrosas (S) CPS 1,580 1,365 1,560

Milagres (S) ML -0,248 -0,248 -0,267 Todas as amostras Total 0,242 1,600* 1,304

Nota: * Valor estatisticamente significante (P<0,05).

No network da figura 9 podemos notar a existência de alguns loops entre os

haplótipos do gene cytB encontrados nos T. brasiliensis, o que representa

homoplasia e ocorrência de mutações reversas/paralelas (Posada & Crandall, 2001).

Em todo network são observados diversos haplótipos perdidos/não amostrados e

não existe a formação de nenhum grupo isolado. Apesar disso, quando os

haplótipos são identificados de acordo com o ambiente de obtenção dos

exemplares, verifica-se que os T. brasiliensis do ambiente silvestre estão mais

próximos dos encontrados no peridomicílio.

No dendrograma da figura 10 podemos observar as relações entre os

haplótipos de T. brasiliensis estudados neste trabalho e aqueles previamente

avaliados (Monteiro et al., 2004). Podemos notar que os haplótipos descritos aqui

formaram um clado com os demais haplótipos descritos para o fenótipo brasiliensis,

embora não tenha ocorrida a formação de clados diferenciados para as localidades

estudadas.

Page 60: toma infestans Triatoma brasiliensis

60

a) b)

Figura 9: Network dos haplótipos do gene mitocondrial cytB observados nos Triatoma

brasiliensis do município de Tauá, Estado do Ceará. As elipses representam os haplótipos e os

pontos representam haplótipos perdidos ou não amostrados, necessários para a correta conexão dos

haplótipos estudados. a) Network representando os números de cada haplótipo. b) Representação

dos ambientes de obtenção dos exemplares. Verde: ambiente silvestre; Amarelo: ambiente

peridomiciliar e; Vermelho: ambiente intradomiciliar.

Page 61: toma infestans Triatoma brasiliensis

61

Figura 10: Dendrograma neighbor-joining dos haplótipos do gene mitocondrial cytB de

Triatoma brasiliensis do município de Tauá comparados com haplótipos previamente descritos para

os quatro fenótipos de T. brasiliensis (brasiliensis, macromelasoma, juazeiro e melanica). Triatoma

infestans foi utilizado como grupo irmão e Rhodnius prolixus como grupo externo. Os números

representam os 50 haplótipos descritos neste trabalho. As letras são os haplótipos previamente

descritos (Monteiro et al., 2004).

Page 62: toma infestans Triatoma brasiliensis

62

6 DISCUSSÃO

6.1 Resistência de triatomíneos a deltametrina

Os conhecimentos atuais sobre a resistência de T. infestans a piretróides,

permitiram a descrição de uma área crítica de resistência, com elevados valores de

RR, que abrange o norte da Argentina e o Sul da Bolívia (Vassena et al., 2007;

Zerba e Picollo, 2007). Nos estudos envolvendo populações de T. infestans do norte

da Argentina foram observados valores de RR que variam de 99 (El Chorro) a 133,1

(Salvador Mazza) (Zerba e Picollo, 2007). Já na Bolívia, a localidade que foi

submetida a ensaios biológicos para definição de razão de resistência, Yacuiba,

apresentou RR de 154,4 (Vassena et al., 2007; Orihuela et al., 2008). Além destes

valores de RR que definem estas populações como possuindo grande resistência a

piretróides, diversas amostras desta espécie de triatomíneo, em outras localidades

dentro desta área de resistência, apresentaram baixa mortalidade quando

submetidos à dose discriminante. Com estes conhecimentos aumentou a

preocupação acerca da ocorrência de T. infestans e/ou outros triatomíneos

resistentes a piretróides em outros países, dentre eles o Brasil.

Devido à persistência de T. infestans em focos peridomiciliares do Rio

Grande do Sul e a ocorrência natural de T. brasiliensis no Ceará (Dias et al., 2000;

Silveira e Vinhaes, 1999), com a rápida recolonização das unidades domiciliares por

esta espécie neste Estado (Diotaiuti et al., 2000), surgiu o interesse em avaliar estas

espécies quanto à resistência a piretróides, através de ensaios biológicos. Os

resultados se mostraram animadores, definindo as amostras testadas como

suscetíveis ao piretróide deltametrina. Segundo a OPAS (2005), valores de RR

iguais ou superiores a 5 indicam alterações na suscetibilidade da amostra testada ao

inseticida utilizado. Dessa forma, como todas as amostras de T. infestans e T.

brasiliensis do Brasil avaliadas neste trabalho apresentaram valores de RR inferiores

a 2, estas podem ser classificadas como altamente suscetíveis a deltametrina, ao

contrário da expectativa.

Yacuiba (Departamento de Tarija, Bolívia) tem sido alvo de muitos estudos

pela importância dos valores de resistência relatados para esta região. Utilizando

uma amostra por nós coletada, encontramos uma RR igual a 30,11 (tabela 2), valor

cinco vezes menor que o relatado por Orihuela et al. (2008) e Toloza et al. (2008).

Não acreditamos que haja discordância entre estes resultados, mas sim que a

resistência de T. infestans a deltametrina nesta região não seja homogênea e,

Page 63: toma infestans Triatoma brasiliensis

63

contrário a isso, possa variar. Este achado pode ter grande importância

epidemiológica para o controle de triatomíneos, e merece ser futuramente melhor

investigado.

As amostras de T. infestans obtidas no Rio Grande do Sul também

apresentaram valores de resistência menores do que já havia sido descrito para este

Estado. Em 2000, Vassena et al. observaram RR igual a 7,0 para T. infestans do Rio

Grande do Sul, o que classificou a amostra como possuindo resistência inicial a

deltametrina. Os valores de RR observados por nós para todas as amostras de T.

infestans deste Estado foram inferiores a 2 (tabela 2), o que demonstra que estes

exemplares são suscetíveis a deltametrina. Uma explicação plausível para estes

valores discrepantes seria a eliminação destes T. infestans resistentes no Rio

Grande do Sul durante o período que separa os dois trabalhos. Esta eliminação

pode ter ocorrido devido a possíveis mudanças no controle de triatomíneos no Rio

Grande do Sul, com um cuidado maior no ambiente peridomiciliar, realizando a

remoção de entulhos que servem de abrigo aos triatomíneos. Também pode-se

imaginar na eliminação natural destes exemplares, devido a redução da capacidade

de sobrevivência dos indivíduos resistentes. Baker et al. (2007) observaram

mudanças em parâmetros de desenvolvimento (fecundidade, sucesso nas mudas,

tempo de desenvolvimento de ovos, velocidade de deslocamento) em populações de

besouros de batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata) resistentes a

imidaclopride (neonicotinoide) ao longo de 6 anos de estudos. Os autores sugeriram

a ocorrência de mudanças dos genes que causam resistência ao longo do período

de estudo.

Redução de fitness em artropodos resistentes a inseticidas tem sido

descrita. Davey et al. (2006) descreveram uma linhagem de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus resistente a organofosfatos que apresentava uma redução na

produção de ovos quando comparada com uma linhagem suscetível. Li et al. (2007)

determinaram a redução do fitness em uma linhagem homogênea de Plutella

xylostella resistente a spinosad (classe de inseticidas derivados de

Saccharopolyspora spinosa, um actinomiceto). Neste trabalho os autores descrevem

redução de fitness da linhagem resistente em regimes de temperaturas naturais

extremas. Recentemente, Gassman et al. (2009) publicaram uma revisão sobre a

redução de fitness para insetos resistentes à toxina botulínica (Bti), e diversos outros

estudos demonstram que o caráter resistência pode influenciar na capacidade de

sobrevivência e reprodução dos artropodos que a possuem.

Page 64: toma infestans Triatoma brasiliensis

64

Infelizmente não tivemos acesso aos dados sobre este controle de T.

infestans no Rio Grande do Sul, e apenas podemos supor alguns fatos que

poderiam contribuir com a eliminação dos exemplares resistentes. Outro fato muito

importante para ser considerado é que este trabalho que define T. infestans com

resistência inicial a deltametrina (Vassena et al., 2000) não define a localidade ou

região de obtenção destes exemplares. Com isso as nossas amostras podem ser

completamente diferentes das utilizadas neste trabalho.

Embora os nossos achados sobre a suscetibilidade de T. infestans e T.

brasiliensis sejam muito importantes do ponto de vista do controle do vetor, não se

pode esquecer que eles são válidos apenas para as amostras estudadas e não

podem ser extrapolados para outras localidades ou populações destas espécies.

Neste raciocínio, e levando em consideração a proximidade do Rio Grande do Sul às

populações resistentes de T. infestans da Argentina e Bolívia, o monitoramento

destas populações é fundamental, como proposto por Rocha e Silva (1979), como

uma medida estratégica de controle e que jamais foi implementada no Brasil.

Atualmente existe uma perspectiva de implementação pela Coordenação Geral de

Laboratório de Saúde Pública (CGLAB/SVS/MS) de um grupo para monitoramento

da resistência/suscetibilidade de triatomíneos a inseticidas no Brasil (Marcos Obara,

SVS-MS, comunicação pessoal), o que permitirá: a) ampliar este estudo para outras

áreas de ocorrência de triatomíneos, bem como para outras espécies de importância

na epidemiologia da doença de Chagas, e b) estabelecer um mapa, com as áreas de

risco de resistência de triatomíneos brasileiros a inseticidas. Como foi observado por

Pessoa et al. (2007), T. sordida em Minas Gerais já apresenta resistência inicial a

deltametrina em cinco localidades do Estado. Neste trabalho os autores avaliaram

14 amostras desta espécie e observaram valores de RR em cinco das amostras

variando de 5,4 a 6,8, o que segundo a OPAS (2005) significa ocorrência de

resistência inicial. Este trabalho pode representar apenas uma parte da área de

ocorrência desta resistência em Triatoma sordida, e outras localidades deveriam ser

investigadas.

Para o programa de controle da doença de Chagas do Rio Grande do Sul, a

persistência do T. infestans é possivelmente devido às condições ambientais, com a

complexidade do ambiente peridoméstico onde é comum o encontro de grandes

anexos construídos principalmente de madeira, o que faz da borrifação de

inseticidas uma tarefa árdua e difícil. Tudo isso indica a necessidade de maior

atenção à atividade de borrifação e da implementação de ferramentas

Page 65: toma infestans Triatoma brasiliensis

65

complementares, tais como a reorganização do peridomicílio, com a limpeza e

higienização deste ambiente, e consequente eliminação dos possíveis refúgios aos

triatomíneos.

No Ceará, a ocorrência natural de T. brasiliensis e a constante invasão do

ambiente domiciliar já foi relatada por Diotaiuti et al. (2000) e os nossos dados só

vem contribuir com o melhor entendimento dessa dinâmica. A ausência de

resistência deste triatomíneo a piretróides não é um fator limitante para a ocorrência

constante no ambiente domiciliar. Diotaiuti et al. (2000) descreveram que o

peridomicílio é reinfestado três meses após aplicação de piretróides, apesar de que

o intradomicílio se mantêm seguro por longo período (mais de 6 meses). Outra

característica que dificulta o controle de T. brasiliensis é que o peridomicílio das

moradias nas zonas rurais deste Estado se confunde com o ambiente da caatinga:

fica difícil determinar, em muitos casos, onde acaba o ambiente doméstico e onde

começa o ambiente silvestre. Isso estreita ainda mais as proximidades das colônias

desta espécie ao ambiente doméstico e facilita assim as sucessivas reinvasões das

casas. Acreditamos que o controle de triatomíneos do Nordeste do Brasil deve ser

uma associação entre a aplicação de inseticidas de ação residual com melhorias do

ambiente peridomiciliar. As melhorias indicadas são: eliminação de entulhos,

afastamento dos criadouros de animais domésticos, como galinhas e bodes, das

paredes das unidades domiciliares, limpeza, eliminação de frestas nas paredes, o

que propicia criadouros para triatomíneos, e manutenção da vigilância

epidemiológica nas áreas onde ocorre a espécie (Diotaiuti, 2007).

6.2 Variabilidade genética de Triatoma infestans

Os estudos mais recentes sobre a variabilidade genética de populações de

T. infestans ao longo de sua distribuição geográfica, defininem que esta espécie

apresenta de baixos a moderados índices de variabilidade intra-populacional e

moderada a grande diferenciação inter-populacional (Garcia et al., 2003; Monteiro et

al., 1999; Pérez de Rosas et al., 2007; Pérez de Rosas et al., 2008; Schachter-

Broide et al., 2004). Os nossos resultados também indicam um perfil parecido,

contudo os valores de variabilidade genética se mostraram diferentes, de acordo

com o marcador utilizado. Os 10 loci de microssatélites se mostraram muito mais

variáveis que as sequencias do gene mitocondrial cytB (tabelas 5 e 9),

principalmente quando comparados os valores de diversidade de nucleotídeos e

diversidade genética média por loci ( n): enquanto o valor observado para este

Page 66: toma infestans Triatoma brasiliensis

66

parâmetro na população total foi de apenas 0,009 para o gene cytB, os loci de

microssatélites apresentaram um valor 69 vezes maior, 0,620. Apesar deste valor

elevado, nas análises dos loci separadamente foram observados desvios

significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg, ocasionados por excesso de

homozigotos, indicando que as populações analisadas apresentam uma

variabilidade genética intra-populacional baixa. Estes resultados reforçam o conceito

de que os microssatélites são extremamente sensíveis para revelar variações

intraespecíficas. Por outro lado, os valores para o gene cytB se mostraram mais

adequados para revelar diferenças genéticas entre as populações. Comparando os

resultados das AMOVAs e FST pareados, utilizando o gene cytB pode-se distinguir

cinco populações geneticamente distintas, com valores de FST indicando de

moderada a grande diferenciação inter-populacional, de acordo com as

interpretações de Wright (1978) já definidas anteriormente, enquanto que nesta

análise para os 10 loci de microssatélite os valores se mostraram muito menores,

com FST indicando de baixa a moderada diferenciação inter-populacional.

Estas diferenças de valores, e consequentemente interpretações distintas,

são importantes para mostrar a necessidade da utilização de mais de um marcador

molecular em estudos desta natureza, de maneira a possibilitar uma avaliação mais

ampla das amostras. Assim sendo o uso das sequencias do gene cytB se mostrou

mais adequado na avaliação da diferenciação genética interpopulacional, enquanto

que os loci de microssatélites foram mais adequados para a avaliação da

variabilidade genética intrapopulacional.

Analisando as populações de T. infestans separadamente, observamos que

a amostra de Yacuiba (Bolívia) apresentou os maiores valores de variabilidade

genética (tabela 5 e 9), corroborando com os conhecimentos anteriores sobre a

maior variabilidade nos T. infestans da Bolívia (Dujardin et al., 1998; Panzera et al.,

2004; Giordano et al., 2005). Apesar disso não foi possível estabelecer uma relação

direta entre variabilidade genética, dos marcadores empregados neste estudo, com

a resistência a deltametrina, pois os valores de resistência observados nas amostras

de Salvador Mazza e Yacuiba são muito elevados, comparados com os valores das

amostras de T. infestans do Brasil, e a variabilidade de todas as amostras estudadas

não é tão discrepante, com valores bem próximos uns dos outros. Acreditamos que

apenas o estudo sobre a variabilidade genética dos genes envolvidos diretamente

com o fenômeno da resistência (ex. canal de sódio, acetilcolinesterase,...) poderá

Page 67: toma infestans Triatoma brasiliensis

67

ser capaz de estabelecer tal relação, e poderá ser empregado como método de

diagnóstico ao nível molecular da resistência a inseticidas neste grupo de insetos.

A caracterização do gene do canal de sódio foi um dos nossos objetivos

iniciais nesse trabalho. Para isso utilizamos de iniciadores degenerados, criados

com base em alinhamentos do gene canal de sódio já descritos para outros grupos

de insetos, incluindo hemípteros pragas agrícolas (Martinez-Torres et al., 1999;

Morin et al., 2002). No início deste trabalho ainda não existia qualquer descrição de

sequencias deste gene para os triatomíneos e não foi possível utilizar iniciadores

mais específicos. Com o uso destes iniciadores degenerados tentamos, por meio de

RT-PCR, identificar e caracterizar o gene do canal de sódio em T. infestans. Após

sucessivas tentativas, utilizando as mais diversas ferramentas de biologia molecular,

tais como sequenciamento direto dos produtos de PCR, sequenciamento dos

produtos clonados, avaliação de diversas concentrações de RNAm, DNA,

plasmídeo, não conseguimos êxito neste objetivo.

Com a caracterização do gene do canal de sódio poderíamos investigar a

ocorrência de mutações pontuais que determinam a resistência a piretróides. Estas

mutações já foram descritas para diversas ordens de insetos e estão amplamente

revistas (Soderlund & Knipple, 2003; Hemingway et al., 2004). Os piretróides, bem

como DDT, agem nos canais de sódio, proteínas transmembrana, com peso

aproximado de 260 kDa, presente no sistema nervoso dos animais. Estas proteínas

possuem quatro domínios (I-IV), cada um consistindo de seis hélices transmembrana

(S1-S6) (figura 11) (Jamroz et al., 1998). Estes canais se encontram fechados

quando a célula está em repouso. Quando a célula está excitada, o canal de sódio

se abre permitindo a passagem deste elemento. Após aproximadamente um

milisegundo ocorre uma mudança conformacional no canal de sódio que bloqueia a

passagem de íons pela membrana. Quando o potencial da membrana retorna ao

nível de repouso, o canal se fecha. Os piretróides agem nos canais de sódio

modificando a cinética de entrada, promovendo assim um colapso do sistema

nervoso do inseto (Hemingway et al., 2004). Quando um inseto é intoxicado por

piretróide ele apresenta inicialmente uma intensa agitação, seguida por uma

paralisia geral. Em seguida os insetos retornam os movimentos após cerca de 10

min ou morrem. Estes efeitos são conhecidos como knockdown e letal,

respectivamente (Hervé, 1982). O intenso uso de DDT e piretróides tem levado ao

desenvolvimento de resistência conhecido como “knockdown resistance” (kdr) em

muitos grupos de insetos. Como esta resistência limita a efetividade dos piretróides,

Page 68: toma infestans Triatoma brasiliensis

68

sua ocorrência no campo compromete severamente o uso continuado deste

inseticida em controle de insetos (Soderlund & Knipple, 2003).

Figura 11: Esquema da proteína Canal de Sódio evidenciando os quatro domínios

constituídos cada um por seis hélices transmembrana. Os domínios se dobram para formar um poro

na membrana celular. Fonte: Soderlund e Knipple (2003).

A resistência kdr pode estar associada ou à super expressão das enzimas

de detoxificação, esterases e monooxigenases, que estão envolvidas no

metabolismo dos piretróides, ou à existência de mutações no gene do canal de

sódio. A atividade aumentada de esterases ou monooxigenases, como fator na

resistência a piretróides, foi observada em várias espécies de insetos, tais como

Anopheles gambiae, A. stephensi, A. subpictus, Culex quinquefasciatus, Helicoverpa

armigera, Pediculus capitis entre outras (Hemingway et al., 1991; Vulule et al., 1994;

Brogdon et al., 1997; Kasai et al., 1998; Vulule et al., 1999, Picollo et al., 2000 e

Kranthi et al., 2001). Quanto a resistência por sítio alvo, as mutações no gene do

Page 69: toma infestans Triatoma brasiliensis

69

canal de sódio mais freqüentes resultam na substituição de leucina por fenilalanina

no segmento 6 (S6) do domínio II, na posição 1014 da seqüência de aminoácidos.

Esta mutação já foi observada em A. gambiae, Blattella germanica, C. pipiens,

Hematobia irritans, Leptinotarsa decenlineata, Musca domestica, Myzus persica e

Plutella xylostella (Ingles et al., 1996; Dong, 1997; Guerrero et al., 1997; Martinez-

Torres et al., 1998; Lee et al., 1999; Martinez-Torres et al., 1999; Liu et al., 2000).

Duas outras substituições nesta mesma posição também conferem resistência ao

DDT e aos piretróides: uma substituição de leucina por histidina em Heliothis

virescens (Park & Taylor, 1997) e outra substituição de leucina por serina em C.

pipiens (Martinez-Torres et al., 1999).

No segmento 5 (S5) do domínio II também ocorrem mutações que

promovem resistência kdr. Em M. domestica, uma segunda mutação que resulta na

substituição de metionina por treonina na posição 918, associada com a mutação na

posição 1014, desenvolve uma resistência conhecida como super-kdr, que confere

uma resistência bem maior que a kdr (Ingles et al., 1996; Miyazaki et al., 1996). Uma

segunda substituição nesta mesma posição, metionina por valina, também foi

observada conferindo resistência kdr em Bemisia tabaci (Morim et al., 2002). Outras

mutações que conferem resistência kdr foram observadas em insetos, mas

geralmente restritas ao domínio II do canal de sódio (revisto por Soderlund e

Knipple, 2003).

Recentemente, fragmentos do gene canal de sódio foram identificados em

bibliotecas de cDNA de R. prolixus pelo grupo que está caracterizando o genoma

expresso desta espécie de triatomíneo (Glória Braz, UFRJ, comunicação pessoal), e

a utilização destas sequencias para o desenvolvimento de iniciadores mais

específicos para serem utilizados na caracterização deste gene em T. infestans,

poderá ser o ponto chave no sucesso deste trabalho.

Com a quase total eliminação do T. infestans do Brasil, é objeto do PCDCh a

vigilância para que esta espécie não seja reintroduzida, a partir dos focos que

persistem nos países vizinhos, ou que as populações demanescentes não voltem a

aumentar. Na perspectiva de determinação da origem de algum foco da espécie que

eventualmente seja encontrado no Brasil, a marcação genética de diferentes

populações de T. infestans poderá representar importante ferramenta da vigilância

epidemiológica. Por isso este trabalho também se ocupou em caracterizar as últimas

populações de T. infestans do Brasil, e também de populações da Bolívia e da

Argentina. Foram definidas as frequências e ocorrência de haplótipos do gene cytB e

Page 70: toma infestans Triatoma brasiliensis

70

alelos dos 10 loci de microssatélites nas amostras, o que indicou a existência de

marcadores em comum entre os três países e, o que torna essa análise mais

interessante, a existência de marcadores exclusivos para cada um deles (tabelas 7 e

11). Na análise do gene cytB foram observados diversos haplótipos deste gene

exclusivos das populações resistentes (Salvador Mazza e/ou Yacuiba), porém as

análises dos loci de microssatélite se mostraram mais promissoras uma vez que este

tipo de marcador apresenta variação no tamanho do produto amplificado por PCR,

sendo facilmente reproduzido para fins de diagnóstico. Em nossas análises foram

identificados 34 alelos de microssatélites exclusivos para as amostras resistentes de

T. infestans (tabela 11), oriundas de Salvador Mazza e Yacuiba. Entretanto, a

utilização destes como ferramenta de diagnóstico de insetos resistentes a piretróides

ainda não é possível, pois existe a necessidade da ampliação deste tipo de estudo

para outras populações resistentes e suscetíveis desta espécie. Com a ampliação

deste tipo de estudo, acreditamos que muitos destes alelos que nos nossos

resultados são exclusivos de um ou outro país, será encontrado em ambos os

países, e que também, com a redução deste número de alelos ocorrerá

consequentemente que os alelos exclusivos de cada país apresentará maior

confiabilidade quanto à especificidade.

Este é o primeiro estudo que tenta identificar e caracterizar ao nível

molecular amostras de T. infestans suscetíveis e resistentes a piretróides. Os nossos

resultados se apresentaram muito animadores e serão ampliados para a real

definição de um método de diagnóstico molecular capaz de identificar resistencia em

T. infestans a partir de um único exemplar. Uma outra e grande utilização desta

ferrementa será a identificação e definição de possíveis futuras novas

invasões/entradas de T. infestans no Brasil a partir de populações dos países

vizinhos, ou presença de focos residuais desta espécie em nosso páís. Esta

diferenciação tem grandes implicações na forma de controle, pois se é caracterizada

a entrada de T. infestans de países vizinhos deverão ser investigadas as formas de

invasão (ex. migrações humanas), e se for definido que os exemplares são de focos

residuais, deverão ser avaliadas as ferramentas atuais de controle (tipos de

inseticidas, formas de aplicação, cobertura das áreas,...). Tudo isso poderá auxiliar

grandemente as autoridades responsáveis pelo controle da doença de Chagas a

definir as melhores formas de eliminação destas populações.

Page 71: toma infestans Triatoma brasiliensis

71

6.3 Variabilidade genética de Triatoma brasiliensis

Quase todos os trabalhos abordando variabilidade genética de T. brasiliensis

estudaram a diferenciação genética existente entre as quatro formas cromáticas da

espécie (brasiliensis, macromelasoma, juazeiro e melanica), e pouco se conhece

sobre a variabilidade genética associada à suscetibilidade a inseticidas nesta

espécie.

Os resultados da AMOVA, interpretados segundo Wright (1978),

demonstram que as amostras de T. brasiliensis, aqui estudadas, compõem uma

única população genética (tabela 14) e este resultado vem corroborar com aqueles

sobre a suscetibilidade a deltametrina destas mesmas amostras (tabela 3) também

aqui demonstradas. Uma vez que esta espécie apresenta diversos focos silvestres,

que são fontes de novas invasões do ambiente doméstico, tal resultado já era

esperado, pois esta dinâmica de reinvasões contribui grandemente para a

distribuição dos caracteres destes indivíduos, reduzindo, assim, as diferenças

genéticas entre as localidades.

Apesar da pouca diferenciação genética entre as amostras de T. brasiliensis

estudadas, observamos a ocorrência de grande variabilidade genética em todas as

amostras (tabela 15), estando esta variação dentro da faixa de neutralidade (tabela

16). Neste ponto, se compararmos a variabilidade genética observada nas amostras

de T. infestans deste trabalho, com esta observada para T. brasiliensis, através da

análise da diversidade de nucleotídeos ( n) podemos verificar uma diferença

enorme, com as amostras de T. brasiliensis apresentando um valor, para este

parâmetro, 6,77 vezes maior que o observado para todas as amostras de T.

infestans (tabelas 5 e 15). Importante ressaltar que a amplitude geográfica das

amostras de T. brasiliensis, comparadas com as amostras de T. infestans, é mínima,

pois as localidades de obtenção dos exemplares estudados são vizinhas, e

pertencem todas elas pertencem a um mesmo município. Esta comparação é

importante para auxiliar o entendimento das variações genéticas entre populações

de uma espécie de triatomíneo nativa, como o T. brasiliensis, que apresenta seu

centro de endemismo no Nordeste brasileiro (Forattini, 1980). Estas características

ecológicas e genéticas contribuem grandemente para as dificuldades no controle

desta espécie de triatomíneo, até mesmo quando as populações não apresentam

resistência aos inseticidas rotineiramente utilizados.

Com a observação de vários haplótipos perdidos ao longo do network (figura

6) acreditamos que a variabilidade genética nas amostras do campo seja muito

Page 72: toma infestans Triatoma brasiliensis

72

maior que a observada aqui, uma vez que toda amostra colonizada sofre redução da

variabilidade genética.

A maior parte dos estudos de variabilidade genética envolvendo T.

brasiliensis teve o objetivo apenas de identificar a diferenciação entre as formas

cromáticas. Entre os poucos estudos que demonstraram variabilidade genética em

T. brasiliensis, Monteiro et al. (2004) observaram que a forma cromática brasiliensis

apresentava a maior variabilidade, e a forma melanica a menor. Entretanto, estes

resultados apresentam a limitação do uso de reduzidos números amostrais de

insetos para várias localidades, que variaram de dois a 24, com a maioria das

localidades estudadas não apresentando mais que cinco insetos. Com a

determinação das áreas de ocorrência das quatro formas cromáticas de T.

brasiliensis (Costa et al., 2002), podemos levantar a hipótese de que esta espécie

apresenta o seu centro de origem e dispersão no Estado de Pernambuco e

proximidades, uma vez que foram observadas, neste estado, três das formas

cromáticas de T. brasiliensis (Monteiro et al., 2004). Isto também poderia explicar a

menor variabilidade genética observada na forma melanica, encontrada no norte de

Minas Gerais, que é a forma cromática mais distante deste possível centro de

dispersão. A redução da variabilidade genética em populações distantes do centro

de dispersão é bem definida para o T. infestans, que apresenta seu centro de

dispersão na Bolívia (Schofield, 1988 apud Giordano et al., 2005; Bermudez et al.,

1993; Dujardin et al., 1998). Diversos estudos, envolvendo vários marcadores,

determinaram redução da variabilidade genética das populações não-andinas da

espécie (Dujardin et al., 1998; Schofield et al., 1999; Garcia et al., 2003; Bargues et

al., 2006), com conseqüente perda de DNA e material heterocromático (Panzera et

al., 2004). Apesar da menor área de distribuição do T. brasiliensis, quando

comparado com o T. infestans, a maior distância do centro de endemismo também

poderia ser o responsável por esta redução de variabilidade genética da forma

melanica desta espécie, a qual não é encontrada colonizando casas. A menor

capacidade de domiciliação, observada em populações desta espécie, já foi

relacionada com a distância do centro de endemismo por Borges et al. (1999) e

corrobora com a hipótese de que T. brasiliensis apresenta seu centro de endemismo

no estado de Pernambuco. Para chegar a uma conclusão sobre o centro de

endemismo do T. brasiliensis seria necessária a realização de um estudo utilizando

amostras de todos os Estados do Nordeste do Brasil, e norte de Minas Gerais,

através de análises dos marcadores rotineiramente usados para este fim. Estudos

Page 73: toma infestans Triatoma brasiliensis

73

abordando também os genes responsáveis por estas variações cromáticas (ex.

genes de melanina) nesta espécie precisam ser realizados, para determinar a real

existência de espécies crípticas que comporiam o então complexo T. brasiliensis. A

avaliação da resistência a inseticidas em outras populações desta espécie também é

imprescindível, o que poderá permitir uma melhor programação das ações de

controle deste triatomíneo.

Page 74: toma infestans Triatoma brasiliensis

74

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÕES

Através dos ensaios biológicos com o piretróide deltametrina as amostras

remanescentes de T. infestans do Rio Grande do Sul e as amostras de T.

brasiliensis do Ceará foram caracterizadas como suscetíveis a este inseticida;

A comparação dos valores de RR das amostras de T. infestans do Rio

Grande do Sul e Yacuiba (Departamento de Tarija) com os dados previamente

descritos na literatura, indica que o fenômeno da resistência pode variar

grandemente, se mostrando complexo;

O estudo da diferenciação genética de T. infestans demonstrou que as

amostras estudadas do Rio Grande do Sul compõem uma única população genética;

A análise das sequências do gene mitocondrial cytB e dos loci de

microssatélites demonstrou que as populações de T. infestans apresentam baixa

variabilidade genética intrapopulacional e de moderada a grande diferenciação

genética interpopulacional;

O uso de dois marcadores moleculares distintos, um “alvo” nuclear e um

“alvo” mitocondrial, nas análises de populações de T. infestans permitiu avaliar a

eficácia de cada um. Dessa forma, o gene mitocondrial citB se mostrou adequado

para avaliar a diferenciação genética interpopulacional, e os loci de microssatélites

de mostraram ideais para avaliar variabilidade genética intrapopulacional;

Os testes de neutralidade empregados nas análises de T. infestans

indicaram que as populações do Rio Grande do Sul e Salvador Mazza sofreram

expansão populacional recente;

Nas análises dos haplótipos do gene cytB foi observado um único haplótipo

compartilhado entre populações de T. infestans do Brasil, Argentina e Bolívia.

Devido a sua elevada frequência e distribuição, ele é o mais antigo dentre todos os

haplótipo observados;

As amostras de T. infestans de Yacuiba e Chuquisaca, ambas pertencentes

à Bolívia, não mostraram nenhum haplótipo do gene cytB em comum, e nenhum dos

haplótipos desse gene definidos para Chuquisaca foi encontrado no Brasil ou

Argentina;

Na análise dos loci de microssatélites foi observado elevado número de loci

polimórficos em todas as populações de T. infestans;

Page 75: toma infestans Triatoma brasiliensis

75

Todas as populações de T. infestans apresentaram desvios do equilíbrio de

Hardy-Weinberg em pelo menos um dos 10 loci de microssatélites analisados, os

quais foram promovidos por excesso de homozigotos;

Nas análises dos loci de microssatélite em T. infestans foram identificados

alelos exclusivos do Brasil (amostras suscetíveis a deltametrina) e alelos exclusivos

de Salvador Mazza e/ou Yacuiba (amostras resistentes a deltametrina). A ampliação

deste tipo de estudo permitirá definir um método de diagnóstico molecular para

avaliar resistência a piretróides por meio de PCR, além de determinar a origem dos

possíveis novos focos desta espécie no Brasil;

O estudo da diferenciação genética das amostras de T. brasiliensis do Ceará

demonstrou que estas amostras compõem uma única população genética;

Os valores de variabilidade genética de T. brasiliensis se mostraram altos, e,

quando comparados com os obtidos para as populações de T. infestans, foi possível

observar que populações nativas de triatomíneos apresentam variabilidade genética

muito maior que a observada para uma espécie domiciliada. Com esta observação

seria importante realizar estudos que comparem a variabilidade genética entre

exemplares de T. brasiliensis silvestres e domésticos;

As características ecológicas, genéticas e comportamentais do T.

brasiliensis contribuem grandemente para as dificuldades no seu controle, mesmo

quando as populações não apresentam resistência aos inseticidas utilizados.

Page 76: toma infestans Triatoma brasiliensis

76

8 ANEXO

Susceptibility of Triatoma infestans to deltamethrin in Rio Grande do Sul, Brazil

(Artigo aceito para publicação nas Memórias do Instituto Oswaldo Cruz)

Page 77: toma infestans Triatoma brasiliensis

77

Running title: T. infestans susceptible to deltamethrin

Title: Susceptibility of Triatoma infestans to deltamethrin in Rio Grande do Sul, Brazil

Author’s Names: Ivan Vieira Sonoda1, Grasiele Caldas D’Ávila Pessoa1, Mirko

Rojas Cortez2, João Carlos Pinto Dias1, Alvaro José Romanha1, Liléia Diotaiuti1

Institutional affiliations: 1. Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença

de Chagas, Centro de Pesquisas René Rachou / FIOCRUZ. Av. Augusto de Lima,

1715, Barro Preto, Belo Horizonte – MG, Brazil. ZIP: 30190-002. 2. Programa

Nacional de Chagas – Ministerio de Salud y Deportes - Bolivia.

Sumary: The strategies to control Chagas disease are based on the spraying

infested houses with pyrethroid insecticides. However the intense use of these

insecticides has promoted resistance of Triatoma infestans in Argentine, Bolivia and

in the South Brazil the species were reported with low levels of resistance. Due to the

persistence of T. infestans in the state of Rio Grande do Sul (RS), we evaluated the

occurrence of deltamethrin resistance on four different municipalities, in comparison

with two Brazilian susceptible strains and one resistant from Bolivia. The results

indicated the absence of resistance on T. infestans from RS.

Key Words: Triatoma infestans, Pyrethroid Resistance, Chagas Disease.

Sponsorships: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

(FAPEMIG), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Bayer CropScience.

Strategies to control Chagas disease are based principally on the interruption

of the vectorial transmission. In Brazil, the control program reached their operational

peak in the 1980s (Vinhaes & Dias 2000). From 1986 onwards the activities suffered

a reduction due to the rise in epidemics of dengue, although it continued to spray

infested residences throughout the country. In 1991, taking part in the Southern Cone

Initiative, an effort of the Ministries of Health of Argentine, Brazil, Bolivia, Chile,

Paraguay and Uruguay, the Chagas Disease Control Program (PCDCH) began to

prioritize areas where Triatoma infestans occurred, implanting epidemiological

vigilance in those where vectorial transmission was already being controlled (Dias et

al. 2002).

Page 78: toma infestans Triatoma brasiliensis

78

The efficacy of residual insecticides to combat triatomines was demonstrated

for the first time in the late 1940s (Dias & Pellegrino 1948), based on applications of

hexachlorobenzene (HCB). Once this compound became readily available it was

possible to elaborate large-scale control programs. These were highly successful,

interruption of vectorial transmission of Chagas disease being obtained over wide

geographical areas. Agricultural use of HCB was however prohibited in the mid-

1980s due to its high environmental toxicity, precluding further commercial

production. Fortunately, by this time, the efficacy of several pyrethroids against

triatomines had been proved and these insecticides began to be used routinely by

the PCDCH (Diotaiuti et al. 1994; Dias 2002).

Few studies have been carried out on insecticide resistance in triatomines. The

first report came from Venezuela in the 1970s, in areas where Rhodnius prolixus was

regularly treated with HCB (Rocha & Silva 1979). The first evidence of resistance to

synthetic pyrethroids was obtained by the Centro de Investigaciones de Plagas e

Insecticidas (CIPEIN) in Buenos Aires in the 1990s (Vassena et al. 2000). In this

pioneer study R. prolixus from Venezuela and T. infestans from the Brazilian state of

Rio Grande do Sul (RS) were studied and the authors found resistance ratio (RR)

values characteristic of populations already possessing initial resistance. R. prolixus

presented the highest values (RR = 12.4 for cypermethrin and 11.4 for deltamethrin)

and T. infestans the lowest (RR = 7.0 for deltamethrin), although the precise origin of

the latter specimens was not specified.

In this study we investigated deltamethrin resistance in specimens of T.

infestans from different municipalities of the northeastern RS (Figure 1): Doutor

Maurício Cardoso (27º30'21"S; 54º21'39"W), Guarani das Missões (28º08'27"S;

54º33'29"W), Mato Queimado (28º15'21"S; 54º36'57"W) and Três de Maio

(27º46'24"S; 54º14'24"W). These municipalities lie within an area including many

residual foci remaining after successive sprayings with pyrethroids (Dias 2002). The

difficulty of eliminating T. infestans from this state was not defined, if due to the

operational difficulties of achieving insecticide coverage in the areas being treated

(comprising ranches with very large, complex constructions) or to the fact that

triatomines are truly resistant to insecticides. The following numbers of T. infestans

specimens were obtained from each municipality: Doutor Maurício Cardoso (five

adults and seven NV), Guarani das Missões (12 adults and eight NV); Mato

Queimado (11 adults and 17 NV) and Três de Maio (nine adults and five NV). All

Page 79: toma infestans Triatoma brasiliensis

79

these samples were reared in the laboratory and the bioassays realized with the

second generation from these colonies.

We selected two populations of T. infestans from the Brazilian states of Minas

Gerais (Montes Claros) and Goiás, maintained in the laboratory for more than 10

generations, as susceptibility reference strains. Insects from the municipality of

Yacuiba, Bolivia, were used as a resistant reference strain, pyrethroid resistance

already having been described for this region (Toloza et al. 2008)

Bioassays consisted of the application of 0.5 L deltamethrin solution to the

dorsal regions of fasted first-instar nymphs aged five days old using a Hamilton

microsyringe provided with a 50-repetition dispenser. WHO protocol (WHO, 1994)

suggests the use of 0.2 L of the solutions, but the present protocol was adapted to

apply a biggest volume to avoid alterations of concentrations promoted by

evaporation. Deltamethrin (99.7% purity; Bayer) was diluted into serial concentrations

(from 0.02 ng/ L to 4.0 ng/ L, when used for RS and susceptible samples, and from

2.0 ng/ L to 640.0 ng/ L when used for resistant sample) which were used to

produce mortality curves for each sample. A control group was set up for each

sample, treated with acetone only. Thirty nymphs were used for bioassays of each

insecticide concentration.

After application of the insecticide, treated nymphs were maintained under

controlled conditions of temperature (24oC 2oC) and relative humidity (75% 5%).

Mortality of the nymphs was evaluated 72 h after application of the insecticide.

Nymphs were characterized according to locomotory capacity as normal (without

alterations), intoxicated (with slight alterations) or knocked down (with marked

alterations or immobile).

Mortality data from the bioassays were subjected to probit analysis to calculate

the 50% and 99% lethal doses (LD50 and LD99) and slope of the straight line in the

graph (which indicates homogeneity of the population) for triatomine samples from

each locality or strain evaluated. All normal nymphs were grouped as alive, while

intoxicated and knocked-down specimens were classed as dead. The Probit Analysis

program (Raymond 1985) was used at this stage of the study. The LD50 and LD99

values were subsequently arranged in tables and the RR for both lethal doses

calculated from the ratios of these parameters in samples of field/laboratory strains

(RR = LDfield/LDlaboratory).

Laboratory strains from Minas Gerais and Goiás were selected as being

susceptible to deltamethrin since they had already passed through more than 10

Page 80: toma infestans Triatoma brasiliensis

80

generations free of contact with any insecticide, the criterion defined by WHO (1994).

The LD50 of the Minas Gerais strain was lower at 0.36 ng/nymph and it was thus

selected to calculate the RR values of the other samples. The LD99 of this strain was

2.68 ng/nymph and the slope 2.09 (Table 1). The Goiás strain presented an LD50

value of 0.42 ng/nymph, LD99 of 3.33 ng/nymph and slope of 2.68. The RRs of this

strain for LD50 and LD99 were 1.17 and 1.24 respectively. No locomotory alterations

were noted in the control groups.

The LD50 of the RS samples varied from 0.26-0.67 ng/nymph, the LD99 from

3.42-4.90 ng/nymph and the slopes from 1.35-1.99 (Table 1). Based on the LD

values it was possible to calculate the RR for these samples; those for the LD50

varied from 0.72-1.86 and for the LD99 from 1.28-1.83 (Table 2).

According to WHO (1994) RR values < 5 indicate susceptibility. Thus the RS

samples of T. infestans studied here can be classified as highly susceptible to

deltamethrin, contrary to expectations. Although these findings are very important

from the point of view of vector control, it should not be forgotten that they are only

valid for the samples studied and cannot be extrapolated to other localities or

populations of this species.

As shown in Table 2, the RR values for Yacuiba confirm that this Bolivian

sample is resistant to deltamethrin, like described elsewhere (Orihuela et al. 2008;

Toloza et al. 2008). This resistance has a large variation in Bolivia, where values for

the RR of the LD50 in T. infestans vary from 17.38 (Mataral) to 154.4 (Yacuiba). The

difference among the present results and the previously published should be due to

methodological differences (use of 0.5 L of insecticide solution, and not 0.2 L).

Nevertheless, as RR is a ratio between two values, the proportions were maintained.

Thus the values encountered in the present study for Yacuiba are in accordance with

the idea that the phenomenon of insecticide resistance does not extend

homogeneously over wide areas and may assume localized characteristics.

The RS populations studied here probably originated from different localities to

those investigated by Vassena et al. (2000), which would explain the discrepancies

between the results of the two studies. On the other hand, the “resistance” character

of these populations could also have been eliminated over the years that separate

the two sampling periods. In this way, and taking into account the proximity of RS to

the resistant populations in Argentina and Bolivia, monitoring of these residual

populations is fundamental, as proposed by Rocha & Silva (1979) as a strategic

control measure without ever having been implemented. For RS control program, the

Page 81: toma infestans Triatoma brasiliensis

81

T. infestans persistence possible is due to environment conditions, like observed in

La Rioja, Argentine (Porcasi et al. 2007), indicating the implementation of

complementary tools, like the reorganization of the peridomicile and elimination of its

refuges.

Acknowledgements

The authors thank Celia Lammerhirt, Secretary of Health – RS, for providing T.

infestans captured in that state and Bayer CropScience for providing the deltamethrin

insecticide used in the bioassays.

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Tables

Table I: LD50, LD99 and slope of Triatoma infestans samples and strains.

Triatoma infestans LD50 CL 95% LD99 CL 95% Slope CL 95% Montes Claros 0.36 0.241 0.410 2.68 2.050 3.699 2.09 ± 0.33

Goiás 0.42 0.321 0.515 3.33 2.872 4.263 2.68 ± 0.47 Mato Queimado 0.53 0.354 0.710 3.42 2.766 5.778 1.80 ± 0.38

Guarani das Missões 0.35 0.240 0.548 4.00 3.511 4.982 1.35 ± 0.22 Três de Maio 0.67 0.520 0.925 4.90 4.201 6.025 1.99 ± 0.31

Doutor Maurício Cardoso 0.26 0.199 0.356 4.21 3.877 4.866 1.93 ± 0.28 Yacuiba 10.84 7.706 14.635 366.62 182.645 1.128.377 1.52 ± 0.19

Lethal doses (LD) correspond to amounts of deltamethrin/treated nymph (ng/tn).

Table II: Resistance ratios (RR) of the LD50 and LD99 of Triatoma infestans

samples and strains

Triatoma infestans RR (LD50) RR (LD99) Goiás 1.17 1.24

Mato Queimado 1.47 1.28 Guarani das Missões 0.97 1.49

Três de Maio 1.86 1.83 Doutor Maurício Cardoso 0.72 1.57

Yacuiba 30.11 136.80

Figure legend

Figure 1: Map of the Brazilian state of Rio Grande do Sul showing localities

from which Triatoma infestans specimens were obtained: 1 - Doutor Maurício

Cardoso (27º30'21"S; 54º21'39"W), 2 - Três de Maio (27º46'24"S; 54º14'24"W), 3 -

Guarani das Missões (28º08'27"S; 54º33'29"W) and 4 - Mato Queimado (28º15'21"S;

54º36'57"W). Source: IBGE (www.ibge.gov.br/mapas_ibge/pol.php).

Page 83: toma infestans Triatoma brasiliensis

83

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