UNIVERDIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS … · viabilidade celular e produção de ROS de células tronco mesenquimais Marcos Fernando Xisto Braga Cavalcanti Orientador: Prof

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UNIVERDIDADE CRUZEIRO DO SUL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

DOUTORADO EM ODONTOLOGIA

Avaliação dos efeitos do laser de baixa intensidade na

viabilidade celular e produção de ROS de células

tronco mesenquimais

Marcos Fernando Xisto Braga Cavalcanti

Orientador: Prof. Dr. Lúcio Frigo

Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia

SÃO PAULO

2015

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA CENTRAL DA

UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL

C366a

Cavalcanti, Marcos Fernando Xisto Braga.

Avaliação dos efeitos do laser de baixa intensidade na viabilidade celular e produção de ROS de células tronco mesenquimais / Marcos Fernando Xisto Braga Cavalcanti. -- São Paulo; SP: [s.n], 2015.

89 p. : il. ; 30 cm.

Orientador: Lúcio Frigo.

tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul.

1. Odontologia - Células-tronco mesenquimais 2. Terapia a laser de baixa intensidade 3. Células de medula óssea 4. Laser (Odontologia) 5. Radicais livres. I. Frigo, Lúcio. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.

CDU: 616.314:602.9(043.3)

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UNIVERDIDADE CRUZEIRO DO SUL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

Avaliação dos efeitos do laser de baixa intensidade na

viabilidade celular e produção de ROS de células

tronco mesenquimais

Marcos Fernando Xisto Braga Cavalcanti

Tese de doutorado defendida e aprovada

pela Banca Examinadora em xx/xx/2015.

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr. Lúcio Frigo

Universidade Cruzeiro do Sul

Presidente

Prof. Dr. Rodrigo Alvares Brandão Lopes-Martins

Universidade Mogi das Cruzes

Profa. Dra. Luciane Teixeira Soares

Universidade Paulista

Prof. Dr. Mauricio Teixeira Duarte


Prof. Dr. Pedro Antonio Fernandes

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DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho a minha esposa

Janaina Cruz Braga Cavalcanti e filho

Pedro Cruz Braga Cavalcanti, e a meus

pais Neusa Xisto Braga Cavalcanti e

Acyr Braga Cavalcanti (in memorian),

“A família é o berço de tudo!”

7

Veni, vidi, vinci!

Julio Cesar, 47aC

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AGRADECIMENTOS

À Deus, que produz todas as oportunidades cabendo somente a cada um de

nós saber reconhecê-las e aproveitá-las.

à CAPES, coordenadoria de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior pelo

apoio financeiro durante todo o curso de doutorado em odontologia realizado

na Universidade Cruzeiro do Sul, e especialmente durante o estágio sanduíche

realizado na Universitè de Lorraine, em Nancy, França.

À Universidade Cruzeiro do Sul, que viabilizou a realização desse trabalho.

Aos meus pais, que contribuíram decisivamente para minha formação, sempre

me incentivando e apoiando a busca pelo conhecimento.

Com amor a minha esposa Janaina e ao meu filho Pedro, que abdicaram do

contato com o restante da família e amigos para mudarem-se comigo para

outro país, outra gente, outros costumes, outra língua, e que mesmo tendo ido

comigo, lhes faltei diversas vezes durante a elaboração desse trabalho.

Aos meus parentes e amigos, de quem me afastei também durante esses

últimos meses devido à dedicação a esse trabalho.

Ao meu orientador e amigo, professor doutor Lúcio Frigo que participou

ativamente da elaboração dessa tese.

A todo o pessoal do Biopólo da Universitè de Lorraine, que me auxiliou na

execução dos experimentos, principalmente à Ghislene, Nasser, Brigitte,

Monique, a professora doutora Celine e especialmente a professora doutora

Natalia de Isla que me acompanhou durante todo estágio de doutorado.

Ao professor doutor Danilo Duarte ex pró-reitor da Universidade Cruzeiro do

Sul, ao professor doutor Jacques Magdalou do Biopólo, e aos professores e

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amigos Lúcio Frigo e Rodrigo Labat que contribuíram decisivamente para

viabilizar meu estágio de doutorado na Universitè de Lorraine.

Ao falecido professor doutor Eduardo Guedes-Pinto, mestre e amigo, que

contribuiu significativamente para que as portas da Universidade Cruzeiro do

Sul e da ortodontia se abrissem para mim e minha equipe.

Aos colegas e amigos, professores da equipe de ortodontia da Universidade

Cruzeiro do Sul, campus Liberdade, Professor Fabio Tieri e Professora Priscila

Seino pela inestimável ajuda, incentivo e apoio.

Aos meus alunos dos cursos de ortodontia e ortopedia dentofacial da

Universidade Cruzeiro do Sul pelo apoio e pela compreensão durante o período

que estive ausente devido ao meu estágio de doutorado na França.

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Cavalcanti MFXB. Avaliação dos efeitos do laser de baixa intensidade na

viabilidade celular e produção de ROS de células-tronco mesenquimais

[tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2015.

RESUMO

Foi realizado um amplo estudo do comportamento de diferentes tipos de

células-tronco mesenquimais adultas humanas, (hWJMSCs, hBMSCs,

hPDLSCs) frente à variação de diversos parâmetros de irradiação do laser de

baixa intensidade. Foram analisadas a variação do espectro, vermelho e infra

vermelho, a variação da densidade de potência e a variação da densidade de

energia em cada fonte de células-tronco. A viabilidade celular foi avaliada com

o teste de Alamar Blue, a concentração de ROS (radicais livres presentes no

citoplasma) foi avaliada com o teste da sonda de DHR (dihidrorodamina). Os

resultados mostraram que cada fonte de célula-tronco responde de forma

diferente aos estímulos do laser, de maneira geral, os comprimentos de onda

na faixa do infravermelho (830nm) apresentaram maior viabilidade celular que

os na faixa do vermelho(660nm), além disso, para cada fonte de células–tronco

pudemos encontrar uma potência, que se traduz no tempo de aplicação do

laser, que verificamos uma relação entre a densidade de energia aplicada

diretamente proporcional à viabilidade celular, e a concentração de ROS,

assim, para as hWJMSCs, obtivemos maior viabilidade celular com 100mW e

12J/ cm2, para as hBMSCs, obtivemos maior viabilidade celular com 50mW e

12J/ cm2, e para as hPDLSCs, obtivemos maior viabilidade celular com 30mW

e 12J/ cm2.

Palavras-chave: Célula-tronco, Laser terapia, Viabilidade Celular, Alamar Blue,

Dihidrorodamina, Radicais livres.

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Cavalcanti MFXB. Low level laser effects on cell viability and ROS production of mesenchymal stem cells [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2015.

ABSTRACT

Several parameters of low level laser were tested into three different sources of

human mesenchymal stem cells, (hWJMSCs, hBMSCs, hPDLSCs).

Wavelength (red and infrared), power and energy density variation were

evaluated for each source of stem cell. Cell viability was evaluated by Alamar

Blue test, free radicals were evaluated by DHR (dihidrorodamina). Results

showed different responses for each source of stem cell to laser stimuli, in

general, infrared wavelength (830nm) presented higher cell viability results than

red laser (660nm), besides, each cell type produced ROS and the cell viability

in a directly proportional way to the elevation of the energy density in a specific

power, related to the time of laser exposure, used, so, higher cell viability and

ROS values were obtained for hWJMSCs, 100mW at 12J/ cm2, for hBMSCs,

50mW at 12J/ cm2, and for hPDLSCs, 30mW at 12J/ cm2.

Keywords: Stem cell, Laser therapy, Cell Viability, Alamar blue,

Dihidrorodamin, Free radicals.

12

13

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Figura ilustrando átomo, núcleo e níveis de energia do elétron.

26

Figura 2 – Figura ilustrando absorção de energia pela matéria. 26

Figura 3 – Figura ilustrando reações atômicas de um fóton com um elétron.

28

Figura 4 – Figura ilustrando espectro de radiação eletromagnética. 29

Figura 5 – Figura ilustrando espectro de luz visível. 30

Figura 6 – Localização do espectro de luz visível dentro do espectro de

radiação eletromagnética. 30

Figura 7 – Figura ilustrando o esquema biomolecular do sítio de ligação do

oxigênio e do óxido nítrico no citocromo C (Huang YY et al., 2009). 34

Figura 8 – Figura ilustrando mórula com 16 células. 38

Figura 9 – Figura ilustrando blastocisto. 39

Figura 10 – Figura ilustrando aparelho Thera Lase, marca DMC, utilizado no

experimento. 55

Figura 11 – Figura ilustrando o experimento montado no interior da câmara de

fluxo laminar. 57

Figura 12 – Fotomicrografia com aumento de 20 vezes da cultura celular em P2

em garrafa de 75 ml, forma semelhante a fibroblastos, sendo pequenas,

alongadas, com formato fusiforme ou estreladas, com prolongamentos

citoplasmáticos. 63

14

Figura 13 – Fotomicrografia com aumento de 20 vezes da cultura celular em P3

em placa de 96 furos, forma semelhante a fibroblastos, sendo pequenas,

alongadas, com formato fusiforme ou estreladas, com prolongamentos

citoplasmáticos. 64

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Tempo exposição ao laser em segundos em função da

densidade de energia J/cm2 e da densidade de potência

mW. 59

16

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Gráfico mostrando a viabilidade celular das culturas de

células-tronco(hWJMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de

laser infravermelho 830nm, com 30, 50 e 100mW de

potência após a coloração com o Alamar Blue, indicando a

viabilidade celular, avaliação em função da densidade de

energia à esquerda e da potência à direita. 65


células-tronco(hWJMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de

laser vermelho 660nm, com 30, 50 e 100mW de potência

após a coloração com o Alamar Blue, indicando a viabilidade

celular, avaliação em função da densidade de energia à

esquerda e da potência à direita. 65


células-tronco(hBMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de






células-tronco(hBMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de






células-tronco(hPDLSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de


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células-tronco(hPDLSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de





Gráfico 7 – Gráfico mostrando a concentração de ROS (radicais livres

presentes no citoplasma) das culturas de células-

tronco(hWJMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser

infravermelho 830nm com 30, 50 e 100mW de potência após

a coloração com a sonda DHR, avaliação em função da

densidade de energia à esquerda e da potência à direita. 68



tronco(hWJMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser

vermelho 660nm com 30, 50 e 100mW de potência após a

coloração com a sonda DHR, avaliação em função da




tronco(hBMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser






tronco(hBMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser

18






tronco(hPDLSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser






tronco(hPDLSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser




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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DNA - ácido desoxiribonucleico

DNAc - ácido desoxiribonucleico complementar

EDTA - ácido etileno dinitro tetracético

RNA - ácido ribonucleico

mRNA - ácido ribonucleico mensageiro

cAMP - adenosina monofosfato cíclica

ADP - adenosina bifostato

ATP - adenosina trifostato

Laser - amplificação da luz pela emissão estimulada de radiação

ANOVA - análise de variância

AsGa- arseniato de gálio

AsGaAl - arseniato de gálio e alumínio

SC - célula-tronco

ASC - célula tronco adulta

ESC - célula tronco embrionária

HSC - célula tronco hematopoiética

MSC - célula tronco mesenquimal

hUCBSC - célula tronco mesenquimal humana do cordão umbilical

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hWJMSC - célula tronco mesenquimal humana da geléia de Warton

hPDLSC - célula tronco mesenquimal humana do ligamento periodontal

hBMSC - célula tronco mesenquimal humana da medula óssea

Cox-2 - ciclooxigenase 2

MgCl2 - cloreto de magnésio

Col 1 - colágeno tipo 1

Col 3 - colágeno tipo 3

DHR- dihidrorodamina

DMSO- dimetil sulfóxido

bFGF- fator de crescimento fibroblástico básico

TGF-B - fator de crescimento transformador beta

TGF-β1 - fator de crescimento transformador beta1

IGF-I - fator de crescimento tipo insulina 1

VEGF- fator de crescimento vascular endotelial

VEGF-A - fator de crescimento vascular endotelial tipo A

NF-kB - fator nuclear kappa-beta

FADH- flavina adenina dinucleotídeo

P13K - fosfatidillinositol 3-quinase

CO² - gás carbônico

He-Ne - Helio neônio

21

IL-1B - interleucina 1B

IL-6 - interleucina 6

IL-8 - interleucina 8

LLL - laser de baixa intensidade

MEM - meio de cultura Alfa Mem

DMEM - meio de cultura eagle Dulbecco’s modificado

Nd:Yag - neodimio-doped ítrio alumínio garnet

NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NADH - nicotinamida adenina dinucleotídeo

Osx - osterix

Oc.- osteocalcina

(P1) - passagem 1 em cultura celular



qPCR - PCR qualitativo

IGFBP3 - proteína de ligação do fator de crescimento tipo insulina 3

MAPK - proteínas quinases ativadas por mitógeno

PKc - proteína quinase C

RTK - proteína quinase receptora da tropomiosina

ERK - proteínas quinases reguladas por estimulo extracelular

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Akt - proteína quinase serine/threonine

RT-PCR- reação de transcrição da cadeia reversa da polimerase

PBS- solução tampão salina

HBSS - solução tampão salina Hank’s balanceada

SFB - soro fetal bovino

ROS – Espécies reativas de oxigênio

DHR – Dihidrorodamina

IPS – células pluripotentes induzidas

http://en.wikipedia.org/wiki/Serine/threonine-specific_protein_kinase

http://en.wikipedia.org/wiki/Serine/threonine-specific_protein_kinase

23

LISTA DE SÍMBOLOS

A - amplitude

a - área

π - Pi

R2 - raio ao quadrado

cm - centímetro

λ - comprimento de onda

DE - densidade de energia

E - energia

F- freqüência

Gl- gaylussac

Hz - hertz

J - Joule

Km- kilômetro

M - metro

mL - mililitro

mW - miliwatts

nm - nanômetros

n - número quântico

24

P - potência

RPM - rotações por minuto

s - segundo

µL- microlitros

W - watt

25

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 24

1.1 Física do laser 24

1.2 Interação do laser com os tecidos 32

1.3 Célula-tronco

2 REVISÃO DA LITERATURA 41

2.1 Célula-tronco mesenquimal 41

2.2 Célula-tronco mesenquimal da geléia de Warton 42

2.3 Célula-tronco mesenquimal de medula óssea 43

2.4 Célula-tronco mesenquimal de ligamento periodontal 44

2.5 Laserterapia de baixa intensidade em células-tronco. 45

3 OBJETIVO 51

4 MATERIAIS E MÉTODO 52

4.1 Amostra 52

4.2 Descrição dos materiais utilizados 52

4.3 Cultura celular 56

4.4 Protocolo de irradiação 56

4.5 Teste de viabilidade celular (Alamar Blue) 59

4.6 Teste da concentração de radicais livres ( dihidrorodamina) 60

26

4.7 Análise estatística 60

5 RESULTADOS 63

5.1 Aspectos morfológicos das células tratadas com laser. 63

5.2 Teste colorimétrico de viabilidade celular (Alamar Blue) 64

5.3 Teste colorimétrico de radicais livres(DHR) 68

6 DISCUSSÃO 72

7 CONCLUSÃO 77

REFERÊNCIAS 78

ANEXO 89

27

1 INTRODUÇÃO

Os seres vivos estão constantemente expostos a estímulos do meio

externo. Esses estímulos podem ser os mais variados: de natureza física,

biológica, química ou emocional, provocando reações no organismo.

Algumas dessas fontes de estímulo externas podem ser benéficas

quando aplicadas em doses certas, contribuindo para o melhor funcionamento

desse organismo, como no caso dos exercícios físicos resistidos (musculação),

do banho de sol tomado em doses corretas pela manhã (bronzeamento), ou de

uma boa relação familiar e com os amigos.

O laser de baixa intensidade (LBI) é um agente físico externo que tem

sido muito estudado nos últimos anos, e quando corretamente indicado é capaz

de produzir efeitos comprovadamente benéficos aos seres vivos.

1.1 Física do laser

A palavra LASER é formada pelas iniciais em inglês do método pelo qual

ela é obtida, ou seja, é a amplificação da luz pela emissão estimulada de

radiação, esse conceito foi introduzido por Albert Einstein em 1917.

Noções atômicas

Já na antiguidade, Leucipo e Demócrito, filósofos gregos, imaginavam

que a matéria era toda formada por partículas indivisíveis.

Assim, imaginaram que quebrando uma rocha com um martelo obteriam

vários pequenos fragmentos, esses por sua vez recebendo outra martelada

dividir-se-iam em outros inúmeros fragmentos menores ainda, e assim

sucessivamente até encontrarem um pedaço de rocha que não pudesse mais

ser dividido, a esse fragmento indivisível para os conceitos da época

chamaram ÁTOMO (RAMALHO, 2003).

28

Dalton em 1808 conferiu um conceito mais científico à noção de átomo,

afirmando que o átomo era uma partícula material minúscula indestrutível

mantendo massa e dimensão inalteradas; e que essas partículas podem

combinar-se produzindo diferentes espécies de matéria (BAGNATO, 2001).

Rutherford em 1911 apresentou seu modelo atômico planetário (assim

chamado pela semelhança que apresentava com o sistema solar, onde os

planetas descrevem órbitas ao redor do sol), o núcleo, de carga positiva,

ocupava uma pequena região no centro do átomo, e os elétrons, de carga

negativa, orbitavam ao seu redor formando a eletrosfera. Esse modelo

explicava satisfatoriamente grande parte dos fenômenos físicos, entretanto, um

corpo em órbita apresenta aceleração centrípeta, e de acordo com Maxwell,

cargas aceleradas irradiam energia, assim, os elétrons estariam continuamente

perdendo energia e consequentemente deveriam cair no núcleo fazendo a

matéria implodir (RAMALHO, 2003).

Segundo Bohr em 1913, o átomo tem um conjunto de estados

estacionários ao redor do núcleo, com energias bem definidas nos quais os

elétrons estão contidos, e nos quais não há irradiação; um átomo só poderia

absorver ou emitir energia quando um elétron passasse de um estado

estacionário para outro. Nessa transição, denominada salto quântico, a energia

emitida ou absorvida seria na forma de um fóton, e seria igual á diferença de

energia entre os dois estados (ARAUJO, 2010; BAGNATO, 2001).

Níveis atômicos

Em cada órbita o elétron possui uma determinada energia, e a cada

nível energético atribui-se um número inteiro, o número quântico. (N=

1,2,3,4,...).

29

Figura 1 – Figura ilustrando átomo, núcleo e níveis de energia do elétron.

Fonte:http://1.bp.blogspot.com/6preYhLyXzo/Te1DAqi_ZeI/AAAAAAAAAQo/VA9aJEHrL2Y/s320/modelo-atomico-de-bohr-1.gif

Estado fundamental e estado excitado

O estado fundamental é aquele de menor energia, ou seja, mais próximo

ao núcleo, onde o elétron encontra-se estável, já os estados de energia maior,

mais afastados do núcleo, são os estados excitados.

Em geral, um elétron permanece em um estado excitado por um tempo

médio da ordem de 0,000.000.01 (10-8) segundo antes de retornar ao estado

fundamental.(ARAUJO, 2010)

Figura 2 – Figura ilustrando absorção de energia pela matéria.

Fonte: http://afisicasemove.blogspot.com/2009/03/o-que-e-mecanica-quantica.html

http://1.bp.blogspot.com/-6preYhLyXzo/Te1DAqi_ZeI/AAAAAAAAAQo/VA9aJEHrL2Y/s320/modelo-atomico-de-bohr-1.gif

http://1.bp.blogspot.com/-6preYhLyXzo/Te1DAqi_ZeI/AAAAAAAAAQo/VA9aJEHrL2Y/s320/modelo-atomico-de-bohr-1.gif

30

O estado metaestável

Em alguns materiais a permanência desse elétron no estado excitado é

bem mais longa, da ordem de 0,001 (10-3) segundo, antes de retornar ao

estado fundamental, sendo denominado estado metaestável, essa propriedade

é essencial à produção do laser.

A inversão de população

Quando o átomo está em condições normais, existem muito mais

elétrons no estado fundamental do que no estado excitado (nesse caso no

estado metaestável). Entretanto, para a produção do laser é necessário que

uma fonte de energia induza mais elétrons ao estado excitado que ao estado

fundamental. (ARAUJO, 2010).

Absorção, emissão, emissão estimulada

Segundo Bohr, na interação da matéria com a radiação luminosa, os

átomos e moléculas podem absorver ou emitir energia. (RAMALHO, 2003)

Um átomo em seu estado estacionário interagindo com um fóton

absorve sua energia e passa para o estado excitado, a esse processo chama-

se absorção.

O átomo em seu estado excitado, decorrido um tempo médio de

0,000.000.01 (10-8) segundo, e não havendo nenhum estímulo externo, retorna

ao seu estado fundamental espontaneamente, emitindo um fóton, que é a

diferença de energia entre os dois níveis o excitado e o fundamental. Ele pode

ter seus elétrons por muito tempo, aproximadamente 0,001 (10-3) segundos, no

estado excitado (estado metaestável), sofrendo a influência de um fóton que

acelerará sua desexcitação.

Na passagem de um nível energético excitado para outro de menor

energia ocorre emissão de outro fóton idêntico ao que acelerou o processo. O

fóton estimulador sai ileso do sistema juntamente com o fóton gerado

31

apresentando esse a mesma energia e direção que o primeiro. (BAGNATO,

2001)

Esses dois fótons que emergiram do sistema vão estimular outros dois

átomos com elétrons em seu estado excitado, havendo a emissão de mais

fótons. Todos esses fótons que emergem do sistema são novamente jogados

sobre ele, aumentando a quantidade de luz. A reação em cadeia desse

processo de emissão estimulada é a geradora da luz laser. (ARAUJO, 2010).

Figura 3 – Figura ilustrando reações atômicas de um fóton com um elétron.

Fonte:http://www.oficinadanet.com.br/artigo/ciencia/como_funciona_lampadas

Luz

A luz é uma configuração de campos elétricos e magnéticos que oscilam

no tempo e no espaço. É uma radiação eletromagnética que pode comportar-

se como onda e como partícula. É uma perturbação transmitida através do

espaço em forma de onda com uma velocidade de 300.000 Km/s.

Freqüência, amplitude, comprimento de onda, energia, potência,

densidade de energia

A freqüência é medida pelo número de cristas ou ciclos que passam por

um ponto fixo em 1 segundo sendo medida em hertz (Hz). A amplitude é a

altura do topo da crista à concavidade do vale da onda, é medida na escala

métrica (M). Comprimento de onda é a distância entre duas cristas sucessivas,

é medida na escala métrica (M). Energia é a capacidade de efetuar um

trabalho, sendo medida em Joules (J). Potência indica a quantidade de energia

depositada por unidade de tempo, é medida em Watts (W). Densidade de

32

energia é a quantidade de energia depositada em uma determinada superfície,

é medida em Joules por centímetro quadrado (J/cm²)

Espectro eletromagnético

O espectro eletromagnético é amplo, com comprimento de onda

variando desde 108 até 10-18.

A emissão de fótons pelos materiais é denominada radiação, dentre elas

podemos citar as ondas de radio e TV, utilizadas nos meios de comunicação,

as microondas utilizadas em equipamentos de cozinha, a radiação

infravermelha associada às emissões de calor, a radiação ultravioleta que pode

causar câncer de pele, os raios gama, muito penetrantes e de alta energia, os

raios X capazes de penetrar tecidos vivos, sendo muito utilizados em

diagnóstico médico e a radiação visível capaz de sensibilizar o olho humano.

Figura 4 – Figura ilustrando espectro de radiação eletromagnética.

Fonte:http://informatica.hsw.uol.com.br/radiacao-dos-telefones-célulares1.htm

Espectro de luz visível

O espectro de luz visível ocupa uma pequena faixa do espectro

eletromagnético, de aproximadamente 380 nm a 740 nm.

33

Figura 5 – Figura ilustrando espectro de luz visível.

Fonte:http://arianepadilha.com/2009/12/04/circulo-cromatico/

Figura 6 – Localização do espectro de luz visível dentro do espectro de radiação

eletromagnética. Fonte:http://www.alemdaimaginacao.com/Noticias/21_12_2012.html

34

Características da luz laser

Monocromaticidade

Como a energia carregada pelo fóton estimulante e pelo fóton emitido

são as mesmas, a luz laser é composta somente por um comprimento de onda,

tendo energia determinada e sendo assim associada somente a uma cor.

Não divergência

Caráter direcional do feixe, fótons inclinados em relação ao eixo do laser

não contribuirão para a formação final do feixe, que é constituído somente por

ondas caminhando paralelamente entre si, assim o feixe de laser é em geral

fino e tem muito pouca dispersão.

Coerência

As ondas que formam a luz laser se propagam no espaço de forma

homogênea, todas no mesmo sentido, como quando jogamos uma pedra em

um lago parado, essa pedra produz uma perturbação concêntrica na superfície

parada do lago, se jogarmos várias pedras nesse mesmo lago, surgirão ondas

que se chocam, sendo assim incoerentes.

O Laser de baixa intensidade (LBI)

O laser de baixa intensidade é uma radiação sem potencial destrutivo

(atérmico), promovendo em geral estimulação celular.

Em 1960, foi construído o primeiro aparelho de laser de Rubi, por

Theodore Maiman.

Atualmente os principais tipos de laser de baixa potência são o de He-

Ne (Helio neônio), com comprimento de onda de 632nm; o de AsGa (Arseniato

de gálio), com comprimento de onda que variam de 830 a 904nm; e o de

35

AsGaAl (Arseniato de gálio e alumínio) com comprimento de onda que variam

de 620 a 830nm.

O laser vermelho

Com comprimento de onda em torno de 630nm tem afinidade por tecidos

moles e menor profundidade de penetração.

O laser infravermelho

Com comprimento de onda em torno de 830nm tem mais afinidade por

tecido esquelético e maior profundidade de penetração.

1.2 Interação do laser com os tecidos

O laser quando entra em contato com os tecidos pode sofrer reflexão,

difusão, absorção e transmissão.

A reflexão ocorre quando o feixe laser retorna ao meio de origem após

incidir sobre a superfície do tecido.

A absorção da energia do laser corresponde a 93 a 96% da radiação

incidente.

A transmissão é a maneira do laser interagir com o tecido sem produzir

efeito no tecido alvo, mas produzindo efeito à distância.

Difusão é o espalhamento do feixe de laser nas diferentes

direções.(ARAUJO, 2010)

Efeitos terapêuticos do laser de baixa intensidade

O LBI não é um tratamento cujos mecanismos baseiam-se no aumento

da temperatura (fototérmico), mas apresenta um mecanismo fotoquímico

comparável ao descrito na fotossíntese quando a luz é absorvida e promove,

36

no receptor, uma alteração química (HOUANG YY; CHEN AC; CARROL JD;

HAMBLIN M, 2009).

Podemos considerar laser de baixa intensidade a aplicação de luz

geralmente no espectro do vermelho ou infravermelho (600nm-1000nm), com

potência de 1mW a 500mW, com densidade de potência entre 1mW/cm² e

5W/cm² aplicado ao tecido doente por um período de 1 segundo a alguns

minutos, em aplicação única ou em poucas aplicações algumas vezes por

semana por algumas semanas, e que não elevam a temperatura mais do que

1° C durante a aplicação. O uso do laser de baixa intensidade ou infravermelho

próximo, para reduzir a dor, a inflamação, e o edema, promover cicatrização de

feridas aumento da profundidade de tecidos e nervos, e prevenir a morte

celular e dano tecidual, tem sido estudado por aproximadamente 40 anos,

desde a invenção do laser. O mecanismo bioquímico de ação da laserterapia

de baixa intensidade nos tecidos celulares, apesar dos efeitos clínicos

positivos, ainda não foi completamente entendido, e a complexidade da

escolha racional entre o grande número de parâmetros como comprimento de

onda, fluência, densidade de potência, estrutura do pulso, e tempo de

tratamento, já levaram à publicação de muitos estudos com efeitos positivos e

muitos com efeitos negativos.

LBI pode ser descrito por dois parâmetros, a medicação (parâmetros da

irradiação) e a dose, (tempo). Assim, em outras palavras se dobrarmos a

energia aplicada e dividirmos por dois o tempo de aplicação a mesma energia

será aplicada, mas os efeitos biológicos serão diferentes. O primeiro efeito foi

descrito por Mester et al. em 1967, como sendo bioestimulatório. Irradiando

ratos tricotomizados com laser de ruby (694nm) para descobrir se o laser

causava câncer, ele descobriu que além do laser não causar câncer, ainda

acelerava o crescimento dos pelos na região tricotomizada (HUANG YY et al.,

2009).

O mecanismo celular e molecular da LBI sugere que os fótons são

absorvidos na mitocôndria, pela citocromo c oxidase (KARU T, 1989)

estimulam a produção de ATP e de baixos níveis de ROS (radicais livres) que

37

ativam fatores de transcrição como NF-kB, para induzir a transcrição de muitos

produtos capazes de responder pelos efeitos benéficos da LBI. Radicais livres

são conhecidos por estimular a proliferação celular em baixos níveis, mas inibir

e até matar em altos níveis (HUANG YY et al., 2009).

O óxido nitroso compete no sítio do citocromo c oxidase com o oxigênio,

o laser libera esse NO do citocromo C oxidase deixando o sítio livre para a

ligação do oxigênio e conseqüente produção de ATP. Além disso, o Laser

produz NO em outros sítios (hemoglobina e mioglobina nitrosiladas). O efeito

vasodilatador foi descrito por Furchgott RF em 1968, que demonstrou a

propriedade do laser em produzir e liberar NO agindo na guanina cíclica

monofosfatada (cGMP) e produzindo vasodilatação. É possível que a liberação

de NO em baixas quantidades pela baixa dose de luz seja benéfica, enquanto

altos níveis sejam prejudiciais (HUANG YY et al., 2009).

38

Figura 7 – Figura ilustrando o esquema biomolecular do sítio de ligação

do oxigênio e do óxido nítrico no citocromo C (Huang YY et al., 2009).

Ao analisar culturas de fibroblastos em microscópio confocal após a

irradiação de laser 648nm foi observado uma alcalinização progressiva do

citoplasma com pico ocorrendo em 6 minutos e retornando ao normal após 15

minutos, aumentando em 30% o potencial de membrana da mitocôndria após 2

minutos da irradiação. A análise de diferentes células da mesma cultura

mostrou ainda que elas respondem de forma diferente ao estímulo do laser, já

que os parâmetros homeostáticos não são homogêneos (ALEXANDRATOU E

et al., 2002).

Segundo Alghamdi KM, et al. (2011), o mecanismo molecular de

proliferação esta relacionado a duplicação do nível de ATP após a absorção da

luz pelos cromóforos, que ativa os nucleotídeos P2 aumentando o cálcio

intracelular (Ca2+) e simultaneamente regula a síntese proteica, de DNA e a

expressão genética, induz a ativação das cascatas de kinases MAPK- ERK 1, 2

e P13K, cadeias de proteínas na célula que comunicam o sinal de um receptor

na superfície da membrana ao DNA do núcleo, sendo importantes guias da

proliferação e sobrevivência celular, e da RTK/PKc que promovem a

proliferação e aumentam os níveis de ROS ativando Akt e relacionando

alterações nos níveis de ROS com os efeitos secundários do laser.

Zhang et al em 2003 demonstrou a alteração genética de 111 genes

após a aplicação do laser, pertencentes a 10 categorias funcionais, 7 das quais

diretamente relacionadas com os processos de aumento da proliferação celular

e supressão da apoptose, ao aplicar LBI 628nm a fibroblastos em cultura, e

submeter os resultados a análise cDNA microarray.

Assim, LLL ativa fatores de transcrição regulando a produção de

proteínas anti apoptóticas e promovendo a viabilidade celular. É também

possível que outros fatores de transcrição que provocam a apoptose sejam

ativados pelas altas doses de energia aplicada.

39

O potencial das fototerapias tem crescido nos últimos anos, e

associações com outros campos de estudo tem produzido resultados

surpreendentes.

A idéia inicial de Francis Crick, criador da estrutura do DNA, de utilizar a

luz para controlar o potencial dos neurônios foi executada por Ed Boyden,

2004, utilizando laser azul para ativar canais iônicos específicos,

channelrhodopsin-2 (ChR2) na membrana e permitir que íons positivos entrem

no citoplasma abrindo um novo campo experimental chamado optogenética,

segundo ele, um canal iônico aberto sob encomenda poderia fazer um animal

sentir um cheiro que não estaria sentindo realmente, recentemente, Malinow

em 2014, utilizando uma variante do ChR2, o ChIEF para obter uma resposta

mais rápida, provou que a memória em ratos poderia ser apagada utilizando

dois fenômenos conhecidos, a potencialização de longa duração (LTP) e a

depressão de longa duração (LTD) que se traduzem no aperto ou

afrouxamento das sinapses nervosas respectivamente, investigando a memória

associativa no processo de aprendizado produziu evidencias de que quando

aprendemos algo, na verdade são as sinapses que estão sofrendo alterações

no cérebro. Com isso o potencial desse campo esta escrito em seu nome, a

genética possibilita que pesquisadores restrinjam a expressão de canais

iônicos ativados pela luz a neurônios específicos, permitindo uma resolução

espacial impossível de ser atingida com drogas ou mesmo com a utilização de

eletrodos, a óptica permite controlar esses canais e mesmo restringir sua

ativação as regiões iluminadas. Com essas ferramentas é possível fazer um

mapeamento do funcionamento cerebral, através das conexões entre os

neurônios e seu padrão de interrelacionamento gerando os mecanismos

nervosos pelos quais as ações ocorrem e alterando a maneira pela qual o

cérebro e estudado. (PERKEL JM 2014)

40

1.3 Célula-tronco

É a menor unidade viva do organismo capaz de se reproduzir por um

processo chamado de divisão celular dando origem a duas novas células

chamadas de células filhas.

Há muito a medicina procura a maneira pela qual o organismo poderia

recuperar-se de suas perdas, sejam elas por trauma, doenças ou

envelhecimento.

A descoberta de células capazes de diferenciar-se em outras células dos

variados tecidos corpóreos tem trazido entendimento dos mecanismos que o

corpo utiliza para regenerar-se, e abriu um campo vastíssimo para a pesquisa e

para a engenharia tecidual, possibilitando terapias antes impensáveis, essas

células foram chamadas de células-tronco (CT).

Existem basicamente três tipos de célula-tronco (CT), as embrionárias

(CTE) e as adultas (CTA), (DE-MIGUEL, M. P. et al., 2009) e as IPS

(Yamanaka ET AL. 2006).

Recentemente, alguns estudos tem chamado a atenção dos

pesquisadores devido a sua aplicação pratica em engenharia tecidual, um

deles é o que transforma uma célula qualquer do organismo em uma célula

muito similar as células tronco embrionárias, ou seja, podem reconstituir um

novo ser por completo, e portanto abrem discussões éticas importantes, são as

células IPS desenvolvidas no Japão por (YAMANAKA, 2006) e o outro é o que

utiliza células tronco adultas de tecido adiposo e de tecidos dentários, mais

especificamente do ligamento periodontal, que podem se diferenciar em todos

os tecidos da linhagem mesodérmica. Essas células tronco do ligamento

periodontal despertam interesse principalmente devido a sua extração ser feita

de forma simples com uma curetagem no fundo do sulco gengival, abrindo

enormes portas para a confecção de tecidos vivos com células de origem

autóloga. (TRUBIANI, 2008)

41

Embriologia

A fecundação ou fertilização é o processo que ocorre quando os

gametas (os dois únicos tipos de células haplóides, ou seja, que possuem

metade dos cromossomos que as outras células) masculino (espermatozóide)

e feminino (óvulo) encontram-se, e o espermatozóide penetra o óvulo.

Os núcleos dessas células haplóides (1n) fundem-se e formam a

primeira célula diplóide (2n) do novo organismo carregando a informação

genética dos dois genitores.

Essa célula ovo ou zigoto dará origem a todas as linhagens celulares

que formarão o novo organismo.

Mórula

O zigoto começa a dividir-se, e após três dias a célula ovo está dividida

em um conjunto de oito células recobertas por uma camada externa, a zona

pelúcida.

Esse amontoado de células é chamado de mórula pela semelhança com

uma amora (DE-MIGUEL, M. P. et al., 2009).

Figura 8 – Figura ilustrando mórula com 16 células.

Fonte:http://www.biogeociencias.com/01_biologiacélular_bioquimica_reproduccion/020303_célulasmadreformacion.htm

42

Blastocisto

As células da mórula que continuaram a se multiplicar começam a

migrar para a periferia deixando uma cavidade interna, desaparece a zona

pelúcida, a mórula se transformou em blastocisto.

Figura 9 – Figura ilustrando blastocisto.

Fonte:http://gensencillo.wordpress.com/page/2/

Nessa fase o blastocisto apresenta uma camada externa que dará

origem à placenta e uma massa celular interna (MCI) que dará origem ao feto

(TORRES, F. C., 2009).

Célula tronco embrionária (CTE)

As células tronco embrionárias (CTE) tem a capacidade de diferenciar-

se em todas as linhagens de células do organismo, inclusive nos gametas,

sendo chamadas de pluripotentes.

A (CTE) é retirada da massa celular interna (MCI) do embrião quando

esse está na fase de blastocisto (TORRES, F. C., 2009).

43

Os tecidos

São formados por células especializadas que foram se diferenciando

para permitir que os diversos órgãos executem cada um suas funções tornando

possível a sobrevivência do indivíduo.

Célula tronco adulta (ASC)

A maioria dos tecidos adultos possui populações de células capazes de

renovação após trauma, doença ou envelhecimento (PITTENGER et al., 1999).

Essas células que não se diferenciaram, e sob condições normais não

se diferenciam, são as células tronco adultas.

Entretanto a presença da ASC em determinado tecido não significa que

irá repará-lo quando lesado.

O processo de diferenciação da célula tronco é influenciado pelo

microambiente ao qual a célula está exposta e pela expressão gênica, ou seja,

pelos genes específicos da célula tronco que são ativados ou desativados

durante o processo de diferenciação celular dando origem aos diversos

fenótipos (CAPLAN, 2007).

O local em que se concentram no tecido é em geral perivascular, por

que assim têm livre acesso a todos os tecidos dando credibilidade à noção que

essas células regeneram muitos tipos celulares diferentes.

A ASC é obtida após a fase de blastocisto, sejam elas provenientes do

indivíduo adulto, recém nascido, ou mesmo do feto após a fase de blastocisto

(TORRES, F. C., 2009).

Segundo Zuk et al. 2002 e Rosenthal, 2003, uma célula indiferenciada

para ser considerada célula tronco deve atender alguns pré-requisitos, dentre

eles ser originada de outra célula tronco, embrionária ou adulta, ter capacidade

de auto renovação, propiciar divisão assimétrica, uma das células filha deverá

44

ser capaz de dar origem a células dos três folhetos embrionários, ectoderme,

pele, cabelo, olhos, sistema nervoso, mesoderme, linhagem hematopoiética,

medula óssea, células sanguíneas, linhagem mesenquimal, músculo, osso,

cartilagem, gordura, e endoderme, pulmão, pâncreas, estômago.

Segundo Verfaillie, 2002; e Musina et al., 2006 as células tronco adultas

podem ser obtidas a partir da medula óssea, da pele, da mucosa intestinal, da

polpa dentária, da córnea, do sangue do cordão umbilical, do tecido nervoso e

do tecido adiposo, Hughes, 2014; inclui ainda a geléia de Warton do cordão

umbilical, e tecidos dentários, dentre eles o ligamento periodontal.

A célula tronco adulta pode ser hematopoiética (HSC) ou mesenquimal

(MSC) dependendo do tecido do qual se origina, por exemplo, medula óssea,

sangue do cordão umbilical, tecido mesenquimal.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Célula tronco mesenquimal (MSC)

As células-tronco mesenquimais apresentam determinadas

características in vitro, como a combinação de marcadores fenotípicos e

propriedades funcionais de diferenciação.

O Comitê de Células-tronco mesenquimais da Sociedade Internacional

de Terapia celular definiu que células-tronco mesenquimais humanas devem

ser CD105, CD73, e CD90 positivas (expressão em torno de 90%) e CD45,

CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19, e HLA negativas.(DOMINICI et al.,

2006) Além disso Stro-1 é considerado o melhor marcador para células-tronco

mesenquimais, porém não é exclusivo para este tipo celular e ainda sua

expressão não é mantida durante sucessivas passagens em cultivo (KOLF et

al., 2007). Essas células, quando cultivadas em baixa densidade, em

superfícies plásticas, aderem-se rapidamente e formam colônias que são

identificadas como unidade formadora de colônia fibroblastóide –CFU-f (do

inglês colony forming units-fibroblastic) (FRIEDENSTEIN et al., 1976). Elas

podem ser isoladas a partir de vários órgãos do organismo como medula

45

óssea, (MEIRELLES et al., 2006) tecido adiposo, periósteo, membrana sinovial,

fluído sinovial, músculo, derme, dente decíduo, pericitos trabeculares ósseos,

cartilagem articular, cordão umbilical, placenta, fígado, baço e timo (BIANCO et

al., 2008). Após o isolamento in vitro as células-tronco mesenquimais

demonstraram capacidade de se diferenciar em vários tecidos mesodermais,

quando induzidas após a utilização de meios de cultivos adequados. As

células-tronco mesenquimais diferenciam-se em osteoblastos, adipócitos,

condrócitos, tenócitos, células musculares, cardiomiócitos e células do estroma

de sustentação da hematopoiese (PITTENGER et al. 1999, CAPLAN et al.

2001, MONTESPAN et al. 2014). Outros autores demonstraram a capacidade

de diferenciarem-se em células neuronais e endoteliais (BARRY 2001).

Nos últimos anos as terapias com células tronco tem evoluído devido a

sua capacidade de ultrapassar as defesas imunológicas,(BIBBER 2013) e

migrar para os tecidos doentes, inclusive o tumoral (DWYER 2013, KE 2013)

recebendo estímulos de diferenciação do microambiente local (ESPINOZA

2013), e do contato célula-célula, com a troca de microvesículas que carregam

mensagens através dos lipídeos, proteínas, ácidos nucléicos e micro

RNA,(VALLABHANENI 2014) e assim reagindo de forma diferente em cada tipo

celular, podendo levar medicamentos para o local da lesão bem como produzir

proteínas em diversos tipos de tumores,(BITSIKA 2013) e ativando o sistema

imunológico contra a proliferação desse tipo de célula tumoral,(DWYER 2013)

levando a uma diminuição dos efeitos colaterais bem como a uma cura mais

eficiente, já que outros focos do mesmo tipo de câncer tratado, mas em estado

de latência podem também ser eliminados.(BIBBER 2013) Informações mais

detalhadas sobre a interação entre as células tronco mesenquimais e os

tecidos tumorais levarão indubitavelmente a terapias celulares mais eficazes e

seguras.(HONG 2014, VALLABHANENI 2014)

2.2 Célula tronco mesenquimal da Geléia de warton (hWJMSCs)

As células tronco dos tecidos fetais, sangue placentário e da geléia de

Warton (hWJMSCs) do cordão umbilical tem origem embrionária epiblástica,

46

ou seja, que dão origem ao mesênquima, e portanto são consideradas mais

primitivas que as células tronco de origem adulta.

A geléia de Warton é composta por uma abundante matriz extracelular

rica em colágeno e glicosaminiglicanos, fornecendo uma quantidade importante

de células tronco mesenquimais, (6,7x105 Cels/cm de cordão) que mantém

morfologia fusiforme e estrelada constante, e englobam cada vaso (artérias e

veias) do cordão umbilical. Exprimem os seguintes marcadores de superfície

CD90, CD166, CD73 et CD164. (TALAR, M. 2013) Sua origem fetal lhe confere

características especificas comparada as células tronco mesenquimais de

medula óssea. (REPPEL L, 2014)

2.3 Célula tronco mesenquimal de medula óssea (hBMSCs)

Segundo Friedenstein et al. 1968 e Friedenstein et al. 1974; a medula

óssea, que tem origem mesodérmica é composta por células tronco

hematopoiéticas (HSC) e um estroma mesenquimal.

As células tronco hematopoiéticas (HSC) são capazes de diferenciar-se

nas células sanguíneas, sendo utilizadas nos transplantes de medula óssea

desde a década de 50.

As células tronco mesenquimais (MSC) são capazes de diferenciar-se

em diversas linhagens celulares como condrócitos, osteócitos, adipócitos e

miócitos (ZUK et al., 2002).

Segundo Bydlowski, et al. (2009), dentre os tecidos conhecidos por

apresentarem células-tronco após a vida pós-natal, a medula óssea foi a mais

estudada, por muitos anos, como fonte tanto de células-tronco hematopoiéticas

quanto de células-tronco mesenquimais, também denominadas de células

mesenquimais estromais da medula óssea ou células estromais mesenquimais

multipotentes. Estas células são um grupo de células clonogênicas, presentes

no estroma da medula óssea, que, quando submetidas a diferentes estímulos

apropriados, são capazes de se diferenciar em várias linhagens de células,

47

como a osteogênica, a condrogênica e a adipogênica e, possivelmente, em

outros tipos celulares não mesodérmicos, como células neurais ou hepatócitos.

Segundo Schaffler, A., e Buchler, C. em 2007 e MONTESPAN et al.

2014, essas células tem igual potencial de diferenciação em tecidos

mesodermais que as células tronco retiradas do tecido adiposo.

Diversos tipos de anticorpos podem ser usados para caracterizar essas

células. O protocolo de caracterização do Biopólo da Universidade de Lorraine

definiu que essas células devem reagir positivamente para CD44, CD90,

CD105, CD34, CD45, CD166, CD73.

Phinney et al. 2013 afirma que os dados atualmente existentes permitem

uma aplicação segura de testes clínicos com a reconstrução de tecidos

esqueléticos utilizando células tronco de medula óssea.

2.4 Célula tronco mesenquimal de ligamento periodontal (hPLSCs)

As células tronco de ligamento periodontal (hPLSCs) também possuem

a característica de formar colônias aderentes ao plástico CFU com morfologia

fibroblastóide, de maior velocidade e densidade que as células de medula

óssea.(HYNES, K. 2012 e HUGHES, FJ. 2014) Diversos autores identificaram

e isolaram células-tronco do ligamento periodontal a partir de dentes extraídos,

terceiros molares,(KATO, H. 2013, KATO, H. 2014 e HAKKI, S. 2014) pré-

molares,(NAGATOMO, K. 2006 e TERAMATSU, Y. 2014) caninos,(LIU,Y. 2008

e DING G. 2010) e do sulco gengival de dentes saudáveis,(TRUBIANI, O.

2004), ou mesmo periodontalmente comprometidos.(CHEN, S C. 2006) Essas

células exprimem os seguintes marcadores de superfície CD29, CD90, CD44,

CD105, CD166, são capazes de se diferenciar em tecidos de linhagem

mesenquimal principalmente em osteoblastos, fibroblastos e cementoblastos,

(SEO, B. 2004, TRUBIANI, O. 2008, GAY, I. 2007) Segundo Trubiani em 2007,

a extração de células tronco do ligamento periodontal a partir do sulco gengival

tem característica menos invasiva, já que não ha necessidade de extrair um

dente para obtê-las. Devido a sua grande capacidade proliferativa além de

48

propriedades imunossupressoras,(WADA, N. 2009) permite que sejam

utilizadas em terapias celulares de origem autóloga visando a aplicação na

engenharia tecidual (YANG, Z. 2009, GE, S. 2013, KATO, H. 2014, YUDA, A.

2014, HAKKI, S. 2014 e TRUBIANI, O. 2014), entretanto, suas características

imunológicas, exprimem HLA, human leucocyte antigen inibindo a COX-2,

importante enzima relacionada a biosíntese da PGE-2, (prostaglandina 2) que

ativa os linfócitos T, permitindo que células alógenas possam ser implantadas

sem efeitos colaterais.(DING, G 2014)

2.5 Laserterapia de baixa intensidade em células-tronco.

Tuby H, et al. (2007), estudaram os efeitos proliferativos da aplicação de

laser de baixa intensidade com 1 e 3 J/cm² em células tronco mesenquimais e

em células tronco cardíacas, concluindo que o número de células teve aumento

significativo uma e duas semanas após o tratamento comparadas ao grupo

controle.

Mvula B, et al. (2008), estudando os efeitos do laser de baixa

intensidade, 635 nm, 5J/cm², 50,2mW, 5,5mW/cm², em culturas de células

tronco mesenquimais de tecido adiposo humano, concluíram que essa

irradiação afeta positivamente esse tipo celular, aumentando a viabilidade

celular, a proliferação e a expressão de beta1- integrina.

Eduardo F de P, et al. (2008), estudando os efeitos da aplicação do laser

de baixa intensidade, InGaAlP, 660nm, 20mW por 6 segundos e 40mW por 3

segundos em células tronco humanas de polpa de dente decíduo concluíram

que o grupo irradiado com 20mW, após 72hs, apresentou viabilidade celular

estatisticamente significante maior em relação aos outros dois grupos (40mW e

controle) e após 24 hs, as culturas irradiadas apresentaram maior número de

células viáveis em relação ao grupo controle, concluindo que esse tipo celular

responde positivamente ao estímulo do laser de baixa intensidade aumentando

a proliferação celular.

49

Hou JF, et al. (2008), estudando a aplicação do laser de baixa

intensidade 635nm, 60mW; 0,5, 1, 2, 5 J/cm², em culturas de células tronco de

medula óssea, concluíram que ele é capaz de estimular a proliferação,

aumentar a secreção de fatores de crescimento, e facilitar a diferenciação

miogênica nesse tipo celular.

Bouvet-Gerbettaz S, et al. (2009), estudando os efeitos da aplicação do

laser de baixa intensidade 808mW, 4J/cm², na proliferação de células tronco

mesenquimais (de ratos murine) e em sua diferenciação, causada por

indutores, em osteoblastos e osteoclastos concluíram que não houve diferença

estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo controle.

Horvát-Karajz K, et al. (2009), estudaram o efeito de drogas que inibem

a proliferação de células tronco mesenquimais em conjunto com a aplicação de

laser de baixa intensidade, e concluíram que quando o laser é aplicado em

baixas doses (1,9 J/cm²) é capaz de inibir ou atenuar a citotoxicidade dessas

drogas, mas quando é aplicado em altas doses (11,7J/cm²) a citotoxicidade

delas aumenta.

Zhang H, et al. (2010), demonstraram que o laser de baixa potência

aplicado previamente ao implante celular pode remodelar o ambiente hostil do

miocárdio infartado e aumentar a sobrevivência e potencial terapêutico das

células tronco de medula óssea implantadas, aumentando a taxa de

sobrevivência de células novas, diminuindo a apoptose dessas células tronco

implantadas no miocárdio infartado e aumentando a quantidade de novos

capilares.

Lin F, et al. (2010), revisando o uso do laser de baixa intensidade em

células tronco, afirmaram que ainda não existe um protocolo definido devido à

variedade de fontes freqüências e intensidades utilizadas, a habilidade de

produzir fatores de crescimento, inibir a inflamação, estimular a angiogênese, e

efeitos diretos sobre as células tronco sugerem que é necessário combinar

essa modalidade de tratamento com a medicina regenerativa.

50

Li WT, et al. (2010), aplicando em protocolo único ou múltiplo, laser de

baixa intensidade (630nm) em células tronco de medula óssea, com potência

variando de 5 a 15 mW/cm2, densidades de energia variando entre 2 e 4 J/cm2

concluíram que a proliferação celular bem como o potencial osteogênico das

células é potencializado pela múltipla aplicação do laser.

Alghamdi KM, et al. (2011), ao revisar a literatura sobre a aplicação de

laser em diversos tipos de cultura celular inclusive células tronco, encontraram

aumentos da taxa de ATP e RNA e aumento da síntese de DNA, sem causar

efeito citotóxico, salientando que os resultados dependem do comprimento de

onda (entre 600 e 700nm) e da densidade de energia aplicada, entre 0,5 e 4

J/cm2,

Soleimani M, et al. (2011), ao irradiar células tronco de medula óssea

induzidas a diferenciar-se em neurônios e osteoblastos, com laser de arseniato

de gálio alumínio, em doses de 3 a 6 J/cm2 concluíram que tanto a proliferação

quanto a diferenciação nesses tipos celulares foi estatisticamente significante

podendo melhorar os métodos de cultura e diferenciação celular antes de

serem transplantadas.

Tuby H, et al. (2011), após aplicarem laser de baixa intensidade em

células tronco de medula óssea de ratos submetidos a infarto do miocárdio,

concluíram que os ratos que receberam a aplicação do laser tiveram uma

redução do tamanho do infarto 76% e da dilatação ventricular 75% em relação

a um grupo controle, devido à influência direta do recrutamento dessas células

da circulação sanguínea para a região infartada a ser reparada.

Primo FL, et al. (2011) estudando a aplicação de laser de baixa

intensidade em fibroblastos e em células tronco concluíram que é possível usar

o efeito fotomodulatório do laser no processo de cicatrização e induzir a

liberação de biomoléculas também relacionadas ao processo inflamatório de

cicatrização.

Saygun, Işıl (2012), utilizando células tronco mesenquimais cultivadas

em meio de cultura osteogênico, analisou a multiplicidade de doses, dose única

51

(685 nm, 25 mW, 14.3 mW/cm2, 140 s, 2 J/cm2) e 2 dias consecutivos

comparados ao controle não irradiado, concluindo que a proliferação,

viabilidade, e expressão de bFGF, IGF-I, e IGFBP3, em todos os grupos

irradiados estava aumentada e que isso se deveu a uma potencialização dos

efeitos dos fatores de crescimento.

Kim H, (2012), usou LBI nas células tronco de tecido adiposo

implantadas em feridas de ratos e concluiu que ele exerceu efeito

bioestimulatório estimulando a secreção de fatores de crescimento no local da

ferida e acelerando a cicatrização.

Wu JY, (2013), utilizando o laser vermelho, GaAlAs, 660nm, em hADSCs

reduziu a produção de citoquinas lipopolissacaride-induzidas, Cox-2, IL-1B, IL-

6, e IL-8 devido ao aumento do cAMP que diminui a atividade transcricional do

fator NF-kB com a aplicação de uma dose de 8J/cm2 e uma densidade de

potência de 15,17mW resultando em uma exposição de 528 segundos.

Wu J Y, (2013), utilizou o laser vermelho, 660nm, em culturas de células

do ligamento periodontal, concluindo que 2J/cm2 foram capazes de aumentar a

proliferação e que 2 e 4 J/cm2 aumentaram a produção de fosfatase alcalina, e

a deposição de cálcio, demonstrando ainda que o cAMP é um importante

regulador dos efeitos do laser.

Basso F G, (2013), analisou os efeitos do laser infra vermelho, InGaAsP,

780nm, em queratinócitos utilizando um protocolo de aplicação em três dias

consecutivos com doses ótimas variando entre 0,5 e 5J/cm2, obtendo como

resultado um aumento da proliferação, e do processo de cicatrização, com

aumento do colágeno tipo 1 e do VEGF.

Parenti S I, (2013), utilizando o laser infravermelho, 915nm, em

osteoblastos em protocolo de aplicação única, dose de 2J/cm2, analisou a

variação da densidade de potência 10, 50, 90mW, o que resultou numa

exposição de 157, 31, 17 segundos ao laser e concluiu que não houve

produção de efeitos em nenhuma das energias aplicadas comparadas ao grupo

controle.

52

Szymanska J, (2013), analisou os efeitos do laser vermelho 635nm,

1,875mW/cm2 e infravermelho 830nm, 3,75mW/cm2, na proliferação de células

endoteliais com doses que variaram entre 2 e 8 J/cm2, concluindo que o laser

vermelho aumenta significativamente a proliferação dessas células diminuindo

a concentração de VEGF-A e que o laser infravermelho diminui a concentração

de TGF-B.

Leonida A, (2013), utilizou o laser Nd:Yag, 15Hz, em dois grupos 100mJ,

1,5W e 150mJ, 2,25W, aplicados por 7 e 14 dias, em culturas de células tronco

de medula óssea expostas a meio de cultura osteogênico, e concluiu que

apesar de não haver efeito proliferativo, a diferenciação celular ocorreu de

forma exponencial a partir do 14 dia.

Tuby, H, (2013), analisou os efeitos do laser em vários órgãos após a

aplicação de laser com variação da densidade de potência de 4, 10, 18, 40

mW/cm2, por 100 segundos, na medula óssea da tíbia de ratos vivos que foram

monitorados por oito meses e sacrificados, não constatando alterações

histopatológicas ou neoplásicas nem em doses consideradas ótimas e nem em

doses cinco vezes maior, em nenhum dos órgãos analisados, (fígado, rim,

cérebro ou medula óssea).

Jawad M M, (2013), utilizou o laser infravermelho, 940nm, em

osteoblastos e concluiu que a proliferação e diferenciação aumentou em todos

os grupos irradiados, com maior proliferação e diferenciação observada nos

grupos irradiados por 6 minutos sendo a maior taxa de proliferação observada

no grupo tratado com 300mW, e as maiores taxas de diferenciação nos grupos

tratados com 100 e 200mW.

Lins E C, (2013), utilizando laser infravermelho, 785nm, para irradiar

culturas de células idealizou um protótipo de aplicação em uma maior área da

placa de cultura, diminuindo 10 vezes o tempo de irradiação do laser e

homogeneizando a incidência de energia nas células.

Oliveira CF, (2013), analisando os efeitos do laser infravermelho 808nm

em culturas de odontoblastos MDPC-23 irradiados com 15 e 25 J/cm2 por três

53

dias consecutivos na busca da dose ideal para o tratamento da

hipersensibilidade dentinária, concluiu que após 72 horas da ultima aplicação,

houve bioestimulação transdentinária das culturas irradiadas com 25 J/cm2,

aumento da proliferação celular, da expressão da fosfatase alcalina e do

colágeno tipo 1.

Pansani T N, (2014), analisando os efeitos do laser infra vermelho,

InGaAsP, 780nm, 25mW, 0,5 e 3J, aplicado durante 3 dias consecutivos a

fibroblastos, constatou aumento na proliferação celular em ambas as

aplicações e menor taxa de apoptose nas culturas irradiadas.

Dillenburg (2014), avaliando os efeitos fisiológicos da LLL na produção e

no acumulo de ROS, instabilidade genômica e danos ao DNA de células

epiteliais humanas concluiu que ao contrario das doses altas em torno de

20J/cm2 as doses baixas em torno de 4J/cm2 resultam em acumulo de ROS

sem induzir danos ao DNA ou instabilidade genética, e que esses resultados

explicam a aceleração no processo de cicatrização observado clinicamente

Pagin, (2014) comparando os efeitos do LED 60mW/cm2 por 50 a 83

segundos e do laser vermelho 660nm e infravermelho 780nm,1W/cm2, 3 e 5

J/cm2 por 2 a 5 segundos na proliferação e diferenciação de pré osteoblastos

concluiu que todas as irradiações produziram efeitos proliferativos após 24

horas com menor resultado nas irradiações com led e maior resultado na

irradiação com 5 J/cm2 de laser vermelho não obtendo resultados significantes

na região do infravermelho.

Gupta A, (2014), analisou os efeitos do laser vermelho 635nm e infra

vermelho 730, 810, 980nm, com densidade de energia de 4J/cm2, densidade

de potência de 10mW/cm2, em feridas dérmicas e constatou que os

comprimentos de onda de 635 e principalmente 810nm promoveram

cicatrização, devido ao aumento do colágeno, aceleração da reepitelização e

proliferação celular, atribuindo a resposta parcial com 635nm e a ineficácia dos

outros comprimentos de onda ao espectro de absorção da energia pelo

citocromo c oxidase.

54

Arany, P. (2014) afirmou que LBI pode ser usado como uma ferramenta

minimamente invasiva que induz a produção de ROS de forma dose

dependente, para ativar um fator de crescimento latente, o transforming growth

factor–β1 (TGF-β1), via uma metionina residual especifica na posição 253 do

LAP como os odontoblastos em capeamentos pulpares diretos.

Avci P. (2014), revisando a aplicação do laser de baixa intensidade em

pacientes quimioterápicos e portadores de alopecia arreata concluiu que o

mecanismo de estimulação esta ligado as células tronco epidermais do folículo

piloso, entretanto a dose ótima e o comprimento de onda ideal ainda não foram

determinados.

3 OBJETIVO

Avaliar a viabilidade celular e a produção de ROS em células tronco de

cordão umbilical, de medula óssea e de ligamento periodontal humanas

irradiadas com laser de baixa intensidade com diferentes densidades de

energia, potências e comprimentos de onda.

55

4 MATERIAIS E MÉTODO

Os experimentos foram realizados na UMR 3765 do Biopólo da

Universitè de Lorraine, em Nancy, Franca, com a colaboração da Profa. Dra.

Natalia de Isla.

O tratamento foi executado com o espectro (contínuo), variando a

potência do aparelho (30, 50, 100mW), o comprimento de onda (660, 830nm),

e a energia aplicada (1, 6, 12J).

Após o plaqueamento, o laser foi aplicado às células com intervalos de

24, 48 e 72 conforme o protocolo clinico de aplicação descrito por Genovese

em 2000 e amplamente utilizado na literatura.

Foram feitos os testes de Alamar Blue para analisar a viabilidade celular,

da sonda DHR (dihidrorodamina) para verificação da produção de ROS, os

resultados obtidos foram submetidos aos testes estatísticos abaixo descritos.

O projeto foi avaliado e aprovado pela Comissão de Ética para Análise

de Projetos de Pesquisa, na Universidade Cruzeiro do Sul (anexo).

4.1 Amostra

As células tronco mesenquimais de cordão umbilical e de medula óssea

utilizadas nesse trabalho foram gentilmente cedidas pelo Biopólo da Universitè

de Lorraine, e as células tronco mesenquimais de ligamento periodontal foram

gentilmente cedidas pelo dipartamento de Scienze Mediche, Orali e

Biotecnologiche dell’Università degli Studi G. D‘Annunzio em Chieti-Pescara,

Itália.

4.2 Descrição dos materiais utilizados

56

Cultura celular

Meio de cultura Alfa Mem Eagle, ref. BE12-169F, Lonza, France.

Meio de cultura sem corante DMEM F12 , ref. 21041-21, Gibco, France.

Antifúngico anfotericina B, ref. 15290, Gibco, France, utilizado em uma

concentração de 2,5µg/mL

Antibiotico penicilina, ref. 15070, Gibco, France utilizado em uma

concentração de 10 mU/mL.

L-Glutamine, ref. G7513, Sigma, France, usado em uma concentração

de 2mM.

Soro fetal bovino, SFB, Sigma, France.

Tampão HBSS, Hank’s ballanced salts solution, ref. H2378, Sigma

Aldrich, France, sem Ca2+ e Mg2+

Tripsina-EDTA à 0,05% ref. 25300, Sigma, France.

Solução tampão salina, PBS, ref. 14190, Invitrogen, France.

DMSO, dimetil sulfóxido, ref. D5879, Sigma Aldrich, France.

Meio de cultura completo para cultivo de células tronco: alfa MEM+SFB

à 10%+Glutamina+Antibiotico.

Solução de congelamento de células: DMSO diluído a 10% em soro fetal

bovino.

Garrafas de cultura de 75mL com tampa e filtro, ref. CC7682-4875,

CytoOne.

Pipetas de 10 e 25 mL.

Álcool 70 gl.

57

Câmara de fluxo.

Estufa.

Aparelho de laser

O aparelho de Laser Utilizado para o experimento foi o Thera Lase,

DMC, São Carlos, Brasil. (Figura 10).

Especificações técnicas:

Características elétricas

Tensão de operação: 90V a 240V

Fusível: 3 A

Potência: 9W

Emissor visível: Laser vermelho

Comprimento de onda: 660nm

Potência útil do emissor: 30, 50, 100mW

Meio ativo: InGaAlP

Emissor invisível: Laser infravermelho

Comprimento de onda: 830nm

Potência útil do emissor: 30,50, 100mW

Meio ativo: AsGaAl

Secção transversal da ponta aplicadora: 0,0283cm2

58

Figura 10 – Figura ilustrando aparelho Thera Lase, ma rca DMC, utilizado no experimento.

Tratamento (aplicação do laser)

Placas de cultura com 96 orifícios de fundo chato, suporte para a

ponteira do laser, folha de cartolina preta 12 X 18 cm, folha de papel cartão

enrolada em papel alumínio 8 X 5,5 cm, envelopes de papel grau cirúrgico de 9

X 25 cm.

Teste de viabilidade celular

Alamar Blue, ref. DAL1100, Invitrogen, France, usado a 10%.

Meio de cultura sem coloração DMEM F12 ref. 21041-021, Gibco,

France.


Folha de papel alumínio.

Teste de ROS

Sonda DHR, (dihidrorodamina) ref. D1054, Sigma-Aldrich, France.

Meio de cultura sem coloração DMEM F12 ref. 21041-021, Gibco,

France.

59


Folha de papel alumínio.

Leitura dos resultados.

4.3 Cultura celular

As células tronco de medula óssea, da geléia de Warton e de ligamento

periodontal foram descongeladas, adicionado ao vaio de 1ml(P1), 2ml de meio

de cultura e centrifugadas a 1500RPM por 10 minutos, descartado o

sobrenadante e ressuspensas em garrafas de 75cm², a quantidade de células

foi medida com o auxílio de uma câmara de Thoma numa densidade inicial de

103/cm2, com 8ml de meio de cultura alfa MEM completo, mantidas em estufa a

37°C com atmosfera de 5% de CO², e cultivadas trocando o meio a cada três

dias, após uma semana atingiram confluência, foram tripsinisadas, contadas e

transferidas em P3 para uma placa de 96 furos em uma densidade de 4x102

por poço em 100µl de meio de cultura, o excedente celular de cada passagem

foi levado ao congelador -80°C.

4.4 Protocolo de irradiação

Foram deixadas livres as colunas e linhas das margens da placa para

evitar erros na análise do espectrofotômetro. A primeira coluna foi mantida

como controle, à segunda foi aplicado laser com uma energia de 1J, energia

mais utilizada até hoje na literatura, à terceira 6J, e a quarta 12J, energias que

produziram maiores efeitos proliferativos com menor quantidade de radicais

livres em nosso trabalho precedente.

Sob a placa foi colocada uma cartolina preta de 12 X 18 cm e sobre as

colunas não utilizadas no ato da aplicação do laser foram colocados cartões de

cartolina de 8 X 5,5 cm embrulhados em papel alumínio deixando livre somente

a coluna utilizada no ato do tratamento, os papéis foram embalados em papel

grau cirúrgico e esterilizados em autoclave Sercon.

60

Os envelopes só foram abertos antes de iniciar a aplicação do Laser

dentro da câmara de fluxo.

A irradiação das células com o laser foi feita em ambiente estéril, câmara

de fluxo.

Foi adaptado um suporte para tubos de ensaio para segurar a ponteira

do aparelho de Laser durante a aplicação da energia, esse foi completamente

higienizado com álcool 70 antes de ir ao fluxo.

A aplicação do laser baseou-se no protocolo clinico estabelecido por

Genovese em 2000, três dias consecutivos. Assim, foi iniciada 24 horas após o

plaqueamento, 48, e 72 horas. As irradiações foram feitas através de fibra

óptica utilizando-se o método direto e pontual sobre cada poço da placa.

O tempo de aplicação foi determinado pelo próprio aparelho de acordo

com a densidade de energia aplicada.

61

Figura 11 – Figura ilustrando o experimento montado no interior da câmara de fluxo laminar.

Os comprimentos de onda utilizados foram 660 e 830nm.

O meio ativo é o InGaAlP no espectro visível e o AsGaAl no espectro

invisível e AsGaAl no laser infravermelho.

As potências do aparelho utilizadas foram 30, 50 e 100mW.

O espectro utilizado foi o contínuo.

O grupo controle não foi irradiado.

Assim, 24 horas após o plaqueamento, as placas de 96 orifícios com as

células foram retiradas da estufa e levadas ao fluxo, onde já estavam o suporte

para a ponteira do laser, os envelopes de papel grau cirúrgico com a cartolina e

os papéis alumínios, e a ponta aplicadora do laser que foi calibrada a cada

mudança de energia no calibrador localizado no próprio aparelho.

62

A densidade de energia aplicada à uma superfície é calculada dividindo-

se a energia produzida pelo aparelho pela área de incidência do feixe de laser,

o aparelho já fornece a densidade de energia baseada na área da ponta

aplicadora, com secção transversal de 0,028 cm2.

O aparelho permite ajustar a área de aplicação do laser, assim, foi feito o

cálculo da área do poço da placa de 96 furos para que a densidade de energia

aplicada fosse referente à área do poço, de forma a atingir, produzindo efeitos,

todas as células ali contidas, para tanto utilizou-se o cálculo da área do círculo,

já que a cultura de células foi feita em 2D e portanto a espessura da camada

de células pode ser considerada desprezível.

a= Pi x R2 a= 3,14 x 3,52mm a=3,14x12,25mm2 a= 38,46mm2

Assim, foi inserida no aparelho a área em que o laser iria incidir e ele

calculou o tempo de aplicação automaticamente de acordo com a variação da

potência selecionada conforme a tabela 1.

energia aplicada 1J/CM2 6J/CM

2 12J/CM

2

tempo de aplicação para

potência aplicada de

30mW

10 S 70 S 150 S



50mW

1 S 40 S 90 S



100mW

1 S 20S 40 S

TABELA 1 - tempo exposição ao laser em função da densidade de energia e da

densidade de potência.

63

O experimento foi realizado em sextuplicata para cada variação de

parâmetro utilizado.

4.5 Teste de Viabilidade celular (Alamar Blue)

O Alamar Blue é uma substância sem efeito tóxico que adicionada as

culturas celulares entra no citoplasma, sofre a ação da atividade enzimática

mitocondrial, aceitando elétrons de NADPH, FADH, FMNH, NADH, além dos

citocromos, mudando de cor de azul escuro para rosa fluorescente à medida

que ocorre essa redução, podendo assim ser facilmente detectada pelo

espectrofotometro, portanto, quanto maior a atividade mitocondrial maior será a

redução da solução de Alamar Blue e a alteração de cor.(FIELDS, RD. 1993)

24 horas após a última aplicação do laser foi preparada uma solução

com 18 mL de meio de cultura alfa Mem e 2mL de Alamar Blue, as placas

foram retiradas da estufa, e aspirado o sobrenadante, a cada poço com as

células foi adicionado 100µL da solução de alamar, as placas foram embaladas

em papel alumínio e levadas novamente à estufa por 3 horas, o sobrenadante

foi aspirado e os poços lavados com PBS, em uma coluna separada foi

aplicado somente a solução de alamar para servir como controle (do alamar e

não do tratamento).

As placas foram levadas ao espectrofotômetro para leitura à 570nm

(absorbância dos compostos reduzidos), à 600nm (absorbância dos compostos

oxidados). A porcentagem de oxidação reflete a atividade metabólica da célula.

4.6 Teste da concentração de radicais livres (DHR - dihidrorodamina)

A sonda DHR (dihidrorodamina 123) é uma molécula muito utilizada na

detecção de radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ROS) 1-3 devido a

sua capacidade de fluorescer, pois na presença destas substâncias, a

dihidrorodamina oxida-se e forma a rodamina, que é fluorescente. Nesse

experimento a DHR se ligou aos radicais livres produzidos no interior do

citoplasma e devido a sua coloração alaranjada puderam ser identificados pelo

64

espectrofotometro produzindo uma leitura que variou em função da

concentração de ROS presente.(EMMENDORFFER A, 1990)

24 horas após a última aplicação do laser foi preparada uma solução

com 20 mL de meio de cultura alfa Mem sem corante e 20µL de sonda DHR, as

placas foram retiradas da estufa, e aspirado o sobrenadante, os poços foram

lavados com 200 µL de PBS, deixados por 5 minutos e aspirados, foi

adicionado 150µL da solução com a sonda DHR a cada poço, as placas foram

embaladas em papel alumínio e levadas novamente à estufa por 1 hora, o

sobrenadante foi aspirado e adicionado 150 µL de meio de cultura alfa MEM

sem corante a cada poço.

As placas foram levadas ao espectrofotômetro para leitura.

4.7 Análise estatística

Alamar Blue

Os dados obtidos no teste colorimétrico de Alamar Blue foram

transferidos para uma tabela no ExcelR e submetidos a seguinte fórmula:

(117,216 * absorbância da amostra a 570nm) - (80,586 * absorbância da amostra a 600nm) *100

(155,677 * absorbância do controle a 570nm) - (14,652 * absorbância do controle a 600nm)

O resultado foi uma nova tabela, foi extraída a média e o desvio padrão

de cada grupo.

Com o intuito de poder comparar todos os grupos foi feita uma regra de

três deixando todos os controles com o mesmo valor, após isso, essa regra de

três foi estendida para os valores lidos.

Foram produzidos gráficos para cada tipo celular e comprimento de

onda para avaliação dos resultados decorrentes da variação da potência do

65

aparelho, da energia aplicada e do tempo de exposição e relacionando a

viabilidade celular do grupo controle com a viabilidade celular nos grupos

tratados com as diversas energias do laser.

Os resultados foram ainda submetidos à análise estatística de variância

ANOVA e ao teste múltiplo de Tukey-Kramer utilizando o programa Graphpad

Prism versão 5.0 para avaliar a significância dos resultados.

A média obtida no grupo controle foi associado o valor de 100% de

quantidade de células. Às médias de cada coluna tratada com laser foi

associado um valor de viabilidade celular usando para isso uma regra de três

relacionando-as ao grupo controle.

Dihidrorodamina (DHR)

Os resultados obtidos com a sonda DHR (dihidrorodamina) para

detecção de ROS foram transferidos para uma tabela no ExcelR, extraída a

media e o desvio padrão de cada grupo.

Com o intuito de poder comparar todos os grupos foi feita uma regra de

três deixando todos os controles com o mesmo valor, após isso, essa regra de

três foi estendida para os valores lidos.

Foram produzidos gráficos para cada tipo celular e comprimento de onda

para avaliação dos resultados decorrentes da variação da potência do

aparelho, da energia aplicada e do tempo de exposição e relacionando a

quantidade de radicais livres presentes no citoplasma do grupo controle com a

quantidade presente nos grupos tratados com as diversas energias do laser.

Os resultados foram submetidos à análise estatística de variância ANOVA Foram

feitas 4 ANOVAS para os resultados de ALAMAR e de ROS, para cada comprimento

de onda 830 e 660nm, comparando a interação de três fatores

(LINHAGEM*POTÊNCIA*DENSIDADE DE ENERGIA) através do teste de múltipla

comparação ajustado de BONFERRONI. Os grupos foram classificados em ordem

66

decrescente, além disso, a presença de LETRA ou LETRAS que se repetem, significa

que os grupos em questão são semelhantes estatisticamente, quando não há

repetição os grupos são diferentes estatisticamente entre si.

5 RESULTADOS

5.1 Aspectos morfológicos das células tratadas com laser.

Fotografias de microscopia ótica do experimento.

Foi dado ênfase às células tronco do ligamento periodontal devido à

intenção de utilizá-las em futuros experimentos, portanto fotografamos o grupo

com células hPDLSCs não irradiado com laser que serviu como controle,

células mostrando confluência.

As células aderentes apresentam forma semelhante a fibroblastos,

sendo pequenas, alongadas, com formato fusiforme ou estreladas, com

prolongamentos citoplasmáticos discretos.

67

Figura 12 – Fotomicrografia com aumento de 20 vezes da cultura celular

em P2 em garrafa de 75 ml, forma semelhante a fibroblastos, sendo

pequenas, alongadas, com formato fusiforme ou estreladas, com

prolongamentos citoplasmáticos.

68

Figura 13 – Fotomicrografia com aumento de 20 vezes da cultura celular

em P3 em placa de 96 furos, forma semelhante a fibroblastos, sendo

pequenas, alongadas, com formato fusiforme ou estreladas, com

prolongamentos citoplasmáticos.

5.2 Teste colorimétrico de Alamar Blue

As células tronco mesenquimais provenientes dos diferentes tecidos

reagem de forma diferente à variação da densidade de potência da energia do

laser e do tempo de irradiação. Para cada tipo celular, uma densidade de

potência produziu uma resposta à variação da densidade de energia

diretamente proporcional ao aumento da densidade óptica, medida em

nanômetros, aumentando a quantidade de células à medida que a energia do

laser é aplicada.

Para as hWJMSCs, as maiores proliferações foram obtidas nas

irradiações com laser infra-vermelho, que receberam 12 Joules /cm2 com 100

mW seguidas pelas irradiações de 6 e 1 Joules /cm2 todas estatisticamente

significantes em relação ao controle. Portanto, para essa densidade de

potência à medida que a energia do laser aplicada às células aumentou, foi

constatado aumento em uma razão diretamente proporcional da viabilidade

celular.

*

* *

* * *

*

hWJMSCs hWJMSCs

1j/cm² 6j/cm² 12j/cm²

69


células-tronco (hWJMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser

infravermelho 830nm, com 30, 50 e 100mW de potência após a coloração com

o Alamar Blue, avaliação em função da densidade de energia à esquerda e da

potência à direita.


células-tronco (hWJMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser vermelho

660nm, com 30, 50 e 100mW de potência após a coloração com o Alamar

Blue, avaliação em função da densidade de energia à esquerda e da potência à

direita.

Para as hBMSCs, as maiores proliferações foram obtidas nas

irradiações com laser infra-vermelho, que receberam 12 e 6 Joules /cm2 com 50

mW estatisticamente significantes em relação ao controle, seguidas pelas

irradiações de 1 Joules /cm2. Portanto, para essa densidade de potência à

medida que a energia do laser aplicada às células aumentou, foi constatado

aumento em uma razão diretamente proporcional da viabilidade celular.

hWJMSCs hWJMSCs


70


células-tronco (hBMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser infravermelho



direita.


células-tronco (hBMSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser vermelho e



direita.

* * * * * *



71

Para as hPDLSCs, as maiores proliferações foram obtidas nas

irradiações com laser infra-vermelho, que receberam 12 Joules /cm2 com 30

mW seguidas pelas irradiações de 6 e 1 Joules /cm2 entretanto sem

significância estatística. Portanto, para essa densidade de potência à medida

que a energia do laser aplicada às células aumentou, foi constatado aumento

em uma razão diretamente proporcional da viabilidade celular mas sem

significância estatística.


células-tronco (hPDLSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser

infravermelho 830nm, com 30, 50 e 100mW de potência após a coloração com

o Alamar Blue, avaliação em função da densidade de energia à esquerda e da

potência à direita.

1j/cm²

6j/cm² 12j/cm²

72


células-tronco (hPDLSCs) irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser vermelho



direita.

A aplicação dos testes estatísticos de variância ANOVA e Bonferroni

obteve resultados de aumento da viabilidade celular estatisticamente

significantes, nas irradiações de células da geléia de Warton e da medula

óssea, com 100mW e 50 mW respectivamente, em relação aos seus controles

não irradiados.

5.3 Teste colorimétrico da sonda ROS

Para as hWJMSCs, as maiores concentrações de ROS foram obtidas

nas irradiações com laser infra vermelho, que receberam 12Joules /cm2 com

100 mW seguidas pelas irradiações de 6 e 1 Joules /cm2. Portanto, para essa

densidade de potência à medida que a energia do laser aplicada às células

aumentou, foi constatado aumento em uma razão diretamente proporcional da

concentração de ROS.


73

Gráfico 7 – Gráfico mostrando a concentração de ROS (radicais

livres presentes no citoplasma) das culturas de células-tronco (hWJMSCs)

irradiadas com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser infravermelho 830nm, com 30, 50

e 100mW de potência após a coloração com a sonda DHR, avaliação em

função da densidade de energia à esquerda e da potência à direita.


presentes no citoplasma) das culturas de células-tronco (hWJMSCs) irradiadas

com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser vermelho 660nm, com 30, 50 e 100mW de

potência após a coloração com a sonda DHR, avaliação em função da

densidade de energia à esquerda e da potência à direita.

Para as hBMSCs, as maiores concentrações de ROS foram obtidas nas

irradiações com laser infra vermelho, que receberam 12 Joules /cm2 com 50


POWER


POWER

74

mW seguidas pelas irradiações de 6 e 1 Joules /cm2. Portanto, para essa






com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser infravermelho 830nm com 30, 50 e 100mW de






POWER


POWER

75

com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser vermelho 660nm, com 30, 50 e 100mW de



Para as hPDLSCs, as maiores concentrações de ROS foram obtidas nas

irradiações com laser infravermelho, que receberam 12 Joules /cm2 com 30

mW seguidas pelas irradiações de 6 e 1 Joules /cm2. Portanto, para essa





presentes no citoplasma) das culturas de células-tronco (hPDLSCs) irradiadas

com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser infravermelho 830nm, com 30, 50 e 100mW de




POWER

76


presentes no citoplasma) das culturas de células-tronco (hPDLSCs) irradiadas

com 0,1, 6, 12J/ cm2 de laser vermelho 660nm, 30, 50 e 100mW de potência

após a coloração com a sonda DHR, avaliação em função da densidade de

energia à esquerda e da potência à direita.

Aplicados os testes estatísticos ANOVA e Bonferroni não se constatou

aumento da quantidade de ROS com significância estatística em nenhuma das

irradiações.


POWER

77

6 DISCUSSÃO

Célula-tronco mesenquimal

Em geral as células-tronco mesenquimais são definidas a partir de um

conjunto de características apresentadas in vitro, incluindo a combinação de

marcadores fenotípicos e propriedades funcionais de diferenciação.

Nos últimos anos as terapias com células tronco tem evoluído

principalmente no combate ao câncer, devido a sua capacidade de ultrapassar

as defesas imunológicas,(BIBBER 2013) e migrar para os tecidos doentes,

inclusive o tumoral (DWYER 2013, KE 2013), identificando seus mecanismos

de recrutamento e interação celular,(ESPINOZA 2013,VALLABHANENI 2014)

levando e ate mesmo produzindo drogas que combatem tumores diretamente

no local,(BITSIKA 2013) diminuindo os efeitos colaterais dos quimioterápicos e

produzindo efeitos que inibem o crescimento de novos tumores do mesmo

tipo.(DWYER 2013) Informações mais detalhadas sobre a interação entre as

células tronco mesenquimais e os tecidos tumorais levarão indubitavelmente a

terapias celulares mais eficazes e seguras.(HONG 2014, VALLABHANENI

2014)

A utilização de células-tronco mesenquimais na bioengenharia tecidual

em associação a biomateriais, também tem demonstrado resultados

promissores, sendo possível já produzir diversos tecidos celulares, em culturas

3D,(LI 2014) com os mais diversos tipos de material com propriedades

mecânicas (SUH 2014) e taxa de reabsorção compatível com a atividade

celular,(BAJAJ 2014) que imitam a matriz extracelular, podendo ser naturais e

sintéticos,(REZWAN 2014) inclusive com fatores de crescimento (SAHOO

2014) que ajudam a proliferação e diferenciação da célula-tronco enxertada no

tipo celular desejado, entretanto ainda esbarramos na proliferação e adesão ao

sistema já existente no organismo de um feixe vásculo-nervoso permitindo a

construção de tecidos espessos e até mesmo de órgãos inteiros.

78

Diferentemente do que ocorre em outros órgãos a medula óssea é

composta por dois sistemas de células-tronco, o sistema hematopoiético e o

sistema estromal (BIANCO et al., 2006). No entanto as células progenitoras

multipotentes que são definidas como células-tronco mesenquimais, ganharam

destaque nas pesquisas com células-tronco, devido ao seu fácil isolamento in

vitro e seu potencial de diferenciação em linhagens mesodermais. Estas

células já foram bem caracterizadas in vitro, sendo demonstrada sua habilidade

em diferenciar-se em osso, cartilagem, músculo, estroma medular e tendão,

derme, gordura. Outra característica importante é sua atuação

imunonoduladora (CAPLAN, 1991, 2005).

Nos últimos anos as células-tronco mesenquimais da medula óssea têm

despertado grande interesse devido ao seu possível potencial de envolvimento

no processo de reparo tecidual. Sendo assim, estas células são um dos tipos

de células-tronco mais estudados.

Atenção tem sido dada as células-tronco cuja utilização não esbarra em

princípios éticos, como as da geléia de Warton,(TALAR 2013) e as que podem

ser obtidas facilmente de maneira autóloga visando facilitar a aplicação na

engenharia tecidual como as de tecido adiposo (BIBBER 2013) e de ligamento

periodontal.(YANG, Z. 2009, GE, S. 2013, KATO, H. 2014, YUDA, A. 2014,

HAKKI, S. 2014 e TRUBIANI, O. 2014)

Essas ultimas vem sendo obtidas de terceiros molares extraídos,(KATO,

H. 2013, KATO, H. 2014 e HAKKI, S. 2014) de pré-molares extraídos,(KATO,

H. 2013, KATO, H. 2014 e HAKKI, S. 2014) e do sulco gengival de dentes

saudáveis,(TRUBIANI, O. 2004) ou mesmo periodontalmente comprometidos

(CHEN, S C. 2006)

Segundo Trubiani em 2004, essas células-tronco de ligamento

periodontal exprimem os seguintes marcadores de superfície CD29, CD90,

CD44, CD105, CD166, sua extração a partir de uma curetagem do ligamento

periodontal na região do sulco gengival tem característica pouco invasiva, já

que não ha necessidade de extrair um dente para obtê-las, além de apresentar

79

grande capacidade proliferativa (WADA, N. 2009, HYNES, K. 2012) levantam

assim grandes possibilidades quanto à engenharia tecidual com células

autógenas, e portanto sem enfrentar o fator de rejeição, devido a suas

propriedades imunossupressoras,(WADA, N. 2009) não somente dos tecidos

orais, pois são capazes de se diferenciar em tecidos de linhagem mesenquimal

principalmente em osteoblastos, fibroblastos e cementoblastos, (SEO, B. 2004,

TRUBIANI, O. 2008, GAY, I. 2007) mas também em tecidos de outras regiões

do corpo como por exemplo tendões.(MOSHAVERINIA 2014)

Laserterapia de baixa intensidade em células-tronco

Os experimentos que incluem a irradiação de células-tronco vem

crescendo muito nos últimos dez anos, tendo sido realizados em células-tronco

cardíacas, de polpa dental, de ligamento periodontal, e mesenquimais obtidas

da medula óssea ou de tecido adiposo. Além disso, constata-se que elas

vieram de diversas fontes doadoras, como: ratos, camundongos, mini porcos e

humanos.

De modo geral, as células-tronco são bastante sensíveis ao meio de

cultura, podendo apresentar comportamentos distintos na presença de meios

de cultura diferentes.(KE 2013)

Do ponto de vista da laserterapia, observa-se que existem trabalhos na

faixa do vermelho (635, 660, 680nm), e do infra vermelho, (780, 808, 830, 915),

dois trabalhos que utilizaram comprimento de onda na faixa do infra-vermelho

(808nm),(915nm) não constataram nenhum efeito proliferativo nas culturas

irradiadas, quando comparada ao controle, foram feitos experimentos com

aplicações em dose única e em múltiplas doses,(MENEGUZZO 2012, BASSO

2013).

Meneguzzo em 2012 afirmou que os experimentos realizados com

múltiplas aplicações do laser como o que foi nesse trabalho realizado são mais

eficazes no que tange a proliferação celular. Alem disso, todos as irradiações

em culturas celulares utilizaram o fluxo de energia contínuo.

80

É justo fazer a ressalva que Bouvet-Gerbettaz S, et al. (2009) verificaram

uma grande diferença entre a potência declarada e a potência real do aparelho,

após a calibração com o powermeter.

A utilização dos comprimentos de onda na faixa do vermelho parecem

ser mais apropriados em estudos de células cultivadas, uma vez que a

penetração do feixe é um fator desprezível nestas condições, entretanto alguns

autores indicam o comprimento infravermelho para tratá-las.(BASSO 2013,

LINS 2013) Esse foi um dos fatores avaliados nesse trabalho e concordamos

com esses autores.

No que concerne à densidade de energia aplicada, a maioria dos

autores utilizaram o intervalo entre 3 e 5J/cm2 , pois são tradicionalmente

encontrados na literatura apresentando efeitos proliferativos.(PRIMO FL, et al.,

2011; TUBY H, et al. , 2011; SOLEIMANI M, et al., 2011; ALGHADAMI KM, et

al., 2011, LI WT, et al., 2010; LIN F, et al., 2010; ZHANG H, et al., 2010;

BOUVET-GERBETTAZ S., et al. 2009; HOU JF, et al. 2008; EDUARDO F de P,

2008; MVULA B, et al., 2008; TUBY H, et al, 2007; LOPES-MARTINS et al.,

2007). Entretato, Horvát-Karajz K, et al. (2009) mostram efeitos proliferativos

com 11,7J/cm2. Entretanto efeitos proliferativos também foram encontrados

com a aplicação de 0,5; 1,5; 2, 8, 10,12J/cm2. (CAVALCANTI 2012, BASSO

2013)

Hou et al. em 2008 depositando diferentes densidades de energia (0,5,

1,0, 2,0 e 5,0J/cm2), Basso em 2013 (0,5, 1, 3, 5, 7J/cm2) e Szymanska em

2013 (2, 4, 8J/cm2) realizaram uma abordagem semelhante a nossa, variando

bastante a energia aplicada. Nossos experimentos, utilizando um espectro

amplo de densidades de energias (1, 6, 12J/cm2), baseado nas energias de

laser que produziram mais efeitos proliferativos com menor produção de

radicais livres em estudo preliminar com células tronco de medula óssea de

cão,(CAVALCANTI 2012) mostraram maiores efeitos proliferativos em maiores

densidades de energia (6, e 12J/cm2), analisadas morfologicamente ao

microscópio, como em nosso estudo anterior, as células também não

apresentaram diferenciação em nenhum tipo celular nem em célula neoplásica.

81

O estudo da produção de radicais livres de oxigênio foi feito pela

utilização de uma sonda de ROS dihidrorodamina, (DRH) que se liga aos

radicais livres presentes no citoplasma das células.

Espécies reativas de oxigênio são um grupo de moléculas, como: íons

superóxido, radicais hidroxil e peróxido de hidrogênio, que são altamente

reativas com proteínas e ácidos nucléicos.

Recentemente a sua atuação na modulação do metabolismo celular tem

sido ressaltada. A laserterapia de baixa intensidade tem se mostrado um

agente efetivo na modulação da produção desses radicais e de maneira mais

ampla na modulação do potencial óxido-redutor em direção à um estado mais

oxidativo. Segundo Alghamdi KM, et al. (2011), o mecanismo molecular de

proliferação esta relacionado a duplicação do nível de ATP após a absorção da

luz pelos cromóforos, que ativa os nucleotídeos P2 aumentando o cálcio

intracelular (Ca2+) e simultaneamente regula a síntese proteica, de DNA e a

expressão genética, induz a ativação das cascatas de kinases MAPK- ERK 1, 2

e P13K, cadeias de proteínas na célula que comunicam o sinal de um receptor

na superfície da membrana ao DNA do núcleo, sendo importantes guias da

proliferação e sobrevivência celular, e da RTK/PKc que promovem a

proliferação e aumentam os níveis de ROS ativando Akt e relacionando

alterações nos níveis de ROS com os efeitos secundários do laser. Essa

modulação pode implicar na indução da atividade de vários fatores

transcricionais entre eles o fator nuclear kappa beta. (HUANG YY et al., 2009.)

Schafer FQ, Buettner GR, (2001) postularam que o ambiente óxido-

redutor celular é de grande importância na modulação do metabolismo

especialmente em função do estímulo de diversas substâncias como o

NADP/NADPH, o sistema glutationa e o sistema tioredoxina. O referido autor

formulou um gráfico que representa um gradiente óxido redutivo e o seu

relacionamento com diferentes fases do ciclo celular. Na extremidade oxidativa

desse gráfico encontramos os efeitos proliferativos e à seguir os eventos de

diferenciação celular. Por outro lado, na extremidade redutora encontramos os

fenômenos de apoptose e necrose.

82

7 CONCLUSÃO

1. As células apresentaram uma variação mais evidente ao laser

infravermelho (830nm) que ao laser vermelho (660nm).

2. Respostas diferentes foram constatadas em cada tipo celular estudado

devido à variação da densidade de potência, que se traduz diretamente

pela quantidade de tempo que uma determinada energia é entregue às

células ou seja, ao tempo de irradiação.

3. Para o pico da densidade de energia, 12J/cm2, as hPDLSCs proliferaram

mais após um tempo de irradiação mais demorado, 30mW, entretanto

sem significância estatística, já as hWJMSCs reagiram a uma aplicação

mais rápida, 100mW, enquanto as hBMSCs ficaram entre as duas,

50mW, ambas estatísticamente significantes quando comparadas com

seus controles não irradiados.

4. A aplicação de diferentes densidades de energia promoveu aumento da

viabilidade das células estudadas; esse aumento mostrou significativa

correlação positiva diretamente proporcional entre a energia aplicada e a

produção de ROS, que não apresentou aumento estatisticamente

significante em nenhuma das irradiações.

83

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ANEXO

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UNIVERDIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS … · viabilidade celular e produção de ROS de células tronco mesenquimais Marcos Fernando Xisto Braga Cavalcanti Orientador: Prof