Embed Size (px)
Citation preview
FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
TRABAJO FIN DE GRADO
TÍTULO: Biosensores electroquímicos para la
detección de aminas biógenas
Autor: Araceli Moreno Sanz
Tutor: Marta Sánchez-Paniagua López
Convocatoria: Junio
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
2
Índice
- Resumen
- Introducción y antecedentes
- Objetivos
- Metodología
-Resultados
- Conclusiones
- Bibliografía
1
1
9
10
10
18
19
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
3
1. Resumen
Las aminas biógenas son compuestos que tienen una gran relevancia en diferentes sectores,
pudiendo emplearse como indicadores de calidad en la industria alimentaria, o como moléculas de
investigación en la industria farmacéutica. La técnica analítica más empleada para su detección es la
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), pero requiere pretatamientos analíticos y tiene un
elevado coste, por ello se están desarrollando nuevas técnicas como los biosensores electroquímicos
enzimáticos que tienen un diseño y manejo sencillos, elevada sensibilidad y un tiempo de respuesta
corto. Existen diferentes tipos de biosensores, monoenzimáticos o bienzimáticos en función de si se
busca detectar una o más aminas biógenas en la muestra y también existen biosensores capaces de
detectar el contenido total de aminas biógenas empleando enzimas poco específicas como la
diamino oxidasa (DAO). En el desarrollo de este estudio se puede apreciar la aplicación
satisfactoria de biosensores electroquímicos enzimáticos en gran variedad de muestras alimentarias
como pescado, quesos o vino.
2. Introducción y antecedentes
Las aminas biógenas (AB) son compuestos nitrogenados que pueden ser sintetizados por células
vegetales o animales o bien originados por la descarboxilación de algunos amioácidos por acción de
determinados microorganismos. Desde un punto de vista biológico, las aminas biógenas tienen
funciones fisiológicas esenciales para los seres vivos. En las plantas, intervienen en diversos
procesos celulares en respuesta al envejecimiento y al estrés oxidativo, y en animales tienen un
importante papel en la división celular y transmisión nerviosa. 1
Por ejemplo la histamina actúa
como neurotransmisor y la tiramina actúa como intermediario en las rutas de biosíntesis de otros
neurotransmisores.
Estos compuestos se emplean como indicadores de la descomposición provocada por determinadas
bacterias en ciertos alimentos como el pescado, carne, queso, vino o cerveza.2
Las aminas biógenas
más frecuentes en alimentos son histamina, tiramina, putrescina, cadaverina, triptamina, B-
feniletilamina, espermina y espermidina. En la figura 1 se muestran las estructuras químicas de las
mismas.
La histamina y la tiramina son las aminas biógenas más estudiadas debido a sus efectos
toxicológicos. La tiramina, produce la conocida "reacción del queso", que aumenta la presión
sanguínea produciendo migrañas severas y hemorragias cerebrales, especialmente en individuos
sensibles.3 Cabe destacar que, además de la propia toxicidad de esta molécula, estudios recientes
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
4
han demostrado que la tiramina favorece la adhesión de patógenos como Escherichia coli cepa
O157:H7 a la mucosa intestinal,4 empeorando el cuadro clínico de la intoxicación. La histamina,
generalmente se encuentra en los pescados y su ingesta puede producir la aparición de la
enfermedad escombroide, en la cual la histamina afecta a las funciones normales del corazón,
neuronas motoras y a la secreción de ácido gástrico5. Es importante su control ya que puede haber
pescados con elevados niveles de histamina sin que se altere el aspecto normal del pescado ni su
olor. Por otro lado, aminas como la putrescina o cadaverina, pueden reaccionar con nitritos dando
lugar a la formación de nitrosaminas, compuestos de conocido efecto cancerígeno.
Figura 1: Estructura química de las aminas biógenas más frecuentes en alimentos.
El consumo de alimentos que contienen cantidades elevadas de aminas biógenas tóxicas, sobretodo
alimentos fermentados, puede causar intoxicaciones y muestra la necesidad de mejorar los controles
y procesos de higiene. Por eso, existe el reglamento (CE) nº 2073/2005 de la comisión del 15 de
noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios,
según el cual, la autoridad competente verificará el cumplimiento de las normas y los criterios
establecidos, pudiendo realizar más muestreos y análisis con el fin de detectar y medir otros
microorganismos, sus toxinas o metabolitos en el caso de alimentos de los que se sospecha no sean
seguros. 6
Este reglamento consta de 12 artículos en los que se especifica entre otros detalles, las
condiciones generales de las empresas alimentarias, las pruebas para la detección de toxinas,
normas específicas para las pruebas y las tomas de muestras, normas sobre el etiquetado, y el
análisis de las tendencias, según el cual, cuando las empresas alimentarias observen una tendencia a
resultados insatisfactorios, adoptarán las medidas adecuadas para rectificar la situación con el fin de
evitar la repetición de los riesgos microbiológicos.
En cuanto a valores de concentraciones de AB aceptables para la salud humana, sólo incluye límites
mínimos y máximos para histamina en pescado (Tabla 1). Sin embargo, estudios demuestran que
ciertos niveles de aminas biógenas producen toxicidad, por ejemplo, el límite de toxicidad para
histamina en quesos se encuentra entre 100 - 400 mg kg-1
. 7
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
5
Tabla 1:Concentraciones límite de histamina aceptadas por el reglamento en vigor.
Categoría de alimentos Límites
mínimo Máximo
1.26. Productos de la pesca procedentes de especies de pescados asociados a un alto contenido de histidina.
100 mg·kg-1
200 mg·kg-1
1.27. Productos de la pesca sometidos a tratamiento de maduración enzimática en salmuera, fabricados a partir de especies de pescados asociados a un alto contenido de hisitidina.
200 mg·kg-1
400 mg·kg-1
Como se puede ver, debido a la importancia que tienen estos compuestos es necesaria la detección
de AB y en este sentido, existe una demanda de desarrollar una técnica relativamente sencilla,
rápida, económica y reproducible que se cubre con el auge de los biosensores.
Los métodos analíticos para la separación y cuantificación de AB se basan generalmente en la
cromatografía de gases y HPLC con detección absorciométrica o fluorimétrica, y métodos
cromatográficos acoplados con espectrometría de masas. Las alternativas están enfocadas a
combinar HPLC con la espectrometría de masas.8
Sin embargo, estos métodos requieren pre-
tratamientos analíticos y unos equipos de costo elevado, por ellos se están buscando alternativas
analíticas como el uso de los biosensores.
El impacto de la tecnología de los biosensores se está incrementando en ámbitos tan importantes
como el sector farmacéutico, el sector ambiental o el sector de la agricultura y la industria
alimentaria.9
Se entiende por biosensor un dispositivo analítico que transforma un proceso biológico en señales
eléctricas que permitan su cuantificación. Consta de un receptor biológico y un transductor (Figura
2.) El receptor es el elemento que interacciona de forma selectiva con el analito y siempre es de
naturaleza biológica, constituyendo una capa delgada de material biológico que está en contacto con
el transductor. El transductor es el elemento encargado de convertir en una señal cuantificable el
cambio fisicoquímico observado. La señal generada guarda una relación proporcional con la
concentración de compuesto específico (analito).10
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
6
Figura 2: Esquema de los componentes y funcionamiento de un biosensor en general.
En función del material biológico empleado se distinguen dos tipos de biosensores:
Biosensores catalíticos: Son los biosensores más aplicados y mejor conocidos y se basan en
el empleo de un catalizador para favorecer una reacción química y obtener uno o varios
productos conocidos sin consumo del biocatalizador, de modo que se regenera y puede
volver a ser empleado en una nueva reacción. Estos biocatalizadores suelen ser enzimas o
sistemas multienzimáticos.
Biosensores de afinidad: Este tipo de sensores se basan en la interacción del analito con el
elemento de reconocimiento sin que exista una transformación catalítica. Simplemente se
produce una reacción de equilibrio en la que se forma un complejo analito-receptor, por eso
normalmente se suelen emplear anticuerpos. Los sensores de afinidad tienen el
inconveniente de que necesitan realizar unos pasos posteriores de lavado para poder
conseguir un resultado claro y preciso. 11
A continuación se presenta una tabla en la que se comparan ambos tipos de sensores observando
las ventajas e inconvenientes de utilizar enzimas o anticuerpos como elementos de
reconocimiento en los biosensores.
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
7
Tabla 2: Ventajas e inconvenientes del empleo de enzimas como elemento de reconocimiento.
Ventajas Inconvenientes
- Elevada sensibilidad
- Respuesta rápida
- Autorregenerables
- No requieren pasos de lavado
- Gran variedad de enzimas disponibles
- Permiten amplificar señales
- Diseño y manejo sencillo
- Bajo coste
- Sensibilidad frente a condiciones ambientales (pH, Tª,
fuerza iónica)
- Pueden requerir presencia de cofactores
- Pueden ser inhibidos por sustancias de la muestra
- Tiempo de vida limitado
Tabla 3: Ventajas e inconvenientes del empleo de anticuerpos como elemento de reconocimiento.
Ventajas Inconvenientes
- Elevada sensibilidad y especificidad
- Estabilidad química
- Afinidad variable
- Respuesta rápida
- Bajo coste
- Difícil regeneración
- Requieren contacto directo con la muestra
- A veces necesitan marcaje
- No amplifican la señal
- Son saturables
- No permiten detectar sustancias desconocidas
En función del tipo de transductor empleado, podemos clasificar los biosensores en cuatro tipos:
Electroquímicos: Estos transductores transforman la señal que se produce por la interacción
entre el analito y el sistema de reconocimiento en una señal eléctrica, y proporcionan una
información analítica cuantitativa o semicuantitativa. Existen diferentes tipos de biosensores
electroquímicos, pudiendo ser conductimétricos, potenciométricos, amperométricos e
impedimétricos, en función de si los sistemas transductores detectan cambios en la
conductividad, en el potencial, en una corriente generada o en la impedancia. Por norma
general, los sensores electroquímicos suelen emplearse con elementos de reconocimiento
biocatalíticos ya que las reacciones enzimáticas dan lugar a sustancias activas eléctricamente, a
cambios en el pH, en el potencial…12
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
8
Ópticos: En este caso, el fundamento consiste en la medida de las variaciones que se producen
en las propiedades de la luz como consecuencia de la interacción física o química entre el
analito y el sistema de reconocimiento del sensor. La señal se mide mediante los cambios
producidos en la absorción, fluorescencia, luminiscencia, dispersión o índice de refracción.
Piezoeléctricos: Éstos miden cambios directos de masa por la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo. Para el diseño de estos sensores se emplean materiales piezoeléctricos, es
decir, materiales que al aplicarles un campo magnético alterno externo entran en resonancia.13
Estos materiales, que suelen ser cristales, se recubren con el elemento de reconocimiento
(anticuerpo) y se pone en contacto con el analito y lo que se mide es la frecuencia de oscilación.
Nanomecánicos: Cuando se emplean este tipo de transductores, el elemento de reconocimiento
se inmoviliza sobre la superficie de una micropalanca de silicio que se sumerge en una muestra
líquida y la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito produce un cambio en
la tensión superficial del líquido, de modo que lo que se mide es un cambio de la deflexión en la
micropalanca o bien, se puede medir también la frecuencia de resonancia. Generalmente se
emplean anticuerpos.
Una vez conocida la clasificación de los diferentes tipos de biosensores que existen, vamos a
centrar este trabajo en los biosensores electroquímicos enzimáticos ya que poseen las ventajas del
empleo de las enzimas y utilizan un transductor electroquímico que otorga mayor sensibilidad, y
son los más utilizados en la detección de aminas biógenas. Así, para terminar de entender cómo
funciona un biosensor, es de vital importancia conocer diferentes técnicas de inmovilización del
elemento de reconocimiento (enzima) sobre una membrana que esté fijada al sistema de
transducción. Este material de inmovilización puede actuar únicamente como soporte del material
biológico, o puede participar en la transmisión de la señal del sistema de transducción. Las técnicas
más empleadas son la adsorción física, atrapamiento, entrecruzamiento y formación de enlaces
covalentes.
Los biosensores electroquímicos enzimáticos pueden emplear dos o más enzimas en su diseño.14
El
empleo de reacciones enzimáticas acopladas facilitan la detección del analito ya que:
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
9
1. Aumentan la sensibilidad utilizando un enzima auxiliar que regenere el analito, dando
lugar por tanto, a un reciclaje del sustrato.
2. Se puede obtener un producto de reacción que sea fácilmente detectable, empleando una
enzima auxiliar que actúe catalíticamente sobre alguno de los productos de la reacción
enzimática principal. Este tipo de estrategia es la empleada por Pérez, S y colaboradores
en su estudio para la detección de histamina mediante una enzima principal (DAO)
utilizando como coenzima HRP.
3. Se eliminan interferencias, ya que la enzima auxiliar puede catalizar una reacción de las
sustancias interferentes de manera que no se vea afectada la reacción enzimática con el
sustrato de interés.
3. Objetivos
El objetivo de este estudio es llevar a cabo una revisión bibliográfica de los biosensores
electroquímicos enzimáticos focalizados en la detección de aminas biógenas, moléculas que
cada día tienen más relevancia en diferentes sectores de la sociedad, con el fin de detectarlas
como indicadoras de la calidad de diferentes productos alimenticios. En dicha revisión se
estudiará el tipo de enzima utilizado, transductor, sistema de inmovilización y se analizarán las
propiedades analíticas obtenidas en cada caso.
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
10
4. Metodología
El estudio de la revisión de biosensores electroquímicos en la detección de aminas biógenas se
realizó mediante una búsqueda bibliográfica en diferentes bases de datos como Sciencedirect,
Pubmed, Scopus, así como en la búsqueda de artículos científicos actuales en Google Scholar.
Como palabras claves de búsqueda se han utilizado "biogenic amines", " electrochemical
biosensors" o "enzimatic biosensors". Se escogieron 6 artículos que cubrían el diseño de
biosensores electroquímicos mono y bienzimáticos para la detección de una única amina
biógena, de varias aminas biógenas o del contenido total de las mismas. Los biosensores
seleccionados fueron aplicados satisfactoriamente al análisis de difentes muestras alimentarias.
5. Resultados
En la revisión bibliográfica realizada se destaca la gran cantidad de artículos científicos
centrados en el diseño y desarrollo de biosensores electroquímicos enzimáticos centrados en la
detección de aminas biógenas y en su posterior aplicación en el análisis de múltiples muestras
reales. En algunos casos, los biosensores se desarrollan con la finalidad de detectar una única
amina biógena, mediante el uso de enzimas de las cuales esa amina biógena es sustrato.
También se han desarrollado biosensores bienzimáticos que permiten la detección simultánea de
dos aminas biógenas diferentes. En otras investigaciones se contempla el uso de biosensores
enzimáticos para la detección del contenido total de aminas biógenas mediante el uso de
enzimas como amino oxidasa.
A continuación se explicarán con detalle algunos de los biosensores electroquímicos
enzimáticos que hasta ahora se han desarrollado, detallando el tipo de sistema de inmovilización
utilizado, electrodo de trabajo, enzima y en qué tipo de muestras de alimentos se han aplicado.
Mirela Apetrei y colaboradores 15
en 2014 desarrollaron un sistema para determinar los niveles
de tiramina en muestras alimentarias, en este caso en diferentes especies de pescados. Para ello
se inmovilizó la enzima tirosinasa sobre la superficie de un electrodo de carbono de pantalla
impresa modificado con nanotubos de carbono de una pared funcionalizados con un grupo
carboxilo (SWCNT-COOH). A continuación, las figuras 4 y 5 representan las reacciones
enzimáticas que tienen lugar cuando la tiramina reacciona con la tirosinasa y la reacción
electroquímica que tiene lugar sobre la superficie del biosensor, respectivamente.
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
11
Figura 4: Reacción enzimática de tirosina en presencia de tirosinasa. (Tyr O-dopaquinona)
Figura 5: Reacción electroquímica de O-dopaquinona en la superficie del biosensor.
La tirosinasa es una enzima bifuncional que cataliza la hidroxilación de monofenoles a O-
difenoles (actividad monofenolasa) y la oxidación de difenoles a O-quinonas (actividad
difenolasa). Lo que caracteriza a estos biosensores es que se basan en medir el descenso de la
señal amperométrica, como consecuencia de la reducción electroquímica de la dopaquinona
generada en la superficie del biosensor. Esa intensidad de reducción será proporcional a la
cantidad de tiramina que exista en la muestra y por eso el potencial de medida empleado es
negativo, concretamente de -0.20V.
El uso de nanotubos como sistemas de inmovilización enzimáticos da lugar a un aumento en el
área activa electroquímica y una mejora de las propiedades de transferencia electrónica. Durante
el estudio, se observó tras una voltamperometría cíclica una corriente de reducción bien
definida, que era proporcional a la concentración de tiramina en la muestra, lo que se atribuyó a
la reducción de la quinona producida enzimáticamente sobre la superficie del electrodo.
Los biosensores desarrollados basados en nanotubos de carbono presentaron un límite de
detección de 0.62µM y una sensibilidad de 6.2 x 10-7
M. Para la determinación de tiramina se
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
12
emplearon muestras de pescados ahumados y en escabeche. Los resultados obtenidos en
pescados ahumados y en escabeche muestran niveles de tiramina que oscilan entre 16.7-61.8mg
x kg-1
, por debajo de los niveles límites de contaminación por tiramina en alimentos. El nivel de
tiramina tiene un rango tan amplio porque el almacenamiento de este tipo de pescados puede
hacer que aumenten los niveles de esta amina biógena, incluso guardados en un refrigerador, de
modo que muestras en las que se podría esperar niveles de tiramina cero pueden estar alteradas
y dar positivo en su análisis. Es por esto que este tipo de sensores pueden servir para hacer un
análisis rápido y detectar presencia o no de tiramina en muestras de la industria alimentaria y
controlar las posibles intoxicaciones por estos compuestos.
Keow y colaboradores
16, desarrollaron un biosensor enzimático electroquímico específico para
detección de histamina. Se trabajó a un potencial de +35V midiendo la oxidación
electroquímica del compuesto imidazol acetaldehído, compuesto que se origina cuando tiene
lugar la reacción enzimática de DAO sobre la histamina. (Figura 6).
Figura 6: Mecanismo de acción del biosensor enzimático electroquímico para detección de histamina mediante la oxidación de
imidazol acetaldehído a un potencial de trabajo de +0.35V.
El enzima diamino oxidasa se inmovilizó mediante la técnica de fotopolimerización y posterior
revelado. En este sistema de inmovilización, DAO se retiene en una película de hidrogel de
metacrilato 2- hidroxietilo (photoHEMA). La determinación de histamina se llevó a cabo
mediante una medida amperométrica utilizando un sistema de tres electrodos basado en un
electrodo de trabajo de pantalla de carbono impresa, un electrodo de referencia de barra de
platino y otro electrodo de referencia Ag / AgCl.
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
13
Este tipo de biosensores se desarrollaron para evaluar los niveles de histamina en gambas tigre y
para controlar la liberación de histamina durante el deterioro de otros productos de origen
marino. El deterioro de las muestras de gambas mediante este procedimiento analítico se
comparó con el método HPLC convencional que se empleó como análisis control. En ambos
métodos los niveles de histamina aumentaron rápidamente cuando las muestras de gambas tigre
se dejaron a temperatura ambiente. Es posible que esta elevación en los niveles de histamina se
produjese por la presencia de bacterias capaces de producir cantidades peligrosas de esta amina
biógena en un período muy corto de tiempo cuando la temperatura no es óptima. Sin embargo,
se observó que la detección de histamina por parte de este tipo de biosensores enzimáticos
electroquímicos era pH dependiente, siendo pH7.4 el óptimo para su detección.
Este tipo de biosensores más sencillos de usar, permiten llevar a cabo una detección rápida e in
situ de aminas biógenas en comparación con otros métodos empleados para ello, como puede
ser la cromatografía líquida de alta eficacia, que requiere de un pretatamiento de la muestra,
posterior extracción, neutralización y lavado. La sensibilidad del biosensor para la detección de
histamina en gambas tigre fue de 5.56 nA ppm-1
, pero además mostró cierta sensibilidad frente a
putrescina y cadaverina, aunque la respuesta de DAO para estas aminas biógenas fue 17.5 veces
menor que para histamina. El intervalo lineal fue hasta 300 ppm con un límite de detección de
histamina de 50 ppm.
Henao-Escobar y colaboradores,17
en el año 2015, desarrollaron un biosensor amperométrico
enzimático dual para determinar histamina y putrescina simultáneamente. Las enzimas
empleadas para ello fueron histamina deshidrogenasa (HMD) y putrescina oxidasa (PUO),
ambas inmovilizadas mediante un proceso de reticulación con glutaraldehído (GA) y albúmina
bovina sérica (BSA).
En este estudio diseñaron un biosensor monoenzimático para la detección de histamina y un
biosensor bienzimático que detecta simultáneamente histamina y putrescina.
- El biosensor monoenzimático, mediante el enzima HMD, utilizó un sistema de
configuración de electrodos impresos con 3 pantallas (SPE) que consistió en un
electrodo de referencia (Ag/AgCl), una capa de carbono como contraelectrodo y una
capa de carbono modificado con 5% de tetratiofluvaleno (TTF) como mediador en el
electrodo de trabajo.
- El procedimiento de fabricación del biosensor bienzimático es similar al utilizado en
el desarrollo convencional de la configuración de electrodos con 3 pantallas, pero
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
14
incluyendo un segundo electrodo de trabajo de carbono (SPE). Un electrodo se
modificó con PUO y otro con HMD, de modo que se pueda llevar a cabo una
detección simultánea de ambas aminas biógenas.
Los potenciales de trabajo fueron en el primer sistema para únicamente histamina de
+130mV y en el segundo sistema de trabajo para detectar histamina y putrescina de +130mV
y +300mV respectivamente. En este caso, se emplea un potencial positivo porque se mide la
oxidación del mediador TTF cuando entra en contacto con la superficie del electrodo.
El mecanismo de acción de estos biosensores se explica en la figura 7.
Figura 7: Mecanismo enzimático de los biosensores HMD/TTF/SPCE
Las muestras alimentarias empleadas para detectar histamina y putrescina mediante este tipo
de biosensores fueron muestras de pulpo y de vino tinto. Para comparar la eficacia de este
método, se utilizó la cromatografía líquida de alta eficacia como método de referencia, con
el fin de comparar los valores obtenidos por ambas técnicas analíticas. Los resultados
obtenidos se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Contenido de His y Put en muestras de pulpo.
Amina biógena Método analítico
Dual-TTF/SPCEs (mg/Kg; α=0.05, n=3) HPLC (mg/Kg; α=0.05, n=3)
Put 16 +/- 1 16 +/- 1
His 15 +/- 1 13 +/- 2
En cuanto al contenido de histamina en la muestra de vino tinto, la concentración obtenida
mediante el empleo del monobiosensor fue de 9.0 +/- 0.7 mg/L (α=0.05), el cual demuestra la
buena calidad de esta técnica ya que fue un resultado muy similar al obtenido mediante la técnica
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
15
de cromatografía líquida de alta eficacia utilizada como método de control y cuyo contenido en
histamina para muestras de vino tinto fue 9.3mg/L (α=0.05).
Con los resultados obtenidos queda demostrado que el biosensor dual desarrollado es preciso y
adecuado para la determinación simultánea de putrescina e histamina en muestras complejas ya
que los valores obtenidos por esta técnica analítica son semejantes a los obtenidos por el método
de referencia HPLC. La capacidad de detección de este método es de 8.1 +/- 0.7 µM para
histamina y de 10 +/- 0.6 µM para putrescina.
Pérez, S 18
y colaboradores desarrollaron un sensor bienzimático para detectar histamina en
muestras de pescado, concretamente en sardinas, anchoas, atún y caballa. Las dos enzimas
empleadas son diamino oxidasa (DAO) y peroxidasa tipo II (HRP). El sistema de
inmovilización de ambas enzimas en el electrodo es mediante la técnica de inversión de fase en
una membrana de polisulfano / nanotubos de carbono / ferroceno. La inversión de fase puede ser
por precipitación por inversión, por precipitación térmica o por precipitación evaporea
controlada. Los electrodos de pantalla impresa de carbono (SPE), constan de un electrodo de
trabajo, un contraelectrodo - ambos de carbono - y un electrodo de plata de referencia. En el
caso de los SPE duales, la configuración del biosensor es la misma salvo que con dos electrodos
de trabajo de carbono. En la figura 8 se refleja el funcionamiento del sensor bienzimático en el
que se emplean reacciones enzimáticas secuenciales, empleando una enzima principal (DAO)
que cataliza la oxidación de la AB y generando peróxido de hidrógeno, el cual es reducido por
la enzima auxiliar HRP que se reduce y mediante el empleo de ferroceno como mediador se
mide la reducción del mismo, permitiendo trabajar a un potencial negativo de -50mV.
Figura 8: Diagrama de las reacciones que suceden en el sistema bienzimático para la determinación de histamina.
Se analizaron diferentes tipos de muestras de peces con el biosensor desarrollado. El objetivo de
esta diversidad de muestras fue evaluar en qué especies el biosensor fue capaz de cuantificar la
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
16
cantidad de histamina con buena fiabilidad ya que en función de la muestra, la producción de
histamina y otras aminas biógenas como cadaverina, putrescina u otros compuestos interferentes
pueden variar. Es importante recalcar que DAO también es activa en estas otras aminas
biógenas que pueden existir en la muestra, por lo que el análisis obtenido mediante el empleo de
este tipo de biosensores ofrece un contenido en aminas biógenas total, no específico para un
compuesto en concreto. Por eso, los resultados obtenidos mediante esta determinación
amperométrica se compararon con los obtenidos con el método de referencia ELISA que
cuantifica sólo los niveles de histamina libre.
Se realizó además, un análisis control de histamina mediante un kit ELISA para comparar con
los resultados obtenidos por la nueva técnica analítica. Los resultados de la evolución de los
niveles de histamina en la muestra de sardinas almacenadas a 4ºC que se estudió durante varios
días con el biosensor y con el kit ELISA, comenzaron a diferir entre ambas metodologías a las
96 horas. Esto podría atribuirse al hecho de que la histamina es la primera amina biógena que
aparece durante el proceso de degradación, por lo tanto, podría suponerse que esta discrepancia
corresponde a la producción de otras AB que podrían ser detectados por el biosensor. Por otra
parte, las muestras de anchoas y atún no presentaron una buena correlación entre los resultados
obtenidos por el inmunoensayo. Este hecho también se explica por la producción de diferentes
aminas biógenas. Por lo tanto, se puede concluir que el biosensor desarrollado sólo puede ser
empleado para cuantificar histamina en sardinas y caballa alta fiabilidad. El límite de detección
para este biosensor es de 1.7 x 10-5
M, y posee una sensibilidad de 1.9 x 10-7
nA-1
.
En 2007, Carelli 19
y colaboradores informaron del desarrollo y aplicación de un biosensor
amperométrico para la determinación del contenido de aminas biogénicas totales utilizando la
enzima diamino oxidasa comercial (DAO de riñón porcino E.C. 1.4.3.6) inmovilizada por
reticulación con glutaraldehído sobre una película bicapa electrosintetizada de polipirrol y poli
β naftol. En la figura 9 se muestra el esquema de un biosensor de este tipo Pt/PPYox-PβNAP.
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
17
Figura 9: Imagen de un gel biosensor Pt/PPYox-PβNAP/ diamino oxidasa. (GLU:glutaraldehído. PPYox: polipirrol
superoxidado. PβNAP: poli-β-naftol.
La diamino oxidasa comercial, es un enzima que registra baja actividad, pero en el diseño de
este biosensor, la técnica de inmovilización mediante reticulación con glutaraldehído en una
película electropolimerizada mostró una alta sensibilidad, siendo la mayor respuesta cuando se
utiliza como sustrato ya que es el sustrato natural de la diamino oxidasa. También mostró un
tiempo de respuesta corto y bajos límites de detección. El biosensor se utilizó como herramienta
de cribado para probar la presencia de aminas biógenas en varias muestras alimentarias tales
como quesos, alimentos fermentados y anchoas y para la evaluación de la frescura en muestras
de pescado almacenadas en condiciones correctas e incorrectas. La sensibilidad del método para
histamina, putrescina y cadaverina es de 106.8 +/- 1.2, 41.7 +/- 0.8, 8.8 +/- 0.2 nA mM-1
respectivamente. El límite de detección es de 6-12 µM.
Por último, se recogen en la Tabla 5 los datos más relevante de cada biosensor electroquímico
enzimático estudiado haciendo referencia al electrodo y enzima empleados, sistema de
inmovilización del enzima, amina biógena que detecta y límite de detección obtenido.
Tabla 5: Tabla comparativa de los diferentes biosensores tratados durante el estudio.
Electrodo Enzima Inmovilización Amina biógena Límite de
detección
Referencia
SPE HDM y PUO Reticulación con
GA y SBA
Histamina y
Putrescina
8.1 +/- 0.7 µM 15
Dual-TTF/SPCE 10 +/- 0.6 µM 15
SPE
Tirosinasa Nanotubos de
carbono
SWCNT-COOH
Tiramina
0.62 µM
16
SPE DAO y HRP Inversión de fase Histamina 0.17 µM 17
SPE
DAO Reticulación con
GA
Pt/PPYox-PβNAP
AB totales
6-12 µM
18
SPE DAO Fotopolimerización
(photoHEMA)
Histamina 50 ppm 19
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
18
6. Coclusiones
Tras la revisión exhaustiva de numerosos artículos de relevancia científica en los que se
muestran diferentes tipos de biosensores para la detección de aminas biógenas en alimentos
sobretodo, se puede afirmar que el desarrollo de nuevas técnicas analíticas como los biosensores
electroquímicos enzimáticos es un avance que puede servir de gran ayuda a la industria
alimentaria para la realización de controles sanitarios y de calidad en los alimentos desde el
momento de su captura en el medio natural hasta el proceso final de ingesta.
Cada biosensor desarrollado tiene ventajas y desventajas frente a otros métodos de detección,
pero hay que destacar la gran variedad de biosensores enzimáticos que existen, desde los más
específicos para detectar una sola amina biógena, hasta aquellos que detectan en una misma
muestra el contenido total de estos compuestos, pasando por aquellos que son capaces de
detectar diferentes AB simultáneamente.
Según la bibliografía consultada, Henao-Escobar y colaboradores midieron la evolución del
proceso de degradación en términos de aminas biógenas totales en muestras de sardina, anchoa
y caballa, y en los tres tipos de muestra hubo una clara tendencia al aumento en el contenido de
AB, demostrando así un aumento de la toxicidad a medida que aumenta el tiempo de
almacenamiento del pescado. Es conocido que la concentración de histamina y de otras aminas
biógenas en pescados aumenta después de ser capturados, debido a una inadecuada
manipulación o refrigeración. Por lo tanto, estos valores de concentración obtenidos mediante
los biosensores HMD/TTF/ SPCE o dual- TTF/SPCE se podrían emplear como indicadores de
la calidad y frescura del pescado, parámetros de vital importancia para evitar la enfermedad
escombroide. El biosensor desarrollado presenta ventajas sobre otros métodos tales como un
tiempo de respuesta corto, bajo límite de detección, alta sensibilidad, estabilidad de
almacenamiento y buena reproducibilidad.
Además, Apetrei y colaboradores también describieron a lo largo del estudio un biosensor
enzimático tipo Ty-SWCNT-COOH / SPE para detectar tiramina. Este tipo de biosensores son
excelentes para determinar con buena sensibilidad tiramina en muestras de pescado ahumado,
de modo que puede ser empleado por la industria alimentaria y agro-alimentaria para realizar
screenings y análisis a tiempo real en las muestras, ya que los nanotubos de carbono como
sistema de inmovilización del enzima permiten desarrollar una zona activa electroquímica con
propiedades de transferencia electrónica mejoradas obteniendo por tanto resultados más
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
19
sensibles y fiables de la amina biógena que se quiera detectar respecto a otros métodos que se
pudieran emplear para su detección.
El resto de biosensores estudiados, descritos por Carelli, Keow , Pérez
y colaboradores,
muestran una excelente respuesta lineal, una alta sensibilidad para diferentes aminas biógenas, y
unos límites de detección aceptables. Todos estos parámetros avalan la seguridad de estos
métodos analíticos y refuerzan la necesidad de profundizar más en su desarrollo para obtener
nuevas técnicas con innovaciones frente a las ya existentes y que aporten resultados nuevos al
mercado.
Finalmente, el desarrollo de diferentes tipos de biosensores electroquímicos enzimáticos es vital
para la detección de aminas biógenas presentes en productos alimenticios. Estos compuestos,
generalmente se emplean como indicadores de la calidad del producto, de la frescura y de otras
características organolépticas, ya que pueden contaminar el alimento sin que se modifique su
aspecto físico o su olor. Por tanto, sería interesante ahondar en el estudio y desarrollo de estas
nuevas técnicas analíticas en un campo tan amplio y actual como es la industria alimentaria,
ayudando a detectar y evitar intoxicaciones debidas a la ingesta de alimentos en mal estado o
contaminados superando los niveles de aminas biógenas aceptados por el reglamento (CE) nº
2073/2005.
7. Bibliografía.
1. Ten Brink, B., Damink, C., Joosten, H. M. L. J., & In't Veld, J. H. (1990). Occurrence and formation
of biologically active amines in foods. International journal of food microbiology, 11(1), 73-84.
2. Di Fusco, Federico, & Boffi, 2011; Kivirand & Rinken, 2011; López et al., 2012; Ordoñez,
Callejón, Morales, & García-Parrilla, 2013.
3. Burdychova, R., & Komprda, T. (2007). Biogenic amine-forming microbial communities in
cheese. FEMS Microbiology Letters, 276(2), 149-155.
4. Lyte, M. (2004). The biogenic amine tyramine modulates the adherence of Escherichia coli O157:
H7 to intestinal mucosa. Journal of food protection,67(5), 878-883.
5. Lehane, L., & Olley, J. (2000). Histamine fish poisoning revisited. International journal of food
microbiology, 58(1), 1-37.
6. Reglamento (CE) nº 2073/2005 de la comisión del 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios
microbiológicos aplicables a los productos alimenticios
7. Linares, D. M., Martín, M., Ladero, V., Alvarez, M. A., & Fernández, M. (2011). Biogenic amines in
dairy products. Critical reviews in food science and nutrition,51(7), 691-703.
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
20
8. Calbiani, F., Careri, M., Elviri, L., Mangia, A., Pistara, L., & Zagnoni, I. (2005). Rapid assay for
analyzing biogenic amines in cheese: matrix solid-phase dispersion followed by liquid
chromatography− electrospray− tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and food
chemistry, 53(10), 3779-3783.
9. Scognamiglio, V., Arduini, F., Palleschi, G., & Rea, G. (2014). Biosensing technology for
sustainable food safety. TrAC Trends in Analytical Chemistry,62, 1-10.
10. Conferencia sobre Nuevos materiales en el diseño de biosensores. Beatriz López Ruiz, Mayo de
2011. Universidad Politécnica de Madrid
11. GONZÁLEZ-RUMAYOR, V., García-Iglesia, E., RUIZ-GALÁN, O., & GAGO-CABEZAS, L.
(2005). Aplicaciones de biosensores en la industria agroalimentaria. CEIM/Dirección General de
Universidades e Investigación.
12. Leonard, P., Hearty, S., Brennan, J., Dunne, L., Quinn, J., Chakraborty, T., & O’Kennedy, R. (2003).
Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme and Microbial
Technology, 32(1), 3-13.
13. Tamayo, J., Alvarez, M., & Lechuga, L. M. (2003). Digital tuning of the quality factor of
micromechanical resonant biological detectors. Sensors and Actuators B: Chemical, 89(1), 33-39.
14. Pingarrón, J. M., & García, A. J. R. (2000). Biosensores electroquímicos: Una herramienta útil para
el análisis medioambiental, alimentario y clínico. In Anales de la Real Sociedad Española de
Química (No. 2, pp. 5-15). Real Sociedad Española de Química.
15. Apetrei, I. M., & Apetrei, C. (2015). The biocomposite screen-printed biosensor based on
immobilization of tyrosinase onto the carboxyl functionalised carbon nanotube for assaying
tyramine in fish products. Journal of Food Engineering,149, 1-8.
16. Keow, C. M., Bakar, F. A., Salleh, A. B., Heng, L. Y., Wagiran, R., & Bean, L. S. (2007). An
amperometric biosensor for the rapid assessment of histamine level in tiger prawn (Penaeus
monodon) spoilage. Food Chemistry, 105(4), 1636-1641.
17. Henao-Escobar, W., Del Torno-de Roman, L., Domínguez-Renedo, O., Alonso-Lomillo, M. A.,
& Arcos-Martínez, M. J. (2016). Dual enzymatic biosensor for simultaneous amperometric
determination of histamine and putrescine. Food chemistry, 190, 818-823.
18. Pérez, S., Bartrolí, J., & Fàbregas, E. (2013). Amperometric biosensor for the determination of
histamine in fish samples. Food chemistry, 141(4), 4066-4072.
19. Carelli, D., Centonze, D., Palermo, C., Quinto, M., & Rotunno, T. (2007). An interference free
amperometric biosensor for the detection of biogenic amines in food products. Biosensors and
Bioelectronics, 23(5), 640-647.
Este
trab
ajo
tiene
una
fina
lidad
doc
ente
. La
Facu
ltad
de F
arm
acia
no
se h
ace
resp
onsa
ble
de la
info
rmac
ión
cont
enid
a en
el m
ism
o.
