of 294 /294
RENORBIO Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Transcriptoma diferencial entre células-tronco mesenquimais humanas jovens e senescentes Joana Cristina Medeiros Tavares Natal RN 2013

Transcriptoma diferencial entre células-tronco mesenquimais

  • Author
    habao

  • View
    225

  • Download
    5

Embed Size (px)

Text of Transcriptoma diferencial entre células-tronco mesenquimais

  • RENORBIO

    Programa de Ps-graduao em Biotecnologia

    Transcriptoma diferencial entre clulas-tronco

    mesenquimais humanas jovens e senescentes

    Joana Cristina Medeiros Tavares

    Natal RN

    2013

  • ii

    Joana Cristina Medeiros Tavares

    Transcriptoma diferencial entre clulas-tronco

    mesenquimais humanas jovens e senescentes

    Tese de Doutorado apresentada ao

    Programa de Ps-Graduao em

    Biotecnologia RENORBIO, como parte

    dos requisitos necessrios para a

    obteno do ttulo de Doutora em

    Biotecnologia.

    rea de concentrao: Biotecnologia em

    Sade.

    Orientadora: Profa. Dra. Silvia Regina

    Batistuzzo de Medeiros.

    Natal RN

    2013

  • iii

    AGRADECIMENTOS

    Aos meus pais por todo amor e ensinamentos dedicados a mim que me fizeram

    ser quem sou.

    Ao meu irmo, Andr Tavares, por ter feito as escolhas de sua vida sempre

    pensando em como contribuir para meus estudos.

    A toda minha famlia, por fazer parte do alicerce para a edificao deste sonho,

    especialmente, minha prima, Ana Carolina, por sua confiana e apoio na

    realizao dos meus objetivos.

    professora Dra. Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros, pela oportunidade

    dada minha formao desde a iniciao cientfica, por ter permitido que eu

    continuasse desenvolvendo o doutorado aps a minha aprovao em concurso

    para docente na UFRN/FACISA e por confiar na minha capacidade de

    desenvolver este trabalho.

    UFRN pela estrutura fsica e pela oportunidade de ter estudado

    gratuitamente com ensino de alta qualidade durante toda minha vida

    acadmica.

    Ao Ministrio da Cincia e Tecnologia MCT, por intermdio do Conselho

    Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico - CNPq e do Ministrio

    da Sade - MS, por intermdio do Departamento de Cincia e Tecnologia da

    Secretaria de Cincia, Tecnologia e Insumos Estratgicos - DECIT/SCTIE -

    Edital CT-Sade/MS/SCTIE/DECIT/MCT/CNPq N 17/2008, pelo apoio

    financeiro.

    minha grande amiga, companheira e colega de doutorado Dborah Afonso,

    por seu incentivo, por sua ajuda, por seu carinho, por sua amizade, pelos seus

    conselhos, por sua pacincia, por sua alegria contagiante, e por toda sua

    contribuio em todas as etapas dessa jornada, contribuindo fortemente para a

    sua concluso de maneira eficiente e prazerosa.

  • iv

    A Isabella que foi uma grande companheira na realizao de todas as etapas

    experimentais deste trabalho, por sua companhia agradvel e inteligente, e por

    sua amizade verdadeira.

    professora Dra. Vivian Silbiger e ao professor Dr. Andr Luchessi , pela ajuda

    nas anlises dos dados de microarranjos e de RT-PCR em tempo real, e por

    suas agradveis companhias.

    pesquisadora Maria Eugnia do Laboratrio de Microarranjos (LMA) LNBio

    - Laboratrio Nacional de Luz Sncroton Campinas/SP, por todo seu auxlio

    tcnico nas etapas de hibridizao e aquisio dos dados de microarranjos.

    Ao Laboratrio Nacional de Luz Sncroton Campinas/SP pela acomodao do

    alojamento e toda a estrutura fsica disponvel.

    minha grande amiga Adriana Brito, por todo seu apoio para que eu pudesse

    conciliar o meu trabalho na FACISA com o meu doutorado, compartilhando

    disciplinas, projetos, reunies, orientaes, e at casa e refeies em Santa

    Cruz-SC. Obrigada tambm pelos momentos de descontrao na praa

    Tequinha Farias-SC, por sua ajuda nesta etapa final de organizao de tese e,

    principalmente, por sua sincera amizade.

    A Pedro Henrique, pelo seu carinho, companherismo, incentivo e pelos

    momentos de alegria vividos. Obrigada tambm sua famlia, pela sua

    receptividade sempre aconchegante e carinhosa, me proporcionando muita paz

    e descanso.

    Aos meus amigos constituintes de minha turma de biologia, especialmente,

    Aurizngela, Daiane, Denise, Jefferson e Jule, que me proporcionaram muitos

    momentos de alegria, compartilharam sonhos pessoais e profissionais, e por

    continuarem dedicando seu carinho e amizade que contribuem para a

    realizao deste trabalho.

    A todos os colegas do LBMG pela boa convivncia, especialmente, a Daniel e

    Fbio, por proporcionar dias de trabalho mais suaves e feliz, pela ajuda nas

    anlises de biologia de sistemas, pelo carinho e amizade.

  • v

    A todos os companheiros e divertidos amigos do LAMA, Jana Dara, Felipe,

    Nilmara, pelas msicas, danas, risadas e, principalmente, pela amizade e

    companheirismo verdadeiro.

    Ao meu amigo e colega de doutorado, Leonam, pelo seu contagiante otimismo

    nos experimentos e em sua vida, pelos seus entusiasmantes planos do tipo

    cebolinha, e por sua grande e inestimvel amizade.

    A toda famlia Pichorim pelo conforto de sua receptividade, ateno e apoio.

    A Mayara e Giselle por todo seu apoio tcnico e por sua convivncia afvel.

    Aos alunos de iniciao cientfica, Guillermo Ortiz Brasil, Isabella Tannus Meira,

    Luiza Xavier e Thais Pimentel, que contriburam para realizao dos

    experimentos deste trabalho.

    A Guillermo Ortiz, por sua amizade e pelo seu exemplo de perseverana,

    dedicao e pacincia.

    A toda famlia Santos, por todo seu apoio, carinho e incentivo ao longo de toda

    minha vida acadmica.

    Ao professor Dr. Geraldo Cavalcanti Jnior pela ajuda na realizao dos

    experimentos de citometria de fluxo.

    direo da FACISA/UFRN, por ter me liberado de algumas atividades de

    docente, nestes dois ltimos anos, em alguns momentos mais crticos para a

    concluso do doutorado.

  • vi

    LISTA DE FIGURAS

    FIGURA 1 Imagens das CTMH jovens e senescentes............................ 48

    FIGURA 2 Imagens das diferenciaes osteognica, adipogncia e

    condrognica das CTMH........................................................ 49

    FIGURA 3 Grfico mostrando que a comparao entre as CTMH/inv

    senescentes e CTMH/inv jovens resultou em maior nmero

    de genes diferencialmente expresso do que na comparao

    entre as CTMH/n senescentes e CTMH/n jovens................... 50

    FIGURA 4 Classificao funcional dos genes diferencialmente

    expressos em CTMH/n senescentes comparadas s

    CTMH/n jovens....................................................................... 52

    FIGURA 5 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

    expressos em CTMH/n senescentes comparadas s

    CTMH/n jovens....................................................................... 53

    FIGURA 6 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

    expressos em CTMH/n senescentes comparadas s

    CTMH/n jovens no contexto genmico................................... 54

    FIGURA 7 Classificao funcional dos genes diferencialmente

    expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s

    CTMH/inv jovens..................................................................... 55

    FIGURA 8 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

    expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s

    CTMH/inv jovens..................................................................... 57

    FIGURA 9 Rede de interaes formada pelos genes diferencialmente

    expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s

    CTMH/inv jovens no contexto genmico................................ 58

    FIGURA 10 Sub-rede da figura 9a, destacando as molculas que

    interage diretamente como gene EGF................................... 59

    FIGURA 11 Diagrama de Venn construdo a partir das listas dos genes

    das comparaes CTMH/n senescentes vs CTMH/n jovens 60

  • vii

    e CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv jovens.......................

    FIGURA 12 Classificao funcional dos 30 genes comuns s duas listas

    de comparaes CTMH/n senescentes vs CTMH/n jovens

    e CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv jovens...................... 61

    FIGURA 13 Diagrama de Venn para identificao dos genes

    diferencialmente expressos em ambas as comparaes,

    CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv

    senescentes vs CTMH/n senescentes.................................... 62

    FIGURA 14 Cluster hierrquico de todas as probsets diferencialmente

    expressas em ambas as comparaes CTMH/inv jovens vs

    CTMH/n jovens e entre as CTMH/inv senescentes vs

    CTMH/n senescentes............................................................. 64

    FIGURA 15 Genes mais expressos em CTMH/inv jovens se tornaram

    ainda mais expressos em CTMH/inv senescentes................. 65

    FIGURA 16 Genes menos expressos em CTMH/inv jovens se tornaram

    ainda menos expressos em CTMH/inv senescentes.............. 66

    FIGURA 17 Caritipo parcial das CTMH/inv mostrando a

    inv(3)(p13p25~26) e seu

    ideograma............................................................................... 68

    FIGURA 18 Representao dos genes diferencialmente expressos em

    CTMH/inv jovens comparadas as CTMH/n Jovens nas

    categorias funcionais de acordo com o IPA Igenuity............. 70

    FIGURA 19 Redes de interaes formadas pela lista dos genes

    diferencialmente expressos na comparao CTMH/inv

    jovens vs CTMH/n jovens....................................................... 71

    FIGURA 20 Redes de interaes formadas pela lista dos genes

    diferencialmente expressos na comparao CTMH/inv

    jovens vs CTMH/n jovens no contexto genmico.................. 72

    FIGURA 21 Representao dos genes diferencialmente expressos em

    CTMH/inv jovens comparadas s CTMH/n jovens nas

    categorias funcionais de acordo com o IPA Igenuity.............. 74

    FIGURA 22 Redes de interaes formadas pela lista dos genes

    diferencialmente expressos apenas na comparao 76

  • viii

    CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes...................

    FIGURA 23 Sub-rede de interaes da figura 22. Esta rede evidencia os

    ns que se conectam ao bottleneck EGF.............................. 77

    FIGURA 24 Sub-rede de interaes da figura 12. Esta rede evidencia

    somente os genes que se ligam diretamente a EGF ou aos

    genes localizados em Inv (3): CNTN3, PDZRN3, LMCD1 e

    BHLHE40........................................................................... 78

    FIGURA 25 Rede de interaes formada pela lista dos genes

    diferencialmente expressos apenas na comparao

    CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes inserida no

    contexto genmico.................................................................. 79

    FIGURA 26 Sub-rede da figura 25, destacando os ns conectados

    diretamente ao gene EGF e os gene localizados na regio

    da Inv (3)................................................................................. 80

    FIGURA 27 Grfico mostrando as categorias funcionais mais

    enriquecidas (com valor de p 0,05 e somente aquelas com

    representao superior 5%) em ambas as comparaes

    CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv

    senescentes vs CTMH/n senescentes.................................... 82

    FIGURA 28 Rede de interaes formada pela unio entre os genes

    diferencialmente expressos em ambas as comparaes

    (CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv

    senescentes vs CTMH/n senescentes) e os exclusivamente

    diferencialmente expressos na comparao CTMH/inv vs

    CTMH/n senescentes............................................................. 84

  • ix

    SUMRIO

    Lista de Figuras........................................................................................... vi

    Resumo........................................................................................................ xii

    Abstract........................................................................................................ Xv

    1.0. Introduo......................................................................................... 17

    2.0. Reviso Bibliogrfica

    2.1. Clulas-tronco mesenquimais humanas.................................. 20

    2.2. Cordo umbilical como fonte de CTMH................................... 23

    2.3. Senescncia celular................................................................. 26

    2.4. Estabilidade genmica das CTMH ao longo tempo de

    cultivo....................................................................................... 29

    2.5. Microarranjos e estudos de exprsso gnica em CTMH......................................................................................

    32

    3.0. Objetivos........................................................................................... 36

    4.0. Material e Mtodos........................................................................... 37

    4.1. Isolamento e caracterizao das CTMH.................................. 37

    4.2. Condies de cultura das CTMH para anlise do perfil de

    expresso gnica..................................................................... 38

    4.3. Caracterizao das CTMH senescentes................................. 39

    4.4. Extrao de RNA..................................................................... 39

    4.5. Preparao do RNA, hibridizao e captura de imagem dos microarranjos...........................................................................

    41

    4.6. Anlise dos dados de microarranjos........................................ 41

    4.7. Avaliao da expresso diferencial por RT-PCR em tempo

    real........................................................................................... 42

    4.8. Classificao funcional dos genes diferencialmente

    expressos................................................................................ 44

    4.9. Anlise de biologia de sistemas.............................................. 44

    5.0. Resultados

    5.1. Caracterizao das CTMH jovens e senescentes................... 46

    5.2. A senescncia in vitro afeta o perfil de expresso das

    CTMH...................................................................................... 50

    5.3. Classificao funcional e rede de interaes dos genes

    diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes vs

    CTMH/n jovens....................................................................... 51

    5.4. Classificao funcional dos genes diferencialmente

    expressos CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv jovens......... 55

    5.5. H um perfil de expresso gnica comum entre as

    CTMH/inv senescentes e as CTMH/n senescentes............. 60

  • x

    5.6. As CTMH/inv tem o transcriptoma distinto das CTMH/n......... 62

    5.7. Alguns genes localizados na regio prxima aos pontos de

    quebra da inverso em CTMH/inv foram diferencialmente

    expressos em CTMH/inv......................................................... 66

    5.8. Classificao funcional e redes de interaes dos genes

    diferencialmente expressos em CTMH/inv jovens

    comparadas s CTMH/n jovens.............................................. 68

    5.9. Classificao funcional e redes de interaes dos genes

    diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes

    comparadas s CTMH/n senescentes..................................... 73

    5.10. Anlise de interpretao biolgica dos genes

    diferencialmente expressos nas comparaes CTMH/inv

    jovens vs CTMH/n jovens e CTMH/inv senescentes vs

    CTMH/n senescentes.............................................................. 80

    5.11. Anlise da expresso gnica das CTMH por RT-PRC em

    tempo real................................................................................ 85

    6.0. Discusso.......................................................................................... 86

    7.0. Concluso......................................................................................... 116

    8.0. Referncias Bibliogrficas.............................................................. 118

    9.0. Apndices........................................................................................ 147

    A. Tabela da lista de genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes na comparao CTMH/n senescentes vs CTMH/n Jovens................................................................................................

    147

    B. Tabela da lista de genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes na comparao CTMH/inv senescentes vs CTMH/inv Jovens................................................................................................

    151

    C. Tabela da classificao funcional dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s CTMH/n jovens.................................................................................................

    162

    D. Tabela de Anotao funcional das cinco categorias mais enriquecidas com menor valor de p dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s CTMH/n Jovens................................................................................................

    163

    E. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s CTMH/n jovens.................................................................................................

    167

    F. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes no contexto genmico formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/n senescentes comparadas s mesmas jovens com a adio de 50 genes do genoma humano.

    169

    G. Tabela da classificao funcional dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s mesmas jovens.................................................................................................

    174

    H. Tabela da anotao funcional das cinco categorias mais enriquecidas com menor p-valor dos genes diferencialmente

    175

  • xi

    expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH/inv jovens.................................................................................................

    I. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH/inv jovens.................................................................................................

    195

    J. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes no contexto formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH/inv jovens com a adio de 50 genes do genoma humano................................................................................

    200

    K. Tabela da lista de genes da interseco entre as duas listas das comparaes senescentes vs jovens de CTMH/n e CTMH/inv.........

    207

    L. Tabela da classificao funcional da lista dos 30 genes comuns em ambas as listas das comparaes Senescentes vs jovens de CTMH/n e CTMH/inv..........................................................................

    209

    M. Tabela da anotao funcional das cinco categorias mais enriquecidas com menor p-valor dos 30 genes comuns em ambas as listas das comparaes Senescentes vs jovens de CTMH/n e CTMH/inv............................................................................................

    210

    N. Tabela de genes diferencialmente expressos em CTMH/inv jovens na comparao entre as CTMH/inv vs CTMH/n jovens, ranqueados do maior para o menor Fold Change.................................................

    214

    O. Tabela da lista de genes diferencialmente expressos entre CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes..............................

    218

    P. Tabela da lista dos genes diferencialmente expressos da interseco entre as comparaes CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e entre as CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes.

    235

    Q. Tabela dos genes localizados prximo regio da inverso que tiveram sua expresso afetada em CTMH/inv...................................

    237

    R. Tabela das categorias funcionais representadas pelos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv jovens da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens..................................................

    238

    S. Tabela da anotao funcional das cinco categorias com menores valor de p representadas pelos genes diferencialmente expressos da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens........................

    239

    T. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes obtida a partir da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens por meio do pluggin BINGO do Cytosacape............

    249

    U. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes obtida a partir da comparao CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens no contexto genmico por meio do pluggin BINGO do Cytosacape...................................................................................

    251

    V. Tabela das categorias funcionais representadas pelos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv Senescentes da comparao CTMH/inv vs CTMH/n Senescentes..............................

    253

    W. Tabela dos genes classificados nas cinco categorias funcionais com menores p-valor da comparao CTMH/inv senescentes vs CTMH/n senescentes.........................................................................

    254

    X. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede 270

  • xii

    de interaes no contexto formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH jovens com a adio de 50 genes do genoma humano................................................................................

    Y. Tabela da classificao funcional dos genes constituintes da rede de interaes no contexto formada pela lista dos genes diferencialmente expressos em CTMH/inv senescentes comparadas s CTMH jovens com a adio de 50 genes do genoma humano................................................................................

    278

    Z. Tabela da comparao dos valores de Fold Change obtidos por anlise de Microarray e de qPCR......................................................

    284

    10.0. Anexos............................................................................................. 286

    1. Lista dos genes localizados prximo regio da inverso cromossmica (inv3p13-25~26) constituinte das CTMH/inv.........

    286

  • xiii

    RESUMO

    Clulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH) so muito teis na terapia

    celular. O longo perodo de cultivo pode resultar em senescncia replicativa ou

    estar relacionado com o aparecimento de alteraes cromossmicas

    responsveis pela aquisio de um carter tumorignico in vitro . Neste estudo,

    foi comparado o transcriptoma de CTMH jovens e senescentes obtidas de

    diferentes doadores. Alm disso, pela primeira vez, o perfil de expresso de

    CTMH com uma inverso cromossmica paracntrica (CTMH/inv) foi

    comparado ao de CTMH que possuem caritipo normal (CTMH/n) em

    passagens jovens e senescentes de cultivo in vitro . As CTMH utilizadas neste

    estudo foram isoladas da veia do cordo umbilical de trs dadores, dois

    CTMH/n e de um CTMH/inv. Aps a criopreservao, elas foram expandidas in

    vitro at alcanarem a senescncia. O RNA total foi extrado utilizando o

    RNeasy mini kit (Qiagen), marcado, purificado e fragmentado com o 3

    'GeneChip IVT expresso Kit (Affymetrix, Inc.). Subsequentemente, o RNA

    fragmentado foi hibridado no microarranjo Affymetrix Human Genome U133

    Plus 2.0 (Affymetrix, Inc.). A anlise estatstica da expresso diferencial foi

    realizada usando o Partek Suite Software Genomic, verso 6.4 (Partek, Inc.).

    Foram consideradas estatisticamente significativas as diferenas na expresso

    com valor de P 0.01 corrigido com Bonferroni. Apenas os sinais com fold

    change 3.0 foram includos na lista de diferencialmente expressos. Diferenas

    na expresso gnica observadas no estudo dos microarranjos foram

    confirmadas por resultados de RT-PCR em tempo real. Para a interpretao

    biolgica dos dados foram utilizados: IPA (Ingenuity Systems) para anlise de

    enriquecimento de funes; STRING 9,0 para a construo de redes de

    interaes; Cytoscape 2,8 para a visualizao das redes e anlises de gargalos

    com o auxlio do software GraphPad Prism 5.0. O pluggin BiNGO do Cytoscape

    foi utilizado para avaliar a representao de categorias funcionais no Gene

    Ontology nas redes biolgicas. A comparao entre senescentes e jovens em

    cada grupo de CTMH mostrou que h uma diferena no perfil de expresso,

    sendo maior nas senescentes do grupo CTMH/inv. Os resultados tambm

    mostraram que h diferena nos perfis de expresso entre as CTMH/inv e

    CTMH/n, sendo maior a diferena quando as clulas esto senescentes. Novas

  • xiv

    redes foram identificadas para genes relacionados com a resposta ao longo do

    tempo de cultivo nos dois grupos de CTMH. Foram identificados genes que

    podem coordenar funes importantes mais enriquecidas nas redes, como por

    exemplo, CXCL12, SFRP1, EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. A interpretao

    biolgica destes dados sugere que a populao de clulas CTMH/inv tem

    diferentes caractersticas constitucionais, relacionadas com o seu potencial de

    proliferao, diferenciao e resposta a estmulos, responsveis por um

    processo de senescncia replicativa em CTMH/inv distinto das CTMH/n. Os

    genes identificados neste estudo so candidatos a marcadores da senescncia

    celular em CTMH, mas a sua relevncia funcional neste processo deve ser

    testada em experincias adicionais in vitro e/ou in vivo.

  • xv

    ABSTRACT

    Human mesenchymal stem cells (MSC) are powerful sources for cell therapy in

    regenerative medicine. The long time cultivation can result in replicative

    senescence or can be related to the emergence of chromosomal alterations

    responsible for the acquisition of tumorigenesis features in vitro. In this study,

    for the first time, the expression profile of MSC with a paracentric chromosomal

    inversion (MSC/inv) was compared to normal karyotype (MSC/n) in early and

    late passages. Furthermore, we compared the transcriptome of each MSC in

    early passages with late passages. MSC used in this study were obtained from

    the umbilical vein of three donors, two MSC/n and one MSC/inv. After their

    cryopreservation, they have been expanded in vitro until reached senescence.

    Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (Qiagen) and marked with

    the GeneChip 3 'IVT Express Kit (Affymetrix Inc.). Subsequently, the

    fragmented aRNA was hybridized on the microarranjo Affymetrix Human

    Genome U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc.). The statistical analysis of

    differential gene expression was performed between groups MSC by the Partek

    Genomic Suite software, version 6.4 (Partek Inc.). Was considered statistically

    significant differences in expression to p-value Bonferroni correction .01. Only

    signals with fold change 3.0 were included in the list of differentially

    expressed. Differences in gene expression data obtained from microarrays

    were confirmed by Real Time RT-PCR. For the interpretation of biological

    expression data were used: IPA (Ingenuity Systems) for analysis enrichment

    functions, the STRING 9.0 for construction of network interactions; Cytoscape

    2.8 to the network visualization and analysis bottlenecks with the aid of the

    GraphPad Prism 5.0 software. BiNGO Cytoscape pluggin was used to access

    overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. The

    comparison between senescent and young at each group of MSC has shown

    that there is a difference in the expression parttern, being higher in the

    senescent MSC/inv group. The results also showed difference in expression

    profiles between the MSC/inv versus MSC/n, being greater when they are

    senescent. New networks were identified for genes related to the response of

    two of MSC over cultivation time. Were also identified genes that can coordinate

    functional categories over represented at networks, such as CXCL12, SFRP1,

  • xvi

    EGF, SPP1, MMP1 e THBS1. The biological interpretation of these data

    suggests that the population of MSC/inv has different constitutional

    characteristics, related to their potential for differentiation, proliferation and

    response to stimuli, responsible for a distinct process of replicative senescence

    in MSC/inv compared to MSC/n. The genes identified in this study are

    candidates for biomarkers of cellular senescence in MSC, but their functional

    relevance in this process should be evaluated in additional in vitro and/or in vivo

    assays.

  • 17

    1.0. INTRODUO

    As clulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH) so clulas

    multipotentes, caracterizadas pela sua capacidade de aderncia ao plstico,

    diferenciao em osteoblastos, adipcitos e condrcitos, apresentam

    expresso dos marcadores CD105, CD90, CD73 e ausncia da expresso de

    CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79 ou CD19 e HLA-DR (Reagan e Kaplan,

    2011). As CTMH tm sido consideradas como uma importante alternativa para

    a terapia celular devido sua facilidade de obteno e expanso in vitro, sua

    plasticidade funcional, e mais recentemente, por secretar molculas bioativas

    com papel na imunomodulao, quimioatrao, com efeitos trficos,

    neuroproteo, entre outras que auxiliam o reparo tecidual (Eyal Ben-Ami et al.,

    2011; Honmou et al., 2012; Youwei Wang et al., 2012).

    H evidncias de que as clulas-tronco sofrem senescncia celular in vivo

    que pode ser responsvel pelo declnio de suas funes e pela origem das

    doenas metablicas, degenerativas, cncer e o envelhecimento dos indivduos

    (Revisado por Rodrguez-Rodero, et al. 2011). Esta proposio est em

    conformidade com a observao de que o envelhecimento afeta a renovao e

    a capacidade de diferenciao de CTMH residentes no tecido adiposo e na MO

    de indivduos mais velhos (Alt et al., 2012; Kretlow et al., 2008; Chen et al.,

    2009).

    O longo tempo de cultivo pode resultar na senescncia replicativa ou

    estar relacionado ao surgimento de uma instabilidade gentica que seria

    responsvel por uma possvel aquisio espontnea de um potencial

    tumorignico das CTMH. A senescncia celular caracterizada por uma srie

    de alteraes que envolvem uma complexa reprogramao de transduo de

    sinais, tais como o encurtamento dos telmeros, estresse celular, danos no

    DNA e ativao em oncogenes, que resultam em alteraes em processos

    celulares, no somente no ciclo celular, mas na morfologia, na funo da clula

    e na aquisio de um perfil de expresso de molculas inflamatrias

    secretadas (revisado por Sikora et al., 2012). O secretoma inflamatrio

    produzido pelas clulas senescentes pode criar um ambiente favorvel para o

  • 18

    prprio processo de senescncia, ou por outro lado propiciar o

    desenvolvimento de cncer e de outras doenas relacionadas idade como

    aterosclerose e diabetes (Cichowski e Hahn, 2008; revisado por Sikora et al.,

    2012).

    Vrias alteraes cromossmicas adquiridas durante o cultivo j foram

    descritas em diferentes tipos de clulas-tronco, embrionrias (Baker et al.,

    2007; Mayshar et al., 2010), pluripotentes induzidas, CTMH e neurais (Ben

    David et al., 2011) que parecem conferir vantagens seletivas e podem

    aumentar a tumorigenicidade das clulas, e alterar a sua capacidade de

    diferenciao (Harrison et al., 2007; Mayshar et al., 2010; Ben-David e

    Benvenisty, 2011). Por outro lado, h relatos que algumas alteraes

    desaparecem na cultura e no conferem vantagem seletiva (Senseb et al.,

    2012; Hussein et al., 2011). A presena de aneuploidia em vrias preparaes

    de CTMH da MO depois de cultivo in vitro foi documentada, mas foi associada

    somente senescncia e no tumorigenese (Tarte et al., 2010).

    Recentemente Duarte e colaboradores (2012) identificaram uma alterao

    cromossmica constitucional, caritipo 46,XY,inv(3)(p13p25~26), em CTMH

    obtidas do endotlio da veia do cordo umbilical de um doador, que so as

    MSC/inv utilizadas no presente trabalho. As inverses paracntricas so

    consideradas como heteromorfismos que no causam problemas sade do

    portador. No entanto, pessoas que a possuem tm maior probabilidade de

    originar rearranjos no balanceados na sua descendncia, e apresentam uma

    frequncia mais elevada de aborto espontneo em relao populao em

    geral (Grati et al., 2008). Contudo, nada se sabe sobre o efeito desta alterao

    cromossmica nas clulas aps sua expanso in vitro, e nem to pouco sobre

    o seu comportamento no organismo de um possvel receptor. Considerando

    que a regio da inverso (3p25~26) contm vrios genes de grande

    importncia biolgica, como genes envolvidos com o reparo de DNA e outros

    responsveis pelo desenvolvimento de tumores, tais clulas podem ser mais

    propensas transformao espontnea in vitro.

    Neste contexto, uma anlise molecular de larga escala por microarranjos

    pode oferecer uma compreenso mais detalhada da complexidade subjacente

  • 19

    biologia das CTMH cultivadas at a sua senescncia, possibilitando

    predies importantes sobre o processo de senescncia celular das CTMH e

    sobre o impacto de alteraes cromossmicas nesse processo celular. Os

    estudos de transcriptoma em CTMH tm focado na diferena de expresso

    gnica entre as CTMH obtidas de fontes distintas (Jansen et al., 2010; Miranda

    et al., 2012; Panepucci et al., 2004; Secco et al., 2009; Tsai et al., 2007; Weng

    et al., 2011; Kim et al., 2011) e no processo de diferenciao (Kock et al.,

    2011; Menssen et al., 2011; Roobrouck et al., 2011; Yoo et al., 2011). Muito

    pouco se sabe sobre expresso gnica durante a senescncia das CTMH e

    sobre o efeito do longo tempo de cultivo em CTMH que apresenta uma

    alterao cromossmica constitucional.

  • 20

    2.0. REVISO BIBLIOGRFICA

    2.1. Clulas-tronco mesenquimais humanas

    O termo clulas-tronco mesenquimais humanas (CTMH) foi introduzido

    por Caplan, em 1991. As primeiras clulas-tronco mesenquimais foram

    isoladas da medula ssea (MO) de roedores e coelhos por Friedenstein e

    colaboradores (1976), e identificadas como unidades formadoras de colnias

    semelhantes a fibroblastos, sendo consideradas como clulas precursoras de

    fibroblastos. Posteriormente, foi observado que elas tinham a capacidade de se

    diferenciar em clulas com caractersticas de osteoblastos, condrcitos e

    adipcitos. Em concomitncia a esta descoberta, foi identificada uma

    populao de clulas aderentes necessrias para o estabelecimento das

    clulas estaminais hematopoiticas no aderentes, em um estudo sobre a

    hematopoese in vitro desenvolvido por Dexter e colaboradores (1977). A partir

    deste momento, em referncia sua localizao anatmica, um novo termo foi

    estabelecido, clulas estromais da MO. Em analogia ao modelo de

    hematopoese, o termo CTMH foi introduzido para designar uma populao de

    clulas especficas do estroma da MO - clulas aderentes que originam os

    diferentes tipos de tecidos mesenquimais, sseo, cartilagem e msculos

    (Revisado por Meirelles e Nardi , 2009). Desde ento, clulas com

    caractersticas semelhantes s CTMH foram isoladas de diferentes tecidos

    adultos, tais como, tecido adiposo, pele, osso, msculo, crebro, fgado, rins,

    pncreas, placenta, glndulas salivares, polpa dentria, ligamento periodontal,

    folculo capilar, linfonodos, bao, timo e at menorreia (Revisado por Momin et

    al., 2010; Ding et al., 2011). Elas tambm podem ser obtidas a partir de tecidos

    perinatais, como do cordo umbilical, fluido e membrana amnitica, e crion

    (Bieback e Brinkmann, 2010; Ding et al., 2011; Hass et al., 2011; Roubelakis et

    al., 2012).

    Em virtude das CTMH serem isoladas de diversos tecidos e cultivadas

    em diferentes laboratrios por diversos mtodos, a sociedade internacional de

    padronizao para terapia celular (The International Society for Cellular

    Therapy Position Statement) formulou trs critrios mnimos exigidos para

  • 21

    identificao de CTMH: capacidade de adeso ao plstico de cultura; fentipo

    positivo para os marcadores de superfcie CD105, CD73 e CD90, e negativo

    para CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19e HLA-DR; e se

    diferenciar in vitro em osteoblastos, adipcitos e condrcitos (Dominici et al.,

    2006).

    Em 2008, Crisan e colaboradores documentaram uma subpopulao de

    clulas perivasculares humanas que expressam marcadores in situ para ambos

    os tipos celulares, CTMH e pericitos. Este e outros estudos, que compararam o

    fentipo das CTMH obtidas de diferentes fontes com os pericitos, sugerem

    fortemente que as CTMH sejam pericitos (Revisado por Caplan, 2008), e que

    sua natureza pleiotrpica seja responsvel pelo seu papel na renovao dos

    tecidos mesenquimais in vivo (Revisado por Singer e Caplan, 2011). Contudo,

    no h nenhuma confirmao definitiva de que a origem de CTMH do tecido

    adiposo (ASC) seja de pericitos. Tornando o quadro mais complexo, dados

    recentes indicam que as CTMH em vrios tecidos humanos podem originar-se

    no s de pericitos (CD146 + CD34-CD31-CD45-), mas tambm a partir de um

    subconjunto fenotipicamente distinto de clulas adventcias (CD34+CD146-

    CD31-CD45-) que residem na camada mais externa da parede de vasos

    maiores. Foi identificado que elas nativamente expressam marcadores de

    superfcie de CTMH (tal como CD90) e comportam-se de maneira semelhante

    s CTMH aps longo tempo de cultura in vitro (Revisado por Strioga et al.,

    2012).

    A diversidade de fontes para obteno das CTMH, a sua capacidade de

    renovao, seu potencial de se diferenciar em mltiplas linhagens, aliados aos

    avanos nas pesquisas sobre as suas propriedades biolgicas, posicionaram

    as CTMH como as clulas-tronco adultas mais promissoras na utilizao em

    protocolos de terapia celular. Vrios estudos mostram que as CTMH se

    diferenciam in vitro em osso, cartilagem, tecido adiposo, cardiomicitos, clulas

    endoteliais e clulas neuronais (Ohnishi et al., 2007; Fraser et al., 2006; Fu et

    al., 2004; Fu et al., 2006, Karaoz et al. 2011). Uma caracterstica bastante

    atraente est relacionada ao seu efeito parcrino de molculas bioativas que

    exercem vrias funes importantes no reparo tecidual. Os principais efeitos

    incluem: imunossupresso por meio da modulao da proliferao das clulas

  • 22

    T, B e NK (Natural killer), e da alterao da secreo de citocinas inflamatrias,

    de imunoglobulinas; secreo de fatores anti-apoptticos, anti-cicatrizantes,

    quimioatraentes, neuroprotetores, neurognicos e angiognicos; favorecimento

    do crescimento e da diferenciao local de clulas-tronco e progenitoras;

    (Revisado por Singer e Caplan, A.I, 2011; Revisado por Soleymaninejadia et

    al., 2012; Revisado por Honmou, O. et al., 2012). As CTMH tambm

    apresentam baixa expresso de MHC de classe I, MHC de classe II e das

    molculas coestimuladoras B7-1/B7-2 (CD80/CD86), conferindo um

    imunoprivilgio que propicia seu uso em transplantes alognicos e em doenas

    auto-imunes (Revisado por Singer e Caplan, 2011; Bem-Ami et al., 2011;

    Miguel et al., 2012).

    Outra caracterstica interessante que as CTMH podem modular a

    progresso do tumor e a sensibilidade a frmacos. Muitas evidncias

    demonstram que elas apresentam tropismo para regio do tumor, promovem a

    proliferao das clulas tumorais e conferem um fentipo de resistncia a

    frmacos. No entanto, alguns estudos verificaram inibio de crescimento

    tumoral em leucemias e hepatomas, por exemplo. Ainda no esto elucidados

    os fatores que definem o papel das CTMH na progresso ou inibio tumoral.

    Porm, acredita-se que seu tropismo pode favorecer o uso destas clulas como

    veculo de frmacos para uma terapia anti-tumoral mais eficiente (Revisado por

    Houthuijzen et al., 2012).

    Um total de 225 estudos clnicos utilizando as CTMH para tratamento de

    diferentes doenas est registrado no banco de dados do Instituto Nacional de

    Sade dos Estados Unidos

    (http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=stem+cell+mesenchymal&no_unk

    =Y, acessado no dia 27 de agosto de 2012). Este nmero ainda subestimado

    considerando que h muitos estudos em andamento que no so registrados

    em bancos de dados. Ambas as pesquisas clnicas em andamento e a

    plasticidade funcional das CTMH descrita acima demostram seu potencial de

    utilizao na terapia celular de vrias doenas, tais como: cardiopatias,

    doenas imunolgicas, doena de Crohn, angiognese, diabetes, esclerose

    mltipla, injrias cerebrais isqumicas e terapia contra o cncer (Meirelles e

    Nardi, 2009; Ciccocioppo et al., 2011;

  • 23

    http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=stem+cell+mesenchymal&no_unk

    =Y, acessado no dia 27 de agosto de 2012).

    A fonte mais comum para obteno de CTMH a medula ssea (MO-

    CTMH) (Pittenger et al.,1999; Jiang et al.,2002). Apesar da identificao de um

    novo mtodo (seleo negativa pelo sorteamento magntico seguido pelo

    FACS - fluorochrome activated cell sorting para a depleo de linhagens

    hematopoiticas e endoteliais) de isolar populaes mais enriquecidas em

    clulas progenitoras mesenquimais/osteoblsticas (Mdder et al., 2012), ainda

    existe uma necessidade de conhecer mais sobre fontes alternativas de CTMH

    devido existncia de um nmero limitado de MO-CTMH disponveis para

    utilizao autloga. H outros problemas em se utilizar MO-CTMH, como o

    procedimento invasivo de aspirao deste tecido, e a diminuio significativa

    da frequncia e potencial de diferenciao das MO-CTMH com o aumento da

    idade do doador (Kretlow et al., 2008; Chen et al., 2009).

    2.2. Cordo umbilical como fonte de CTMH

    O cordo umbilical humano um anexo fetal originado de um

    mesoderma extra-embrionrio, importante durante a gravidez e que

    descartado aps o nascimento. Descrita em 1977 por Nanaev e colaboradores,

    sua arquitetura interna constituda por vasos sanguneos, uma veia e duas

    artrias, envoltos por um tecido conectivo, tambm chamado de geleia de

    Wharton, delimitado pelo epitlio umbilical. A geleia composta por uma matriz

    esponjosa, rica em fibras de colgenos e proteoglicanas, embebidas por

    clulas estromais responsveis pela sntese dos componentes da matriz

    (Revisado por Fan et al., 2011). Este tecido conectivo importante por prevenir

    a compresso, toro, e o enrolamento dos vasos que realizam fluxo

    sanguneo bidirecional entre o feto e a me (Can e Karahuseyinoglu, 2007).

    So vrias as razes pelo crescente interesse em obteno de CTMH do

    cordo umbilical, estas incluem: fonte de clulas-tronco prematuras, com o

    potencial de diferenciao intermedirio entre as CTMH de outros tecidos

    adultos e as clulas-tronco embrionrias (CTE); o uso do cordo no envolve

    implicaes ticas, polticas ou religiosas como as CTE e ao contrrio destas,

    as CTMH apresentam capacidade proliferativa finita e no formam teratomas

  • 24

    (Revisado por Troyer, e Weiss, 2008; Fan et al., 2011); derivam de tecidos que

    so descartados aps o nascimento; maior acessibilidade, no h a

    necessidade de procedimentos invasivos como ocorre na obteno de MO e

    tecido adiposo; menor risco de infeco devido presena da barreira

    placentria (revisado por Yang et al., 2012); possvel a obteno de maior

    nmero de CMTH que possuem grande potencial proliferativo ao longo tempo

    do cultivo comparadas s originadas da MO de idosos (Petsa et al., 2009;

    Revisado por Fan et al., 2011); so hipoimunognicas, enquanto as CTE

    podem provocar uma resposta imunolgica depois do transplante (Revisado

    por Bieback e Brinkmann, 2010).

    As vantagens descritas acima colocaram as CTMH do cordo como uma

    importante fonte alternativa de clulas para uso na terapia celular. Vrios

    estudos j demonstram seu potencial em regenerao cutnea (Revisado Yang

    et al., 2012), cardiomiognico (Roura et al., 2010; Bai et al. 2012), em reparo

    de danos neurolgicos (Lu et al., 2012; Dalous et al., 2012, Koh et al.,2008).

    Em uma consulta ao banco de dados do Instituto Nacional de Sade dos

    Estados Unidos (http://www.clinicaltrials.gov), utilizando os termos Umbilical

    Cord e Mesenchymal Stem Cell, acessado no dia 30 de agosto de 2012, foram

    encontrados 43 estudos clnicos registrados, incluindo: hepatite auto imune;

    cirrose biliar primria, reconstituio imunolgica de pacientes com HIV; cirrose

    heptica; doena de Alzheimer; displasia broncopulmonar; esclerose lateral

    amiotrfica; nefrite lpica; colite ulcerativa; diabetes tipo 1; cardiopatia dilatada

    idioptica; ataxia hereditria; esclerose mltipla e neuromielite ptica; distrofia

    muscular de Duchene; artrite reumatoide e queimadura aguda.

    As CTMH podem ser obtidas de vrios constituintes do cordo: sangue

    do cordo umbilical, da geleia de Wharton, regio perivascular, e do endotlio

    da veia (Troyer e Weiss, 2008). Em 2009, tambm foram isoladas das artrias

    (Ishige et al., 2009). Desde 1998 o sangue do cordo umbilical tem sido

    utilizado para transplante de clulas-tronco hematopoiticas. Em 2000, foi

    identificada a presena de CTMH no sangue do cordo umbilical (Erices et al.,

    2000). Posteriormente, outros estudos apontaram o sangue como fonte dessas

    clulas (Lee et al., 2004; Goodwin et al., 2001; Bieback et al., 2004). No

    entanto, em 2001, Mareschi e colaboradores tentaram isolar CTMH da MO e do

  • 25

    sangue do cordo, obtendo sucesso apenas com a MO. Outros estudos

    tambm falharam ou tiverem uma eficincia de isolamento muito baixa (Wexler

    et al., 2003; Romanov et al., 2003). Tais resultados motivaram pesquisas por

    novas fontes de CTMH, levando descoberta da presena de CTMH no

    endotlio da veia do cordo (Romanov et al., 2003; Covas et al., 2003) e da

    geleia de Wharton (Wang et al., 2004; Fong et al.; 2007). Posteriormente,

    outros pesquisadores documentaram a presena de CTMH numa regio que

    fica ao redor dos vasos umbilicais (Baksh et al., 2007; Sarugaser et al., 2005).

    Apesar de muitas partes do cordo serem fontes de CTMH com

    fentipos muito semelhantes, algumas diferenas tm sido documentadas em

    relao sua eficincia de isolamento, capacidade de expanso e de

    diferenciao. Um estudo comparando a eficincia de obteno de CTMH a

    partir do sangue e de todo o tecido do cordo revelou que o sucesso de

    isolamento do primeiro muito baixo, ao contrrio da eficincia de 100% obtida

    a partir do segundo. Os autores sugeriram que nos bancos de cordo deveriam

    ser estocados tanto o sangue como o tecido (Secco et al., 2008). A baixa

    quantidade de clulas e taxa de crescimento das CTMH do UCB so

    considerados fatores limitantes para seu uso na medicina regenerativa (Musina

    et al., 2007). Fong e colaboradores (2010) tambm identificaram o tecido do

    cordo como ma fonte mais rica em CTMH e que sua capacidade proliferativa

    maior do que as do sangue do cordo. No entanto, um novo mtodo de

    obteno das CTMH do sangue do cordo foi mais eficiente e sugere que esta

    fonte ainda possa se constituir em uma alternativa importante (Hussein et al.,

    2012). Outro estudo tambm concluiu que a capacidade de expanso das

    clulas estromais da geleia de Wharton maior do que as obtidas dos vasos

    do cordo (Karahusevinoglu et al., 2007). O tempo necessrio para dobrar a

    populao (PDT) das CMTH dos vasos do cordo de at 60 horas (Sarugaser

    et al., 2005), enquanto o PDT das obtidas dos vasos do cordo de 24 a 25

    horas (Fong et al., 2010). Alguns pesquisadores demonstraram que CTMH

    derivadas dos vasos do cordo umbilical compartilham morfologia, marcadores

    imunofenotpicos e capacidade de diferenciao similares quelas da MO

    (Romanov et al., 2003; Covas et al., 2003; Kim et al., 2004; Panepucci et al.,

    2004; Kadivar et al., 2006; Ishige et al., 2009; Li et al., 2010).

  • 26

    As diferenas citadas acima podem ocorrer devido aplicao de

    metodologias distintas de isolamento e condies de cultura, prpria

    identidade biolgica dos doadores, ou por outro lado, sugerir potencialidades

    distintas para estas populaes celulares. Apesar de existirem vrios trabalhos

    sobre CTMH isoladas de tecidos umbilicais, o conhecimento biolgico e

    gentico sobre elas ainda insuficiente para que o seu potencial teraputico

    seja explorado com segurana e eficcia, sobretudo no que diz respeito s

    CTMH isoladas da veia do cordo umbilical humano. Alm disso, o uso dessas

    clulas na clnica depende de seu isolamento e expanso in vitro. Portanto,

    informaes sobre as propriedades biolgicas dessas clulas aps um longo

    perodo de cultivo pode auxiliar na elaborao de novas estratgias que

    assegurem e monitorem a manuteno do fentipo de clula-tronco,

    oferecendo maior garantia e segurana para seu uso nos tratamentos clnicos.

    2.3. Senescncia celular

    O processo de senescncia celular foi originalmente caracterizado pela

    capacidade limitada de diviso celular de fibroblastos humanos in vitro por

    Leonard Hayflick e Paul Moorhead (1961), sendo chamada de senescncia

    replicativa. Posteriormente, esta condio foi atribuda diminuio do

    comprimento dos telmeros e ausncia da telomerase. Adicionalmente,

    muitas clulas somticas humanas sofrem senescncia replicativa in vitro

    (revisado Chen et al., 2007). Um estudo desenvolvido por Takubo e

    colaboradores (2010) demonstra que o envelhecimento dos tecidos in vivo

    tambm deve estar relacionado ao encurtamento dos telmeros. Estes

    pesquisadores observaram que, com poucas excees, principalmente crebro

    e miocrdio, a taxa de reduo do telmero (pb/ano) muito semelhante em

    mais de duas dezenas de tecidos retirados de pacientes humanos na faixa

    etria de recm-nascido at 100 anos. Estudos adicionais demonstraram que o

    telmero encurtado se constitui como um stio de leso no DNA e que este

    ativa uma resposta ao dano no DNA (DDR DNA damage response))

    envolvida com a senescncia replicativa (revisado Chen et al., 2007). O

    desgaste acelerado do telmero est implicado com vrias doenas humanas

    relacionadas idade como, aumento de risco ao desenvolvimento de cncer,

    doena de Alzheimer, sndromes progerides (por exemplo, Werner e Bloom),

  • 27

    Diabete Mellitus, osteoartrite, aterosclerose, diminuio da cicatrizao de

    feridas e da resposta imune (revisado por Bekaert et al., 2005).

    Alm do encurtamento dos telmeros, outros fatores esto associados

    senescncia celular, tais como estresse oxidativo (Toussaint et al., 2000);

    senescncia prematura induzida por estresse (Serrano e Blasco, 2001;

    Toussaint et al., 2000); ativao de oncogenes (revisados por Prieur e Peeper,

    2008); e ativao da DDR (revisado por dAdda di Fagagna, 2008).

    Resumidamente, o mecanismo de senescncia celular pode ser explicado da

    seguinte maneira: danos no DNA (causados por vrios tipos de estresse como,

    disfuno telomrica; quebras de dupla fita; estresse oxidativo; e ativao de

    oncogenes) resultam na ativao da DDR promovendo a parada no ciclo

    celular de forma irreversvel, mesmo na presena de fatores de crescimento

    (revisado por Magalhes, 2004).

    Alguns estudos tem contribudo para uma contribuio na compreenso

    de mecanismos moleculares senescncia envolvidos com a parada do ciclo

    celular. Genes como CCNA2, que promovem a proliferao celular, podem ter

    sua expresso inibida. Alguns trabalhos demonstram que genes supressores

    tumorais, como P16/RB e P53/p21, podem levar formao de SAHF. Estes

    genes fazem parte da via DDR relacionada senescncia (Revisado por Sikora

    et al., 2011). Tambm foi observado que nas clulas senescentes so

    formados focos de heterocromatina (SAHF- senescence-associated

    heterochromatic foci), que podem contribuir para a natureza irreversvel da

    senescncia.

    Assim, basicamente, em virtude de uma clula senescente sofrer uma

    parada no ciclo celular de forma irreversvel, este processo considerado

    como uma proteo contra o desenvolvimento do cncer (Braig et al., 2005;

    Chen et al., 2005; Collado et al., 2005; Courtois-Cox et al., 2006; Michaloglou et

    al., 2005). No entanto, as clulas senescentes no sofrem apenas parada do

    ciclo celular, estas sofrem alteraes no seu fentipo, afetando sua morfologia

    e funo (CampisiedAdda di Fagagna, 2007). Elas adquirem aumento do seu

    tamanho, numerosos grnulos no seu citoplasma e aumento da atividade de

    beta galoctosidase. Outra caracterstica que clulas senescentes exibem

    instabilidade cromossmica (Arendt et al., 2009; MosieniakeSikora, 2010;

  • 28

    Wojda et al., 2006) e adquirem um fentipo secretoma caracterstico, chamado

    de fentipo secretrio associado senescncia (SASP - senescent-associated

    secretory phenotype). Ele compreende o aumento no nvel de liberao de

    mais de 40 fatores que atuam na sinalizao celular, fatores de crescimento,

    proteases, entre outros (Revisado por Davalos et al., 2010). Foi proposto que o

    SASP contribui para a manuteno da senescncia no tecido e para o

    desenvolvimento de doenas relacionadas idade e d suporte

    carcinognese (Revisado por Sikora et al., 2011). Contudo, detalhes

    moleculares das redes de interaes de vias relacionadas ao processo de

    senescncia celular ainda precisam ser elucidados para uma melhor

    compreenso sobre a sua ligao com o envelhecimento in vivo, com o

    surgimento de doenas e com o cncer.

    No indivduo adulto, a homeostasia do tecido se d por meio da

    renovao e diferenciao de clulas-tronco somticas, especficas de cada

    tecido. Durante o envelhecimento, fatores ambientais, o gentipo do indviduo e

    fatores estocsticos podem induzir gradualmente alteraes genticas e

    epigenticas que causam um declnio das funes de clulas-tronco que pode

    ser a origem das doenas metablicas, degenerativas, cncer e o

    envelhecimento dos indivduos (Revisado por Rodrguez-Rodero, et al. 2011).

    Esta proposio est em conformidade com a observao de que o

    envelhecimento afeta a renovao e a capacidade de diferenciao de CTMH

    residentes no tecido adiposo e na MO de indivduos mais velhos (Alt et al.,

    2012; Kretlow et al., 2008; Chen et al., 2009), bem como a morfologia das

    CTMH obtidas da MO em indivduos idosos (Zaim et al., 2012). As vias

    envolvidas com as alteraes na sequncia do DNA no envelhecimento das

    clulas-tronco somticas no so claras, mas alguns estudos sugerem que o

    comprimento do telmero ou deficincias no reparo possam fazer parte destas

    rotas (Revisado por Rodrguez-Rodero et al., 2011).

    Algumas caractersticas de senescncia replicativa j foram descritas em

    CTMH cultivadas aps longo tempo in vitro. Wagner e colaboradores (2008)

    estudaram o efeito da senescncia replicativa de MO-CTMH, comparando as

    clulas na passagem 7 e na passagem 12. Os resultados deste trabalho

    demonstraram que as MO-CTMH na passagem mais tardia apresentaram uma

    capacidade finita de diviso celular; alteraes na sua morfologia, tornaram-se

  • 29

    maiores; declnio na expresso de marcadores moleculares especficos, bem

    como, diminuio de seu potencial de diferenciao adipognico e aumento do

    osteognico. Outros autores demonstram que as MO-CTMH perdem

    gradualmente sua capacidade progenitora (Banfi et al.,2000). Alm destas

    consequncias funcionais, o co-cultivo de CTMH com HSC evidenciou que

    quando foi utilizado CTMH de passagens tardias houve um aumento da

    proliferao de clulas progenitoras hematopoiticas enquanto que com CTMH

    de passagens iniciais as HSC mantiveram um fentipo mais primitivo (Walenda

    et al., 2009). Como j foi descrito que a secreo de fatores de crescimento e

    citocinas por fibroblasto pode ser influenciada pelo tempo de cultura (Coppe et

    al. 2008), uma sugesto que as funes imunomoduladoras de CTMH

    possam ser alteradas durante a expanso na cultura por alterao no seu perfil

    secretrio.

    Os estudos de senescncia celular tm utilizado o nmero de

    passagens, o tempo para duplicao da populao (PD- Population doublings);

    e a deteco da -galactosidase (SA--gal), para identificar as clulas

    senescentes aps sua expanso. O nmero de passagens representa o

    nmero de vezes que a cultura foi expandida. O tempo requerido para isto

    depende do nmero de clulas semeadas inicialmente, o qual afeta o momento

    em que elas alcanam a confluncia, e, consequentemente, a frequncia da

    passagem. Portanto, podem haver diferenas laboratoriais produzindo artefatos

    no estudo da senescncia. O PD o quociente entre o nmero de clulas

    colhidas dividido pelo nmero de clulas que foram inicialmente semeadas. No

    entanto, este nmero expressa apenas o nmero cumulativo de divises

    celulares de toda a cultura, independentemente de clulas individuais; algumas

    clulas podem ser perdidas durante a lavagem; e j documentado que h

    diferenas entre PD sob mesma condio de cultura entre doadores. O ensaio

    da enzima SA--gal um mtodo bem estabelecido que pode ser aplicado em

    preparaes de CTMH. Embora ele no facilite a quantificao absoluta de

    clulas senescentes, a enzima ativa apenas em senescentes e no em

    quiescentes, pr-senescentes, ou diferenciadas (Revisado por Wagner et al.,

    2010). Entretanto, em culturas confluentes pode ocorrer a colorao com a SA-

    -gal que aumentada pela inibio por contato (Gary e Kindell, 2005).

  • 30

    2.4. Estabilidade genmica das CTMH ao longo tempo de cultivo

    A proliferao das clulas em cultivo usualmente maior do que in vivo,

    com isso elas esto sujeitas a acumular mais danos no DNA quando

    expandidas in vitro. Diversos estudos relatam que o tempo de cultivo pode

    levar aquisio de alteraes cromossmicas em CTMH humanas (Bochkov

    et al., 2007; Maitra et al., 2005; Sareen et al., 2009; Stephenson et al., 2010;

    Ueyama et al., 2011;). O mais recente e maior estudo de estabilidade genmica

    em clulas-tronco adultas utilizou 400 amostras isoladas de diferentes tecidos

    (de MO, tecido adiposo, cordo umbilical e tecidos fetais) e nove amostras de

    CTMH derivadas de CT embrionrias. Estes autores encontraram nove

    alteraes em seis das 144 amostras de CTMH analisadas, uma frequncia de

    4%, menor do que a encontrada em CT neurais e CT pluripotentes induzidas,

    ambas apresentaram cerca de 9%. Eles demonstraram que a presena de

    alteraes cromossmicas uma caracterstica comum de clulas-tronco

    propagadas in vitro, e sugeriram que cada tipo de clula-tronco tem uma

    predisposio a adquirir um conjunto particular de alteraes cromossmicas.

    Em CTMH foi identificada uma tendncia ao surgimento de monossomia, uma

    delas foi do cromossomo 13. Tal alterao relacionada com tumores

    mesenquimais, frequente em tumores de tecidos moles e osso (lipomas,

    condrossarcomas e osteossarcomas) (Ben David et al., 2011). Alm disso, em

    modelos animais, CTMH expandidas in vitro apresentam uma alta

    susceptibilidade transformao maligna (Miura et al., 2006; Tolar et al., 2007;

    Ren et al., 2011).

    No entanto, h tambm alguns estudos que no encontraram

    aberraes cromossmicas em MO-CTMH aps sua expanso in vitro (Zhang

    et al., 2007; Choumerianou et al., 2008; Spees et al., 2004; Bernardo et al.,

    2007 a, b). CTMH isoladas de lquido amnitico e da vilosidade corinica,

    expandidas at chegar senescncia, apresentaram caritipo normal,

    indicando que as CTMH fetais so estveis e podem ser usadas na medicina

    regenerativa (Poloni et al., 2011). Descries de transformao espontnea in

    vitro em CTMH humanas (Rubio et al., 2005; Rosland et al., 2009), foram

    desvalidadas pela retratao destes trabalhos, afirmando que os resultados de

  • 31

    transformao encontrados foram originados de contaminao cruzada (de La

    Fuente et al., 2010; Torsvik et al., 2010). Contudo, a presena de aneuploidia

    em vrias preparaes de MO-CTMH para aplicao clnica foi observada

    depois de seu cultivo. No entanto, como valores de expresso de genes

    relacionados transformao estavam normais, os autores sugeriram que

    aneuploidia poderia aparecer durante a expanso, mas isso no significaria

    uma transformao, e sim uma senescncia celular (Tarte et al., 2010). Depois

    disso, as pesquisas clnicas com CTMH na Frana foram liberadas, mesmo

    sendo identificadas aneuploidias.

    A inexistncia de alteraes cromossmicas tambm foi relatada em

    CTMH do cordo umbilical expandidas in vitro (Spees et al., 2004). Um estudo

    com infuso de CTMH em modelos animais revelou que em nenhum dos

    camundongos tratados com CTMH da geleia de Wharton houve o

    aparecimento de doena e nem reaes inflamatrias (Fong et al., 2010;

    Gauthaman et al., 2012). Estes estudos indicam que as CTMH do cordo

    umbilical so hipoimunognicas e no tumorignicas, com grande potencial

    para o uso seguro na terapia celular. Nekanti e colaboradores (2010)

    observaram caritipos normais de CTMH da geleia de Wharton expandidas at

    a passagem 20. Duarte e colaboradores (2012) encontraram um grande

    nmero de alteraes cromossmicas aps a criopreservao das UV-CTMH

    de um dos cordes, entretanto, nenhuma alterao clonal foi observada.

    Apesar da maioria dos achados apontarem para uma maior estabilidade

    das CTMH comparadas aos outros tipos de clulas-tronco, embrionrias e

    pluripotentes induzidas, os relatos do surgimento de alteraes cromossmicas

    em cultura merecem ateno, uma vez que estas podem estar relacionadas

    com os eventos de insucesso da terapia celular, ou de carcinognese. O efeito

    de alteraes cromossmicas na biologia das CTMH expandidas in vitro deve

    ser estudado por uma investigao mais detalhada que fornea conhecimentos

    moleculares dos processos celulares afetados.

  • 32

    2.5. Microarranjos e Estudos de expresso gnica em CTMH

    Uma maneira de conhecer a funo dos genes por monitoramento da

    expresso de milhares de genes em uma amostra sobre uma determinada

    condio. O conjunto de molculas de RNA transcritas de um genoma

    chamado de transcriptoma. O mtodo mais comum para sua avaliao o de

    microarranjos (Auer et al., 2009; Hey e Pepper, 2009). Eles so um conjunto de

    sequncias de DNA (DNA complementar ou oligonucleotdeo) construdas

    artificialmente, complementares aos transcritos dos genes que se deseja

    interrogar a expresso, e distribudas em stios especficos (spots ou probe cell)

    em uma superfcie slida. Cada spot contm centenas de cpias das

    sequncias de desoxirribunucleotdeos complementares a um nico RNA alvo

    (Revisado por Bute, 2002).

    Na pesquisa mdica, o estudo do perfil de expresso por microarranjos

    surge como uma ferramenta til para melhor compreenso de doenas,

    identificao de novos alvos teraputicos, e subclassificao de doenas para

    identificar estratgias mais individualizadas de tratamento (Revisado por Auer

    et al., 2009). Em outras pesquisas bsicas e aplicadas, sua anlise tem como

    objetivo acessar o perfil molecular de uma dada amostra; descobrir novos

    biomarcadores; ou fornecer informaes para fazer novas anotaes do

    genoma. As duas anlises principais deste mtodo consistem em testar genes

    diferencialmente expressos entre duas ou mais condies, e identificar as

    categorias funcionais mais representadas pelos genes diferencialmente

    expressos em um estudo (Revisado por Kauffmann e Huber, 2010).

    Na ultima dcada, os avanos nesta tecnologia, bem como o

    desenvolvimento de programas para a anlise dos seus dados, aumentaram a

    confiabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade desta tcnica, por exemplo, por

    meio de um melhor controle da qualidade de dados (Revisado por Kauffmann e

    Huber et al., 2010; Revisado por Snchez-Pla et al., 2012). Dentre as vrias

    plataformas de microarranjos disponveis, GeneChips Affymetrix so os mais

    frequentemente usados para analisar perfil de expresso, mais de 3000

    publicaes cientficas descreveram resultados com esta tecnologia (Auer et

    al., 2009). Estes microarranjos consistem numa matriz de alta densidade de

    oligonucleotdeos, e cada transcrito detectado por um grupo particular de

  • 33

    sequncias de sondas com 25 nucleotdeos, conhecidos como um conjunto de

    sonda (probe set). O agrupamento das intensidades em vrias sondas resulta

    em uma medida nica de expresso de um gene. Um dos microarranjos da

    affymetrix, o GeneChip Human Genome U133 plus 2.0 Array (HG U133

    Plus 2.0). Neste h 1.300.000 oligonucleotdeos nicos cobrindo mais de

    47.000 transcritos e variantes (acessado em:

    http://media.affymetrix.com/support/technical/datasheets/hgu133arrays_datash

    eet.pdf, no dia 08 de setembro de 2012).

    Embora ainda haja algumas limitaes na tcnica de microarranjos,

    como sua incapacidade de descoberta de novos RNA mensageiros, ela

    considerada uma tecnologia consolidada para anlise de transcriptoma

    utilizada a mais de uma dcada. Mais recentemente, muita ateno tem sido

    dada ao sequenciamento de RNA (RNA-seq). Esta nova abordagem, uma das

    tcnicas de sequenciamento de ltima gerao (next-generation sequencing

    NGS), supera as limitaes da primeira. No entanto, acredita-se que sua

    existncia no extinguir a utilizao dos microarranjoss. A escolha dever se

    dar pelo custo, disponibilidade, e a necessidade de cada pesquisa (Revisado

    por Snchez-Pla et al., 2012).

    Recentemente, um banco de dados denominado Stem Base

    (http://www.stembase.ca/?path=/) foi desenvolvido com o propsito de oferecer

    uma interface entre os dados gerados pela Rede Canadense de Clulas-

    tronco, para facilitar a descoberta de funes de genes relevantes no controle e

    diferenciao celular. Este banco disponibiliza trs opes para seu uso:

    pesquisa por experimentos, busca por amostras ou sondas, e anlises de

    dados de expresso do banco a partir de uma lista de genes de interesse do

    usurio. Dados de Microarranjos da Affymetrix de 50 amostras de clulas-

    tronco humanas foram depositados no Stem Base. Dentre estas, a maioria de

    clulas-tronco hematopoiticas e no h nenhuma amostra de CTMH humana,

    apenas 18 de clula-tronco mesenquimal de camundongo (Sandie et al., 2009).

    Os estudos de anlise de expresso gnica global em CTMH tm

    focado, basicamente, em dois aspectos: no processo de diferenciao celular

    (Kock et al., 2011; Menssen et al., 2011; Roobrouck et al., 2011; Yoo et al.,

    2011) e nas diferenas entre CTMH de fontes distintas (Jansen et al., 2010;

    Miranda et al., 2012; Panepucci et al., 2004; Secco et al., 2009; Tsai et al.,

  • 34

    2007; Weng et al., 2011; Kim et al., 2011). CTMH isoladas a partir da veia do

    cordo so funcionalmente semelhantes s MO-CTMH, mas genes

    diferencialmente expressos podem refletir as diferenas relacionadas aos seus

    locais de origem: MO-CTMH seriam mais comprometidas com a osteognese,

    enquanto CTMH do cordo seriam mais comprometidas com a angiognese

    (Panepucci et al., 2004). Uma comparao, mais recente, de dados de

    transcriptoma e protemica entre CTMH da veia do cordo e MO-CTMH,

    encontrou alguns genes/protenas diferencialmente expressos, mas que

    participam de funes celulares semelhantes (Miranda et al., 2012).

    Os estudos descritos acima mostram que CTMH residentes em locais

    distintos guardam muitas semelhanas, sugerindo uma origem comum, e

    diferenas que possivelmente refletem distintas propriedades biolgicas

    adquiridas pelo seu nicho natural (tais como, potenciais de proliferao e

    diferenciao), que, talvez, possam ser modificadas com a escolha adequada

    das condies de cultivo. Por exemplo, a substituio do meio de cultivo de

    CTMH pelo de MAPC (Multipotent Adult Progenitor Cells), tornou as CTMH

    capazes de se diferenciar em clulas semelhantes s endoteliais e aumentou a

    expresso de cinco transcritos endoteliais (CD34, VWF, FLK1, FLT1, TIE2)

    (Roobrouck et al., 2011).

    Alguns trabalhos sugerem que o tempo de cultivo afeta a expresso

    gnica. MO-CTMH na passagem 10, cultivadas em Soro Fetal Bovino (SBF),

    que tiveram diversos transcritos regulados positivamente, incluindo alguns

    envolvidos com a inibio do ciclo celular. Enquanto, que MO-CTMH na mesma

    passagem cultivadas com soro autlogo, mantiveram uma expresso estvel

    (Shahdadfar et al., 2005). Um estudo, utilizando um arranjo de baixa densidade

    (Human Stem Cell Pluripotency Low Density), contendo marcadores de clulas-

    tronco indiferenciadas e alguns de linhagens no estgio inicial de diferenciao,

    verificou que a expresso de alguns marcadores de clulas indiferenciadas

    diminuiu em CTMH da geleia de Wharton e MO-CTMH nas passagens tardias

    (P15-p20), sendo observada uma maior diminuio em MO-CTMH, sugerindo

    uma manuteno do fentipo de clula-tronco mais forte em CTMH da geleia

    de Wharton comparadas s MO-CTMH aps expanso in vitro (Nekanti et al.,

    2010). O transcriptoma de MO-CTMH e ASC humanas, na passagem 20 (P20)

    e 30 (P30), respectivamente, no foi afetado de maneira significativa. No

  • 35

    entanto, esse mesmo estudo detectou diminuio na quantidade da protena

    p53 em ASC em P30. O estudo ainda comparou estas linhagens com as

    mesmas obtidas de macaco Rhesus em passagens iguais, sendo observada

    uma alterao significativa no perfil de expresso de genes envolvidos com o

    ciclo celular, resposta ao dano e reparo do DNA, tais como TP53. A diminuio

    da expresso da p53 pode estar relacionada com a menor taxa de apoptose

    nas ASC humanas e de clulas-tronco mesenquimais de MO de Rhesus na

    passagem 30, bem como associada com o fato de que estas ltimas

    puderam ser cultivadas alm da passagem 30 (Izadpanah et al., 2008).

    Uma anlise de expresso gnica, por meio de protemica, de CTMH da

    geleia de Wharton depois da expanso in vitro at a 12 passagem, revelou

    que diversas protenas, incluindo Shootin1, Adenilatoquinase 5 isoenzima e

    inibidor do ativador do plasminognio-2 j no so expressas aps a passagem

    2, sugerindo que a potncia proliferativa destas clulas reduzida aps a sua

    fase inicial de crescimento in vitro. Este estudo tambm observou que na ltima

    passagem analisada, houve o surgimento de novas protenas, incluindo, ERO1-

    alfa, aspartil-tRNA sintetase e prolil-4-hidroxilase, indicando que estas

    protenas estejam envolvidas na dificuldade de sobrevivncia e diferenciao

    celular aps o tempo de cultivo (Angelucci et al., 2010). O perfil de expresso

    gnica de CTMH de diferentes origens (lquido amnitico, membrana amnitica,

    sangue do cordo, e MO) permaneceu estvel entre as passagens 3 e 6,

    durante a cultura in vitro , e depois da criopreservao (Tsai et al., 2007).

  • 36

    3.0. OBJETIVOS

    O presente trabalho teve como objetivo geral analisar o efeito da

    senescncia no perfil de expresso gnica das CTMH/inv, que tm a inverso

    cromossmica (inv(3)(p13p25~26), e das CTMH/n, que apresentam caritipo

    constitucional normal, sob as mesmas condies de cultivo, bem como

    comparar, pela primeira vez, o perfil de expresso gnica de CTMH/inv com o

    perfil de CTMH/n jovens e senescentes.

    Objetivos especficos:

    Identificar o nmero de passagens in vitro necessrio para

    obteno de uma cultura celular senescente;

    Verificar se h diferena entre o perfil de expresso de

    senescentes vs jovens em cada CTMH/inv e CTMH/n;

    Verificar se h diferena entre o perfil de expresso de CTMH/inv

    vs CTMH/n, jovens e senescentes;

    Verificar se a expresso diferencial de genes identificados na

    anlise de microarranjos corroborada por PCR em tempo real;

    Identificar as categorias funcionais mais representadas pelos

    genes diferencialmente expressos para cada comparao;

    Construir redes de interao gnica e identificar gargalos destas

    redes para auxiliar na interpretao biolgica dos processos

    afetados.

  • 37

    4.0. MATERIAL E MTODOS

    4.1. Isolamento e Caracterizao das CTMH

    No presente trabalho, foram utilizadas CTMH obtidas do endotlio da

    veia do cordo umbilical de trs doadores. Os cordes foram coletados na

    maternidade Janurio Cicco da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

    (UFRN). Todas as mes que doaram os cordes assinaram o termo de

    consentimento livre e esclarecido de acordo com aprovao do Comit de

    tica em Pesquisa da UFRN sob o protocolo n. FR132464. Os procedimentos

    realizados para a coleta de todos os cordes, bem como o isolamento, a

    caracterizao imunofenotpica por citometria de fluxo, as diferenciaes

    adipognica, osteognica e condrognica, e a anlise citogentica das CTMH

    do endotlio da veia do cordo seguiram os protocolos realizados por Duarte et

    al. (2012).

    As CTMH isoladas dos trs cordes umbilicais foram caracterizadas

    citogeneticamente por Cornlio (2012), Um dos cordes tem uma alterao

    cromossmica constitucional: inverso paracntrica no brao curto do

    cromossomo 3, caritipo: 46,XY,inv(3)(p13p25~26) (Duarte et al. 2012), esta

    linhagem aqui denominada como CTMH/inv. Muitas clulas CTMH/inv

    senescentes apresentaram instabilidade gentica, caracterizada pelo

    surgimento de alteraes cromossmicas, especialmente, associaes

    telomricas (tas) e ganho de material gentico do cromossomo 20, que so

    alteraes caractersticas de tumor sseo de clulas gigantes (TCG). Os outros

    dois cordes possuem caritipo constitucional normal, portanto, no presente

    trabalho as CTMH isoladas de tais cordes sero denominadas CTMH/n.

  • 38

    4.2. Condies de cultura das CTMH para anlise do seu perfil de

    expresso gnica

    As clulas recuperadas da criopreservao, conforme protocolo de

    Duarte et al. (2012), foram plaqueadas em frascos T25 com meio alfa-MEM

    (Gibco), suplementadas com 10% de SFB (Gibco) e 1% de soluo de

    antibitico (penicilina e estreptomicina Sigma ou Gibco) e mantidas 37 C

    em incubadora umidificada com 5% de CO2. Ao atingir a confluncia de 60-

    70%, as clulas foram expandidas utilizando 1mL de 0,25% de tripsina/EDTA

    (Invitrogen). Depois de contadas em hemocitmetro com azul de tripan (Gibco),

    as clulas foram plaqueadas novamente em uma concentrao de 4000

    clulas/cm2 em diferentes frascos de cultura, este procedimento caracteriza

    uma passagem (P) celular. As clulas foram monitoradas em microscpio

    invertido (CKX 41, OLYMPUS) e a troca de meio foi realizada a cada 72 horas

    ou quando o meio ficava amarelado, indicativo de mudana de pH.

    A expanso teve continuidade at a passagem 18 para obteno das

    amostras para anlise de expresso gnica das CTMH obtidas de dois cordes

    (cordo 10 caritipo normal - com 9 replicatas experimentais e cordo 04

    inv(3)(p13-25~26) - com 6 replicatas experimentais), e at a 9 passagem para

    CTMH do outro cordo (cordo 12 caritipo normal com 3 replicatas

    experimentais), seguindo as mesmas condies de cultivo descritas acima.

    Portanto, as passagens de cultura utilizadas para as anlises do perfil de

    expresso gnica foram:

    a) Passagem 9 consideradas como CTMH jovens isoladas do cordo

    com inverso (grupo CTMH/inv) e de dois cordes com caritipo

    constitucional normal (grupo CTMH/n).

    b) Passagem 18 consideradas como CTMH senescentes isoladas do

    cordo com inverso (grupo CTMH/inv) e de um cordo com caritipo

    constitucional normal (grupo CTMH/n).

    Aps a passagem 18, as clulas foram expandidas at o momento

    em que no foi possvel realizar um novo subcultivo, isto ocorreu na passagem

  • 39

    24. Nessa ltima passagem, as clulas foram mantidas em cultivo com trocas

    de meio e monitoradas diariamente pela observao em microscpio invertido.

    4.3. Caracterizao das CTMH senescentes

    As clulas foram definidas como senescentes ao se visualizar em

    microscpio invertido (CKX 41, OLYMPUS) as seguintes caractersticas:

    aumento do tamanho celular, alterao na morfologia, aumento na presena de

    clulas vacuolizadas, diminuio da capacidade proliferativa e maior proporo

    de clulas flutuantes no meio de cultura.

    Alm disso, foi realizado o ensaio para deteco da atividade da -

    galactosidase em pH 6,0, utilizando o Kit Senescence - galactosidase da Cell

    Signaling Technology, conforme as instrues do fabricante (Chemicon, USA)

    Resumidamente, as clulas foram fixadas durante 5 min temperatura

    ambiente em soluo fixadora 1X, em seguida, foram lavadas e incubadas

    durante a noite 37 C com soluo de colorao SA--gal. Posteriormente,

    as clulas foram lavadas com PBS e visualizadas utilizando um microscpio de

    luz. As clulas que apresentaram colorao verde foram consideradas

    senescentes. Para evitar a interferncia da confluncia celular, o ensaio foi

    realizado em culturas com 60% de confluncia em triplicatas experimentais.

    4.4. Extrao de RNA

    O RNA total foi extrado de 1x106 clulas (~90% de confluncia) em dois

    momentos: na passagem 9, caracterizadas como clulas jovens das CTMH/inv

    (obtidas do cordo 04) e CTMH/n (obtidas dos cordes 10 e 12); e na

    passagem 18, caracterizadas como senescentes das CTMH/inv (obtidas do

    cordo 04) e CTMH/n (obtidas do cordo 10).

    O protocolo da extrao seguiu as instrues contidas no manual do

    RNeasy mini kit (Qiagen). O RNA extrado foi mantido -80 C at sua

    utilizao nos ensaios de expresso gnica. A sua avaliao quanto

    integridade e quantidade foi, respectivamente, realizada por ensaios utilizando

    o Agilent 2100 Bioanalyzer RNA (Agilent Technologies) e o espectrofotmetro

    NANODROP (Nano Drop Technologies Inc.), seguindo as instrues dos

    manuais dos mesmos. Todos os parmetros exigidos para publicao

  • 40

    utilizando o mtodo de reao em cadeia de polimerase com transcriptase

    reversa (RT-PCR) em tempo real foram devidamente avaliados conforme

    descritos por Bustin e colaboradores em 2009. Todas as amotras de RNA

    utilizadas para os ensaios de microarranjos e de RT-PCR em tempo real

    apresentaram RIN 9,0 e razo 260/280 prxima ao valor 2,0.

  • 41

    4.5. Preparao do RNA, Hibridizao e Captura da imagem do

    Microarranjos.

    Do RNA total extrado de cada replicata de todas as CTMH/n e

    CTMH/inv, jovens e senescentes, 100 ng foi utilizado para a marcao

    utilizando o GeneChip 3 IVT Express Kit (Affymetrix Inc.) de acordo com as

    instrues do mesmo. Resumidamente, a primeira fita cDNA foi sintetizada

    pela transcrio reversa utilizando um primer oligo dT etiquetado com um

    promotor T7 a partir do RNA total 42 C por 2 horas. Este cDNA foi ento

    convertido em dupla fita utilizando a complementariedade do promotor T7 da

    primeira fita do cDNA 16 C por 1 hora. Posteriormente, foi realizada uma

    transcrio in vitro para sintetizar RNA marcado (aRNA) por meio da

    incorporao de nucleotdeos conjugados com biotina 40 C por 16 horas. O

    aRNA foi ento purificado por microesferas magnticas e 15 g deste foi

    fragmentado 94 C por 35 minutos. O aRNA purificado e fragmentado foi

    mantido -20 C at sua hibridizao no Laboratrio Nacional de Luz Sncroton

    (LNLS) em Campinas-SP. Depois, 12,5 g do aRNA fragmentado foi

    hibridizado no microarranjo Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0 arrays,

    juntamente com os controles e a soluo de hibridizao conforme indicado

    pelo Hybridization, Wash, and Stain Kit (Affymetrix Inc). Em seguida, os

    microarranjos foram mantidos em uma incubadora, Genechip Hybridization

    Oven-640 (Affymetrix Inc), com rotao de 60rpm 45C por 16 horas. Depois,

    os microarranjos foram lavados na estao de lavagem, Genechip Fluidics

    Station-450 (Affymetrix Inc), e corados para amplificao do sinal com o

    Hybridization, Wash, and Stain Kit (Affymetrix Inc), como indicado pelo manual

    do fabricante. Os microarranjos foram escaneados com o Affymetrix Gene-Chip

    Scanner-3000-7G (Affymetrix Inc). A qualidade da hibridizao foi avaliada pelo

    Affymetrix GCOS software seguindo as instrues do fabricante.

    4.6. Anlises dos dados de microarranjos

    Os dados obtidos da hibridizao foram monitorados quanto sua

    qualidade inserindo os arquivos CEL no programa Expression Console Version

    1.1 (Affymetrix) utilizando o padro do algortimos RMA (Robust Multi-array

    Analysis). Foram observados todos os parmetros de qualidade conforme

  • 42

    recomendado pelo fabricante. Subsequentemente, os arquivos CEL foram

    importados para o programa Partek Genomic Suite (version 6.4; Partek Inc.,

    St. Louis, MO) utilizando o algortimo RMA para sumarizao e normalizao

    com correo de background CG. O sinal de cada transcrito foi calculado

    utilizando a mdia das intensidades de cada probset correspondente ao

    mesmo transcrito. A correspondncia entre as replicatas experimentais foi

    realizada utilizando anlise de componente principal e de correlao de

    Pearson. Posteriormente, para identificao dos genes diferencialmente

    expressos foi aplicado o teste ANOVA (one-way analysis of variance) com

    correo Bonferroni. Foi considerado estatisticamente significativo os genes

    com o valor de p 0,001 com correo Bonferroni e com o fold change 3,0. Os

    perfis de expresso gnica comparados foram:

    a) CTMH/n senescentes (replicatas do cordo 10) vs CTMH/n jovens

    (replicatas do cordo 10);

    b) CTMH/inv senescentes (replicatas do cordo 04) vs CTMH/inv

    jovens (replicatas do cordo 04);

    c) CTMH/inv jovens (replicatas do cordo 04) vs CTMH/n jovens

    (replicatas do cordo 10 e 12);

    d) CTMH/inv senescentes (replicatas do cordo 04) vs CTMH/n

    senescentes (replicatas do cordo 10).

    4.7. Avaliao da expresso diferencial por RT-PCR em tempo Real

    Para verificar se o perfil de expresso diferencial identificado por

    microarranjos reproduzido por outra tcnica, alguns genes de cada

    comparao foram selecionados para anlise de expresso por RT-PCR em

    tempo Real (qPCR). Para tanto, 1g do RNA total extrado de todas as

    amostras foi utilizado para a sntese de cDNA conforme recomendaes do

    fabricante do High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied

    Biosystems). O cDNA foi mantido -20C at a sua amplificao. 200ng do

    cDNA foi amplificado utilizando os ensaios TaqMan Gene Expression Assays

    (Applied Biosystems) seguindo os procedimentos conforme sugerido pelo

    fabricante. A anlise de expresso gnica foi realizada com o mtodo de

  • 43

    quantificao relativa, utilizando o gene YWHAZ como referncia endgena, o

    qual j foi identificado como melhor endgeno para CTMH de cordo umbilical

    por Wang et al. (2010). O gene foi eleito como endgeno para o qPCR por

    meio de anlise de variao de seus valores de expresso nos microarranjos.

    A anlise estatstica foi feita utilizando o programa geNorm M. O valor de M

    para YWHAZ foi de 0,142, demonstrando uma expresso estvel para este

    gene.

    Para realizao do qPCR foram selecionados 11 genes (Tabela 1) a

    partir da lista do genes diferencialmentes expressos em ambas as

    comparaes CTMH/inv jovens vs CTMH/n jovens e em CTMH/inv

    senescentes vs CTMH/n senescentes. Foram eleitos conforme seu padro de

    expresso, bem como pela sua relevncia biolgica sugerida pelo Igenuity

    Analysis Pathway (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA). Todos

    os ensaios foram sintetizados pelo servio sondas inventoriadas com

    marcao FAM (Applied Biosystems).

    Os genes ANKRD1 e MMP1 tambm foram utilizados para comparao

    entre as CTMH/n (cordo 10) senescentes vs CTMH/n (cordo 10) jovens. Os

    genes SFRP1, G0S2, ANKRD1 e NDN foram utilizados para a comparao

    entre as CTMH/inv (cordo 04) senescentes vs CTMH/inv (cordo 04) jovens.

    Assim, ao total foram 28 comparaes de expresso gnica entre os dados de

    microarranjos e de qPCR.

    Gene ID do ensaio

    LAMC2 Hs01043711_m1

    ANKRD1 Hs00173317_m1

    KYNU Hs00187560_m1

    MMP1 Hs00899658_m1

    MAB21L1 Hs00366575_s1

    SFRP1 Hs00610060_m1

    NDN Hs00267349_s1

    ADORAB2 Hs00386497_m1

    CCL7 Hs00171147_m1

    G0s2 Hs00274783_s1

    ALDH1A1 Hs00946916_m1

    YWHAZ Hs03044281_g1

    Tabela 1. Ensaios utilizados para o qPCR.

  • 44

    4.8. Classificao funcional dos genes diferencialmente expressos

    Os genes diferencialmente expressos foram submetidos analise

    biolgica utilizando o programa Igenuity Patway analysis (IPA) (Ingenuity

    Systems, Redwood City, CA, USA) para identificar as categorias funcionais

    mais representadas pelos genes diferencialmente expressos. Os paramtros

    selecionados para esta anlise no programa, foram: Reference set Igenuity

    Knowlodge Base; Relationship to include Direta and indirect; Includes

    Endogenous Chemicall; Filter consider only molecules and/or relationships

    where species = human.

    4.9. Anlises de biologia de sistemas

    As redes de interaes foram construdas utilizando o software STRING

    verso 9.0 (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)

    (Szklarczyk et al., 2012). Para cada lista de genes diferencialmente expressos

    foram construdas duas redes: uma incluindo somente os genes da lista e outra

    incluindo genes do genoma humano com o limite de 5