Pedro F. Del Peloso

Uma tarde com a microbiologia clínica

área do laboratório de microbiologia,

equipamentos e as legislações vigentes

Louis Pasteur 1885

1905

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https://www.youtube.com/watch?v=8KiR-

cxZE4w#t=273

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Biossegurança

Conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir

ou eliminar os riscos inerentes as atividades que possam

comprometer a saúde humana, animal ou vegetal e ao meio

ambiente

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Classe 2 Classe 3

Classe 4

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O PAPEL DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA E A

IMPORTÂNCIA DA COLETA DE AMOSTRAS

Coleta de Amostras

Resultados / Correlação Clínica / Avaliação Médica

/ Tratamento

Programas de Controle de

Infecção Hospitalar/Vigilân

cia de Microrganismos

Isolamento rápido, Identificação e Teste de Sensibilidade de

microrganismos envolvidos em

processos infecciosos

LABORATÓRIO DE

MICROBIOLOGIA

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CONSIDERAÇÕES GERAIS

- Os resultados obtidos no Laboratório de Microbiologia dependem diretamente da qualidade da amostra clínica colhida e de um correto acondicionamento e transporte;

- O material obtido deve ser representativo do processo infeccioso;

- Durante a coleta deve ser evitada a contaminação com a microbiota normal de áreas adjacentes;

- Sempre que possível colher a amostra antes do uso de antimicrobianos;

- Fornecer ao paciente instruções claras sobre os procedimentos de coleta;

- Utilizar material de coleta estéril e realizar as práticas de anti-sepsia antes de iniciar a coleta;

- Colher volumes suficientes das amostras. Quantidades inadequadas podem levar a resultados falso-negativos;

- Identificar corretamente todas as amostras colhidas;

- Transportar as amostras colhidas imediatamente ao laboratório ou utilizar alternativas para o acondicionamento de amostras.

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REQUISIÇÃO DE EXAMES

E IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS

Requisição de Exames

1. Nome do Paciente

2. Sexo; Idade

3. Localização do Paciente

4. Nome do Médico e Contato

5. Tipo de Amostra e Topografia da Coleta

6. Data e Hora da Coleta

7. Diagnóstico Clínico/Hipótese Diagnóstica

8. Observações da Coleta

9. Antibioticoterapia Prévia

Identificação da Amostra

Nome do Paciente:

Leito/Setor:

Data e Hora:

Amostra: 41

CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO DE AMOSTRAS

Amostras não recomendáveis para serem processadas:

- Amostras com erros de identificação ou discrepantes em relação ao pedido médico;

- Amostras obtidas em frascos não estéreis;

- Amostras acondicionadas ou transportadas de forma inadequada;

- Urinas colhidas em um tempo superior a 24 horas ou sem acondicionamento adequado;

- Ponta de Cateter de Foley;

- Swabs secos;

- Material fixado em Formol;

- Um único swab para vários exames;

- Cultura para anaeróbios colhidas inadequadamente;

- Vômito

- Amostras de colostomia;

- Swabs de úlcera de decúbito e de queimaduras. 42

TRANSPORTE DE AMOSTRAS

. Todo o material deve ser transportado o mais rapidamente

possível ao laboratório.

Objetivos principais de um correto transporte de amostras:

Garantir a viabilidade dos microrganismos;

Evitar a atividade bactericida de substâncias utilizadas durante a coleta;

Garantir resultados mais fidedignos, principalmente nas culturas quantitativas.

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HEMOCULTURAS

Cada instituição deve estabelecer seu próprio protocolo de coleta de sangue para hemocultura, variando em função do sistema de cultivo utilizado (manual, automatizado), além de fatores como idade e condição clínica do paciente.

Número de Amostras e Intervalo de Coleta:

Sepse Aguda: 2 a 3 amostras de sítios anatômicos diferentes.

Endocardite Aguda: 3 amostras através de coleta distintas e, preferencialmente em braços diferentes, com intervalo mínimo de 15 minutos entre elas.

Endocardite Sub-Aguda: 3 amostras em intervalos de, no mínimo, 15 minutos. Se negativas em até 24 horas, colher mais 3 amostras.

Febre de Origem Desconhecida: Obter 2 amostras em um intervalo de, no mínimo, 1 hora. Se negativas em 24-36 horas, repetir mais 2 amostras no intervalo de no mínimo 1 hora.

Fungemia: Obter 2 amostras com intervalo mínimo de 15 minutos.

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HEMOCULTURAS

Volume da Amostra:

Em geral, o volume corresponde a 10% do volume total do frasco utilizado para a coleta. A proporção entre o volume de sangue coletado e meio de cultura deve ser obedecida para não acarretar resultados falso-negativos ou falso-positivos.

Exemplificação:

* Crianças: 1 a 4 ml por frasco colhido

* Adultos: 5 a 10 ml por frasco colhido

O sangue para Hemoculturas pode ser venoso, arterial ou ainda colhido através de cateter quando assim for solicitado pelo médico.

As amostras de sangue destinadas à Hemocultura devem ser colhidas antes das

amostras destinadas aos outros setore e exames. A coleta não pode ser realizada com serigas heparinizadas.

Antes de iniciar a coleta, ter em mãos todos os materiais a serem utilizados.

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HEMOCULTURAS

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PONTA DE CATETER INTRAVASCULAR

Tipos indicados para cultura: Central, Swan-Ganz, Periférico, Arterial; Umbilical, Hiperalimentação, CVP, Hickman, Broviac.

Procedimentos para retirada do cateter:

1) Fazer rigorosa anti-sepsia da pele ao redor do cateter

2) Remover o cateter, cortar assepticamente 5cm da porção distal transcutânea, ou seja, a que estava mais profundamente introduzida na pele;

3) Colocar a ponta obtida em frasco estéril;

4) Encaminhar ao laboratório imediatamente para que seja minimizado o ressecamento do cateter.

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TRATO RESPIRATÓRIO:

ESCARRO

- Instruir o paciente: escarro x saliva

- Lavar a boca (bochechar e gargarejar) com água ou salina antes de iniciar a coleta

- Expectoração espontânea ou indução ultrassônica

- Frasco estéril, boca larga, tampa de rosca

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TRATO RESPIRATÓRIO:

SECREÇÃO TRAQUEAL

- Este material não é recomendado para o diagnóstico etiológico de pneumonias hospitalares, uma vez que o resultado microbiológico de secreções traqueais pode indicar apenas a colonização microbiana local, dificultando a correlação clínica.

- A coleta é realizada pela equipe médica em pacientes entubados através de procedimentos de aspiração.

- Aspirado Transtraqueal: Objetiva-se evitar a contaminação da amostra com flora do trato respiratório superior.

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www.med.umich.edu 50

Métodos de Coleta

Mini-BAL

Cateter Protegido

Kimberly-Clark Corporation

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Culturas Quantitativas ?

O diagnóstico das PAV sempre foi cercado de incertezas pela falta de um padrão de referência.

Revisão: Amostras de BAL, Mini-BAL, Sec. Traqueal, métodos de quantificação usados, tipos de equipamentos e avaliação nos critérios de “cutoff”.

A quantificação de uma amostra respiratória, é inerentemente instável por uma perspectiva matemática, dada a variabilidade do volume instilado e re-aspirado e a complexidade da área a ser analisada. (BAL, Mini-Bal, Sec. Traqueal ?)

Nós predizemos que as culturas quantitativas serão olhadas um dia como uma tentativa curiosa mas mal sucedida no diagnóstico de PAV CID 2006:43 (Suppl 2) • Fujitani and Yu

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Sec. traqueal

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Mini-BAL 4x10e5 UFC/ml

Stenotrophomonas maltophilia

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Diretriz na Microbiologia

1) Preferência por cultura quantitativa

2) (BAL, Cat. Protegido e Mini-BAL)

3) Solicitar preenchimento adequado do pedido médico

4) Indicação Clínica (PAV ?, PH ?, Rastreamento de MDR ?, Cultura

de Vigilância ? Rastreamento de Infecção ?

5) Integração com CCIH e Médico assistente

6) Dados da Epidemiologia local

7) Análise crítica na tomada de decisão com o maior número de

informações possíveis sobre o paciente e amostra (idade, uso de

antibiótico, método de coleta, tempo de internação, doença de

base, condições da coleta, etc.

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TRATO RESPIRATÓRIO:

LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)

- Método mais fidedigno para o diagnóstico de pneumonias, realizado pela equipe médica;

- Cultura Quantitativa;

- O transporte ao laboratório deve ser feito em até 2 horas após a coleta;

- Colher em frasco estéril (Tubo de Lukens ou similar); destinar um frasco em separado para a Microbiologia;

- Evitar a presença de sangue obtendo o LBA antes de realizar biópsias ou escovados pulmonares

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LÍQUIDOS ORGÂNICOS ESTÉREIS

Liquido Pleural/Pericárdico/Sinovial/Ascítico

- A coleta destes materiais é feita por procedimento médico através de punção percutânea ou cirúrgica;

- Obter a amostra em tubo estéril, sem aditivos ou ainda inocular diretamente em frascos de hemoculturas;

- Devem ser obtidos volumes suficientes para todos os tipos de cultura solicitados.

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SECREÇÕES DE FERIDA,

ABSCESSOS E EXSUDATOS

Procedimentos para Amostragem de Feridas Profundas ou Abscessos:

1) Desinfetar a superfície da pele

2) Aspirar a porção mais profunda da lesão, evitando a contaminação com a superfície da ferida.

- Feridas superficiais: Limpar as adjacências ao sítio de coleta com soro fisiológico e gaze estéreis, obter material de camadas não expostas em swab contendo meio de cultura.

- Vesículas: Obter o fluido.

É dada preferência à coleta por aspiração em seringa no lugar de um swab.

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TECIDOS

-O meterial deve ser colhido pelo médico assistente através de aspirado ou fragmento de biópsia. Amostras em swabs não fornecem boa representatividade do material;

- A amostra deve ser obtida por procedimeto médico específico e colocada em frasco estéril contendo solução salina fisiológica (NaCl 0,85%) estéril.

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BIÓPSIAS DE PELE E TECIDO SUBCUTÂNEO

Materiais colhidos através de procedimentos médicos específicos.

1) Desinfetar a superfície da pele

2) Obter fragmentos de 3 a 4mm;

3) Enviar ao laboratório em frasco estéril. Não adicionar Formol.

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SECREÇÃO DE OUVIDO

- Infecções externas (otite externa): limpar o canal auditivo externo com salina estéril e obter a amostra com swab estéril com meio de transporte

- Infecções profundas (otite interna): amostra colhida por timpanocentese

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URINA

Considerações Gerais:

- Amostras de urina nunca devem ser coletadas a partir de coletores hospitalares (“comadres”);

- Antes da coleta deve ser feita uma limpeza com água e sabão neutro da região genital externa para evitar contaminação com microrganismos que colonizam a área;

- As amostras devem ser processadas em até duas horas após a coleta. Em caso de demora, refrigerar (2 - 8°C).

Tipos de Amostras de Urina:

- Micção espontânea;

- Urina colhida por cateter;

- Punção supra-púbica.

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COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS PARA ANAERÓBIOS

- A coleta de amostras para germes anaeróbios deve ser feita evitando-se a contaminação com a flora normal endógena;

- O transporte de amostras deverá ser imediato (crítico), garantindo a manutenção das condições ideais dos microrganismos e minimizando a perda de viabilidade dos mesmos;

- A solicitação de Cultura para Anaeróbios deve ser claramente explicitada na Requisição Médica;

- O tipo de amostra ideal é aquela obtida por aspiração com agulha e seringa ou de fragmentos possivelmente infectados;

- A coleta por swabs é desencorajada, pois o material poderá estar contaminado por organismos da pele ou mucosa, além da amostragem ser relativamente pequena e os swabs estarem sujeitos a ressecamentos;

- Para coletas com swab, utilizar meios de transporte específicos (ex: atmosfera pré-reduzida);

- O material obtido através de punção/aspiração poderá ser enviado na própria seringa (com retirada de ar residual e sem agulha) ou ainda transferido para o frasco de hemocultura automatizada com anaerobiose (neste caso, o volume da amostra deverá obedecer as especificações do sistema utilizado).

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TECIDOS

-O meterial deve ser colhido pelo médico assistente através de aspirado ou fragmento de biópsia. Amostras em swabs não fornecem boa representatividade do material;

- A amostra deve ser obtida por procedimeto médico específico e colocada em frasco estéril contendo solução salina fisiológica (NaCl 0,85%) estéril.

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Comitê Brasileiro de Testes de

Susceptibilidade Antimicrobiana

BrCast

SBPC: Sociedade Brasileira de Patologia Clínica

SBAC: Sociedade Brasileira de Análises

Clínicas SBI: Sociedade Brasileira de Infectologia SBM: Sociedade Brasileira de Microbiologia

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A COLORAÇÃO DE GRAM E SEUS PRINCIPAIS

ACHADOS CLÍNICOS

ASPECTOS GERAIS SOBRE A COLORAÇÃO DE GRAM

1884 – Hans Christian Gram;

Um dos procedimento mais utilizados no Laboratório de Microbiologia;

Técnica de coloração utilizada para detectar bactérias e fungos, evidenciando suas características morfo-tintoriais;

São utilizados 4 reagentes: Cristal Violeta, Lugol, Descorante, Safranina (ou Fucsina Básica);

Fundamento baseia-se na habilidade da parede celular bacteriana reter o corante cristal violeta durante o tratamento com solvente.

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IMPORTÂNCIA CLÍNICA

A coloração de Gram tem uma relação e efeito diretos no tratamento do paciente;

Achados na coloração de Gram de fluidos estéreis são critérios para uma possível internação do paciente;

A escolha terapêutica inicial de antimicrobianos é guiada pelos resultados do Gram

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FUNDAMENTOS

- As bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas coram de maneira diferente em função da estrutura de suas paredes celulares;

- Gram-Positivas e Leveduras coram roxo escuro;

- Gram-Negativas coram rosa.

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RELATO DOS RESULTADOS

Deve ser observada e relatada a presença de células, bactérias e leveduras;

Utilizar terminologia sistemático-descritiva para os resultados de Gram;

Não é possível determinar a espécie bacteriana somente pela coloração de Gram. A identificação do agente etiológico requer Cultura e provas bioquímicas.

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CONTROLE DE QUALIDADE

Preparar lâminas para controle que contenham microrganismos Gram-Positivos de Gram-Negativos;

Estabelecer uma freqüência para as rotinas de controle de acordo com a demanda de seu laboratório (recomendação: semanal).

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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS

Morfologias Básicas – Gram-Positivas:

COCOS: Bactérias esféricas; representam vários grupos de relevância clínica:

1) DIPLOCOCO: cocos aparecem aos pares; podem ter formato alongado;

2) CADEIA: cocos formam cadeias de comprimento variado; os fragmentos da cadeia podem parecer diplococos;

3) TÉTRADE: grupos de exatos 4 cocos; também chamados de grupamentos ou cachos;

4) GRUPAMENTOS: grupos de cocos de número variável.

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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS

Morfologias Básicas – Gram-Positivas:

BASTONETES OU BACILOS: Retangulares, variam de comprimento, espessura e intensidades na coloração. Há 4 formas clinicamente significativas:

1) LONGOS E FINOS;

2) LONGOS E ESPESSOS (podem formar cadeias);

3) COCOBACILOS (possuem características entre cocos e bacilos; são bastões curtos);

4) RAMIFICADOS (longos e estreitos, podem apresentar coloração falhada).

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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

Morfologias Básicas – Gram-Negativas:

COCOS: Esféricos, podem se apresentar como:

1) COCOS (não formam cadeias ou grupamentos);

2) DIPLOCOCOS (aos pares, podem ter formato de “rim”).

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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

BASTONETES: Forma retangular, variam em comprimento, espessura e na intensidade da coloração. Há 4 formas de relevância clínica:

1) LONGOS E ESPESSOS (a coloração geralmente é uniforme, podem aparecer em pequenas cadeias);

2) COCOBACILOS (são muito curtos e estreitos – não confundir com os cocos gram-negativos);

3) CURVADOS (curtos, estreitos e curvados, podem formar cadeias);

4) FUSIFORMES (longos e estreitos com extremidades pontudas);

5) ESPIRALADOS (longos, estreitos, com muitas curvas).

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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – LEVEDURAS

Esporos/Blastoconídios:

- Geralmente aparecem como brotamentos;

Pseudohifas:

- Aparecem como projeções alongadas das leveduras.

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Exemplo :TRATO RESPIRATÓRIO Bactérias Gram-Negativas

Haemophilus influenzae - Escarro

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URINA – Bactérias Gram-Positivas

Enterococcus faecalis 102

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ESwab – New Liquid Based Transport System for Microbiology

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Meio Cromogênico

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No Laboratório ......

Cef. 3ª g

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CIQ

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MRSA

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As Vantagens da Automação em Microbiologia

Conceito:

Automação (do latim Automatus, que significa mover-se por si) , é um sistema automático de controle pelo qual os mecanismos verificam seu próprio funcionamento, efetuando medições e introduzindo correções, sem a necessidade da interferência do homem.

Automação é a aplicação de técnicas computadorizadas ou mecânicas para diminuir o uso de mão-de-obra em qualquer processo, especialmente o uso de robôs nas linhas de produção. A automação diminui os custos e aumenta a velocidade da produção.

Também pode ser definida como um conjunto de técnicas que podem ser aplicadas sobre um processo objetivando torná-lo mais eficiente, ou seja maximizando a produção com menor consumo de energia, menor emissão de resíduos e melhores condições de segurança, tanto humana e material quanto das informações inerentes ao processo.

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E na Microbiologia ?

Semeadura

Bacterioscopias/BAAR

Incubação

Identificação e Teste de Sensibilidade

Hemoculturas

Culturas para Micobactérias

Culturas para Fungos

Diagnóstico Microbiológico

Correlação Clinica/Laboratorial

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Pilotar ou Conduzir ?

O termo pilotagem deve ser utilizado

quando a complexidade da condução é

maior.

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Gram

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Aerospray Gram™

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POLY STAINER 5300 automated system for Gram stain

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BAAR

Heating system for Ziehl-Neelsen hot

staining method

Auto Stainer, the heating function was

built in to fix sputum smear on a slide

automatically and to stain it with

heating. Temperature in the tray can be

controlled. Duration and level of

temperature can be preprogrammed. 126

BAAR

Using the new AFB-0010 with Rapid Modified

Auramine O (SDL), process time is reduced to two

minutes - fifteen seconds per test. This single slide

machine delivers quality and consistency for every test.

Counterstain quenches fluorescence of all non-acid fast

organisms and debris resulting in a cleaner field of

view. It is just as sensitive as other Auramine Stains.

127

Semeadura Primária

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Semeadura Primária

Frascos ≠

Alças ≠ calibres

Câmera interna

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Vários volumes

de rotina

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AccuPAS

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Identificação e Teste de Sensibilidade

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Identificação

Qual método usar?

Qual é o seu Perfil?

Tamanho laboratório

Recursos financeiros disponíveis

Perfil de atendimento (hospitalar, ambulatorial, apoio)

Recursos humanos

Expertise

Acurácia e relevância clínica (rotinas manuais e automatizadas)

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64 wells gives more tests for greater

accuracy.

VITEK® 2 Compact

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WalkAway® plus System

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Phoenix 100 Instrument

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MALDI-TOF

2002

ionização por dessorção a laser assistida por matriz

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1 hora !

2.000 espécies

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Custo ?? R$ 600.000,00

R$ 3,61

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Teste de Sensibilidade

Disco Difusão ou Microdiluição em Caldo

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Sistemas Automatizados e Semi-Automatizados

Os sistemas automatizados e semi-automatizados são aprovados pelo

FDA (EUA), baseados nas normas do CLSI (reprodutibilidade do

método >95%)

- O CLSI não recomenda nenhum sistema comercial

- Mas e o MIC ??

Gram-negative bacteremia and cefepime

28 d mortality, Cart-analysis

Prognostic and Outcome

Bhat et al, AAC 51:4390 (2007) 146

Vantagens

Painéis pré-definidos (Gram-negativos, Gram-positivos, Perfil Urinário)

Agilização de rotinas; redução das variáveis do método

Gerenciamento da rotina por software atualizado frente às normas do CLSI; Alertas; Customização

Screening de Resistência

Estatística Epidemiológica (Relatórios CCIH)

Gerenciamento de dados de CIQ

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Desvantagens:

Não pode ser considerada metodologia de referência

Falha na indicação de procedimentos prévios incorretos (microrganismos misturados; contaminações; erros técnicos);

Problemas no TSA de microrganismos fastidiosos (tempo e condições de crescimento)

Falta de acurácia em TSA para determinados microrganismos (P. aeruginosa, Acinetobacter spp, S. pneumoniae)

Necessidade de pessoal técnico especializado e com conhecimento avançado em Microbiologia

Falha na detecção de carbapenemases (KPC) marcador ERTA

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Detecção fenotípica de mecanismos de resistência

ESBL: Extended Spectrum Beta-Lactamase (Beta-lactamase de espectro ampliado - com

teste confirmartório)

Staphylococcus produtor de Beta-lactamase

MRSA: Methicilin (Oxacillin) Resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus

resistente à meticilina (oxacilina/cefoxitina)

VRE: Vancomycin Resistant Enterococci (Enterococcus resistente à vancomicina)

HLAR: High Level Aminoglycoside Resistance (altos níveis de resistência a

aminoglicosídeos) – Gentamicina: HLGR; Estreptomicina: HLSR

Altos níveis de resistência a macrolídeos em estreptococos (Efflux/MLSb)

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VITEK 2 Card - A unique concept in ID/AST •Designed to provide ID/AST results in as little as 5 to 8 hours. (2) •Reduced hands-on time, no additional reagents are required. •Optimised user safety as it is a closed disposable. •Maximum traceability provided with the pre-applied card barcodes. •Lightweight reduces disposable costs

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•A broad menu of current antimicrobials to meet your formulary needs for clinically significant pathogens of gram-negative bacteria, staphylococci, enterococci and beta-streptococci •Visual confirmation of biochemical and susceptibility results for added confidence •PROMPT™* or turbidity inoculation method supports workflow

flexibility •Fits any laboratory workflow by offering either manual or automated processing on the autoSCAN®-4 and WalkAway® systems •Testing both ID and AST in one panel with our Combo format reduces workload •ID-only and MIC-only formats offer testing choice •Room temperature stability with 1-year shelf-life provides convenient storage •Offers extensive identification coverage of clinically significant gram-negative and gram-positive bacterial pathogens •ESBL confirmation on most gram negative panels

WalkAway® plus System

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Real MIC for 14 to 21 Drugs per Panel

Novo Painel 2013 – 8 diluições

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Hemoculturas

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Principais Vantagens:

- Padronização do método

- Maior sensibilidade

- Rapidez na detecção

- Monitoramento contínuo

- Protocolo menor (5 dias)

- Coleta com antibioticoterapia em curso

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Porinas - Efluxo Ativo - Enzima

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Obrigado !!

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