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Touchdown
RACE
SSCP Everton Bettin
Cristiano Tavares
Touchdown
PCR
Etapas da Apresentação
1. Introdução
2. Anelamento dos Primers e a Tm
3. TD PCR e seus objetivos
4. Artigos
5. Vantagens e Desvantagens do TD PCR
6. Conclusão
Introdução
A técnica de Touchdown PCR consiste
em uma alteração no processo da PCR.
Sem a necessidade de alterações nos
componentes da reação.
Modifica a Temperatura de anelamento
dos primers.
Ciclos da PCR tradicional
Programa
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
35 ciclos
PCR CICLOS
Anelamento dos primers
Estipulada normalmente como sendo:
Entre 50ºC e 65ºC
~5ºC abaixo do Tm (melting temperature)
Melting Temperature (Tm)
Temperatura em que cada metade da
fita dupla de DNA dos primers é
dissociada se tornando uma fita simples
Interferência direta sobre o resultado da
técnica.
Temperatura de Anelamento
“T” mais altas (65ºC) “T” mais baixas (50ºC)
Alta Especificidade Alto Rendimento
Baixo Rendimento Baixa Especificidade
Touchdown PCR
Objetiva a produção de amplificações
específicas e com um bom rendimento
através da variação na temperatura de
anelamento á cada ciclo.
Inicialmente utiliza-se uma temperatura de anelamento maior que Tm
A temperatura de anelamento cai 0,5ºC/ 1ºC a cada ciclo. (ou a cada 2 ciclos)
Se mantem estável à uma temperatura pouco abaixo de Tm durante o resto os demais ciclos.
Techne thermal Cyclers Protocol
1. Open the 3 STEP PCR TEMPLATE and touch EDIT.
2. Adjust the default parameters as required and set the number of cycles for the amplification stage.
3. Touch the first segment of the amplification stage to edit the required denaturation temperature and hold time.
4. Touch the second, annealing, segment to edit the decrement temperatures for the annealing step. Do this as
follows:
a. Touch the Inc/Dec button.
b. On the top line where it says ‘First’, enter the starting annealing temperature, 5 to 10ºC higher
than the Tm of the primers. Next, enter the hold time.
c. On the next line where it says ‘Last’, enter the final annealing temperature, 2 to 5ºC lower than
the Tm of the primers. Next, enter the hold time. Touch OK to accept.
5. Touch the third segment to edit the temperature and hold time for the extension step.
6. Edit the remaining defaults as required.
7. Touch ‘Save As’ to save and give the program a name
Temperaturas iniciais mais altas amplificam
apenas fragmentos específicos.
Quando temperaturas mais baixas são
utilizadas, existem muito mais fragmentos
corretos, logo este serão amplificados em
maior escala em relação a fragmentos não
desejados.
Vantagens
94ºC por 3 min
94ºC por 1 min
xxºC por 2 min
72ºC por 3 min
72ºC por 7 min
4ºC
Hot Start (add Taq P. at 80ºC)
x Ciclos
Vantagens
Permite a produção de fragmentos de
alta especificidade, possuindo mesmo
assim, alto rendimento do produto final.
Vantagens
Melhora no resultado do produto sem a
necessidade de alterar os componentes
da reação (Mg, tampão e etc.),
podendo até mesmo compensar o fato
de não existir quantidades perfeitas
destes componentes.
Vantagens
Pode ser utilizado rotineiramente, não
precisando ser encarado apenas como
uma técnica de optimização.
Útil em amostras de difícil amplificação
Objetivo
Materiais e métodos
Retirada de amostras de muco nasal e
leite.
Isolamento e Cultura em meio sólido
Extração de DNA
PCR
Primers
Protocolo PCR convencional TD PCR
96ºC por 3 min 96ºC por 3 min
96ºC por 1 min 96ºC por 1min
65ºC por 1min 72-65ºC por 1min
72ºC por 1 min 72ºC por 1min
96ºC por 1min
65ºC por 1min 72ºC por 1min
72ºC por 8 min 72ºC por 8 min
8x
30x
30x ou
38x
Resultados
Determination of
the PCR sensitivity
using DNA in water
Desvantagens
Muitas vezes não se faz necessário.
Necessidade de alteração dos
programas já estabelecidos nos
termocicladores.
Concluindo...
TD PCR mostra-se útil na necessidade de
produtos mais “puros”, bem como, na
identificação da presença de fragmentos
de difícil amplificação nas amostras.
Técnica fácil, sem necessidade de
aditivos ou técnicas adicionais.
RACE PCR
Etapas da Apresentaçao
Introdução
3’ RACE
5’ RACE
Artigos (vantagens e desvantagens)
Rapid Amplification of cDNA
Ends
Procedimento de amplificação de uma sequencia de acido nucleico, compreendida entre um local específico e a terminação (3’ ou 5’) de um mRNA
Permite a amplificação de um segmento inteiro de DNA complementar.
Também chamado de:
one-sided PCR e Anchored PCR
Necessita de alteração nos componentes da reação.
Necessita de procedimentos adicionais.
Necessita apenas de um primer específico
Dividido em RACE 3’ e RACE 5’
Race 3’
Se utiliza da cauda de Poli A como um
sítio inicial de ligação.
Component Amount
10X PCR buffer [200 mM Tris-HCl (pH 8.4), 500 mM KCl]
500 μl
25 mM MgCl2 500 μl
10 mM dNTP mix (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
100 μl
0.1 M DTT 100 μl
SuperScript™ II Reverse Transcriptase (RT, 200 units/μl) 20 μl
adapter primer (AP, 10 μM) 20 μl
universal amplification primer (UAP, 10 μM) 20 μl
abridged universal amplification primer (AUAP, 10 μM)
20 μl
E. coli RNase H (2 units/μl) 20 μl
DEPC-treated water 1.2 ml
control RNA (50 ng/μl) 10 μl
control gene-specific primer (GSP, 10 μM) 20 μl
Sintese da fita de cDNA
A sintese da primeira fita de cDNA é catalizada por uma Transcriptase Reversa (RT)
É utilizado um “Adapter Primer” (Poli T)
Esta enzima tem atuação ideal à ~50ºC
No fim da etapa utiliza-se uma RNAse.
Amplificação do cDNA alvo
Utiliza-se 2 primers e a Taq DNA
Polimerase
Primer 1) Gene Specific Primer (GSP)
Único primer específico utilizado !!
Primer 2) Universal Adapter Primer
5’ RACE PCR
Envolve 3 passos:
Transcriptase Reversa
Adição da Cauda Homopolimérica
PCR
Síntese da fita de cDNA
Não possui cauda de poli A
A síntese se inicia através da utilização do
primer: Gene Specific Primer (GSP1)
Purificação da Fita: Remoção dos
oligonucleotides e do GSP1
Adição da Cauda
Homopolimérica
Utilização da enzima “Terminal
Desoxinucleotideo Transferase”
Amplificação do cDNA alvo
Taq DNA Polimerase
Gene Specific Primer (GSP2)
Anchor Primer (ligação à cauda
homopolimérica)
1
Polimorfismo de conformação de fita
simples (Single-Strand Conformation
Polymorphism SSCP)
SSCP-PCR
Usada para detectar mutações
em uma sequência especifica
de DNA
AMPLIFICAÇÃO DO DNA
DESNATURAÇÃO
ANALISE EM ELETROFORESE
A SSCP- PCR PODE SER DIVIDIDA EM
TRÊS ETAPAS:
Nessa etapa, a sequência especifica de DNA em
que pretende-se verificar a presença de mutações, juntamente com DNA de controle ( sem mutação), é amplificada usando a técnica de PCR convencional.
O tamanho do fragmento a ser amplificado deve
ter entre 150-300 pb.
Quanto maior o fragmento, menor a sensibilidade da técnica.
AMPLIFICAÇÃO DO DNA
AMPLIFICAÇÃO DO DNA
A desnaturação deve ocorrer por
incubação à 95ºc de 5-7 minutos.
Imediatamente após a desnaturação, as
amostras devem ser resfriadas em gelo
por 10 minutos. Isso evita que as fitas
voltem a reanelarem-se.
DESNATURAÇÃO
Deve ser feita em gel de poliacrilamida não desnaturante (baixa temperatura).
A presença de uma única base nitrogenada diferente do DNA de controle, faz com que o fragmento adquira uma conformação diferente afetando sua mobilidade no gel.
Se o fragmento suspeito de ter mutação tiver uma diferente mobilidade do DNA de controle na corrida em gel, indica a presença de mutação.
ANALISE EM ELETROFORESE
C- CONTROLE ;
1,2,4,6- SEM MUTAÇÃO;
3,5- APRESENTARAM MUTAÇÃO
ANALISE EM ELETROFORESE
RESUMO
VANTAGENS
Possibilidade de procurar por mutações
em uma região especifica do DNA
usando primers que abrangem essa
região.
A técnica é simples rápida e barata.
A técnica SSCP só mostra que uma
mutação existe. Para identificar qual
mutação é necessário fazer um
sequenciamento do DNA.
DESVANTAGENS
GIBCO. 5´ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0
ROUX, Kenneth. (2002) Single step PCR optimization using Touchdown and Stepdown PCR programming.
ROUX, Kenneth. (1996) High and Low Annealing Temperatures Increase
Both Specificity and Yield in Touchdown and
Stepdown PCR
SAMBROOK, RUSSEL ( 2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Touchdown PCR: using the decrement temperature
programming feature of Techne thermal cyclers. Em: www.bibby-scientific.com
Zumárraga, M. et al. (2005) Use of touch-down polymerase chain reaction to enhance the sensitivity of Mycobacterium bovis detection
Referências
DÚVIDAS ?
OBRIGADO!
.
Touchdown – PCR, Race – PCR e
SSCP - PCR
Integrantes:
Alex Pereira Rodrigues
Rafael Lopes da Rosa
O que é PCR? Consiste em fazer cópias de DNA
“in vitro”, usando os elementos
básicos do processo de replicação
natural do DNA ou cDNA.
Dividido em 3 partes: • Denaturação das cadeias
• Anelamento dos Primers ou
iniciadores • Polimerização das novas cadeias
complementares pela ação da
enzima Taq polimerase
Touchdown – PCR(TD-PCR)
TD-PCR é uma modificação de PCR em que a temperatura de recozimento inicial é mais elevada do que a T°m ótima dos iniciadores e é gradualmente reduzido ao longo dos ciclos subsequentes até que a temperatura T°m ou "temperatura de touchdown" é alcançado
Porque Touchdown?
O passo a passo
Pesquisa
Prímers
T°m
Leitura em gel de agarose
Protocolo
Anelamento
Ciclos
Onde :
x = temperatura(T°)
t = tempo
1ªFase: Queda Gradual
de T°C
2ªFase: PCR Genérico
Vantagens e
Desvantagens
Não necessita de redesenho dos prímers
Muito mais específico que a técnica
convencional de PCR
Especificidade, Sensibilidade e
rendimento
Os primers evitam a amplificação de
sequências não-específicas
Vantagens e
Desvantagens
Este método é eficaz para a
amplificação de apenas um
ou poucos genes transcritos em um
momento.
Surgimento de bases auto-
complementares
Artigos
Artigos
Artigos
Referências
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/187728
72
http://bitesizebio.com/articles/touchdown-
pcr-a-primer-and-some-tips/
http://www.princeton.edu/genomics/mcclea
n/protocols/Touchdown-PCR-Protocol.pdf
http://www.ufpel.edu.br/cic/2011/anais/pdf/
CS/CS_00756.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/230185
05
(Sistema de amplificação rápida
das extremidades de cDNA)
RACE - PCR
RACE - PCR •Variante do RT – PCR
•A técnica de RACE facilita o isolamento de
sequências das extremidades 5’ e 3’ dos cDNAs,
permitindo obter cDNAs completos.
• Sequencia âncora e Primer senso ou anti-senso
• 2 protocolos: 3’ RACE PCR e 5’RACE PCR
Protocolo Invitrogen
3’RACE E 5’RACE
•Protocolo 3’ RACE – PCR
Utiliza um Primer Anti-senso com uma sequência de extensão 5’ específica (15 nucleotídeos).
Um primer-senso interno é usado para gerar uma segunda fita curta em uma sequência complementar à sequência ancora original.
Após essas etapas, a PCR ocorre da maneira “tradicional”.
AAAA
AAAA
Oligo
dT
TTTTTTT
TT
Primer
sense
•Protocolo 3’ RACE – PCR
Protocolo 3’ RACE - PCR
1. First strand cDNA synthesis: - Reaction set up (total volume 20 ul) cDNA synthesis buffer 4 ul dNTP mixture 2 ul oligo-dT anchor primer 1 ul total RNA 1 ul AMV reverse transcriptase 1 ul RNasin (RNase inhibitor) 0.5 ul 0.1M DTT 1 ul ddH2O 9.5 ul - Spin down briefly and incubate at 55 C for 1 hour. - Stop reaction: 65 C for 10 min. - Briefly spin down reaction mixture.
• 2. RACE PCR amplification of cDNA:
- Reaction set up (total volume 50 ul) cDNA 1 ul PCR anchor primer 1 ul gene specific primer 1 ul dNTP mixture 1 ul Taq polymerase 0.5 ul 10x PCR reaction buffer 5 ul ddH2O 40.5 ul For negative control: no cDNA template, add 41.5 ul ddH2O. - Mix well and spin down briefly. - PCR amplification. - Perform PCR products analysis on 1.5% agarose gel.
• Um primer anti-senso interno é utilizado na síntese primária de um cDNA a partir de um mRNA molde.
• Uma cauda Poly-A é adicionada a extremidade 3’ do cDNA(transferase terminal)
• A síntese da segunda fita é preparada através de um primer-senso com sua sequência âncora.
•Protocolo 5’ RACE – PCR
GGGG
Primer
Âncor
a
CCCC
C
Primer
anti-
sense
• Protocolo 5’ RACE - PCR
1. First strand cDNA synthesis: - Reaction set up (total volume 20 ul) cDNA synthesis buffer 4 ul dNTP mixture 2 ul gene specific primer 1 1 ul total RNA 1 ul AMV reverse transcriptase 1 ul RNasin (RNase inhibitor) 0.5 ul 0.1M DTT 1 ul ddH2O 9.5 ul - Mix well and spin down briefly. - Incubate at 55 C for 1 hour. - Heat termination of reaction at 65 C for 10 min. - Spin down briefly.
2. Purification of cDNA using PCR product purification column of your choice.
3. Tailing reaction of cDNA: - Reaction set up (total volume 24 ul): Purified cDNA products 19 ul 10x reaction buffer 2.5 ul 2 mM dATP 2.5 ul - Incubate at 94ºC for 3 min. - Stand on ice for 1 hour. - Spin down briefly and add 1 ul of terminal transferase (10 unit/ul). - Mix and incubate at 37ºC for 20 min. - Incubate at 70ºC for 10 min to inactivate the terminal transferase enzyme. - Spin down and place reaction tube on ice.
4. PCR amplification of dA-tailed cDNA: - Reaction set up (total volume 50 ul)
dA-tailed cDNA 5 ul oligo-dT anchor primer 1 ul gene specific primer 2 1 ul dNTP mixture 1 ul Taq polymerase 0.5 ul 10x PCR reaction buffer 5 ul ddH2O 36.5 ul Negative control: add water 41.5ul without adding dA-tailed cDNA - Mix well and spin down briefly. - Start PCR
5. 5' nested PCR using gene specific primer 3:
- Dilute 1000 times of the first PCR products for nested PCR. - PCR reaction set up (total volume 50 ul) Diluted PCR products 1 ul PCR anchor primer 1 ul gene specific primer 3 1 ul dNTP mixture 1 ul Taq polymerase 0.5 ul 10x PCR reaction buffer 5 ul ddH2O 40.5 ul Negative control: no diluted PCR products.
Aplicações:
- Estudo completo do transcriptoma;
- Pode gerar cDNAs completos
- Amplificação e clonagem de mRNAs raros
- Análise direta de variações de expressão mediante
mutações nas regiões terminais;
- Estudo de regiões gênicas variáveis;
- Pode trabalhar com regiões desconhecidas;
Artigos e trabalhos
Caracterização dos transcritos de
UL144 citomegalovírus humano
Objetivo geral:
Caracterização dos transcritos de UL144 citomegalovírus humano
Etapas:
- RNA total foi extraído a partir de
células não infectadas e helf HCMV
infectadas
- Foi feito um RT – PCR no mRNA do
gen U144.
- 5'-RACE-PCR foi realizada utilizando
os iniciadores específicos do gene de
144Rev1 e 144Rev2.
- Eletroforese em gel 1,5% de agarose para confirmação.
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E
RELAÇÃO FILOGENÉTICA DO
GENOMA COMPLETO DOS ARBOVÍRUS
BUSSUQUARA, IGUAPE, ILHÉUS
E ROCIO (FAMÍLIA FLAVIVIRIDAE, GÊNERO
FLAVIVIRUS)
DANIELE BARBOSA DE ALMEIDA
MEDEIROS
Objetivo Geral
- Realizar a caracterização molecular do
genoma completo dos flavivírus
brasileiros, Bussuquara, Iguape, Ilhéus
e Rocio,
Etapas:
- O mRNA do flavirovíros extraido e
realizada uma RT – PCR.
- O cDNA foi aplificado utilizando o os
protocolos 5’RACE e 3’RACE PCR.
Referencias: http://www.ufpel.edu.br/cic/2011/anai
s/pdf/CA/CA_00562.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/arti
cles/PMC3141681/#B9
http://www2.iq.usp.br/docente/goldb
erg/veterinaria2006/Aula_PCRvet_2006.
SSCP-PCR
(Single Strand Conformation
Polymorfism)
É definida como uma técnica de diferenciação de
filamentos únicos de DNA de comprimentos idênticos.
Essa propriedade permite distinguir o polimorfismo nas
sequências, por meio de eletroforese.
Como funciona a técnica?
Extração
Amplificação
Corrida em gel de poliacrilamida
Leitura do Gel
Resultados e Discussões
Amplificação
Extração e Purificação
PCR normal acoplado com uma corrida
em gel de poliacrilamida
Marcação das sequências de interesse
T°C
Eletroforese
Gel – Glicerol
- Retirar os géis do sistema de
preparação e montá-los no sistema
de eletroforese.
- Desnaturar as amostras a 950C
durante 10 min.
- Colocar as amostras rapidamente em gelo durante pelo menos 1 minuto
antes de iniciar o carregamento do
gel. - Manter as amostras em gelo e
Leitura do Gel
Resultados e Discussões
Mutação
Heterozigoto e homozigoto
Considerações
T°C
Glicerol
Tamanho da amostra
Artigos
Artigos
Artigos
Referências
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Parker/method.html
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-54052011000300002&script=sci_arttext
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962006000500005
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3537474/
