UFRRJ

INSTITUTO DE VETERINÁRIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

VETERINÁRIAS

TESE

Efeitos de Medicamentos Homeopáticos e Bioterápicos em

Camundongos Experimentalmente Infectados por

Trypanosoma evansi (STEEL, 1885) BALBIANI, 1988 e

Trypanosoma cruzi CHAGAS, 1909

Luciana Rodrigues de Almeida

2007

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO

CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Efeitos de Medicamentos Homeopáticos e Bioterápicos em Camundongos Experimentalmente Infectados por Trypanosoma evansi (STEEL, 1885)

BALBIANI, 1988 e Trypanosoma cruzi CHAGAS, 1909

LUCIANA RODRIGUES DE ALMEIDA

Sob a Orientação do Professor Adivaldo Henrique da Fonseca

e Co-orientação dos Professores

Heitor Miraglia Herrera e Leoni Villano Bonamin

Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, no Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Área de Concentração Parasitologia Animal.

Seropédica, RJ Fevereiro 2007

“Não quero para mim a terrível limitação de viver apenas o que é passível de fazer sentido. Eu

não. Quero uma verdade inventada”. (Clarice Lispector).

Dedico esse trabalho aos animais destinados à pesquisa científica. . .

vítimas de sofrimento físico e psicológico.

AGRADECIMENTOS

A Deus pela vida. A meus pais, Dejair e Denise, pelo amor e apoio incondicional de sempre. Ao Prof. Adivaldo Henrique da Fonseca, pela oportunidade, assim como pelo exemplo de convivência e ética que sempre proporcionou aos seus orientados. Ao Dr. Heitor Miraglia Herrera, pela co-orientação deste trabalho, assim como pela oportunidade e confiança. À Dra. Leoni Villano Bonamin, pela co-orientação deste trabalho e por toda sua contribuição ao conhecimento científico da Homeopatia. À Dra. Ana Maria Jansen, pela oportunidade, pelos ensinamentos e pelo exemplo de compromisso com o espírito científico. Ao Professor Rogério Tortelli, Universidade Federal Fluminense (UFF), pelo apoio incondicional e ensinamentos na execução das avaliações histopatológicas, assim como pelas palavras sempre positivas e motivadoras. Aos amigos da Anatomia Patológica da UFF, Lorenzo, Isabelle e Marcelle, sempre dispostos a colaborarem de alguma forma. Ao Médico Veterinário Rodrigo Caldas Menezes, CECAL / Fiocruz, pelo apoio e orientação nas avaliações anatomopatológicas e histopatológicas. Ao Prof. Luiz Figueira Pinto, quem me proporcionou o conhecimento da Terapêutica Homeopática, introduzindo o ensino da Homeopatia na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRuralRJ), onde emprega brilhantemente esta terapêutica. Às queridas amigas do Laboratório de Doenças Parasitárias da UFRuralRJ, Raquel Lisbôa, Nathalie Cunha, Renata Madureira e Jânia Rezende pelo apoio e amizade de sempre. Ao representante dos alunos do Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fábio Silva Souza, pela paciência e pelas informações sempre ‘precisas’. Aos funcionários do laboratório de Biologia de Tripanossomatídeos, IOC/Fiocruz, Valquírea Menezes, Marco Antônio, Carlos Alberto, Marilene e Amarildo, pela atenção e apoio na rotina das atividades experimentais. À Mônica Caroline de Oliveira Campos, pelo auxílio fundamental nas atividades experimentais, pela presença amiga, assim como por compartilhar momentos tão inusitados, os quais permeiam o meio científico.

Aos amigos do laboratório de Biologia de Tripanossomatídeos, IOC/Fiocruz, Daniella Barcelos, Daniela Rozas, Mariane Amâncio e Rafael Monteiro pela ajuda e amizade em todos os momentos. Ao Professor Pedro Cabello, IOC/Fiocruz, pelo auxílio com as análises estatísticas. À Comissão de Apoio ao Ensino Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

BIOGRAFIA DO AUTOR

Luciana Rodrigues de Almeida, filha de Dejair Lopes de Almeida e Denise Iunes Rodrigues de Almeida, nasceu em Bom Jardim - RJ, no dia 08/11/1976. Em 1990, ingressou no Colégio Técnico da UFRRJ, obtendo o título de Técnico em Agropecuária em 1993. Graduou-se em Medicina Veterinária pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro – UFRRJ, em outubro de 1999. No período compreendido entre março de 1996 e fevereiro de 1998, foi bolsista de Iniciação Científica pelo programa PIBIC-CNPq, junto à UFRRJ. Em agosto de 2001, ingressou no curso de Mestrado em Medicina Veterinária, área de concentração Medicina Veterinária Preventiva, sob a orientação do professor Adivaldo Henrique da Fonseca, durante o qual, teve a oportunidade de estar na “Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse”-França, onde obteve diploma de especialização em “Pathologie Animale en Régions Chaudes”. Em dezembro de 2002, obteve o título de especialista em Homeopatia Veterinária pelo Instituto Hanhemanniano do Brasil, onde, posteriormente, em 2005, foi aceita como Membro Titular.

RESUMO ALMEIDA, Luciana Rodrigues de. Efeitos de Medicamentos Homeopáticos e Bioterápicos em Camundongos Experimentalmente Infectados por Trypanosoma evansi (STEEL, 1885) BALBIANI, 1988 e Trypanosoma cruzi CHAGAS, 1909. 2007. 67p Tese (Doutor em Ciências Veterinárias, Parasitologia Veterinária). Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2007. Com o objetivo de estudar efeitos terapêuticos e profiláticos de medicamentos homeopáticos foram empregados modelos de infecção aguda e crônica: infecção experimental de camundongos por Trypanosoma evansi e por Trypanosoma cruzi, respectivamente, assim como foi, também, empregado modelo de imunização de camundongos com extrato de T. evansi, objetivando avaliar efeitos imunomodulatórios de bioterápico homeopático. Foram empregados os medicamentos homeopáticos: bioterápico de Trypanosoma evansi no modelo de infecção por T. evansi e imunização; bioterápico de Trypanosoma cruzi e Phosphorus na infecção por T. cruzi. Para tal, camundongos machos adultos da linhagem C57BL/6 foram divididos em grupos experimentais: tratado com bioterápico antes da infecção experimental e imunização (Bai); tratado com bioterápico após infecção e imunização (Bpi); tratado com Phosphorus após infecção por T. cruzi (Phosphorus); tratado com soro fisiológico antes e após infecção e imunização (Controle ) e grupo controle não infectado (s/ infec.). Os bioterápicos foram preparados a partir do sangue de camundongos experimentalmente infectados por T. evansi e por T. cruzi. O medicamento Phosphorus foi proposto através da correlação entre as imagens clínicas e repertorial da infecção por T. cruzi, considerando-se as características diatésicas da Doença de Chagas. Ambos foram empregados na 12ª dinamização decimal Hering (12DH). Após infecção experimental, os animais foram monitorados a cada dois dias para determinação da parasitemia e de parâmetros relacionados à infectividade e à virulência da parasita. Foram também realizadas avaliações hematológicas e sorologia para pesquisa de anticorpos IgM e IgG após- infecção e imunização. De acordo com os resultados obtidos, não foram observados efeitos profiláticos e/ou terapêuticos decorrentes da administração de bioterápico homeopático em camundongos infectados por T. evansi, o que pode ser atribuído à elevada virulência e curso hiper agudo característico deste modelo experimental. Os resultados decorrentes do tratamento com bioterápico antes e após imunização de camundongos com extrato de T. evansi sugerem efeito imunomodulador, sendo observada resposta linfocítica mais precoce e intensa em Bai (p<0,05), assim como maiores títulos de IgG em Bpi (p<0,05) em relação ao controle. Em camundongos infectados por T. cruzi, observou-se em Bai menor período de patência (p<0,05), menor percentual de mortalidade e menores valores parasitêmicos nos dias 09, 13, 15 (p<0,05), 17(p<0,05), 22, 24 e 28 dias pós- infecção, em relação ao Controle, além de aumento significativo no número de linfócitos (p<0,05) e neutrófilos (p<0,05) ao longo do curso da infecção. O grupo Phosphorus apresentou maior período de patência e maior valor de parasitemia máxima (p<0,05), quando comparados ao Bai e ao Controle, entretanto, registrou-se 0% de mortalidade neste grupo durante o período avaliado. O estudo histopatológico revela que o grupo Bai apresentou, em geral, lesões inflamatórias teciduais menos intensas, sendo as lesões mais intensas observadas em Phosphorus e Controle, o qual apresentou características de cronificação do processo inflamatório. Os resultados obtidos indicam efeitos imunomoduladores associados à administração de bioterápicos, assim como efeitos do medicamento Phosphorus sobre a patogenia da infecção por T. cruzi, devendo, assim, ser melhor investigados. Palavras-chave: Trypanosoma sp, bioterápico, Phosphorus.

ABSTRACT ALMEIDA, Luciana Rodrigues de. Effects of homeopathic medecines and biotherapics on Trypanosoma evansi (STEEL, 1885) BALBIANI, 1988 and Trypanosoma cruzi experimentally infected mice CHAGAS, 1909. 2007. 67p Thesis (Doctor of Science in Veterinary Science, Veterinary Parasitology). Instituto de Veterinária, Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2007. With the aim to study the therapeutic and prophylactic effects of homeopathic medicines were employed acute and chronic infection models: experimental infection of mice by Trypanosoma evansi and by Trypanosoma cruzi, respectively, as a mice immunization model with T. evansi extract aiming evaluate the homeopathic biotherapic immunomodulatory effects. It were employed the homeopathic medicines: T. evansi biotherapic on T. evansi infection model and immunization, T. cruzi biotherapic and Phosphorus on T. cruzi infection model. Adult male C57BL/6 inbred mice had been divided in experimental groups: Treated with biotherapic before experimental infection and immunization (Bbi); treated with biotherapic post- infection and immunization (Bpi); treated with Phosphorus post T. cruzi infection (Phosphorus); treated with physiologic serum before and post- infection and immunization (Control) and control group not infected. The biotherapics were made from blood of T. evansi and T. cruzi experimentally infected mice. Phosphorus was proposed by correlation between clinical and repertorial images of T. cruzi infection, considering the diathesis of Chaga’s Disease. Both were used at 12 DH (Hering’s decimal) potency. After infection, mice were monitored at two days intervals, to determine the parasitaemia and infectivity and virulence parasite’s parameters. Hematological evaluations were also realized as a serology to IgM and IgG search. In according with the obtained results, it were not observed therapeutic or prophylactic effects due to biotherapic on T. evansi infected mice, that may be attributed to the high virulence and hyper acute course of infection characteristic of this experimental model. The results obtained when mice were treated with biotherapic before and after immunization with T. evansi extract suggests immunomodulatory effect, since it were observed highest lymphocytic response at Bbi (p<0,05), as highest IgG titers at Bpi (p<0,05), when comparated to the control group. On T. cruzi infected mice a significant lower patence period was observed in Bai group (p<0,05), as well a lower rate of mortality, lowest parasitaemias values at 9, 13, 15 (p<0,05), 17 (p<0,05), 22, 24 and 28 days post infection, and a significant growing of lymphocytes (p<0,05) and neutrophils (p<0,05) along the course of infection, regarding Control group. Phosphorus showed longest patent period, higher maximum of parasitaemia value (p<0,05), in relation to Bai and Control group, nevertheless, with 0% of mortality. The histopathological study showed at Bbi less intense inflammatory lesions, being the more intense lesions observed at Phosphorus and Control group, which showed cronification characteristics of inflammatory process. The results indicate immunomodulatory effects of biotherapics, as an effect of Phosphorus on the patogenicity of infection, and should be better investigated. Key words : Trypanosoma sp., biotherapic, Phosphorus.

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

C’

Sistema Complemento

CH

Diluição Centesimal Hahnemanniana

DEAE-celulose

Dietil Amino Etil-celulose

DH

Diluição Decimal de Hering

IgG

Imunoglobulina G

IgM

Imunoglobulina M

IL-12

Interleucina 12

IL-10

Interleucina 10

INF-?

Interferon gama

KLH

Hemocyanin . Macro-molécula extraída da hemolinfa de molusco

LTh1

Linfócito T auxiliar 1 (T ‘helpher’ 1)

LTh2

Linfócito T auxiliar 2 (T ‘helpher’ 2)

MHC

Complexo principal de histocompatibilidade (“Major histocompatibility complex”)

NK

Células exterminadoras naturais (“Natural killer cells”)

NO

Óxido nítrico (“Nitric oxide”)

PBS

Salina Fosfatada Tamponada (“Phophate Buffer Saline”)

PSG

Fosfato de sódio monobásico e dibásico + glicose (“Phophate Solution + glucose”)

TGF-ß

Fator transformador de crescimento-beta (“Transforming growth factor ß”)

TNF-a

Fator de necrose tumoral (“Tumor necrosis factor”)

UHD

Ultradiluição (“Ultra high dilution”)

VAT

Tipo de variação antigênica (‘Variation antigenic type”).

VG

Volume globular

VSG

Glicoproteína variante de superfície (“Variante surface glicoprotein”)

LISTA DE FIGURAS

Páginas Figura 1

Biotério convencional de experimentação, Pavilhão Carlos Chagas, IOC, Fiocruz, RJ. Estante com ventilação e temperatura controlada destinada à alocação de camundongos. Camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6 alocados em gaiolas de polietileno convencionais .....................................................................................

14

Figura 2 Administração oral de medicamento na forma líquida a camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi..................

16

Figura 3 Curso da infecção experimental por T. evansi em camundongos C57BL/6 tratados com bioterápico antes e após infecção experimental (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fiosiológico dinamizado (Controle). Log das médias de parasitemias observadas nos grupos....................................................

22

Figura 4 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores parasitêmicos entre os grupos de tratamento após infecção experimental por T. evansi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção experimental (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fiosiológico dinamizado (Controle). * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.............................................................................

22

Figura 5 Postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos das contagens global e diferencial de leucócitos em camundongos tratados com bioterápico antes da infecção (Bai), após infecção (Bpi) e, tratados com soro fiosiológico dinamizado (Controle) antes e após infecção experimental por T. evansi. Kruskal-Wallis Test.‘continua’...............

24-25

Figura 6 Postos médios (Mean Rank) dos títulos de anticorpos IgM e IgG aos 10 dias pós- infecção experimental por T. evansi em camundongos tratados com bioterápico antes da infecção (Bai), após infecção (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após infecção (Controle). Kruskal Wallis Test........................

26

Figura 7 Postos médios (Mean Rank) valores globais de leucócitos em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.................................

28

Figura 8 Postos médios (Mean Rank) dos valores globais de linfócitos em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle) antes e após imunização com extrato de T. evansi. * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.....................................

29

Figura 9 Postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de neutrófilos em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle) antes e após imunização com extrato de T. evansi. * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test..................................

29

Figura 10 Postos médios (Mean Rank) valores absolutos de eosinófilos em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). Kruskal-Wallis Test.............................................................................

30

Figura 11 Postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de monócitos em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). *Significância estatística. Kruskal-Wallis Test...................................

30

Figura 12 Postos médios (Mean Rank) dos títulos sorológicos de IgG em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.....................................

31

Figura 13 Postos médios (Mean Rank) dos títulos sorológicos de IgM em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle) Kruskal-Wallis Test.............................................................................

32

Figura 14 Curso da infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). Postos médios (Mean Rank) dos valores de parasitemia. Kruskal-Wallis Test...........................................................................................

36

Figura 15 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores parasitêmicos após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). Postos médios (Mean Rank) dos valores de parasitemia. *Significância estatística. Kruskal-Wallis Test...................................

37

Figura 16 Postos médios (Mean Rank) dos valores máximos de parasitemia após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). Kruskal-Wallis Test.....

38

Figura 17 Variação dos postos médios (Mean Rank) do número de leucócitos entre os grupos de tratamento após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test....

44

Figura 18 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de linfócitos entre dias após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.........................

44

Figura 19 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de linfócitos entre os grupos de tratamento após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test....

45

Figura 20 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de neutrófilos entre dias após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.........................

45

Figura 21 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de neutrófilos entre os grupos de tratamento após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e cont role não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test............................................................

46

Figura 22 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de monócitos entre dias após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.........................

46

Figura 23 Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de monócitos entre os grupos de tratamento após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bp i, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test............................................................

47

Figura 24 Aspectos microscópicos de músculo cardíaco de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. Fase aguda da infecção, 14 dias p.i.. (a) Grupo Bai. Miocardite moderada, infiltrado inflamatório mononuclear (objetiva 40x. H.E.). (b) Grupo Bpi. Miocardite moderada, infiltrado inflamatório mononuclear (objetiva 40x. H.E.). (c) Grupo Phosphorus. Miocardite intensa, infiltrado inflamatório mononuclear, presença pseudocisto de T. cruzi. (objetiva 40x. HE). (d) Grupo Controle. Miocardite intensa, infiltrado inflamatório mononuclear (objetiva 10x. H.E.). ‘continua’...........................................................................................

51

Figura 25 Aspectos microscópicos de músculo esquelético de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. Fase crônica da infecção, 42 dias p.i. (a) Grupo Bai. Miosite moderada, infiltrado inflamatório mononuclear (objetiva 40x. HE). (b) Grupo Phosphorus. Miosite discreta, infiltrado inflamatório mononuclear (objetiva 40x. HE). (c) Grupo Controle. Miosite intensa, infiltrado inflamatório mononuclear; (c’) destruição da parede vascular (objetiva 40x. HE). .............................................................................

52

Figura 26 Aspectos microscópicos de fígado de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. Fase crônica da infecção, 42 dias p.i. (a) Grupo Bai. Infiltrado inflamatório mononuclear intenso (objetiva 40x. HE). (b) Grupo Bbi. Infiltrado inflamatório mononuclear intenso (objetiva 40x. HE). (c) Grupo Phosphorus. Infiltrado inflamatório mononuclear moderado (objetiva 40x. HE). (d) Grupo Controle. Infiltrado inflamatório mononuclear intenso (objetiva 40x. HE)...............................................................................

53

Figura 27 Aspectos microscópicos de intestino grosso de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. Fase crônica da infecção, 42 dias p.i. (a) Grupo Bai. Infiltrado inflamatório mononuclear moderado (objetiva 40x. HE). (b) Grupo Bbi. Infiltrado inflamatório mononuclear intenso (objetiva 40x. HE). (c, c’) Grupo Phosphorus. Infiltrado inflamatório mononuclear intenso (objetiva 10x e 40x, respectivamente. HE). (d) Grupo Controle. Infiltrado inflamatório mononuc lear intens (objetiva 40x. HE).

54

LISTA DE TABELAS

Páginas Tabela 1 Médias dos períodos pré-patentes de camundongos tratados

com bioterápico antes e após infecção experimental por T. evansi (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle)..............................................

21

Tabela 2 Médias de parâmetros hematológicos, aos 10 dias p.i., em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção experimental por T. evansi (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle)................

23

Tabela 3 Títulos de anticorpos IgG e IgM, aos 10 dias p.i., em soros de camundongos tratados com bioterápico antes da infecção (Bai), após infecção (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após infecção (Controle)...............................

27

Tabela 4 Títulos de anticorpos IgG em soros de camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle) antes e após imunização com extrato de T. evansi. * Significância estatística.............................................................

32

Tabela 5 Títulos de anticorpos IgM em soros de camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle)..........................

33

Tabela 6 Resultado da repertorização matemática das rubricas representativas da imagem clínica da infecção por T. cruzi no homem e em modelo murino experimental. Medicamentos ordenados por cobertura de sintomas e pontuação final...............

34

Tabela 7 Valores médios dos períodos de pré-patência e patência, taxa de mortalidade aos 42 dias pós- infecção de camundongos C57BL/6 experimentalmente infectados por T. cruzi, tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle)...

35

Tabela 8 Percentual (%) de reagentes IgG e IgM (IFI) em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle).................................

40

Tabela 9 Percentuais de títulos sorológicos (%) de anticorpos IgM em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle)...

41

Tabela 10 Percentuais (%) de títulos sorológicos de anticorpos IgG em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle)...

41

Tabela 11 Percentual de lesões inflamatórias no músculo cardíaco em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, placebo e, controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção.....................................................

55

Tabela 12 Percentual de lesões inflamatórias em músculo esquelético em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, placebo e, controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção.....................................................

55

Tabela 13 Percentual de lesões inflamatórias em intestino grosso em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, placebo e, controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção.....................................................

56

Tabela 14 Percentual de lesões inflamatórias em intestino delgado em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, placebo e, controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção.....................................................

56

Tabela 15 Percentual de lesões inflamatórias em fígado em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, placebo e, controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção............................................................................

57

LISTA DE QUADROS

Páginas Quadro 1 Rubricas Repertoriais dos sintomas da infecção por T. cruzi

citados na literatura. Imagem clínica da infecção por T. cruzi no homem e no modelo murino....................................

35

SUMÁRIO

Página

1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 3

2.1 Divisão do gênero Trypanosoma ....................................................................... 3

2. Características da infecção por Trypanosoma evansi ...................................... 3

2.3 Características da infecção por Trypanosoma cruzi ...................................... 4

2.3.1 Doença de Chagas ............................................................................................. 5

2.3.2 Resposta imune à infecção pelo Trypansoma cruzi .......................................... 5

2.3.3 Patogênese na infecção por Trypanosoma cruzi ............................................... 7

2.3.4 Tratamento ............................................................................................. 7

2.3.5 Abordagem imunológica .................................................................................. 8

2.3.6 Critérios de cura ................................................................................................ 8

2.4 Homeopatia ........................................................................................................ 9

2.4.1 Medicamentos homeopáticos ............................................................................ 9

2.4.2 Mecanismo de ação das ultradiluições ............................................................ 9

2.4.3 Efeitos biológicos das ultradiluições ................................................................ 10

2.4.4 Bioterápicos ...................................................................................................... 11

2.4.5 Diátese .............................................................................................................. 13

2.4.6 Repertorização .................................................................................................. 13

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 14

3.1 Experimento 1: Infecção Experimental de Camundongos por T. evansi ............. 15

3.2 Experimento 2: Imunização de Camundongos com Extrato de T. evansi ........... 17

3.3 Experimento 3: Infecção Experimental de Camundongos por T. cruzi ............... 18

3.4 Análise Estatística ................................................................................................ 20

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 21

4.1 Infecção Experimental de Camundongos por T. evansi ...................................... 21

4.1.1 Parasitemia e curso da infecção ........................................................................ 21

4.1.2 Parâmetros Hematológicos .............................................................................. 23

4.1.3 Resposta Imune Humoral .................................................................................. 25

4.2 Imunização de Camundongos com extrato de T. evansi ...................................... 27

4.2.1 Resposta leucocitária ........................................................................................ 27

4.2.2 Resposta imune humoral .............................................................. 31

4.3. Infecção Experimental de Camundongos por T. cruzi .................................. 34

4.3.1 Estudo das imagens clínica e repertorial homeopáticas .................................... 34

4.3.2 Parasitemia e curso da infecção ........................................................................ 35

4.3.3 Resposta imune humoral ................................................................................... 39

4.3.4 Resposta leucocitária ........................................................................................ 42

4.3.5 Avaliações histopatológicas .............................................................................. 48

5. CONCLUSÕES .................................................................................................... 58

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 59

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1 INTRODUÇÃO

Muitas espécies do gênero Trypanosoma são responsáveis por doenças parasitárias de grande importância médica e veterinária na África, Ásia, América Central e América do Sul.

O Trypanosoma evansi (STEEL, 1885) é um protozoário flagelado encontrado no sangue e fluidos tissulares de diversas espécies de mamíferos domésticos e silvestres.

No Brasil, a doença determinada pela infecção por T. evansi já foi diagnosticada nos Estados do Pará, São Paulo, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paraná e Rio Grande do Sul e é conhecida vulgarmente por “mal das cadeiras”, afetando especialmente eqüinos (SEQUEIRA e AMARANTE, 2001). Os animais não tratados geralmente morrem em conseqüência do parasitismo (SEQUEIRA e AMARANTE, 2001). Desde 1930, a droga empregada contra a doença tem sido o Berenil® [4,4’-(diazoamine)-aceturato de dibenzamidine], entretanto o desenvolvimento de resistência à referida droga tem sido relatado (CARDOSO et al., 1999).

Além de mamíferos domésticos, várias espécies de animais de laboratório, como coelhos, cobaias, ratos e camundongos, são sensíveis à infecção pelo T. evansi, tendo sido estes empregados como modelo experimental (OLIVEIRA e MENEGUIN, 1989).

O Trypanosoma cruzi CHAGAS 1909, agente etiológico da Doença de Chagas, é um protozoário flagelado encontrado no sangue e tecidos de homens, animais domésticos e silvestres e no tubo digestivo do inseto vetor. Embora avanços tenham sido alcançados no controle da transmissão vetorial intradomiciliar, não existe quimioterapia segura disponível ao tratamento da doença, a qual constitui, ainda, importante problema de saúde pública. Os tradicionais antiparasitários, Nifurtimox e Benzonidazol são eficazes apenas na fase aguda da infecção (CANÇADO, 1985) e têm aplicabilidade severamente restrita em pacientes crônicos, além de serem altamente tóxicos (de CASTRO, 1993).

Os tripanosomas parasitas de mamíferos, evolutivamente, desenvolveram mecanismos para escapar da resposta imunológica do organismo hospedeiro, como a ocupação intracelular, no caso do T. cruzi, ou a variação antigênica exemplificada pelos tripanossomas da seção Salivaria, como o T. evansi (NELSON et al., 1984), o que tem frustrado tentativas de vacinação (URQUHART et al., 1998). Tais aspectos associados ao desenvolvimento da resistência dos parasitos a drogas empregadas no tratamento da infecção tornam difícil o controle das tripanosomíases em áreas endêmicas.

A perspectiva de emprego de medicamentos bioterápicos, anteriormente conhecidos como nosódios, no tratamento e na profilaxia de doenças parasitárias e infecciosas tem sido investigada e questionada por diversos autores. Embora os bioterápicos sejam amplamente empregados pela terapêutica homeopática, ainda são poucas as informações disponíveis, as quais evidenciem através de metodologia adequada, a ação dos mesmos.

Hahnemann (1835), idealizador da Homeopatia, após concluir suas observações sobre as doenças crônicas, apresentou o conceito de que estas teriam como base um princípio hereditário e/ou adquirido, ao qual denominou miasma. Atualmente, o termo miasma é substituído por diátese (grego: “dispor à”), indicando estado mórbido reacional crônico do organismo para desenvolver determinados grupos de moléstias (PUSTIGLIONE e CARILLO Jr., 1994). Andrade et al. (2005), em estudo da origem diatésica da Doença de Chagas, observaram significância estatística entre esta e a diátese sifilínica.

Uma das principais características do medicamento homeopático é a reduzida concentração de substância que este contém, sendo os medicamentos ultradiluídos e dinamizados (“Ultra High Dilution”). A partir de potências equivalentes à 12 CH, não há mais presença de moléculas da substância original (BASTIDE et al., 1995), visto que o número de

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Avogrado foi ultrapassado. Entretanto, de acordo com vários autores, tais ultradiluições continuam a exercer efeitos biológicos em sistemas vivos (WYNN, 1998; JONAS e DILNNER, 2000; WEISSMAN et al., 1992; MACHADO, 2003; BUKHSH, 2003).

O presente trabalho teve como objetivos avaliar os efeitos terapêuticos, profiláticos e imunomodulatórios de bioterápico homeopático em dois modelos de doença parasitária: infecção experimental de camundongos por T. evansi e por T. cruzi, representando infecção de curso agudo e crônico, respectivamente; assim como avaliar os efeitos do medicamento homeopático Phosphorus na infecção por T. cruzi.

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2 REVISAO DE LITERATURA

2.1 Divisão do gênero Trypanosoma Com base no comportamento em seus hospedeiros e, principalmente, no vetor, o

gênero Trypanosoma foi dividido em duas seções: Salivaria e Stercoraria, incluindo, respectivamente, tripanosomas que não apresentam fase de desenvolvimento no vetor, sendo inoculados mecanicamente, como é o caso do Trypanosoma evansi e tripanosomas que se desenvolvem no trato digestivo do vetor e têm suas formas infectivas liberadas juntamente com as fezes, como é o caso do Trypanosoma cruzi (HOARE, 1972).

2.2 Características da infecção por Trypanosoma evansi

Durante seu ciclo evolutivo, o T. evansi apresenta somente a forma tripomastigota, a qual vive livre no plasma sangüíneo, assim como nos espaços extracelulares dos hospedeiros (SEQUEIRA e AMARANTE, 2001).

A transmissão do T. evansi de um animal a outro ocorre mecanicamente através da picada de moscas hematófagas como Tabanus e Stomoxys (SOULSBY, 1982), embora, nas Américas Central e do Sul, o morcego hematófago também possa atuar como vetor e hospedeiro do parasita (URQUHART et al., 1998).

Nos hospedeiros vertebrados, os tripomastigotas se dividem assexuadamente por divisão binária simples. Após a infecção inicial, os parasitas multiplicam-se rapidamente, determinando elevados níveis de parasitemia (SEQUEIRA e AMARANTE, 2001).

A maioria dos animais domésticos é susceptível ao T. evansi (ITARD, 1989). Dependendo da virulência do parasita e da suscetibilidade individual do hospedeiro, a sintomatologia clínica varia, sendo os casos graves da doença normalmente observados em eqüinos, camelos e cães (SOULSBY, 1982). Outros animais domésticos, como bovinos, bubalinos e suínos são também comumente infectados, porém, a doença clínica nestes animais é raramente observada, sendo sua maior importância como reservatório da infecção (URQUHART et al., 1998). Os eqüinos infectados apresentam febre, anemia severa e emaciação características da tripanosomose, além de desenvolverem tumefações edematosas na região ventral do abdome e genitais. Nos casos crônicos é comum a paralisia progressiva dos quartos posteriores (URQUHART et al., 1998). Os animais não tratados geralmente morrem em conseqüência do parasitismo (SEQUEIRA e AMARANTE, 2001).

Certamente, o aspecto mais importante da tripanosomose causada pelos trypanosomas da seção Salivaria, responsável pela parasitemia persistente, seja a maneira pela qual o parasita escapa da resposta imunológica do hospedeiro. Os tripanosomas possuem uma camada glicoprotéica antigênica (VSG), a qual determina a formação de anticorpos, que causam opsonização e lise dos tripanosomas. Entretanto, quando os anticorpos são produzidos, certa proporção dos tripanosomas já apresenta alterada a estrutura química de sua camada glicoprotéica e, apresentando uma superfície antigênica diferente, não são afetados por estes anticorpos. Esse processo de variação antigênica produz ondas de remissão da parasitemia (URQUHART et al., 1998). Nos eqüinos, tal processo de multiplicação dos parasitas e resposta do hospedeiro se repete até a morte do animal (SEQUEIRA e AMARANTE, 2001).

Sabe-se que o animal, o qual se recupera de infecção por T. evansi, adquire certa imunidade à re- infecção. Entretanto, esta resistência é de curta duração quando a cura decorre da administração de quimioterápicos e mais duradoura, quando os animais se recuperam sem tratamento. Em nenhum caso haverá proteção contra cepa heteróloga. Existem numerosas

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cepas antigenicamente distintas de T. evansi em várias partes do mundo (WOO, 1977; UCHE e JONES, 1994).

Na patogenia da infecção por T. evansi, a anemia é um dos aspectos mais importantes, (HOARE, 1972; HERRERA et al., 1998; MENEZES et al., 2004), embora sua patogênese não tenha sido completamente elucidada. De acordo com IGBOKWE e NWOSU (1997), a etiologia da anemia na tripanossomíase é multifatorial, com hemólise, hemodiluição e / ou eritropoiese não compensatória, oscilando durante o curso da infecção.

Entre os fatores associados à tripanotolerânica, caracterizada pela capacidade de controlar a parasitemia e a anemia, conseqüências importantes do parasitismo por tripanosomas salivários (MURRAY et al., 1982; LUCKINS e MEHLIITZ, 1976 ‘citado por’ MENEZES et al., 2004), D’Ieteren et al. (1998) descrevem a capacidade de uma resposta humoral mais rápida à infecção, assim como um sistema fagocítico mononuclear mais eficiente, além da participação de mecanismos inespecíficos.

Embora o mecanismo de tripanotolerância tenha sido discutido no modelo murino para várias espécies de tripanosomas salivários, estas questões ainda são pouco conhecidas em relação ao T. evansi (MENEZES et al. 2004).

Onah et al. (1997) observaram que ovinos portadores de infecção crônica por T. evansi apresentam declínio na proporção de células T, e aumento dos níveis de linfócitos B. Entretanto, a expansão do numero de linfócitos B circulantes com títulos ascendentes de IgM não possib ilita o controle da infecção.

Dados obtidos através da avaliação do reconhecimento de peptídeos antigênicos de T. evansi, assim como dos níveis específicos de anticorpos em “Wistar rats” (Rattus norvegicus) experimentalmente infectados com isolados domésticos e silvestres de T. evansi, oriundos da região do Pantanal, Brasil, sugerem que a resposta imunológica humoral não é suficiente para garantir efetivo controle da infecção (QUEIROZ et al., 2001). Semelhantemente, Menezes et al. (2004) não observaram correlação entre título sorológico de IgG, maior tempo de sobrevida e capacidade de controlar a parasitemia, em camundongos experimentalmente infectados por T. evansi. UMEDA (1988) avaliou as lesões teciduais determinadas pela infecção por T. evansi em camundongos, ratos, coelhos, entre outros roedores, experimentalmente infectados. Os autores observaram multiplicação de formas parasitárias em vários órgãos duas semanas após infecção, quando os níveis de anticorpos se elevaram. Infiltrado inflamatório mononuclear foi observado no fígado, pâncreas, epidídimo, músculo esquelético, cérebro e coração. 2.3 Características da Infecção por Trypanosoma cruzi O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, tem despertado grande interesse em Biologia, devido à importância da doença grave que determina e, visto que os tripanossomatídeos apresentam alguns aspectos biológicos especiais, devido aos quais eles constituem excelente modelo para estudo de questões biológicas básicas (BRENER et al. 2000).

A transmissão do T. cruzi pode ocorrer naturalmente a humanos e a outros mamíferos pela contaminação da pele ou das mucosas por fezes e/ou urina dos vetores, insetos hematófagos da família Reduviidae, conhecidos como triatomíneos ou, popularmente, como ‘barbeiros’. Outras formas de transmissão incluem a transfusão sanguínea, transmissão pelas vias oral e transplacentária, através do transplante de órgãos e acidental em laboratório (GOMES, 1997).

Independentemente da via de infecção do hospedeiro vertebrado, o T. cruzi apresenta um estágio intracelular. Formas infectantes do parasito, tripomastigotas metacíclicos, invadem as células (como macrófagos, por exemplo), diferenciam-se e dividem-se em amastigotas

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intracelulares (formas multiplicativas) para emergirem como tripomastigotas que circulam pelo sangue e reinvadem várias células (GARCIA e AZAMBUJA, 2000). Esse ciclo determina aumento da parasitemia, caracterizando a fase aguda da infecção (PEREIRA, 2003). A queda da parasitemia, decorrente da resposta imune efetora do hospedeiro, dá início à fase crônica. Essa fase é caracterizada por afecções cardíacas (forma cardíaca), digestivas (forma digestiva), cardíacas e digestivas (forma mista) e sem sintomatologia, mas com sorologia positiva (forma indeterminada) (RODRIGUES et al., 1999 ‘citado por’ PEREIRA, 2003). Tais manifestações estão relacionadas a fatores inerentes ao parasito (cepa, virulência, tropismo) e ao hospedeiro (idade, perfil da resposta imune) (DIAS, 2000). 2.3.1 Doença de Chagas

Originalmente a Doença de Chagas era uma enzootia de animais silvestres, tendo ocorrido a adaptação dos triatomíneos vetores ao domicílio nos ciclos da agricultura e pecuária, devido ao desmatamento intenso (COURA, 2003).

A doença é circunscrita ao continente americano, particularmente às regiões tropicais e subtropicais da América Latina, aonde estima-se que sua prevalência seja em torno de 18 milhões de casos e que aproximadamente 100 milhões de pessoas estejam expostos ao risco da infecção (COURA, 2003). Além disso, a migração crescente de populações aumentou o risco de transmissão por transfusão de sangue em diversos outros países fora da América Latina. Entretanto, atualmente, a Doença de Chagas está entre as doenças consideradas negligenciadas pelas autoridades de saúde púb lica.

A Doença de Chagas Aguda pode ser aparente (casos clássicos) ou inaparente (freqüentemente apresentando somente quadro febril passageiro e inespecífico). A cura espontânea da infecção aguda pode ser observada em modelo experimental, sobretudo entre grandes mamíferos como bovinos e eqüinos, não podendo ser excluída em seres humanos, apesar de nunca ter sido reportada (BRENER et al., 2000). Em humanos, a duração da fase aguda varia geralmente entre 4 e 12 semanas, ao fim das quais o quadro febril e a parasitemia (detectada por métodos diretos) tendem a desaparecer. Em paralelo, decrescem também os níveis de imunoglobulinas da classe M e sobem os níveis de IgG, definindo, praticamente, a passagem para a Doença de Chagas Crônica (DIAS et al., 1997; STORINO et al., 1994 ‘citado por’ BRENER et al, 2000).

A fase aguda pode se iniciar com a formação de um edema no local de entrada do parasito (chagoma de inoculação), que tende a desaparecer durante o curso da infecção. Este primeiro momento é seguido por um período pré-patente, de tempo variável, no qual os parasitos se multiplicam de forma exponencial. Após este período, é possível a detecção do parasito na corrente sanguínea e sob a forma de pseudocistos em tecidos, principalmente musculares (DIAS et al., 1956).

A presença do parasito induz acentuada resposta imunológica no indivíduo, e conseqüente diminuição da parasitemia a níveis sub-patentes, dando início à fase crônica da infecção. Tanto a fase aguda com a crônica são caracterizadas por intensa reação inflamatória no tecido cardíaco (DIAS et al., 1956). 2.3.2 Resposta imune à infecção pelo T. cruzi

A infecção pelo T. cruzi mobiliza múltiplos mecanismos humorais e celulares da resposta inata (natural) e adquirida (adaptativa) do hospedeiro. Em conseqüência, o parasita passa a ser continuamente combatido e tem a sua multiplicação reduzida nos tecidos do hospedeiro. No entanto, ele pode persistir indefinidamente, assim como a resposta imune. Lesões teciduais resultantes dessa atividade imunológica prolongada acumulam-se e, eventualmente, levam às alterações funcionais musculares e nervosas características da Doença de Chagas. Atualmente, está bem estabelecido que células e mecanismos efetores do

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sistema imune são responsáveis tanto pelo controle da multiplicação do parasita nos tecidos como pelas lesões locais resultantes da atividade antiparasitária (BRENER et al., 2000).

O T. cruzi apresenta nos hospedeiros vertebrados dois estágios do seu ciclo de vida que são biológica e morfologicamente distintos e que, conseqüentemente, ativarão moléculas e populações celulares distintas do sistema imune. Os tripomastigotas extracelulares são formas flageladas que circulam no sangue e são alvos de anticorpos e da lise mediada por complemento, assim como, da fagocitose e morte por fagócitos ativados. A via alternada do complemento (C’) é ativada pelo T. cruzi, entretanto, enquanto formas não infectivas (epimastigotas) do parasita são destruídas, formas infectivas tripomastigotas são resistentes à ação lítica do C’ (NOGUEIRA et al., 1975).

Inúmeros autores já descreveram a presença de anticorpos anti-T. cruzi em pacientes e em modelos experimentais e propõem sua importância no controle da infecção (SILVA, 1996; KUMAR e TARLETON, 1998). Krettli e Brener (1976) demonstraram a existência de anticorpos protetores contra formas sanguíneas vivas de T. cruzi, denominados anticorpos líticos. Esses anticorpos induzem a lise dos parasitas mediada por complemento e diferem dos anticorpos convencionais detectados nos diagnósticos sorológicos. Os anticorpos líticos participam da resistência a infecções com cepas virulentas e desaparecem após a cura.

Ao penetrar nas células do hospedeiro vertebrado, os tripomastigotas se diferenciam em amastigotas, forma replicativa do parasito, localizando-se no citoplasma da célula hospedeira sob a forma de pseudocistos. Nesta forma intracelular o sistema imune reconhece preferencialmente a célula infectada através de epítopos do parasito apresentados no contexto do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e, portanto, por células T CD8, as quais controlam a replicação do parasito destruindo a célula infectada. (TARLETON, 1991).

A invasão de diversos tipos celulares pelo T. cruzi, em especial de macrófagos, inicia uma série de interações moleculares que mobilizam a resposta imune inata (ALIBERTI et al., 1996). A citocina pró- inflamatória TNF-a, produzida pelos macrófagos durante a infecção, participa de forma sinérgica na interação entre macrófagos e células NK, as quais, ativadas por IL-12 produzida pelos macrófagos, produzem IFN-? que, por sua vez agirá sobre macrófagos, ativando-os para a atividade microbicida (TARLETON, 1988). O papel do TNF-a na resposta inata do hospedeiro é complexo, levando a efeitos tanto deletérios como protetores. Macrófagos de animais susceptíveis (maior letalidade) secretam níveis altos de TNF-a, comparados a macrófagos de animais resistentes. Além disso, a injeção de TNF-a exarceba a mortalidade de animais infectados . Entretanto, a atividade de proteção do TNF-a é evidente em animais geneticamente deficiente para o mesmo, os quais apresentam altas parasitemias e mortalidade, quando infectados pelo T. cruzi. No tecido cardíaco desses animais, o parasita se replica em grande número, mas na ausência do infiltrado inflamatório mononuclear observado em animais normais (SANTOS LIMA; MINOPRIO, 1996). Em associação ao TNF-a, o IFN-? produzido pelas células NK estimula, em macrófagos, a produção de NO (GAZZINELLI et al., 1992), com atividade tóxica sobre o T. cruzi. As citocinas regulatórias IL-10 e TGF-ß inibem a produção de NO e a atividade tripanocida de macrófagos infectados e ativados por IFN-? (GAZZINELLI et al., 1992), sendo responsáveis pela ‘desativação’, controlando os efeitos inflamatórios letais de citocinas tipo 1 produzidas durante a infecção (REVELLI et al., 1999). Diferentes estudos demonstraram a correlação entre maior susceptibilidade de linhagens murinas à infecção e uma maior produção da citocina antiinflamatória IL-10. Camundongos geneticamente deficientes em IL-10 são capazes de controlar melhor a infecção pelo T. cruzi (ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996), entretanto, a necessidade de produção de IL-10 pode estar relacionada com a proteção do hospedeiro contra sua própria resposta imune (HUNTER et al., 1997).

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Citocinas de perfil Th1, como IFN-?, têm sido freqüentemente associadas à resistência a doenças parasitárias, como a doença de Chagas, leishmaniose, entre outras (BRANDONISIO et al., 2001; LAUCELLA et al., 2004). Porém, na fase crônica da infecção chagásica, este perfil de citocinas tem sido associado à cronificação da inflamação (FRESNO et al., 1997; BAHIA-OLIVEIRA et al., 1998; DOS SANTOS et al., 2001, GOMES et al., 2003 citados por” MARINO, 2005).

2.3.3 Patogênese na infecção por Trypanosoma cruzi

Os processo patogênicos das lesões na fase aguda da infecção, são complexos e nele estão envolvidos o parasita, sua multiplicação e morte intracelular, além mecanismos imunológicos humoral e celular (BRENER et al., 2000).

Os estudos iniciais referentes à ação do parasito revelaram que o seu desenvolvimento normal não lesa a célula parasitada, o que só ocorre quando os parasitos se rompem (MAYER e ROCHA LIMA, 1954). GRIMAUD e ANDRADE (1984) demonstraram que a integridade das miocélulas cardíacas está preservada mesmo na presença de pseudocistos contendo formas amastigotas de T. cruzi.

Muitos esforços têm sido empregados na tentativa de compreender os mecanismos envolvidos na gênese e perpetuação da miocardite chagásica crônica. Durante vários anos, questionamentos sobre a participação do parasita e seus antígenos nestes processos foram colocados num segundo plano em função da hipótese de que mecanismos auto- imunes seriam os principais responsáveis pela miocardite chagásica crônica (PIRMEZ e RIBEIRO dos SANTOS, 1994; KALIL e CUNHA NETO, 1996). Contudo, vários trabalhos têm mostrado que a presença de células T CD8+ está correlacionada à persistência do parasita e seus antígenos, sugerindo a influência direta do mesmo no desenvolvimento da miocardite em pacientes chagásicos crônicos (HIGUCHI et al., 1993).

Estas observações sugerem que o sucesso do controle da infecção pelo T. cruzi envolva a geração da resposta imune adequada para controlar o parasitismo e a regulação desta resposta, para prevenir a extensa destruição de tecidos do hospedeiro. Alguns trabalhos propõem que, na fase crônica da doença de Chagas, as células TCD4+ respondam de forma deletéria contra antígenos próprios, desencadeando reações inflamatórias de cunho auto-imune, sendo estas responsáveis pela manutenção da miocardite (RIBEIRO dos SANTOS et al., 1992). No entanto, em pacientes cardiopatas crônicos, a miocardite é determinada principalmente pelas células T CD8+ (HIGUCHI et al., 1993).

2.3.4 Tratamento

A quimioterapia para tratamento da Doença de Chagas ainda constitui um desafio, assim como a busca por alternativas de tratamento. Atualmente, existem apenas duas drogas disponíveis para uso clínico, Nifurtimox e Benzonidazol, entretanto, ambas com aplicabilidade restrita em pacientes crônicos, além de serem altamente tóxicas (de CASTRO, 1993). O tratamento específico com Nifurtimox ou Benzonidazol consegue curar a Doença de Chagas Humana aguda entre 30 e 80% dos casos relatados, incluindo os congênitos, sendo tanto mais efetivo quanto mais precocemente for instalado (BRENER et al., 2000).

O Ministério da Saúde, através do documento intitulado ‘Tratamento Etiológico da Doença de Chagas’, preconiza o tratamento com drogas anti-T. cruzi de todos os pacientes na fase aguda da infecção, sendo o Benzonidazol a droga de escolha, independente de qual tenha sido o mecanismo de transmissão (MARINO, 2005). De acordo com Andrade et al. (1996), a administração do Benzonidazol em crianças soropositivas para infecção chagásica é justificável, devendo ser recomendada como medida de saúde pública.

Alguns autores evidenciam que o tratamento com os nitroderivados é insatisfatórios na infecção pelo T. cruzi e não deve ser recomendado, devido à ineficiência na erradicação do

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parasita (CANÇADO, 1999). Novas propostas terapêuticas têm sido abordadas na literatura, como a identificação de potenciais candidatos vacinais (BHATIA et al., 2004), imunoterapia através de vacina de DNA (COSTA et al., 1998; ZAPATA-ESTRELLA et al., 2006) ou, ainda, o promissor transplante de células da medula óssea para reparo do tecido cardíaco e redução da miocardite (SOARES et al., 2004). Na busca de novos agentes quimioterápicos para o tratamento da doença de Chagas, destacam-se alguns antifúngicos de última geração, que atuam na inibição de enzimas envolvidas na biossíntese do ergosterol (FERRAZ, 2005). Novos quimioterápicos, obtidos de produtos naturais, medicamentos ou fármacos ativos em outras doenças e compostos químicos de síntese têm exibido resultados promissores, porém, os estudos ainda são preliminares e não existe previsão de chegada destes compostos ao mercado farmacêutico. Assim, ainda não há disponibilidade de uma terapia eficaz, o que impulsiona a busca de novas terapias, associadas ou não ao benzonidazol, que atuem de forma pontual e apresentem menores efeitos colaterais, aumentando a qualidade de vida do portador desta parasitose (MARINO, 2005). 2.3.5 Abordagem imunológica

Na infecção por Trypanosoma cruzi, a participação do sistema imune é importante, uma vez que uma resposta eficaz impede a evasão do parasito e, conseqüentemente, evita reações inflamatórias e teciduais causadas pelo mesmo. Assim, estratégias que envolvam intervenções imunes poderão ser uma ferramenta adicional para aumentar a eficácia do tratamento (PEREIRA, 2003).

Recentemente, vários grupos vêm desenvolvendo estudos de imunoproteção, no modelo murino, utilizando antígenos definidos. Estão sendo utilizados antígenos protéicos purificados de T. cruzi, assim como proteínas e peptídeos clonados e fusionados, expressos em bactérias por tecnologia de DNA recombinante (BRENER et al. 2002).

Zapata-Estrella et al. (2006) avaliaram os efeitos da administração de vacina DNA sobre o controle da infecção por T. cruzi e sobre a população de células T em camundongos. De acordo com os autores, a vacinação durante as fases aguda e crônica induziu aumento no número de linfócitos CD4+ e CD8+ em ambas as fases da infecção, além da redução das lesões e do parasitismo no tecido cardíaco.

Garcia et al. (2006) avaliaram as manifestações imunológicas e patológicas associadas à administração da proteína Tc13 do T. cruzi, assim como a capacidade do referido antígeno conferir proteção contra a infecção. Decorridos cinco meses da imunização, foram detectados sinais de hepatotoxidade e alterações reativas no coração, fígado e baço em 40-80% dos animais. Quando os animais imunizados foram infectados, observou-se decréscimo significante da parasitemia na fase aguda, assim como menor severidade das lesões cardíacas, entretanto sem alterações na sobrevida.

Licon-Trillo e Perez-Reyes (1994) avaliaram a cinética da resposta imune humoral em camundongos imunizados com membranas obtidas através do cultivo de formas epimastigotas de T. cruzi. De acordo com os autores, os animais previamente imunizados responderam primeiramente à infecção, além de reconhecerem maior número de petptídeos antigênicos (22 a 115 KDa). 2.3.6 Critérios de cura

Na fase crônica da infecção por T. cruzi, em geral, não há parasitemia patente; assim, diversos métodos de diagnóstico devem ser usados a fim de se estabelecer um critério de cura. Entre estes, Hemocultivo, Xenodiagnóstico, Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) e Subinoculação (BRENER et al. 2000). A lise mediada por complemento (LMC) muitas vezes se torna gradualmente negativa após a quimioterapia específica, enquanto que a sorologia

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convencional permanece positiva, constituindo assim, um importante parâmetro para medir a cura parasitológica pós-tratamento (KRETTLI et al. 1982). 2.4 Homeopatia A homeopatia, do grego homoios: semelhante e pathos: doença,é uma modalidade terapêutica praticada há mais de duzentos anos, tendo como idealizador o médico alemão Samuel Hahnemann (1755-1843). A idéia central da homeopatia está baseada na ‘Lei de Similitude’: substâncias submetidas a diluições seriadas, e a sucussões ritmadas (processo chamado ‘dinamização’) consevariam um poder curativo contra doenças que apresentassem sintomas semelhantes aos que seriam produzidos pela mesma substância em indivíduos sãos (HAHNEMANN, 1835). Ao investigar as propriedades medicamentosas de diversas substâncias, Hahenmann tomou, como base fundamental para seus estudos, os efeitos da droga no homem são, fenômeno denominado patogenesia, sendo seu objetivo, produzir sintomas bem caracterizados para, posteriormente, poder empregar esta mesma substância ultradiluída e dinamizada nos enfermos com sintomas semelhantes (MARTINEZ, 1997).

A medicina homeopática, no Brasil, é oficialmente reconhecida como uma especialidade, pela Associação Médica Brasileira, desde 1979 e pelo Conselho Federal de Medicina, desde 1980, estando presente até mesmo no sistema público de saúde (BONAMIN, 2001). 2.4.1 Medicamentos homeopáticos

Os medicamentos homeopáticos são submetidos a diluições e triturações seguidas de sucussões sucessivas, ‘dinamizações homeopáticas’, descritas como processos pelos quais são despertadas as propriedades medicinais, latentes nas substâncias naturais enquanto em estado bruto (HAHNEMANN, 1835), recebendo, também, o nome de ‘ultradiluição’, ‘diluição ultramolecular’ ou UHD (ultra high dilution), sobretudo na literatura científica tradicional, uma vez que alguns medicamentos são preparados de forma a apresentarem quantidades não ponderais do soluto, ou seja, ultrapassam a concentração equivalente a 6x10-24M (número de Avogrado) (BONAMIN, 2001).

O fármaco é dinamizado em água destilada com a finalidade de desenvolver o potencial medicamentoso, podendo ser conservado em insumo inerte adequado – veículo que pode ser álcool, sacarose ou lactose. As potências são representadas por escalas (proporções de insumo ativo: insumo inerte): Centesimal Hahnemanniana (1: 100 e símbolo CH), Decimal Hering (1: 10 e símbolo DH) e Cinquenta Milesimal (1: 50.000 e símbolo LM ou Q) (FARMACOPÉIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA, 1997).

2.4.2 Mecanismo de ação das ultradiluições O mecanismo de ação dos medicamentos homeopáticos não pode ser explicado em nosso presente estado de conhecimento, visto que, a partir de potências equivalentes a 12 CH não há mais presença de moléculas da substância original no medicamento (JONAS e DILNNER, 2000). Assim, propostas teóricas, não mecanicistas, da Ciência contemporânea, se aplicam à compreensão do fenômeno homeopático (BONAMIN, 2001). Teoria da Memória da Água

O modelo da memória da água, proposto por Citro et al. (1995), afirma que a transferência da atividade farmacológica molecular de uma substância, entre sistemas biológicos, poderia ocorrer através de processos envolvendo campos magnéticos. Neste caso, o mesmo efeito da substânc ia será observado no sistema receptor, após a transferência.

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Durante as diluições seriadas, ocorreria uma mudança estável nas conexões intermoleculares da água, impressa pelo soluto, sendo que tal propriedade poderia ser propagada para a água presente no organismo (BONAMIN, 2001). Teoria do Caos e dos Sistemas Complexos

Os sistemas complexos são definidos como sistemas abertos, em condição de não-equilíbrio e auto-organizados (autopoiéticos). Assim, os fenômenos ocorrem nos sistemas complexos na forma de rede e não de forma linear (SAVI, 2006). Os seres vivos são descritos como ‘sistemas abertos’, os quais operam longe do equilíbrio e garantem sua sobrevivência através de mecanismos auto-reguladores não lineares. Nos sistemas complexos, pequenas variações podem representar grandes mudanças na organização do sistema como um todo (CAPRA, 1996 ‘citado por’ BONAMIN, 2001). A eficácia terapêutica dos medicamentos homeopáticos seria, então, compatível com a descrição de comportamento dos chamados ‘sistemas complexos’: uma pequena variação, representada pela ultradiluição de uma substância, poderia determinar grandes modificações fisiológicas e estas, por sua vez, dependeriam das condições prévias do organismo (BONAMIN, 2001).

BELLAVITE e SIGNORINI (1998) propõem também que os sistemas vivos estariam ‘suspensos’ entre a ordem e o caos, ou seja, albergariam simultaneamente estas duas características, o que constitui outra peculiaridade dos sistemas complexos. Ordem e caos seriam encontrados em todos os níveis de homeostase, das moléculas à mente humana. Segundo os autores, a doença seria antes de suas manifestações estruturais, um distúrbio de oscilações internas e de suas comunicações.

O Paradigma dos significantes corporais

A Teoria dos Significantes Corporais tem como base o conceito de informação dos sistemas biológicos e de seu papel na homeostase. Segundo este modelo teórico, alguns fenômenos biológicos poderiam ser mediados através dos hipotéticos objetos semânticos (informação) ao invés dos conhecidos objetos moleculares (droga e receptor) O sistema mínimo de informação constitui-se de três elementos: a matriz da informação (substância), o instrumento de mediação (água) e o recebedor da informação (doente). Esses três elementos são indissociáveis e a informação só existe através de suas relações recíprocas. (BONAMIN, 2001). O “Paradigma dos Significantes Corporais” nos faz conceber outra forma de comunicação entre os seres vivos: todo organismo vivo é capaz de fazer trocas de informação com o meio de maneira não necessariamente simbólica, cognitiva ou molecular, o que se associa ao uso da homeopatia (BASTIDE e LAGACHE, 1997).

2.4.3 Efeitos biológicos das ultradiluições

Recentemente, vários trabalhos experimentais demonstraram a existência de efeitos biológicos dos medicamentos homeopáticos, entretanto, tais resultados não minimizam o principal entrave a sua aceitação científica, que é a incompatibilidade com as bases filosóficas da ciência tradicional, representadas pelo paradigma cartesiano-mecanicista (BONAMIN, 2001).

Bonamin et al. (2001) avaliaram em camundongos, a interação de dexametasona 7CH (10-17) e dexametasona 15CH (10-33), preparadas de acordo com a farmacotécnica homeopática, com dexametasona em concentrações farmacológicas. Os autores observaram que as referidas ultradiluições bloqueiam o efeito citotóxico determinado pelas concentrações farmacológicas da droga.

Belon (1999) avaliou a ação da Aspirina 5CH sobre a coagulação sanguínea, observando, em humanos, diminuição do tempo de sangramento. Após vários experimentos, o

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autor concluiu que a Aspirina ultradiluída (9CH, 15CH e 30CH) determina aumento da agregação plaquetária, contrariamente ao efeito da droga em doses ponderais, a qual diminui a agregação, e que o efeito de doses ponderais da droga (100mg / Kg) pode ser totalmente inibido pela Aspirina 15 CH.

Guedes (2003) observou que preparações homeopáticas ultradiluídas de glândula tireoidiana de Rana catesbeiana altera a velocidade de metamorfose de girinos da mesma espécie. O numero de imagos foi significativamente menor no grupo tratado com altas diluições da glândula tireoidiana quando comparado ao grupo controle. De acordo com o autor, os hormônios tireoidianos transmitem ‘informações’ específicas para as moléculas utilizadas na preparação da solução, mesmo em molaridade acima do numero de Avogrado.

Entre os trabalhos destinados à avaliação da atividade imunomoduladora de antígenos ultradiluídos, Weissman et al. (1992) observaram que o KLH (macro-molécula extraída da hemolinfa de molusco) ultradiluído, administrado a camundongos, via oral ou parenteral, modulou a resposta imune especifica humoral (IgG) e celular ao referido antígeno.

Um novo conceito de imunomodulação é proposto, tal conceito baseado em nova abordagem da capacidade de resposta do organismo, não em novas moléculas envolvidas na reposta. Visto que o sistema imune é submetido a complexas interações celulares e moleculares, é possível que o aspecto qualitativo ao invés do quantitativo possa ser importante e que a simples ‘informação’ de um imunomediador possa ser ‘entendida’ pelo organismo (BASTIDE e BOUDARD, 1995).

2.4.4 Bioterápicos

A Farmacopéia Francesa de 1948 define como nosódios os medicamentos obtidos a partir de culturas microbianas, de vírus, ou de secreções patológicas. Em 1954, a comissão permanente da Farmacopéia Francesa criou o termo bioterápico, o qual inclui os nosódios, os sarcódios e os auto-nosódios (PINTO, 2001).

De acordo com a 2ª edição do Manual de Normas Técnicas para Farmácia Homeopática de 1995, os bioterápicos são produtos oriundos de excreções, secreções, tecidos e órgãos, patológicos ou não, ou ainda, de produtos de origem microbiana ou alérgenos. Todos estes serão matérias-prima para as preparações de uso homeopático (PINTO, 2001).

Os bioterápicos são considerados medicamentos homeopáticos por serem preparados de acordo com a farmacotécnica homeopática, sofrendo diluição e dinamização. Entretanto, o método é chamado de Isopatia ou Isoterapia, visto que segue não a Lei dos Semelhantes, mas a Lei dos Iguais. Na Isopatia, é empregado o próprio agente etiológico, visando uma reação terapêutica. Nos modelos de isopatia (princípio de identidade), deve haver uma identidade estrita entre a substância diluída e a substância tóxica desafiante. Sob tal aspecto, a Isoterapia se diferencia da Homeopatia, a qual emprega o principio da Similitude. Porém, estas não se distanciam muito, visto que as duas terapêuticas têm por objetivo provocar reação curativa, empregando substancias em doses infinitesimais, uma vez que alguns medicamentos são preparados de forma a apresentarem quantidades ‘não ponderais’ do soluto.

De acordo com Bastide (1994), a isopatia é designada erroneamente como ‘vacinação homeopática’, através do emprego de antígenos virais, bacterianos ou parasitário s diluídos e dinamizados, visto que não determina, após o emprego de antígenos ultradiluídos, síntese de moléculas, particularmente de imunoglobulinas. Segundo a referida autora, a administração de antígenos ultradiluídos é capaz de determinar modulação da resposta imune apenas quando o organismo for exposto ao referido antígeno.

Os primeiros relatos do emprego de bioterápicos datam de 1676. Nesta época, Robert Fludd utilizou o escarro tuberculoso no tratamento da tuberculose. Séculos mais tarde, em 1820, o primeiro veterinário homeopata na França, Wilheim Lux, descreve o êxito obtido a partir do uso de secreção nasal de eqüino portador de Mormo, no tratamento da doença,

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empregando a diluição de 30 CH e, a partir daí, passa a experimentar diversas outras secreções contagiosas (LABRE, 2001).

Nasi et al. (1982) propuseram o tratamento de camundongos infectados por Trypanosoma cruzi com o nosódio preparado com o referido agente etiológico da Doença de Chagas. Foi observado que os animais tratados apresentaram redução da parasitemia, assim como maior tempo de sobrevivência, em relação ao grupo controle. Após o tratamento dos animais infectados, o xenodiagnóstico e a hemocultura revelaram resultado negativo.

Ribeiro et al. (1987) investigaram experimentalmente a susceptibilidade de duas cepas de T. cruzi (Y e Bolívia) à ação de quimioterápicos (Nifurtimax e Benzonidazol) e à ação do bioterápico Trypanosominum (TC D30), preparado de acordo com a farmacotécnica homeopática, a partir de cultura do T. cruzi. Para tal, grupos de camundongos foram experimentalmente infectados e, após o tratamento, foram avaliados a parasitemia e o comportamento dos animais. De acordo com os resultados, os autores observaram que a cepa Bolívia apresentou elevada resistência aos agentes quimioterápicos, enquanto a cepa Y mostrou-se mais susceptível aos mesmos. Porém, as duas cepas estudadas mostraram-se identicamente susceptíveis ao Trypanosominum D30. De acordo com os autores, os quimioterápicos atuam sobre as formas parasitarias, destruindo-as ou não, enquanto que o bioterápico agiria sobre a resposta imunológica do hospedeiro à infecção, a qual por mecanismo de resposta especifica destruiu o agente etiológico, independentemente das características das cepas.

Buffa e Aubagna (1995) propuseram o emprego de nosódio no tratamento da ceratoconjuntivite infeciosa bovina. Para a produção do nosódio foi obtida secreção ocular de animais que apresentavam sintomatologia clínica da doença. De acordo com os autores, foi observado que a metade dos animais tratados com o bioterápico apresentou melhora do quadro clínico com recuperação total das estruturas oculares afetadas, sem recidivas. Tais resultados foram superiores quando comparados ao grupo tratado pela terapia convencional (gentaminica intrapalpebral, dexametasona, cloranfenicol e prednisolona).

Produtos homeopáticos foram ineficientes no controle de infecção por determinados nematódeos no gado. Um nosódio contra Dyctiocaulus viviparus não ofereceu proteção para infecção pulmonar determinada por este parasita, quando comparado ao grupo controle (TAYLOR et al., 1989). Da mesma forma, o Antimônio homeopático foi ineficaz na eliminação de microfilárias de Setaria labiatopapillosa (KUMAR et al., 1989).

Machado (2003) observou eficácia anti-helmíntica de 36,65% com o emprego de bioterápico preparado a partir de larvas infectantes do nematódeo Trichostrongylus colubrifomis, em coelhos experimentalmente infectados, em relação ao número de nematódeos adultos recuperados à necrópsia.

Jonas (1999) avaliou a eficácia de nosódio preparado a partir de tecido infectado por Fransicella tularensis em camundongos C3H/HeN tratados antes e após infecção experimental, observando proteção parcial (22%) quando comparado ao grupo controle. De acordo com o autor, se os nosódios homeopáticos podem induzir proteção contra agentes infecciosos contra os quais não há vacinação disponível, estes representam meio de redução de mortalidade e morbidade determinadas por tais agentes.

Neill (1993) ressalta a necessidade de investigações científicas sobre a eficácia dos bioterápicos preparados a partir de agentes infecciosos e parasitários ultradiluídos, visto que existem profissionais que empregam tais preparados em substituição às vacinas, mesmo em ausência de bases científicas que justifiquem tal procedimento.

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2.4.5 Diátese

Diátese, palavra originada do grego diathesis (‘dispor à’), indica predisposição hereditária ou adquirida do organismo para desenvolver determinados grupos de moléstias, frente a certos estímulos extrínsecos ou intrínsecos. Foram propostos quatro tipos de diáteses: Psora, Sicose, Sifilinismo e Tuberculinismo, cada uma correspondendo a síndromes representantes de determinado funcionamento orgânico. O conceito de diátese esclarece porque uma mesma entidade nosológica pode apresentar evoluções tão diversas, uma vez que variações no quadro clínico refletem a capacidade reacional herdada e adquirida por cada indivíduo, frente a um mesmo agressor. O conhecimento das diáteses é fundamental para melhor compreensão e abordagem terapêutica das enfermidades (CARILLO Jr., 2000).

De acordo com Andrade et al. (2005) as características clínicas e histopatológicas da Doença de Chagas poderiam ser explicados e melhor entendidos pela teoria da diátese sifilínica proposta por Carillo Jr. (2000).

Diátese Sifilínica

Diátese decorrente de deficiência hepática, tanto na estocagem de glicogênio e ferritina, como nas funções de desintoxicação de certas substâncias derivadas da metabolização do álcool e outros elementos, resultando em processos irritativos (inflamatórios) vasculares (arterites, tromboses e infartos, por comprometimento do vasa vasorum e proliferação da camada íntima) que evoluem para ulceração (fenômenos necróticos) e/ou esclerose, em nível de tecido elástico, gânglios, glândulas, vísceras, ossos, mucosas e pele. Tais deficiências comprometeriam o Sistema Mononuclear Fagocitário (SMF), presente em todos os tecidos e responsável pelo metabolismo intermediário, ou seja, pelos processos de assimilação e desassimilação de diversas partículas. Desse modo, o SMF além de realizar o metabolismo intermediário, entregando o produto metabolizado (nutrientes) ao parênquima do órgão, defende o organismo contra infecções, produzindo o processo de resposta inflamatória (CARILLO Jr., 2000).

Quanto ao aspecto de hipersensibilidade, é provável que o Sifilinismo apresente reação do tipo II de Gell e Coombs, onde o dano aos tecidos é resultante de sua interação com anticorpos do tipo IgG ou IgM, com fixação e ativação do complemento (CARILLO Jr., 2000). 2.4.6 Repertorização

A consulta ao Repertório Homeopático - índice de medicamentos referentes a cada sintoma apresentado na experimentação patogenésica - auxilia a escolha do medicamento a ser utilizado. Os sintomas do indivíduo enfermo são colhidos e transformados em rubricas. Após repertorização das rubricas, são listados os respectivos medicamentos com diferentes pontuações, as quais se referem à freqüência com que este medicamento causou o respectivo sintoma, quando administrado a indivíduo são. Dispondo-se dos medicamentos que apresentaram maior pontuação, consulta-se a Matéria Médica Homeopática para seleção do medicamento cuja patogenesia é mais semelhante ao quadro clínico observado (ZOBY, 1996).

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3 MATERIAL E MÉTODOS Local O trabalho experimental foi conduzido no Laboratório de Biologia de Trypanossomatídeos, Departamento de Protozoologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, RJ. Animais

Foram utilizados camundongos (Mus musculus) isogênicos, da linhagem C57BL/6, machos, com aproximadamente 60 dias de idade, provenientes do Centro de Criações de Animais de Laboratório (CECAL, Fiocruz). Os animais receberam água e alimento à vontade e foram mantidos em gaiolas de polietileno, máximo de 8 animais por caixa (Figua 1b), alojadas em estantes ventiladas (Figura 1a), com controle de temperatura (22±3ºC) e luminosidade (12h de luz / dia), no biotério de experimentação do Pavilhão Carlos Chagas, IOC, Fiocruz, RJ. O emprego de animais nos procedimentos experimentais foi previamente autorizado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA – Fiocruz). Licença n0 P 0209-04.

Figura 1. Biotério convencional de experimentação, Pavilhão Carlos Chagas, IOC, Fiocruz, RJ. Estante com ventilação e temperatura controladas, destinada à alocação de camundongos. Camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6 alocados em gaiolas de polietileno convencionais. Delineamento Experimental

Foi empregado Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC). Atividades Experimentais

As atividades experimentais foram divididas em três experimentos, através do emprego de diferentes modelos, os quais foram realizados em tempos distintos, como descrito a seguir:

a b

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Experimento 1: destinado à avaliação dos efeitos profiláticos e terapêuticos de BIOTERÁPICO T. evansi em camundongos experimentalmente infectados por T. evansi. Experimento 2: destinado à avaliação de efeito imunomodulador do tratamento com BIOTERAPICO T. evansi em camundongos imunizados com extrato total de T. evansi. Experimento 3: destinado à avaliação dos efeitos profiláticos e terapêuticos de BIOTERÁPICO T. cruzi em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi, assim como à avaliação dos efeitos do medicamento Phosphorus na infecção. 3.1 Experimento 1 Infecção de camundongos por Trypanosoma evansi Inóculo de Trypanosoma evansi

Foi empregado isolado de T. evansi estocado em nitrogênio a -196°C em laboratório, obtido a partir de quati (Nasua nasua) naturalmente infectado. Por ocasião do preparo do inóculo, o material foi descongelado à temperatura ambiente e inoculado via intraperitoneal em camundongos C57BL/6 (n=4). Em seguida, a parasitemia dos camundongos infectados foi monitorada diariamente, através de exame direto de uma gota de sangue, obtida na extremidade da cauda dos animais, entre lâmina e lamínula, ao microscópio óptico, até a detecção do pico parasitêmico. Preparo do inóculo / infecção experimental

Após detecção do pico parasitêmico nos camundongos experimentalmente infectados, os animais foram insensibilizados em câmara de CO2 e foi colhido o sangue total através de punção cardíaca. Em seguida, foi realizada contagem de parasitos em câmara de Neubauer e ajustado o inóculo a ser empregado. Assim, cada animal pertencente aos grupos de tratamento recebeu cinco formas tripomastigo tas de T. evansi, por grama de peso corpóreo, via subcutânea, em Solução Fosfatada Glicosada (PSG). Visto que os animais apresentaram peso médio igual a 32 gramas, o inóculo foi constituído de 160 tripomastigotas por animal. Obtenção de sangue destinado ao preparo do medicamento bioterápico (BIOTERÁPICO T. evansi):

Para tal, camundongos (n=6) receberam, por via intraperitoneal, 10 formas tripomastigostas de T. evansi / por grama de peso corpóreo. Em seguida, a parasitemia dos camundongos infectados foi monitorada diariamente. À detecção do pico parasitêmico nos camundongos experimentalmente infectados, os animais foram eutanasiados, sendo colhido o sangue total após insensibilização. O sangue obtido foi acondicionado em tubo estéril contendo soro fisiológico, destinando-se ao preparo do bioterápico na potência 12 DH, em solução com alcoolatura igual a 30%, em farmácia homeopática especializada1, de acordo com a técnica proposta por COSTA (1988). Para o tratamento do grupo controle, a farmácia homeopática forneceu soro fisiológico na potência 12 DH, em solução com alcoolatura igual a 30%. Grupos de tratamento Bai: 10 camundongos foram tratados com BIOTERÁPICO T. evansi 12 DH, por via oral (Figura 2), durante 10 dias. Após 07 dias de intervalo, foram submetidos ao tratamento por mais 10 dias, de acordo com o esquema proposto por NASI et al. (1982), antes da infecção experimental, constituindo grupo Bai (Bioterápico antes da infecção).

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Bpi: 10 camundongos, experimentalmente infectados por T.evansi, receberam BIOTERÁPICO T. evansi 12DH, 03 gotas via oral, durante 10 dias, de acordo com o esquema proposto por NASI et al. (1982), constituindo grupo Bpi (Bioterápico pós- infecção).

1 Farmácia Homeopática Átomo, Rio de Janeiro, RJ.

Controle : 10 camundongos receberam soro fisiológico 12 DH, durante 10 dias, após 07 dias de intervalo foram submetidos ao tratamento por mais 10 dias, de acordo com o esquema proposto por NASI et al. (1982). Em seguida, foram experimentalmente infectados e submetidos ao tratamento com soro fisiológico 12 DH, por via oral, durante mais 10 dias, constituindo grupo Controle.

Figura 2. Administração oral de medicamentos na forma líquida a camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi.

Parâmetros avaliados • Avaliação da parasitemia (parasitas / mL de sangue) e do curso da infecção: Os parâmetros avaliados relacionados à infectividade e virulência do parasita foram: parasitemias, períodos de pré-patência e patência. Para tal, decorridos 5 dias da infecção experimental, iniciou-se monitoramento da parasitemia dos animais. Após detecção de formas tripomastigotas sanguíneas por exame direto, a cada dois dias, foi colhido sangue (5 microlitros) diretamente da extremidade da cauda de todos os animais pertencentes aos grupos experimentalmente infectados, para determinação da parasitemia, através de contagem de tripanosomas em câmara de Neubauer. O sangue colhido foi submetido ao seguinte procedimento: diluição em cloreto de amônio, acondicionamento do sangue diluído em

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câmara de Neubauer e contagem dos parasitos presentes nos quatro campos externos da câmara em microscópio ótico (objetiva 40x). O resultado era determinado a partir do seguinte cálculo: número de parasitas / 4 x 104 (fator de correção da câmara de Neubauer) x diluição em cloreto de amônio. • Avaliações hematológicas :

Após detecção de parasitemias elevadas (108-109 parasitas / mL de sangue), aos 10 dias pós- infecção, os animais foram eutanasiados e foi colhido sangue total. As amostras de sangue obtidas foram destinadas à determinação do volume globular (VG), através de método de microhematócrito; hematimetria (x 104 / mm3 de sangue), através da contagem de hemácias em câmara de Neubauer; leucometria global e específica (leucócitos / mm3 de sangue), através de contagem de leucócitos em câmara de Neubauer e contagem diferencial em esfregaços sanguíneos corados com corante Panótico Rápido®, respectivamente. • Avaliação sorológica :

Parte do sangue colhido foi destinada à obtenção de soro para realização de técnica de Imunofluorescência Indireta, objetivando pesquisa de anticorpos das classes IgM e IgG, segundo a técnica descrita por CAMARGO (1964), empregando-se as seguintes diluições séricas: 1:4 , 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 e 1:128. Após depósito de 10 µl de cada diluição nos poços das lâminas contendo antígeno do parasita previamente fixado, as lâminas foram incubadas e lavadas com PBS. Em seguida, procedeu-se a incubação das lâminas com conjugado fluoresceinado anti-IgM e anti-IgG de camundongo, diluído em PBS e azul de Evans, para revelação da reação antígeno-anticorpo. Após lavagem, as lâminas foram montadas em glicerina tamponada e foi realizada leitura em microscópio com luz ultravioleta. O resultado foi considerado positivo quando 50% dos parasitas se apresentavam fluorescentes. O título sorológico correspondeu à última diluição positiva. 3.2 Experimento 2 Imunização de camundongos com extrato bruto de Trypanosoma evansi. Preparo do Imunógeno Para obtenção de antígeno total de T. evansi, camundongos (n=6) foram previamente infectados, recebendo, por via intraperitoneal, 10 formas tripomastigostas de T. evansi / por grama de peso corpóreo. Em seguida, a parasitemia dos animais infectados foi monitorada diariamente e após diagnóstico do 1º pico parasitêmico, os animais foram eutanasiados, sendo colhido sangue total. O sangue obtido foi processado em coluna de troca iônica preparada com DEAE-celulose (LANHAM e GODFREY, 1970), destinada à purificação dos parasitas por separação. Os parasitas, colhidos em PSG, foram submetidos à centrifugação, lavagem e ressuspensão em PBS. Para possibilitar a lise dos parasitas, o material foi submetido ao ultra-som (sonicador) e, em seguida, à dosagem protéica através de espectrofotometria.

Imunização

Foram realizadas 3 imunizações, via subcutânea, em intervalos de 3 semanas, de acordo com o seguinte esquema: 1ª imunização: 50 µg de imunógeno em Adjuvante Completo de Freund (CFA), 2ª imunização: 50 µg de imunógeno em Adjuvante Incompleto de Freund (IFA),

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3ª imunização: 50 µg de imunógeno em Adjuvante Incompleto de Freund (IFA).

Grupos de tratamento

Bai: 24 camundongos receberam BIOTERÁPICO T. evansi 12DH, 3 gotas via oral, durante 10 dias. Após 07 dias de intervalo, receberam o tratamento por mais 10 dias, antes da imunização, cons tituindo grupo Bai (Bioterápico antes da imunização). Bpi: 24 camundongos imunizados receberam BIOTERÁPICO T. evansi 12DH, 3 gotas via oral, durante 10 dias, constituindo grupo Bpi (Bioterápico pós- imunização). Controle: 24 camundongos receberam soro fisiológico dinamizado (12DH), três gotas via oral, durante 10 dias. Após 7 dias de intervalo, receberam o tratamento por mais 10 dias. Após o período de tratamento, os animais foram imunizados por via subcutânea e em seguida, receberam soro fisiológico dinamizado (12DH), três gotas via oral, durante mais 10 dias, constituindo o grupo Controle.

Parâmetros avaliados Nos dias 7, 14, 21, 28, 35, 42, 52 e 72 pós-imunização, foram eutanasiados 3 animais de cada grupo de tratamento. O sangue obtido destinou-se à avaliação de parâmetros hematológicos (leucometria global e específica) e à obtenção de soro destinado à Reação de Imunofluorescência Indireta para pesquisa de anticorpos das classes IgM e IgG (CAMARGO, 1964). 3.3 Experimento 3

Infecção de camundongos por Trypanosoma cruzi Inóculo de Trypanosoma cruzi Foi empregada a cepa Y de T. cruzi, isolada de paciente humano infectado e mantida em laboratório por passagens seriadas em camundongos.

Para a ampliação do inóculo a ser empregado na infecção experimental, camundongos (n=4) receberam, via intraperitoneal, sangue contendo formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi cepa Y. Em seguida, a parasitemia dos camundongos infectados foi monitorada diariamente, através do exame direto de uma gota de sangue, obtida na extremidade da cauda dos animais, entre lâmina e lamínula, ao microscópio óptico, até a detecção do pico parasitêmico, aproximadamente aos 7 dias p.i. Preparo do inóculo / infecção experimental Após detecção do pico parasitêmico nos camundongos experimentalmente infectados, os animais foram eutanasiados e foi colhido o sangue total. Em seguida, foi ajustado, em câmara de Neubauer, o inóculo a ser empregado na infecção experimental dos animais pertencentes aos grupos de tratamento, 10.000 formas tripomastigotas sangüíneas do parasito, em PBS (pH 7,2) / por animal. Obtenção de sangue destinado ao preparo do medicamento bioterápico Para tal, camundongos (n=6) receberam, por via intraperitoneal, 10.000 formas tripomastigostas de T. cruzi cepa Y em diferentes dias, objetivando a obtenção de sangue de animais em diferentes fases da infecção. Em seguida, a parasitemia dos animais infectados foi monitorada até a detecção do estabelecimento da fase crônica, nos animais primeiramente

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infectados (n=3) e diagnóstico do pico parasitêmico (fase aguda), nos animais secundariamente infectados (n=3), quando então, os animais foram eutanasiados e foi colhido o sangue total. O sangue obtido foi acondicionado em tubo estéril contendo soro fisiológico, destinando-se ao preparo do bioterápico na potência 12 DH, em solução com alcoolatura igual a 15%, em farmácia homeopática, de acordo com a técnica proposta por Costa (1988). Para o tratamento do grupo Controle, a farmácia homeopática forneceu soro fisiológico, em solução com alcoolatura igual a 15%. Visto que a durabilidade da solução com alcoolatura igual a 15 % é de, em média, uma semana, os medicamentos foram fornecidos semanalmente. Escolha do medicamento homeopático Phosphorus

O emprego do medicamento homeopático Phosphorus foi proposto através do estudo da literatura especializada, nas áreas de parasitologia, clínica médica e homeopatia, a fim de determinar a imagem clínica da infecção por T. cruzi no homem e no modelo murino e produzir a imagem repertorial e patogenésica da infecção. Através da correlação entre as imagens clínica e repertorial, foi determinando o diagnóstico medicamentoso da enfermidade, com base em descrições patogenésicas, em sintomas homeopáticos relatados em repertório (FILHO, 2000) e através do emprego de técnica de repertorização matemática (SIHOREMAX Software). Considerando-se a diátese, de acordo com o estudo da origem diatésica da Doença de Chagas proposto por Andrade et al. (2005), o tratamento homeopático da enfermidade foi proposto.

O medicamento Phosphorus, a ser empregado no tratamento dos animais experimentalmente infectados, foi preparado na potência 12 DH, em solução com alcoolatura igual a 15%, em farmácia homeopática.

Grupos de tratamento Grupo 1: 16 camundongos receberam BIOTERÁPICO T. cruzi 12DH, 3 gotas via oral, durante 10 dias. Após 7 dias de intervalo, foram submetidos ao tratamento por mais 10 dias, de acordo com o esquema proposto por NASI et al. (1982), antes da infecção experimental, constituindo grupo Bai (Bioterápico antes da infecção). Grupo 2: 16 camundongos, experimentalmente infectados por T. cruzi, receberam BIOTERÁPICO T. cruzi 12DH, 3 gotas via oral, durante 10 dias, de acordo com o esquema proposto por NASI et al. (1982), constituindo grupo Bpi (Bioterápico pós- infecção). Grupo 3: 16 camundongos, experimentalmente infectados por T. cruzi, receberam Phosphorus 12 DH, 3 gotas via oral, durante 10 dias, constituindo grupo Phosphorus. Grupo 4: 16 camundongos receberam soro fisiológico, durante 10 dias. Após 7 dias de intervalo foram submetidos ao tratamento por mais 10 dias, de acordo com o esquema proposto por NASI et al. (1982). Em seguida, foram experimentalmente infectados e submetidos ao tratamento com soro fisiológico, por via oral, durante mais 10 dias, constituindo grupo Controle. Grupo 5: 16 camundongos não receberam nenhum tipo de tratamento e não foram submetidos à infecção experimental, constituindo grupo Controle não-infectado (s/ infec.).

Parâmetros avaliados

20

• Avaliação da parasitemia (parasitas / mL de sangue) e do curso da infecção: Os parâmetros avaliados relacionados à infectividade e virulência do parasita foram:

parasitemias, parasitemia máxima, dia de parasitemia máxima, períodos de pré-patência e patência e taxa de mortalidade aos 42 dias pós- infecção. Para tal, decorridos cinco dias da infecção experimental, após detecção de formas tripomastigotas sanguíneas por exame direto, a cada dois dias, foi colhido sangue (5 microlitros), diretamente da extremidade da cauda de todos os animais pertencentes aos grupos experimentalmente infectados, para determinação da parasitemia, de acordo com a metodologia já descrita acima (Experimento 1). • Avaliações hematológicas e sorológicas:

Aos 7, 14 e 42 dias após infecção experimental foram eutanasiados 4, 4 e 8 animais, respectivamente, de cada grupo experimental e colhido sangue total através de punção cardíaca. O sangue colhido destinou-se à determinação da leucometria global e específica (leucócitos / mm3 de sangue), e à obtenção de soro para realização de técnica de Imunofluorescência Indireta (CAMARGO, 1964). Objetivando a pesquisa de anticorpos das classes IgM e IgG foram empregadas as seguintes diluições séricas: 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 e 1:128. • Avaliação Histopatológica

O estudo histopatológico de órgãos e tecidos dos animais pertencentes aos grupos experimentais foi conduzido no Laboratório de Anatomia Patológica, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense (UFF).

Para tal foram eutanasiados nos dias 0, 7, 14 e 42 pós-infecção, 4, 4, 4 e 8 animais de cada grupo experimental, respectivamente. Os seguintes órgãos e tecidos foram colhidos: coração, músculo esquelético, fígado, rins e intestinos grosso e delgado, os quais foram fixados em formalina Millonig e posteriormente processados da seguinte forma: desidratação sucessiva em concentrações crescentes de álcool etílico, diafanização em xilol puro, banho em parafina histológica e inclusão em parafina. Em seguida, os blocos contendo os órgãos foram submetidos a cortes de 5 µm em micrótomo e transferidos para lâminas, as quais foram coradas pela hematoxilina-eosina (HE) e examinadas ao microscópio óptico (obj. 40x). O processo inflamatório observado durante as fases agudas e crônicas da infecção foi classificado como: infiltrado inflamatório discreto, moderado, intenso e sem alterações.

As preparações histológicas foram fotografadas com câmera digital (3,2 mega pixels), empregando-se zoom digital (3x).

3.4 Análise Estatística Para a avaliação dos períodos de pré-patência e patência, entre os grupos

experimentais, empregou-se Análise de Variância (ANOVA) e para a avaliação da taxa de mortalidade aos 42 dias pós- infecção, teste Qui-Quadrado. Para as demais variáveis: índices parasitêmicos, leucocitários e sorológicos, empregou-se o teste não-paramétrico Kruskal-Wallis, seguido do teste Mann-Whitney destinado à comparação de duas amostras independentes, quando indicado. O nível de significância adotado em todos os testes foi de 5% (a = 0,05). Para realização dos referidos testes estatísticos foi empregado o software SPSS 10.0.

21

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Infecção Experimental de Camundongos por Trypanosoma evansi 4.1.1 Parasitemia e curso da infecção

De acordo com os resultados obtidos, em relação ao curso da infecção em camundongos tratados com bioterápico T. evansi antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente) e soro fisiológico dinamizado, antes e após infecção experimental por T. evansi (Controle), observou-se que não houve variação significativa em relação ao período pré-patente (Tabela 1). Após o período de pré-patência, os animais dos três grupos experimentais apresentaram aumento progressivo da parasitemia (Figura 3).

No presente trabalho, aos 10 dias pós- infecção, foram observados valores parasitêmicos de até 3,6 x 109 parasitas / mL de sangue (Figura 3), quando se realizou a eutanásia dos animais pertencentes aos grupos experimentais para obtenção de sangue destinado a avaliações hematológicas e sorológicas, visto que o aumento progressivo da parasitemia, sem ondas de remissão típicas das infecções por tripanosomas salivários (HERRERA, 1998; QUEIROZ et al., 2000), indicava que o curso da infecção seguia para o óbito. Embora o grupo experimental Bpi tenha apresentado índices parasitêmicos menores, em relação a Bai e Controle, nos dias 07, 08 (p<0,05), 09 e 10 p.i. (Figura 4), a variação observada foi atribuída ao fato de que 01 animal do grupo Bpi apresentou curso da infecção atípico em relação aos animais dos demais grupos, apresentando parasitemia patente apenas aos 14 dias pós- infecção. Assim, apesar da referida variação observada em relação às parasitemias, em geral, não houve variação entre os grupos experimentais, quanto ao curso da infecção, uma vez que o aumento progressivo da parasitemia indicava que a infecção seguia para o óbito de todos os animais.

MENEZES et al (2004) estudaram o comportamento biológico de isolados de T. evansi, entre estes, o mesmo isolado empregado no presente trabalho (isolado obtido de quati naturalmente infectado) em camundongos C57BL/6 experimentalmente infectados. Os autores observaram que a maioria dos animais infectados apresentou aumento progressivo da parasitemia até 109 parasitas / mL de sangue, sem apresentar ondas de remissão, característica da infecção por T. evansi em outras espécies. Todos os isolados estudados se apresentaram extremamente virulentos para as linhagens de camundongos estudadas, sendo observado 100% de mortalidade. Os autores observaram que morte dos camundongos ocorria quando a parasitemia alcançava 108-109 parasitas / mL de sangue.

Tabela 1. Médias dos períodos pré-patentes de camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção experimental por T. evansi (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle). Bai

(n=08) Bpi

(n=10) Controle

(n=06)

PPP (dias) 7,3 ± 0,71 8,5 ± 2,13 7,5 ± 0,55

22

Curso da infecção

02468

10

6 7 8 9 10

dias pós-infecção

Par

asit

as /

mL

de

san

gu

e (L

og

)Bai

Bpi

Controle

Figura 3. Curso da infecção experimental por T. evansi em camundongos C57BL/6 tratados com bioterápico antes e após infecção experimental (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle). Log das médias de parasitemias observadas nos grupos experimentais.

Parasitemia

02468

10121416

6 7 8 9 10Dias pós-infecção

6

Bai

Bpi

Controle

*

Figura 4. Variação dos postos médios (Mean Rank ) dos valores parasitêmicos, entre os grupos de tratamento, após infecção experimental por T. evansi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção experimental (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle). * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.

23

4.1.2 Parâmetros hematológicos De acordo com os resultados das avaliações hematológicas realizadas em

camundongos tratados com bioterápico e soro fisiológico dinamizado, antes e após infecção experimental por T. evansi (Bai, Bpi e Controle), observa-se que não houve variação significativa em relação aos valores de: hematócrito, hematimetria, leucometria global (Tabela 2) e específica (Figura 5), embora tenham sido registradas menores médias de leucócitos e menores valores absolutos de neutrófilos e linfócitos no grupo controle, em relação a Bai e Bpi.

No presente trabalho, observou-se que os valores de hematócrito dos animais se apresentaram abaixo dos valores de referência (49,6% ± 5,0), entretanto, os valores da hematimetria se apresentaram compreendidos entre valores de referência (5,0 a 8,0 x 106 / mm3 de sangue). A anemia é uma característica importante na patogenia da infecção por T. evansi (HOARE, 1972; MENEZES et al. 2004; HERRERA et al. 1998), embora, sua patogênese não tenha sido completamente elucidada. Observa-se que os valores da contagem global de leucócitos se apresentaram abaixo dos valores de referência (4,0 ± 1,0 x 103 leucócitos / mm3 de sangue), caracterizando imunossupressão determinada pela infecção experimental. A imunossupressão associada à infecção experimental por tripanosomas patogênicos tem sido relacionada à ação de metabólitos liberados pelo parasita e à imunomodulação causada pelo mesmo, buscando escapar da resposta imune do hospedeiro (ZAMBRANO et al. 2002; SIZEMORE e MANSFIELD, 1984). Menezes et al. (2004) observaram que a leucocitose não pode ser correlacionada com a maior ou menor resistência do hospedeiro.

Tabela 2. Médias de parâmetros hematológicos, aos 10 dias p.i., em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção experimental por T. evansi (Bai e Bpi, respectivamente) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle). Bai

(n=08) Bpi

(n=10) Controle

(n=06)

Hematócrito (%)

37 ± 3

35 ± 9

38 ± 5

Hematimetria (x 104 / mm3 de

sangue)

845 ± 101

805 ± 245

860 ± 127

Leucometria global (leucócitos / mm3 de

sangue)

2775 ± 693

2705 ± 1354

1996 ± 1220

24

Leucometria global

0

5

10

15

20P

osto

s m

édio

s do

nº

de

leuc

ócito

s / m

m3 d

e sa

ngue

Bai

Bpi

Controle

Linfócitos

0

5

10

15

20

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

linfó

cito

s / m

m3 d

e sa

ngue

Bai

Bpi

Controle

Neutrófilos

0

5

10

15

20

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

neut

rófil

os /

mm

3 de

sang

ue

Bai

Bpi

Controle

Figura 5. Postos médios (Mean Rank) dos resultados do leucograma realizado em camundongos tratados com bioterápico antes da infecção (Bai), após infecção (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após infecção experimental por T. evansi (Controle). (a) Contagem global de leucócitos. (b) Valores absolutos de linfócitos. (c) Valores absolutos de neutrófilos. (d) Valores absolutos de eosinófilos. (e) Valores absolutos de monócitos. Kruskal-Wallis Test.‘continua’.

a

b

c

25

Eosinófilos

0

24

68

1012

14

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

eosi

nófil

os /

mm

3 de

san

gue

Bai

Bpi

Controle

Monócitos

11,5

12

12,5

13

13,5

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

mon

ócito

s / m

m3 de

sang

ue

Bai

Bpi

Controle

‘Figura 5. continuação’. 4.1.3 Resposta imune humoral De acordo com os resultados da avaliação da resposta imune humoral, através de Reação de Imunofluorescência Indireta, observou-se que não houve variação significativa entre os grupos experimentais, em relação aos títulos de IgM e IgG (Figura 6), assim como em relação ao número de animais reagentes (Tabela 3). Observou-se que a resposta imune humoral, expressa pelos níveis de anticorpos IgM e IgG, em geral, foi baixa, apenas 01 animal do grupo Bpi, o qual apresentou curso da infecção atípico em relação aos demais, apresentou título maior que 1:8. A importância da resposta imune humoral no controle da população parasitária circulante nas infecções por tripanosomas salivários é reportada por vários autores, sendo descrita em infecções experimentais (FRANKE et al., 1994; HERRERA, 1998) e naturais (BRANDÃO et al., 2002), embora Menezes et al. (2004) não tenham observado correlação entre título sorológico de IgG e tempo de sobrevida ou capacidade de controlar a parasitemia. Nas condições do presente trabalho, observou-se que a elevada virulência da infecção, expressa por elevadas parasitemias e curso hiper agudo, reflete, provavelmente a baixa produção de imunoglobulinas, visto o custo orgânico de uma resposta imune humoral, em um curso infeccioso extremamente agudo e grave.

Menezes et al. (2004) observaram que isolados de T. evansi se apresentaram virulentos para camundongos da linhagem C57BL/6 e concluíram que a infecção experimental de camundongos constitui modelo apropriado para estudar aspectos relacionados à patogenia da infecção por T. evansi. Entretanto, no presente trabalho, observa-se que o referido modelo experimental pode não ter sido adequado para se estudar os efeitos imunomodulares de

d

e

26

bioterápico homeopático, uma vez que a infecção apresentou curso hiper agudo, seguindo, invariavelmente, para o óbito, ou seja, pode não ter decorrido tempo suficiente para instalação de reposta imune específica efetora.

0

24

68

10

1214

16

IgM

Po

sto

s m

édio

s d

os

títu

los

soro

lóg

ico

s

Bai

Bpi

Controle

0

24

68

10

1214

16

IgG

Po

sto

s m

édio

s d

os

títu

los

soro

lóg

ico

s

Bai

Bpi

Controle

Figura 6. Postos médios (Mean Rank) dos títulos de anticorpos IgM e IgG, aos 10 dias pós-infecção experimental por T. evansi, em camundongos tratados com bioterápico antes da infecção (Bai), após infecção (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após infecção (Controle). Kruskal Wallis Test.

27

Tabela 3. Títulos de anticorpos IgG e IgM, aos 10 dias p.i., em soros de camundongos tratados com bioterápico antes da infecção (Bai), após infecção (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle) antes e após infecção experimental por T. evansi (Controle).

Bai

Bpi

Controle

IgG IgM IgG IgM IgG IgM

neg neg 1:4 neg neg neg neg neg neg neg neg neg 1:8 1:4 neg neg neg neg 1:4 1:8 neg neg 1:4 neg neg neg neg neg neg neg neg neg 1:4 neg neg neg 1:4 1:4 neg neg - - neg neg neg neg - - - - neg neg - - - - 1:64 1:64 - -

- soros excluídos da análise (animais não apresentaram parasitemia patente). 4.2 Imunização de Camundongos com Extrato de Trypansoma evansi

Conforme descrito, não foram observados efeitos profiláticos ou terapêuticos em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção experimental por T. evansi, o que pôde ser atribuído ao fato deste modelo não se adequar ao estudo de uma possível atividade imunomoduladora do bioterápico. Assim, foi proposta a inoculação de extrato bruto de T. evansi (imunização) em camundongos tratados com bioterápico homeopático antes (Bai) e após (Bpi) imunização, objetivando avaliar possível efeito imunomodulador do tratamento. 4.2.1 Resposta leucocitária

De acordo com os resultados obtidos, observou-se variação significativa do valor global de leucócitos, entre os grupos experimentais, aos 07 e 52 dias pós- imunização (Figura 7). Aos 07 dias p.i., observou-se que o grupo experimental Bai apresenta valor superior (p=0,05) em relação ao Bpi, e tendência a ser mais elevado em relação ao controle (p=0,07). Aos 52 dias pós- imunização, observou-se que os grupos Bai e Controle apresentaram valores significativamente superiores, em relação ao Bpi (p=0,05 e 0,046, respectivamente). Observou-se que, exceto aos 52 dias p.i., em geral, o grupo Bai apresentou número de leucócitos mais elevado, em relação ao controle, mesmo no dia 0 p.i., o que poderia estar associado ao tratamento prévio com o antígeno ultradiluído (bioterápico).

28

Leucometria global

0

2

4

6

8

10

0 7 14 21 28 35 42 52 62dias após imunização

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

le

ucóc

itos

/ mm

3 de

sang

ueBai

Bpi

Controle

Figura 7. Postos médios (Mean Rank) dos valores globais de leucócitos, em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.

Aos 7 dias pós- imunização, observou-se que Bai apresentou número de linfócitos

significativamente superior, em relação ao Bpi e Controle (p=0,05 e p=0,05, respectivamente) (Figura 8). Aos 52 dias, o grupo Bai e Controle apresentaram número de linfócitos significativamente superiores, quando comparados a Bpi (p=0,05 e p=0,05, respectivamente). Observou-se que, em geral, Bai e Bpi apresentaram valores de linfócitos superiores, quando comparado ao grupo controle, exceto aos 52 dias pós- infecção.

* *

29

Linfócitos

0

2

4

6

8

10

0 7 14 21 28 35 42 52 62

dias após imunização

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

linfó

cito

s / m

m3

de

sang

ue

Bai

Bpi

Controle

Figura 8. Postos médios (Mean Rank) dos valores globais de linfócitos, em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle) antes e após imunização com extrato de T. evansi. * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.

Em relação ao número de neutrófilos (Figura 9), observou-se que aos 42 dias pós-imunização, os grupos Bai e Bpi apresentaram valores significativamente superiores (p=0,05 e p=0,05, respectivamente), quando comparados ao Controle. Aos 52 dias observou-se que Bai e Controle apresentaram número de neutrófilos significativamente maior em relação a Bpi (p=0,05, p=0,05, respectivamente). Observou-se que, em geral, Bai e Bpi, apresentaram valores de neutrófilos mais elevados em relação ao controle, exceto aos 52 dias p.i.

Neutrófilos

0

2

4

6

8

0 7 14 21 28 35 42 52 62

dias após imunização

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

neut

rófil

os /

mm

3 de

sang

ue

Bai

Bpi

Controle

Figura 9. Postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de neutrófilos, em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado (Controle) antes e após imunização com extrato de T. evansi. * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.

* *

* *

30

Em relação ao número de eosinófilos (Figura 10), não foi observada variação entre os grupos de tratamento.

Eosinófilos

0

2

4

6

8

0 7 14 21 28 35 42 52 62

dias após-imunização

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

eosi

nófil

o / m

m3 d

e

sang

ue

Bai

Bpi

Controle

Figura 10. Postos médios (Mean Rank) valores absolutos de eosinófilos, em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). Kruskal-Wallis Test.

Aos 21 dias pós-imunização, observou-se que o grupo Bpi apresentou número de

monócitos (Figura 11) significativamente mais elevado em relação ao Controle (p=0,46). Observou-se que, em geral, os grupos Bai e Bpi apresentaram número de monócitos superiores, quando comparados ao controle, exceto aos 52 e 62 dias pós- imunização.

Monócitos

0

2

4

6

8

10

0 7 14 21 28 35 42 52 62

dias após-imunização

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

mon

ócito

s / m

m3 de

sang

ue Bai

Bpi

Controle

Figura 11. Postos médios (Mean Rank ) dos valores absolutos de monócitos, em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e, tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.

*

31

4.2.2 Resposta imune humoral De acordo com os resultados obtidos, observou-se que, aos 28 dias pós- imunização, o

grupo experimental Bpi, apresentou títulos sorológicos de IgG significativamente superiores (p<0,05), quando comparado ao grupo Controle (Figura 12, Tabela 4). Em geral, observou-se que o grupo Bpi apresentou títulos superiores, quando comparado ao Controle, aos 14, 21, 28(p<0,05), 35, 52 e 62 dias pós-imunização. Nos grupos Bai e Bpi foram observados títulos sorológicos de até 1:128, enquanto no controle apenas até 1:64 (Tabela 4). Não foram observadas variações significativas entre os grupos em relação aos títulos sorológicos de IgM.

IgG

0

2

4

6

8

10

7 14 21 28 35 42 52 62

dias após imunização

Pos

tos

méd

ios

dos

títul

os s

orol

ógic

os

Bai

Bpi

Controle

Figura 12. Postos médios (Mean Rank) dos títulos sorológicos de IgG, em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). * Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.

*

32

IgM

0

2

4

6

8

7 14 21 28 35 42 52 62

dias após imunização

Pos

tos

méd

ios

dos

títul

os s

orol

ógic

os

Bai

Bpi

Controle

Figura 13. Postos médios (Mean Rank) dos títulos sorológicos de IgM, em camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle) Kruskal-Wallis Test. Tabela 4. Títulos de anticorpos IgG em soros de camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). * Significância estatística. dias após imunização 7 14 21 28 35 42 52 62 Grupos de tratamento

neg neg neg 1:16 1:128 neg 1:128 1:32 neg neg neg neg 1:64 1:16 1:128 1:128

Bai

neg neg neg 1:32 1:16 1:16 1:32 1:128 neg neg neg 1:32* 1:8 1:64 1:128 1:128 neg 1:4 1:64 1:64* 1:32 1:64 1:32 -

Bpi

neg 1:4 1:16 1:64* 1:4 1:8 1:64 - neg neg 1:8 neg 1:32 1:32 1:4 1:8 neg neg neg 1:16 neg 1:64 1:64 1:64

Controle

neg neg 1:8 neg 1:8 1:64 1:32 -

- sem amostras para análise

33

Tabela 5. Títulos de anticorpos IgM, em soros de camundongos tratados com bioterápico antes da imunização (Bai), após imunização (Bpi) e tratados com soro fisiológico dinamizado antes e após imunização com extrato de T. evansi (Controle). dias após imunização 7 14 21 28 35 42 52 62 Grupos de tratamento

neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg 1:4

Bai

1:4 neg neg neg neg neg neg 1:4 neg neg neg neg neg 1:4 neg neg neg 1:4 1:4 neg neg neg neg -

Bpi

neg 1:4 1:4 neg neg neg neg - neg neg 1:8 neg neg neg neg neg neg neg neg 1:16 neg neg neg neg

Controle

neg neg neg neg neg neg neg -

- sem amostras para análise

Observou-se que, em geral, os grupos Bai e Bpi apresentaram valores mais elevados em relação ao número global de leucócitos e valores absolutos de linfócitos, neutrófilos e monócitos, em relação ao Controle, exceto aos 52 dias pós- imunização. Além disso, maiores títulos de IgG foram observados nos grupos Bai e Bpi, embora significância estatística tenha sido observada apenas aos 28 dias pós-imunização, para Bpi em relação ao controle. A observação de que logo após a 1ª imunização, aos 7 dias p.i., o grupo previamente tratado com bioterápico 12DH tenha apresentado número de linfócitos superior (p<0,05) em relação a Bpi e Controle, sugere imunomodulação devido ao tratamento prévio. Entretanto, de acordo com os resultados, não é possível distinção clara entre os resultados de Bai e Bpi, sugerindo que ambos os tratamentos modularam a resposta à imunização. Assim, novos estudos devem ser realizados, para que sejam avaliados os mecanismos específicos, os quais seriam determinantes de imunomodulação em ensaios envolvendo tratamento com bioterápico ultradiluído.

Weissman et al. (1992) observaram em seus estudos, que a administração de antígenos ultradiluídos é capaz de determinar modulação da resposta imune quando, posteriormente, o organismo for exposto ao referido antígeno. Os autores procederam a imunização com antígeno KLH (hemocyanin) em camundongos previamente tratados com o mesmo antígeno ultradiluído (7CH e 15CH) por via oral ou por via parenteral e observaram modulação da resposta imune especifica humoral (IgG) e celular ao referido antígeno, mesmo quando empregada diluição acima do número de Avogrado, neste caso, 15CH.

34

4.3 Infecção Experimental de Camundongos por Trypanosoma cruzi 4.3.1 Estudo das imagens clínica e repertorial homeopáticas

Os sintomas da infecção por T. cruzi no homem e no modelo murino, citados na literatura, podem ser transcritos para as rubricas repertoriais as quais representam as imagem clínica e repertorial da infecção (quadro 1). A repertorização matemática destas rubricas resultou nos medicamentos apresentados (tabela 6), tendo sido selecionados 11 medicamentos, ordenados por cobertura dos sintomas e pontuação final. Observa-se que o medicamento homeopático Phosphorus representou a imagem repertorial da infecção por T. cruzi, cobrindo maior número de sintomas e alcançando maior pontuação.

A imagem patogenésica do medicamento Phosphorus o associa aos indivíduos enfraquecidos pela perda de fluidos corporais, emagrecidos, desanimados e subitamente prostrados. Há presença de hemorragias decorrentes de ações irritativas, inflamatórias e degerenativas, com conseqüente comprometimento de vasos sanguíneos (BOERICKE, 1997). Tais aspectos caracterizam o Phosphorus como um medicamento da diátese sifilínica (CARILLO Jr., 2000). De acordo com Andrade et al. (2005), as características clínicas e histopatológicas da Doença de Chagas podem ser explicadas e melhor entendidas pela teoria da diátese sifilínica de Carillo Jr. (2000). Em seus estudos sobre a origem diatésica da Doença de Chagas, Andrade et al. (2005) observaram relação estatisticamente significativa entre Diátese Sifilínica e Doença de Chagas. De acordo com os referidos autores, esta observação possibilita a adoção de novas medidas profiláticas e terapêuticas que favoreçam melhor prognóstico, através do tratamento homeopático diatésico. Quadro 1. Rubricas Repertoriais dos sintomas da infecção por T. cruzi citados na literatura. Imagem clínica da infecção por T. cruzi no homem e no modelo murino. Seção Rubrica Sub-rubrica Peito congestão coração Peito inflamação coração Peito inflamação coração miocárdio Peito afecções coração Peito afecções coração crônicas Peito dilatação coração Abdome aumentado baço Abdome inchação baço Garganta inflamação esôfago Cabeça inflamação cérebro Generalidades inflamação gânglios Generalidades inflamação músculos

35

Tabela 6. Resultado da repertorização matemática das rubricas representativas da imagem clínica da infecção por T. cruzi no homem e no modelo murino experimental. Medicamentos ordenados por cobertura de sintomas e pontuação final.

Medicamentos

Cobertura Pontos

PHOSPHORUS 10 20 ACON 7 17 ARS 7 14 IOD 7 13

PULS 7 13 SULPH 7 8 LACH 6 12 BRY 6 11

NAT-M 6 11 NUX-V 6 11 KALI-I 6 07

4.3.2 Parasitemia e curso da infecção

A partir do quinto dia pós-infecção experimental por T. cruzi, formas tripomastigotas sanguíneas foram detectadas no sangue dos animais infectados. Os resultados referentes aos períodos de pré-patência, patência, taxa de mortalidade aos 42 dias p.i. e dias p.i. em que ocorreu o óbito, para os grupos experimentalmente infectados, estão apresentados na tabela 7. De acordo com os resultados observou-se que não houve variação significativa entre os grupos, em relação ao período pré-patente. Em relação ao período de patência, observou-se que o grupo Bai apresentou valor significativamente menor em relação aos demais grupos (p=0,026). Os percentuais referentes à taxa de mortalidade aos 42 dias pós-infecção não variaram significativamente, porém, observou-se um menor percentual de mortalidade no grupo Bai em relação ao Controle, e no grupo Phosphorus em relação aos demais grupos, sendo o grupo Controle o qual apresentou maior índice de mortalidade. Tabela 7. Valores médios dos períodos de pré-patência, patência e taxa de mortalidade aos 42 dias pós- infecção de camundongos C57BL/6 experimentalmente infectados por T. cruzi, tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle).

Grupo

Experimental

Pré-patência (dias)

Patência (dias)

Mortalidade

aos 42 dias p.i. (%) valores dias p.i. Bai 5,0 ± 0,0 11,0 ± 3,5 * 12,5 1/8 13 Bpi 5,2 ± 0,8 16,4 ± 4,8 37,5 3/8 14±3 Phosphorus 5,3 ± 0,8 19,8 ± 2,9 0,0 0/8 - Controle 5,5 ± 2,1 17,5 ± 7,5 42,8 3/7 21±7 * Estatisticamente significativo (ANOVA, 5% sig.).

36

Não foi detectada variação significativa entre os grupos experimentais em relação ao

dia de parasitemia máxima (DMP), todos os grupos infectados apresentaram, em média, pico parasitêmico (máximo de parasitemia) aos 7 dias pós- infecção experimental (Figura 16). Em seguida, observou-se variação dos valores de parasitemia até o estabelecimento da parasitemia subpatente (figura 14). Os valores dos postos médios da parasitemia de cada grupo, assim como as variações significativas entre os grupos, em diferentes dias pós-infecção, estão apresentados na figura 15.

Curso Parasitêmico

0

10

20

30

40

50

5 7 9 11 13 15 17 20 22 24 26 28

dias após infecção

Pos

tos

méd

ios

do n

úmer

o de

para

sita

s x

105

/ mL

de s

angu

e

Bai Bpi Phosphorus Controle

Figura 14. Curso da infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). Postos médios (Mean Rank) dos valores de parasitemia. Kruskal-Wallis Test.

37

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

5 7 9 11 13 15 17 20 22 24 26 28

dias pós-infecção

Pos

tos

méd

ios

do n

úmer

o de

par

asita

s

x 10

5 / m

L de

san

gue

Bai

Bpi

Phosphorus

Controle

*

* * * *

Figura 15. Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores parasitêmicos, após infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). Postos médios (Mean Rank) dos valores de parasitemia. *Significância estatística. Kruskal-Wallis Test.

Observou-se que o grupo Bai apresentou valores de parasitemia menores em relação

ao Controle nos dias 09, 13, 15 (p<0,05), 17(p<0,05), 22, 24 e 28 dias pós-infecção. Os animais pertencentes ao grupo Phosphorus apresentaram, em média, período de patência mais longo em relação aos demais grupos, assim como parasitemias mais elevadas nos dias 7 (p=0,05) e 20 p.i. (p<0,05) em relação ao Controle e, nos dias nos dias 07 (<0,05), 17(<0,05), 20(<0,05), e 24 p.i. (<0,05) em relação ao Bai. Observa-se também maior valor de parasitemia máxima no grupo Phosphorus em relação ao Controle (p<0,05) (Figura 16). Entretanto, não foi observado nenhum óbito no grupo Phosphorus. De acordo com Brener et al. (2000), a mortalidade de camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi é um efeito tanto do parasita quando da própria resposta imune do hospedeiro. A excessiva multiplicação parasitária no organismo do hospedeiro pode levar à morte animais susceptíveis. A sobrevivência de 100% observada no grupo tratado com medicamento Phosphorus, embora sem significância estatística, sugere uma ação sobre a resistência do hospedeiro à multiplicação excessiva do parasita, visto que todos os animais atingiram a fase crônica da infecção, apesar das elevadas parasitemias. De acordo com Hunter et al. (1997), elevadas parasitemias associadas à reduzida mortalidade em camundongos infectados por T. cruzi, pode indicar ação regulatória e antiinflamatória, ou efeito sobre o balanço entre mediadores pró e anti- inflamatórios. De acordo com Brener et al. (2000) pode-se dizer que ‘uma fase aguda leve não é necessariamente seguida de uma fase crônica atenuada’, visto que os mediadores inflamatórios os quais poderiam deter efetivamente a multiplicação dos parasitas na fase aguda da infecção, determinando reduzidas parasitemias, teriam efeitos lesionais para os tecidos orgânicos na fase crônica da infecção. Daí a necessidade de modular a resposta orgânica à infecção.

38

Valores máximos de parasitemia

0

10

20

30

40

50

Pos

tos

méd

ios

do n

úmer

o de

pa

rasi

tas

x 10

5 / m

L de

san

gue

BAI

BPI

PPI

Placebo

7,3*

7,6 *

7,3 *

* dia de parasitemia máxima pós-infecção. Figura 16. Postos médios (Mean Rank) dos valores máximos de parasitemia, após infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). Kruskal-Wallis Test.

De acordo com Dias et al. (1997); Storino et al. (1994) ‘citado por’ Brener et al.

(2000), o período de parasitemia patente, o qual compreende os valores máximos de parasitemia, com multiplicação de parasitos, caracteriza a fase aguda infecção. O período sub-patente, estabelecido após redução da parasitemia caracteriza a fase crônica da infecção.

Observa-se, em relação à mortalidade dos animais, que independente do grupo experimental, os óbitos ocorreram na fase aguda, ou seja, quando ainda eram detectadas formas tripomastigotas sanguíneas circulantes por exame direto. A multiplicação exagerada do parasita no hospedeiro pode levar à morte animais susceptíveis: esse efeito é prevenido por citocinas pró-inflamatórias do tipo 1 (IL-12, TNF-a e IFN-?). No entanto, em situações em que certas cepas do parasita infectam hospedeiro resistente, a mortalidade é prevenida por uma combinação dos efeitos antiparasitários de citocinas tipo 1 com os efeitos antagônicos que citocinas regulatórias antiinflamatórias, como TGF-ß e a IL-10, exercem sobre as primeiras. As citocinas do tipo 1 são “armas de dois gumes”, sendo necessárias para controlar o parasitismo, mas exercendo também efeitos tóxicos letais para o hospedeiro, se produzidas em excesso. Dessa forma, o escape do parasita a esse primeiro nível de ataque poderia ser uma necessidade para a manutenção da integridade dos tecidos do hospedeiro (BRENER et al. 2000).

De acordo com os resultados, sugere-se que o tratamento prévio à infecção experimental com bioterápico modulou a resposta imune do hospedeiro controlando melhor a parasitemia. Entretanto, devem ser estudados e esclarecidos os mecanismos específicos os quais estariam envolvidos neste processo, como por exemplo, se a administração de antígenos ultradiluídos de T. cruzi poderia ter efeito sobre os anticorpos líticos, visto que é sabido até o momento que estes são capazes de reagir somente com formas vivas de T. cruzi e desempenham papel importante na proteção do hospedeiro (KRETTLI e BRENER, 1982).

Toledo et al. (2004) avaliaram os efeitos da quimioterapia com Benzinidazol e Itraconazol sobre parâmetros parasitológicos e histopatológicos de camundongos infectados

7,7 *

39

por diferentes clones de T. cruzi, obtendo diferentes resultados. Os autores afirmaram que a diversidade filogenética entre os clones deve ser considerada quando a quimioterapia for empregada. Assim, a possibilidade de emprego de bioterápico com o medicamento feito a partir do sangue individual do paciente infectado, deve ser considerada, uma vez que a reposta do hospedeiro pode influenciar a resposta ao tratamento específico (TOLEDO et al. 2004; FERRAZ, 2005).

4.3.3 Resposta imune humoral

No presente estudo, a resposta imune humoral adquirida ao T. cruzi, foi estudada através da detecção de anticorpos anti-Trypansoma cruzi das classes IgM e IgG, nos dias 7, 14 e 42 pós-infecção. Na tabela 8 estão apresentados os percentuais de IgM e IgG reagentes de acordo com o grupo de tratamento nos referidos dias p.i. Na tabela 9 estão apresentados os percentuais de IgM reagentes, assim como os respectivos títulos sorológicos. De acordo com os resultados, observou-se que não houve variação significativa entre os grupos, em relação aos níveis séricos de IgM (p>0.05), entretanto, aos 7 dias p.i., os grupos Bai, Bpi e Phosphorus se apresentavam reagentes para IgM, o que não foi observado no grupo controle. Aos 14 dias pós- infecção, observa-se que Bai e Phosphorus apresentavam menor número de reagentes para IgM (50%), seguido de Bpi (75%), enquanto todos os animais do controle (100%) ainda se apresentavam reagentes para IgM, o que foi observado também aos 42 dias p.i.

Embora seja observada variação entre o número de IgM reagentes, assim como entre os títulos sorológicos observados entre os grupos, todos os grupos apresentaram produção crescente de IgM ao longo do período avaliado, entretanto, o grupo Bai apresentou menor número de reagentes, assim como menores títulos, em relação ao controle. Os anticorpos IgM são os primeiros a serem produzidos em uma resposta imune humoral, sendo produzidos antes que as células B sofram hipermutação somática e, portanto, tendem a ser de baixa afinidade , sendo também produzidos nas respostas secundárias e subseqüentes, embora outros isotipos dominem as fases tardias da resposta de anticorpos (JANEWAY et al., 2002). De acordo com Brener et al. (2000), o desaparecimento da parasitemia, o decréscimo dos níveis de imunoglobulinas da classe M e o aumento dos níveis de IgG caracterizam a transição da fase aguda da infecção para a fase crônica, assim pode-se associar tal observação ao menor período de patência observado em Bai.

Na tabela 10 estão apresentados os percentuais de IgG reagentes, assim como os respectivos títulos sorológicos, nos referidos dias p.i. Não se observa variação significativa entre os grupos, em relação aos títulos de IgG aos 7 e 14 dias p.i. (p>0,05), entretanto, aos 7 dias p.i., observa-se que 100% dos animais pertencentes ao grupo Bai apresentavam títulos sorológicos para IgG, sugerindo switch mais precoce das classes de imunoglobulinas neste grupo, em relação ao controle. Aos 14 dias p.i., observa-se que 100% dos animais dos grupos Bai, Phosphorus e Controle se apresentavam reagentes para IgG, entretanto, entre estes grupos, observa-se maior percentual de títulos sorológicos mais elevados (1:64) no grupo pré-tratado com bioterápico (Bai). De acordo com Brodskyn et al. (1989), o aparecimento de anticorpos específicos está relacionado com a queda da parasitemia e isotipos de IgG estão associados à eliminação de formas sanguíneas do parasita. Assim, pode-se associar a reposta secundária (IgG) mais precoce e intensa observada no grupo Bai ao melhor controle da parasitemia, observado na fase aguda da infecção, em relação ao Controle. Tal resposta assegurou a resistência à infecção, visto que 87,5% dos animais do grupo Bai atingiram a fase crônica da infecção, comparados a 57 % do grupo controle. Weissman et al. (1992) observaram que, camundongos pré-tratados com diluições homeopáticas (15CH) do antígeno KLH, 14 dias após receberem doses ponderais do antígeno, apresentaram resposta secundária

40

(IgG) mais precoce e intensa, enquanto o controle ainda apresentava baixos títulos de IgG e ainda elevados títulos de IgM. Entretanto, de acordo com os autores, quando foi empregada a ultradiluição 7CH, o efeito do pré-tratamento somente se apresentou mais intenso aos 30 dias p.i. Os autores observaram que a administração de antígenos ultradiluídos, por via oral ou por via parenteral determinou a modulação da resposta imune específica humoral (IgG) e celular, mesmo quando empregada diluição abaixo do número de Avogrado.

Aos 42 dias p.i., observa-se que 100% dos animais pertencentes ao grupo Controle apresentaram títulos sorológicos de IgG significativamente mais elevados (p<0,05), em relação aos demais grupos. Tal observação pode demonstrar ineficiente ‘controle’ da resposta imune na fase crônica da infecção, o que normalmente associa-se à presença de lesões teciduais imunomediadas no organismo do hospedeiro, visto que nesta fase, não são requeridos elevados níveis de imunoglobulinas para controle da parasitemia.

Os linfócitos B são considerados importantes ferramentas de defesa do hospedeiro no controle da infecção, pela característica ativação clonal e hipergamaglobulinemia, que ocorrem na fase aguda, auxiliando na remoção dos parasitos circulantes (MARINO, 2005). Entretanto, Morgan et al. (1996) relacionaram os linfócitos B, mais especificamente as imunoglobulinas, ao possível mecanismo auto- imune da doença. Os autores observaram elevados níveis de IgG1 e IgG3 no soro de pacientes com a forma crônica sintomática da Doença de Chagas. Estudos realizados demonstraram que a produção de anticorpos específicos anti-Trypanosoma cruzi (IgG) tem importância na resistência à infecção, entretanto, estão associados à patogenia da doença (MORGAN et al, 1996; ZAUZA e BORGES-PEREIRA, 2001; HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001). De acordo com Janeway et al (2002), a administração de antígenos protéicos solúveis pela via oral pode resultar em tolerância, a qual constitui mecanismo a ser explorado para reduzir as respostas imunes indesejadas. Assim, este deve ser outro aspecto a ser melhor estudado em relação à possibilidade de melhor controle de mecanismos imunopatológicos na fase crônica da infecção por T. cruzi, visto que, nesta fase, um tratamento o qual pudesse ter efeito sobre a tolerância imunológica aos antígenos do parasita teria relevante importância. A resposta imune normalmente observada na fase crônica da infecção pode ser “desproporcional” aos antígenos residuais de T. cruzi presentes, caracterizando assim os aspectos imunopatogênicos da doença.

Tabela 8. Percentual (%) de reagentes IgG e IgM (IFI), em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle).

7 dias PI

14 dias PI

42 dias PI

Grupo de tratamento

IgG

IgM

IgG

IgM

IgG

IgM

BAI

100,0

25,0

100,0

50,0

100,0 56,0

BPI 25,0 50,0 75,0 75,0 * * Phos 75,0 25,0 100,0 50,0 100,0 75,0

Controle 50,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0

* Amostras comprometidas, não foi possível determinar os resultados.

41

Tabela 9. Percentuais de títulos sorológicos (%) de anticorpos IgM, em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). 7dias PI 14 dias 42 dias

Título sorológico Bai Bpi Phos Contr Bai Bpi Phos Contr Bai Bpi* Phos Contr

1:4 0,0 25,0 0,0 0,0 0,0 0,0 25,0 0,0 14,0 0,0 0,0 1:8 0,0 0,0 0,0 0,0 25,0 0,0 25,0 25,0 0,0 0,0 0,0

1:16 0,0 25,0 0,0 0,0 25,0 25,0 0,0 75,0 14,0 25,0 25,0 1:32 25,0 0,0 25,0 0,0 0,0 25,0 0,0 0,0 14,0 12,5 50,0 1:64 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 25,0 0,0 0,0 14,0 25,0 25,0 1:128 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 12,5 0,0

* Amostras comprometidas, não foi possível determinar os resultados.

Tabela 10. Percentuais (%) de títulos sorológicos de anticorpos IgG, em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção e tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle). 7dias PI 14 dias 42 dias

Título sorológico Bai Bpi Phos Contr Bai Bpi Phos Contr Bai Bpi* Phos Contr

1:4 50,0 0,0 0,0 25,0 25,0 0,0 25,0 0,0 14,0 0,0 0,0 1:8 25,0 0,0 25,0 25,0 0,0 0,0 25,0 25,0 0,0 0,0 0,0 1:16 0,0 0,0 25,0 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 14,0 0,0 0,0 1:32 25,0 25,0 25,0 0,0 0,0 25,0 25,0 50,0 29,0 0,0 0,0 1:64 0,0 0,0 0,0 0,0 50,0 25,0 0,0 0,0 43,0 63,0 0,0 1:128 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 25,0 100**

* Amostras comprometidas, não foi possível determinar os resultados. ** Significância Estatística.

42

4.2.4 Resposta Leucocitária Com o objetivo de avaliar aspectos da imunidade inata (inespecífica) e adquirida

(específica) à infecção por T. cruzi em camundongos tratados com homeopatia, soro fisiológico e, em animais controle não infectados, foi realizado leucograma nos dias 0, 7, 14 e 42 pós-infecção. As variações entre os grupos experimentais, em relação aos valores absolutos de leucócitos estão apresentadas na figura 17. De acordo com os resultados obtidos, observou-se que todos os animais dos grupos experimentalmente infectados apresentaram redução do número de linfócitos aos 7 dias pós- infecção (figura 18), evidenciando imunossupressão induzida pelo T. cruzi.

Parasitos protozoários são altamente adaptados para escapar dos efeitos da imunidade humoral e celular, sendo um dos principais mecanismos de evasão do T. cruzi, a anergia de células T (SILVA et al., 1998 ‘citado por’ PEREIRA, 2003) e aumento da apoptose linfocitária (BRENER e GAZZINELLI, 1997) levando à imunossupressão. De acordo com Curoto de Lafaille et al. (1990), a intensa imunossupressão presente na fase aguda da infecção é característica da infecção pelo T. cruzi, com recuperação parcial no início da fase crônica.

No presente trabalho, após o período inicial de imunossupressão característico da infecção, apenas o grupo pré-tratado com bioterápico (Bai) apresentou aumento significativo no número de linfócitos (p<0,05) ao longo do curso da infecção, até 42 dias p.i., (Figura 18 e 19) assim como significativo aumento no número de neutrófilos (p<0,05) (Figuras 20 e 21). Os valores médios absolutos de neutrófilos dos animais de todos os grupos infectados tenderam a um declínio no período entre dia 0 e 7 p.i. com exceção do grupo Bai o qual aumentou significativamente (p<0,05). No grupo Controle, observou-se redução significativa no número de neutrófilos até os 42 dias p.i. (p<0,05).

Tais resultados sugerem efeito imunomodulador associado à administração prévia do bioterápico (Bai), com ação sobre a imunidade inata e adquirida na fase aguda da infecção, uma vez que foi observado melhor cont role da parasitemia, ou seja, melhor resistência à infecção, assim como menor taxa de mortalidade em relação ao grupo Controle. Aos 42 dias p.i., quando não mais se detectava parasitemia patente, observou-se que Bai apresentou número de linfócitos significativamente mais elevado (p<0,05), em relação ao Controle (Figura 19), entretanto, apesar da intensa ativação linfocitária, pode ser sugerido possível efeito imunomodulador, determinando balanço Th1/Th2, visto que, a análise histológica de músculo cardíaco aos 42 dias p.i. revela que 71,4 % dos animais do grupo Bai não mais apresentavam alteração inflamatória, enquanto todos os animais do grupo controle ainda apresentavam lesões, embora discretas. Mais experimentos são necessários para elucidar os possíveis mecanismos imunomoduladores que os bioterápicos possam determinar na infecção pelo T. cruzi, principalmente em relação ao balanço Th1/Th2 e, conseqüentemente, ao equilíbrio entre a produção de citocinas pró e antiinflamatórias, visto que, na fase aguda da infecção são necessários mediadores da inflamação e ativação de linfócitos B para controle da parasitemia, entretanto, na fase crônica é necessário “frear” tais mecanismos, evitando assim lesões teciduais imunomediadas. A resposta imune no princípio da infecção visa redução e controle da multiplicação do parasito, além do preparo e otimização do sistema imune para gerar a resposta imune adquirida Th1 (REIS e LOPES, 2000), entretanto, na fase crônica da infecção chagásica, este perfil de citocinas (Th1) tem sido associado à cronificação da inflamação (FRESNO et al., 1997; BAHIA-OLIVEIRA et al., 1998; DOS SANTOS et al., 2001, GOMES et al., 2003 ‘citados por’ MARINO, 2005).

Estudos realizados relatam que antígenos homeopáticos (ultradiluídos) podem “transferir sinais” ao sistema imune, modulando assim sua resposta quando o organismo for exposto ao respectivo antígeno (BASTIDE, 1994; JONAS, 2000; MACHADO, 2003). Bastide e Boudard (1995) propuseram um novo conceito de imunomodulação, baseado em uma nova habilidade de resposta do organismo, ao invés de novas moléculas. De acordo

43

com os autores, visto que o sistema imune é submetido à complexa rede de interações celulares e moleculares, é possível que o aspecto qualitativo possa ser mais importante que o quantitativo, e que uma simples “informação” de um imunomediador possa ser ‘entendida’ pelo organismo.

As relações parasito / hospedeiro, na infecção de vertebrados pelo T. cruzi, são caracterizadas pela multiplicação intracelular e evolução das formas parasitárias, pelas alterações das células parasitadas e pela resposta imunológica, com o seu componente inflamatório. Mecanismos celulares inatos exercem efeito protetor, o qual antecede o aparecimento de anticorpos (BRENER et al., 2000). Posteriormente, ao longo da fase aguda da infecção, mecanismos inatos e adquiridos podem cooperar entre si para determinar a proteção do hospedeiro (PLATA et al., 1987).

Os mesmos efeitos não foram observados quando o bioterápico foi empregado após a infecção experimental (Bpi). De acordo com Janeway et al. (2002), a modulação do sistema imune pode ser empregada para inibir as respostas imunopatológicas a agentes infecciosos, entretanto, é mais efetivo prevenir uma reposta imunopatogênica, do que tratar uma resposta já estabelecida.

Em relação ao número de monócitos, houve um aumento significativo no grupo Phosphorus no período de 0 a 42 dias p.i. (p<0,05) (Figura 22). Nos demais grupos, não houve diferença significativa em relação a esse tipo celular.

Embora os monócitos sejam células hospedeiras de alta afinidade para a multiplicação do T. cruzi, os macrófagos têm sido considerados elemento-chave no controle do parasita, desde que ativados (HOFF, 1975 ‘citado por’ JORGE e CASTRO, 2000), apresentando papel decisivo na multiplicação parasitária (MONTÈON et al., 1996 ‘citado por’ JORGE e CASTRO 2000).

A redução significativa no número de linfócitos observada no grupo Phosphorus aos 42 dias p.i. (p<0,05) (Figuras 18 e 19) pode estar associada às elevadas parasitemias observadas neste grupo na fase aguda da infecção. A produção excessiva de óxido nítrico (NO) por macrófagos no curso da infecção por T. cruzi apresenta efeito supressivo sobre células T. (ABRAHAMSHON e COFFMAN 1995). Entretanto, na fase crônica da infecção, a redução da população de linfócitos pode ser importante prevenindo lesões imunomediadas. Pereira et al. (2005) estudaram os efeitos do medicamento homeopático Canova na infecção por Leishmanina amazonensis in vitro e in vivo e observaram aumento significativo na produção de óxido nítrico, sugerindo que o tratamento homeopático teve efeito sobre a ativação de macrófagos.

44

Leucometria global

0

5

10

15

20

25

0 7 14 42

dias após infeccção

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

leuc

ócito

s /

mm

3 de

sang

ue

BAIBPIPPIPlaceboControle

*

Fig. 17. Variação dos postos médios (Mean Rank) do número de leucócitos, entre os grupos de tratamento, após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test

Linfócitos

0

5

10

15

20

Bai Bpi Phos Controle s / infec.Pos

to m

édio

s do

nº

de li

nfóc

itos

/ mm

3 d

e sa

ngue

0

7

14

42 dias PI

* * **

Fig 18. Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de linfócitos, entre dias após infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.

45

Linfócitos

0

5

10

15

20

25

0 7 14 42dias pós-infecção

Pos

to m

édio

s do

nº

de

linfó

cito

s / m

m3 de

san

gue

BaiBpiPhosphorusControles / infec.

*

Fig 19. Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de linfócitos, entre os grupos de tratamento, após infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.

Neutrófilos

02

4

6

8

10

1214

16

Bai Bpi Phos Controle s/ infec.Pos

tos

méd

ios

do n

º de

neu

trófil

os

/ mm

3 de

sang

ue

0

7

14

42 dias PI

** *

Fig 20. Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de neutrófilos, entre dias após infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.

46

Neutrófilos

0

5

10

15

20

25

0 7 14 42dias após infecção

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

neut

rófil

os /

mm

3 de

sang

ue

Bai

Bpi

Phos

Controle

s/ infec.

*

Fig 21. Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de neutrófilos, entre os grupos de tratamento, após infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.

Monócitos

0

2

4

6

8

1012

14

16

BAI BPI Phos Controle s/ infec.Pos

tos

méd

ios

do n

º de

mon

ócito

s

/ mm

3 de

sang

ue

0

7

14

42 dias PI

*

Fig 22. Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de monócitos, entre dias, após infecção experimental por T. cruzi, em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.

47

Monócitos

02468

1012141618

0 7 14 42

dias após infecção

Pos

tos

méd

ios

do n

º de

mon

ócito

s / m

m3 de

sang

ue BaiBpi

Phosphorus

Controle

S / infec.

*

Fig 23. Variação dos postos médios (Mean Rank) dos valores absolutos de monócitos entre os grupos de tratamento após infecção experimental por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus após infecção, tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e controle não infetado (s/ infec.). Kruskal-Wallis Test.

48

4.2.5 Avaliações histopatológicas Com objetivo avaliar a patogênese da infecção por T. cruzi em camundongos tratados com bioterápico antes e após infecção (Bai e Bpi, respectivamente), tratados com Phosphorus pós-infecção (Phosphorus), tratados com soro fisiológico antes e após infecção (Controle) e em camundongos controle não infectados (s/ infec.), foi conduzido estudo histopatológico aos 0, 7, 14 e 42 dias pós- infecção. As lesões inflamatórias observadas durante as fases agudas e crônicas foram classificadas como: infiltrado inflamatório mononuclear discreto, de caráter focal; infiltrado inflamatório mononuclear moderado, de caráter confluente; infiltrado inflamatório mononuclear intenso, de caráter difuso e, sem alterações.

A inflamação é o processo patológico básico da Doença de Chagas, ocorrendo dois tipos de reação associada ao T. cruzi: reação focal – parasito dependente, que surge aonde ocorre multiplicação do parasita, causando ruptura da célula parasitada; reação difusa, que ocorre apenas no miocárdio, durante as fases aguda e crônica da infecção (BRENER et al. 2000).

No presente trabalho observou-se que as características das lesões nos tecidos do hospedeiro não variaram qualitativamente, ou seja, em geral, as lesões foram de caráter inflamatório com predominância de células mononucleares. Músculo cardíaco (Tabela 11, Figura 24))

Aos 07 dias pós- infecção, a análise de cortes histológicos de músculo cardíacos dos animais pertencentes aos grupos experimentais não revelou nenhuma alteração de caráter inflamatório.

Aos 14 dias pós- infecção, quando ainda se detectava parasitemia patente nos animais infectados, observou-se que, em geral, o grupo Phosphorus apresentou maior número de animais com lesões intensas, seguido do grupo Controle, enquanto os animais do grupo Bai apresentavam lesões discretas. Aos 42 dias pós- infecção, já eram observados animais sem qualquer alteração inflamatória cardíaca, sendo estes em maior número em Bai (71,4%), seguido de Bpi (60%) e Phosphorus (25%), enquanto todos os animais do grupo controle ainda apresentavam lesões inflamatórias, embora discretas, sugerindo a cronificação do processo inflamatório neste grupo. Tal observação pode ser associada aos maiores títulos de IgG observados neste grupo, aos 42 dias p.i. (p<0,05). De acordo com JANEWAY (2002), os complexos imunes são produzidos em todas as respostas de anticorpos, devendo ser removidos da circulação pelo sistema fagocítico mononuclear (SFM), sendo seu potencial patogênico associado à ativação leucocitária e conseqüente lesão tecidual. Assim, uma vez que a diátese sifilínica, a qual é associada à patogenia da infecção por T. cruzi, é caracterizada por comprometimento do SFM (CARILLO Jr. 2000), o tratamento diatésico com o medicamento Phosphorus pode ter determinado melhor re-organização da resposta celular a este nível, refletindo na regressão das lesões e na ausência de mortalidade, observada neste grupo. Sugere-se assim, efeito do referido tratamento sobre a patogenia da infecção.

Músculo esquelético (Tabela 12, Figura 25)

Aos 7 dias pós-infecção, não observou-se nenhuma alteração em músculo esquelético dos animais pertencentes aos grupos experimentais.

Aos 14 dias pós- infecção, 75, 75, 25 50% dos animais dos grupos Bai, Bpi, Phosphorus e Controle apresentaram, respectivamente, lesões inflamatórias focais discretas; 0, 25, 50 e 25% dos animais dos respectivos grupos apresentaram lesões inflamatórias de caráter moderado (miosite moderada); 25% dos animais dos grupos Phosphorus apresentaram lesões inflamatórias difusas intensas (miosite difusa intensa) e 25% dos animais dos grupos Controle e Bai não apresentaram nenhuma alteração inflamatória.

49

Aos 42 dias pós- infecção, observou-se que 43; 60; 57 e 25% dos animais dos grupos Bai, Bpi, Phosphorus e Controle, respectivamente, apresentavam miosite focal discreta, 29; 0; 14 e 50% dos animais dos respectivos grupos apresentavam miosite moderada, enquanto 29; 40; 29 e 0%, respectivamente, não apresentavam nenhuma alteração inflamatória. Neste período, 25% dos animais do grupo Controle apresentavam miosite intensa de caráter difuso.

Apesar da maior intensidade das lesões em músculo esquelético, observadas, em geral, no grupo Phosphorus aos 14 dias p.i., aos 42 dias pós- infecção, lesões intensas eram ainda observadas no grupo Controle, enquanto em Bai, Bpi e Phosphorus já eram observados animais sem qualquer alteração, sugerindo, mais uma vez, a cronificação do processo no grupo Controle. Fígado (Tabela 15, Figura 26)

As lesões hepáticas observadas foram representadas por áreas de inflamação no parênquima e nos espaço-porta (infiltrado inflamatório mononuclear).

Aos 7 dias pós- infecção, 25% dos animais do grupo Phosphorus apresentavam infiltrado inflamatório discreto no parênquima hepático. Infiltrado inflamatório de caráter moderado foi notado em 75, 100, 75 e 100% dos animais dos grupos Bai, Bpi, Phosphorus e Controle, respectivamente. Não foram observadas alterações em 25% dos animais do grupo Bai. Aos 14 dias p.i., 100; 100; 50 e 100% dos animais dos grupos Bai, Bpi, Phosphorus e Controle apresentavam infiltrado inflamatório intenso. No grupo Phosphorus, 50% dos animais apresentavam hepatite moderada.

Aos 42 dias p.i., 100% dos animais dos grupos Bai, Bpi e Phosphorus apresentavam infiltrado inflamatório discreto, enquanto no grupo Controle, 60% dos animais tinham infiltrado discreto e 40% moderado.

Intestino grosso (Tabela 13, Figura 27)

As lesões inflamatórias observadas na camada muscular do intestino grosso apresentavam caráter focal, associadas à destruição de fibras, variando apenas em intensidade.

Aos 7 dias pós-infecção, fragmentos de intestino grosso dos animais pertencentes aos grupos experimentais revelaram que 25 e 33 % dos animais dos grupos Phosphorus e Controle, respectivamente, apresentavam alterações inflamatórias focais discretas. Nos demais grupos experimentais não foram observadas alterações.

Aos 14 dias pós-infecção, observou-se que 100, 100 e 25 % dos animais dos grupos Bai, Bpi e Placebo, apresentavam, respectivamente, lesões inflamatórias moderadas na, enquanto, 100 e 75% dos animais dos grupos Phosphorus e Controle, lesões inflamatórias intensas.

Aos 42 dias p.i., notou-se que 43 e 57 %; 0 e 20%; 57 e 13% dos animais dos grupos Bai, Bpi, e Phosphorus exibiam lesões inflamatórias discretas e moderadas na muscular do órgão, respectivamente. Foram observadas lesões inflamatórias intensas em 80; 88 e 100% dos animais dos grupos Bpi, Phosphorus e Controle, respectivamente.

Intestino delgado (Tabela 14).

As lesões inflamatórias observadas na camada muscular do intestino delgado apresentavam caráter focal, associadas à destruição de fibras, variando apenas em intensidade.

Aos 7 dias pós- infecção, a análise de fragmentos de intestino delgado revelou que 25 % dos animais do grupo Phosphorus tinham lesões inflamatórias discretas, enquanto nos demais grupos experimentais não foram observadas alterações.

50

Aos 14 dias pós- infecção, verifica-se que 50 e 100% dos animais dos grupos Bpi e Controle apresentavam infiltrado inflamatório moderado, enquanto 100; 50 e 100% dos animais dos grupos Bai, Bpi e Phosphorus, infiltrado inflamatório intenso, respectivamente.

Aos 42 dias p.i., observou-se que 57; 71 e 50% dos animais dos grupos Bai, Phosphorus e Controle, respectivamente, não apresentavam alterações. Infiltrado inflamatório de caráter moderado foi observado em 43; 60; 14 e 50% dos animais dos grupos Bai, Bpi, Phosphorus e Controle, respectivamente, enquanto de grande intensidade foi encontrado em 40% dos animais do grupo Bpi. Rins

Fragmentos renais de animais infectados por T. cruzi e submetidos a tratamento com homeopatia e soro fisiológico não revelaram nenhuma alteração.

De acordo com os resultados obtidos à avaliação histopatológica observou-se em

músculo cardíaco e esquelético que, em geral, aos 14 dias pós- infecção, Bai apresentou lesões de menor intensidade, em relação aos demais grupos. As lesões mais intensas, conforme relatado, foram observadas no grupo Phosphorus. Segundo BOUNAN (1989), as doenças infecciosas resultam da penetração de um agente infeccioso, quer natural ou experimentalmente, e de um ‘terreno mórbido’ ou ‘diátese’ ou ‘pré-disposição’, o qual determinará os ‘mecanismos reacionais’ responsáveis pelas manifestações clínicas com significado para a semiologia médica, porém, qualificados por características genéticas, história patológica pregressa do indivíduo, além de fatores ambientais. A partir daí tem-se como possibilidades terapêuticas: a destruição do agente microbiano (terapia anti- infeciosa) e/ ou a correção do ‘terreno mórbido’. Em relação à importância da diátese no curso de um quadro infeccioso tem-se: 1. a infecção propriamente dita, ou seja, à predisposição à infecção, visto que mesmo sob condições idênticas alguns indivíduos escapam de uma infecção; 2. A evolução da infecção, a qual dependente do processo reacional, determinado pela diátese, caracterizando a intensidade de certas fases do processo reacional, assim como os aspectos lesionais associados. De acordo com o autor, durante a manifestação de insuficiência dos mecanismos defensivos, o tratamento homeopático da diátese permite amplificar o processo reacional no momento de sua expressão clínica (agravação) possibilitando a regressão das lesões. No presente trabalho, a menor intensidade de lesões inflamatórias observadas em Bai sugere, mais uma vez, efeito imunomodulador associado ao tratamento, com melhor controle de respostas imunopatológicas na fase crônica da infecção.

51

Figura 24. Aspectos microscópicos de músculo cardíaco de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. 14 dias p.i. (a) Grupo Bai. Miocardite multifocal coalescente moderada mononuclear (seta) (H.E. obj. 40x.). (b) Grupo Bpi. Miocardite multifocal coalescente moderada mononuclear (seta) (H.E. obj. 40x.). (c) Grupo Phosphorus. Miocardite intensa mononuclear em torno de pseudocisto de T. cruzi (seta) (H.E. obj. 40x.). (d) Grupo Controle. Miocardite difusa intensa mononuclear (seta) (H.E. obj. 10x.).

c d

a b

52

Figura 25. Aspectos microscópicos de músculo esquelético de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. 42 dias p.i. (a) Grupo Bai. Miosite moderada multifocal coalescente mononuclear (seta) (H.E. obj. 40x.). (b) Grupo Phosphorus. Miosite focal discreta mononuclear em torno de pseudocisto de T. cruzi (seta) (H.E. obj. 40x.). (c) Grupo Controle. Miosite difusa intensa mononuclear; (c’) hialinização da parede vascular associada a infiltrado mononuclear (seta) (H.E. obj. 40x.).

a b

c c’

a b

53

Figura 26. Aspectos microscópicos de fígado de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. Fase crônica da infecção, 42 dias p.i. (a) Grupo Bai. Hepatite multifocal mononuclear intensa (H.E. obj. 40x.). (b) Grupo Bbi. Hepatite multifocal mononuclear intensa (H.E. obj. 40x.). (c) Grupo Phosphorus. Hepatite multifocal mononuclear moderada (H.E. obj. 40x.). (d) Grupo Controle. Hepatite difusa mononuclear intensa (H.E. obj. 40x.).

c d

54

Figura 27. Aspectos microscópicos de intestino grosso de camundongos C57BL/6 infectados com T. cruzi, cepa Y. Fase crônica da infecção, 42 dias p.i. (a) Grupo Bai. Infiltrado inflamatório coalescente mononuclear moderado, camada muscular (H.E. obj. 40x.). (b) Grupo Bbi. Infiltrado inflamatório difuso mononuclear intenso, camada muscular (H.E. obj. 40x.). (c) Grupo Phosphorus. Infiltrado inflamatório difuso mononuclear intenso, camada muscular (H.E. obj. 40x.). (d) Grupo Controle. Infiltrado inflamatório difuso mononuclear intenso, camada muscular (H.E. obj. 40x.).

d c

a b

55

Tabela 11. Percentual de lesões inflamatórias no músculo cardíaco, em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, soro fisiológico e controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção. Dias p.i.

Bai

Bpi

Phosphorus

Controle

s/ infec.

Infiltrado inflamatório

Discreto 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Moderado 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

7 dias

s/ alterações 100,0 100,0 100,0 100,0 100

Discreto 25 0,0 0,0 0,0 0,0 Moderado 75 100 50 50 0,0 Intenso 0,0 0,0 50 25 0,0

14 dias

s/ alterações 0,0 0,0 0,0 25 100

Discreto 28,6 20 75 100 0,0 Moderado 0,0 20 0,0 0,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

42 dias

s/ alterações 71,4 60,0 25,0 0,0 100

Tabela 12. Percentual de lesões inflamatórias em músculo esquelético, em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, soro fisiológico e controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção. Dias p.i.

Bai

Bpi

Phosphorus

Controle

s/ infec.

Infiltrado inflamatório

Discreto 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Moderado 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

7 dias

s/ alterações 100,0 100,0 100,0 100,0 100

Discreto 75 75,0 25,0 50,0 0,0 Moderado 0,0 25,0 50 25,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 25,0 0,0 0,0

14 dias

s/ alterações 25,0 0,0 0,0 25,0 100

Discreto 42,9 60,0 57,1 25,0 0,0 Moderado 28,6 0,0 14,3 50,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 25,0 0,0

42 dias

s/ alterações 28,6 40,0 28,6 0,0 100

56

Tabela 13. Percentual de lesões inflamatórias em intestino grosso, em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, soro fisiológico e controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção. Dias p.i.

Bai

Bpi

Phosphorus

Controle

s/ infec.

Infiltrado inflamatório

Discreto 0,0 0,0 25,0 33,3 0,0 Moderado 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

7 dias

s/ alterações 100,0 100,0 75,0 66,7 100

Discreto 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Moderado 100,0 100,0 00 25,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 100,0 75,0 0,0

14 dias

s/ alterações 0,0 0,0 0,0 0,0 100

Discreto 42,9 0,0 0,0 0,0 0,0 Moderado 57,1 20,0 12,5 0,0 0,0 Intenso 0,0 80,0 87,5 100,0 0,0

42 dias

s/ alterações 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

Tabela 14. Percentual de lesões inflamatórias em intestino delgado, em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, soro fisiológico e controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção. Dias p.i.

Bai

Bpi

Phosphorus

Controle

s/ infec.

Infiltrado inflamatório

Discreto 0,0 0,0 25,0 0,0 0,0 Moderado 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

7 dias

s/ alterações 100,0 100,0 75,0 100,0 100,0

Discreto 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Moderado 0,0 50,0 0,0 100,0 0,0 Intenso 100,0 50,0 100,0 0,0 0,0

14 dias

s/ alterações 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

Discreto 0,0 0,0 14,3 0,0 0,0 Moderado 42,9 60,0 14,3 50,0 0,0 Intenso 0,0 40,0 0,0 0,0 0,0

42 dias

s/ alterações 57,1 0,0 71,4 50,0 100,0

57

Tabela 15. Percentual de lesões inflamatórias em fígado, em camundongos experimentalmente infectados por T. cruzi e tratados com homeopatia, soro fisiológico e controle não infectado, nas fases aguda e crônica da infecção. Dias p.i.

Bai

Bpi

Phosphorus

Controle

s/ infec.

Infiltrado inflamatório

Discreto 0,0 0,0 25,0 0,0 0,0 Moderado 75,0 100,0 75,0 100,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

7 dias

s/ alterações 25,0 0,0 0,0 0,0 100,0

Discreto 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Moderado 0,0 0,0 50,0 0,0 0,0 Intenso 100,0 100,0 50,0 100,0 0,0

14 dias

s/ alterações 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

Discreto 100,0 100,0 100,0 60,0 0,0 Moderado 0,0 0,0 0,0 40,0 0,0 Intenso 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

42 dias

s/ alterações 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

58

5 CONCLUSÕES

• Não foram observados efeitos profiláticos e/ou terapêuticos decorrentes da administração de bioterápico ultradiluído preparado a partir de sangue infectado, quando foi empregado modelo experimental de elevada virulência e curso agudo, infecção experimental de camundongos por Trypanosoma evansi.

• O tratamento com bioterápico antes e após imunização de camundongos com extrato de T.

evansi determinou efeito imunomodulador. • Correspondendo à imagem clínica e repertorial da infecção por T. cruzi, no homem e no

modelo murino, o medicamento Phosphorus demonstrou ser o que melhor caracteriza a enfermidade.

• O tratamento com bioterápico T. cruzi 12 DH, previamente à infecção experimental por T.

cruzi, determinou efeito imunomodulador. • O medicamento homeopático Phosphorus apresentou efeito sobre a patogenia da infecção

por T. cruzi.

59

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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