Universidade Tecnológica Federal do ParanáDepartamento Acadêmico de Química e Biologia

TOXICOLOGIA: TOXICOLOGIA: ASPECTOS GERAIS DE TOXICOCINÉTICAASPECTOS GERAIS DE TOXICOCINÉTICA

Profa. Lucia Regina R. Martins

TOXICOCINÉTICA:TOXICOCINÉTICA:

� estuda a relação entre a quantidade de um agente tóxico que entra em

contato com um organismo e sua concentração plasmática/tecidual.

�diretamente relacionada aos processos: absorção, distribuição,

biotransformação e excreção em função do tempo

Composto Químico

via de exposição

absorção toxicante livre

toxicante ligado

Biotransformação

metabólitos

excreçãosangue

local de açãoligado livre

tecidos de depósito

via de exposição

sítio de

entrada

TOXICOCINÉTICA:TOXICOCINÉTICA:

� efeito tóxico: normalmente proporcional à concentração do toxicante no

sítio de ação (= tecido-alvo)

� determinação in situ seria ideal

� na prática: usam-se concentrações no sangue/plasma (em constante

comunicação com tecidos-alvo)comunicação com tecidos-alvo)

� O movimento de toxicantes no organismo depende de sua capacidade de

atravessar as membranas biológicas.

Estrutura de Membranas Celulares:� espessura: 7 – 9 nm

� dupla camada de fosfolipídeos (interior hidrofóbico)

� proteínas: - integrais (transmembrana ou não; passagem única/múltipla )

- periféricas

� glicolipídeos e glicoproteínas (mecanismos de reconhecimento/sinalização)

Mecanismos de Permeabilidade de Toxicantes em Membranas Biológicas:

� qual será utilizado? depende das propriedades físico-químicas

1 – Transporte Passivo:

� sem consumo de energia

� a favor do gradiente de concentração

� processos: difusão lipídica, filtração e difusão facilitada

� Difusão Lipídica:� Difusão Lipídica:

� fatores: tamanho molecular e solubilidade

eletrólitos fracos: forma ionizada fracamente lipossolúvel

� permeabilidade depende do pKa e pH do meio

Henderson-Hasselbach: ácidos fracos

pKa – pH = log [forma não-ionizada]

[forma ionizada]

� Eletrólitos Fracos: importância do pH e pKa

�moléculas não-ionizadas são facilmente absorvidas por difusão

� ácidos fracos: maior permeabilidade em pH ácido

� bases fracas: maior em pH alcalino

Mecanismos de Permeabilidade de Toxicantes em Membranas Biológicas:

Para íons e moléculas polares :

� Filtração (poros de membrana): mediado por proteínas de canal

� Difusão Facilitada: mediado por proteínas transportadoras (permeases)

� é seletivo e pode ser saturado

1 – Transporte Passivo (cont.):

Mecanismos de Permeabilidade de Toxicantes em Membranas Biológicas:

2 – Transporte Ativo:

�ocorre contra gradiente de concentração (“bombas” ou co-transporte)

�consumo de energia

� mediado por proteínas transportadoras de membrana (alta seletividade)

� ex.: MDR (= glicoproteína P → resistência a quimioterápicos → transporte

para fora da célula)

�pode reduzir a toxicidade; depende de expressão gênica: varia entre tipos

celulares, espécies e entre indivíduoscelulares, espécies e entre indivíduos

3 – Pinocitose:

� processo ativo de incorporação de substâncias na matriz extracelular

(adsorção seletiva ou não à membrana).

� mecanismo semelhante à fagocitose (ex.: remoção de material

particulado dos alvéolos)

Mecanismos de Permeabilidade de Toxicantes em Membranas Biológicas:

ABSORÇÃOABSORÇÃO

� passagem de substâncias do local de contato para a circulação sanguínea.

• Principais vias: dérmica, respiratória e oral.

1. Absorção Dérmica:�Pele: múltimas camadas (epiderme e derme)

� pele fina e grossa

�Barreiras limitantes da absorção:

• queratinização da camada córnea

• impermeabilização lipídica (camada granulosa)• impermeabilização lipídica (camada granulosa)

pele grossapele fina

� fatores associados à substância:

lipossolubilidade, pKa, PM,

volatilidade e viscosidade.

� Derme: tec. conjuntivo,

↑irrigação sanguínea,

� glândulas

1. Absorção Dérmica:

� fracamente permeável a soluções aquosas e íons

� permeável a toxicantes lipossolúveis (↑Kow): aromáticos e seus derivados

oxigenados ou halogenados (ex.: DDT, PCB´s), hidrocarbonetos (C6 a C9),

organometálicos (ex.: metilmercúrio, chumbo tetraetila)

� alguns causam efeitos locais: corrosão, sensibilização, mutações

ABSORÇÃOABSORÇÃO

� efeitos sistêmicos: ação do toxicante em tecidos distantes do local de absorção;

penetração em camadas celulares mais profundas e distribuição pelo organismo.

ABSORÇÃOABSORÇÃO2. Absorção pela via respiratória:

• fossas nasais, faringe, laringe, brônquios, traquéia e alvéolos

• área superficial média: 90 m2, rede capilar: 140 m2

• alcança rapidamente a circulação sistêmica, efeito quase imediato

• toxicantes: partículas sólidas ou líquidas suspensas no ar, gases e subst. voláteis

• efeitos podem ser locais ou sistêmicos.

� Mecanismos de Defesa:

• movimento de cílios, produção de muco• movimento de cílios, produção de muco

• espirros

Partículas sólidas suspensas:

�efeito tóxico mais comum = inflamação e irritação das vias respiratórias

� absorção relacionada com o tamanho e densidade.

2. Absorção pela via respiratória:ABSORÇÃOABSORÇÃO

ABSORÇÃOABSORÇÃO

2. Absorção pela via respiratória:Gases e substâncias voláteis:

• absorção depende da solubilidade no sangue (local predominante: alvéolos)

• difusão para o sangue → distribuição sistêmica

• equilíbrio dinâmico entre as concentrações do toxicante no ar inspirado e

sangue (função da solubilidade) → coeficiente de partição sangue/ar

• alto coef. de partição: absorção aumenta com a frequência respiratória

• baixo coef. de partição: absorção aumenta com estímulo da circulação• baixo coef. de partição: absorção aumenta com estímulo da circulação

ABSORÇÃOABSORÇÃO3. Absorção oral (trato digestivo):

• presença de microvilosidades e alta vascularização favorecem a absorção

• local: estômago, intestino, sublingual (oral), retal, etc.

• fatores: pH, alimentos (esvaziamento gástrico e lipídios), lipossolubilidade,

pKa, ionização (ex.: curare).

• ciclo entero-hepático (reabsorção de toxicantes já excretados pela bile)

• absorção de metais (ex.: Fe, Ca) → transporte especializado (proteínas de

membrana), mecanismos de competição (ex.: Cd, Zn e Cu)

Epitélio esôfago Microvilosidades intestinais

DISTRIBUIÇÃO DISTRIBUIÇÃO � depende do fluxo sanguíneo e linfático

� fatores: perfusão dos órgãos,

% ligação a proteínas plasmáticas (equilíbrio dinâmico) ou fração globular

diferenças de pH

grau de ionização e lipossolubilidade

� tecidos muito vascularizados → rápido equilíbrio com a concentração sanguínea

ex.: coração, rins, baço, fígado

� para alcançar o sítio de ação: toxicante na forma livre e mais lipossolúvel� para alcançar o sítio de ação: toxicante na forma livre e mais lipossolúvel

toxicante livre

introdução do toxicante

na circulação

Plasma

toxicante livre

toxicante ligado

a proteínas

Espaço Extracelular

(líquido intersticial)

toxicante ligado a

proteínas

Células alvo

complexo toxicante-alvo

intensidade do efeito tóxicodepende [toxicante]

me

mb

ran

a

me

mb

ran

a

toxicante livre

toxicante livre

DISTRIBUIÇÃO DISTRIBUIÇÃO

Volume de distribuição (Vd):• parâmetro toxicocinético que expressa o volume tecidual no qual o toxicante

está homogeneamente distribuído

• alto Vd → toxicante presente em várias partes do organismo; ex.: etanol

• baixo Vd → maior fração permanece no plasma (ligado a proteínas)

� está relacionado à toxicidade

� Quantidade de uma substância que se distribui aos tecidos:

� está relacionado à toxicidade

� locais de maior distribuição nem sempre são os mais lesados (depósito).

� Tecidos de Depósito → maior afinidade pelo toxicante (ou solubilidade)

� ex.: Pb2+: ossos

organoclorados, solventes orgânicos, organometálicos: tecido adiposo, SNC

Hg: grupos sulfidrila (-SH) de enzimas e proteínas (rins)

CO: hemoglobina (sangue)

� equilíbrio com a fração livre do plasma: liberação proporcional à biotransformação

e eliminação.

Ligação de toxicantes a proteínas plasmáticas:

DISTRIBUIÇÃO DISTRIBUIÇÃO

Complexos com xenobióticos (interações fracas: dipolo-dipolo, lig. H, ...)

� Albumina: mais abundante; afinidade por moléculas de caráter ácido

� α1-glicoproteína ácida: ligação a bases fracas

� lipoproteínas: transportam substâncias lipofílicas de caráter básico

� xenobióticos ligados a proteínas plasmáticas são inativos

� livres são capazes de atingir o sítio de ação e provocar efeito tóxico

� aumentar a % de ligação a proteínas reduz a toxicidade

� interações toxicológicas: competição por ligação a proteína plasmática →

desloca equilíbrio → ↑↑toxicidade

� livres são capazes de atingir o sítio de ação e provocar efeito tóxico

albumina

Ligação a proteínas plasmáticas:

�Frações proteicas do sangue e suas afinidades por substâncias químicas

Fonte: Azevedo e Chasin. As Bases Toxicológicas da Ecotoxicologia.

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

� Após absorção os xenobióticos tendem a ser excretados:

• diretamente (inalterado)

• após modificações químicas

� meios de excreção: urina, fezes, ar expirado, leite, saliva, suor, lágrima

� comportamento cinético depende de propriedades do xenobiótico:

• substâncias lipofílicas: facilmente absorvidas e dificilmente excretadas

• substâncias hidrofílicas: excreção favorecida (principalmente renal) • substâncias hidrofílicas: excreção favorecida (principalmente renal)

subst. lipofílicas → biotransformação → maior polaridade/hidrofilia → excreção

� reações catalisadas por enzimas inespecíficas do metabolismo endógeno

� órgãos: fígado, rins, adrenais, pele, mucosa do TGI

� absorção por via oral → fígado → efeito de primeira passagem

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações – tipos: FASE 1

FASE 2

REAÇÕES DE FASE 1:

• oxidações, reduções e hidrólises

• aumentam a polaridade/reatividade de xenobióticos

• podem levar a produtos mais tóxicos que o composto original → bioativação*

REAÇÕES DE FASE 2:

• incorporação de co-fatores endógenos aos produtos das reações de fase 1;

• Ex.: glicuronidação, sulfatação, acetilação, metilação, conjugação com glutationa

• envolve enzimas sintetases e/ou transferases

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Exemplos de bioativação (Reações de Fase 1):

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

1 – homogeneização de fragmento de tecido

�Fracionamento por centrifugação diferencial

de tecido hepático:

Enzimas hepáticas:� reações da fase 1 = microssômicas (maioria)

� reações da fase 2 = citossólicas

1 – homogeneização de fragmento de tecido

2 – precipitação de fibras e grumos e separação de

células dissociadas (sobrenadante)

3 – sobrenadante é centrifugado (1.000g/20’):

precipitação dos núcleos

4 - sobrenadante é centrifugado (10.000g/20’):

mitocôndrias e lisossomos precipitam

5 - sobrenadante é centrifugado (105.000g/120’): microssomos precipitam (fragmentos de R.E.rugoso)

� sobrenadante = fração solúvel (enzimas não-

microssômicas)

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 1 (microssômicas):

• Sistema citocromo P-450 (Oxidase de Função Mista):

• família de monoxigenases (CYP)

• proteínas integrais da membrana do RE

• citocromo P-450 → hemoproteína, λmax 450nm (complexo com CO in vitro)

• enzimas associadas (transferases): NADPH citocromo P-450 redutase

citocromo b5 redutase (NADH)

• sistema enzimático com afinidade a vários substratos• sistema enzimático com afinidade a vários substratos

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 1 (microssômicas):

Xenobiótico (RH)

Cit.P-450 (Fe3+)(RH) ---Cit.P-450 (Fe3+)

NADPH

NADP+

eNADPH cit. P-450 redutase

e

(RH) ---Cit.P-450 (Fe2+)+

� Oxidação:

Cit.P-450 (Fe3+)O2

NADH NAD+e

citocromo b5 redutase

e

(RH) --Cit.P-450 (Fe3+_O-O2-)

2H+H2O

(RH) --Cit.P-450 (Fe=O3+)

ROH

↑ ↑ reativo↑ reativo/instável

�Produtos: álcoois, epóxidos, óxidos, cetonas, ácidos

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 1 (microssômicas):

� Oxidação, ex.:

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO Reações de fase 1:

� Redução:

• muitas são catalisadas pelo citocromo P-450

• ocorre em baixa concentração de O2

• transferência de elétrons diretamente ao substrato: podem levar à formação de

radicais mais tóxicos, reativos (ex.: CCl4)

• grupos funcionais que são substratos: aldeído, cetona, dissulfeto, sulfóxidos,

haletos, alcenos, nitro, etc.haletos, alcenos, nitro, etc.

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 1:

� Hidrólise:

• substratos : éster, amidas, tio-ésteres, ésteres fosfatados

• hidrolases: ampla distribuição tecidual e plasmática (não-microssomal)

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 2:

1. Glicuronidação:• a mais comum em mamíferos

• classe de enzima: glicuroniltransferases

�doador de glicuronila: glicuronil-UDP

� Reações de Fase 1 → aumento da polaridade/reatividade → Fase 2

�Sintetases

�Transferases

�doador de glicuronila: glicuronil-UDP

• substratos comuns: álcoois, ác. carboxílicos, aminas e sulfidrilas

• glicuronatos são polares e facilmente excretados (rins e fígado)

• microbiota intestinal → β-glicuronidase (hidrólise de glicuronatos) →

reabsorção da aglicona (recirculação entero-hepática)

ác. glicurônico

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 2:

2. Sulfatação:

� classe de enzimas: sulfotransferases (solúvel) presente em vários tecidos

�doador de grupo sulfato: PAPS (3’-fosfoadenosina-5’-fosfossulfato)

� substratos comuns: álcoois alifáticos, fenóis e aminas.

� produtos: facilmente excretados na urina

PAPS

3. Metilação:

� classe de enzimas: metiltransferases

� subtipos: N, O ou S-metiltransferases

� doador de grupo metila (co-fator): S-adenosil-metionina (SAM)

� substratos: aminas aromáticas/alifáticas, N-heterocíclicos, fenóis e sulfidrilas

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 2:

SAM metilada

4. Acetilação:• classe de enzimas: N-acetiltransferases

• doador de grupo acetila (co-fator): acetil-coA

• substratos: aminas primárias e aromáticas, hidrazinas, sulfonamidas

• variabilidade entre/intra espécies: acetiladores rápidos e lentos

(susceptibilidade ao câncer induzido por aminas aromáticas; ex.: corantes)

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 2:

acetil-coA

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

Reações de fase 2:

5. Conjugação com glutationa:• enzima: glutationa S-transferase (citossol e RE)

• em mamíferos → fígado, intestino, rins, adrenais.

• co-fator: glutationa (tripeptídeo: ác. glutâmico + cisteína + glicina)

• Reações: sulfidrila (nucleófilo) com espécies eletrofílicas (radicais livres e

espécies reativas formadas nas reações de Fase 1)

glutationa (GSH)

espécies reativas formadas nas reações de Fase 1)

• os produtos são hidrolisados e acetilados (ác. mercaptúrico)→ excreção

• protege as células de danos (reações com lipídeos, proteínas e DNA)

• depleção da glutationa (GSH): quadro de estresse oxidativo (peroxidação lipídica)

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

5. Conjugação com glutationa:

exemplo de xenobiótico com

carbono eletrofílico

derivado da N-acetilcisteína

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

�Fatores que interferem na biotransformação:

I. Internos: associados ao organismo

� Espécie e Raça; Genética; Gênero; Idade; Estado Nutricional e Patológico

� associados à capacidade de metabolização (quali e quantitativamente)

� determinam a sensibilidade do organismo � determinam a sensibilidade do organismo

� fatores dietéticos → desnutrição: redução de proteínas, vitaminas, GSH

� influência variável na toxicidade: substâncias ativas ou bioativadas

II. Externos : associados às substâncias

�indução/inibição enzimática

2.1 - Indução Enzimática:

• aceleração da biotransformação: estímulo da síntese de enzimas de uma

via metabólica → tolerância ou aumento de toxicidade (bioativação)

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

�Fatores que interferem na biotransformação:

via metabólica → tolerância ou aumento de toxicidade (bioativação)

• indução pode ser rápida (horas) ou lenta (dias)

• interfere no metabolismo de outras substâncias (inespecífico)

• volta ao normal ao cessar o uso do indutor

• ex.: enzimas do citocromo P-450 → hormônios, inseticidas clorados,

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH’s), dioxinas

2.2 - Inibição enzimática:

• redução da biotransformação e atividade enzimática

• múltiplos mecanismos:

- inibição da síntese proteica

- interação competitiva com enzimas

• efeitos sobre a toxicidade:

- aumento: acúmulo no organismo e maior duração dos efeitos biológicos

- redução: para substâncias que sofrem bioativação

BIOTRANSFORMAÇÃO BIOTRANSFORMAÇÃO

�Fatores que interferem na biotransformação:

- redução: para substâncias que sofrem bioativação

• ex.: aldeído-desidrogenase (ex.: dissulfiram)

� em alguns casos a inibição

enzimática representa o próprio

mecanismo de ação tóxica

EXCREÇÃOPrincipais vias: urinária, fecal e pulmonar

1. Excreção renal • substâncias polares/hidrossolúveis;

• mecanismos: filtração glomerular,

reabsorção tubular e

secreção tubular (transporte ativo)

• toxicantes ligados à proteínas plasmáticas não são excretados

• alterações do pH urinário interferem na eliminação de eletrólitos fracos• alterações do pH urinário interferem na eliminação de eletrólitos fracos

• fatores que interferem: idade, insuficiência renal/cardiovascular, interações

entre toxicantes (competição por transporte ativo), ligação a proteínas.

EXCREÇÃO

2. Excreção pelo trato digestivo • fezes: toxicantes não absorvidos por V.O. + biotransformados

� via biliar: conjugados de P.M. > 325

�ciclo entero-hepático (reabsorção): aumento da meia-vida biológica de alguns

xenobióticos (glicuronatos).

• Classificação quanto à relação das concentrações bile/plasma:

Tipo A: (~ 1) (ex.: sódio, potássio, glicose, mercúrio, tálio, césio, cobalto)Tipo A: (~ 1) (ex.: sódio, potássio, glicose, mercúrio, tálio, césio, cobalto)

Tipo B: (> 1) (ex.: ácidos biliares, bilirrubina, chumbo, arsênio, manganês)

Tipo C: (< 1) (ex.: albumina, zinco, ferro, cromo)

� mecanismo de excreção biliar de metais: transporte ativo

EXCREÇÃO

3. Excreção pelos pulmões

• principal forma de excreção de substâncias gasosas/voláteis

• velocidade de eliminação é inversamente proporcional à solubilidade no sangue

E as outras vias???E as outras vias???

• suor, saliva, lágrimas, leite

• fatores: pKa, gradiente de pH (comparado ao plasma), lipossolubilidade e

mecanismos de transporte ativo.

• bases fracas difundem-se para leite e saliva: pH menor que do plasma

ex.: cocaína, anfetaminas

PARÂMETROS CINÉTICOS INDICADORES DA ELIMINAÇÃO

� Tempo de Meia-vida (t1/2):

� tempo necessário para que a concentração plasmática seja reduzida à metade,

após completa absorção e distribuição.

� Depuração (Dp) ou Clearance (Cl):� Depuração (Dp) ou Clearance (Cl):

� é a capacidade do organismo eliminar uma substância do plasma.

� corresponde ao somatório dos processos de depuração de cada órgão/tecido.

� depuração renal: quantidade excretada / conc. plasmática média (em 24 horas)

• creatinina: avalia a função renal