RENORBIO

Programa de Ps-graduao em Biotecnologia

Transcriptoma diferencial entre clulas-tronco

mesenquimais humanas jovens e senescentes

Joana Cristina Medeiros Tavares

Natal RN

2013

ii

Joana Cristina Medeiros Tavares

Transcriptoma diferencial entre clulas-tronco

mesenquimais humanas jovens e senescentes

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em

Biotecnologia RENORBIO, como parte

dos requisitos necessrios para a

obteno do ttulo de Doutora em

Biotecnologia.

rea de concentrao: Biotecnologia em

Sade.

Orientadora: Profa. Dra. Silvia Regina

Batistuzzo de Medeiros.

Natal RN

2013

iii

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais por todo amor e ensinamentos dedicados a mim que me fizeram

ser quem sou.

Ao meu irmo, Andr Tavares, por ter feito as escolhas de sua vida sempre

pensando em como contribuir para meus estudos.

A toda minha famlia, por fazer parte do alicerce para a edificao deste sonho,

especialmente, minha prima, Ana Carolina, por sua confiana e apoio na

realizao dos meus objetivos.

professora Dra. Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros, pela oportunidade

dada minha formao desde a iniciao cientfica, por ter permitido que eu

continuasse desenvolvendo o doutorado aps a minha aprovao em concurso

para docente na UFRN/FACISA e por confiar na minha capacidade de

desenvolver este trabalho.

UFRN pela estrutura fsica e pela oportunidade de ter estudado

gratuitamente com ensino de alta qualidade durante toda minha vida

acadmica.

Ao Ministrio da Cincia e Tecnologia MCT, por intermdio do Conselho

Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico - CNPq e do Ministrio

da Sade - MS, por intermdio do Departamento de Cincia e Tecnologia da

Secretaria de Cincia, Tecnologia e Insumos Estratgicos - DECIT/SCTIE -

Edital CT-Sade/MS/SCTIE/DECIT/MCT/CNPq N 17/2008, pelo apoio

financeiro.

minha grande amiga, companheira e colega de doutorado Dborah Afonso,

por seu incentivo, por sua ajuda, por seu carinho, por sua amizade, pelos seus

conselhos, por sua pacincia, por sua alegria contagiante, e por toda sua

contribuio em todas as etapas dessa jornada, contribuindo fortemente para a

sua concluso de maneira eficiente e prazerosa.

iv

A Isabella que foi uma grande companheira na realizao de todas as etapas

experimentais deste trabalho, por sua companhia agradvel e inteligente, e por

sua amizade verdadeira.

professora Dra. Vivian Silbiger e ao professor Dr. Andr Luchessi , pela ajuda

nas anlises dos dados de microarranjos e de RT-PCR em tempo real, e por

suas agradveis companhias.

pesquisadora Maria Eugnia do Laboratrio de Microarranjos (LMA) LNBio

- Laboratrio Nacional de Luz Sncroton Campinas/SP, por todo seu auxlio

tcnico nas etapas de hibridizao e aquisio dos dados de microarranjos.

Ao Laboratrio Nacional de Luz Sncroton Campinas/SP pela acomodao do

alojamento e toda a estrutura fsica disponvel.

minha grande amiga Adriana Brito, por todo seu apoio para que eu pudesse

conciliar o meu trabalho na FACISA com o meu doutorado, compartilhando

disciplinas, projetos, reunies, orientaes, e at casa e refeies em Santa

Cruz-SC. Obrigada tambm pelos momentos de descontrao na praa

Tequinha Farias-SC, por sua ajuda nesta etapa final de organizao de tese e,

principalmente, por sua sincera amizade.

A Pedro Henrique, pelo seu carinho, companherismo, incentivo e pelos

momentos de alegria vividos. Obrigada tambm sua famlia, pela sua

receptividade sempre aconchegante e carinhosa, me proporcionando muita paz

e descanso.

Aos meus amigos constituintes de minha turma de biologia, especialmente,

Aurizngela, Daiane, Denise, Jefferson e Jule, que me proporcionaram muitos

momentos de alegria, compartilharam sonhos pessoais e profissionais, e por

continuarem dedicando seu carinho e amizade que contribuem para a

realizao deste trabalho.

A todos os colegas do LBMG pela boa convivncia, especialmente, a Daniel e

Fbio, por proporcionar dias de trabalho mais suaves e feliz, pela ajuda nas

anlises de biologia de sistemas, pelo carinho e amizade.

v

A todos os companheiros e divertidos amigos do LAMA, Jana Dara, Felipe,

Nilmara, pelas msicas, danas, risadas e, principalmente, pela amizade e

companheirismo verdadeiro.

Ao meu amigo e colega de doutorado, Leonam, pelo seu contagiante otimismo

nos experimentos e em sua vida, pelos seus entusiasmantes planos do tipo

cebolinha, e por sua grande e inestimvel amizade.

A toda famlia Pichorim pelo conforto de sua receptividade, ateno e apoio.

A Mayara e Giselle por todo seu apoio tcnico e por sua convivncia afvel.

Aos alunos de iniciao cientfica, Guillermo Ortiz Brasil, Isabella Tannus Meira,

Luiza Xavier e Thais Pimentel, que contriburam para realizao dos

experimentos deste trabalho.

A Guillermo Ortiz, por sua amizade e pelo seu exemplo de perseverana,

dedicao e pacincia.

A toda famlia Santos, por todo seu apoio, carinho e incentivo ao longo de toda

minha vida acadmica.

Ao professor Dr. Geraldo Cavalcanti Jnior pela ajuda na realizao dos

experimentos de citometria de fluxo.

direo da FACISA/UFRN, por ter me liberado de algumas atividades de

docente, nestes dois ltimos anos, em alguns momentos mais crticos para a

concluso do doutorado.

vi

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Imagens das CTMH jovens e senescentes............................ 48

FIGURA 2 Imagens das diferenciaes osteognica, adipogncia e

condrognica das CTMH........................................................ 49

FIGURA 3 Grfico mostrando que a comparao entre as CTMH/inv

senescentes e CTMH/inv jovens resultou em maior nmero

de genes diferencialmente expresso do que na comparao

entre as CTMH/n senescentes e CTMH/n jovens................... 50

FIGURA 4 Classificao funcional dos genes diferencialmente

expressos em CTMH/n senescentes comparadas s

CTMH/n jovens....................................................................... 52

FIGURA 5 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

expressos em CTMH/n senescentes comparadas s

CTMH/n jovens....................................................................... 53

FIGURA 6 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

expressos em CTMH/n senescentes comparadas s

CTMH/n jovens no contexto genmico................................... 54

FIGURA 7 Classificao funcional dos genes diferencialmente

expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s

CTMH/inv jovens..................................................................... 55

FIGURA 8 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s

CTMH/inv jovens..................................................................... 57

FIGURA 9 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s

CTMH/inv jovens no contexto genmico................................ 58

FIGURA 10 Sub-rede da figura 9a, destacando as molculas que

interage diretamente como gene EGF................................... 59

FIGURA 11 Diagrama de Venn construdo a partir das listas dos genes

das comparaes CTMH/n senescentes vs CTMH/n jovens 60

vii

e CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv jovens.......................

FIGURA 12 Classificao funcional dos 30 genes comuns s duas listas

de comparaes CTMH/n senescentes vs CTMH/n jovens

e CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv jovens...................... 61

FIGURA 13 Diagrama de Venn para identificao dos genes

diferencialmente expressos em ambas as comparaes,

CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv

senescentes vs CTMH/n senescentes.................................... 62

FIGURA 14 Cluster hierrquico de todas as probsets diferencialmente

expressas em ambas as comparaes CTMH/inv jovens vs

CTMH/n jovens e entre as CTMH/inv senescentes vs

CTMH/n senescentes............................................................. 64

FIGURA 15 Genes mais expressos em CTMH/inv jovens se tornaram

ainda mais expressos em CTMH/inv senescentes................. 65

FIGURA 16 Genes menos expressos em CTMH/inv jovens se tornaram

ainda menos expressos em CTMH/inv senescentes.............. 66

FIGURA 17 Caritipo parcial das CTMH/inv mostrando a

inv(3)(p13p25~26) e seu

ideograma............................................................................... 68

FIGURA 18 Representao dos genes diferencialmente expressos em

CTMH/inv jovens comparadas as CTMH/n Jovens nas

categorias funcionais de acordo com o IPA Igenuity............. 70

FIGURA 19 Redes de interaes formadas pela lista dos genes

diferencialmente expressos na comparao CTMH/inv

jovens vs CTMH/n jovens....................................................... 71

FIGURA 20 Redes de interaes formadas pela lista dos genes

diferencialmente expressos na comparao CTMH/inv

jovens vs CTMH/n jovens no contexto genmico.................. 72

FIGURA 21 Representao dos genes diferencialmente expressos em

CTMH/inv jovens comparadas s CTMH/n jovens nas

categorias funcionais de acordo com o IPA Igenuity.............. 74

FIGURA 22 Redes de interaes formadas pela lista dos genes

diferencialmente expressos apenas na comparao 76

viii

CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes...................

FIGURA 23 Sub-rede de interaes da figura 22. Esta rede evidencia os

ns que se conectam ao bottleneck EGF.............................. 77

FIGURA 24 Sub-rede de interaes da figura 12. Esta rede evidencia

somente os genes que se ligam diretamente a EGF ou aos

genes localizados em Inv (3): CNTN3, PDZRN3, LMCD1 e

BHLHE40........................................................................... 78

FIGURA 25 Rede de interaes formada pela lista dos genes

diferencialmente expressos apenas na comparao

CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes inserida no

contexto genmico.................................................................. 79

FIGURA 26 Sub-rede da figura 25, destacando os ns conectados

diretamente ao gene EGF e os gene localizados na regio

da Inv (3)................................................................................. 80

FIGURA 27 Grfico mostrando as categorias funcionais mais

enriquecidas (com valor de p 0,05 e somente aquelas com

representao superior 5%) em ambas as comparaes

CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv

senescentes vs CTMH/n senescentes.................................... 82

FIGURA 28 Rede de interaes formada pela unio entre os genes

diferencialmente expressos em ambas as comparaes

(CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv

senescentes vs CTMH/n senescentes) e os exclusivamente

diferencialmente expressos na comparao CTMH/inv vs

CTMH/n senescentes............................................................. 84

ix

SUMRIO

Lista de Figuras........................................................................................... vi

Resumo........................................................................................................ xii

Abstract........................................................................................................ Xv

1.0. Introduo......................................................................................... 17

2.0. Reviso Bibliogrfica

2.1. Clulas-tronco mesenquimais humanas.................................. 20

2.2. Cordo umbilical como fonte de CTMH................................... 23

2.3. Senescncia celular................................................................. 26

2.4. Estabilidade genmica das CTMH ao longo tempo de

cultivo....................................................................................... 29

2.5. Microarranjos e estudos de exprsso gnica em CTMH......................................................................................

32

3.0. Objetivos........................................................................................... 36

4.0. Material e Mtodos........................................................................... 37

4.1. Isolamento e caracterizao das CTMH.................................. 37

4.2. Condies de cultura das CTMH para anlise do perfil de

expresso gnica..................................................................... 38

4.3. Caracterizao das CTMH senescentes................................. 39

4.4. Extrao de RNA..................................................................... 39

4.5. Preparao do RNA, hibridizao e captura de imagem dos microarranjos...........................................................................

41

4.6. Anlise dos dados de microarranjos........................................ 41

4.7. Avaliao da expresso diferencial por RT-PCR em tempo

real........................................................................................... 42

4.8. Classificao funcional dos genes diferencialmente

expressos................................................................................ 44

4.9. Anlise de biologia de sistemas.............................................. 44

5.0. Resultados

5.1. Caracterizao das CTMH jovens e senescentes................... 46

5.2. A senescncia in vitro afeta o perfil de expresso das

CTMH...................................................................................... 50

5.3. Classificao funcional e rede de interaes dos genes

diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes vs

CTMH/n jovens....................................................................... 51

5.4. Classificao funcional dos genes diferencialmente

expressos CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv jovens......... 55

5.5. H um perfil de expresso gnica comum entre as

CTMH/inv senescentes e as CTMH/n senescentes............. 60

x

5.6. As CTMH/inv tem o transcriptoma distinto das CTMH/n......... 62

5.7. Alguns genes localizados na regio prxima aos pontos de

quebra da inverso em CTMH/inv foram diferencialmente

expressos em CTMH/inv......................................................... 66

5.8. Classificao funcional e redes de interaes dos genes

diferencialmente expressos em CTMH/inv jovens

comparadas s CTMH/n jovens.............................................. 68

5.9. Classificao funcional e redes de interaes dos genes

diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes

comparadas s CTMH/n senescentes..................................... 73

5.10. Anlise de interpretao biolgica dos genes

diferencialmente expressos nas comparaes CTMH/inv

jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv senescentes vs

CTMH/n senescentes.............................................................. 80

5.11. Anlise da expresso gnica das CTMH por RT-PRC em

tempo real................................................................................ 85

6.0. Discusso.......................................................................................... 86

7.0. Concluso......................................................................................... 116

8.0. Referncias Bibliogrficas.............................................................. 118

9.0. Apndices........................................................................................ 147

A. Tabela da lista de genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes na comparao CTMH/n senescentes vs CTMH/n Jovens................................................................................................

147

B. Tabela da lista de genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes na comparao CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv Jovens................................................................................................

151

C. Tabela da classificao funcional dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s CTMH/n jovens.................................................................................................

162

D. Tabela de Anotao funcional das cinco categorias mais enriquecidas com menor valor de p dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s CTMH/n Jovens................................................................................................

163

E. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s CTMH/n jovens.................................................................................................

167

F. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes no contexto genmico formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s mesmas jovens com a adio de 50 genes do genoma humano.

169

G. Tabela da classificao funcional dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s mesmas jovens.................................................................................................

174

H. Tabela da anotao funcional das cinco categorias mais enriquecidas com menor p-valor dos genes diferencialmente

175

xi

expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH/inv jovens.................................................................................................

I. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH/inv jovens.................................................................................................

195

J. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes no contexto formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH/inv jovens com a adio de 50 genes do genoma humano................................................................................

200

K. Tabela da lista de genes da interseco entre as duas listas das comparaes senescentes vs jovens de CTMH/n e CTMH/inv.........

207

L. Tabela da classificao funcional da lista dos 30 genes comuns em ambas as listas das comparaes Senescentes vs jovens de CTMH/n e CTMH/inv..........................................................................

209

M. Tabela da anotao funcional das cinco categorias mais enriquecidas com menor p-valor dos 30 genes comuns em ambas as listas das comparaes Senescentes vs jovens de CTMH/n e CTMH/inv............................................................................................

210

N. Tabela de genes diferencialmente expressos em CTMH/inv jovens na comparao entre as CTMH/inv vs CTMH/n jovens, ranqueados do maior para o menor Fold Change.................................................

214

O. Tabela da lista de genes diferencialmente expressos entre CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes..............................

218

P. Tabela da lista dos genes diferencialmente expressos da interseco entre as comparaes CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e entre as CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes.

235

Q. Tabela dos genes localizados prximo regio da inverso que tiveram sua expresso afetada em CTMH/inv...................................

237

R. Tabela das categorias funcionais representadas pelos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv jovens da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens..................................................

238

S. Tabela da anotao funcional das cinco categorias com menores valor de p representadas pelos genes diferencialmente expressos da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens........................

239

T. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes obtida a partir da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens por meio do pluggin BINGO do Cytosacape............

249

U. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes obtida a partir da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens no contexto genmico por meio do pluggin BINGO do Cytosacape...................................................................................

251

V. Tabela das categorias funcionais representadas pelos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv Senescentes da comparao CTMH/inv vs CTMH/n Senescentes..............................

253

W. Tabela dos genes classificados nas cinco categorias funcionais com menores p-valor da comparao CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes.........................................................................

254

X. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede 270

xii

de interaes no contexto formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH jovens com a adio de 50 genes do genoma humano................................................................................

Y. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes no contexto formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH jovens com a adio de 50 genes do genoma humano................................................................................

278

Z. Tabela da comparao dos valores de Fold Change obtidos por anlise de Microarray e de qPCR......................................................

284

10.0. Anexos............................................................................................. 286

1. Lista dos genes localizados prximo regio da inverso cromossmica (inv3p13-25~26) constituinte das CTMH/inv.........

286

xiii

RESUMO

Clulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH) so muito teis na terapia

celular. O longo perodo de cultivo pode resultar em senescncia replicativa ou

estar relacionado com o aparecimento de alteraes cromossmicas

responsveis pela aquisio de um carter tumorignico in vitro . Neste estudo,

foi comparado o transcriptoma de CTMH jovens e senescentes obtidas de

diferentes doadores. Alm disso, pela primeira vez, o perfil de expresso de

CTMH com uma inverso cromossmica paracntrica (CTMH/inv) foi

comparado ao de CTMH que possuem caritipo normal (CTMH/n) em

passagens jovens e senescentes de cultivo in vitro . As CTMH utilizadas neste

estudo foram isoladas da veia do cordo umbilical de trs dadores, dois

CTMH/n e de um CTMH/inv. Aps a criopreservao, elas foram expandidas in

vitro at alcanarem a senescncia. O RNA total foi extrado utilizando o

RNeasy mini kit (Qiagen), marcado, purificado e fragmentado com o 3

'GeneChip IVT expresso Kit (Affymetrix, Inc.). Subsequentemente, o RNA

fragmentado foi hibridado no microarranjo Affymetrix Human Genome U133

Plus 2.0 (Affymetrix, Inc.). A anlise estatstica da expresso diferencial foi

realizada usando o Partek Suite Software Genomic, verso 6.4 (Partek, Inc.).

Foram consideradas estatisticamente significativas as diferenas na expresso

com valor de P 0.01 corrigido com Bonferroni. Apenas os sinais com fold

change 3.0 foram includos na lista de diferencialmente expressos. Diferenas

na expresso gnica observadas no estudo dos microarranjos foram

confirmadas por resultados de RT-PCR em tempo real. Para a interpretao

biolgica dos dados foram utilizados: IPA (Ingenuity Systems) para anlise de

enriquecimento de funes; STRING 9,0 para a construo de redes de

interaes; Cytoscape 2,8 para a visualizao das redes e anlises de gargalos

com o auxlio do software GraphPad Prism 5.0. O pluggin BiNGO do Cytoscape

foi utilizado para avaliar a representao de categorias funcionais no Gene

Ontology nas redes biolgicas. A comparao entre senescentes e jovens em

cada grupo de CTMH mostrou que h uma diferena no perfil de expresso,

sendo maior nas senescentes do grupo CTMH/inv. Os resultados tambm

mostraram que h diferena nos perfis de expresso entre as CTMH/inv e

CTMH/n, sendo maior a diferena quando as clulas esto senescentes. Novas

xiv

redes foram identificadas para genes relacionados com a resposta ao longo do

tempo de cultivo nos dois grupos de CTMH. Foram identificados genes que

podem coordenar funes importantes mais enriquecidas nas redes, como por

exemplo, CXCL12, SFRP1, EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. A interpretao

biolgica destes dados sugere que a populao de clulas CTMH/inv tem

diferentes caractersticas constitucionais, relacionadas com o seu potencial de

proliferao, diferenciao e resposta a estmulos, responsveis por um

processo de senescncia replicativa em CTMH/inv distinto das CTMH/n. Os

genes identificados neste estudo so candidatos a marcadores da senescncia

celular em CTMH, mas a sua relevncia funcional neste processo deve ser

testada em experincias adicionais in vitro e/ou in vivo.

xv

ABSTRACT

Human mesenchymal stem cells (MSC) are powerful sources for cell therapy in

regenerative medicine. The long time cultivation can result in replicative

senescence or can be related to the emergence of chromosomal alterations

responsible for the acquisition of tumorigenesis features in vitro. In this study,

for the first time, the expression profile of MSC with a paracentric chromosomal

inversion (MSC/inv) was compared to normal karyotype (MSC/n) in early and

late passages. Furthermore, we compared the transcriptome of each MSC in

early passages with late passages. MSC used in this study were obtained from

the umbilical vein of three donors, two MSC/n and one MSC/inv. After their

cryopreservation, they have been expanded in vitro until reached senescence.

Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (Qiagen) and marked with

the GeneChip 3 'IVT Express Kit (Affymetrix Inc.). Subsequently, the

fragmented aRNA was hybridized on the microarranjo Affymetrix Human

Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc.). The statistical analysis of

differential gene expression was performed between groups MSC by the Partek

Genomic Suite software, version 6.4 (Partek Inc.). Was considered statistically

significant differences in expression to p-value Bonferroni correction .01. Only

signals with fold change 3.0 were included in the list of differentially

expressed. Differences in gene expression data obtained from microarrays

were confirmed by Real Time RT-PCR. For the interpretation of biological

expression data were used: IPA (Ingenuity Systems) for analysis enrichment

functions, the STRING 9.0 for construction of network interactions; Cytoscape

2.8 to the network visualization and analysis bottlenecks with the aid of the

GraphPad Prism 5.0 software. BiNGO Cytoscape pluggin was used to access

overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. The

comparison between senescent and young at each group of MSC has shown

that there is a difference in the expression parttern, being higher in the

senescent MSC/inv group. The results also showed difference in expression

profiles between the MSC/inv versus MSC/n, being greater when they are

senescent. New networks were identified for genes related to the response of

two of MSC over cultivation time. Were also identified genes that can coordinate

functional categories over represented at networks, such as CXCL12, SFRP1,

xvi

EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. The biological interpretation of these data

suggests that the population of MSC/inv has different constitutional

characteristics, related to their potential for differentiation, proliferation and

response to stimuli, responsible for a distinct process of replicative senescence

in MSC/inv compared to MSC/n. The genes identified in this study are

candidates for biomarkers of cellular senescence in MSC, but their functional

relevance in this process should be evaluated in additional in vitro and/or in vivo

assays.

17

1.0. INTRODUO

As clulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH) so clulas

multipotentes, caracterizadas pela sua capacidade de aderncia ao plstico,

diferenciao em osteoblastos, adipcitos e condrcitos, apresentam

expresso dos marcadores CD105, CD90, CD73 e ausncia da expresso de

CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79 ou CD19 e HLA-DR (Reagan e Kaplan,

2011). As CTMH tm sido consideradas como uma importante alternativa para

a terapia celular devido sua facilidade de obteno e expanso in vitro, sua

plasticidade funcional, e mais recentemente, por secretar molculas bioativas

com papel na imunomodulao, quimioatrao, com efeitos trficos,

neuroproteo, entre outras que auxiliam o reparo tecidual (Eyal Ben-Ami et al.,

2011; Honmou et al., 2012; Youwei Wang et al., 2012).

H evidncias de que as clulas-tronco sofrem senescncia celular in vivo

que pode ser responsvel pelo declnio de suas funes e pela origem das

doenas metablicas, degenerativas, cncer e o envelhecimento dos indivduos

(Revisado por Rodrguez-Rodero, et al. 2011). Esta proposio est em

conformidade com a observao de que o envelhecimento afeta a renovao e

a capacidade de diferenciao de CTMH residentes no tecido adiposo e na MO

de indivduos mais velhos (Alt et al., 2012; Kretlow et al., 2008; Chen et al.,

2009).

O longo tempo de cultivo pode resultar na senescncia replicativa ou

estar relacionado ao surgimento de uma instabilidade gentica que seria

responsvel por uma possvel aquisio espontnea de um potencial

tumorignico das CTMH. A senescncia celular caracterizada por uma srie

de alteraes que envolvem uma complexa reprogramao de transduo de

sinais, tais como o encurtamento dos telmeros, estresse celular, danos no

DNA e ativao em oncogenes, que resultam em alteraes em processos

celulares, no somente no ciclo celular, mas na morfologia, na funo da clula

e na aquisio de um perfil de expresso de molculas inflamatrias

secretadas (revisado por Sikora et al., 2012). O secretoma inflamatrio

produzido pelas clulas senescentes pode criar um ambiente favorvel para o

18

prprio processo de senescncia, ou por outro lado propiciar o

desenvolvimento de cncer e de outras doenas relacionadas idade como

aterosclerose e diabetes (Cichowski e Hahn, 2008; revisado por Sikora et al.,

2012).

Vrias alteraes cromossmicas adquiridas durante o cultivo j foram

descritas em diferentes tipos de clulas-tronco, embrionrias (Baker et al.,

2007; Mayshar et al., 2010), pluripotentes induzidas, CTMH e neurais (Ben

David et al., 2011) que parecem conferir vantagens seletivas e podem

aumentar a tumorigenicidade das clulas, e alterar a sua capacidade de

diferenciao (Harrison et al., 2007; Mayshar et al., 2010; Ben-David e

Benvenisty, 2011). Por outro lado, h relatos que algumas alteraes

desaparecem na cultura e no conferem vantagem seletiva (Senseb et al.,

2012; Hussein et al., 2011). A presena de aneuploidia em vrias preparaes

de CTMH da MO depois de cultivo in vitro foi documentada, mas foi associada

somente senescncia e no tumorigenese (Tarte et al., 2010).

Recentemente Duarte e colaboradores (2012) identificaram uma alterao

cromossmica constitucional, caritipo 46,XY,inv(3)(p13p25~26), em CTMH

obtidas do endotlio da veia do cordo umbilical de um doador, que so as

MSC/inv utilizadas no presente trabalho. As inverses paracntricas so

consideradas como heteromorfismos que no causam problemas sade do

portador. No entanto, pessoas que a possuem tm maior probabilidade de

originar rearranjos no balanceados na sua descendncia, e apresentam uma

frequncia mais elevada de aborto espontneo em relao populao em

geral (Grati et al., 2008). Contudo, nada se sabe sobre o efeito desta alterao

cromossmica nas clulas aps sua expanso in vitro, e nem to pouco sobre

o seu comportamento no organismo de um possvel receptor. Considerando

que a regio da inverso (3p25~26) contm vrios genes de grande

importncia biolgica, como genes envolvidos com o reparo de DNA e outros

responsveis pelo desenvolvimento de tumores, tais clulas podem ser mais

propensas transformao espontnea in vitro.

Neste contexto, uma anlise molecular de larga escala por microarranjos

pode oferecer uma compreenso mais detalhada da complexidade subjacente

19

biologia das CTMH cultivadas at a sua senescncia, possibilitando

predies importantes sobre o processo de senescncia celular das CTMH e

sobre o impacto de alteraes cromossmicas nesse processo celular. Os

estudos de transcriptoma em CTMH tm focado na diferena de expresso

gnica entre as CTMH obtidas de fontes distintas (Jansen et al., 2010; Miranda

et al., 2012; Panepucci et al., 2004; Secco et al., 2009; Tsai et al., 2007; Weng

et al., 2011; Kim et al., 2011) e no processo de diferenciao (Kock et al.,

2011; Menssen et al., 2011; Roobrouck et al., 2011; Yoo et al., 2011). Muito

pouco se sabe sobre expresso gnica durante a senescncia das CTMH e

sobre o efeito do longo tempo de cultivo em CTMH que apresenta uma

alterao cromossmica constitucional.

20

2.0. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. Clulas-tronco mesenquimais humanas

O termo clulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH) foi introduzido

por Caplan, em 1991. As primeiras clulas-tronco mesenquimais foram

isoladas da medula ssea (MO) de roedores e coelhos por Friedenstein e

colaboradores (1976), e identificadas como unidades formadoras de colnias

semelhantes a fibroblastos, sendo consideradas como clulas precursoras de

fibroblastos. Posteriormente, foi observado que elas tinham a capacidade de se

diferenciar em clulas com caractersticas de osteoblastos, condrcitos e

adipcitos. Em concomitncia a esta descoberta, foi identificada uma

populao de clulas aderentes necessrias para o estabelecimento das

clulas estaminais hematopoiticas no aderentes, em um estudo sobre a

hematopoese in vitro desenvolvido por Dexter e colaboradores (1977). A partir

deste momento, em referncia sua localizao anatmica, um novo termo foi

estabelecido, clulas estromais da MO. Em analogia ao modelo de

hematopoese, o termo CTMH foi introduzido para designar uma populao de

clulas especficas do estroma da MO - clulas aderentes que originam os

diferentes tipos de tecidos mesenquimais, sseo, cartilagem e msculos

(Revisado por Meirelles e Nardi , 2009). Desde ento, clulas com

caractersticas semelhantes s CTMH foram isoladas de diferentes tecidos

adultos, tais como, tecido adiposo, pele, osso, msculo, crebro, fgado, rins,

pncreas, placenta, glndulas salivares, polpa dentria, ligamento periodontal,

folculo capilar, linfonodos, bao, timo e at menorreia (Revisado por Momin et

al., 2010; Ding et al., 2011). Elas tambm podem ser obtidas a partir de tecidos

perinatais, como do cordo umbilical, fluido e membrana amnitica, e crion

(Bieback e Brinkmann, 2010; Ding et al., 2011; Hass et al., 2011; Roubelakis et

al., 2012).

Em virtude das CTMH serem isoladas de diversos tecidos e cultivadas

em diferentes laboratrios por diversos mtodos, a sociedade internacional de

padronizao para terapia celular (The International Society for Cellular

Therapy Position Statement) formulou trs critrios mnimos exigidos para

21

identificao de CTMH: capacidade de adeso ao plstico de cultura; fentipo

positivo para os marcadores de superfcie CD105, CD73 e CD90, e negativo

para CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19e HLA-DR; e se

diferenciar in vitro em osteoblastos, adipcitos e condrcitos (Dominici et al.,

2006).

Em 2008, Crisan e colaboradores documentaram uma subpopulao de

clulas perivasculares humanas que expressam marcadores in situ para ambos

os tipos celulares, CTMH e pericitos. Este e outros estudos, que compararam o

fentipo das CTMH obtidas de diferentes fontes com os pericitos, sugerem

fortemente que as CTMH sejam pericitos (Revisado por Caplan, 2008), e que

sua natureza pleiotrpica seja responsvel pelo seu papel na renovao dos

tecidos mesenquimais in vivo (Revisado por Singer e Caplan, 2011). Contudo,

no h nenhuma confirmao definitiva de que a origem de CTMH do tecido

adiposo (ASC) seja de pericitos. Tornando o quadro mais complexo, dados

recentes indicam que as CTMH em vrios tecidos humanos podem originar-se

no s de pericitos (CD146 + CD34-CD31-CD45-), mas tambm a partir de um

subconjunto fenotipicamente distinto de clulas adventcias (CD34+CD146-

CD31-CD45-) que residem na camada mais externa da parede de vasos

maiores. Foi identificado que elas nativamente expressam marcadores de

superfcie de CTMH (tal como CD90) e comportam-se de maneira semelhante

s CTMH aps longo tempo de cultura in vitro (Revisado por Strioga et al.,

2012).

A diversidade de fontes para obteno das CTMH, a sua capacidade de

renovao, seu potencial de se diferenciar em mltiplas linhagens, aliados aos

avanos nas pesquisas sobre as suas propriedades biolgicas, posicionaram

as CTMH como as clulas-tronco adultas mais promissoras na utilizao em

protocolos de terapia celular. Vrios estudos mostram que as CTMH se

diferenciam in vitro em osso, cartilagem, tecido adiposo, cardiomicitos, clulas

endoteliais e clulas neuronais (Ohnishi et al., 2007; Fraser et al., 2006; Fu et

al., 2004; Fu et al., 2006, Karaoz et al. 2011). Uma caracterstica bastante

atraente est relacionada ao seu efeito parcrino de molculas bioativas que

exercem vrias funes importantes no reparo tecidual. Os principais efeitos

incluem: imunossupresso por meio da modulao da proliferao das clulas

22

T, B e NK (Natural killer), e da alterao da secreo de citocinas inflamatrias,

de imunoglobulinas; secreo de fatores anti-apoptticos, anti-cicatrizantes,

quimioatraentes, neuroprotetores, neurognicos e angiognicos; favorecimento

do crescimento e da diferenciao local de clulas-tronco e progenitoras;

(Revisado por Singer e Caplan, A.I, 2011; Revisado por Soleymaninejadia et

al., 2012; Revisado por Honmou, O. et al., 2012). As CTMH tambm

apresentam baixa expresso de MHC de classe I, MHC de classe II e das

molculas coestimuladoras B7-1/B7-2 (CD80/CD86), conferindo um

imunoprivilgio que propicia seu uso em transplantes alognicos e em doenas

auto-imunes (Revisado por Singer e Caplan, 2011; Bem-Ami et al., 2011;

Miguel et al., 2012).

Outra caracterstica interessante que as CTMH podem modular a

progresso do tumor e a sensibilidade a frmacos. Muitas evidncias

demonstram que elas apresentam tropismo para regio do tumor, promovem a

proliferao das clulas tumorais e conferem um fentipo de resistncia a

frmacos. No entanto, alguns estudos verificaram inibio de crescimento

tumoral em leucemias e hepatomas, por exemplo. Ainda no esto elucidados

os fatores que definem o papel das CTMH na progresso ou inibio tumoral.

Porm, acredita-se que seu tropismo pode favorecer o uso destas clulas como

veculo de frmacos para uma terapia anti-tumoral mais eficiente (Revisado por

Houthuijzen et al., 2012).

Um total de 225 estudos clnicos utilizando as CTMH para tratamento de

diferentes doenas est registrado no banco de dados do Instituto Nacional de

Sade dos Estados Unidos

(http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=stem+cell+mesenchymal&no_unk

=Y, acessado no dia 27 de agosto de 2012). Este nmero ainda subestimado

considerando que h muitos estudos em andamento que no so registrados

em bancos de dados. Ambas as pesquisas clnicas em andamento e a

plasticidade funcional das CTMH descrita acima demostram seu potencial de

utilizao na terapia celular de vrias doenas, tais como: cardiopatias,

doenas imunolgicas, doena de Crohn, angiognese, diabetes, esclerose

mltipla, injrias cerebrais isqumicas e terapia contra o cncer (Meirelles e

Nardi, 2009; Ciccocioppo et al., 2011;

23

http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=stem+cell+mesenchymal&no_unk

=Y, acessado no dia 27 de agosto de 2012).

A fonte mais comum para obteno de CTMH a medula ssea (MO-

CTMH) (Pittenger et al.,1999; Jiang et al.,2002). Apesar da identificao de um

novo mtodo (seleo negativa pelo sorteamento magntico seguido pelo

FACS - fluorochrome activated cell sorting para a depleo de linhagens

hematopoiticas e endoteliais) de isolar populaes mais enriquecidas em

clulas progenitoras mesenquimais/osteoblsticas (Mdder et al., 2012), ainda

existe uma necessidade de conhecer mais sobre fontes alternativas de CTMH

devido existncia de um nmero limitado de MO-CTMH disponveis para

utilizao autloga. H outros problemas em se utilizar MO-CTMH, como o

procedimento invasivo de aspirao deste tecido, e a diminuio significativa

da frequncia e potencial de diferenciao das MO-CTMH com o aumento da

idade do doador (Kretlow et al., 2008; Chen et al., 2009).

2.2. Cordo umbilical como fonte de CTMH

O cordo umbilical humano um anexo fetal originado de um

mesoderma extra-embrionrio, importante durante a gravidez e que

descartado aps o nascimento. Descrita em 1977 por Nanaev e colaboradores,

sua arquitetura interna constituda por vasos sanguneos, uma veia e duas

artrias, envoltos por um tecido conectivo, tambm chamado de geleia de

Wharton, delimitado pelo epitlio umbilical. A geleia composta por uma matriz

esponjosa, rica em fibras de colgenos e proteoglicanas, embebidas por

clulas estromais responsveis pela sntese dos componentes da matriz

(Revisado por Fan et al., 2011). Este tecido conectivo importante por prevenir

a compresso, toro, e o enrolamento dos vasos que realizam fluxo

sanguneo bidirecional entre o feto e a me (Can e Karahuseyinoglu, 2007).

So vrias as razes pelo crescente interesse em obteno de CTMH do

cordo umbilical, estas incluem: fonte de clulas-tronco prematuras, com o

potencial de diferenciao intermedirio entre as CTMH de outros tecidos

adultos e as clulas-tronco embrionrias (CTE); o uso do cordo no envolve

implicaes ticas, polticas ou religiosas como as CTE e ao contrrio destas,

as CTMH apresentam capacidade proliferativa finita e no formam teratomas

24

(Revisado por Troyer, e Weiss, 2008; Fan et al., 2011); derivam de tecidos que

so descartados aps o nascimento; maior acessibilidade, no h a

necessidade de procedimentos invasivos como ocorre na obteno de MO e

tecido adiposo; menor risco de infeco devido presena da barreira

placentria (revisado por Yang et al., 2012); possvel a obteno de maior

nmero de CMTH que possuem grande potencial proliferativo ao longo tempo

do cultivo comparadas s originadas da MO de idosos (Petsa et al., 2009;

Revisado por Fan et al., 2011); so hipoimunognicas, enquanto as CTE

podem provocar uma resposta imunolgica depois do transplante (Revisado

por Bieback e Brinkmann, 2010).

As vantagens descritas acima colocaram as CTMH do cordo como uma

importante fonte alternativa de clulas para uso na terapia celular. Vrios

estudos j demonstram seu potencial em regenerao cutnea (Revisado Yang

et al., 2012), cardiomiognico (Roura et al., 2010; Bai et al. 2012), em reparo

de danos neurolgicos (Lu et al., 2012; Dalous et al., 2012, Koh et al.,2008).

Em uma consulta ao banco de dados do Instituto Nacional de Sade dos

Estados Unidos (http://www.clinicaltrials.gov), utilizando os termos Umbilical

Cord e Mesenchymal Stem Cell, acessado no dia 30 de agosto de 2012, foram

encontrados 43 estudos clnicos registrados, incluindo: hepatite auto imune;

cirrose biliar primria, reconstituio imunolgica de pacientes com HIV; cirrose

heptica; doena de Alzheimer; displasia broncopulmonar; esclerose lateral

amiotrfica; nefrite lpica; colite ulcerativa; diabetes tipo 1; cardiopatia dilatada

idioptica; ataxia hereditria; esclerose mltipla e neuromielite ptica; distrofia

muscular de Duchene; artrite reumatoide e queimadura aguda.

As CTMH podem ser obtidas de vrios constituintes do cordo: sangue

do cordo umbilical, da geleia de Wharton, regio perivascular, e do endotlio

da veia (Troyer e Weiss, 2008). Em 2009, tambm foram isoladas das artrias

(Ishige et al., 2009). Desde 1998 o sangue do cordo umbilical tem sido

utilizado para transplante de clulas-tronco hematopoiticas. Em 2000, foi

identificada a presena de CTMH no sangue do cordo umbilical (Erices et al.,

2000). Posteriormente, outros estudos apontaram o sangue como fonte dessas

clulas (Lee et al., 2004; Goodwin et al., 2001; Bieback et al., 2004). No

entanto, em 2001, Mareschi e colaboradores tentaram isolar CTMH da MO e do

25

sangue do cordo, obtendo sucesso apenas com a MO. Outros estudos

tambm falharam ou tiverem uma eficincia de isolamento muito baixa (Wexler

et al., 2003; Romanov et al., 2003). Tais resultados motivaram pesquisas por

novas fontes de CTMH, levando descoberta da presena de CTMH no

endotlio da veia do cordo (Romanov et al., 2003; Covas et al., 2003) e da

geleia de Wharton (Wang et al., 2004; Fong et al.; 2007). Posteriormente,

outros pesquisadores documentaram a presena de CTMH numa regio que

fica ao redor dos vasos umbilicais (Baksh et al., 2007; Sarugaser et al., 2005).

Apesar de muitas partes do cordo serem fontes de CTMH com

fentipos muito semelhantes, algumas diferenas tm sido documentadas em

relao sua eficincia de isolamento, capacidade de expanso e de

diferenciao. Um estudo comparando a eficincia de obteno de CTMH a

partir do sangue e de todo o tecido do cordo revelou que o sucesso de

isolamento do primeiro muito baixo, ao contrrio da eficincia de 100% obtida

a partir do segundo. Os autores sugeriram que nos bancos de cordo deveriam

ser estocados tanto o sangue como o tecido (Secco et al., 2008). A baixa

quantidade de clulas e taxa de crescimento das CTMH do UCB so

considerados fatores limitantes para seu uso na medicina regenerativa (Musina

et al., 2007). Fong e colaboradores (2010) tambm identificaram o tecido do

cordo como ma fonte mais rica em CTMH e que sua capacidade proliferativa

maior do que as do sangue do cordo. No entanto, um novo mtodo de

obteno das CTMH do sangue do cordo foi mais eficiente e sugere que esta

fonte ainda possa se constituir em uma alternativa importante (Hussein et al.,

2012). Outro estudo tambm concluiu que a capacidade de expanso das

clulas estromais da geleia de Wharton maior do que as obtidas dos vasos

do cordo (Karahusevinoglu et al., 2007). O tempo necessrio para dobrar a

populao (PDT) das CMTH dos vasos do cordo de at 60 horas (Sarugaser

et al., 2005), enquanto o PDT das obtidas dos vasos do cordo de 24 a 25

horas (Fong et al., 2010). Alguns pesquisadores demonstraram que CTMH

derivadas dos vasos do cordo umbilical compartilham morfologia, marcadores

imunofenotpicos e capacidade de diferenciao similares quelas da MO

(Romanov et al., 2003; Covas et al., 2003; Kim et al., 2004; Panepucci et al.,

2004; Kadivar et al., 2006; Ishige et al., 2009; Li et al., 2010).

26

As diferenas citadas acima podem ocorrer devido aplicao de

metodologias distintas de isolamento e condies de cultura, prpria

identidade biolgica dos doadores, ou por outro lado, sugerir potencialidades

distintas para estas populaes celulares. Apesar de existirem vrios trabalhos

sobre CTMH isoladas de tecidos umbilicais, o conhecimento biolgico e

gentico sobre elas ainda insuficiente para que o seu potencial teraputico

seja explorado com segurana e eficcia, sobretudo no que diz respeito s

CTMH isoladas da veia do cordo umbilical humano. Alm disso, o uso dessas

clulas na clnica depende de seu isolamento e expanso in vitro. Portanto,

informaes sobre as propriedades biolgicas dessas clulas aps um longo

perodo de cultivo pode auxiliar na elaborao de novas estratgias que

assegurem e monitorem a manuteno do fentipo de clula-tronco,

oferecendo maior garantia e segurana para seu uso nos tratamentos clnicos.

2.3. Senescncia celular

O processo de senescncia celular foi originalmente caracterizado pela

capacidade limitada de diviso celular de fibroblastos humanos in vitro por

Leonard Hayflick e Paul Moorhead (1961), sendo chamada de senescncia

replicativa. Posteriormente, esta condio foi atribuda diminuio do

comprimento dos telmeros e ausncia da telomerase. Adicionalmente,

muitas clulas somticas humanas sofrem senescncia replicativa in vitro

(revisado Chen et al., 2007). Um estudo desenvolvido por Takubo e

colaboradores (2010) demonstra que o envelhecimento dos tecidos in vivo

tambm deve estar relacionado ao encurtamento dos telmeros. Estes

pesquisadores observaram que, com poucas excees, principalmente crebro

e miocrdio, a taxa de reduo do telmero (pb/ano) muito semelhante em

mais de duas dezenas de tecidos retirados de pacientes humanos na faixa

etria de recm-nascido at 100 anos. Estudos adicionais demonstraram que o

telmero encurtado se constitui como um stio de leso no DNA e que este

ativa uma resposta ao dano no DNA (DDR DNA damage response))

envolvida com a senescncia replicativa (revisado Chen et al., 2007). O

desgaste acelerado do telmero est implicado com vrias doenas humanas

relacionadas idade como, aumento de risco ao desenvolvimento de cncer,

doena de Alzheimer, sndromes progerides (por exemplo, Werner e Bloom),

27

Diabete Mellitus, osteoartrite, aterosclerose, diminuio da cicatrizao de

feridas e da resposta imune (revisado por Bekaert et al., 2005).

Alm do encurtamento dos telmeros, outros fatores esto associados

senescncia celular, tais como estresse oxidativo (Toussaint et al., 2000);

senescncia prematura induzida por estresse (Serrano e Blasco, 2001;

Toussaint et al., 2000); ativao de oncogenes (revisados por Prieur e Peeper,

2008); e ativao da DDR (revisado por dAdda di Fagagna, 2008).

Resumidamente, o mecanismo de senescncia celular pode ser explicado da

seguinte maneira: danos no DNA (causados por vrios tipos de estresse como,

disfuno telomrica; quebras de dupla fita; estresse oxidativo; e ativao de

oncogenes) resultam na ativao da DDR promovendo a parada no ciclo

celular de forma irreversvel, mesmo na presena de fatores de crescimento

(revisado por Magalhes, 2004).

Alguns estudos tem contribudo para uma contribuio na compreenso

de mecanismos moleculares senescncia envolvidos com a parada do ciclo

celular. Genes como CCNA2, que promovem a proliferao celular, podem ter

sua expresso inibida. Alguns trabalhos demonstram que genes supressores

tumorais, como P16/RB e P53/p21, podem levar formao de SAHF. Estes

genes fazem parte da via DDR relacionada senescncia (Revisado por Sikora

et al., 2011). Tambm foi observado que nas clulas senescentes so

formados focos de heterocromatina (SAHF- senescence-associated

heterochromatic foci), que podem contribuir para a natureza irreversvel da

senescncia.

Assim, basicamente, em virtude de uma clula senescente sofrer uma

parada no ciclo celular de forma irreversvel, este processo considerado

como uma proteo contra o desenvolvimento do cncer (Braig et al., 2005;

Chen et al., 2005; Collado et al., 2005; Courtois-Cox et al., 2006; Michaloglou et

al., 2005). No entanto, as clulas senescentes no sofrem apenas parada do

ciclo celular, estas sofrem alteraes no seu fentipo, afetando sua morfologia

e funo (CampisiedAdda di Fagagna, 2007). Elas adquirem aumento do seu

tamanho, numerosos grnulos no seu citoplasma e aumento da atividade de

beta galoctosidase. Outra caracterstica que clulas senescentes exibem

instabilidade cromossmica (Arendt et al., 2009; MosieniakeSikora, 2010;

28

Wojda et al., 2006) e adquirem um fentipo secretoma caracterstico, chamado

de fentipo secretrio associado senescncia (SASP - senescent-associated

secretory phenotype). Ele compreende o aumento no nvel de liberao de

mais de 40 fatores que atuam na sinalizao celular, fatores de crescimento,

proteases, entre outros (Revisado por Davalos et al., 2010). Foi proposto que o

SASP contribui para a manuteno da senescncia no tecido e para o

desenvolvimento de doenas relacionadas idade e d suporte

carcinognese (Revisado por Sikora et al., 2011). Contudo, detalhes

moleculares das redes de interaes de vias relacionadas ao processo de

senescncia celular ainda precisam ser elucidados para uma melhor

compreenso sobre a sua ligao com o envelhecimento in vivo, com o

surgimento de doenas e com o cncer.

No indivduo adulto, a homeostasia do tecido se d por meio da

renovao e diferenciao de clulas-tronco somticas, especficas de cada

tecido. Durante o envelhecimento, fatores ambientais, o gentipo do indviduo e

fatores estocsticos podem induzir gradualmente alteraes genticas e

epigenticas que causam um declnio das funes de clulas-tronco que pode

ser a origem das doenas metablicas, degenerativas, cncer e o

envelhecimento dos indivduos (Revisado por Rodrguez-Rodero, et al. 2011).

Esta proposio est em conformidade com a observao de que o

envelhecimento afeta a renovao e a capacidade de diferenciao de CTMH

residentes no tecido adiposo e na MO de indivduos mais velhos (Alt et al.,

2012; Kretlow et al., 2008; Chen et al., 2009), bem como a morfologia das

CTMH obtidas da MO em indivduos idosos (Zaim et al., 2012). As vias

envolvidas com as alteraes na sequncia do DNA no envelhecimento das

clulas-tronco somticas no so claras, mas alguns estudos sugerem que o

comprimento do telmero ou deficincias no reparo possam fazer parte destas

rotas (Revisado por Rodrguez-Rodero et al., 2011).

Algumas caractersticas de senescncia replicativa j foram descritas em

CTMH cultivadas aps longo tempo in vitro. Wagner e colaboradores (2008)

estudaram o efeito da senescncia replicativa de MO-CTMH, comparando as

clulas na passagem 7 e na passagem 12. Os resultados deste trabalho

demonstraram que as MO-CTMH na passagem mais tardia apresentaram uma

capacidade finita de diviso celular; alteraes na sua morfologia, tornaram-se

29

maiores; declnio na expresso de marcadores moleculares especficos, bem

como, diminuio de seu potencial de diferenciao adipognico e aumento do

osteognico. Outros autores demonstram que as MO-CTMH perdem

gradualmente sua capacidade progenitora (Banfi et al.,2000). Alm destas

consequncias funcionais, o co-cultivo de CTMH com HSC evidenciou que

quando foi utilizado CTMH de passagens tardias houve um aumento da

proliferao de clulas progenitoras hematopoiticas enquanto que com CTMH

de passagens iniciais as HSC mantiveram um fentipo mais primitivo (Walenda

et al., 2009). Como j foi descrito que a secreo de fatores de crescimento e

citocinas por fibroblasto pode ser influenciada pelo tempo de cultura (Coppe et

al. 2008), uma sugesto que as funes imunomoduladoras de CTMH

possam ser alteradas durante a expanso na cultura por alterao no seu perfil

secretrio.

Os estudos de senescncia celular tm utilizado o nmero de

passagens, o tempo para duplicao da populao (PD- Population doublings);

e a deteco da -galactosidase (SA--gal), para identificar as clulas

senescentes aps sua expanso. O nmero de passagens representa o

nmero de vezes que a cultura foi expandida. O tempo requerido para isto

depende do nmero de clulas semeadas inicialmente, o qual afeta o momento

em que elas alcanam a confluncia, e, consequentemente, a frequncia da

passagem. Portanto, podem haver diferenas laboratoriais produzindo artefatos

no estudo da senescncia. O PD o quociente entre o nmero de clulas

colhidas dividido pelo nmero de clulas que foram inicialmente semeadas. No

entanto, este nmero expressa apenas o nmero cumulativo de divises

celulares de toda a cultura, independentemente de clulas individuais; algumas

clulas podem ser perdidas durante a lavagem; e j documentado que h

diferenas entre PD sob mesma condio de cultura entre doadores. O ensaio

da enzima SA--gal um mtodo bem estabelecido que pode ser aplicado em

preparaes de CTMH. Embora ele no facilite a quantificao absoluta de

clulas senescentes, a enzima ativa apenas em senescentes e no em

quiescentes, pr-senescentes, ou diferenciadas (Revisado por Wagner et al.,

2010). Entretanto, em culturas confluentes pode ocorrer a colorao com a SA-

-gal que aumentada pela inibio por contato (Gary e Kindell, 2005).

30

2.4. Estabilidade genmica das CTMH ao longo tempo de cultivo

A proliferao das clulas em cultivo usualmente maior do que in vivo,

com isso elas esto sujeitas a acumular mais danos no DNA quando

expandidas in vitro. Diversos estudos relatam que o tempo de cultivo pode

levar aquisio de alteraes cromossmicas em CTMH humanas (Bochkov

et al., 2007; Maitra et al., 2005; Sareen et al., 2009; Stephenson et al., 2010;

Ueyama et al., 2011;). O mais recente e maior estudo de estabilidade genmica

em clulas-tronco adultas utilizou 400 amostras isoladas de diferentes tecidos

(de MO, tecido adiposo, cordo umbilical e tecidos fetais) e nove amostras de

CTMH derivadas de CT embrionrias. Estes autores encontraram nove

alteraes em seis das 144 amostras de CTMH analisadas, uma frequncia de

4%, menor do que a encontrada em CT neurais e CT pluripotentes induzidas,

ambas apresentaram cerca de 9%. Eles demonstraram que a presena de

alteraes cromossmicas uma caracterstica comum de clulas-tronco

propagadas in vitro, e sugeriram que cada tipo de clula-tronco tem uma

predisposio a adquirir um conjunto particular de alteraes cromossmicas.

Em CTMH foi identificada uma tendncia ao surgimento de monossomia, uma

delas foi do cromossomo 13. Tal alterao relacionada com tumores

mesenquimais, frequente em tumores de tecidos moles e osso (lipomas,

condrossarcomas e osteossarcomas) (Ben David et al., 2011). Alm disso, em

modelos animais, CTMH expandidas in vitro apresentam uma alta

susceptibilidade transformao maligna (Miura et al., 2006; Tolar et al., 2007;

Ren et al., 2011).

No entanto, h tambm alguns estudos que no encontraram

aberraes cromossmicas em MO-CTMH aps sua expanso in vitro (Zhang

et al., 2007; Choumerianou et al., 2008; Spees et al., 2004; Bernardo et al.,

2007 a, b). CTMH isoladas de lquido amnitico e da vilosidade corinica,

expandidas at chegar senescncia, apresentaram caritipo normal,

indicando que as CTMH fetais so estveis e podem ser usadas na medicina

regenerativa (Poloni et al., 2011). Descries de transformao espontnea in

vitro em CTMH humanas (Rubio et al., 2005; Rosland et al., 2009), foram

desvalidadas pela retratao destes trabalhos, afirmando que os resultados de

31

transformao encontrados foram originados de contaminao cruzada (de La

Fuente et al., 2010; Torsvik et al., 2010). Contudo, a presena de aneuploidia

em vrias preparaes de MO-CTMH para aplicao clnica foi observada

depois de seu cultivo. No entanto, como valores de expresso de genes

relacionados transformao estavam normais, os autores sugeriram que

aneuploidia poderia aparecer durante a expanso, mas isso no significaria

uma transformao, e sim uma senescncia celular (Tarte et al., 2010). Depois

disso, as pesquisas clnicas com CTMH na Frana foram liberadas, mesmo

sendo identificadas aneuploidias.

A inexistncia de alteraes cromossmicas tambm foi relatada em

CTMH do cordo umbilical expandidas in vitro (Spees et al., 2004). Um estudo

com infuso de CTMH em modelos animais revelou que em nenhum dos

camundongos tratados com CTMH da geleia de Wharton houve o

aparecimento de doena e nem reaes inflamatrias (Fong et al., 2010;

Gauthaman et al., 2012). Estes estudos indicam que as CTMH do cordo

umbilical so hipoimunognicas e no tumorignicas, com grande potencial

para o uso seguro na terapia celular. Nekanti e colaboradores (2010)

observaram caritipos normais de CTMH da geleia de Wharton expandidas at

a passagem 20. Duarte e colaboradores (2012) encontraram um grande

nmero de alteraes cromossmicas aps a criopreservao das UV-CTMH

de um dos cordes, entretanto, nenhuma alterao clonal foi observada.

Apesar da maioria dos achados apontarem para uma maior estabilidade

das CTMH comparadas aos outros tipos de clulas-tronco, embrionrias e

pluripotentes induzidas, os relatos do surgimento de alteraes cromossmicas

em cultura merecem ateno, uma vez que estas podem estar relacionadas

com os eventos de insucesso da terapia celular, ou de carcinognese. O efeito

de alteraes cromossmicas na biologia das CTMH expandidas in vitro deve

ser estudado por uma investigao mais detalhada que fornea conhecimentos

moleculares dos processos celulares afetados.

32

2.5. Microarranjos e Estudos de expresso gnica em CTMH

Uma maneira de conhecer a funo dos genes por monitoramento da

expresso de milhares de genes em uma amostra sobre uma determinada

condio. O conjunto de molculas de RNA transcritas de um genoma

chamado de transcriptoma. O mtodo mais comum para sua avaliao o de

microarranjos (Auer et al., 2009; Hey e Pepper, 2009). Eles so um conjunto de

sequncias de DNA (DNA complementar ou oligonucleotdeo) construdas

artificialmente, complementares aos transcritos dos genes que se deseja

interrogar a expresso, e distribudas em stios especficos (spots ou probe cell)

em uma superfcie slida. Cada spot contm centenas de cpias das

sequncias de desoxirribunucleotdeos complementares a um nico RNA alvo

(Revisado por Bute, 2002).

Na pesquisa mdica, o estudo do perfil de expresso por microarranjos

surge como uma ferramenta til para melhor compreenso de doenas,

identificao de novos alvos teraputicos, e subclassificao de doenas para

identificar estratgias mais individualizadas de tratamento (Revisado por Auer

et al., 2009). Em outras pesquisas bsicas e aplicadas, sua anlise tem como

objetivo acessar o perfil molecular de uma dada amostra; descobrir novos

biomarcadores; ou fornecer informaes para fazer novas anotaes do

genoma. As duas anlises principais deste mtodo consistem em testar genes

diferencialmente expressos entre duas ou mais condies, e identificar as

categorias funcionais mais representadas pelos genes diferencialmente

expressos em um estudo (Revisado por Kauffmann e Huber, 2010).

Na ultima dcada, os avanos nesta tecnologia, bem como o

desenvolvimento de programas para a anlise dos seus dados, aumentaram a

confiabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade desta tcnica, por exemplo, por

meio de um melhor controle da qualidade de dados (Revisado por Kauffmann e

Huber et al., 2010; Revisado por Snchez-Pla et al., 2012). Dentre as vrias

plataformas de microarranjos disponveis, GeneChips Affymetrix so os mais

frequentemente usados para analisar perfil de expresso, mais de 3000

publicaes cientficas descreveram resultados com esta tecnologia (Auer et

al., 2009). Estes microarranjos consistem numa matriz de alta densidade de

oligonucleotdeos, e cada transcrito detectado por um grupo particular de

33

sequncias de sondas com 25 nucleotdeos, conhecidos como um conjunto de

sonda (probe set). O agrupamento das intensidades em vrias sondas resulta

em uma medida nica de expresso de um gene. Um dos microarranjos da

affymetrix, o GeneChip Human Genome U133 plus 2.0 Array (HG U133

Plus 2.0). Neste h 1.300.000 oligonucleotdeos nicos cobrindo mais de

47.000 transcritos e variantes (acessado em:

http://media.affymetrix.com/support/technical/datasheets/hgu133arrays_datash

eet.pdf, no dia 08 de setembro de 2012).

Embora ainda haja algumas limitaes na tcnica de microarranjos,

como sua incapacidade de descoberta de novos RNA mensageiros, ela

considerada uma tecnologia consolidada para anlise de transcriptoma

utilizada a mais de uma dcada. Mais recentemente, muita ateno tem sido

dada ao sequenciamento de RNA (RNA-seq). Esta nova abordagem, uma das

tcnicas de sequenciamento de ltima gerao (next-generation sequencing

NGS), supera as limitaes da primeira. No entanto, acredita-se que sua

existncia no extinguir a utilizao dos microarranjoss. A escolha dever se

dar pelo custo, disponibilidade, e a necessidade de cada pesquisa (Revisado

por Snchez-Pla et al., 2012).

Recentemente, um banco de dados denominado Stem Base

(http://www.stembase.ca/?path=/) foi desenvolvido com o propsito de oferecer

uma interface entre os dados gerados pela Rede Canadense de Clulas-

tronco, para facilitar a descoberta de funes de genes relevantes no controle e

diferenciao celular. Este banco disponibiliza trs opes para seu uso:

pesquisa por experimentos, busca por amostras ou sondas, e anlises de

dados de expresso do banco a partir de uma lista de genes de interesse do

usurio. Dados de Microarranjos da Affymetrix de 50 amostras de clulas-

tronco humanas foram depositados no Stem Base. Dentre estas, a maioria de

clulas-tronco hematopoiticas e no h nenhuma amostra de CTMH humana,

apenas 18 de clula-tronco mesenquimal de camundongo (Sandie et al., 2009).

Os estudos de anlise de expresso gnica global em CTMH tm

focado, basicamente, em dois aspectos: no processo de diferenciao celular

(Kock et al., 2011; Menssen et al., 2011; Roobrouck et al., 2011; Yoo et al.,

2011) e nas diferenas entre CTMH de fontes distintas (Jansen et al., 2010;

Miranda et al., 2012; Panepucci et al., 2004; Secco et al., 2009; Tsai et al.,

34

2007; Weng et al., 2011; Kim et al., 2011). CTMH isoladas a partir da veia do

cordo so funcionalmente semelhantes s MO-CTMH, mas genes

diferencialmente expressos podem refletir as diferenas relacionadas aos seus

locais de origem: MO-CTMH seriam mais comprometidas com a osteognese,

enquanto CTMH do cordo seriam mais comprometidas com a angiognese

(Panepucci et al., 2004). Uma comparao, mais recente, de dados de

transcriptoma e protemica entre CTMH da veia do cordo e MO-CTMH,

encontrou alguns genes/protenas diferencialmente expressos, mas que

participam de funes celulares semelhantes (Miranda et al., 2012).

Os estudos descritos acima mostram que CTMH residentes em locais

distintos guardam muitas semelhanas, sugerindo uma origem comum, e

diferenas que possivelmente refletem distintas propriedades biolgicas

adquiridas pelo seu nicho natural (tais como, potenciais de proliferao e

diferenciao), que, talvez, possam ser modificadas com a escolha adequada

das condies de cultivo. Por exemplo, a substituio do meio de cultivo de

CTMH pelo de MAPC (Multipotent Adult Progenitor Cells), tornou as CTMH

capazes de se diferenciar em clulas semelhantes s endoteliais e aumentou a

expresso de cinco transcritos endoteliais (CD34, VWF, FLK1, FLT1, TIE2)

(Roobrouck et al., 2011).

Alguns trabalhos sugerem que o tempo de cultivo afeta a expresso

gnica. MO-CTMH na passagem 10, cultivadas em Soro Fetal Bovino (SBF),

que tiveram diversos transcritos regulados positivamente, incluindo alguns

envolvidos com a inibio do ciclo celular. Enquanto, que MO-CTMH na mesma

passagem cultivadas com soro autlogo, mantiveram uma expresso estvel

(Shahdadfar et al., 2005). Um estudo, utilizando um arranjo de baixa densidade

(Human Stem Cell Pluripotency Low Density), contendo marcadores de clulas-

tronco indiferenciadas e alguns de linhagens no estgio inicial de diferenciao,

verificou que a expresso de alguns marcadores de clulas indiferenciadas

diminuiu em CTMH da geleia de Wharton e MO-CTMH nas passagens tardias

(P15-p20), sendo observada uma maior diminuio em MO-CTMH, sugerindo

uma manuteno do fentipo de clula-tronco mais forte em CTMH da geleia

de Wharton comparadas s MO-CTMH aps expanso in vitro (Nekanti et al.,

2010). O transcriptoma de MO-CTMH e ASC humanas, na passagem 20 (P20)

e 30 (P30), respectivamente, no foi afetado de maneira significativa. No

35

entanto, esse mesmo estudo detectou diminuio na quantidade da protena

p53 em ASC em P30. O estudo ainda comparou estas linhagens com as

mesmas obtidas de macaco Rhesus em passagens iguais, sendo observada

uma alterao significativa no perfil de expresso de genes envolvidos com o

ciclo celular, resposta ao dano e reparo do DNA, tais como TP53. A diminuio

da expresso da p53 pode estar relacionada com a menor taxa de apoptose

nas ASC humanas e de clulas-tronco mesenquimais de MO de Rhesus na

passagem 30, bem como associada com o fato de que estas ltimas

puderam ser cultivadas alm da passagem 30 (Izadpanah et al., 2008).

Uma anlise de expresso gnica, por meio de protemica, de CTMH da

geleia de Wharton depois da expanso in vitro at a 12 passagem, revelou

que diversas protenas, incluindo Shootin1, Adenilatoquinase 5 isoenzima e

inibidor do ativador do plasminognio-2 j no so expressas aps a passagem

2, sugerindo que a potncia proliferativa destas clulas reduzida aps a sua

fase inicial de crescimento in vitro. Este estudo tambm observou que na ltima

passagem analisada, houve o surgimento de novas protenas, incluindo, ERO1-

alfa, aspartil-tRNA sintetase e prolil-4-hidroxilase, indicando que estas

protenas estejam envolvidas na dificuldade de sobrevivncia e diferenciao

celular aps o tempo de cultivo (Angelucci et al., 2010). O perfil de expresso

gnica de CTMH de diferentes origens (lquido amnitico, membrana amnitica,

sangue do cordo, e MO) permaneceu estvel entre as passagens 3 e 6,

durante a cultura in vitro , e depois da criopreservao (Tsai et al., 2007).

36

3.0. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo geral analisar o efeito da

senescncia no perfil de expresso gnica das CTMH/inv, que tm a inverso

cromossmica (inv(3)(p13p25~26), e das CTMH/n, que apresentam caritipo

constitucional normal, sob as mesmas condies de cultivo, bem como

comparar, pela primeira vez, o perfil de expresso gnica de CTMH/inv com o

perfil de CTMH/n jovens e senescentes.

Objetivos especficos:

Identificar o nmero de passagens in vitro necessrio para

obteno de uma cultura celular senescente;

Verificar se h diferena entre o perfil de expresso de

senescentes vs jovens em cada CTMH/inv e CTMH/n;

Verificar se h diferena entre o perfil de expresso de CTMH/inv

vs CTMH/n, jovens e senescentes;

Verificar se a expresso diferencial de genes identificados na

anlise de microarranjos corroborada por PCR em tempo real;

Identificar as categorias funcionais mais representadas pelos

genes diferencialmente expressos para cada comparao;

Construir redes de interao gnica e identificar gargalos destas

redes para auxiliar na interpretao biolgica dos processos

afetados.

37

4.0. MATERIAL E MTODOS

4.1. Isolamento e Caracterizao das CTMH

No presente trabalho, foram utilizadas CTMH obtidas do endotlio da

veia do cordo umbilical de trs doadores. Os cordes foram coletados na

maternidade Janurio Cicco da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN). Todas as mes que doaram os cordes assinaram o termo de

consentimento livre e esclarecido de acordo com aprovao do Comit de

tica em Pesquisa da UFRN sob o protocolo n. FR132464. Os procedimentos

realizados para a coleta de todos os cordes, bem como o isolamento, a

caracterizao imunofenotpica por citometria de fluxo, as diferenciaes

adipognica, osteognica e condrognica, e a anlise citogentica das CTMH

do endotlio da veia do cordo seguiram os protocolos realizados por Duarte et

al. (2012).

As CTMH isoladas dos trs cordes umbilicais foram caracterizadas

citogeneticamente por Cornlio (2012), Um dos cordes tem uma alterao

cromossmica constitucional: inverso paracntrica no brao curto do

cromossomo 3, caritipo: 46,XY,inv(3)(p13p25~26) (Duarte et al. 2012), esta

linhagem aqui denominada como CTMH/inv. Muitas clulas CTMH/inv

senescentes apresentaram instabilidade gentica, caracterizada pelo

surgimento de alteraes cromossmicas, especialmente, associaes

telomricas (tas) e ganho de material gentico do cromossomo 20, que so

alteraes caractersticas de tumor sseo de clulas gigantes (TCG). Os outros

dois cordes possuem caritipo constitucional normal, portanto, no presente

trabalho as CTMH isoladas de tais cordes sero denominadas CTMH/n.

38

4.2. Condies de cultura das CTMH para anlise do seu perfil de

expresso gnica

As clulas recuperadas da criopreservao, conforme protocolo de

Duarte et al. (2012), foram plaqueadas em frascos T25 com meio alfa-MEM

(Gibco), suplementadas com 10% de SFB (Gibco) e 1% de soluo de

antibitico (penicilina e estreptomicina Sigma ou Gibco) e mantidas 37 C

em incubadora umidificada com 5% de CO2. Ao atingir a confluncia de 60-

70%, as clulas foram expandidas utilizando 1mL de 0,25% de tripsina/EDTA

(Invitrogen). Depois de contadas em hemocitmetro com azul de tripan (Gibco),

as clulas foram plaqueadas novamente em uma concentrao de 4000

clulas/cm2 em diferentes frascos de cultura, este procedimento caracteriza

uma passagem (P) celular. As clulas foram monitoradas em microscpio

invertido (CKX 41, OLYMPUS) e a troca de meio foi realizada a cada 72 horas

ou quando o meio ficava amarelado, indicativo de mudana de pH.

A expanso teve continuidade at a passagem 18 para obteno das

amostras para anlise de expresso gnica das CTMH obtidas de dois cordes

(cordo 10 caritipo normal - com 9 replicatas experimentais e cordo 04

inv(3)(p13-25~26) - com 6 replicatas experimentais), e at a 9 passagem para

CTMH do outro cordo (cordo 12 caritipo normal com 3 replicatas

experimentais), seguindo as mesmas condies de cultivo descritas acima.

Portanto, as passagens de cultura utilizadas para as anlises do perfil de

expresso gnica foram:

a) Passagem 9 consideradas como CTMH jovens isoladas do cordo

com inverso (grupo CTMH/inv) e de dois cordes com caritipo

constitucional normal (grupo CTMH/n).

b) Passagem 18 consideradas como CTMH senescentes isoladas do

cordo com inverso (grupo CTMH/inv) e de um cordo com caritipo

constitucional normal (grupo CTMH/n).

Aps a passagem 18, as clulas foram expandidas at o momento

em que no foi possvel realizar um novo subcultivo, isto ocorreu na passagem

39

24. Nessa ltima passagem, as clulas foram mantidas em cultivo com trocas

de meio e monitoradas diariamente pela observao em microscpio invertido.

4.3. Caracterizao das CTMH senescentes

As clulas foram definidas como senescentes ao se visualizar em

microscpio invertido (CKX 41, OLYMPUS) as seguintes caractersticas:

aumento do tamanho celular, alterao na morfologia, aumento na presena de

clulas vacuolizadas, diminuio da capacidade proliferativa e maior proporo

de clulas flutuantes no meio de cultura.

Alm disso, foi realizado o ensaio para deteco da atividade da -

galactosidase em pH 6,0, utilizando o Kit Senescence - galactosidase da Cell

Signaling Technology, conforme as instrues do fabricante (Chemicon, USA)

Resumidamente, as clulas foram fixadas durante 5 min temperatura

ambiente em soluo fixadora 1X, em seguida, foram lavadas e incubadas

durante a noite 37 C com soluo de colorao SA--gal. Posteriormente,

as clulas foram lavadas com PBS e visualizadas utilizando um microscpio de

luz. As clulas que apresentaram colorao verde foram consideradas

senescentes. Para evitar a interferncia da confluncia celular, o ensaio foi

realizado em culturas com 60% de confluncia em triplicatas experimentais.

4.4. Extrao de RNA

O RNA total foi extrado de 1x106 clulas (~90% de confluncia) em dois

momentos: na passagem 9, caracterizadas como clulas jovens das CTMH/inv

(obtidas do cordo 04) e CTMH/n (obtidas dos cordes 10 e 12); e na

passagem 18, caracterizadas como senescentes das CTMH/inv (obtidas do

cordo 04) e CTMH/n (obtidas do cordo 10).

O protocolo da extrao seguiu as instrues contidas no manual do

RNeasy mini kit (Qiagen). O RNA extrado foi mantido -80 C at sua

utilizao nos ensaios de expresso gnica. A sua avaliao quanto

integridade e quantidade foi, respectivamente, realizada por ensaios utilizando

o Agilent 2100 Bioanalyzer RNA (Agilent Technologies) e o espectrofotmetro

NANODROP (Nano Drop Technologies Inc.), seguindo as instrues dos

manuais dos mesmos. Todos os parmetros exigidos para publicao

40

utilizando o mtodo de reao em cadeia de polimerase com transcriptase

reversa (RT-PCR) em tempo real foram devidamente avaliados conforme

descritos por Bustin e colaboradores em 2009. Todas as amotras de RNA

utilizadas para os ensaios de microarranjos e de RT-PCR em tempo real

apresentaram RIN 9,0 e razo 260/280 prxima ao valor 2,0.

41

4.5. Preparao do RNA, Hibridizao e Captura da imagem do

Microarranjos.

Do RNA total extrado de cada replicata de todas as CTMH/n e

CTMH/inv, jovens e senescentes, 100 ng foi utilizado para a marcao

utilizando o GeneChip 3 IVT Express Kit (Affymetrix Inc.) de acordo com as

instrues do mesmo. Resumidamente, a primeira fita cDNA foi sintetizada

pela transcrio reversa utilizando um primer oligo dT etiquetado com um

promotor T7 a partir do RNA total 42 C por 2 horas. Este cDNA foi ento

convertido em dupla fita utilizando a complementariedade do promotor T7 da

primeira fita do cDNA 16 C por 1 hora. Posteriormente, foi realizada uma

transcrio in vitro para sintetizar RNA marcado (aRNA) por meio da

incorporao de nucleotdeos conjugados com biotina 40 C por 16 horas. O

aRNA foi ento purificado por microesferas magnticas e 15 g deste foi

fragmentado 94 C por 35 minutos. O aRNA purificado e fragmentado foi

mantido -20 C at sua hibridizao no Laboratrio Nacional de Luz Sncroton

(LNLS) em Campinas-SP. Depois, 12,5 g do aRNA fragmentado foi

hibridizado no microarranjo Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0 arrays,

juntamente com os controles e a soluo de hibridizao conforme indicado

pelo Hybridization, Wash, and Stain Kit (Affymetrix Inc). Em seguida, os

microarranjos foram mantidos em uma incubadora, Genechip Hybridization

Oven-640 (Affymetrix Inc), com rotao de 60rpm 45C por 16 horas. Depois,

os microarranjos foram lavados na estao de lavagem, Genechip Fluidics

Station-450 (Affymetrix Inc), e corados para amplificao do sinal com o

Hybridization, Wash, and Stain Kit (Affymetrix Inc), como indicado pelo manual

do fabricante. Os microarranjos foram escaneados com o Affymetrix Gene-Chip

Scanner-3000-7G (Affymetrix Inc). A qualidade da hibridizao foi avaliada pelo

Affymetrix GCOS software seguindo as instrues do fabricante.

4.6. Anlises dos dados de microarranjos

Os dados obtidos da hibridizao foram monitorados quanto sua

qualidade inserindo os arquivos CEL no programa Expression Console Version

1.1 (Affymetrix) utilizando o padro do algortimos RMA (Robust Multi-array

Analysis). Foram observados todos os parmetros de qualidade conforme

42

recomendado pelo fabricante. Subsequentemente, os arquivos CEL foram

importados para o programa Partek Genomic Suite (version 6.4; Partek Inc.,

St. Louis, MO) utilizando o algortimo RMA para sumarizao e normalizao

com correo de background CG. O sinal de cada transcrito foi calculado

utilizando a mdia das intensidades de cada probset correspondente ao

mesmo transcrito. A correspondncia entre as replicatas experimentais foi

realizada utilizando anlise de componente principal e de correlao de

Pearson. Posteriormente, para identificao dos genes diferencialmente

expressos foi aplicado o teste ANOVA (one-way analysis of variance) com

correo Bonferroni. Foi considerado estatisticamente significativo os genes

com o valor de p 0,001 com correo Bonferroni e com o fold change 3,0. Os

perfis de expresso gnica comparados foram:

a) CTMH/n senescentes (replicatas do cordo 10) vs CTMH/n jovens

(replicatas do cordo 10);

b) CTMH/inv senescentes (replicatas do cordo 04) vs CTMH/inv

jovens (replicatas do cordo 04);

c) CTMH/inv jovens (replicatas do cordo 04) vs CTMH/n jovens

(replicatas do cordo 10 e 12);

d) CTMH/inv senescentes (replicatas do cordo 04) vs CTMH/n

senescentes (replicatas do cordo 10).

4.7. Avaliao da expresso diferencial por RT-PCR em tempo Real

Para verificar se o perfil de expresso diferencial identificado por

microarranjos reproduzido por outra tcnica, alguns genes de cada

comparao foram selecionados para anlise de expresso por RT-PCR em

tempo Real (qPCR). Para tanto, 1g do RNA total extrado de todas as

amostras foi utilizado para a sntese de cDNA conforme recomendaes do

fabricante do High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied

Biosystems). O cDNA foi mantido -20C at a sua amplificao. 200ng do

cDNA foi amplificado utilizando os ensaios TaqMan Gene Expression Assays

(Applied Biosystems) seguindo os procedimentos conforme sugerido pelo

fabricante. A anlise de expresso gnica foi realizada com o mtodo de

43

quantificao relativa, utilizando o gene YWHAZ como referncia endgena, o

qual j foi identificado como melhor endgeno para CTMH de cordo umbilical

por Wang et al. (2010). O gene foi eleito como endgeno para o qPCR por

meio de anlise de variao de seus valores de expresso nos microarranjos.

A anlise estatstica foi feita utilizando o programa geNorm M. O valor de M

para YWHAZ foi de 0,142, demonstrando uma expresso estvel para este

gene.

Para realizao do qPCR foram selecionados 11 genes (Tabela 1) a

partir da lista do genes diferencialmentes expressos em ambas as

comparaes CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e em CTMH/inv

senescentes vs CTMH/n senescentes. Foram eleitos conforme seu padro de

expresso, bem como pela sua relevncia biolgica sugerida pelo Igenuity

Analysis Pathway (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA). Todos

os ensaios foram sintetizados pelo servio sondas inventoriadas com

marcao FAM (Applied Biosystems).

Os genes ANKRD1 e MMP1 tambm foram utilizados para comparao

entre as CTMH/n (cordo 10) senescentes vs CTMH/n (cordo 10) jovens. Os

genes SFRP1, G0S2, ANKRD1 e NDN foram utilizados para a comparao

entre as CTMH/inv (cordo 04) senescentes vs CTMH/inv (cordo 04) jovens.

Assim, ao total foram 28 comparaes de expresso gnica entre os dados de

microarranjos e de qPCR.

Gene ID do ensaio

LAMC2 Hs01043711_m1

ANKRD1 Hs00173317_m1

KYNU Hs00187560_m1

MMP1 Hs00899658_m1

MAB21L1 Hs00366575_s1

SFRP1 Hs00610060_m1

NDN Hs00267349_s1

ADORAB2 Hs00386497_m1

CCL7 Hs00171147_m1

G0s2 Hs00274783_s1

ALDH1A1 Hs00946916_m1

YWHAZ Hs03044281_g1

Tabela 1. Ensaios utilizados para o qPCR.

44

4.8. Classificao funcional dos genes diferencialmente expressos

Os genes diferencialmente expressos foram submetidos analise

biolgica utilizando o programa Igenuity Patway analysis (IPA) (Ingenuity

Systems, Redwood City, CA, USA) para identificar as categorias funcionais

mais representadas pelos genes diferencialmente expressos. Os paramtros

selecionados para esta anlise no programa, foram: Reference set Igenuity

Knowlodge Base; Relationship to include Direta and indirect; Includes

Endogenous Chemicall; Filter consider only molecules and/or relationships

where species = human.

4.9. Anlises de biologia de sistemas

As redes de interaes foram construdas utilizando o software STRING

verso 9.0 (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)

(Szklarczyk et al., 2012). Para cada lista de genes diferencialmente expressos

foram construdas duas redes: uma incluindo somente os genes da lista e outra

incluindo genes do genoma humano com o limite de 5