UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO · complexão destes com metais de transição, com a finalidade de se obter novas moléculas com maior atividade biológica e baixa toxicidade

UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO

Mestrado Profissional em Farmácia

Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos

Maéli Mosena Ferri Civa

Síntese, caracterização e avaliação do potencial

antioxidante de complexos metálicos de diosmina

São Paulo

2012







Dissertação apresentada à Universidade

Bandeirante de São Paulo, como requisito

de conclusão do Mestrado Profissional em

Farmácia Produtos Naturais e Sintéticos

Bioativos.

Orientadora: Profª. Drª. Regina Mara Silva

Pereira

São Paulo

2012







Dissertação apresentada à Universidade

Bandeirante de São Paulo, como requisito

de conclusão do Mestrado Profissional em

Farmácia Produtos Naturais e Sintéticos

Bioativos.

Aprovada em: ___________________________________________________

Banca Examinadora:

_______________________________________________________________

1º Membro Titular Externo: Prof. Dr. Erick Leite Bastos (USP)

_______________________________________________________________

2º Membro Titular Interno: Profª. Drª. Claudete Justina Valduga (UNIBAN)

_______________________________________________________________

Presidente - Orientadora: Profª. Drª. Regina Mara Silva Pereira (UNIBAN)

Dedico este trabalho às pessoas que

lutam diariamente ao meu lado, com

determinação, coragem e paciência, tornando os

meus dias mais fáceis e felizes, ao meu esposo

Mário, aos meus pais e irmãos pelo apoio

recebido.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela força espiritual para a realização desse trabalho.

Aos meus pais Alfeu e Maria e irmãos Marlos e Maiara, pelo orgulho, pelo

apoio, pela compreensão, e em especial, por todo carinho ao longo deste percurso.

Ao meu marido Mário, pelo carinho, apoio, compreensão e pela grande ajuda.

Aos meus amigos e a todos os colegas de curso, em especial Dayany e

Daniel, pela cumplicidade, grande ajuda e amizade.

A todos os componentes do Mestrado Profissional em Farmácia, aos técnicos

dos laboratórios, aos professores, em especial às professoras, Drª. Susana Diniz,

Drª. Claudete Valduga, Drª. Isis Arvati e Drª. Cristina Okuyama, pelo conhecimento

adquirido, e colaboração extremada.

E por fim, à professora Drª. Regina Mara Sila Pereira, pela orientação deste

trabalho, conhecimento e carinho durante todos esses meses.

“Não se pode ensinar tudo a alguém,

pode-se apenas ajudá-lo a encontrar por si

mesmo”.

Galileu Galilei

RESUMO

CIVA, M. F. Maéli. Síntese, caracterização e avaliação do potencial antioxidante

de complexos metálicos de diosmina. Dissertação. Curso de Mestrado

Profissional em Farmácia da Universidade Bandeirante (UNIBAN). São Paulo. p. 80,

2012.

A busca por novos compostos com potencial bioativo é objeto de estudo de

muitos pesquisadores, o que motiva a utilização de flavonóides, devido ao

conhecimento de suas atividades biológicas. Uma das formas de investigação é a

complexão destes com metais de transição, com a finalidade de se obter novas

moléculas com maior atividade biológica e baixa toxicidade.

O flavonóide diosmina é considerado um agente protetor vascular da

circulação periférica de retorno, utilizada para tratar a insuficiência venosa crônica,

hemorroidas, linfedema e varizes. Também possui atividade anti-inflamatória e

antioxidante. Outras atribuições recentes da diosmina vêm sendo investigadas como

agente no combate ao câncer, síndrome pré-menstrual, colite e diabetes.

A diosmina foi complexada com metais de transição Cu (II), Ni (II), Fe (II) e Co

(II). Os complexos obtidos, diosmina-Cu (II), diosmina-Ni (II), diosmina-Fe (III) e

diosmina-Co (II), foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho (IV) e

ultravioleta (UV) e também por espectrometria de massas (EM).

Neste trabalho, também foram avaliadas as propriedades antioxidante dos

complexos obtidos de acordo com a metodologia do radical orgânico ABTS˙ˉ. Os

complexos diosmina-Fe e diosmina-Cu apresentaram atividade antioxidante melhor

em comparação à diosmina e aos demais complexos.

Palavras-chave: flavonóide - diosmina - complexos - metais de transição

ABSTRACT

CIVA, M. F. Maéli. Synthesis, characterization and evaluation of the antioxidant

potential of metal complexes from diosmin. Dissertation. Professional Master

Course in Pharmacy at the University Bandeirante (UNIBAN). Sao Paulo. p. 80,

2012.

Searching for new compounds with bioactive potential, is object of study by

many researchers, which motivates the use of flavonoids because the knowledge

about their biological activities. One way of investigation is the complexation of

flavonoids with transition metals in search for new molecules with increased

biological activity and low toxicity.

Flavonoid diosmin is considered a vascular protective agent from the

peripheral circulation of return used to treat chronic venous insufficiency,

hemorrhoids, lymphedema, and varicose veins. It also has anti-inflammatory and

antioxidant activity. Other recent assignments of diosmin have been investigated as

an agent against cancer, premenstrual syndrome, colitis and diabetes.

The diosmin was complexed with transition metals Cu (II), Ni (II), Fe (II) and

Co (II). The diosmin-Cu (II), diosmin-Ni (II), diosmin-Fe (III) and diosmin-Co (II)

complexes obtained, were characterized by infrared spectroscopy (IR), ultraviolet

(UV) and by mass spectrometry (MS).

This work also evaluated the antioxidant properties of the complexes obtained,

in accordance with the methodology of organic radical ABTS˙ˉ. The complex diosmin-

Fe and diosmin-Cu showed the best antioxidant activity in comparison with diosmin

and the other complexes.

Keywords: flavonoid - diosmin - complexes - transition metals

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ciclo biossintético dos flavonóides (metabólitos secundários) ............. 18

Figura 2 - Estrutura geral dos flavonóides............................................................. 19

Figura 3 - Esqueletos básicos de flavonóides........................................................ 19

Figura 4 - Estrutura da diosmina............................................................................ 20

Figura 5 - Scrophularia nodosa.............................................................................. 21

Figura 6 - Diferença estrutural da diosmina (A) e hesperidina (B) ........................ 22

Figura 7 - Estrutura da hesperitina ........................................................................ 24

Figura 8 - Estrutura da diosmetina ..................................................................... 25

Figura 9 - Aspecto macroscópico dos complexos formados diosmina-Cu (A),

diosmina-Co (B), diosmina-Ni (C) e diosmina-Fe (D)............................

37

Figura 10 - Estrutura do radical ABTS2-..................................................................... 40

Figura 11 - Estrutura do radical ABTS˙ˉ................................................................... 41

Figura 12 - Estrutura do trolox ................................................................................. 42

Figura 13 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Cu

em azul .................................................................................................

46

Figura 14 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Ni em

azul .......................................................................................................

46

Figura 15 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Fe

em azul ................................................................................................

47

Figura 16 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Co

em azul ................................................................................................

47

Figura 17 - Espectro UV da diosmina-Cu em comparação a diosmina................... 49

Figura 18 - Espectro UV da diosmina-Ni em comparação a diosmina..................... 49

Figura 19 - Espectro UV da diosmina-Fe em comparação a diosmina ................... 50

Figura 20 - Espectro UV da diosmina-Co em comparação a diosmina .................. 50

Figura 21 - Espectros UV da diosmina em comparação aos complexos D-Cu (II),

D-Co (II), D-Fe (II) e D-Ni (II).................................................................

51

Figura 22 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Cu e seus

principais fragmentos ............................................................................

53

Figura 23 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Co e seus

principais fragmentos ............................................................................

54

Figura 24 - Estrutura proposta para os complexos da diosmina-metal (Cu, Ni e

Co).........................................................................................................

55

Figura 25 - Estrutura proposta para o complexo diosmina-Fe ................................ 56

Figura 26 - Curva de decaimento do radical ABTS˙ˉ pelo composto diosmina-Fe.. 57

Figura 27 - % Inibitória do radical ABTS˙ˉ pelas concentrações dos complexos e

da diosmina............................................................................................

57

Figura 28 - Consumo do radical ABTS˙ˉ (µM) versus as concentrações da

diosmina-Fe (µM), demonstrando o n = 3,3683 (3,4) calculado da

diosmina-Fe...........................................................................................

58

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1 - Quantidades dos reagentes utilizados para formação dos complexos.. 37

Quadro 2 - Diluições e concentrações da diosmina e dos complexos diosmina-

metal.......................................................................................................

41

Tabela 1 - Solubilidade dos compostos ................................................................. 45

Tabela 2 - Principais bandas na espectroscopia no infravermelho da diosmina e

dos complexos ....................................................................................

48

Tabela 3 - Principais bandas na espectroscopia no infravermelho da diosmina e

dos complexos ......................................................................................

52

Tabela 4 - Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) da diosmina-

e dos complexos ...................................................................................

59

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 12

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 13

2.1 Radicais livres..................................................................................... 13

2.2 Flavonóides.......................................................................................... 17

2.3 Flavonóides diosmina e hesperidina................................................... 20

2.4 A utilização terapêutica de metais....................................................... 26

2.5 Compostos de coordenação................................................................ 28

2.6 Complexação de flavonóides com metais de transição...................... 28

3 OBJETIVO............................................................................................ 33

3.1 Objetivo geral........................................................................................ 33

3.2 Objetivos específicos............................................................................ 33

4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 34

4.1 Material e equipamentos utilizados.................................................... 34

4.2 Reagentes e solventes utilizados......................................................... 35

4.3 Síntese da diosmina com os metais de transição ............................... 36

4.4 Teste de solubilidade dos compostos................................................... 37

4.5 Caracterização dos complexos ............................................................ 38

4.6 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos.......................... 39

4.6.1 Determinação da atividade antioxidante dos complexos de diosmina-

metal pela captura do radical livre ABTS˙ˉ...........................................

39

4.6.2 Preparo da solução tampão fosfato 20 mM pH 7,4 ............................. 39

4.6.3 Preparo da solução ABTS2- 2 mM ...................................................... 39

4.6.4 Preparo da solução de ABTS˙ˉ 100 µM ............................................... 40

4.6.5 Preparação das soluções de diosmina e diosmina-metal para os

testes de atividade antioxidante...........................................................

41

4.6.6 Avaliação da atividade antioxidante da diosmina e complexos

diosmina-metal.....................................................................................

42

4.6.7 Determinação da atividade antioxidante total (AAT)............................ 42

4.6.8 Determinação da capacidade antioxidante equivalente ao trolox

(TEAC)..................................................................................................

43

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................... 44

5.1 Síntese dos complexos de coordenação de diosmina-metal............... 44

5.2 Solubilidade dos complexos diosmina-metal........................................ 44

5.3 Espectroscopia no Infravermelho (IV).................................................. 45

5.4 Espectroscopia no Ultravioleta (UV)..................................................... 48

5.5 Análise elementar................................................................................. 52

5.6 Espectrometria de massas (EM).......................................................... 52

5.7 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos diosmina-metal 56

5.7.1 Método ABTS˙ˉ............................................................................. 56

6 CONCLUSÃO....................................................................................... 60

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................... 61

ANEXOS.............................................................................................. 69

12

1 INTRODUÇÃO

A oxidação é um processo metabólico presente nas células para a produção

de energia, no entanto, o metabolismo do oxigênio gera de radicais livres, que

quando em excesso, provocam danos extensivos. O estresse oxidativo vem sendo

associado ao desenvolvimento de doenças degenerativas crônicas,

cardiovasculares, inflamatórias bem como ao desenvolvimento de câncer.

Os flavonóides são substâncias naturais derivadas de metabólitos

secundários de plantas presentes principalmente nas folhas, flores e frutos, ou ainda

podem ser semissintéticos. Possuem atividade antioxidante conhecida e explorada

devido aos seus principais mecanismos de ação serem as interações diretas com

enzimas biológicas, radicais livres e metais de transição, prevenindo o organismo

dos efeitos adversos destas espécies quando geradas em excesso.

Possuem estruturas derivadas de benzeno e piranos e também anéis

fenólicos, com uma infinidade de formas diferentes. Estudos sugerem e demonstram

que flavonóides quando complexados com metais de transição, apresentam

propriedades melhoradas, em comparação aos flavonóides em sua forma livre.

A diosmina é um flavonóide da classe das flavonas usada como medicamento

(Daflon 500®, Flavenos®, Diosmin®) em associação ao flavonóide hesperidina uma

flavanona. A diosmina semissintética é conhecida por apresentar propriedades

venotônica e venoprotetora dentre outras.

Poucos estudos são encontrados na literatura quanto a sua complexação com

metais de transição. Em estudos realizados neste trabalho com complexos de Cu

(II), Ni (II), Fe (III) e Co (II) observou-se um aumento da capacidade antioxidante da

diosmina complexada. Outra área de interesse é o estudo das propriedades

antitumorais dos complexos que se encontram em andamento.

13

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Radicais livres

Na atualidade é crescente a variedade de pesquisas realizadas para melhor

compreensão sobre os radicais livres e os danos que possam causar ao organismo.

Há um enorme interesse no estudo e na busca de novos compostos com atividade

antioxidante devido ao conhecimento sobre os efeitos dos radicais livres e espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio no organismo (BARREIROS e DAVID, 2006; HECK,

et al., 2011).

Radicais livres são átomos ou moléculas altamente reativos e que possuem

elétrons ímpares na sua última camada eletrônica. “É este não emparelhamento de

elétrons da última camada que confere alta reatividade a esses átomos ou

moléculas” (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).

A oxidação é parte fundamental do nosso metabolismo para cumprir funções

fisiológicas relevantes como a geração de energia para a célula. E assim, os radicais

livres naturalmente e continuamente são formados em pequenas quantidades pelos

processos normais do metabolismo. Atuando como mediadores para a transferência

de elétrons para as várias funções bioquímicas.

Os mecanismos de geração de radicais livres ocorrem normalmente nas

mitocôndrias, membranas celulares e citoplasma das células. Sendo que nas células

de organismos aeróbios (que necessitam de oxigênio para sobreviver) as

mitocôndrias consomem 85 – 90% do oxigênio (O2), o restante deste, 10 – 15% são

utilizados por enzimas como oxidases, oxigenases e por reações químicas de

oxidação diretas (BARBOSA, et al., 2010).

Devido à produção contínua de radicais livres, pelos processos metabólicos

celulares, o organismo desenvolveu mecanismos de defesa antioxidante, com o

objetivo de limitar a geração destes intracelularmente e controlar a ocorrência de

danos. Por alguma disfunção biológica, genética ou proveniente dos alimentos estas

espécies reativas, em determinadas situações podem aumentar e causar danos para

as biomoléculas quando gerados em excesso (MIRA, et al., 2002; BARREIROS e

DAVID, 2006).

14

É importante ressaltar que esses radicais livres cujo elétron desemparelhado

encontra-se centrado nos átomos de oxigênio ou nitrogênio são denominados ERO

(espécies reativas de oxigênio) e ERN (espécies reativas de nitrogênio),

respectivamente. Sendo estes os responsáveis por inúmeras patogenias, pois nem

todas as substâncias denominadas radicais livres apresentam elétrons

desemparelhados em sua última camada. Como é o caso do peróxido de hidrogênio

(H2O2) (BARBOSA, et al., 2010).

No organismo, os radicais livres estão fisiologicamente envolvidos na

produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, fertilização do

óvulo, ativação de genes, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas

importantes, dentre outras.

Os termos ERO compreendem radicais como superóxido (O2•), derivado do

oxigênio molecular (O2); hidroxila (OH•); peroxila (ROO•/LO2•); hidroperoxila (HO2•) e

alcoxila (RO•/LO•); bem como espécies não radicalares derivadas de oxigênio como

peróxido de hidrogênio (H2O2), extremamente reativo e tóxico para as células.

Dentre as ERN incluem-se o óxido nítrico (NO•), óxido nitroso (N2O2), ácido

nitroso (HNO2), nitritos (NO2), nitratos (NO3) e peroxinitritos (ONOO-) dentre outras

(FERREIRA e MATSUBARA, 1997; BARREIROS e DAVID, 2006; DORNAS, et al.,

2007; BARBOSA, et al., 2010).

A situação de desequilíbrio entre espécies oxidantes e sua destruição

denomina-se estresse oxidativo. Este pode conduzir o organismo à um metabolismo

anormal com perda de funções fisiológicas e a doenças. Como por exemplo, a

agressão às proteínas dos tecidos e das membranas, às enzimas, aos carboidratos

e ao DNA (MIRA, et al., 2002; FERNANDEZ, et al., 2007; BARBOSA, et al., 2010)..

Essa agressão causada gera doenças como aterosclerose, trauma, infarto do

miocárdio, isquemia tecidual, inflamação, artrite, Parkinson, Alzheimer, acidente

vascular cerebral (AVC), o envelhecimento celular precoce e principalmente câncer

(FERREIRA e MATSUBARA, 1997; BARREIROS e DAVID, 2006; DORNAS, et al.,

2007).

Outra preocupação é com a presença de metais e o estresse oxidativo.

Metais de transição, como o ferro e o cobre participam de reações de óxido-redução.

Eles podem doar ou aceitar elétrons livres durante reações intracelulares, formando

15

radicais livres. Essas reações onde os metais participam na formação de espécies

reativas de OH• são conhecidas como reações de Fenton e Haber-Weiss

(FERNANDEZ, et al., 2007; BARBOSA, et al., 2010). O esquema da reação de

Fenton está descrito abaixo:

H2O2 + Mn+ HO- + HO. + M (n+1)+

Onde M = metal

Na reação de Haber-Weiss, representada abaixo, ocorre a formação de O2•

com a finalidade de gerar radicais OH• da mesma maneira.

O2- + Mn+ O2

. + M (n-1)+

Como exemplo dessas reações, na mitocôndria, o O2 sofre uma redução

tetravalente, por meio da qual recebe quatro elétrons (e-) e quatro íons de

hidrogênio (H+), formando duas moléculas de água (H2O) e liberando energia na

forma de ATP (adenosina trifosfato). Quando o O2, em seu estado fundamental,

recebe um e- ocorre a geração de superóxido (O2•).

Por meio de um processo denominado dismutação, o O2•, ao receber íons

hidrogênio, gera H2O2. Tal reação é catalisada pela superóxido dismutase (SOD),

enzima esta que acelera a reação. Na reação de Fenton, quando o H2O2 reage com

íons ferro (Fe2+) ou cobre (Cu+) forma-se o radical hidroxila (OH•).

Logo, na reação de Haber-Weiss os referidos íons também podem catalisar a

reação entre H2O2 e O2• gerando, da mesma forma o OH•. O O2• pode também

reagir com o óxido nítrico radicalar (NO•) gerando peroxinitrito (ONOO-) (BARBOSA,

et al., 2010).

A enzima responsável pelo controle dessas reações é a citocromo oxidase,

ela oxida as quatro moléculas de citocromo c (uma pequena proteína heme presente

na membrana interna da mitocôndria), removendo um elétron de cada uma delas.

Esses quatro elétrons são acondicionados no O2 (sofre uma redução tetravalente)

até a formação da água. A enzima referida controla a geração excessiva de radicais

livres na mitocôndria (BARBOSA, et al., 2010).

A reação de Fenton, também ocorre em neurônios dopaminérgicos. A

monoamina oxidade (MAO) enzima responsável por degradar as catecolaminas

16

(noradrenalina, adrenalina, dopamina e dopa) ao degradar a dopamina pela sua

desaminação oxidativa gera o H2O2, e o acumulo deste, como já visto anteriormente,

gera radicais livres, podendo causar doenças como o Mal de Parkinson

(LEOPOLDINI, et al., 2006).

Estas espécies reativas livres afetam a saúde humana, e os danos mais

graves são aqueles causados ao DNA e RNA e ao sistema nervoso central (SNC).

Se a cadeia de DNA é quebrada pode ser reconectada em outra posição, alterando

a ordem de suas bases. Esse é um processo básico de mutação, que pode

desencadear a oncogênese (MIRA, et al., 2002).

Já o SNC, de todos os órgãos, é um dos mais sensíveis, devido ao alto

consumo de oxigênio (O2) e a tendência de acumular metais, e também devido a

neurotransmissores que se oxidam (exemplo a dopamina) produzindo ERO,

podendo implicar em doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson

como já mencionado (FERNANDEZ, et al., 2007).

Agentes antioxidantes que protegem as células podem ser classificados em

enzimáticos e não enzimáticos. Enzimáticos, como por exemplo, a superóxido

dismutase, catalase, glutationa peroxidase, presentes no organismo. E não

enzimáticos como α-tocoferol (vitamina E), β-caroteno, ácido ascórbico (vitamina C),

selênio, curcumina, flavonóides (polifenólicos) dentre outros obtidos da dieta

alimentar (BIANCHI e ANTUNES, 1999; DE MORAIS, et al, 2009)

Em situações de aumento dos radicais livres endógenos, como em

oncologias, devem-se reforçar as defesas antioxidantes com suplementação de

antioxidantes na dieta (MIRA, et al., 2002).

Estudos como dos Santos e Cruz (2001) descrevem que em alguns casos

como em terapias antitumorais, as interações entre medicamentos antineoplásicos e

antioxidantes promovem a potencialização do mecanismo de ação destes fármacos,

resultando em diminuição do tamanho do tumor com redução dos efeitos colaterais.

E também a melhoria da qualidade de vida dos pacientes oncológicos com maior

tempo de sobrevida.

Outros estudos como o de Dornas e colaboradores (2007) citam apud Heo e

Lee (2004), que o flavonóide quercetina, pode proteger as células nervosas, contra

os danos do estresse oxidativo, associado ao Alzheimer. Comprovaram que o efeito

17

protetor da quercetina, foi superior ao da vitamina C. A quercetina pode entrar em

regiões cerebrais beneficiando-se de funções antioxidantes e biológicas, protegendo

da citotoxicidade induzida por peróxido de hidrogênio (H2O2).

O organismo é protegido em parte por macro e micro moléculas, de origem

endógena ou obtidas diretamente da dieta, como a exemplo de micromoléculas

provenientes da dieta estão os flavonóides (BARREIROS e DAVID, 2006).

2.2 Flavonóides

A palavra “flavonóide” deriva do latim flavus, que significa amarelo, apesar de

alguns flavonóides serem incolores e outros variarem seu espectro de cores do

verde ao azul.

Os flavonóides foram descobertos em 1936, por Albert von Szent-György

Nagyrápolt (1893 – 1986), um fisiologista Húngaro, naturalizado Norte-Americano,

prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1937, por descobrir e documentar a

vitamina C como catalisador.

A descoberta dos flavonóides deu-se pela extração da citrina da casca do

limão. A citrina possui a capacidade de regulação da permeabilidade dos capilares,

e por isso recebeu na época a denominação de vitamina P e também vitamina C2,

devido a algumas substâncias da classe, apresentarem atividades semelhantes às

da vitamina C.

Em 1950 pela não confirmação dessas substâncias como vitaminas essa

denominação foi abandonada (MALESEV e KUNTIC, 2007). O termo flavonóide foi

introduzido em 1952 por Geissman e Hinreiner (PIRES, 2009).

Os flavonóides são definidos como metabólitos secundários de plantas, sendo

pigmentos naturais presentes em vegetais. Eles participam de funções como

crescimento, desenvolvimento e defesa dos vegetais. São encontrados em

sementes, frutos, cascas, raízes, flores e folhas das plantas. Mais de 8000

flavonóides diferentes já foram identificados. São biossintetizados através da via do

ácido chiquímico e da acetil-CoA (acetato) (Fig. 1), e também pela via dos

fenilpropanóides, precursores de vários grupos de substâncias como aminoácidos

18

alifáticos, terpenóides, ácidos graxos e outros (DORNAS, et al., 2007; GATTUSO, et

al., 2007).

Figura 1 - Ciclo biossintético dos flavonóides (metabólitos secundários). Fonte: Maciel, 2011 apud SIMÕES, et al., pag. 411, 2004.

A quantidade de flavonóides nas plantas é grande e variada devido à

existência da forma O-glicosídica com diversos açúcares, tais como glucose,

galactose, ramnose, arabinose, xilose e rutinose. A glicosilação aumenta a

polaridade dos flavonóides e também sua solubilidade (PIRES, 2009).

A estrutura básica dos flavonóides (Fig. 2) consiste em um núcleo

fundamental flavano constituído de quinze átomos de carbono, arranjados em três

anéis (C6-C3-C6). Sendo preferencialmente dois anéis fenólicos substituídos (A e B)

e um pirano (C) cadeia heterocíclica acoplado ao anel A. Os anéis A e B são

hidroxilados e podem conter substituintes metoxílicos (MOURÃO, 1990; DORNAS, et

al., 2007; PIRES, 2009).

19

O

C A

B

Figura 2 - Estrutura geral dos flavonóides.

De acordo com modificações no anel C (pirano) central, os flavonóides podem

formar várias classes estruturais diferentes incluindo flavonas, flavonóis, flavanonas,

chalconas, isoflavonas, antocianidinas, flavan-3-ol, flavononol dentre outros como

mostra a Figura 3 (FRAGA, 2010).

Flavonol

O

Chalcona

A

B

HO

O

3

Flavan-3-ol

O+

Antocianidina

O

O

Isoflavona

AC

B

AC

B

AC

B

AC

B

A

B

CAC

B

AC

B

HO

O

O

Flavona

O

O

Flavanona

O

HO

O

Flavanonol

O

O

HO

Figura 3 - Esqueletos básicos de flavonóides.

Estes compostos atuam principalmente capturando radicais livres com

formação de radicais flavínicos, muito menos reativos que radicais livres de ERO e

ERN, também podem quelar íons metálicos de transição como, por exemplo, Fe (III)

e Cu (II) o que evitaria a formação de ERO (DE LUIS, et al., 2008).

20

2.3 Flavonóides diosmina e hesperidina

Diosmina e hesperidina são flavonóides glicosilados que ocorrem

naturalmente nas Rutáceas (família Rutaceae), plantas compostas por frutos cítricos.

Ou também em outros gêneros, como Fabaceae, Betulaceae, Lamiaceae e

Papilionaceae em menor quantidade (MAJUMDAR e SRIRANGAM, 2009).

Estes compostos apresentam grande variedade de propriedades

farmacológicas tais como anti-inflamatório, antioxidante, antiulceroso, sequestro de

radicais livres, além de inibir determinadas enzimas do citocromo P-450, podendo

causar interações com outros medicamentos (NIOPAS, 2009; PIRES, 2009).

A diosmina (C28H32O15) (Fig. 4) foi isolada pela primeira vez em 1925 da

planta Scrophularia nodosa (Fig. 5), e seu emprego como agente terapêutico foi

introduzido pela primeira vez em 1969. É um flavonóide da classe das flavonas.

O OH

CH3

H3C

OH

O

O

O

OH

OH

HO

OH

OH

HO

O O

O

Figura 4 - Estrutura da diosmina

A diosmetina (3′,5,7-trihidroxi-4′-metoxiflavona) é a aglicona da diosmina

(3′,5,7-trihidroxi-4′-metoxiflavona-7-ramnoglicosídeo), ou seja, não possui o açúcar

em sua estrutura (DORNAS, et al., 2007).

A diosmina comercial é sintetizada a partir da hesperidina, flavonóide extraído

de casca de frutos cítricos imaturos. A síntese consiste da sua conversão em

diosmina pela oxidação da ligação dupla via reação de desidrogenação no anel

21

central C. O produto se apresenta na forma sólida, amarelo pálido, com ponto de

fusão 274°C e massa molecular de 608,54 g/mol (THE MERCK INDEX, 1996;

PIRES, 2009).

Figura 5 - Scrophularia nodosa. Fonte: NHSN, 2012.

A diosmina difere da hesperidina apenas pela presença da ligação dupla entre

dois átomos de carbono presentes no anel central C (pirano) das moléculas, como

mostra a Figura 6.

22

CA

BC

CH3

CH3

H3C

H3C

O

O

OH

OH

OH

OH

O

O

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

OH

OH

HO

HO

O

O

O

O

O

O

Figura 6 - Diferença estrutural da diosmina (A) e hesperidina (B).

A diosmina é considerada um agente protetor vascular da circulação periférica

de retorno, utilizada para tratar a insuficiência venosa crônica dos membros

inferiores, hemorroidas, linfedema e varizes. Sua farmacologia é reportada por

exercer a diminuição da distensibilidade e redução da estase venosa. Na

microcirculação, normaliza a permeabilidade e resistência capilar; e promove

aumento da drenagem linfática por diminuir a pressão intra-linfática e aumentar o

número de linfáticos funcionais, promovendo uma maior eliminação do líquido

intersticial (Bula Daflon®).

Como um flavonóide, apresenta propriedade antioxidante e antimutagênica.

Outras atividades biológicas atribuídas à diosmina vêm sendo investigadas mais

recentes, como agente no combate ao câncer, síndrome pré-menstrual, colite e

diabetes (DE LUIS, et al., 2008; NIOPAS, 2009; VADE-MÉCUM, 2010).

A hesperidina é um flavonóide glicosídeo que pertence à classe das

flavanonas, que são intermediárias biossintéticas da maioria das classes de

flavonóides (DORNAS, et al., 2007).

A hesperidina (3′,5-dihidroxi-4′-metoxiflavanona-7-O-rutinosa), C28H34O15,

apresenta-se sob a forma de um pó cristalino claro, com ponto de fusão entre 250 e

23

255 °C. Sua massa molecular é de 610,56 g/mol (PIRES, 2009). Possui ação

analgésica, anti-inflamatória, modulando a síntese de prostaglandinas (tipo E2) via

ciclooxigenase 2 (COX-2); antioxidante, pela capacidade de modular reações

oxidativas; antialérgica, vasoprotetora, hipolipemiante, anti-hipertensiva, diurética e

anticarcinogênica, mediada pela supressão da proliferação celular (KANAZE, et al.,

2005; PIRES, 2009). Outra propriedade importante estudada é sua atividade em

prevenir a iniciação ou progressão de retinopatia diabética ou degeneração macular

(MALESEV, et al., 1997; MAJUMDAR e SRIRANGAM, 2009).

A estudos reportam que uma dieta rica em hesperidina combinada ou não

com a diosmina, exerce ação contra o câncer de língua, de colón, entre outros; no

entanto, é fato que a associação destes dois ativos possui ação sinérgica no

tratamento das patologias para quais são indicados (PIRES, 2009).

Como medicamento a associação da diosmina (90%) com a hesperidina

(10%) em uma dose de 500 mg duas vezes ao dia, é indicada em flebologia nos

casos de insuficiência venosa crônica, varizes e varicosidades, úlceras varicosas

entre outros processos flebíticos. Também é usado em proctologia, nos tratamentos

de hemorroidas (Bula Daflon®).

Em ginecologia e obstetrícia, nos casos de insuficiência venosa da mulher

grávida, na prevenção de congestão pélvica e na prevenção do risco venoso no

tratamento com anticoncepcionais, menorragias funcionais e prevenção das

menorragias devido ao DIU (dispositivo intrauterino). Nestes últimos casos, em

doses mais elevadas 1000 mg duas vezes ao dia. Apresenta um excelente perfil de

segurança, sendo os efeitos adversos infrequentes ou leves (Bula Daflon®,

Diosmin®, Flavenos®).

As informações farmacocinéticas relacionadas ao medicamento Daflon® 500

mg são escassas e se referem apenas a diosmina.

Após a administração oral, a diosmina é rapidamente hidrolisada por enzimas

produzidas por bactérias da microflora intestinal formando sua aglicona flavona

diosmetina, que é então absorvida para a circulação sistêmica (KANAZE, et al.,

2005; CAMPANERO, et al., 2010).

Estudos farmacocinéticos como o de Niopas e colaboradores (2009) sugerem

ainda que na microflora intestinal, a diosmetina seja reduzida por enzimas

24

bacterianas a forma aglicona hesperitina (Fig. 7), pela redução da ligação dupla no

anel C da diosmetina. No estudo, foi administrada uma dose diária de 1000 mg de

diosmina, em homens saudáveis. No plasma foi encontrada a forma aglicona

hesperitina. O estudo não reportou a porcentagem de pureza da diosmina utilizada.

C

B

A

O OH

H3C

OH

O

OHO

Figura 7 - Estrutura da hesperitina.

A diosmetina apresenta uma fase rápida de distribuição e uma fase lenta de

eliminação, com concentração plasmática máxima de 417 ng/mL encontrada 1 hora

após a administração e meia-vida de eliminação plasmática de 26 a 43 horas, sendo

em média 31,5 horas (COVA, et al., 1992; LYSENG e PERRY, 2003). Estes dados

de meia-vida e tmax (tempo para atingir o pico máximo de concentração plasmática)

foram obtidos a partir da administração de formulação não micronizada de diosmina

(COVA, et al., 1992).

A diosmina é excretada essencialmente pela via fecal (80%) e também é

degradada em ácidos fenólicos e eliminada pela via urinária (14%), evidenciado pela

presença de vários fenóis ácidos na urina (Bula Daflon 500®). A estrutura da

diosmetina é mostrada na Figura 8 abaixo.

.

25

C

B

A

O OH

H3C

OH

O

OHO

Figura 8 - Estrutura da diosmetina.

A absorção da diosmetina é diferenciada entre as formulações micronizada e

não micronizada de diosmina, mas os processos metabólicos são semelhantes a

partir das duas formulações. Estudos como o de Garner e colaboradores (2002)

demonstraram que a forma micronizada da diosmina (partículas menores que 2

micrômetros/µm), possuem um aumento na absorção de 80% em comparação à

formulação não micronizada (partículas com tamanho aproximado de 36 µm),

melhorando a farmacocinética e a eficácia clínica da formulação.

A diosmetina é rapidamente degradada em ácidos fenólicos ou conjugados

glicínicos que são eliminados na urina. Não é possível encontrar diosmina ou

diosmetina na urina. Aproximadamente metade de uma dose marcada com

radioatividade é encontrada nas fezes como diosmina e diosmetina, correspondendo

à fração não absorvida da dose e também a uma pequena excreção biliar (LYSENG

e PERRY, 2003).

Os mecanismos de ação sugeridos para a diosmina e outros flavonóides são

a inibição da prostaglandina E2 (PGE2) e tromboxano A2 (TXA2) e também inibem a

ativação, migração e adesão de leucócitos. A diosmina provoca uma significativa

diminuição dos níveis plasmáticos de moléculas de adesão endotelial vascular e

reduz a ativação de neutrófilos, protegendo contra danos na microcirculação (DE

LUIS, et al., 2008; MAJUMDAR e SRIRANGAM, 2009).

26

2.4 A utilização terapêutica de metais

A utilização de metais na medicina existe há aproximadamente 5000 anos.

Fármacos à base de ferro foram utilizados no Egito em torno de 1500 a.C., ao

mesmo tempo em que se descobriu que o zinco promovia a cura de feridas. No

entanto, foram nos últimos cem anos, que as propriedades medicinais dos metais

começaram a ser investigadas, sendo recente a elucidação dos prováveis

mecanismos de ação no organismo (BERALDO, 2005).

O primeiro composto de coordenação, contendo a platina, usado no

tratamento do câncer foi a cisplatina, sintetizada pela primeira vez em 1844 e

denominado na época de cloreto de Peyrone. Mas somente em 1970 sua eficácia no

tratamento do câncer foi estabelecida. Complexos metálicos contendo ferro, ou

outros metais, também apresentam atividade antitumoral (BERALDO, 2005).

Metais possuem um importante papel nos sistemas biológicos, por interagirem

com biomoléculas tais como proteínas, e por apresentarem afinidade por outras

moléculas como a de oxigênio (O2) ou de óxido nítrico (NO), dentre outras (GUO e

SADLER, 1999; BERALDO, 2005; VILELA-RIBEIRO, et al., 2011; BERALDO, 2011).

O estudo destes metais e outros compostos inorgânicos presentes

naturalmente nos meios biológicos hoje esta incluído em um ramo da química

chamado de Bioinorgânica.

Estas biomoléculas são conhecidas como metaloenzimas ou

metalobiomoléculas, que contêm em seu sítio ativo, no mínimo um íon metálico. Este

sítio ativo consiste em um ou mais íons metálicos, tendo na cadeia da proteína,

pontes ligantes que definem a coordenação de cada íon metálico. O papel do íon

metálico nos sistemas biológicos é tanto estrutural quanto funcional (HENRIQUES,

et al., 2003).

O ferro e o cobre são centros ativos de várias metaloenzimas e também

proteínas transportadoras de oxigênio (O2) como a hemoglobina (Hb) e mioglobina.

Manganês, cobalto e zinco são constituintes de enzimas catalisadoras de reações

de hidrólise e descarboxilação. Proteínas de expressão gênicas contêm zinco, a

exemplo as de RNA-polimerase (DE FARIAS, 2009).

27

A Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) ou dipeptidil-carboxipeptidase,

dentre outras nomenclaturas conhecidas, é também uma

metaloenzima/metaloprotease, a qual possui o metal zinco em sua estrutura. É

importante para o mecanismo renal hormonal (sistema

renina/angiotensina/aldosterona), no controle da pressão arterial e da homeostase

hidroeletrolítica corpórea (HENRIQUES, et al., 2003).

A citocromo c oxidase, que participa da cadeia respiratória celular apresenta o

cobre em sua estrutura. A urease, que hidrolisa a uréia a dióxido de carbono (CO2) e

o amoníaco, possui o níquel. A xantina desidrogenase, que converte xantina a ácido

úrico no metabolismo de degradação de purinas apresenta molibdênio. As

superóxido dismutases (SOD), que protegem as células dos radicais superóxido,

contêm cobre, manganês e zinco em suas estruturas. Estes são alguns exemplos de

metaloenzimas, dentre várias outras conhecidas. Assim, com a evolução, os metais

foram sendo incorporados às funções essenciais á vida (GUYTON e HALL, 1998;

HENRIQUES, et al., 2003; DE FARIAS, 2009).

As contribuições da química inorgânica para a química medicinal tiveram suas

origens nos trabalhos de Paul Ehrlich (1854-1915), prêmio Nobel em Medicina e

Fisiologia em 1908, fundador da quimioterapia e introdutor das primeiras ideias

sobre relações estrutura-atividade e do conceito de índice terapêutico.

Alfred Werner (1866-1919), pai da química de coordenação, também

contribuiu com sua teoria para explicar as estruturas das ligações químicas nos

complexos metálicos; ganhou o prêmio Nobel de Química em 1913, o primeiro a ser

conferido a um químico inorgânico. Apesar da grande importância de Ehrlich e

Werner, a química medicinal dedicava-se mais aos compostos orgânicos, até a

descoberta da Cisplatina e suas propriedades antitumorais em 1965, pelo físico

Barnett Rosenberg (1926-2009). Desde então, ocorre um grande interesse por

complexos metálicos como possíveis agentes terapêuticos (GUO e SADLER, 1999;

BERALDO, 2005; DE FARIAS, 2009; BERALDO; 2011).

28

2.5 Compostos de coordenação

A grande maioria dos compostos de coordenação (complexos) tem como

átomos centrais, elementos metálicos na forma catiônica (+), que funcionam como

ácidos de Lewis. Um ácido de Lewis é um íon ou átomo metálico, receptor de pares

de elétrons.

Com relação aos ligantes, verifica-se que podem ser aniônicos, moleculares,

radicalares ou catiônicos, e comportam-se como bases de Lewis. Uma base de

Lewis é um doador de pares eletrônicos. O requisito para que uma espécie possa

funcionar como ligante é que pelo menos um de seus átomos disponha de elétrons

para se ligar ao átomo central (ácido), formando ligações coordenativas (DE

FARIAS, 2009).

A reação dos ácidos com as bases de Lewis é a formação de um complexo,

unido pelo compartilhamento do par (ou dos pares) de elétron fornecido pela base

(SHRIVER e ATKINS, 2008).

Duas das teorias mais utilizadas para explicar a coordenação dos complexos

dos metais do bloco d (como ferro, cobre, níquel e cobalto), são a Teoria do Campo

Cristalino (TCC) e a Teoria do Campo Ligante (TCL). A TCC é utilizada para os

elementos da primeira série (incluindo ferro, cobre, níquel e cobalto, também

chamados de 3d); e segunda série de transição da tabela periódica (4d). Na TCC,

para o estudo de compostos de coordenação, se reconhece somente as interações

eletrostáticas entre o íon metálico e os ligantes (SHRIVER e ATKINS, 2008).

A TCL é utilizada para interpretar dados magnéticos, espectroscópicos e

termoquímicos dos compostos de coordenação. Ela é a teoria dos orbitais

moleculares e se concentra mais nos orbitais d do átomo metálico central (SHRIVER

e ATKINS, 2008; DE FARIAS, 2009; MCMURRY, 2011).

2.6 Complexação de flavonóides com metais de transição

A complexação de flavonóides com metais é conhecida graças a um dos

mecanismos de ação antioxidante dos flavonóides ser a capacidade destes em

quelar íons metálicos endógenos, como ferro e cobre, evitando a participação destes

29

na formação de ERO. Compostos com capacidade de quelar metais, removem o

metal e alteram o potencial de redução tornando-o inativo. Os flavonóides com seus

inúmeros grupamentos hidroxila (OH) e carbonila (C=O) no anel C, possuem sítios

para complexação com metais (LEOPOLDINI, et al., 2006).

Devido à sua estrutura química, os flavonóides têm facilidade de fazer

ligações com metais de transição e outros átomos, a exemplo alumínio. O alumínio

quando elevado endogenamente, implica em desordens neurológicas e ósseas, pela

sua alta toxicidade. Complexando a quercetina com alumínio (Al3+) ocorre a redução

da sobrecarga deste na dieta, podendo sugerir que flavonóides também sejam

antídotos para metais pesados (MALESEV, et al., 1997).

Ao se complexarem com íons de metais de transição, especialmente Fe (II) e

(III), e Cu (II), os flavonóides previnem a geração de radicais livres mediados por

estes metais, protegendo o organismo do estresse oxidativo (MALESEV e KUNTIC,

2007).

Estudos de Moridani e colaboradores (2003) demonstram a atividade

antioxidante de flavonóides como quercetina, rutina, luteonina (flavonas) e taxifolina

(flavanona), dentre outros, quando complexados com ferro (Fe2+ e Fe3+) e cobre

(Cu2+). Estes apresentam maior atividade em sequestrar radicais superóxido, do que

quando livres, ou seja, a forma não complexada. Além disso, estudos mostram que

flavonóides complexados com metais são mais efetivos em prevenir hipóxia,

prevenindo lesão nos hepatócitos (de ratos) causadas por ERO, no teste de

citotoxicidade. Kuntic e colaboradores (2011) apud Guglielmone e colaboradores

(2002) também citam a atividade anticoagulante da quercetina.

Pereira e colaboradores (2007) demostraram a melhora da atividade do

flavonóide naringina, uma flavanona, após sua complexação com cobre (Cu2+).

Avaliaram a sua atividade anti-inflamatória (in vivo e in vitro), antioxidante,

antimicrobiana e antitumoral. A atividade anti-inflamatória em células 264.7 RAW

NO- (monócitos/macrófagos), avaliaram pela redução do óxido nítrico (NO); e in vivo

observaram a redução da inflamação induzida pela carragenina na cavidade

peritoneal de ratos Swiss. A atividade antioxidante foi realizada pelo método de

sequestro do radical orgânico DPPH (radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil). Na

verificação sobre os efeitos antibacterianos e antifúngicos, pelo método de difusão

30

em disco (em S. aureus, E. coli, B. cereus e C. albicans). E também na atividade

antitumoral em células dos tipos K562 (eritroleucemia), B16F10 (melanoma) e 3T3

(fibroblastos embrionários). Demonstrando que em todos os experimentos realizados

a atividade do complexo naringina-Cu é superior comparando com a molécula não

complexada.

Li e colaboradores (2008) sintetizaram e caracterizaram novos derivados

metálicos com cobre (II), níquel (II) e zinco (II), do flavonóide naringenina (flavanona)

um flavonóide com atividade antibacteriana e antitumoral. Testando a interação

destes compostos com DNA de timo de vitelo [CT DNA (Calf-Thymus DNA)], e

analisarem por espectroscopia eletrônica de absorção, verificando que a interação

dos complexos metálicos com o DNA, ocorre mais fortemente, em comparação com

naringenina. Sendo ainda o complexo naringenina cobre, o que interage mais

fortemente. Na avaliação da supressão dos radicais superóxido (O2•) e hidroxila

(OH•), os complexos metálicos também apresentaram atividade superior.

Tan e colaboradores (2009) complexaram hesperitina, naringenina e

apigenina (uma flavona), com cobre (II), caracterizaram e estudaram a ação

antitumoral destes complexos, em células. Contra células de linhagem humana

como HepG-2 (carcinoma hepatocelular), SGC-7901 (carcinoma gástrico) e HeLa

(carcinoma cervical). Verificaram que a ação citotóxica dos complexos metálicos é

elevada nas três linhagens em comparação aos respectivos flavonóides. Os

complexos hesperitina-Cu e apigenina-Cu foram mais efetivos contra as linhagens

SGC-7901 e HepG-2; e a naringenina-Cu apresentou elevada atividade contra

células do tipo HepG-2. Sugerindo com o estudo, que esses novos compostos

apresentaram potencial como possíveis fármacos contra o câncer.

Em 2010, Panhwar e colaboradores estudaram outro flavonol, a morina,

complexado com cobre (II). Neste trabalho avaliaram a atividade antioxidante pelo

método de sequestro da radical DPPH, onde observaram que a atividade

antioxidante da morina-Cu é superior à da morina.

Em 2011, Kuntic e colaboradores, utilizaram os flavonóides rutina e

hesperidina, e seus complexos com os metais alumínio (Al3+) e cobre (Cu2+), em um

estudo para avaliar a atividade na coagulação sanguínea (in vitro). Utilizaram três

testes para esta avaliação, aPTT (tempo de tromboplastina parcial ativada), PT

31

(tempo de protrombina) e TT (tempo de trombina). Os resultados da avaliação da

rutina e hesperidina mostraram que estes compostos não possuem nenhuma

atividade satisfatória na cascata da coagulação plasmática. Apenas a rutina, em

elevada concentração apresenta atividade anticoagulante, porém, estatisticamente

insignificante. Já os quatro complexos Hesp-Cu, Hesp-Al, Rut-Cu e Rut-Al

apresentam atividade anticoagulante ao aumentar o tempo do teste aPTT, sem

interferir nos outros testes PT e TT. Entretanto, o mecanismo anticoagulante dos

complexos, necessita de mais estudos para ser elucidado.

Gharagozloo e colaboradores (2008) investigaram a atividade antiproliferativa

em células Jurkat (linfoma de células T), do flavonóide silimarina, conhecido por

suas atividades hepatoprotetora, anticarcinogênica, antiinflamatória e

imunomoduladora. Comparando este, com a desferroxamina, um agente quelante,

que promove a excreção do ferro e do alumínio, no organismo. A desferroxamina

inibe a proliferação das células Jurkat ao quelar com o ferro do meio, o que não foi

observado com a silimarina, que ao contrário, promoveu o crescimento celular em

baixa concentração e somente em concentrações elevadas inibiu parcialmente a

proliferação celular. Quando complexados com ferro (III), a desferroxamina-Fe

continuou inibindo a divisão celular; entretanto, a silimarina-Fe, não apresentou

atividade antiproliferativa, sugerindo ainda ser este, um complexo pró-oxidante para

as células Jurkat.

Flavonóides complexados com metais são objeto de pesquisa ha muitos

anos, durante os quais, suas propriedades, composição, características de formação

do complexo, estabilidade e sua avaliação biológica estão sendo estudadas. As

investigações de compostos flavonóides-metais datam desde 1980 até hoje, e mais

de 40 complexos de flavonóides de diferentes classes, com inúmeros íons metálicos

estão sendo investigados (MALESEV e KUNTIC, 2007; GRAZUL e BUDZISZ, 2008;

KUNTIC, et al., 2011).

A literatura, neste contexto, necessita de maiores informações sobre os

mecanismos de ação de complexos metálicos com flavonóides, e os resultados

dependem de condições experimentais para entender o tipo de coordenação e

interação entre o flavonóide e o íon metálico em questão. A utilização de agentes

antioxidantes melhores pode representar uma nova abordagem para redução dos

32

danos causados pelo excesso de radicais livres ao nosso organismo, e também a

obtenção de novos compostos com atividade anticancerígena. Estas interações,

metal-flavonóide mudam as propriedades antioxidantes e os efeitos biológicos dos

flavonóides, sugerindo que quando coordenados com metais essas atividades são

melhoradas (PEREIRA, et. al., 2007; GRAZUL e BUDZISZ, 2008; KUNTIC, et al.,

2011).

33

3 OBJETIVO

3.1 Objetivo geral

Síntese, caracterização e avaliação da atividade antioxidante de complexos

de coordenação do flavonóide diosmina com metais de transição.

3.2 Objetivos específicos

- Síntese de novos compostos através da complexação do flavonóide

diosmina com os íons dos metais de transição (3d) cobre (II), ferro (II), cobalto (II) e

níquel (II);

- Purificação dos complexos formados.

- Caracterização dos complexos por Espectroscopia no Ultravioleta (UV),

Infravermelho (IV), Espectrometria de Massas (EM);

- Avaliação da atividade antioxidante dos complexos.

34

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material e equipamentos utilizados

Agitador magnético

Balanças analíticas (com precisão de 0,0001g e 0,00001g)

Balões volumétricos

Barra magnética

Bastão de vidro

Béqueres

Capela de exaustão

Centrífuga refrigerada (ALC PK 120R)

Chapa de aquecimento

Cubetas de quartzo e vidro

Eppendorfs

Erlenmeyers

Espátulas

Espectrofotômetro (UV-VIS) (Femto 800 XI)

Espectrofotômetro (UV-VIS) (Beckman DU® 640B. U.S. A) (UNICAMP)

Espectrofotômetro (IV) (Nicolet, Nexus)

Espectrômetro de massas (TQD Acquity. Micromass Water) (UNICAMP)

Estufa (Quimis 317B342)

Etiquetas

Funil simples

Garras (anel para funil)

Papel de filtro qualitativo

Papel de pesagem

Phmetro (Digimed - DM 20)

Pipetas volumétricas

Placas de Petri

Ponteiras

35

Ponto de fusão (Quimis - PMF II)

Provetas

Rota evaporador (Rotovac - Heidolph digital)

Shaker (Tecnal - TE 420)

Suporte universal

Destilador (Millipore)

4.2 Reagentes e solventes utilizados

ABTS [2,2’ azinobis (3-etil-benzotiazolino-6-ácido sulfônico) sal diamônio]

(Fluka®)(MM=548,68g/mol)

Acetato de cobalto (II) [Co(CH3COO)2] (Audaz®)(MM=249,08g/mol)

Acetato de cobre (II) [Cu(CH3COO)2] (Sigma-Aldrich®)(MM=199,65g/mol)

Acetato de níquel (II) [Ni (CH3COO)2] (Sigma-Aldrich®)(MM=248,86g/mol)

Acetato de zinco (II) [Zn(CH3COO)2] (Sigma-Aldrich®) (MM=219,51g/mol)

Acetonitrila (CH3-CN)

Água destilada

Álcool etílico (etanol) (CH3-CH2-OH) (J.T. Baker®)

Álcool metílico P.A. (metanol) (CH3-OH) (Dinâmica®)

Clorofórmio (CHCl3) (Dinâmica®)

Dimetilformamida (DMF) (H-C(O)N(CH3)2) (Dinâmica®)

Dimetilsulfoxido (DMSO) (CH3-S(O)-CH3) (Synth®)

Diosmina (C28H32O15) (Sigma-Aldrich®) (MM=608,56g/mol)

Fosfato de sódio dibásico (Sigma®) (MM=141,98 g/mol)

Fosfato de sódio monobásico (Sigma®) (MM=138,01g/mol)

Hexano (C6H14) (Audaz®)

Oxido de manganês (MnO2) (Sigma-Aldrich®)

Sulfato de ferro (II) (sulfato ferroso) (FeSO4)7H2O (Sigma-

Aldrich®)(MM=278,02g/mol)

Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-ácido carboxílico) (Calbiochem®)

(250,3g/mol)

36

Todos os reagentes e solventes obtidos comercialmente utilizados nesse

trabalho possuem grau de pureza PA ou HPLC.

4.3 Síntese da diosmina com os metais de transição

A diosmina foi pesada e solubilizada em 20 mL de dimetilformamida (DMF) a

uma temperatura de aproximadamente 50 graus célsius (ºC) e agitação até completa

solubilização. Os sais de acetato de Zn (II), Cu (II), Co (II), Ni (II) e sulfato de Fe (II)

também foram solubilizados nas mesmas condições da diosmina, em 20 mL DMF, à

temperatura de aproximadamente 50 ºC e agitação constante. Os respectivos sais

foram adicionados à diosmina gota a gota até completa solubilização, sem que

ocorressem precipitações.

As soluções foram agitadas em Shaker por cinco dias a 160 rotações por

minuto (rpm) e a temperatura mantida em 37 ºC. Os complexos diosmina-metal

foram filtrados em papel de filtro (nº 42) e colocados em placas de petri a

temperatura ambiente em capela de exaustão para completa secagem do solvente.

Em uma segunda etapa, os compostos obtidos [diosmina-cobalto (diosmina-

Co), diosmina-níquel (diosmina-Ni) e diosmina-ferro (diosmina-Fe)] foram

solubilizados em metanol. A diosmina-cobre (diosmina-Cu) em água purificada.

Foram novamente filtrados em papel filtro para serem recristalizados. Esta etapa foi

repetida por no mínimo duas vezes para garantir a purificação dos compostos.

Devido à diosmina não ser solúvel em metanol e água e não ocorrerem

dissociações dos complexos, o metanol foi o solvente escolhido para recristalização

(purificação). Com exceção da diosmina-cobre que é praticamente insolúvel em

metanol. Após a secagem dos solventes, em rotaevaporador e capela de exaustão,

os compostos purificados foram acondicionados em vidro âmbar etiquetados e

mantidos à temperatura ambiente (25 ± 5ºC).

O aspecto macroscópico dos complexos obtidos é mostrado na Figura 9.

As proporções dos reagentes utilizadas para formação dos complexos (como

mostra o quadro 1) foi de 1:4 de diosmina/sal metálico.

37

Quadro 1 – Quantidade dos reagentes utilizados para formação dos complexos

de diosmina metal.

Reagentes

Complexos

diosmina-Cu diosmina-Ni diosmina-Fe diosmina-Co

Diosmina

126 mg (0,21 mmol)

135 mg (0,22 mmol)

125 mg (0,20 mmol)

116 mg (0,19 mmol)

Sal metálico

165 mg (0,83 mmol)

220 mg (0,88 mmol)

228 mg (0,82 mmol)

190 mg (0,76 mmol)

Outros sais como nitrato de cobre (II) [(Cu(NO3)2], nitrato de níquel (II)

[Ni(NO3)2], nitrato de cobalto (II) [Co(NO3)2] e nitrato de zinco (II) [Zn(NO3)2] também

foram testados.

Os solventes e reagentes utilizados estão descritos na seção 4.2.

Figura 9 – Aspecto macroscópico dos complexos formados diosmina-Cu (A), diosmina-Co (B),

diosmina-Ni (C) e diosmina-Fe (D).

4.4 Teste de solubilidade dos compostos

O teste de solubilidade dos compostos foi realizado em duplicata, em capela

com exaustão, sem aquecimento e sob agitação constante em agitador magnético,

38

pesando-se 1 mg de diosmina e 1 mg de cada composto sintetizado (diosmina-Cu,

diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co) para cada solvente testado.

Os compostos foram pesados em papel de pesagem, em seguida transferidos

para tubos de ensaio, aos quais se adicionaram 100 µL do solvente e mantidos sob

agitação. A cada intervalo de tempo (3 minutos) adicionando-se a cada tudo de

ensaio mais 100 μL de solvente, até completa dissolução do composto.

4.5 Caracterização dos complexos

Os compostos foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho

(Espectrofotômetro Nicolet, Nexus) e no Ultravioleta-Visível (Espectrofotômetro

Femto – 800-XII) no laboratório de química de coordenação da UNIBAN.

A leitura das absorbâncias no UV dos complexos foi realizada partindo-se de

1mg de cada complexo e da diosmina e diluindo-os em 1 mL de dimetilsulfóxido

(DMSO), transferindo-se para balão de 10 mL, completando o volume com água

deionizada. Desta solução, pipetaram-se 700 µL e transferiu-se para um novo balão

volumétrico de 10 mL completou-se com água deionizada. As concentrações das

soluções foram de 2,9 µM da diosmina-Cu; 8,8 µM da diosmina-Ni; 8,4 µM da

diosmina-Fe; 8,7 µM da diosmina-Co; e de 11,5 µM da diosmina. Os comprimentos

de onda utilizados para leitura foram de 190 – 500 nm em intervalos de 2s.

Os complexos também foram enviados para análise elementar no instituto de

química da USP.

A espectrometria de massas dos complexos (Espectrômetro de massas - TQD

Acquity. Micromass Water), foi realizada no instituto de biologia no laboratório do

Prof. Dr. Paulo Mazzafera (UNICAMP). As condições do equipamento foram de

capilar 3,0 kV (3000 v), cone 35 V, energia de colisão 20 e 25 eV (diosmina-Cu) e

30, 40 e 50 eV (diosmina-Co), infusão direta em modo positivo e negativo.

Temperatura da fonte 150 ºC e temperatura de solvatação 300 ºC.

39

4.6 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos

4.6.1 Determinação da atividade antioxidante dos complexos de

diosmina-metal pela captura do radical livre ABTS˙ˉ

O fundamento do ensaio de determinação de capacidade antioxidante

consiste basicamente na redução de radicais livres ABTS˙ˉ [2,2’ azinobis(3-etil-

benzotiazolino-6-ácido sulfônico) sal diamônio] por compostos com atividade

antioxidante. A metodologia foi adaptada de Souza e colaboradores (2003),

Leopoldini e colaboradores (2006), Rufino e colaboradores (2007) e Velosa e

colaboradores (2012).

4.6.2 Preparo da solução tampão fosfato 20 mM pH 7,4

Em balança analítica foram pesados 5,52 g de fosfato de sódio monobásico e

diluídos em 200 mL de água desionizada, formando uma solução final de 200 mM

(solvente monobásico).

Pesaram-se 5,68 g de fosfato de sódio dibásico e dissolveram-se em 200 mL

de água desionizada formando uma segunda solução também a 200 mM (solvente

dibásico).

Mediu-se o pH das duas soluções, e estas apresentaram um pH de 7,4.

Pipetaram-se 8 mL da solução diluída de solvente dibásico e transferiu-se

para um balão volumétrico de 100 mL. Pipetaram-se 2 mL da solução diluída de

solvente monobásico e transferiram-se para o mesmo balão volumétrico de 100 mL,

completando-se o volume do balão com água deionizada (18 M cm), obtendo-se

uma solução final de tampão fosfato (100 mL) a 20 mM. Verificou-se o pH da

solução e este manteve-se a 7,4.

4.6.3 Preparo da solução ABTS2- 2 mM

Pesou-se 0,0274 g de ABTS e em balão de 25 mL e solubilizou-se com água

desionizada, obtendo-se uma concentração final de 2 mM de ABTS2-.

40

Observação. Quando em água o ABTS torna-se um ânion (duas cargas

negativas) ABTS2- (Fig. 10).

S

O

OO

-

S

N

NN

N

S S

O-

O

O

Figura 10 - Estrutura do radical ABTS2-

.

4.6.4 Preparo da solução de ABTS˙ˉ 100 µM

Pipetaram-se 5 mL da solução de 2 mM de ABTS2-, transferiu-se para balão

volumétrico de 100 mL e completou-se com tampão fosfato 20 mM (pH 7,4),

atingindo uma concentração de 100 μM.

Em tubos de ensaio para centrífuga, foram adicionados, aproximadamente

0,0200 g de óxido de manganês (MnO2) (agente oxidante), e 5 mL de ABTS2- (100

µM); os tubos foram agitados em vórtex por aproximadamente 60 segundos e

centrifugados a 3800 rpm durante 30 minutos. O líquido sobrenadante dos tubos foi

recolhido em um béquer com delicadeza, onde o MnO2 não se desprendeu do fundo.

A solução recolhida foi filtrada com filtro de seringa de 0,22 µm para obter

uma solução de ABTS˙ˉ de concentração aproximadamente 60 µM (absorbância

0,95), considerando-se que a absortividade molar do ABTS.- em água ou tampão é

igual a 15000. A solução apresentou uma coloração verde escuro (Fig.11).

A solução final foi acondicionada em um frasco âmbar, sob-refrigeração e

protegida da luz e deixada por 48 horas sob refrigeração a 5 ºC, até sua

absorbância ser aproximadamente 0,70 e sua concentração nesta absorbância ser

48 µM.

41

S

O

OO

-

S

N

NN

N

S S

O-

O

O.+.

Figura 11 - Estrutura do radical ABTS˙ˉ.

4.6.5 Preparação das soluções de diosmina e diosmina-metal para os

testes de atividade antioxidante

Pesou-se 1mg de cada um dos composto (diosmina, diosmina-Ni, diosmina-

Fe, diosmina-Co), com exceção da diosmina-Cu (0,33 mg). Os compostos foram

dissolvidos em 1 mL de DMSO e transferidos para balões volumétricos de 10 mL

completando-se o volume com água deionizada (solução padrão).

Partindo-se da solução mãe, pipetaram-se cinco volumes diferentes de cada

composto (como mostra o quadro 2) e transferiu-se os volumes para balões de 5 mL.

Os balões foram completados com água desionizada, para formar cinco soluções em

diferentes concentrações variando de 1,4 a 7,1 µM.

O cálculo das concentrações das soluções dos complexos foi baseado no

trabalho de Velosa e colaboradores (2012), que utilizaram o método do ABTS para

avaliar a atividade do flavonóide rutina e seus complexos metálicos.

Quadro 2 - Diluições e concentrações da diosmina e dos complexos diosmina-metal.

Compostos Diluição 1 (µL)

Diluição 2 (µL)

Diluição 3 (µL)

Diluição 4 (µL)

Diluição 5 (µL)

Diosmina 218 174 131 87 43

Diosmina-Cu(II) 862 689 517 345 172

Diosmina-Ni(II) 283 226 169 113 56

Diosmina-Fe(III) 320 256 192 128 64

Diosmina-Co(II) 350 280 210 140 70

Concentração dos compostos

7,1 µM 5,7 µM 4,3 µM 2,8 µM 1,4 µM

42

O trolox (Fig. 12) é um antioxidante análogo da vitamina E utilizado para

comparar e avaliar a capacidade antioxidante dos compostos (TEAC) pela

metodologia do radical ABTS˙ˉ. O valor do fator estequiométrico ou “n” do rolox foi

obtido através da literatura (n trolox = 2,0), segundo Velosa e colaboradores (2012).

O

OH

HO

O

Figura 12 - Estrutura do trolox.

4.6.6 Avaliação da atividade antioxidante da diosmina e complexos

diosmina-metal

Em uma cubeta de vidro adicionou-se água deionizada e foi realizada a leitura

do branco. Após está etapa foi realizada a leitura da absorbância (em 734 nm) do

padrão (em triplicata), 2 mL da solução de ABTS˙ˉ.

Adicionaram-se 10 µL de cada uma das soluções preparadas no item 4.6.5

em uma cubeta de vidro e rapidamente adicionaram-se 2 mL da solução de ABTS˙ˉ.

As absorbâncias foram monitoradas em função do tempo, por 180 segundos com

intervalos de 1 segundo. Foram realizadas leituras em triplicatas.

4.6.7 Determinação da atividade antioxidante total (AAT)

Inicialmente foram construídas as curvas de decaimento espectrofotométrico

do radical ABTS˙ˉ, plotando-se as absorbâncias das diferentes concentrações no

eixo Y e o tempo em segundos no eixo X em um gráfico de dispersão.

Para o cálculo da AAT, utilizaram-se os valores referentes ao último ponto da

curva de decaimento espectrofotométrico (absorbância em 180 s de cada

concentração) na seguinte equação matemática:

43

4.6.8 Determinação da capacidade antioxidante equivalente ao trolox

(TEAC)

Para o cálculo do consumo de ABTS.- em µM, utilizaram-se os valores de

absorbância referentes ao último ponto da curva de decaimento espectrofotométrico

(em 180 s para cada concentração) na seguinte equação matemática:

Com os valores de concentração de radicais ABTS.- sequestrados versus a

concentração dos compostos (µM) foi construído um novo gráfico, cuja inclinação da

reta corresponde ao numero de moléculas de radicais abstraídos (n) por molécula de

antioxidante (composto).

O gráfico foi construído plotando-se as concentrações dos compostos no eixo

X, e os valores de ABTS consumido no eixo Y. Calculou-se a equação da reta

obtendo-se:

y = ax – b (onde o valor numérico de “a” = “n”, número de radicais ABTS.-

sequestrados por molécula antioxidante)

A determinação da TEAC foi obtida usando-se diretamente o valor referente à

inclinação da reta das regressões lineares obtidas (n), dividindo-se esse valor pelo

valor do fator estequiométrico (n) do trolox.

44

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Síntese dos complexos de coordenação de diosmina-metal

Os rendimentos dos complexos foram calculados pela massa molar (MM),

utilizando a proporção de 1:1 diosmina/metal. Os resultados obtidos foram

aproximadamente (≈) 44,7% para diosmina-Ni; ≈ 45,9% para diosmina-Fe; e ≈ 60,3%

para diosmina-Co. O rendimento do complexo diosmina-Cu não foi calculado devido

à dificuldade de solubilização e recristalização deste, nos solventes utilizados. O

complexo obtido com melhor rendimento foi diosmina-Co.

A complexação da diosmina com os nitratos não ocorreu. Com os sais (nitrato

e acetato) de zinco (II) também não ocorreu complexação.

5.2 Solubilidade dos complexos diosmina-metal

Os resultados de solubilidade em diferentes solventes testados estão

representados na Tabela 1. Os complexos obtidos tiveram diferenças significativas

referentes à solubilidade comparados com a diosmina. A diosmina é insolúvel em

solventes como metanol, etanol e água. No entanto, os complexos apresentaram

solubilidade relativa nestes solventes.

Solventes polares como água, etanol, DMSO e DMF, são solventes com

caráter de bases “duras” de Lewis, e podem formar complexos com o soluto e

participar da reação. Em DMSO os complexos apresentaram as melhores

solubilidades, devido ao DMSO [(CH3)2SO] ser um solvente bidentado, e comportar-

se como uma base “dura” de Lewis, devido ao oxigênio (O) ser um doador de é, e

também como base “mole” de Lewis, por causa do enxofre (S) como doador

(SHRIVER e ATKINS, 2008).

O complexo diosmina-Fe (III) é o complexo que apresentou melhor

solubilidade, o que se pode justificar devido a sua instabilidade de Fe3+ (d5).

45

Tabela 1 - Solubilidade dos compostos. Onde I = Insolúvel.

Solventes

Solventes Polares Apróticos

Solventes Polares Próticos

Compostos Massa

pesada

Acetona Acetonitrila DMSO DMF Água Etanol

Metanol

Diosmina

1 mg I I 0,2 mL 0,3 mL I I I

Diosmina-Cu

1 mg I I 3 mL 3 mL 6 mL I I

Diosmina-Fe

1 mg I I 0,2 mL 0,2 mL 0,07 mL 0,2 mL 0,2 mL

Diosmina-Ni

1 mg I I 2 mL 2 mL 0,2 mL 2 mL 0,2 mL

Diosmina-Co 1 mg I I 0,6 mL 1 mL 0,2 mL I 0,6 mL

Solventes apolares como o clorofórmio e o hexano também foram testados e

tanto a diosmina quanto os complexos formados são insolúveis. Os solventes

apolares comportam-se como bases “moles” de Lewis (SHRIVER e ATKINS, 2008).

5.3 Espectroscopia no Infravermelho (IV)

Os resultados das principais bandas obtidas nos espectros IV da diosmina em

comparação as principais bandas dos complexos estão demonstrados nas figuras

13, 14, 15 e 16.

As bandas alargadas obtidas para os espectros IV são processos envolvendo

orbitais moleculares, influenciadas pelas vibrações moleculares (PAVIA, et al.,

2010).

46

Figura 13 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Cu em azul.

Figura 14 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Ni em azul.

47

Figura 15 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Fe em azul.

Figura 16 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Co em azul.

Na Tabela 2 são mostradas as principais bandas dos espectros IV da

diosmina em relação aos complexos diosmina-metal.

48

Tabela 2 - Principais bandas na espectroscopia no infravermelho da diosmina e dos complexos.

Composto C=O cm-1(Δ) C=C cm-1 (Δ) C-O-C cm-1(Δ)

Diosmina 1659,75 1610,03 1097,70 - 1056,69

Diosmina-Cu 1631, 80 (27,95) 1556,44 – 1528,07

(53,59) 1046,00 (51,70)

Diosmina-Ni 1633,74 (26,01) 1558,94 (51,09) 1047,35 (50,35)

Diosmina-Fe 1626,80 (32,95) 1521,22 (88,81) 1077,47 (20,23)

Diosmina-Co 1633,09 (26,66) 1557,99 (52,04) 1047,86 (49,84)

As bandas C=O referente à carbonila do anel pirano C, sofreram

deslocamento para frequências mais baixas nos complexos diosmina-Cu, diosmina-

Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co em relação à diosmina. As bandas C=C dos

complexos diosmina-Cu, diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co referentes ao anel

A aromático também sofrem deslocamento para frequências mais baixas. As bandas

C-O-C referente ao éter aromático ao grupamento do anel C dos complexos

(diosmina-Cu, diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co) apresentaram

deslocamentos para frequências menores também. Ocorreram modificações

também nas bandas dos complexos referentes à região de impressão digital das

moléculas. Estes deslocamentos mostram que ocorreram mudanças nos

comprimentos de ligações C=O e C=C do anel aromático da diosmina. Significando

que ocorreram distorções nas ligações, alongando-as, por interações eletrônicas dos

ligantes com os orbitais d dos metais (Fe d6, Co d7, Ni d8 e Cu d9).

5.4 Espectroscopia no Ultravioleta (UV)

Nas Figuras 17, 18, 19 e 20 são mostrados os espectros no UV-VIS da

diosmina e de seus complexos.

49

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

237 262 287 312 337 362 387 412

Diosmina X D-Cu (II)

D-Cu

Diosmina

Ab

sorb

ân

cia

Comprimento de onda (nm)

Figura 17 - Espectro UV da diosmina-Cu em comparação a diosmina.

Figura 18 - Espectro UV da diosmina-Ni em comparação a diosmina.

50

Figura 19 - Espectro UV da diosmina-Fe em comparação a diosmina.

Figura 20 - Espectro UV da diosmina-Co em comparação a diosmina.

No espectro UV-VIS da diosmina foram observadas duas bandas de máxima

absorção, em 262 nm correspondente aos anéis A e C (benzoilpirano) e em 342 nm

correspondente ao anel B (cinamoil) (Fig. 21).

51

Figura 21 - Espectros UV da diosmina em comparação aos complexos D-Cu (II), D-Co (II), D-Fe (II) e D-Ni (II).

Ao comparar os comprimentos de onda no espectro UV da diosmina com os

complexos diosmina-Cu, diosmina-Co e diosmina-Ni, observa-se que ocorre um

deslocamento da banda correspondente ao anel A/C, para comprimentos de onda

maiores, ou seja, um deslocamento batocrômico nos três complexos. O mesmo não

se observa com o complexo diosmina-Fe, para o qual o deslocamento da banda

correspondente ao anel A é do tipo hipsocrômico. Muito provavelmente, devido ao

ferro oxidar-se rapidamente a um estado de Fe3+. Com centros metálicos muito

polarizáveis [Fe(III)], os ligantes H2O e O, do complexo, comportam-se como ligantes

de campo forte, promovendo o deslocamento para comprimentos de onda menores,

devido ao desdobramento do campo ligante (Δ0), ou seja, maior aumento do Δ0.

Os demais metais (M = Cu, Ni e Co) permanecerem no seu estado de

oxidação M2+, e portanto os ligantes H2O e O na série espectroquímica, são ligantes

de campo fraco para estes complexos.

Já com as bandas correspondentes ao anel B, dos quatro complexos, ocorre

uma diminuição da intensidade da banda e uma pequena redução no comprimento

de onda comparado com a diosmina (Tabela 3).

52

O perfil das curvas (ou λ) para todos os complexos são semelhantes,

podendo-se sugerir com estes dados, que a complexação ocorre nos mesmos

ligantes para todos os complexos.

Tabela 3 - Principais bandas na espectroscopia no ultravioleta da diosmina e dos complexos.

Compostos Comprimento de onda

Correspondente ao

Anel A

Comprimento de onda

Correspondente ao

Anel B

Diosmina 262 nm 342 nm

Diosmina-Cu (II) 281 nm 331 nm

Diosmina-Ni (II) 277 nm 330 nm

Diosmina-Fe (III) 253 nm 333 nm

Diosmina-Co (II) 268 nm 327 nm

Estes deslocamentos são característicos da interação dos orbitais d dos

metais, com os ligantes do flavonóide e H2O. Essa interação dos ligantes com os

orbitais d dos centros metálicos (energia de transição) depende não somente das

energias dos orbitais, mas também da repulsão elétron-elétron que ocorre.

5.5 Análise elementar

Na análise elementar dos complexos não foram obtidos resultados

satisfatórios, devido ser esta uma análise onde os compostos devem estar com o

máximo de pureza. Uma das hipóteses para explicar a dificuldade de purificação dos

complexos de diosmina é devido à diosmina comercial utilizada apresentar 95% de

pureza. Os outros 5%, muito provavelmente são de hesperidina, de onde a diosmina

é obtida.

5.6 Espectrometria de massas (EM)

A espectrometria de massas permite determinar a massa molecular de um

composto desconhecido, e a partir de seu padrão de fragmentação propor uma

estrutura molecular para a mesma. Quando suas moléculas são quebradas

(fragmentadas) por um processo de elétron ionização (EI) (bombardeamento por um

53

fluxo de elétrons) em que as moléculas ganham uma carga elétrica os íons são

separados pela relação massa-carga (m/z). O espectro de massas é representado

como um gráfico de barras, com massas (valores m/z) no eixo X e intensidade ou

abundância relativa (%) no eixo Y (MCMURRY, 2011).

O espectro de massas da diosmina-Cu (ANEXO G) obtido, demonstra a

dissociação de 672,2 m/z, referente ao complexo diosmina-Cu. A fragmentação

parcial do primeiro açúcar em 555,1 m/z, e a fragmentação do segundo açúcar em

393,4 m/z (Fig. 22).

Figura 22 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Cu e seus principais fragmentos.

No espectro da diosmina-Co, no modo negativo, o complexo não foi

encontrado, apenas a aglicona diosmetina a 357,1 m/z (ANEXO H).

No modo positivo, (com energia de colisão 40 V) representado na Figura 23, o

composto de coordenação contendo o cobalto foi observado em 666,5 m/z. A

diosmina com um “H” a menos (saindo da hidroxila no anel A) e um cobalto

adicionado na estrutura (entre a carbonila e a hidroxila).

A fragmentação completa do primeiro açúcar ocorre em 520,3 m/z e o

segundo açúcar ocorre em 358,3 m/z.

Em 301,3 m/z muito provavelmente é a diosmetina (aglicona) protonada (H+).

54

Figura 23 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Co e seus principais fragmentos.

O complexo diosmina-Fe não sofre ionização em modo positivo, e em modo

negativo não foi observado fragmentos contendo íon Fe, apenas sulfato. O mesmo

foi observado para o complexo diosmina–Ni.

Os resultados dos espectros de massa da diosmina com os metais de

transição (cobre, cobalto) indicam que a proporção íon metálico e diosmina nos

complexos é de 1:1 e, levando-se em conta as demais análises espectroscópicas,

que a interação metal-ligante ocorre através da carbonila e da hidroxila no anel A/C

no flavonóide e não no açúcar.

Comparando-se os dados obtidos com os trabalhos de Cuyckens e Claeys

(2004) e de Vukics e Guttman (2010), que estudaram a estrutura de flavonóides

glicosilados (como a flavona apigenina), em vários estágios, na espectrometria de

massas, e demonstraram que a fragmentação dos flavonóides O-glicosídeos, como

a diosmina, ocorre de forma muito similar, o que nos dá segurança para propor a

fragmentação dos complexos.

Na busca por referências bibliográficas que tratem da complexação do

flavonóide diosmina com metais de transição, não foram encontrados relatados de

trabalhos científicos publicados. Portanto, outro parâmetro comparativo são

complexações referentes ao flavonóide hesperidina ou a outros flavonóides

derivados de flavonas e flavanonas.

Trabalhos como os de Grazul e Budzisz (2009), que complexaram flavonóides

com metais de transição como a flavona naringina sugerem que o sítio de

55

complexação ocorreu entre os anéis A e C (benzoilpirona) com íons Cu (II) na

proporção de 1:1, devido à hidroxila (OH) ser mais ácida e favorecer a complexação

neste sítio. Outros autores como Malesev e Kuntic (2007) sugerem que os prováveis

sítios de complexação para flavonóides como a hesperidina, de onde se deriva a

diosmina, sejam entre a carbonila e a hidroxila dos anéis A e C (benzoilpirona) ou

entre a hidroxila e o éter aromático no anel B. Porém, a complexação ocorre

principalmente entre os anéis A e C para a hesperidina.

Com os Espectros no IV, UV e EM, podemos sugerir pelas evidências obtidas

que o principal sítio de complexação do flavonóide diosmina com os metais Cu (II),

Ni (II), Fe (II) e Co (II), sejam entre a carbonila e a hidroxila dos anéis A e C (Fig. 24

e 25).

CH3COO -

OH2

OH2

H2O

OH2

Me = Cu, Ni e Co

O

Me2+

-

C A

B

CH3

H3C

O

OH

O

O

O

OH

OH

HO

OH

OH

HO

O O

O

Figura 24 - Estrutura proposta para os complexos da diosmina-metal (Cu, Ni e Co).

56

SO4

2-

OH2

OH2

H2O

OH2

O

Fe3+

-

C A

B

CH3

H3C

O

OH

O

O

O

OH

OH

HO

OH

OH

HO

O O

O

Figura 25 - Estrutura proposta para o complexo diosmina-Fe.

Desta maneira, as massas moleculares propostas para os complexos são de

802,04 g/mol para diosmina-Cu; 797,24 g/mol para diosmina-Ni; 797,44 g/mol para

diosmina-Co; e 775,62 g/mol para diosmina-Fe.

5.7 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos diosmina-metal

5.7.1 Método ABTS.-

Os complexos que apresentaram melhor atividade antioxidante, nas cinco

concentrações testadas, pelo método do sequestro de radicais ABTS foram a

diosmina-Cu e a diosmina-Fe. A diosmina apresentou atividade antioxidante

semelhante à diosmina-Co e diosmina-Ni.

A curva de decaimento do radical ABTS.- obtida do composto diosmina-Fe,

que apresentou melhor atividade antioxidante esta representada na Figura 26.

57

Figura 26 - Curva de decaimento do radical ABTS˙ˉ pelo composto diosmina-Fe.

Na Figura 27 foi apresentado o gráfico de porcentagem de radicais

sequestrados (% Inibição) versus a concentração dos compostos (µM).

Figura 27 - % Inibitória do radical ABTS˙ˉ pelas concentrações dos complexos e da diosmina.

Observou-se que a capacidade de abstração (% inibitória) de radicais ABTS.-

é muito semelhante para os compostos de coordenação diosmina-Cu e diosmina-Fe.

58

No entanto, ao aumentarmos a concentração da diosmina-Fe, esta apresenta melhor

atividade antioxidante, inibindo 45 % de radicais ABTS.- na maior concentração

testada (7,1 µM). Já a diosmina-Cu inibe 42 % na concentração 5,7 µM,

permanecendo constante sua capacidade de sequestrar os radicais, mesmo

aumentando a sua concentração (7,1 µM). A diosmina-Co, diosmina-Ni e a própria

diosmina, possuem capacidade de abstração muito semelhante.

O gráfico representado na Figura 28 demonstrou o cálculo do fator

estequiométrico (n) da diosmina-Fe, como exemplo.

Figura 28 - Consumo do radical ABTS˙ˉ (µM) versus as concentrações da diosmina-Fe (µM), demonstrando o n = 3,3683 (3,4) calculado da diosmina-Fe.

Na Tabela 4 observa-se que a capacidade de abstração de ABTS.- da

diosmina e dos complexos diosmina-Co, diosmina-Fe e diosmina-Cu, são melhores

que a do Trolox. Apesar do complexo diosmina-Ni não apresentar atividade

antioxidante melhor que a diosmina, como os demais complexos, sua atividade é

superior ao Trolox. A diosmina-Cu, seguida da diosmina-Fe apresentam maior

atividade em comparação à diosmina e aos demais compostos.

59

Tabela 4 - Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) da diosmina e dos

complexos.

Compostos n TEAC

Trolox 2,0 1

Diosmina-Cu 3,7 ± 0,2 1,9 ± 0,1

Diosmina-Fe 3,4 ± 0,4 1,7 ± 0,2

Diosmina-Co 2,7 ± 0,1 1,4 ± 0,1

Diosmina-Ni 2,3 ± 0,2 1,2 ± 0,4

Diosmina 2,5 ± 0,8 1,3 ± 0,4

Os resultados da atividade antioxidante, obtidos para a diosmina, diosmina-Ni,

diosmina-Cu e diosmina-Co estão nos ANEXOS I, J, K e L respectivamente.

60

6 CONCLUSÃO

Os complexos diosmina-Cu, diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co

sintetizados neste trabalho, foram caracterizados por espectroscopia no IV e UV e

espectrometria de massas. De acordo com os resultados obtidos, é possível sugerir

que a complexação ocorreu entre os anéis A e C do flavonóide para todos os metais

complexados, ocorrendo ainda na proporção de 1:1 de diosmina:metal.

A caracterização dos complexos por análise elementar não foi possível devido

à presença da hesperidina (a diosmina comercializada apresenta 5% de hesperidina

na sua composição). A separação da hesperidina da diosmina não foi possível

devido à similaridade de solubilidade e polaridade entre os compostos. Além disso,

alguns complexos como a diosmina-Fe são extremamente higroscópicos, devido a

sua instabilidade, impossibilitando determinar sua composição com exatidão por

esta técnica.

A avaliação da atividade antioxidante frente ao radical ABTS.- demonstrou que

a diosmina-Cu e a diosmina-Fe apresentaram um potencial antioxidante superior aos

demais complexos, nas concentrações testadas. Esta maior atividade pode estar

associada aos íons Cu2+ e Fe3+ por serem ácidos de Lewis de fronteira, com caráter

duro. Isto faz com que ocorra uma diminuição da densidade eletrônica no flavonóide,

quando coordenado ao Cu (II) e Fe (III), o que permite que os elétrons livres do

radical sejam mais facilmente acomodados na molécula.

Estes dados corroboram com os relatos de literatura, que sugerem que

flavonóides complexados a metais de transição apresentam melhor potencial

antioxidante.

Como perspectiva para o complemento deste trabalho, encontra-se em

andamento a avaliação da atividade citotóxica dos complexos sintetizados, contra

linhagens de células tumorais, com a colaboração da Profª. e Drª. Susana Diniz

(UNIBAN). Os resultados preliminares apontam o complexo diosmina-Fe com melhor

atividade. O mesmo também apresentou melhor atividade antioxidante in vitro.

61

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69

ANEXO A - Espectroscopia no infravermelho (IV) da diosmina

70

ANEXO B - Espectroscopia no UV da diosmina

71

ANEXO C - Espectroscopia no IV da diosmina-Fe (III)

72

ANEXO D - Espectroscopia no IV da Diosmina-Cu (II)

73

ANEXO E- Espectroscopia no IV da diosmina-Ni (II)

74

ANEXO F - Espectroscopia no IV da diosmina-Co (II)

75

ANEXO G – Espectro de massas da diosmina-Cu, nos modos negativo e positivo,

(com energias de colisão 20, 25 eV).

m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

%

0

100

DIOSNINS CU NEG 79 (1.332) Cm (59:90) Scan ES- 8.23e5339.4250.2

225.1

61.8221.2

93.2216.2

101.0

325.5

299.2607.2340.2

341.1383.1 459.6

663.2

665.1758.2 1035.61007.2

917.5 1268.2

m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

%

0

100

DIOSNINS CU NEG AGUA 120 (2.024) Cm (47:196) Scan ES- 3.57e5299.2

62.0

250.2

225.1110.0

220.3112.0

216.2

161.1

607.3339.4

405.4341.2 406.2

459.3 577.1

608.3663.2

665.2 741.1973.2

m/z200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100

DIOSMINA CU 1 110 (1.855) Cm (1:132) Scan ES+ 2.05e7287.3

269.3288.3

301.4

m/z150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

%

0

100


269.3195.2163.3 217.2

288.3

301.4 363.5307.4

m/z200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

%

0

100


163.3288.3

301.3 609.2

76

ANEXO H – Espectro de massa da diosmina-Co, nos modos negativo e positivo

(com energias de colisão de 30, 40 e 50 eV).

m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

%

0

100

DIOSMINA CO NEG 39 (0.333) Cm (1:115) Scan ES- 5.18e6236.1

178.1

177.1

150.0134.1

208.1

385.2

371.2357.1327.3311.3283.3

413.2478.2

464.2506.2

655.3609.3534.2 683.2711.3

724.5

m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

%

0

100

m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

%

0

100

m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

%

0

100

DIOSMINA CO POS MS 185 (1.577) Cm (126:194) Daughters of 666ES+ 1.32e5666.6

666.2

444.2430.2188.9127.0 358.1301.3276.3220.1 324.6

376.2

665.6520.3

519.1454.4594.4580.3

562.7 663.2604.7667.2

696.9


357.9

357.7

357.2301.3276.2204.2127.2 161.8219.9

430.1376.1 418.2

400.2

520.3444.3519.6

475.3

666.5520.5 594.2579.7 663.7603.0 736.7714.1670.0


357.9

357.4

356.6301.1204.1123.2 132.2 177.9220.1

430.4376.1 417.8 444.3519.9509.9 665.5578.7554.8

593.3658.0

679.1

77

ANEXO I – Resultados obtidos para diosmina versus radical ABTS˙ˉ.

78

ANEXO J – Resultados obtidos para diosmina-Ni versus radical ABTS˙ˉ.

79

ANEXO K – Resultados obtidos para diosmina-Cu versus radical ABTS˙ˉ.

y = 3,6636x - 3,7702R² = 0,9388

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8

Co

ns

um

o A

bts

(µ

M)

Concentração D-Cu (µM)

ABTS (48 µM) X D-Cu

80

ANEXO L – Resultados obtidos para diosmina-Co versus radical ABTS˙ˉ.

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UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO · complexão destes com metais de transição, com a finalidade de se obter novas moléculas com maior atividade biológica e baixa toxicidade