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UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO FERNANDO MATEUS SCREMIN
COSMÉTICOS ORGÂNICOS: DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE EMULSÕES ACRESCIDAS DO EXTRATO
PADRONIZADO EM FLAVONÓIDES TOTAIS DE Physalis angulata L.
SÃO PAULO 2011
FERNANDO MATEUS SCREMIN MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
COSMÉTICOS ORGÂNICOS: DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE EMULSÕES ACRESCIDAS DO EXTRATO
PADRONIZADO EM FLAVONÓIDES TOTAIS DE Physalis angulata L.
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Profissional em Farmácia, da Universidade Bandeirante de São Paulo, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmácia. Orientador: Dr. Niraldo Paulino
SÃO PAULO 2011
Scremin, Fernando Mateus
Cosméticos Orgânicos: desenvolvimento e avaliação da estabilidade de emulsões acrescidas do extrato padronizado em flavonóides totais de Physalis angulata L.
137 f.; il; 30cm
Dissertação de Mestrado – Universidade Bandeirante de São Paulo, Curso de Mestrado Profissional em Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. Niraldo Paulino
1. Cosmético Orgânico 2. Physalis angulata L. 3. Emulsão 4. Avaliação da estabilidade I. Título
COSMÉTICOS ORGÂNICOS: DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE EMULSÕES ACRESCIDAS DO EXTRATO PADRONIZADO EM FLAVONÓIDES TOTAIS DE Physalis angulata L.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA À UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO, COMO EXIGÊNCIA DO PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM FARMÁCIA.
BANCA EXAMINADORA
- 1° Examinador - Presidente / Orientador Prof. Dr. Niraldo Paulino Titulação: Doutor em Farmacologia (UFSC) Instituição: Universidade Bandeirante de São Paulo (UNIBAN) - 2º Examinador Prof. Dr. Titulação: Instituição: - 3º Examinador Prof. Dr. Titulação: Instituição: - 4º Examinador Prof. Dr. Titulação: Instituição: - 5º Examinador Prof. Dr. Titulação: Instituição:
São Paulo, 01 de Dezembro de 2011.
Dedico a minha esposa e minha filha que me deram muita força e amor para persistir e concluir mais esta fase de estudos e a toda a minha família que apóiam meus sonhos e que confiaram em mim e deram toda a base e força!
AGRADECIMENTOS
Obrigado a Deus, pela sua graça sobre a minha vida e por ter me permitido
viver tudo isso.
A todos os professores que durante esses dois anos me proporcionaram
novas experiências, conhecimentos e esclarecimentos que moldaram minha vida
profissional. Em especial à Prof.ª Maria Cristina Marcucci pelo apoio e pelas aulas
de validação de métodos, que levaram ao desenvolvimento de parte deste trabalho.
À professora Márcia e Claudete, que qualificaram a minha dissertação e
ajudaram e muito na melhoria deste trabalho final.
Aos colegas do mestrado e de laboratório, pelo companheirismo e troca de
experiências ao longo destes dois anos que juntos convivemos.
Ao professor Niraldo Paulino, sempre prestativo e dedicado que se
disponibilizou a orientar e que sempre apóia meus sonhos e, mais que tudo, ensina
a sonhar e acreditar que tudo é possível, basta acreditar.
A Lúcia Beatriz Althoff Souza, por toda a ajuda, disponibilizando a Farmácia
de Manipulação Maria Rocha para alguns testes realizados, e por acreditar em mim
e estimular o meu crescimento pessoal e intelectual.
À minha esposa Cristiane e minha filha Ane, que suportaram a minha
ausência para me verem crescer e vencer. Muito obrigado, amo muito vocês.
Aos meus pais e irmãs, sempre próximos, e que são o alicerce de toda a
minha vida.
À todas as pessoas que, direta ou indiretamente, estiveram presentes,
colaborando e participando desta etapa de minha vida.
Obrigado!
O acaso não existe. Quando alguém
encontra algo de que verdadeiramente
necessita, não é o acaso que tal
proporciona, mas a própria pessoa; seu
próprio desejo e sua própria necessidade
o conduzem a isso (Demian).
Herman Hesse
RESUMO
Scremin, F. M. Cosméticos Orgânicos: desenvolvimento e avaliação da estabilidade de emulsões contendo o extrato de Physalis angulata L. 2011. 137f. Dissertação de Mestrado – Curso de Mestrado Profissional em Farmácia, Universidade Bandeirante de São Paulo, São Paulo, 2011.
O uso de produtos tópicos antioxidantes auxilia de forma eficaz na redução da peroxidação lipídica, diminuindo o envelhecimento da pele e evitando o aparecimento de rugas. Os cosméticos antienvelhecimento tem crescido mundialmente, assim como a preocupação em relação a sustentabilidade do planeta. Atualmente as pessoas procuram produtos que agridam menos o meio ambiente, principalmente o que podemos chamar de cosméticos orgânicos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar, sob o ponto de vista físico-químico, três formulações de emulsão acrescida do extrato padronizado de Physalis angulata. O extrato dos frutos de Physalis angulata utilizado no desenvolvimento da emulsão foi validado para flavonóides totais expressos em quercetina, o que garante a qualidade final das emulsões a serem testadas. As formulações foram avaliadas inicialmente pelo teste de centrifugação, a partir deste teste, foi escolhida uma única formulação, para serem realizados os testes de estabilidade preliminar, onde amostras das emulsões foram colocadas em estresse ambiental, com temperaturas variando de -5º C a 40º C, por 15 dias. Dando continuidade aos testes as amostra foram avaliadas por um período maior, durante 90 dias com variação de temperatura idênticos ao teste anterior. As formulações armazenadas em geladeira, freezer, estufa, luz e temperatura ambiente, mantiveram sua densidade específica, não apresentando notória oxidação ou modificação da aparência, mostrando-se estáveis no período de tempo analisado. Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que os ensaios realizados garantem a estabilidade físico-química e a qualidade da emulsão com extrato de Physalis angulata.
Palavra chave: Cosmético Orgânico. Physalis angulata L. Emulsão. Avaliação da
estabilidade.
ABSTRACT
Scremin, F. M. Organic Cosmetics: development and evaluation of the stability of emulsions containing extract of Physalis angulata L. 2011. 137 f. Dissertation – Master course in Pharmacy, Bandeirante University of São Paulo, São Paulo, 2011.
The use of topical antioxidants products effectively help in reducing lipid peroxidation, reducing aging skin and preventing wrinkles. The use of anti-aging cosmetic has been growing worldwide, as well as concern about the sustainability of the planet. Now people look for products that are less harmfull the environment, especially what we call organic cosmetics. The objective of this study was to develop and characterize from the point of the view of the physico-chemical, three emulsion formulations increased the standardized extract of Physalis angulata. The extract of Physalis angulata fruits used in the development of the emulsion was validated for total flavonoids expressed as quercetin, which guarantees the final quality of the emulsions to be tested. The formulations were evaluated initially by centrifugation test, from this test, a single formulation was chosen to be performed preliminary tests of stability, where samples of the emulsions were placed in environmental stress, with temperatures ranging from -5°C to 40°C for 15 days. Continuing to test, the samples were evaluated for a longer period for 90 days with temperature variation similar to the previous test. The formulations stored in the refrigerator, freezer, stove, light and temperature, maintained their specific density, showing no noticeable oxidation or modification of the appearance, being stable in the time period analyzed. The obtained results allow concluding that the tests carried out ensure the physical and chemical stability and quality of the emulsion with extract of Physalis angulata.
Keywords: Organic Cosmetics. Physalis angulata L. Emulsions. Evaluation of the
stability.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Espécies de Physalis L. e seu uso etnofarmacológico............................ 15 Tabela 2 – Chave de identificação da Physalis angulata L., Physalis viscosa L., Physalis pubescebs L. e Physalis peruviana L. ......................................................... 19 Tabela 3 – Esteróides encontrados na Physalis angulata L. ................................... 21 Tabela 4 – Ficha de análise físico-química do álcool etílico e especificações de qualidade ................................................................................................................... 28 Tabela 5 – Resultados dos parâmetros físicos de qualidade dos frutos de Physalis angulata L.................................................................................................................. 34 Tabela 6 – Resultados das medidas dos frutos de Physalis angulata L. .................. 35 Tabela 7 – Resultados para o controle de qualidade do álcool etílico ...................... 36 Tabela 8 – Determinação do teor alcoólico, pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura de Physalis angulata L. ............................................................................. 37 Tabela 9 – Prospecção fitoquímica do extrato aquoso e hidroalcoólico dos frutos de Physalis angulata L. .................................................................................................. 38 Tabela 10 – Volumes de quercetina e cloreto de alumínio para preparo das soluções nas concentrações de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10µg/mL de quercetina ............................ 51 Tabela 11 – Concentração real das amostras analisadas de quercetina para formar a curva de calibração ................................................................................................ 56 Tabela 12 – Leitura da absorbância das amostras de quercetina a 425nm .............. 57 Tabela 13 – Leitura média da absorbância das amostras de quercetina com desvio padrão, desvio padrão relativo e incerteza ................................................................ 57 Tabela 14 – Leituras de absorbância da quercetina (3µg/mL), extrato de Physalis e do extrato de Physalis acrescido da amostra ............................................................ 59 Tabela 15 – Resultados do primeiro dia de análises para o testes de precisão do método de quantificação de flavonóides totais do extrato de Physalis angulata L. ... 60 Tabela 16 – Resultados do segundo dia de análises para o testes de precisão do método de quanficação de flavonóides totais de Physalis angulata L. ..................... 61 Tabela 17 – Valores obtidos no ensaio de Robustez do método de quanficação de flavonóides totais de Physalis angulata L. ................................................................. 62 Tabela 18 - Valores da diferença relativa (%) dos ensaios de Robustez do extrato de Physalis Angulata L. em relação ao teste de repetibilidade ...................................... 63 Tabela 19 – Alterações cutâneas provocadas pelo envelhecimento ........................ 70 Tabela 20 – Formulação das 3 emulsões testadas ................................................... 80 Tabela 21 – Classificação das matérias primas utilizadas na produção da emulsão quanto a sua origem .................................................................................................. 85 Tabela 22 – Avaliação das características organolépticas da emulsão EC3 durante a estabilidade preliminar .............................................................................................. 89 Tabela 23 – Valores de pH da emulsão EC3 durante o teste de estabilidade preliminar................................................................................................................... 90 Tabela 24 – Avaliação das características organolépticas da emulsão EC3 durante a estabilidade preliminar .............................................................................................. 94 Tabela 25 – Valores de pH da emulsão EC3 durante o teste de estabilidade acelerado................................................................................................................... 95 Tabela 26 - Valores da densidade emulsão EC3 durante o teste de estabilidade preliminar................................................................................................................... 97
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ramo demonstrando as características macroscópicas das folhas da Physalis angulata L. .................................................................................................. 16 Figura 2 – Secção transversal da lâmina foliar da Physalis angulata L. ................... 16 Figura 3 – Flor da Physalis Angulata L. (A) Corola em vista frontal. (B) Corola em vista lateral ................................................................................................................ 17 Figura 4 – Fruto da Physalis Angulata L. (A) Fruto envolto pelo cálice frutífero. (B) Esquema do fruto com cálice acrescente em corte longitudinal. (C) Corte transversal do fruto ...................................................................................................................... 18 Figura 5 – Vitaesteróides isolados dos frutos da Physalis angulata L. ..................... 22 Figura 6 – Fotos dos frutos de Physalis angulata L. aprovados(A) e rejeitados(B) a partir dos parâmetros físicos de qualidade ................................................................ 34 Figura 7 – Fotos dos frutos de Physalis angulata sendo avaliados quanto ao peso e diâmetro .................................................................................................................... 35 Figura 8 – Estrutura química básica de um flavonóide ............................................. 46 Figura 9 – Algumas classes de flavonóides.............................................................. 46 Figura 10 - Formação do complexo Al+2-flavonóide................................................. 48 Figura 11 – Curva padrão de flavonóides totais expressa em quercetina ................ 57 Figura 12 – Demonstração da faixa linear de trabalho do padrão Quercetina.......... 58 Figura 13 – Ilustração da estrutura básica da pele ................................................... 67 Figura 14 – Fotomicrografia do corte da pele humana ............................................. 68 Figura 15 – Desenho demonstrando as estruturas da pele que se originam a partir de invaginações epidérmicas .................................................................................... 69 Figura 16 – Corte da pele do grupo jovem (A) e corte da pele do grupo idoso (B)... 71 Figura 17 – Representação da diminuição da tensão interfacial entre as fases aquosa e oleosa de uma emulsão, formação de filamentos entre as fases e formação das gotículas ............................................................................................. 74 Figura 18- Processos de desestabilização de emulsões .......................................... 75 Figura 19 – Fotografia da emulsão EC3 ................................................................... 86 Figura 20: Fotografia das formulações EC1, EC2 e EC3 após 30 minutos de centrifugação a 3000 rpm .......................................................................................... 87 Figura 21 – (A) Valores de pH da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente, estufa e luz indireta e (B) nas condições de armazenamento em ciclo, geladeira e freezer, no teste de estabilidade preliminar .. 91 Figura 22 – Fotografia da emulsão EC3 estável ao teste de estabilidade preliminar ... .................................................................................................................................. 92 Figura 23 – (A) Valores de densidade específica da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente, estufa e luz indireta e (B) nas condições de armazenamento em ciclo, geladeira e freezer, na estabilidade preliminar ........... 93 Figura 24 – Fotografia do pHmetro com a dispersão aquosa da emulsão EC3 ....... 95 Figura 25 – (A) Valores de pH da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente, estufa e luz indireta e (B) nas condições de armazenamento em ciclo, geladeira e freezer, no teste de estabilidade preliminar .. 96 Figura 26 – Valores de densidade específica da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente (20º C), estufa (40º C) e luz indireta ..... 97 Figura 27 - Valores de densidade específica da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em ciclo (-5 e 20 °C), geladeira (5 °C) e freezer (-5 °C), no teste de estabilidade preliminar .............................................................................................. 97
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 13 PARTE 1 – CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS FRUTOS E DO EXTRATO DE Physalis angulata L. 1 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 14 1.1 O GÊNERO Physalis ........................................................................................... 14 1.2 Physalis Angulata L. ............................................................................................ 15 1.2.1 Descrição botânica ........................................................................................... 15 1.2.2 Dados taxonômicos .......................................................................................... 18 1.2.3 Distribuição geográfica ..................................................................................... 19 1.2.4 Dados etnofarmacológicos ............................................................................... 20 1.2.5 Constituintes químicos e atividade farmacológica ............................................ 21 1.2.6 Toxicidade da espécie Physalis angulata L. ..................................................... 24 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 25 3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 26 3.1 MATERIAIS ......................................................................................................... 26 3.1.1 Material botânico .............................................................................................. 26 3.2 MÉTODOS .......................................................................................................... 26 3.2.1 Caracterização física dos frutos ....................................................................... 26 3.2.2 Método extrativo ............................................................................................... 27 3.2.3 Caracterização físico-química da tintura. ......................................................... 29 3.2.4 Caracterização fitoquímica ............................................................................... 30 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 34 4.1 CARACTERIZAÇÃO FÍSICA DOS FRUTOS ...................................................... 34 4.2 MÉTODO EXTRATIVO ....................................................................................... 36 4.2.1 Controle de qualidade do álcool ....................................................................... 36 4.2.2 Caracterização físico-química da tintura. ......................................................... 36 4.3 CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA ................................................................... 37 5 CONCLUSÕES PARCIAIS .................................................................................... 39 PARTE 2 - VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE FLAVONÓIDES TOTAIS EXPRESSOS EM QUERCETINA NO EXTRATO ETANÓLICO DE Physalis angulata L. 6 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 40 6.1VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA .................................................... 40 6.1.1Seletividade e especificidade. ........................................................................... 42 6.1.2 Linearidade ....................................................................................................... 42 6.1.3 Precisão ........................................................................................................... 43 6.1.5 Exatidão ........................................................................................................... 44 6.1.6 Robustez .......................................................................................................... 44 6.2 FLAVONÓIDES TOTAIS ..................................................................................... 45 6.2.1 Espectrofotometria UV-VIS .............................................................................. 47 7 OBJETIVOS ........................................................................................................... 49 8 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 50 8.1 MATERIAIS ......................................................................................................... 50 8.2 MÉTODOS .......................................................................................................... 50 8.2.1 Obtenção do extrato de Physalis angula L. ...................................................... 50 8.2.2 Obtenção da curva analítica da quercetina ...................................................... 51 8.2.3 Precisão ........................................................................................................... 52
8.2.4 Seletividade ...................................................................................................... 52 8.2.5 Exatidão ........................................................................................................... 53 8.2.6 Robustez .......................................................................................................... 54 9 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 56 9.1 LINEARIDADE .................................................................................................... 56 9.2 SELETIVIDADE E EXATIDÃO ............................................................................ 58 9.3 PRECISÃO E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA ...................................................... 59 9.4 ROBUSTEZ ......................................................................................................... 61 10 CONCLUSÕES PARCIAIS .................................................................................. 64 PARTE 3 - DESENVOLVIMENTO E ESTUDO DA ESTABILIDADE DAS EMULSÕES CONTENDO O EXTRATO DE Physalis angulata L. 11 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 65 11.1 PELE ................................................................................................................. 66 11.1.1 Estrutura geral da pele ................................................................................... 67 11.1.1 Envelhecimento cutâneo ................................................................................ 69 11.2 EMULSÕES COSMÉTICAS E ESTUDO DE ESTABILIDADE .......................... 73 12 OBJETIVO ........................................................................................................... 78 13 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 79 13.1 MATERIAIS ....................................................................................................... 79 13.2 MÉTODOS ........................................................................................................ 80 13.2.1 Desenvolvimento das emulsões ..................................................................... 80 13.2.2 Teste de centrifugação ................................................................................... 81 13.2.3 Teste de estabilidade ..................................................................................... 81 13.2.4 Teste de estabilidade preliminar das emulsões .............................................. 81 13.2.5 Testes de estabilidade acelerada das emulsões ............................................ 82 13.2.5.1 Avaliação das características organolépticas .............................................. 82 13.2.5.2 Determinação do valor de pH ...................................................................... 83 13.2.5.3 Determinação da densidade ........................................................................ 83 14 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 84 14.1 DESENVOLVIMENTO DA EMULSÃO .............................................................. 84 14.2 Testes de centrifugação .................................................................................... 86 14.3 Testes de estabilidade....................................................................................... 87 14.4 Testes de estabilidade preliminar das emulsões ............................................... 88 14.4.1 Avaliação das características organolépticas ................................................. 88 14.4.2 Determinação do valor de pH ......................................................................... 89 14.4.3 Determinação da densidade ........................................................................... 91 14.5 Testes de estabilidade acelerada das emulsões ............................................... 94 14.5.1 Avaliação das características organolépticas ................................................. 94 14.5.2 Determinação do valor de pH ......................................................................... 94 14.5.3 Determinação da densidade ........................................................................... 97 15 CONCLUSÃO PARCIAL ..................................................................................... 99 16 CONCLUSÃO FINAL ......................................................................................... 100 REFERENCIAS ....................................................................................................... 101 ANEXOS ................................................................................................................. 113
13
INTRODUÇÃO
As pesquisas com plantas do gênero Physalis vem crescendo nos últimos
anos, as duas últimas décadas apresentaram um grande número de citações e
referências. A procura por novos ativos oriundos de vegetais, alavanca ainda mais
as pesquisa sobre as plantas no Brasil, em especial as nativas, como é o caso da
Physalis angulata L. (LOPES et al., 2006).
Além da criação de fitofármacos, medicamentos fitoterápicos a partir das
plantas medicinais (LOPES et al., 2006), existe também a produção de cosméticos,
ou como podem ser chamados “Fitocosméticos” (PONTES et al, 2003). O que na
antiguidade era utilizado para fins terapêuticos, atualmente está sendo utilizado pela
indústria do embelezamento para a criação de novos cosméticos (LOPES, 2005).
Existe uma tendência mundial na busca de produtos que não agridam o meio
ambiente ou que tragam um maior equilíbrio ecológico. Esta tendência cosmética
ocorre principalmente no uso de produtos naturais derivados da flora brasileira
(LIMA et al, 2008).
Para o desenvolvimento e garantia de qualidade de fitocosméticos se faz
necessária a avaliação da estabilidade destes produtos frente a estímulos externos
(fatores ambientais) e fatores internos (reações de formulação).
O estudo de estabilidade fornece informações sobre o produto, para estimar o
prazo de validade, aperfeiçoar a formulação e determinar o material de
acondionamento, entre outros fatores. A avaliação de características como cor, odor,
aspecto, pH, densidade e viscosidade, produzem informações sobre a confiabilidade
e segurança do produto final (BRASIL, 2004).
A estabilidade é um fator primordial em uma forma farmacêutica, avaliar e
garantir a estabilidade de emulsão, garante a qualidade e o sucesso terapêutico do
produto final (LANGE, HEBERLE E MILÃO, 2009).
Com isso o objetivo principal deste projeto foi desenvolver uma emulsão com
o Extrato de Physalis angulata e avaliar a estabilidade desta, bem como utilizar
matérias primas que garantem sustentabilidade e proteção do meio ambiente.
14
PARTE 1 – CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
DOS FRUTOS E DO EXTRATO DE Physalis angulata L.
1 REVISÃO DE LITERATURA
1.1 O GÊNERO Physalis
Physalis L. (Solanaceae) é um gênero facilmente caracterizado pela
presença de uma bolsa ou cálice frutífero inflado, que envolve totalmente o fruto
(TOMASSINI, 2000; SOARES et al., 2009). A facilidade no reconhecimento deste
gênero se dá pelo tipo de fruto, uma baga com cálice persistente (SOUZA, 2011).
Este gênero possui aproximadamente 90 espécies, sendo a mais conhecida
a Physalis peruviana L. comumente encontrada nos Andes sul-americanos. Sua
distribuição ocorre desde a América do Norte até a América do Sul, e algumas de
suas espécies como a Physalis angulata L., são cultivadas por sua importância na
alimentação humana (SILVA e AGRA, 2005).
As espécies pertencentes ao gênero são normalmente endêmicas, e
encontradas em ambientes nativos, solos modificados ou até mesmo como
vegetação secundária (SOARES et al., 2009). Existem várias relatos na literatura
que revelam as Physalis L. como ervas daninhas. A grande maioria das espécies
encontradas no gênero Physalis L. são de origem americana, com exceção da
Physalis alkekengi L., que encontrada é na Europa e Ásia. Na América do Sul
ocorrem cerca de 12 espécies, que podem ser encontradas desde altas altitudes até
o nível do mar (SOARES et al., 2009).
As plantas que constituem este gênero tem uma importância medicinal
bastante valorizada pela medicina tradicional do mundo. Algumas espécies tem sido
domesticadas, para uso nas mais diversas patologias, como as que estão descritas
na tabela 1.
Na família Solanaceae o gênero Physalis possui várias atividades
farmacológicas descritas na literatura e estas atividades ocorrem principalmente pela
presença dos vitaesteróides (SILVA e AGRA, 2005).
Importantes papéis farmacológicos são descritos para o gênero Physalis,
tais como a atividade antibacteriana e antifúngica, com destaque a atividade da
15
Physalis phyladelphica contra o S. aureus (LOPES, 2006), bem como atividade
antimicrobiana, antitumoral, imunomoduladora, anti-inflamatória, tripanossomicida,
antileishmanial, dentre outras (CHECON, 2011).
Tabela 1 – Espécies de Physalis L. e seu uso etnofarmacológico.
Espécies Uso Medicinal
Physalis angulata Diabetes, malária, hepatite, reumatismo, diurético, antiinflamatório, sedativo, antipirético e desinfetante.
Physalis alkekengi Expectorante, antitussígeno, diurético e antitumoral.
Physalis chenopodifolia Infecções respiratórias, febre e diabetes.
Physalis mínima Inflamações da pele, diurético, tônico e purgativo.
Physalis philadelphica Distúrbios gastrointestinais, depurativo e antídoto contra veneno de animais peçonhentos.
Physalis pubescens Diabetes, malária, hepatite, reumatismo, diurético, antiinflamatório, sedativo, antipirético, antivômito e desinfetante.
Physalis peruviana Tratamento de câncer, leucemia, malária, asma, hepatite, dermatites, reumatismo, diurético, antipirético e antimicrobiano
Fonte: Magalhães, 2005.
1.2 Physalis Angulata L.
A Physalis angulata L. pertence à família das Solanaceae (SOARES et al.,
2003), é considerada uma erva daninha muito encontrada no norte e nordeste do
Brasil, e é considerada uma planta nativa brasileira (LORENZI e MATOS, 2002).
1.2.1 Descrição botânica
A Physalis é uma planta herbácea e anual, uma erva ereta com altura de 30-
50 cm (SILVA e AGRA, 2005) podendo chegar a 70 cm (SIMAS, 2005).
Sua folha é simples, oblonga e oval-lanceolada com margem denteada,
alternas e pubescentes, membranácea, ápice agudo a acuminado, com base aguda
ou oblíqua (Figura 1), possui tricomas simples glandulares e eglandulares (SILVA e
AGRA, 2005; SOARES et al., 2009).
16
Figura 1 – Ramo demonstrando as características macroscópicas das folhas da Physalis angulata L. (adaptado de SILVA e AGRA, 2005).
A epiderme da lâmina foliar é anfiestomática, uniestratificada e seu mesófilo
é dorsiventral e heterogêneo (SILVA e AGRA, 2005), e com cutícula espessa
(SIMAS, 2005).
Na epiderme a face abaxial difere da adaxial, pois as células que formam as
paredes da epiderme são de menor tamanho, ondeadas, anticlinais e mais delgadas,
esta possui uma quantidade maior de estômatos dos tipos anisocítico e anomocítico
e apenas na face abaxial localizam-se pouco abaixo da epiderme. Ocorre a
formação de drusas no interior do parênquima esponjoso, devido à formação deste,
por três a cinco camadas de células de diversos formatos, já o parênquima
paliçádico é uniestratificado (Figura 2) (SILVA e AGRA, 2005; SOARES et al., 2009).
As flores possuem pedicelo cilíndrico, pubérulo, com 1,0 a 1,7 cm de
comprimento. O cálice florífero tem comprimento de 0,2 a 0,5 cm, sépalas
lanceoladas, soldadas até a porção mediana (SOARES et al., 2009). As flores são
solitárias ou em cimeiras (SILVA e AGRA, 2005), com corola amarela, amarelo-
17
esverdeada a amarelo-pálida, com mancha contínua acastanhada na base (Figura
3) (SOARES et al., 2009).
Figura 2 – Secção transversal da lâmina foliar, na parte superior da imagem a epiderme na face adaxial, na parte central o parênquima paliçádico e esponjoso, na parte inferior a epiderme na face abaxial (adaptado de SILVA e AGRA, 2005).
Os estames são formados por filetes de até 0,5 cm de comprimento; anteras
azuis, com 0,1 a 0,2 cm de comprimento, o ovário é subgloboso, com 1,2 a 1,5 mm
de diâmetro, bilocular, pluriovular (SILVA e AGRA, 2005; SOARES et al., 2009).
A B
Figura 3 – Flor da Physalis Angulata L. (A) Corola em vista frontal. (B) Corola em vista lateral. (adaptado de SOARES, 2009).
O fruto é amarelo quando maduro, e pode possuir até 1,5 cm de diâmetro,
classificado como uma baga globosa e envolvida pelo cálice acrescente, inflado. Um
corte do fruto em secção transversal possuiu 1,5 a 3,5 cm de comprimento e 0,9 a
2,8 cm de largura (Figura 4) (SILVA e AGRA, 2005; SOARES et al., 2009). As
18
sementes com até 0,2 cm de comprimento, são numerosas com formato discóide e
testa reticulada, com coloração ferrugínea a marrom (Figura 4) (SILVA e AGRA,
2005).
A B C
Figura 4 – Fruto da Physalis Angulata L. (A) Fruto envolto pelo cálice frutífero. (B) Esquema do fruto com cálice acrescente em corte longitudinal. (C) Corte transversal do fruto. (adaptado de SILVA E AGRA, 2005; SOARES et al., 2009).
A floração e frutificação ocorrem principalmente nos meses de dezembro a
julho, sendo que neste último é o período mais produtivo da planta (SOARES, 2009).
1.2.2 Dados taxonômicos
Antigamente as plantas recebiam nomes descritivos e longos, um exemplo é
o camapu que era denominado como Physalis amno ramosissinme ramis angulosis
glabris follis dentoserratis, porém Lineu a classificou posteriormente como Physalis
angulata (FONSECA, 2011).
Baseado no sistema binomial o camapu ou physalis é nomeado como
Physalis angulata L., porém existem vários sinônimos botânicos para esta espécie,
tais como: Physalis capsicifolia; Physalis esquirolii; Physalis lanceifolia; Physalis
linkiana; Physalis ramosissima (LORENZI E MATOS, 2002; SILVA e AGRA, 2005).
A nomenclatura vernacular é a mais variada para a espécie Physalis
angulata L., são elas: Camapu, joá, balãozinho, bucho-de-rã, joá-de-balão, camaru,
camambu, mata-fome (LORENZI E MATOS, 2002; SILVA e AGRA, 2005), balão-
rajado, joá-de-capote, bate-testa, (SILVA e AGRA, 2005), fisális e campainha
(SOARES, 2009).
19
Analisando a morfologia da planta ela é classificada como sendo da família
Solanaceae L., subfamília Solanoideae, tribo Solaneae, subtribo Physalinae (SILVA
e AGRA, 2005; SOARES et al., 2009).
A identificação botânica da Physalis angulata L. pode ser realizada através
de uma chave botânica, como a descrita por Soares e colaboradores (2009), que
utilizaram esta para a identificação de algumas espécies de Physalis encontradas no
Rio Grande do Sul. As características para identificação botânica da Physalis
angulata L. estão descritas na Tabela 2.
Tabela 2 – Chave de identificação da Physalis angulata L., Physalis viscosa L., Physalis pubescebs L. e Physalis peruviana L.
1. Plantas de caule subcilíndrico, com tricomas simples e/ou dendríticos, freqüentemente glandulares; estigma clavado. ............................Physalis viscosa L.
1’. Plantas de caule anguloso, glabras ou com tricomas simples ou glandulares, nunca dendríticos; estigma capitado.
2. Caules glabros ou glabrescentes; tricomas antrorsos nos ramos jovens, pecíolos e nervuras; lâminas foliares ovalado-lanceoladas a oblongas; corola com mancha acastanhada na fauce.................................................................Physalis angulata L.
2’. Caules cobertos por tricomas simples e/ou glandulares; tricomas patentes nos ramos jovens, pecíolos e nervuras; lâminas foliares deltóides; corola com cinco máculas vinosas.
3. Cálice frutífero penta-costado em secção transversal; plantas herbáceas ................................................................................................ Physalis pubescens L.
3’.Cálice frutífero circular em secção transversal; plantas arbustivas ...................................................................................................Physalis peruviana L.
1.2.3 Distribuição geográfica
A Physalis angulata L. é encontrada na América do Norte, Central e do Sul
(SILVA e AGRA, 2005), e é a espécie com a maior distribuição geográfica nestes
continentes (SOARES, 2009).
Encontrada em quase todo o Brasil, a Physalis angulata L. é considerada
uma erva daninha nas regiões Norte e Nordeste (SIMAS, 2005; CRUZ, 2009).
Segundo Soares (2009) há vários registros de coletas desta espécie no Rio
Grande do Sul, tais como, nas margens do Rio Uruguai e em áreas de derrubadas,
como no Parque Estadual do Turvo, dentre outras.
20
1.2.4 Dados etnofarmacológicos
A Physalis angulata L. tem grande importância na etnomedicina e com
atividade farmacológica reconhecida. É usada em todo o mundo e largamente
utilizada na medicina popular, principalmente em países como Brasil, Peru,
Suriname e Colômbia. Suas folhas e raízes são amplamente utilizadas na medicina
popular do Nordeste do Brasil (SILVA e AGRA, 2005).
Na medicina popular há a descrição de uso para uma grande variedade de
doenças tais como, hepatite, reumatismo, dermatite, otite, febre, entre outras,
através do uso do uso dos extratos e infusões da Physalis angulata L. (SILVA et al.,
2005a; SOARES et al., 2006). Propriedades sedativa e depurativa também foram
descritas por Lima e colaboradores (2006).
Em Taiwan (Ásia) é uma planta bastante comum e utilizada na medicina
tradicional como antipirético, diurético, antitumoral e analgésico, sendo que esta
última atividade justifica seu uso no tratamento do reumatismo e processos
inflamatórios, como é o caso de uma inflamação de garganta (SIMAS, 2005).
Na América do Sul a infusão das folhas é usada pelos índios da Amazônia
como diurético e tribos da Colômbia usam como desinfectante da pele e
antiinflamatório e consideram que as folhas e frutos possuem atividades narcóticas
(SIMAS, 2005).
As pesquisas científicas relatam o uso desta espécie como potencialmente
anticarcinogênica, mas popularmente é utilizada como anticoagulante,
antiinflamatória, dentre outras indicações medicinais (SOUZA, 2010b), tais como,
antileucêmica, antimutagênica, antiespasmódica, antiséptica, analgésica e no
tratamento do diabetes (SOUZA, 2011).
Esta espécie aparece em relatórios da Organização Mundial de Saúde
(OMS), como uma planta popularmente utilizada para facilitar o parto, tratar
problemas de fertilidade feminina, bem como em casos de febre causados pela
dengue (SIMAS, 2005).
O uso da Physalis angulata L. não é somente terapêutico, produtores e
consumidores possuem grande interesse no plantio e consumo desta planta,
primeiro pelo seu potencial econômico e porque os frutos são ricos em vitaminas A e
C, justificando o seu uso como alimento (CARVALHO, 2010).
21
1.2.5 Constituintes químicos e atividade farmacológica
Muitos dos constituintes químicos da Physalis angulata L. já foram isolados e
identificados. Foram encontrados compostos da classe dos alcalóides, flavonóides
simples e heterosídeos, carotenóides, terpenóides, esteróides e ácidos graxos
(CHECON, 2011), também foram descritos compostos como, campferol, quercetina,
rutina, β-sitosterol, estigmasterol, campestrol, 24-metileno-colesterol, carotenóides e
ácido ascórbico (TOMASSINI, 2000).
A constituição química pode variar conforme a parte da planta estudada,
sendo que foram encontrados alcalóides como a figrinina nas partes áreas e raizes;
aminoácidos como a acetilcolina nos frutos; compostos inorgânicos como o selênio,
cobre e zinco nas folhas frescas; flavonóides heterosídeos como a miricetina 3-O-
neoesperidosídeo (SIMAS, 2005).
Os principais constituintes encontrados na Physalis angulata L. são os
esteróides, que variam também dependendo da parte da planta (Tabela 3) (SIMAS,
2005; BASTOS, 2006).
Tabela 3 – Esteróides encontrados na Physalis angulata L.
Parte da planta Tipo de esteróide
Folhas Vamonolídeo e fisangulídeo
Folhas e galhos Fisagulinas A, B, C, D, F, H, I, J, K
Frutas frescas Fisagulinas E, F e G
Galhos Sitosterol
Planta toda Fisalinas B, D, E, F, G, H, I, J, K e
Fonte: SIMAS, 2005.
A produção destes esteróides ocorre pela capacidade das plantas do gênero
Physalis L. sofrerem oxidação dos átomos de carbono do núcleo esteroidal e da
cadeia lateral, formando assim, metabólitos polioxigenados (Figura 5). Dentre estes
metabólitos, destacam-se os vitaesteróides, que são derivados do metabolismo
secundário do ergostano (SIMAS, 2005).
Os vitaesteróides, isolados da Physalis angulata L., são compostos com
funções oxigenadas, apresentando em sua estrutura molecular açúcares e
halogênios, como por exemplo as fisagulinas C e D encontradas nas folhas e galhos
22
(SIMAS, 2005). Já as fisagulinas E, F e G foram isoladas dos frutos da Physalis
angulata L.(Figura 5) (SHINGU et al., 1992).
Tem sido descrito na literatura atividades farmacológicas para a Physalis
angulata, bem como, de seus principais constituintes químicos, tais como, atividade
calmante e depurativa (PIO CORRÊA, 1978), atividade antiinflamatória e
antinociceptiva (CHOI e HWANG, 2003; VIEIRA et al., 2008; BASTOS et al., 2006;
BASTOS et al., 2008; PINTO et al., 2010), atividade antimicrobiana (PIETRO et al.,
2000; JANUÁRIO et al., 2002; LOPES et al., 2005; SILVA et al., 2005a;
LUSAKIBANZA, 2010), atividade neuromuscular (MELO e AFIATPOUR, 1985),
atividade antitumoral (CHIANG et al., 1992; ISMAIL e ALAM, 2001; SHU et al., 2004;
MAGALHÃES et al., 2006; HSIEH, HUANG e CHUNG, 2006; ALVES et al., 2008;
LEE et al., 2009), atividade imunomodulatória (LIN et al., 1992; SOARES, 2003;
CARVALHO et al., 2008; YU et al., 2010), atividade tripanocida (NAGAFUJI et al.,
2004; VIEIRA, 2008) e atividade antileishimania (GUIMARÃES et al., 2009).
Fisagulina E Fisagulina F Fisagulina G
Figura 5 – Vitaesteróides isolados dos frutos da Physalis angulata L. (adaptado de Shingu et al., 1992).
A atividade antineoplásica e antitumoral ocorre segundo Silva e Agra (2005)
pela presença dos vitaesteróides, como as fisalinas e neofisalinas que estão
presentes na Physalis angulata L. Segundo Lopes e colaboradores (2006) existem
várias revisões da literatura demonstram que algumas espécies do gênero Physalis
são fontes de derivados do ergostano, estas substâncias são responsáveis por
atividades farmacológicas como: atividade imunomodulatória; atividade
antimicrobiana; atividade anticancerígena e atividade moluscicida.
23
Teste de difusão em ágar com o extrato etanólico dos frutos e raízes de
Physalis angulata L. apresentaram atividade antibacteriana contra a bactéria
Staphylococcus aureus (TOMASSI, 2000; LOPES, 2006).
A Physalis angulata L. possui grande importância farmacológica pela
produção de esteróides, além disso, produzem corticosteróides como as fisalinas B,
F e G, que exercem função sobre o sistema imunológico (SOUZA, 2010a). As
fisalinas são compostos secundários produzidos por esta espécie, apresentam
grande valor farmacológico e para a produção de fitofármacos, podendo ser usadas
no tratamento de carcinomas e doenças renais (NUNES, 2010).
Um estudo realizado por Choi e Hwang em 2003, comprovou a atividade
antiinflamatória de um extrato metanólico das flores de Physalis angulata L., que
quando testado em camundongos foi capaz de inibir as inflamações aguda e
subaguda.
O efeito antiinflamatório da fisalina E isolada de Physalis angulata L. foi
avaliado em modelos agudos e crônicos de dermatite induzida em orelhas de
camundongos. Os resultados sugerem que fisalina E pode ser potente e eficaz, por
via tópica, como agente antiinflamatório útil para tratar dermatite inflamatória aguda
e crônica (PINTO, 2010).
O extrato das partes áreas de Physalis angulata L. apresentam atividade
satisfatória, quando testados contra o vírus do Herpes simplex (HSV-1), vírus da
pólio (tipo 1) e da rubéola (SIMAS, 2005).
A atividade das fisalinas purificadas de Physalis angulata L. contra a
leishmaniose cutânea foi comprovada, pois os resultados demonstraram que as
fisalinas B e F foram capazes de reduzir o percentual de macrófagos infectados
com Leishmania. Já, o tratamento tópico com fisalina F reduziu significativamente o
tamanho da lesão, a carga parasitária e as alterações
histopatológicas em camundongos (BALB) infectados com Leishmania amazonensis
(GUIMARÃES, 2009).
A inibição do crescimento de algumas bactérias e fungos pelo óleo essencial
extraído das partes aéreas de Physalis angulata L., mostra a capacidade desta
planta em se tornar um promissor agente antimicrobiano (OSHO et al., 2010).
A atividade antineoplásica das cápsulas do fruto foi comprovada por Ribeiro
e colaboradores em 1992, quando testadas em linfomas de ratos, apresentaram
uma inibição de 97% da massa tumoral.
24
1.2.6 Toxicidade da espécie Physalis angula L.
As plantas do genêro Physalis são consideradas medicinais e tóxicas em
vários países das Américas, África e Ásia, devido à presença de vitaesteróides,
como nicandrenona, vitanolídeo, fisalinas e neofisalinas, e pelos alcalóides
tropânicos e pirrolidínicos, como higrina e tropinona (SILVA e AGRA, 2005).
Segundo Lopes (2006) o extrato de Physalis angulata L. a 25% não
apresentou atividade fototóxica, quando o dorso de cobaias foi exposto à luz
ultravioleta, e não foi observada a formação de eritemas.
O extrato acetônico de Physalis angulata L. foi diluído em água e
administrado em camundongos por via oral, durante 7 dias, e nenhuma morte foi
registrada. Os exames laboratoriais e comportamentais também não demonstraram
alterações significativas (SANTOS, 2005).
25
2 OBJETIVO
Investigar a composição fitoquímica e avaliar as características físicas dos
frutos e físico-química do extrato de Physalis angulata L.
26
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Material botânico
O material vegetal da espécie Physalis angulata L. foi obtido de cultura
orgânica da Fazenda Fiore, localizada na Estrada das Moreiras, s/n, bairro Saboó,
município de São Roque, São Paulo. Todo o material enviado estava devidamente
certificado pela Organização Internacional Agropecuária – OIA, com o número OIA:
00112.
As plantas foram coletadas no período de 03/2011, uma amostra significativa
foi classificada pelo Prof. Jasper José Zanco e depositada no herbário LAELIA
PURPURATA, da Universidade do Sul de Santa Catarina, sob o número SRS 5750
(“voucher”).
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Caracterização física dos frutos
A caracterização física dos frutos foi efetuada em uma amostra de 10 frutos
para cada 100 gramas de frutos, considerando-se as seguintes variáveis: peso (g),
diâmetro longitudinal (mm) e diâmetro transversal (mm).
Segundo Lima (2009) os frutos de Physalis, depois de colhidos, devem ser
classificados conforme a coloração da epiderme, em: 0 = verde; 1 = amarelo-
alaranjado; 2 = laranja-claro; 3 = laranja; 4 = laranja-escuro e 5 = laranja
avermelhado, em que normalmente as três últimas fases são as que apresentam
melhores características físico-químicas. Os frutos com coloração verde, amarelo-
alaranjado e laranja claro não foram utilizados na preparação do extrato.
Frutos em estado de decomposição, com manchas, perfurações ou outras
características que colocassem em dúvida sua qualidade, também foram
descartados, para não influenciar na qualidade do extrato final.
27
3.2.2 Método extrativo
O extrato hidroetanólico foi obtido a partir dos frutos frescos por maceração.
Para a obtenção do extrato é necessária a determinação do resíduo sólido dos frutos
frescos, para isso, deve-se tomar uma amostra de frutos de peso conhecido,
fracioná-los em fragmentos suficientemente reduzidos, deixando-os em estufa à
temperatura entre 100 e 105 °C, até peso constante.
Com o resultado do resíduo sólido, foi calculada a quantidade de líquido que
o fruto fresco contém. O volume do líquido extrator a ser adicionado foi equivalente
ao volume final de extrato a ser obtido subtraído do volume de água contido no
vegetal fresco.
A graduação alcoólica final do líquido extrator deve ser de 60 a 70%, que foi
resultante da mistura alcoólica adicionada com o teor de água contido na fruta.
Para os ensaios fitoquímicos foram preparados um extrato hidroalcoólico e
um aquoso:
A obtenção do extrato hidroalcoólico a 20%(m/v) foi realizada a partir da
maceração de 40 g do material vegetal fresco de Physalis angulata L. (frutos),
em 200 mL de álcool etílico a 70% v/v. O processo extrativo foi efetuado em
banho-maria à 70 °C pelo período de uma hora.
O processo extrativo para a obtenção do extrato aquoso a 20% (m/v)
envolveu a maceração de 40 g do material vegetal fresco de Physalis
angulata L. (frutos) com 200 mL de água destilada em banho-maria a 60 °C,
pelo período de duas horas e com agitação ocasional.
3.2.2.1 Controle de qualidade do álcool
O álcool utilizado no processo extrativo foi adquirido de cultura orgânica da
Native Produtos Orgânicos Comercial Importadora e Exportadora Ltda e produzido
pela CERBA destilaria de álcool Ltda. As duas empresas estão localizadas na
Rodovia Carlos Tonani – Km 97,5 , Sertãozinho, São Paulo. O álcool é certificado
pela ECOCERT Brasil sob o número 1418BR0900Z1p(BR) (ANEXO 1).
O controle de qualidade do álcool foi realizado seguindo a metodologia e as
especificações descritas na tabela 4.
28
Tabela 4 – Ficha de análise físico-química do álcool etílico e especificações de qualidade.
ANÁLISE ESPECIFICAÇÃO
Características
Organolépticas
Aspecto físico: Líquido móvel, límpido, transparente, volátil, inflamável (Farmacopéia Brasileira, 2005).
Cor: Incolor (Farmacopéia Brasileira, 1977).
Odor: Característico (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2005).
Sabor: Ardente (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2005).
Solubilidade Miscível em água, acetona, éter, clorofórmio, benzeno e glicerol (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1977 e 2005).
Acidez Preparou-se um solução 50:50 água/álcool. Adicione-se fenolftaleína e titulou-se com hidróxido de sódio 0,02N até que a cor rósea permanecesse por mais de 30 segundos (USP, 1995; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2005).
Densidade (20/20):
0,8050 a 0,8123 a 20 °C e 0,812 a 0,816 a 15 °C, indicando teor entre 92,3% e 93,8% (p/V) ou entre 94,9% e 96,0% (V/V) de C2H5OH (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2005).
Resíduo por evaporação
Evaporou-se 40mL em uma vidraria tarada em banho-maria, e secou-se a 105 °C por uma hora. O peso do resíduo não excede 1mg (USP, 1995).
Identificação Em 5mL de uma solução aquosa a 10% (V/V) adicionou-se 1mL de hidróxido de sódio M, então lentamente (após 3 minutos) adicionou-se 2mL de iodo 0,1N: o odor de iodofórmio aparece, e um precipitado amarelo se forma dentro de 30 minutos (USP, 1995; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2005).
Sustâncias insolúveis em
água
Dilui-se em igual volume de água, a mistura é limpa e permanece limpa por 30 minutos após resfriamento a 10º (USP, 1995; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2005).
Aldeídos e outras
substâncias orgânicas estranhas
Mediu-se 20mL de álcool em uma proveta com tampa, que tenha sido lavada com ácido clorídrico, rinsada com água e finalmente com álcool a ser testado. Esfriou-se o conteúdo à aproximadamente 15 °C e adicionou-se com uma pipeta 0,1 mL de permanganato de potássio 0,1N anotando exatamente a hora da adição. Misturou-se uma vez, invertendo a proveta, e foi deixado em repouso a 15 °C durante 5 minutos. A cor rosa não deve desaparecer completamente (USP, 1995; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2005).
Constituintes de óleo fúsel
Umedeceu-se um pedaço de papel absorvente, limpo e inodoro, com uma mistura de 10mL de álcool, 5mL de água e 1mL de glicerina e deixou-se evaporar espontaneamente. Nenhum odor estranho é perceptível após os últimos traços de álcool deixado no papel (USP, 1995).
Teor No mínimo, 95,1% (v/v) e, no máximo 96,9% (v/v) de C2H6O (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1977).
29
3.2.3 Caracterização físico-química da tintura
3.2.3.1 Características organolépticas
Foram observados aspectos relacionados à cor, odor e sabor das amostras.
3.2.3.2 Teor alcoólico
O extrato foi colocado em provetas e o teor alcoólico foi determinado por meio
de alcoômetro.
3.2.3.3 Densidade
A análise da densidade aparente foi realizada através do uso de um
picnômetro com capacidade para 10 mL, devidamente calibrado. Previamente
tarado, foi preenchido com água recém destilada e pesado. Após devidamente seco
o picnômetro foi preenchido com o extrato e pesado. A relação entre o peso da
amostra e da água, em um volume fixo, forneceu o valor da densidade aparente da
tintura à média de três determinações independentes (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA, 1988).
3.2.3.4 Resíduos secos
Exatamente 5 mL da extrato foram pipetados e transferidos para cápsulas de
porcelana previamente taradas nas mesmas condições empregadas durante a
análise propriamente dita.
As cápsulas foram levadas à estufa a 105 °C, após resfriarem totalmente em
dessecador, as cápsulas foram pesadas, até peso constante. O resultado do resíduo
seco foi determinado a partir da média de três determinações (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA, 1988).
30
3.2.3.5 pH
A determinação do pH do extrato de Physalis angulata L. foi realizada em
pHmetro previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 e os resultados
corresponderam à média de três determinações independentes (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA, 1988).
3.2.4 Caracterização fitoquímica
A caracterização fitoquímica da espécie Physalis angulata L. foi realizada de
acordo com metodologia descrita por Philippsen (2010) e também por Marcucci
(2010). A identificação qualitativa dos grupamentos químicos foi realizada somente
nos frutos da Physalis angulata L.
3.2.4.1 Pesquisa de alcalóides
Para a realização deste ensaio utilizaram-se 50 mL do extrato hidroalcoólico,
que foi evaporado à secura, em banho-maria a 70 °C. O resíduo resultante foi,
então, dissolvido em 1 mL de etanol, fazendo-se na sequência a adição de 20 mL de
ácido clorídrico a 1%.
A solução obtida foi particionada em 5 tubos de ensaio em porções de 1 mL,
tendo como objetivo a pesquisa de alcalóides com os seguintes reativos:
Reativo de Mayer: reação positiva consiste na formação de precipitado
branco ou turvação branca.
Reativo de Dragendorff: reação positiva é indicada pela formação de
precipitado cor vermelho-tijolo.
Reativo de Bouchardat: reação positiva é indicada pela formação de
precipitado alaranjado.
Reativo de Bertrand: a formação de precipitado branco ou turvação branca
indica reação positiva.
31
3.2.4.2 Pesquisa de leucoantocianidinas
Para a realização deste método, foram transferidos para um béquer 10 mL do
extrato hidroalcoólico. A este foram adicionadas 5 gotas de ácido clorídrico
concentrado e, em seguida, levou-se à ebulição. A positividade da reação para a
presença de leucoantocianidinas foi evidenciada pelo aparecimento de coloração
vermelha.
3.2.4.3 Pesquisa de flavonóides
O ensaio para a identificação de heterosídeos flavônicos, foi realizado com a
transferência de 5 mL do extrato hidroalcoólico para um tubo de ensaio com a
adição consecutiva de 200 mg de limalha de magnésio e 1 mL de ácido clorídrico
fumegante pelas paredes do recipiente. A interpretação dos resultados decorre do
desenvolvimento de diferentes colorações. Neste sentido, a formação de cor laranja
indica a presença de flavonas, a violácea indica a presença de flavanonas e a
vermelha indica a presença de flavonóis.
3.2.4.4 Pesquisa de cumarinas
Em um cápsula de porcelana foram adicionado 30 mL do extrato
hidroalcoólico, em seguida foi acidificado com ácido clorídrico 2N até pH 1. O
volume foi concentrado em banho-maria até 5 mL. A alíquota resultante foi então
passada para um funil de separação e efetuou-se a extração com duas vezes de 10
mL de éter etílico. O volume obtido foi concentrado novamente em banho-maria até
5 mL.
A partir do extrato etéreo obtido, foram transferidos 3 mL para um tubo de
ensaio e a este foram adicionados 2 mL de hidróxido de sódio 1N. O recipiente foi
levado à câmara de luz ultravioleta a 366 nm por um período de 15 minutos.
A positividade da reação decorre da formação de fluorescência de coloração
azul ou verde-amarelada.
32
3.2.4.5 Pesquisa de heterosídeos antraquinônicos
O teste foi iniciado com a adição de 30 mL do extrato hidroalcoólico e 5 mL de
solução aquosa de ácido sulfúrico a 10 % em um balão de fundo chato com
capacidade para 250 mL. O balão foi acoplado a um condensador, no qual ficou em
refluxo por 30 minutos. O volume retirado do condensador foi filtrado ainda quente
em papel de filtro. Ao filtrado, fez-se a adição de 30 mL de água destilada e, o
conteúdo foi transferido para um funil de separação para realizar a extração com
duas alíquotas de 10 mL de éter etílico.
O extrato etéreo resultante foi concentrado em banho-maria até 5 mL e,
posteriormente, foram transferidos para um tubo de ensaio onde foi realizada a
reação de Borntraeger, efetuando-se a adição de 5 mL de solução de hidróxido de
amônio e agitando-se lentamente.
O desenvolvimento de coloração vermelha na solução alcalina evidencia
reação positiva para a presença de naftoquinonas e/ou antraquinonas.
3.2.4.6 Pesquisa de esteróides e/ou triterpenos
A 2,0mL do extrato etanólico, adicionaram-se 5,0mL de clorofórmio, filtrou-se,
dividiu-se o filtrado em duas porções. Em cada um dos tubos realizaram-se as
reações de Liebermann- Burchard, que consiste na adição lenta de 1 mL de anidrido
acético e 2 mL de ácido sulfúrico. Os triterpenos desenvolvem coloração estável e
os esteróides desenvolvem coloração mutável com o tempo.
A reação de Keller Kiliani foi realizada para identificar a presença de
esteróides e triterpenos. A reação foi feita a partir da transferência de 2 mL do
extrato clorofórmico para um tubo de ensaio e, levou-se o mesmo à secura em
banho-maria. Ao resíduo foram adicionados 2 mL de ácido acético glacial e 0,2 mL
de cloreto férrico a 1%. A mistura foi cuidadosamente transferida para um tubo de
ensaio contendo 2 mL de ácido sulfúrico concentrado.
A positividade da reação de Keller Kiliani foi observada pelo desenvolvimento
de coloração na zona de contato dos sistemas líquidos e/ou coloração na fase
acética, sendo que, a tonalidade azul é sugestiva para esteroides e tonalidade verde
para triterpenos.
33
3.2.4.7 Pesquisa de heterosídeos antociânicos
Foi realizada a adição inicial de porções de 5 mL do extrato aquoso em três
tubos de ensaio. Ao primeiro tubo foi adicionado ácido sulfúrico 1N até pH 1; ao
segundo, foi acrescentado hidróxido de sódio até pH 10; no terceiro tubo efetuou-se
o ajuste para neutralização do meio (pH=7). A detecção de diferentes colorações
são indicadores da presença de heterosídeos antociânicos.
3.2.4.8 Pesquisa de heterosídeos saponínicos
Para a obtenção dos dados deste teste foram utilizados 5 mL do extrato
aquoso em um tubo de ensaio, este foi energicamente agitado por 15 segundos,
após, os mesmos foram deixados em repouso por 15 minutos. Transcorrido o tempo,
fez-se a medida da espuma formada, em centímetros. A ocorrência de espuma com
característica persistente, maior ou igual a um centímetro indica a presença de
heterosídeos saponínicos.
3.2.4.9 Pesquisa de taninos
A pesquisa de taninos foi realiza a partir da reação com cloreto férrico a 1% e
precipitação com solução de gelatina a 2,5%.
Na reação com cloreto férrico a 1% foram adicionados 1 mL do extrato
aquoso em um tubo de ensaio e 5 gotas de solução aquosa de cloreto férrico a 1%.
O desenvolvimento de coloração azul é indicativo de reação positiva para taninos
hidrolisáveis, verde para taninos condensados e marrom para polifenóis.
Na reação de precipitação com solução de gelatina a 2,5%, em 1 tubo de
ensaio foram adicionados 2,0 mL do extrato aquoso e 2 mL de solução aquosa de
gelatina a 2,5%. A reação é considerada positiva se ocorrer desenvolvimento de
precipitado.
34
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 CARACTERIZAÇÕES FÍSICA DOS FRUTOS
A amostra inicial de frutos Physalis angulata foi de um quilograma (1 Kg), de
onde foram retiradas 6 amostras aleatoriamente, contendo 10 frutos cada. Desta
amostragem os frutos que apresentaram alguma característica que colocassem em
dúvida sua qualidade (frutos podres, com fungo, perfurados) ou que apresentassem
coloração da epiderme, verde e amarelo-alaranjado foram retirados da amostra. A
Tabela 5 e a Figura 6 demonstram os resultados obtidos quanto a este parâmetro
físico de qualidade das frutas.
Tabela 5 – Resultados dos parâmetros físicos de qualidade dos frutos de Physalis angulata L.
Amostras (número de frutos)
1 2 3 4 5 6
Aprovados 10 8 9 10 10 10
Rejeitados 0 2 1 0 0 0
Os frutos retirados tem pequena representatividade na amostra total, porém
poderiam interferir na qualidade final do extrato, como demonstrado por Lima (2009).
Dentre os 60 frutos analisados, foram retirados 3 (5% da amostra total) que
apresentavam coloração verde a amarelo-claro.
Figura 6 – Fotos dos frutos de Physalis angulata L.. Amostra dos frutos aprovados(A) e rejeitados(B) a partir dos parâmetros físicos de qualidade. Fonte: Acervo do autor.
A B
35
Outra característica que demonstra a qualidade final do fruto é a medida do
peso e diâmetro longitudinal (mm) e do diâmetro transversal (mm). Os resultados
estão expressos na Tabela 6 e ilustrados na Figura 7.
Segundo Freitas e colaboradores (2003), variando os tipos de solos para a
produção de Physalis angulata L. os frutos apresentaram um peso médio de 3,825 g
e diâmetros longitudinal e transversal de 10,675 e 10,375 mm, respectivamente.
Quando comparado aos resultados médios das amostras, os mesmos não
apresentaram diferenças significativas.
Tabela 6 – Resultados das medidas dos frutos de Physalis angulata L.
Amostras (número de frutos)
1 2 3 4 5 6
Medida Longitudinal (mm) 9,983 9,852 9,666 9,938 9,500 9,421
Medida transversal (mm) 9,673 9,578 9,358 9,612 9,213 9,215
Peso (g) 3,496 3,452 3,445 3,411 3,496 3,489
Figura 7 – Fotos dos frutos de Physalis angulata sendo avaliados quanto ao peso e diâmetro. Fonte: Acervo do autor.
36
4.2 MÉTODOS EXTRATIVOS
4.2.1 Controle de qualidade do álcool
Todas as análises apresentaram conformidade e resultados estão dentro dos
especificados, como demonstrados na Tabela 7.
Tabela 7 – Resultados para o controle de qualidade do álcool etílico.
ANÁLISE Resultado
Características Organolépticas: aspecto físico, cor, odor e sabor
Conforme
Solubilidade Conforme
Testado para água, acetona e éter
Acidez Conforme
0,8mL de hidróxido de sódio.
Densidade (20/20): Conforme - 0,815g/mL a 16ºC
Resíduo por evaporação Conforme
Identificação Conforme
Odor característico e formação de precipitado
Sustâncias insolúveis em água Conforme
Aldeídos e outras substâncias orgânicas estranhas
Conforme
Permanência de coloração rosa.
Constituintes de óleo fúsel Conforme - Nenhum odor estranho
Teor Conforme - 96,5%
4.2.2 Caracterização físico-química da tintura
4.2.2.1 Características organolépticas
A técnica utilizada para o processo extrativo dos frutos de Physalis angulata
L. foi adaptada da técnica de produção de tinturas mãe, para plantas frescas da
Farmacopéia Brasileira Homeopática, que leva em conta o teor de água na planta.
Do ponto de vista organoléptico a tintura apresentou um aspecto
transparente, sem presença de partículas nem separação de capas de cor amarela e
37
odor característico da droga vegetal. Os valores de teor alcoólico, pH, densidade
aparente e resíduo seco da tintura de Physalis estão descritos na Tabela 8.
Tabela 8 – Determinação do teor alcoólico, pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura de Physalis angulata L.
Testes Leitura das amostras (n=3) Média (%) Desvio Padrão
Teor alcoólico 66 67 66 66,33 0,8703
pH 5,61 5,67 5,72 5,695 0,6208
Densidade(g/mL) 0,916 0,902 0,923 0,9125 0,0148
Resíduo seco(g) 0,2361 0,2356 0,2351 0,2356 0,1714
Do ponto de vista físico-químico a adaptação do método extrativo apresentou
resultados aceitáveis para o teor de extrativos (4,71%).
4.3 CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA
A caracterização dos constituintes químicos relevantes para identificação de
drogas vegetais faz parte da avaliação da matéria-prima empregada. Os testes
fitoquímicos indicaram a presença das seguintes classes químicas na tintura:
flavonóides, saponinas, taninos, antraquinonas e esteróides, como demonstrados na
Tabela 9.
Na reação de Borntraeger, com a adição de solução de hidróxido de amônio
ocorreu inicialmente o desenvolvimento de coloração vermelha na solução,
evidenciando reação positiva para a presença de naftoquinonas e/ou antraquinonas.
Porém, esta coloração não foi persistente e manteve-se no tubo de ensaio uma
coloração rosa.
No ensaio para a identificação de heterosídeos flavônicos, após a adição de
limalha de magnésio e do ácido clorídrico fumegante, o resultado foi a observação
de uma coloração laranja de baixa intensidade. Com a formação desta cor laranja,
pode-se sugerir a presença de flavonas no extrato dos frutos de Physalis angulata L.
O extrato hidroalcoólico após as reações características para a identificação
de cumarinas e exposição à luz ultravioleta, apresentou uma coloração verde-
amarela fluorescente, indicando a presença de cumarina no extrato.
38
A pesquisa de esteróides e ou triterpenos foi realizada pela reação de
Liebermann-Burchard, onde ocorreu a formação coloração verde, porém não
persistente, sugerindo a presença de esteróides. Para confirmação do resultado foi
realizada a reação de Keller Kiliani, onde observou-se na zona de contato dos
sistemas líquidos e na fase acética a coloração azul, que confirma a presença de
esteróides no extrato de Physalis angulata L..
A pesquisa de taninos foi realiza a partir da reação com cloreto férrico a 1% e
precipitação com solução de gelatina a 2,5%. Na reação com cloreto férrico a 1%
ocorreu modificação de coloração para um tom de verde, mas a detecção foi de
baixa intensidade. Já para a reação de precipitação com solução de gelatina a 2,5%,
ocorreu o desenvolvimento de precipitado branco em grande quantidade no fundo do
tubo de ensaio.
A pesquisa de saponinas demonstrou a presença de espuma persistente,
porém não maior que um centímetro como determinado pela Farmacopéia Brasileira.
Tabela 9 – Prospecção fitoquímica do extrato aquoso e hidroalcoólico dos frutos de Physalis angulata L.
Classe fitoquímica Resultado
Alcalóides -
Antocianidinas -
Antraquinonas +
Cumarinas +
Esteróides e ou triterpenos ++
Flavonóides ++
Leucoantocianidinas -
Saponinas -
Taninos +++
+, baixa visualização; ++, moderada visualização; +++, alta visualização; -, não detectado
O gênero Physalis possui em sua composição química carotenóides,
cumarinas, saponinas, flavonóides, taninos e fitoesteróides, bem como bons teores
de vitaminas A e C, como demonstrado na revisão de literatura. Os resultados
obtidos com a caracterização fitoquímica dos frutos de Physalis angulata L. são
condizentes com os trabalhos encontrados na literatura.
39
5 CONCLUSÕES PARCIAIS
A caracterização física dos frutos é necessária para a obtenção de um extrato
de qualidade. Existem poucas descrições físicas existentes para o fruto da Physalis
angulata L.. Os dados obtidos no presente trabalho podem contribuir para uma
melhor avaliação dos frutos vendidos no mercado nacional, seja para o uso em
cosméticos, medicamentos e na alimentação.
O método de extração adaptado da Farmacopéia Homeopática demonstrou
bons resultados a partir da análise do teor de extrativos. O método pode ser utilizado
para a produção de tinturas para aplicação cosmética.
Os resultados obtidos com o estudo fitoquímico estão de acordo com histórico
de constituição química do gênero, ressaltando a presença de flavonóides e taninos
o que provavelmente justifica a ação antiinflamatória e anti-séptica descrita na
literatura para a Physalis angulata L.
40
PARTE 2 - VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE
FLAVONÓIDES TOTAIS EXPRESSOS EM QUERCETINA NO EXTRATO
ETANÓLICO DE Physalis angulata L.
6 REVISÃO DA LITERATURA
6.1VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA
A validação de um método analítico consiste no processo de avaliação da
eficiência de um método na rotina do laboratório e tem como objetivo demonstrar
que o método analítico é adequado ao seu propósito. Um método só é considerado
validado quando apresenta as mesmas características dos pré-requisitos
estabelecidos (BRITO et al., 2003).
O desenvolvimento de novas técnicas analíticas, a adaptação de técnicas já
validadas e ou o uso de novos equipamentos, levam ao processo de validação
(BRITO et al., 2003).
Validação é considerado um termo não-específico, existem vários conceitos
descritos na literatura, tais como os descritos por Ribani e colaboradores (2004) e
Moraes (2011):
“A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados” (BRASIL, 2003).
“Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o
método sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que
a aplicação requer” (EURACHEM WORKING GROUP, 1998).
“Validação é a confirmação por testes e apresentação de evidências objetivas de
que determinados requisitos são preenchidos para um dado uso intencional”
(ISO/IEC 17025, 1999).
“A validação de métodos assegura sua credibilidade durante seu uso rotineiro,
sendo algumas vezes mencionado como o processo que fornece uma evidência
documentada de que os métodos realizam aquilo para o qual são indicados para
fazer” (USP, 2003).
41
“Avaliação sistemática de um procedimento analítico para demonstrar que está
sob as condições nas quais deve ser aplicado” (WHO, 1992).
Metodologias analíticas desenvolvidas e que não estejam descritas em
farmacopéias ou formulários oficiais, serão validadas, desde que sejam avaliados
parâmetros como: especificidade/seletividade, função da resposta (gráfico analítico),
intervalo de trabalho, linearidade, sensibilidade, exatidão, precisão (repetitividade,
precisão intermediária e reprodutividade), limite de detecção, limite de quantificação
e robustez (BRASIL, 2003; BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004; MORAES,
2011). Estes termos são conhecidos como parâmetros de desempenho analítico,
características de desempenho e figuras analíticas de mérito (RIBANI et al., 2004).
O Guia para validação de métodos analíticos e bionalíticos, descreve que
para cada tipo de metodologia analítica desenvolvida, exige um conjunto de
parâmetros necessários para a validação do método (BRASIL, 2003). Nos testes
quantitativos para a determinação da substância ativa em produtos farmacêuticos ou
matérias-primas, os parâmetros necessários são: especificidade, linearidade,
intervalo, precisão (repetitividade), exatidão e robustez. Se houver comprovação da
reprodutibilidade não é necessária a comprovação da precisão intermediária
(BRASIL, 2003; BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004; MORAES, 2011).
Nos testes quantitativos para a determinação de impurezas e produtos de
degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas, os parâmetros
necessários são: especificidade, linearidade, intervalo, precisão (repetitividade),
limite de quantificação, exatidão e robustez. Se houver comprovação da
reprodutibilidade não é necessária a comprovação da Precisão Intermediária
(BRASIL, 2003; BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004; MORAES, 2011).
Nos testes de ensaio de limite para a determinação de impurezas e produtos
de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas, os parâmetros
necessários são: especificidade, limite de detecção e robustez. Os parâmetros
intervalo e exatidão podem ser necessários, dependendo da natureza do teste
específico (BRASIL, 2003; BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004; MORAES,
2011).Nos testes de identificação o parâmetro necessário é o de especificidade
(BRASIL, 2003; BRITO et al., 2003; RIBANI, 2004; MORAES, 2011).
42
6.1.1Seletividade e especificidade
A seletividade deve ser o primeiro passo no desenvolvimento e validação de
um método analítico, e uma das formas de determinar a seletividade é avaliar o
extrato inicial sem adição da substância de interesse e o extrato com a adição da
substância de interesse (padrão) (RIBANI et al., 2004).
Os termos seletividade e especificidade têm sido utilizados como sinônimos,
para evitar confusões a IUPAC (“International Union of Pure and Applied Chemistry”)
sugere o uso do termo seletividade, já que métodos cromatográficos produzem
respostas a vários compostos químicos e não para uma única substância, são
seletivos e não específicos (RIBANI et al., 2004; MORAES, 2011).
A seletividade em um método é a capacidade de medir exatamente um
composto na presença de outros componentes que formam o extrato vegetal
(matriz) (BRASIL, 2003).
6.1.2 Linearidade
É a capacidade de um método analítico em fornecer resultados diretamente
proporcionais à concentração da substância em análise, dentro de uma determinada
faixa de aplicação (BRASIL, 2003; USP, 2003; RIBANI et al., 2004).
A linearidade de um método é obtida pela padronização interna ou externa e
formulada como expressão matemática (MORAES, 2011), conhecida como
regressão linear (RIBANI et al., 2004).
A estimativa dos coeficientes de regressão a e b de uma curva analítica
podem ser calculadas a partir de um conjunto de medições experimentais, bem
como o coeficiente de correlação r (RIBANI et al., 2004).
A equação da reta relaciona os coeficientes de regressão (BRITO et al., 2003
e RIBANI et al., 2004):
y = ax + b
y = resposta medida (absorbância, altura ou área do pico, etc.); x = concentração; a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade; b = interseção com o eixo y, quando x = 0.
43
Segundo Moraes (2011) a linearidade de um método analítico pode ser
visualizada a partir do gráfico de obtenção da equação da reta ou calculada a partir
da equação da regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados.
6.1.3 Precisão
Consiste na análise da proximidade dos resultados obtidos com várias
medidas, com amostragem múltipla de uma mesma amostra (BRASIL, 2003). Esta
proximidade entre as várias medidas e a sua avaliação é a precisão do método
analítico, e pode ser expressa como o desvio padrão, variância ou coeficiente de
variação (BRITO et al., 2003).
A precisão de um método analítico pode ser obtida através de dois meios, a
reprodutibilidade e a repetitividade, e seus dados expressos pelo desvio padrão
(INMETRO, 2007).
A precisão pode ser considerada em três níveis (BRASIL, 2003):
Repetibilidade (precisão intra-corrida): proximidade dos resultados em um curto
período de tempo e com o mesmo analista, com no mínimo de 6 determinações a
100% da concentração do teste.
Precisão intermediária (precisão inter-corridas): proximidade dos resultados no
mesmo laboratório em dias diferentes e com analistas diferentes e ou
equipamentos diferentes.
Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): proximidade dos resultados em
laboratórios diferentes. Este tipo de estudo é realizado para inclusão de
metodologia em farmacopéias.
A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR), segundo a
fórmula a seguir, em que, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média
determinada.
44
O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia
empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do
método, não se admitindo valores superiores a 5% (BRASIL, 2003).
6.1.4 Exatidão
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos
pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro (BRASIL, 2003) e constituem
o propósito da validação. Esta pode ser determinada, baseando-se em quatro
principais processos de estudo: materiais de referência certificados, comparação de
métodos, ensaios de recuperação na matriz e ensaios com adição de padrão
(BRITO et al., 2003; RIBANI et al., 2004).
Independente do processo escolhido para determinar a exatidão do método, o
resultado será expresso pela média (MORAES, 2011). O resultado da exatidão de
um método pode ser expresso também pela quantidade (%) recuperada de um
padrão que foi adicionado a amostra, ou pela diferença percentual entre as médias e
o valor verdadeiro, mais o intervalo de confiança (BRASIL, 2003).
A forma mais usual de expressão da exatidão é a relação entre a
concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica,
obtida a partir da linearidade do método (BRASIL, 2003).
O número de ensaios para determinação da exatidão pode variar segundo a
legislação ou diretriz adotada (RIBANI, 2004). A Agência Nacional de Vigilância
Sanitária determina que o ensaio seja realizado em triplicata e para três níveis de
concentração (BRASIL, 2003).
6.1.5 Robustez
Existem várias definições de robustez descritas na literatura, tais como:
A robustez do método é a medida da sua capacidade de permanecer inalterado
sob pequenas, mas estudadas variações nos parâmetros do método e prover
indicação da sua dependência durante o uso normal (BRITO, 2003)
45
A robustez de um método mede a sensibilidade que este apresenta face a
pequenas variações (INMETRO, 2003).
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a
pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua
confiança durante o uso normal (BRASIL, 2003).
A robustez de um método espectrofotométrico pode ser determinada pela
variação do pH da solução, temperatura e diferentes fabricantes de solventes
(BRASIL, 2003).
A avaliação da robustez serve para mostrar quais fatores influenciam
significativamente na resposta do método estudado. Os resultados obtidos com o
teste de robustez demonstram a capacidade que um método tem de ser repetido em
diferentes condições ou até mesmo em outros laboratórios (BRITO et al., 2003).
A análise estatística da robustez de um método pode ser medida aplicando o
teste t (student) com um nível de confiança de 95%. O método que não apresentar
diferença estatisticamente significativa a este nível de confiança é considerado
robusto (MORAES, 2011).
6.2 FLAVONÓIDES TOTAIS
Os flavonóides representam um sistema de defesa nas plantas pela
capacidade de absorverem radiação ultravioleta (UV). Quando utilizados em
humanos também desempenham um importante papel, como ação antioxidante,
atuando na diminuição da peroxidação lipídica (MARCUCCI et al., 1998).
A classificação química dos flavonóides é baseada no núcleo que consiste de
dois anéis fenólicos e um anel central (Figura 8) (MARCUCCI et al., 1998; HUBER e
RODRIGUEZ-AMAYA, 2008).
Os flavonóides são metabólitos secundários derivados da via do ácido
chiquímico, produzidos a partir de derivados da fenilalanina (HUBER e
RODRIGUEZ-AMAYA, 2008), que sofre várias modificações químicas, como, adição
ou redução, hidroxilação, metilação, dimerização e glicosação. De acordo com o
processo de formação os flavonóides podem ser classificados em 10 classes de
compostos (POZZI, 2007).
46
Figura 8 – Estrutura química base de um flavonóide. Fonte: HUBER e RODRIGUEZ-AMAYA, 2008.
A identificação química de um flavonóide ocorre de acordo com a
conformação química, se ocorre ou não a presença de um anel central, de uma
dupla ligação no anel e de um grupamento hidroxila a ele ligado (MARCUCCI et al.,
1998). São mais de 6000 diferentes flavonóides já identificados quimicamente e
descritos na literatura, sendo as principais classes os flavonóis, flavonas,
catequinas, antocianinas, isoflavonas, diidroflanonóis e chalconas (Figura 9)
(MACHADO, 2008).
Flavona Isoflavona Flavonóis
Antocianidina Chalcona Catequina
Figura 9 – Algumas classes de flavonóides Fonte: MACHADO, 2008; HUBER e RODRIGUEZ-AMAYA, 2008.
47
Os flavonóides se destacam por suas ações terapêuticas, já demonstradas
experimentalmente e em humanos. O uso de fitoterápicos que contém flavonóides
em sua composição tem várias atividades farmacológicas descritas (MACHADO,
2008), tais como: repositor hormonal (PINTO, 2009), antimicrobiano (ZERAIK et al.,
2010), antiviral (ZERAIK et al., 2010), antiulcerogênico (ZERAIK et al., 2010),
antineoplásico (BECHO et al., 2009), antioxidante (MARCUCCI et al., 1998; BECHO
et al., 2009), protetor hepático (MACHADO, 2008), anti-hipertensivo (SILVA et al.,
2002; SILVA et al., 2005b), hipolipidêmico (MARCUCCI et al., 1998; SILVA et al.,
2001; SILVA et al., 2002; OLIVEIRA, 2010), antiinflamatório (SILVA et al., 2002;
COUTINHO et al., 2009) e anti agregante plaquetário (OLIVEIRA, 2010).
6.2.1 Espectrofotometria
A identificação e quantificação de flavonóides em plantas medicinais estão
sendo bastante investigadas, o que justifica isso, é o número de ações
farmacológicas ligadas a esta classe de compostos. Segundo Marcucci e
colaboradores (2008) o método mais preciso e exato para identificar e quantificar
flavonóides é a cromatografia líquida de alta eficiência. Porém a espectrofometria na
região do UV-VIS é uma alternativa mais barata e permite a análise sequencial de
várias amostras.
A determinação de flavonóides em plantas pelo método de espectrofotometria
no UV-VIS é descrita nas Farmacopéias Francesa, Européia e Brasileira, como o
método de escolha (CHABARIBERI et al., 2009).
A aplicabilidade da espectrofotometria na região do UV-VIS ocorre pela
capacidade dos flavonóides absorverem a luz no comprimento de onda de 350nm,
devido à presença de ligações duplas conjugadas com os anéis aromáticos
(GAITEN et al., 2000).
A identificação e quantificação de flavonóides por espectrofotometria no UV-
VIS pode ser realizada através do uso de reagentes como o AlCl3, H3BO3, AcONa e
NaOMe. Os grupamentos oxigenados dos flavonóides formam complexos que
geram um deslocamento batocrômico no espectro UV-VIS (POZZI, 2007).
48
A determinação de flavonóides totais expressos em quercetina é realizada
através do uso de uma solução metanólica de cloreto de alumínio (2%) e a leitura
em espectrofotômetro é realizada a 425nm (MARCUCCI et al., 1998).
O alumínio forma complexos estáveis com os flavonóides (Al+3-flavonóide),
pois nos flavonóides há três possíveis sítios quelantes: grupos 3-OH, 5-OH e 3’, 4’-o-
diOH, este tipo de complexação ocorre em soluções neutras (Figura 10) (POZZI,
2007).
Figura 10 - Formação do complexo Al+2-flavonóide. Fonte: MARCUCCI et al., 1998
49
7 OBJETIVO
Desenvolver e validar um método espectrofotométrico para a quantificação de
flavonóides totais expressos em quercetina na Physalis angulata L.
50
8 MATERIAIS E MÉTODOS
8.1 MATERIAIS
Foram utilizados no desenvolvimento da metodologia analítica os seguintes
reagentes e equipamentos:
Metanol – Merck, 95%, lote: 1009831000, validade: 31/01/2012.
Etanol – CERBA, lote: AEHN ORG. 027010, validade: 27/09/2012
Cloreto de Alumínio – ECIBRA, lote: 25648, validade: 15/05/2013.
Quercetina SIGMA, lote: 90K1746, validade: 31/01/2013.
Extrato de Physalis angulata L. 20mg/mL, lote: 01, validade: 20/04/2012.
Balões volumétricos de 10, 25, 50 e 100mL.
Tubos de ensaio.
Estante metálica para tubo de ensaio
Micropipeta automática com capacidade de 10 a 100µL.
Termômetro de vidro 0-100ºC.
Espectrofotometro UV-Vis, Modelo 1-7200 No. de série: 475.
Balança analítica, Marca OHAUS.
8.2 MÉTODOS
8.2.1 Obtenção do extrato de Physalis angula L.
A solução estoque de Physalis angulata L. foi preparada por processo de
maceração durante 15 dias, a proporção droga vegetal/solvente (água/álcool 70%)
foi de 30%. Após maceração a solução foi filtrada e armazenada em vidro âmbar, ao
abrigo da luz.
A solução estoque foi diluída para ficar com uma concentração de 20mg/mL,
para isso foram utilizados balões volumétricos de 25 e 50mL e álcool etílico e
metílico, gerando duas soluções da Physalis angulata L. que foram posteriormente
testadas. Após a diluição as soluções foram filtradas e guardadas em vidro âmbar.
51
8.2.2 Obtenção da curva analítica da quercetina
Para determinação da faixa de linearidade utilizada na quantificação da
quercetina foi realizada uma curva de calibração contemplando 8 pontos de
referência. Foi preparada uma solução estoque de cloreto de alumínio em metanol
a 2%, bem como uma solução estoque de quercetina em metanol a 1mg/mL.
A partir da solução de quercetina (1mg/mL) foram realizadas as diluições para
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10µg/mL, que contemplam os 8 pontos da curva de calibração.
As soluções para a curva foram preparadas em 8 balões volumétricos de
10mL, com aproximadamente 5 mL de metanol, foram acrescentados os volumes da
solução de quercetina (1mg/mL) e do Cloreto de Alumínio (2%), conforme descritos
na Tabela 10:
Tabela 10 – Volumes de quercetina e cloreto de alumínio para preparo das soluções nas concentrações de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10µg/mL de quercetina.
Balão nº Quantidade de Quercetina Cloreto de Alumínio
1 30 µL 200 µL
2 40 µL 200 µL
3 50 µL 200 µL
4 60 µL 200 µL
5 70 µL 200 µL
6 80 µL 200 µL
7 90 µL 200 µL
8 100 µL 200 µL
Após a adição dos volumes aos balões, estes foram completados até o
volume de 10 mL com metanol. Foram homogeneizados e deixados por 30 minutos
em banho de gelo, com temperatura controla a 20ºC. Após decorrido o tempo foram
realizadas as leituras de cada amostra por 6 vezes. Utilizou-se metanol como branco
e para a realização das leituras foi utilizado o Espectro UV-Vis, Modelo 1-7200,
onde, este foi ligado 30 minutos antes do uso, e seu “setup” foi configurado para o
comprimento de onda de 425nm. O equipamento foi zerado com a solução branco
(metanol) e após foram realizadas as leituras das amostras.
Após construção do gráfico da concentração versus a média das leituras, foi
calculado o coeficiente angular e linear da reta, bem como o coeficiente de
correlação dos pontos.
52
Os critérios de aceitação dos resultados foram de no mínimo 0,990 para o
coeficiente de correlação (r), máximo de 2,0% para o coeficiente linear da reta (b) e
máximo de 2,0% para o desvio padrão relativo entre as replicatas analisadas.
A medida de linearidade do método foi avaliada utilizando o método de
regressão linear dos mínimos quadrados. A partir da calibração dos balões
volumétricos utilizados, foi calculada a concentração real, a média e o desvio
padrão. Todos os dados foram calculados utilizando o programa Microsoft Office
Excel 2007.
8.2.3 Precisão
A precisão do método foi determinada pelo ensaio de repetitividade intradia
(repetibilidade) e interdia (precisão intermediária).
Para isso foram analisadas 6 amostras do extrato de Physalis angulata L. em
um mesmo dia por um único analista, obtendo-se assim os resultados de
repetibilidade. Os resultados da análise interdia foram obtidos através da análise de
seis amostras por 2 analistas e em dias alternados.
O preparo das soluções foi realizado da seguinte forma: foram utilizados 6
balões volumétricos de 10mL, a cada um foram adicionados aproximadamente 5 mL
do extrato de Physalis (20mg/mL) e 200 µL de solução cloreto de alumínio (2%).
O volume do balão foi completado para 10 mL com o extrato de Physalis
(20mg/mL). As misturas foram homogeneizadas e deixadas por 30 minutos em
banho de gelo (20ºC). A leitura da absorbância foi realizada em UV-Vis por seis
vezes para cada amostra. Na precisão intradia o desvio padrão relativo não pode ser
maior que 5%. Para a precisão interdia a diferença das médias das análises intradia
para o interdia não podem ser superior a 5%.
8.2.5 Seletividade
A seletividade foi avaliada pela adição de padrão analítico a amostra de
extrato analisado, sendo esta uma técnica muito empregada em análises por
espectrometria de absorção (BRITO, 2003).
53
Para realizar as análises foram preparadas as seguintes soluções:
Amostra do extrato: em um balão volumétrico de 10 mL foram colocados
aproximadamente 5 mL do extrato de Physalis 15% e 200 µL de cloreto de
alumínio (2%) e completado o volume de 10mL com o extrato. Deixou-se por 30
minutos em banho de gelo (20 ºC) antes de efetuar a leitura em espectrofotômetro
no comprimento de onda de 425nm.
Amostra do extrato sem cloreto de alumínio: em um balão volumétrico de 10 mL
foi colocado o extrato de Physalis 15%. Deixar por 30 minutos em banho de gelo
(20ºC) antes de ser efetuada a leitura em espectrofotômetro no comprimento de
onda de 425nm.
Amostra do extrato + Padrão de quercetina: em um balão volumétrico de 10 mL
foram colocados 5 mL do extrato de Physalis e 200 µL de cloreto de alumínio
(2%). Foram adicionados mais 40 µL da solução padrão de quercetina (1mg/mL) e
completado o volume de 10mL do balão com o extrato. Esta mistura permaneceu
por 30 minutos em banho de gelo (20ºC) antes de efetuar a leitura em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 425nm.
O critério para avaliar a seletividade do método foi: o desvio padrão relativo
(DPR) entre as leituras, do padrão, amostra e amostra mais o padrão, não devem
ser maior que 2,0%.
8.2.4 Exatidão
A exatidão do método foi determinada pela média percentual de recuperação
do método, a partir da adição do padrão quercetina na amostra.
As soluções para análise foram preparadas conforme descritas no item 8.2.3
(Seletividade). Todas as amostras foram deixadas por 30 minutos em banho de gelo
(20ºC) antes de efetuar a leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de
425nm. As leituras iniciaram pelas soluções de concentração mais baixa e
terminaram com a solução de concentração mais alta.
Os resultados foram expressos a partir da média, mais o desvio padrão
relativo, dos teores obtidos de cada concentração analisada. Foi feita seis leituras de
absorbância.
54
A taxa de recuperação foi calculada a partir da seguinte fórmula:
Os critérios de aceitação para a exatidão do método foi de 70 a 120%
conforme descrito por Pozzi (2007).
8.2.5 Robustez
A medida de robustez do método foi realizada através da alteração de alguns
parâmetros operacionais do método.
As alterações realizadas foram: mudança de temperatura do banho de
incubação das amostras, 15 ºC, 20 ºC e 25 ºC, bem como alterações dos solventes
utilizados, tais como:
Metanol da marca CHEMCO, lote 24376, validade Abril de 2013.
Álcool etílico da marca CERBA, lote AEHNORG.027010, validade Setembro de
2012.
As soluções analisadas foram preparadas a partir do extrato de Physalis com
concentrações de 30%. Para realizar as análises foram preparadas as seguintes
soluções:
Amostra 1 – o extrato de Physalis a 30% foi diluido em álcool etílico para a
concentração de 15% e filtrado. Em um balão volumétrico de 10 mL foi colocado
aproximadamente 5 mL do extrato de Physalis 15% e acrescentado 200 µL de
Cloreto de Alumínio (2%) e completado o balão com o extrato. Foi deixado por 30
minutos em banho de gelo (20ºC). A leitura da absorbância foi feita em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 425nm.
Amostra 2 – o extrato de Physalis a 30% foi diluído em metanol para a
concentração de 15% e filtrado. Em um balão volumétrico de 10 mL adicionou-se
5 mL do extrato de Physalis 15% e 200 µL de Cloreto de Alumínio (2%). O volume
do balão foi completado com extrato e foi deixado por 30 minutos em banho de
55
gelo (20ºC). A leitura foi efeutada em espectrofotômetro no comprimento de onda
de 425nm.
Amostra 3 – em um balão volumétrico de 10 mL foi colocado 5mL do extrato de
Physalis 15% e 200 µL de Cloreto de Alumínio. O volume foi completado para 10
mL com o extrato. Foi deixado o balão por 30 minutos em banho de gelo (15ºC), e
a leitura foi efetuada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 425nm.
Este mesmo procedimento foi realizado para as amostras 4 e 5, porém com a
alteração da temperatura do banho para 20 e 25 °C respectivamente.
Após estabilização do equipamento foram realizadas as leituras de
absorbância da amostra em triplicata.
Os resultados de análise de todas as amostras foram expressos pela média
mais o desvio padrão relativo. Para a validação da robustez foi calculada a diferença
relativa de cada resultado em relação ao valor médio obtido no teste de
repetibilidade.
56
9 RESULTADOS E DISCUSSÃO
9.3 LINEARIDADE
A linearidade do método foi analisada através do gráfico de concentração de
quercetina em função da absorbância lida pelo método espectrofotométrico.
A construção do gráfico, ou seja, da curva analítica foi obtida pela preparação
de concentrações crescente de quercetina, sendo que a absorbância de cada
concentração foi obtida através de seis leituras.
O material de referência certificado quercetina (Sigma) adquirido possui 98%
de pureza, portanto foi feita a conversão dos valores das concentrações teóricas
para os valores de concentração reais. Outro parâmetro utilizado na determinação
da concentração real foi o valor de calibração dos balões volumétricos utilizados
durante o processo de diluição (Tabela 11).
Tabela 11 – Concentração real das amostras analisadas de quercetina para formar a curva de calibração.
Concentração teórica (µg/mL)
Calibração do balão (mL)
Concentração do padrão (98%)
Concentração real (µg/mL)
3,0 9,8211 2,9400 2,9936
4,0 10,0096 3,9200 3,9162
5,0 9,9929 4,9000 4,9035
6,0 9,9163 5,8800 5,9296
7,0 9,8744 6,8600 6,9473
8,0 9,9475 7,8400 7,8814
9,0 10,0399 8,8200 8,7849
10,0 9,9684 9,8000 9,8311
Com a obtenção das médias dos valores das absorbâncias de cada
concentração lida (Tabela 12 e 13), foi determinada a curva e a equação da reta
(Figura 11) representada pela equação abaixo, com um valor de coeficiente de
correlação igual a R2= 0,9950 e R=0,9975.
Equação: y=0,076x + 0,057
57
Tabela 12 – Leitura da absorbância das amostras de quercetina a 425nm.
Concentração teórica (µg/mL)
1 2 3 4 5 6
3,0 0,3035 0,3034 0,3040 0,3026 0,3042 0,3019
4,0 0,3574 0,3584 0,3586 0,3588 0,3586 0,3596
5,0 0,4206 0,4215 0,4222 0,4225 0,4208 0,4219
6,0 0,4969 0,4970 0,4971 0,4979 0,4978 0,4971
7,0 0,5920 0,5898 0,5893 0,5877 0,5884 0,5895
8,0 0,6787 0,6746 0,6731 0,6732 0,6730 0,6740
9,0 0,7443 0,7449 0,7459 0,7462 0,7454 0,7455
10,0 0,8080 0,8083 0,8095 0,8092 0,8081 0,8079
Tabela 13 – Leitura média da absorbância das amostras de quercetina com desvio padrão, desvio padrão relativo e incerteza.
Concentração teórica (µg/mL)
Média (A425)
Desvio padrão
Desvio padrão relativo
Incerteza
3,0 0,3033 0,0009 0,2872 0,0004
4,0 0,3586 0,0007 0,1977 0,0003
5,0 0,4216 0,0008 0,1809 0,0003
6,0 0,4973 0,0004 0,0872 0,0002
7,0 0,5895 0,0015 0,2495 0,0006
8,0 0,6744 0,0022 0,3233 0,0009
9,0 0,7454 0,0007 0,0920 0,0003
10,0 0,8085 0,0007 0,0839 0,0003
Figura 11 – Curva padrão de flavonóides totais expresso em quercetina obtida por espectrofotometria UV-visível.
y = 0,076x + 0,057R² = 0,9950 R=0,9975
0,00
0,50
1,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
A (
425n
m)
Concentração (ug/mL)
58
A legislação brasileira vigente determina que a linearidade de um método,
calculada a partir da regressão linear pelo método dos mínimos quadrados, tenha
um R2 igual ou superior a 0,98 (ANVISA, 2003) e 0,90 (INMETRO, 2003), é
considerado um método linear.
O método é linear, sendo que, o coeficiente de variação foi menor que 2% e
as residuais são mostradas na Figura 12.
Figura 12 – Gráfico das residuais mostrando a faixa linear de trabalho do padrão Quercetina.
9.1 SELETIVIDADE E EXATIDÃO
A seletividade de um método analítico é demonstrada pela habilidade deste,
em medir de forma exata a presença de um analito presente na matriz de uma
amostra, sem que ocorra a interferência dos demais componentes da formulação.
Para isso foram analisadas a amostra, amostra mais padrão e o padrão (quercetina).
O método espectroscópico demonstrou seletividade para a determinação dos
flavonóides totais no extrato de Physalis angulata L. expressos em quercetina, já
que as leituras do padrão, padrão mais amostra e da amostra apresentaram o
desvio padrão relativo menor que 2% (Tabela 14).
O valor de recuperação de um método deve ficar entre 70 e 120% segundo
descrito por Pozzi (2007). O valor de recuperação do método foi de 79,8%,
demonstrando que o método é considerado exato.
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
3 4 5 6 7 8 9 10
De
svio
pad
rão
re
lati
vo
Concentração teórica de Quercetina (µg/mL)
59
Tabela 14 – Leituras de absorbância da quercetina (3µg/mL), extrato de Physalis e do extrato de Physalis acrescido da amostra.
Quercetina 3µg/mL A (425nm) Flav. (µg/mL) em mg/mL % (m/V)
0,3135 4,0680 0,0041 0,00041
0,3134 4,0667 0,0041 0,00041
0,3140 4,0746 0,0041 0,00041
0,3126 4,0562 0,0041 0,00041
0,3142 4,0772 0,0041 0,00041
0,3119 4,0469 0,0040 0,00040
Média (m/V) DP DPR incerteza
0,000406 0,000001 0,281941 0,0000005
Amostra Physallis A (425nm) Flav. (µg/mL) em mg/mL % (m/V)
0,3215 4,1735 0,0042 0,00042
0,3232 4,1954 0,0042 0,00042
0,3235 4,1998 0,0042 0,00042
0,3225 4,1858 0,0042 0,00042
0,3209 4,1647 0,0042 0,00042
0,3217 4,1757 0,0042 0,00042
Média (m/V) DP DPR incerteza
0,000418 1,36x10-06 0,324490 5,54x10-07
Amostra Physallis +
Quercetina
A (425nm) Flav. (µg/mL) em mg/mL % (m/V)
0,5059 6,5996 0,0066 0,00066
0,5039 6,5733 0,0066 0,00066
0,5043 6,5785 0,0066 0,00066
0,5050 6,5877 0,0066 0,00066
0,5043 6,5785 0,0066 0,00066
0,5038 6,5719 0,0066 0,00066
Média (m/V) DP DPR incerteza
0,000514 1,15x10-06 0,224029 4,70x10-07
* A incerteza é calculada como i (s=desvio padrão; n= no de medidas)
9.2 PRECISÃO E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
A precisão foi determinada pela repetitividade do método, que representa a
semelhança entre os dados obtidos de várias leituras, sendo estas efetuadas nas
mesmas condições, em um mesmo dia, em curto intervalo de tempo, em um mesmo
equipamento e um mesmo analista (POZZI, 2007).
60
Os resultados da precisão (repetitividade) estão demonstrados na Tabela 15.
Analisando os valores do coeficiente de variação, todos menores que 5%, o método
é considerado preciso.
Tabela 15 – Resultados do primeiro dia de análises para o testes de precisão do método de quantificação de flavonóides totais do extrato de Physalis angulata L.
ANALISTA 01 Amostra
1 Amostra
2 Amostra
3 Amostra
4 Amostra
5 Amostra
6
1 0,3211 0,3228 0,3219 0,3223 0,3222 0,3228
2 0,3206 0,3260 0,3262 0,3216 0,3177 0,3209
3 0,3228 0,3207 0,3224 0,3234 0,3226 0,3213
Média A (425nm) 0,3215 0,3232 0,3235 0,3225 0,3209 0,3217
Flavonóides (µg/mL)
4,1735 4,1954 4,1998 4,1858 4,1647 4,1757
% (m/V) 0,000417 0,000420 0,000420 0,000419 0,000416 0,000418
Média %(m/V) 0,000418
Desvio Padrão 1,36x10-06
Desvio Padrão Relativo 0,324490
Incerteza 5,54x10-07
ANALISTA 02 Amostra
1 Amostra
2 Amostra
3 Amostra
4 Amostra
5 Amostra
6
1 0,3212 0,3220 0,3232 0,3222 0,3234 0,3212
2 0,3183 0,3179 0,3172 0,3180 0,3175 0,3163
3 0,3394 0,3358 0,3346 0,3346 0,3340 0,3342
Média A (425nm) 0,3263 0,3252 0,3250 0,3249 0,3250 0,3239
Flavonóides (µg/mL)
4,2364 4,2224 4,2193 4,2184 4,2189 4,2048
% (m/V) 0,000424 0,000422 0,000422 0,000422 0,000422 0,000420
Média %(m/V) 0,000422
Desvio Padrão 1,01E-06
Desvio Padrão Relativo 0,239148
Incerteza 4,12x10-07
A precisão intermediária foi avaliada pela mudança de analistas, com os
resultados expressos na Tabela 15 e pela variação interdias como representando na
Tabela 16. Analisando os coeficiente de variação, o método apresenta valores
61
aceitáveis, bem como quando analisada a diferença entre as médias de leitura do
dia 1 e 2, que foram de 1,67%, que deve ser menor que 5%.
Tabela 16 – Resultados do segundo dia de análises para o testes de precisão do método de quanficação de flavonóides totais de Physalis angulata L.
ANALISTA 01
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
Amostra 4
Amostra 5
Amostra 6
1 0,3315 0,3325 0,3318 0,3314 0,3305 0,3297
2 0,3297 0,3269 0,3264 0,3261 0,3264 0,3265
3 0,3246 0,3244 0,3241 0,3249 0,3246 0,3252
Média A (425nm) 0,3286 0,3279 0,3274 0,3275 0,3272 0,3271
Flavonóides (µg/mL)
4,2667 4,2579 4,2513 4,2518 4,2478 4,2474
% (m/V) 0,000427 0,000426 0,000425 0,000425 0,000425 0,000425
Média %(m/V) 0,000425
Desvio Padrão 7,35x10-07
Desvio Padrão Relativo 0,172735
Incerteza 3,00x10-07
ANALISTA 02 Amostra
1 Amostra
2 Amostra
3 Amostra
4 Amostra
5 Amostra
6
1 0,3355 0,3356 0,3357 0,3354 0,3368 0,3356
2 0,3339 0,3341 0,3341 0,3331 0,335 0,3349
3 0,3353 0,3341 0,3315 0,3346 0,3329 0,3327
Média A (425nm) 0,3349 0,3346 0,3338 0,3344 0,3349 0,3344
Flavonóides (µg/mL)
4,3496 4,3456 4,3347 4,3426 4,3496 4,3430
% (m/V) 0,000435 0,000435 0,000433 0,000434 0,000435 0,000434
Média %(m/V) 0,000434
Desvio Padrão 5,57x10-07
Desvio Padrão Relativo 0,128133
Incerteza 2,27x10-07
9.4 ROBUSTEZ
Os resultados obtidos com os testes de robustez estão descritos na Tabela
17, e foram obtidos a partir das modificações descritas na metodologia:
62
Amostra 1 – diluição do extrato de Physalis a 30% em álcool etílico.
Amostra 2 – diluição do extrato de Physalis a 30% em metanol.
Amostra 3 – extrato de Physalis 15%, em banho de gelo a 15ºC.
Amostra 4 – extrato de Physalis 15%, em banho de gelo a 20ºC.
Amostra 5 – extrato de Physalis 15%, em banho de gelo a 25ºC.
Tabela 17 – Valores obtidos no ensaio de Robustez do método de quanficação de flavonóides totais de Physalis angulata L.
Amostra 1 A(425nm) Flavonóides (µg/mL) Concentração (%)
Diluição Extrato em etanol
0,3339 4,3364 0,000434
0,3331 4,3259 0,000433
0,3327 4,3206 0,000432
0,3329 4,3233 0,000432
0,3335 4,3312 0,000433
0,3402 4,4193 0,000442
Média 0,000433
Desvio Padrão 8,04E-07
Coeficiente variação (%) 0,19
Amostra 2 A(425nm) Flavonóides (µg/mL) Concentração (%)
Diluição Extrato em metanol
0,3235 4,1996 0,000420
0,3207 4,1627 0,000416
0,3224 4,1851 0,000419
0,3213 4,1706 0,000417
0,3231 4,1943 0,000419
0,3224 4,1851 0,000419
Média 0,000418
Desvio Padrão 1,86E-06
Coeficiente variação (%) 0,44
Amostra 3 A(425nm) Flavonóides Reta (µg/mL) Concentração (%)
Banho de incubação 15oC
0,3206 4,1619 0,000416
0,3228 4,1904 0,000419
0,3216 4,1750 0,000418
0,3234 4,1983 0,000420
0,3226 4,1877 0,000419
0,3209 4,1658 0,000417
Média 0,000418
Desvio Padrão 1,43E-06
Coeficiente variação (%) 0,34
63
Continuação da Tabela 17 – Valores obtidos no ensaio de Robustez do método de quanficação de flavonóides totais de Physalis angulata L.
Amostra 4 A(425nm) Flavonóides (µg/mL) Concentração
(%)
Banho de incubação 20 °C 0,3228 4,1904 0,000419
0,3207 4,1627 0,000416
0,3224 4,1851 0,000419
0,3234 4,1983 0,000420
0,3226 4,1877 0,000419
0,3213 4,1706 0,000417
Média 0,000418
Desvio Padrão 1,47E-06
Coeficiente variação (%) 0,35
Amostra 5 A(425nm) Flavonóides (µg/mL) Concentração(%)
Banho de incubação 25 oC
0,3358 4,3614 0,000436
0,3352 4,3535 0,000435
0,3346 4,3456 0,000435
0,3249 4,2184 0,000422
0,3250 4,2189 0,000422
0,3342 4,3404 0,000434
Média 0,000435
Desvio Padrão 7,89E-07
Coeficiente variação (%) 0,18
A robustez do método foi avaliada pela diferença relativa (%) de cada
resultado obtido em relação ao valor médio obtido no teste de repetibilidade, como
expresso na Tabela 18.
O método demonstrou robustez, pois as comparações dos resultados obtidos
estão dentro do especificado.
Tabela 18 - Valores da diferença relativa (%) dos ensaios de Robustez do extrato de Physalis Angulata L. em relação ao teste de repetibilidade.
Robustez Reprodutibilidade Diferença Relativa (%) Conc.Média(%) Conc. Média(%)
Amostra 1 0,000433 0,000418 3,35
Amostra 2 0,000418 0,000418 0
Amostra 3 0,000418 0,000418 0
Amostra 4 0,000418 0,000418 0
Amostra 5 0,000435 0,000418 3,93
64
10 CONCLUSÃO PARCIAL
Considerando que a espectrofotometria no UV-Vis para a quantificação de
flavonóides em extratos vegetais é um método oficial, conclui-se que o método
descrito neste trabalho, pode ser utilizado para a determinação da concentração de
flavonóides totais no extrato dos frutos de Physalis angulata L.
O método para a quantificação de flavonóides demonstrou ser específico em
425nm para o extrato dos frutos de Physalis angulata L. A linearidade confirmou que
o método é linear e confere confiabilidade na quantificação de flavonóides.
A robustez, precisão e exatidão do método também foram avaliadas e os
resultados encontram-se dentro dos limites exigidos pela legislação vigente,
atestando a confiabilidade necessária para o uso deste método no controle de
qualidade de extratos de Physalis angulata L.
O método validado e a facilidade de execução e acessibilidade demonstram
que este, é uma alternativa viável para os laboratórios de controle de qualidade.
65
PARTE 3 - DESENVOLVIMENTO E ESTUDO DA ESTABILIDADE DAS EMULSÕES
CONTENDO O EXTRATO DE Physalis angulata L.
11 REVISÃO DA LITERATURA
Na antiguidade, os gregos, egípcios e outros povos tratavam doenças com o
uso de plantas medicinais. Este uso de compostos medicinais a partir de plantas, fez
surgir os produtos cosméticos, que é uma palavra de origem grega Kosm tikos, que
significa, “ter o poder de decorar” (PONTES et al., 2003).
O mercado farmacêutico de cosméticos tem mostrado um grande aumento
nos últimos anos no que se refere ao desenvolvimento de novas formulações, sendo
as emulsões amplamente utilizadas na incorporação de ativos cosméticos e de
fármacos (LANGE, HEBERLE E MILÃO, 2009).
Este mercado que aumenta suas vendas anualmente é justificado pela
mudança do tradicional conceito de cosméticos, que deixa de ser algo somente para
enfeitar e passa a ser algo necessário para conviver. Os produtos de higiene
pessoal, perfumaria e cosméticos passam a ser necessários, por exemplo, para um
bom relacionamento no ambiente de trabalho e nos deslocamentos nas grandes
cidades (PONTES et al., 2003).
O uso de extratos vegetais vem crescendo cada vem mais na indústria
cosméticos, o que na antiguidade era usado na preparação de produtos para fins
terapêuticos (LOPES, 2005). O uso de extratos vegetais, plantas medicinais, faz
com que sejam criados novos conceitos no mercado cosmético, como é o caso dos
Fitocosméticos, que podem se enquadrar em uma nova classe na indústria
cosmética, que são os cosmecêuticos (do inglês, cosmetics e pharmaceuticals)
(PONTES et al., 2003)
O desenvolvimento de cosméticos com Physalis angulata foi descrito por
Lopes e colaboradores (2005), as formulações preparadas usavam 25% do extrato
etanólico dos frutos da Physalis angulata em quatro formulações. Os resultados
demonstraram que a utilização do extrato etanólico se mostrou viável para o
desenvolvimento e produção de produtos dermatológicos, bem como, no
desenvolvimento e produção industrial de produtos cosméticos.
66
Existe uma tendência mundial na busca de produtos que não agridam o meio
ambiente ou que tragam um maior equilíbrio ecológico, os consumidores de países
desenvolvidos já criam uma certa resistência a produtos sintéticos, que normalmente
estão associados à contaminação do meio ambiente (PONTES et al, 2003; LIMA et
al, 2008). Esta tendência cosmética ocorre principalmente no uso de produtos
naturais derivados da flora brasileira (LIMA et al., 2008).
A estabilidade é um fator primordial em uma forma farmacêutica. Avaliar e
garantir a estabilidade de emulsão garante a qualidade e o sucesso terapêutico do
produto final. A avaliação de estabilidade de um produto cosmético pode ser
checada com o teste de estabilidade acelerada, que verificam a capacidade de um
produto, em condições específicas e controladas, de manter as mesmas
propriedades e características ao longo de sua validade (LANGE, HEBERLE e
MILÃO, 2009).
11.1 PELE
A pele não é apenas o maior órgão do corpo humano, é bem mais complexo,
fazendo uma análise histológica, este tecido contem mais de 5 tipos diferentes de
células que organizam estruturalmente o tecido, e outras células provenientes dos
sistemas circulatório e imunológico (BABY, 2007).
A interface do organismo humano com o ambiente externo é representada
pelo tecido epitelial que forma o revestimento da pele e mucosas. A pele reveste a
superfície externa do corpo e representa 16% do peso corporal (BOROJEVIC e
SERRICELLA, 1999; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
A pele apresenta como função essencial a proteção do organismo frente a
agentes químicos, físicos e biológicos. Existem ainda outras funções que são
essenciais para a manutenção da homeostasia do corpo humano, tais como,
termorregulação, função sensorial e endócrina, funções psicossociais (influência na
reprodução humana, expressão emocional, etc.) (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004;
BABY, 2007).
A pele é composta por um epitélio estratificado pavimentoso queratinizado,
chamado epiderme, e por uma camada mais profunda de tecido conjuntivo,
chamado de derme (Figura 13) (GAETNER e HIATT, 2007).
67
Figura 13 – Ilustração da estrutura básica da pele, com as três camadas componentes, epiderme, derme e hipoderme. Fonte: GAETNER e HIATT, 2007. A junção entre as duas principais camadas da pele, a epiderme e derme
ocorre através da formação das papilas dérmicas, já a interligação entre a pele e os
tecidos mais profundos ocorre pela bainha facial, mais conhecida como hipoderme
(GAETNER e HIATT, 2007).
11.1.1 Estrutura geral da pele
A pele apresenta três camadas principais, a epiderme, derme e hipoderme,
sendo que alguns autores a classificam em duas camadas. A epiderme é um epitélio
estratificado pavimentoso queratinizado, que possui a capacidade de regeneração,
sua camada superficial é caracterizada pela presença de células preenchidas por
queratina, que conhecida como estrato córneo (YOUNG et al., 2007). A camada
mais profunda da epiderme é chamada de estrato basal ou germinativo, que é
formado por uma única camada de células responsáveis pela renovação celular,
sendo que as células produzidas tendem a serem empurradas em direção à
superfície, formando as camadas mais espessas, tais como, estrato espinhoso,
granuloso e lúcido (Figura 14) (GAETNER e HIATT, 2007).
68
Figura 14 – Fotomicrografia do corte da pele humana, onde são visualizadas as camadas epiderme e derme, bem como as papilas dérmicas penetrando na epiderme. Fonte: JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004.
As células mais abundantes na epiderme são os queratinócitos, bem como
outros três tipos principais de células, os melanócitos, as células de Langerhans e as
células de Merkel (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004; GAETNER e HIATT, 2007).
A derme é constituída por tecido conjuntivo denso não modelado, rico em
fibras de colágeno e elásticas. Nesta parte do tecido epitelial são encontrados vasos
sanguíneos, nervos e receptores sensitivos (YOUNG et al, 2007). O colágeno
encontrado na derme é principalmente do tipo I, e as fibras elásticas auxiliam na
fixação da derme a hipoderme (GAETNER e HIATT, 2007).
A derme é subdivida em uma camada superficial, denominada camada
papilar, formada por tecido conjuntivo frouxo e uma camada profunda, denominada
camada reticular, constituída por tecido conjuntivo denso (Figura 15) (GAETNER e
HIATT, 2007).
69
A hipoderme é constituída principalmente por tecido adiposo e vasos
sanguíneos de maior calibre que suprem a drenagem e a vascularizam sanguínea
dérmica (YOUNG et al, 2007). Tem como função principal realizar a interligação da
derme aos órgãos subjacentes, bem como facilitar o deslizamento da pele sobre os
órgãos ao qual se apóia (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
Além destas estruturas, existem os anexos cutâneos, que incluem os folículos
pilosos, as glândulas sebáceas, as glândulas sudoríparas e as unhas (Figura 18)
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004; GAETNER e HIATT, 2007; YOUNG et al, 2007).
Figura 15 – Desenho demonstrando as estruturas da pele que se originam a partir de invaginações epidérmicas. Visualização do folículo piloso, glândulas sebáceas, músculo eretor do pêlo e uma glândula sudorípara. Fonte: JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004.
11.1.1 Envelhecimento cutâneo
Os tecidos passam por uma mudança gradual como o passar dos anos,
sendo que, na pele as alterações são bem visíveis. Os sinais mais aparentes em
uma pele envelhecida são a atrofia, enrugamento, ptose e lassidão (ORIÁ, 2003).
70
Existe uma tendência mundial no aumento da longevidade da população, o
Brasil, segundo projeções estatísticas terá em 2025, 32 milhões de pessoas com 60
anos ou mais. Os idosos buscam cada vez mais a redução de sinais de
envelhecimento na pele, dentre os diferentes cosméticos existentes, as emulsões
são amplamente utilizadas, pois estas podem atenuar as marcas decorrentes do
envelhecimento cutâneo, melhorando a auto-imagem e a qualidade de vida da
população idosa (MILAN et al, 2007).
As mudanças da pele humana durante o envelhecimento ocorrem por dois
fatores, os extrínsecos e intrínsecos. Os fatores externos como a radiação
ultravioleta é considerado um fator extrínseco (ORIÁ et al., 2003). Já os fatores
intrínsecos ou internos estão ligados a fatores genéticos, é inevitável e natural este
tipo de envelhecimento (BAGATIN, 2008).
As alterações morfológicas resultantes do envelhecimento extrínseco, em
essência, diferem das observadas no envelhecimento e intrínseco. O comparativo
entre as alterações está demonstrados na Tabela 19.
Tabela 19 – Alterações cutâneas provocadas pelo envelhecimento.
Envelhecimento intrínseco Envelhecimento extrínseco
Rugas Finas Profundas
Camada córnea Inalterada Afilada
Células displásicas Poucas Muitas
Fibras de colágeno Pequenas alterações no tamanho e organização
Grande alteração no tamanho e organização
Fibras elásticas Reorganização Menor produção e maior degeneração
Folículo capilar Menor número e afinamento Menor número e estrutura: perda capilar
Melanócitos Normal Menor número e melanina
Glândulas sebáceas e sudoríparas
Menor número Menor número: pele seca
Alterações benignas Ceratose seborreica
Alterações malignas Carcinoma basocelular Carcinoma espinocelular
Fonte: MONTAGNER e COSTA, 2009.
As alterações no tecido conjuntivo delineiam as mudanças na epiderme,
essas mudanças na estrutura e na aparência da pele ocorrem a partir de
modificações do sistema colágeno-elástico (ORIÁ et al., 2003).
71
Em um estudo realizado por Oriá e colaboradores (2003), foi visualizada em
corte da pele humana retirada de cadáveres (autópsia), que a derme do grupo senil
apresentou uma fragmentação acentuada das fibras elásticas, em contraste com as
fibras elásticas dos espécimes do grupo jovem (Figura 16).
Figura 16 – Corte da pele do grupo jovem (A) e corte da pele do grupo idoso (B). Na imagem B é visível o achatamento progressivo da junção epidermo-dérmica e a redução da derme média, refletindo a redução da densidade de fibras colágenas. Fonte: ORIÁ et al., 2003.
O envelhecimento é um processo biológico complexo, contínuo e
caracterizado por alterações celulares e moleculares. Apesar de o envelhecimento
cutâneo ser divido em intrínseco (cronológico) e extrínseco (fotoenvelhecimento),
atualmente sabe-se que os mecanismos celulares de envelhecimento para os dois
fatores são os mesmos (BAGATIN, 2008).
A compreensão do mecanismo de envelhecimento teve muito progresso nos
últimos 40 anos. Existem muitas evidências no processos de envelhecimento, dentre
eles a senescência e ou apoptose são processo fundamentais, e estes são
influenciados pelo dano causado ao DNA por agressões internas e externas. Vários
72
são os mecanismos descritos para o envelhecimento cutâneo, dentre eles podemos
destacar (BAGATIN, 2008):
A nível celular, nas mitocôndrias ocorre a produção de radicais livres (espécies
reativas de oxigênio) que são produzidas continuamente, que provocam a
oxidação de células e o envelhecimento.
As radiações UVB e UVA penetram na epiderme e derme, e atuam sobre os
queratinócitos e fibroblastos gerando espécies reativas de oxigênio. O estresse
oxidativo causa mutações genéticas, alterações funcionais das proteínas e
peroxidação lipídica da membrana celular.
A nicotina produz vasoconstrição, gerando hipóxia tissular e colabora com a
produção de radicais livres.
Como demonstrado nos itens acima a formação de radicais livres conduz ao
estresse oxidativo, que consiste em reações em cadeia que leva a alterações em
proteínas extracelulares e a modificações celulares.
O extresse oxidativo causa danos como a peroxidação lipídica das
membranas celulares, levando à morte celular. Para evitar a morte celular, nosso
organismo possui um sistema de defesa, onde utiliza enzimas, vitaminas e agentes
quelantes, entretanto este mecanismo de defesa perde a potência com o passar dos
anos e se faz necessário a suplementação exógena com compostos antioxidantes
(HIRATA et al., 2004).
A avaliação dos sinais de envelhecimento permite que sejam desenvolvidas
formulações apropriadas para a proteção dos diferentes compartimentos celulares
cutâneos. Estas formulações podem aperfeiçoar a proteção celular e retardar o
aparecimento de sinais de envelhecimento (HIRATA, 2004).
Segundo Machado e colaboradores (2008) existem vários estudos que
demonstram o uso de substâncias antioxidantes como agentes protetores, contra os
danos causados pelos processos oxidativos celulares. A atividade antioxidante dos
flavonóides é resultante de uma reação de óxido-redução, a partir da qual os
flavonóides absorvem e neutralizam os radicais livres.
O uso de plantas que contenham flavonóides em sua constituição química
pode colaborar no combate de vários tipos de moléculas oxidantes, moléculas estas
que causam danos celulares.
73
11.2 EMULSÕES COSMÉTICAS E ESTUDO DE ESTABILIDADE
O termo emulsão deriva do latim emulgeo, que significa mungir, em um
conceito geral, são preparações de aspecto leitoso de sistema disperso de duas
fases líquidas (PRISTA, ALVES e MORGADO, 2005; MORAES, 2006; BONTORIM,
2009).
O conceito de emulsões pode variar conforme a sua formulação, porém o
mais utilizado é o de que:
Emulsão é um sistema termodinamicamente instável resultante da mistura
de duas fases imiscíveis entre si, estabilizadas por um agente emulsificante,
podendo ser classificada em O/A (óleo em água) e A/O (água em óleo),
dependendo da fase externa, contínua ou, também denominada dispersante
(LIMA, 2008).
A constituição básica de uma emulsão é uma fase aquosa, uma fase oleosa e
um sistema emulsificante, com função de manter as fases dispersas, e estas, são
classificadas segundo a natureza de sua fase externa (BONTORIM, 2009). As
emulsões do tipo água em óleo (A/O) devem apresentar como fase externa o óleo e
como fase dispersa a água, que deve estar na forma de partículas maiores que 0,1
milímetro. Já a emulsão do tipo óleo em água (O/A), o material oleoso está disperso
na água, fase externa (PIANOVSKI et al, 2008).
Ao fornecer energia mecânica suficiente a um sistema formado por duas
fases líquidas imiscíveis, por exemplo, óleo em água, ocorre a formação de
filamentos de uma fase passando através da outra. Como estes filamentos são
instáveis, este assumem o formato de gotas, que tendem a se unir em gotas maiores
e ocorrer à separação das fases (SOUZA, 2007).
A tensão superficial das gotículas que tendem a se unir pode ser reduzida a
partir da adição de um agente emulsionante, impedindo a coalescência das gotas e
com isso reduzindo a instabilidade de uma emulsão (Figura 17 ) (SOUZA, 2007).
A redução da tensão superficial a partir dos emulsionantes segundo Ansel e
colaboradores (2007), ocorre devido à diminuição da tensão interfacial entre as
fases aquosa e oleosa, isso faz com que ocorra a redução da força de repulsão
74
entre as moléculas bem com as forças de atração, facilitando a formação das
gotículas.
A qualidade e a estabilidade de uma emulsão em grande parte dependem da
escolha do tensoativo, ou seja, do agente emulsificante (PRISTA et al, 1990).
Figura 17 – Representação da diminuição da tensão interfacial entre as fases aquosa e oleosa de uma emulsão, formação de filamentos entre as fases e formação das gotículas. Fonte: SOUZA, 2007.
As emulsões são utilizadas por diversas áreas, tais como cosmética,
farmacêutica e química em geral, porém estas devem apresentar um período pré-
determinado de estabilidade físico-química (ATTWOOD, 2005).
75
Dentre os ensaios utilizados para determinar a estabilidade física de
formulações cosméticas, o estresse por temperaturas altas é um dos mais utilizados,
tanto em pesquisas quanto em industrias cosméticas (CAMARGO JUNIOR, 2006).
A avaliação da instabilidade de uma emulsão pode ser realizada a partir da
variação de características físico-químicas, tais como: pH, viscosidade, densidade,
condutividade elétrica, umidade, tamanho de partícula, entre outros (PIANOVSKI et
al, 2008). Já a identificação de instabilidade de uma emulsão por ser feita a partir da
visualização da separação das fases. Segundo Pianovski e colaboradores (2008)
este tipo de instabilidade é verificada a partir das seguintes características:
As partículas menos densas podem subir para o topo da formulação, fator
este denominado de cremosidade.
Diminuição da força de repulsão entre as moléculas, elas tendem a se
associar de maneira fraca, fator denominado de floculação.
Atração entre as gotículas da fase interna que se unem formando uma
gotícula maior, podendo ocorrer a inversão de fases. Este processo é
denominado de coalescência.
Figura 18- Processos de desestabilização de emulsões onde as alterações podem ser visualizadas em (a) cremeação; (b) sedimentação; (c) floculação; (d) inversão de fases; (e) coalescência; (f) amadurecimento de Ostwald. Fonte: BONTORIM, 2009.
76
Como demonstrado na Figura 18, Bontorim (2009) descreve ainda como
processos de desestabilização de emulsões a sedimentação e amadurecimento de
Ostwald. A sedimentação ocorre porque a densidade da fase dispersa é mais
elevada que a da fase dispersante, já o amadurecimento de Ostwald ocorre devido à
diferença de solubilidade entre pequenas e grandes partículas, levando ao
aglomeramento das partículas menores junto às maiores.
As causas de desestabilização de uma emulsão são muitas, e estas podem
ocorrer durante o transporte e armazenamento, processo de fabricação, bem como a
partir da interação entre os componentes da formulação (BOOCK, 2007).
O Guia de estabilidade de produtos cosméticos descreve os estudos de
estabilidade necessários para fornecer indicações sobre o comportamento do
produto em determinado intervalo de tempo, frente a condições ambientais a que
possa ser submetido (BRASIL, 2004). Estes ensaios garantem que a formulação
cosmética não sofra nenhum tipo de alteração físico-química desde a produção até o
término da validade.
A avaliação da estabilidade dos produtos cosméticos é de responsabilidade
da empresa produtora e a apresentação destes dados é exigida no ato da
regularização do produto ou quando solicitado pela autoridade sanitária (BRASIL,
2004).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2004), preconiza em seu
Guia de estabilidade de produtos cosméticos que os testes a serem realizados nos
produtos podem seguir a seguinte ordem:
Teste de centrifugação, consistem em submeter uma amostra do produto a
3000 rpm por 30 minutos, se não for identificado nenhum tipo de alteração do
produto está passará para o próximo passo.
Teste de estabilidade preliminar consiste em uma triagem de curto prazo
onde o produto e colocado em condições de estresse, como temperatura,
umidade. Este teste tem duração de 15 dias, se aprovado passa para o
próximo teste.
Teste de estabilidade acelerado ou exploratório tem duração de 90 dias e
assim como no teste anterior as amostras são levadas ao estresse ambiental.
Teste de prateleira ou de longa duração, este é realizado à temperatura
ambiente e acompanha toda a validade do produto.
77
Os testes de estabilidade descritos acima determinam se em sua embalagem
específica, o produto cosmético manterá suas características físico-químicas,
microbiológicas, terapêuticas e toxicológicas, dentro de limites especificados. Nestes
testes as condições forçadas de armazenamento tem o propósito de monitorar
possíveis reações de degradação e prever o prazo de validade (PROENÇA et al,
2006).
78
12 OBJETIVO
Desenvolver e avaliar a estabilidade físico-química de emulsões cosméticas
do tipo óleo em água (O/A) contendo o extrato hidroalcoólico dos frutos de Physalis
angulata L.
79
13 MATERIAIS E MÉTODOS 13.1 MATERIAIS As emulsões foram formuladas com as seguintes matérias-primas
denominadas pela International Nomenclature Cosmetics Ingredients (INCI), nome
comercial e fornecedores:
Cetearyl olivate, sortitan olivate (Olivem 1000 - Vital Especialidades
Dermocosmética LDTA).
Dehydroxanthan Gum (Amaze XT – Via Farma Importadora LTDA).
Orbignya oleifera Seed Oil (Óleo de babaçu orgânico – Via Farma Importadora
LDTA e CRODA-Brasil).
Bertholletia ecelsa seed oil (Óleo de castanha da índia orgânico - Via Farma
Importadora LDTA e CRODA-Brasil).
Dehydriacetic Acid and Benzyl Alcohol (Geogard 221 – CHEMYUNION Química
LTDA).
Vegetable Oil and Palm Alcohol and Lecithin and Phytosteryl Canolate
(Sensactive VEG – DEG FRAGON Importadora de produtos químicos LTDA e
CHEMYUNION Química LTDA).
Octyldodecanol (Eutanol G – EMBACAPS Química e Farmacêutica LDTA).
Dicaprylyl Carbonate (Cetiol CC - EMBACAPS Química e Farmacêutica LDTA).
Theobroma grandiflorum Seed Butter (Manteiga de Cupuaçu - Via Farma
Importadora LDTA e CRODA-Brasil).
Astrocaryum murumuru Seed Butter (Manteiga de Muru Muru – Mapric Produtos
Farmacêuticos e Cosméticos).
Physalis angulata extract (Extrato padronizado de Physalis angulata ).
Sodium hidroxide (Hidróxido de sódio – HENRIFARMA Produtos Químicos e
Farmacêuticos LTDA).
Os equipamentos e vidrarias utilizadas estão descritos abaixo:
Balança semi-analítica (precisão 0,025g) – Marca BEL equipamentos para
Laboratórios.
pHmetro digital calibrado (pH 4,0 e 7,0) – Marca Bel equipamentos para
Laboratórios.
Estufa de cultura Fanen – modelo 002 CB.
80
Centrífuga Excelsa Baby II – modelo 206R.
Agitador Mecânico – Fisaton (Mod. 713D).
Placa de aquecimento – Marte.
Geladeira - Eletrolux
Vidrarias – picnometro, tubos de ensaio, copo béquer, espátulas, bastões, etc.
13.2 MÉTODOS
13.2.1 Desenvolvimento das emulsões
Foram preparadas três séries de emulsões cosméticas denominadas: EC1,
EC2 e EC3. As três formulações foram preparadas em triplicata e suas composições
estão descritas na Tabela 20.
Tabela 20 – Formulação das 3 emulsões testadas.
Concentração (%)
Fase Matérias prima EC1 EC2 EC3
1 Olivem 1000 3,0 4,0 6,0
1 Óleo de Babaçu orgânico 5,0 5,0 5,0
1 Óleo de Castanha da Índia orgânico 5,0 5,0 5,0
1 Eutanol G 2,0 2,0 2,0
1 Cetiol CC 3,0 3,0 3,0
1 Manteiga de Cupuaçu - 0,5 1,0
1 Manteiga de Muru Muru - 0,5 1,0
1 Sensactive VEG 2,0 2,0 2,0
2 Amaze XT 0,5 0,5 0,5
2 Geogard 221 0,8 0,8 0,8
2 Água destilada qsp 100 100 100
3 Extrato de Physalis angulata L. orgânico 10 10 10
As emulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases, a fase
aquosa (2) e oleosa (1) foi pesada em balança semi-analítica, foram aquecidas
separadamente à temperatura de 80 ±5º C. Em seguida, a fase aquosa foi vertida
lentamente sobre a fase oleosa sob agitação constante de 900 rpm, com o auxílio de
um agitador mecânico (Fisaton) com haste do tipo ancora. A agitação permaneceu
constante até que a emulsão atingisse a temperatura ambiente controlada de 25
81
±5ºC. Após controle da temperatura foi adicionada a fase três, extrato de Physalis
angulata L. A massa final das formulações foi corrigida com água destilada.
13.2.2 Teste de centrifugação
O teste de estabilidade à centrifugação foi realizado com amostras de 10 g,
estas alíquotas foram pesadas e acondicionados em tubo de centrífuga graduados.
Posteriomente as amostras foram submetidas à centrifugação na velocidade de
3000 rpm. A análise foi realizada em triplicada e com tempo de rotação de 30
minutos (BRASIL, 2004; ISAAC et al, 2008). Após cada ciclo, foi avaliado
visualmente qualquer sinal de instabilidade da amostra.
13.2.3 Teste de estabilidade
Os testes de estabilidade realizados tem base nas recomendações do Guia
de Estabilidade de produtos Cosméticos (BRASIL, 2004) bem como no Protocolo
para ensaios físico-químicos de estabilidade fitocosméticos descrito por Isaac e
colaboradores (2008).
13.2.4 Teste de estabilidade preliminar das emulsões
O teste de estabilidade preliminar consiste em submeter à amostra a
condições extremas de temperatura e realizar os ensaios em relação aos
parâmetros de qualidade da emulsão (ISAAC, 2008).
Os testes foram realizados durante 15 dias consecutivos, onde as
preparações foram estocadas em temperatura ambiente (20 ±2°C), estufa (40 ±2
°C), geladeira (5 ±2 °C), freezer (-5 ±2 °C) e expostos a luz indireta.
A avaliação da estabilidade foi medida a partir das características
macroscópicas e pH durante os 15 dias, já as medidas de densidade foram
realizadas no dia 1 para as amostras estocadas em temperatura ambiente (20 ±2ºC)
e nos dias 7 e 15 para todas as amostras.
Outro teste de estabilidade preliminar é o ciclo congela e desgela, onde as
amostras foram submetidas a condições extremas de temperaturas, alternando entre
82
estufa (40º ±2 °C) e congelamento (-5 ±2 °C). Estes ciclos devem ser alternados a
cada 24 horas, durante 15 dias consecutivos.
Os resultados obtidos foram expressos pela média aritmética dos testes
realizados em triplicados e pelo desvio padrão da média.
13.2.5 Testes de estabilidade acelerada das emulsões
O teste de estabilidade acelerada também chamado de estabilidade normal
ou exploratória é realizado para avaliar a capacidade de estabilidade do produto
cosmético, bem como, a vida útil e a compatibilidade da formulação com a
embalagem (BRASIL, 2004).
Os testes foram realizados durante 90 dias consecutivos, onde as
preparações foram estocadas em temperatura ambiente (20 ±2 °C), estufa (40 ±2
°C), geladeira (5 ±2 °C), freezer (-5 ±2 °C) e expostos a luz indireta.
A avaliação da estabilidade foi medida a partir das características
macroscópicas, densidade e pH durante os 90 dias, nos dias de análise 1, 7, 15, 30,
45, 60 e 90 para todas as amostras.
Os resultados obtidos foram expressos pela média aritmética dos testes
realizados em triplicatas e pelo desvio padrão da média. A variação dos
resultados não pode ser maior que 10% (BRASIL, 2004).
13.2.6 Avaliação das características organolépticas
A avaliação da amostra deve ser comparativa ao padrão, a fim de avaliar as
características macroscópicas para verificar possíveis instabilidades. A emulsão
poderá ser considerada estável se não apresentar separação de fases, turvação e
precipitação. As descrições dos resultados da análise foram: normal, sem alteração,
levemente separada, precipitada, turva e separada (ISAAC et al, 2008).
O aspecto, cor e o odor devem manter-se estáveis durante todos os testes,
mantendo seu aspecto inicial, exceto em temperaturas elevadas, freezer ou ciclos
em que pequenas alterações são aceitáveis (BRASIL, 2004). As descrições dos
resultados da análise podem ser descritas como normal sem alteração (N),
83
levemente ou ligeiramente modificado (L), modificado (M) e intensamente modificado
(I) (BRASIL, 2004).
13.2.7 Determinação do valor de pH
A determinação do valor de pH nas emulsões foi realizada a partir da
dispersão de 1 grama da emulsão em 9 gramas de água destilada (10% p/p),
usando phmetro digital. O eletrodo foi imerso diretamente na dispersão aquosa, e os
valores devem ser mantidos entre 5,5 e 6,5. Estes valores são considerados com
critério de estabilidade, pois são compatíveis com o pH cutâneo (ISAAC, 2008).
A variação dos resultados não pode ser maior que 10% (BRASIL, 2004).
13.2.8 Determinação da densidade
A densidade específica é obtida a partir da densidade absoluta da amostra e
a densidade absoluta da água (BRASIL, 2007).
A Farmacopéia Brasileira, quarta edição, descreve que a determinação da
densidade específica deve ser realizada em picnômetro, com temperatura
controlada, previamente pesado vazio (mPv). A amostra da emulsão deve ser
inserida no picnômetro, a temperatura deve ser controlada (20º C), sendo pesado
(mPa). A diferença entre a massa do picnomêtro vazio e a massa do pcnomêtro com
a amostra é a massa da amostra. A relação entre a massa da amostra e a massa da
água, ambas a 20º C, representa a densidade específica da amostra da emulsão
(BRASIL, 2001).
84
14 RESULTADOS E DISCUSSÃO
14.1 DESENVOLVIMENTO DA EMULSÃO
O desenvolvimento da formulação foi baseado no referencial COSMOS
Standard. Os cosméticos para serem considerados como orgânicos, devem ser
isentos de nanomateriais e organismos geneticamente modificados, além de não
serem testados em animais (COSMOS-Standard, 2007).
Na padronização COSMOS (Anexo 2), as matérias primas dos produtos
cosméticos são classificadas em: água, mineirais e matérias primas de origem
mineral, matérias primas de origem vegetal fisicamente e quimicamente processado
e outros ingredientes (COSMOS-Standard, 2007).
As regras para os cosméticos obterem certificação orgânica são:
A água e minerais não são calculados como materiais orgânicos.
Pelo menos 95% dos ingredientes vegetais processados fisicamente e
quimicamente devem ser de origem orgânica, para serem considerados matéria
prima orgânica.
O produto cosmético acabado deve conter no mínimo 20% de sua formulação
composta por produtos orgânicos.
As matérias primas utilizadas na formulação devem estar presentes na lista
positiva do referencial ou devem ser de origem vegetal.
As formulações desenvolvidas são classificadas como cosmético orgânico
segundo o referencial COSMOS-Standard, pois apresentam em sua composição
constituintes permitidos (lista positiva de matéria prima), bem como substâncias de
origem vegetal (modificadas física e quimicamente) e matérias primas de origem
orgânica como visto na Tabela 20.
Analisando a formulação, 100% das matérias primas utilizadas são permitidas
para o uso em cosméticos orgânicos e naturais. Já a quantidade de constituintes
com certificação orgânica, representam um mínimo de 20% da formulação, pois
temos 5% de Orbignya oleifera Seed Oil (Óleo de Babaçu), 5% de Bertholletia
ecelsa seed oil (Óleo de Castanha da Índia) e 10% do Extrato de Physalis angulata.
85
Como demonstrado no capítulo 1, o extrato de Physalis angulata L. é
classificado como um produto orgânico, pois apresenta em sua composição os frutos
de Physalis que foram adquiridos de cultura orgânica, bem como, o álcool etílico
utilizado, também é proveniente de produção orgânica, ambos com certificação.
Tabela 21 – Classificação das matérias primas utilizadas na produção da emulsão quanto a sua origem.
Matérias prima Classificação
Cetearyl olivate, sortitan olivate (Olivem 1000)
Certificação de Orgânico
Orbignya oleifera Seed Oil (Óleo de Babaçu)
Certificação de Orgânico
Vegetable Oil and Palm Alcohol and Lecithin and Phytosteryl Canolate
(Sensactive VEG)
Quimicamente processado (origem vegetal)
Bertholletia ecelsa seed oil (Óleo de Castanha da Índia)
Certificação de Orgânico
Octyldodecanol (Eutanol G)
Lista positiva
Dicaprylyl Carbonate (Cetiol CC)
Lista positiva
Theobroma grandiflorum Seed Butter (Manteiga de Cupuaçu)
Origem vegetal
Astrocaryum murumuru Seed Butter (Manteiga de Muru Muru)
Origem vegetal
Dehydroxanthan Gum (Amaze XT)
Quimicamente processado (origem vegetal)
Dehydriacetic Acid and Benzyl Alcohol (Geogard 221)
Lista positiva
Água destilada qsp Isento
Extrato de Physalis angulata L. orgânico Orgânico
Nas emulsões foi utilizado o Olivem 1000 (Cetearyl olivate, sortitan olivate)
com variação na sua concentração de 3, 4 e 6%, nas emulsões EC1, EC2 e EC3
respectivamente.
O Olivem 1000 é um emulsificante de emulsões do tipo óleo em água,
também atua como um sistema auto-emulsionante que forma uma rede de cristais
líquidos no interior da emulsão, permitindo a formulação de emulsões mais estáveis.
Este é produzido a partir de matéria prima natural, e é livre de ingredientes
tensoativos e etoxilados. Enquanto o derivado Cetearylic Ester estabiliza os cristais
líquidos o Sorbitan Olivate melhora as propriedades de emoliência da emulsão. A
concentração usual recomendada é de 2 a 8% (BIOLOGIA e TECNOLOGIA, 2002).
86
A emulsão EC3 (Figura 19) em que foram utilizados 6% do Olivem 1000,
apresentou um aumento da viscosidade do sistema, quando comparada às
emulsões EC1 e EC2. Considerando o Olivem 1000 um agente emulsionante,
empregado no preparo de emulsões de fase externa aquosa (O/A), este quando
utilizado em maiores concentrações, aumenta a viscosidade do sistema e com isso
pode proporcionar maior estabilidade à emulsão.
Figura 19 – Fotografia da emulsão EC3. Fonte: Acervo do autor.
14.2 Testes de centrifugação
O teste de centrifugação produz estresse na amostra simulando um aumento
na força de gravidade, aumentando a mobilidade das partículas e antecipando
possíveis instabilidades (BRASIL, 2004).
As emulsões EC1, EC2 e EC3 após serem submetidas ao teste de
centrifugação, nenhuma das formulações apresentou instabilidade, quando
analisadas visualmente. Como demonstrado na Figura 20 não houve a separação de
fases, presença de precipitado, coalescência o que caracteriza a estabilidade das
emulsões, frente ao teste de centrifugação.
Segundo Isaac e colaboradores (2008), a não separação de fases não
assegura sua estabilidade, por isso as emulsões devem ser submetidos aos testes
de estabilidade preliminar e acelerado, sem a necessidade de alterar a formulação.
87
Figura 20: Fotografia das formulações EC1, EC2 e EC3 após 30 minutos de centrifugação a 3000 rpm. Fonte: Acervo do autor.
Apesar de as três formulações passarem pelo teste de centrifugação, foi
escolhida apenas uma para dar continuidade aos testes de estabilidade.
Um dos pontos escolhidos para determinar qual formulação foi escolhida, foi a
avaliação visual da viscosidade. Como descrito no Guia de estabilidade de produtos
cosméticos (BRASIL, 2004), os limites de aceitação da viscosidade devem ser
definidos pelo formulador, considerando a percepção visual e sensorial da
formulação, levando em consideração a possibilidade do consumidor também
percebê-las.
A formulação EC3 foi escolhida por apresentar uma percepção visual e
sensorial melhor que as outras duas formulações. A redução nos custos de pesquisa
foi também um dos motivos que levaram a escolha da fórmula EC3.
88
14.3 Testes de estabilidade
Uma vez criadas às especificações para o produto, devem ser realizados os
testes, para verificar se estas foram mantidas, garantindo a qualidade final do
produto. Existem vários testes importantes de estabilidade que são empregados em
formulações (ANSEL et al., 2000).
Os resultados iniciais foram mensurados após 24 horas do preparo da
emulsão EC3:
Avaliação das características organolépticas:
o Cor: amarelo claro
o Aspecto: cremoso, homogêneo, leitoso, brilhante e viscoso.
o Odor: baixo poder odorante e agradável.
Avaliação das características físico-químicas:
o pH: a médias das análises do pH foi de 7,03 (±0,056), porém após a
adição do extrato de Physalis diminuiu para 3,93 (±0,061), sendo
necessária a adição de um sistema tampão para ajustar o pH, com
valores entre 5,5 a 6,5. Para isso foi prepara uma solução aquosa de
Hidróxido de sódio 10% (p/p), da qual foi adicionada quantidade
suficiente para ajustar o pH. A medida do pH após a adição do tampão
foi de 6,46 (±0,110).
o Densidade: 0,929 (±0,015)g/mL
o Centrifugação: sem separação de fases, floculação e sedimentação.
14.4 Teste de estabilidade preliminar das emulsões
Durante os 15 dias do teste de estabilidade preliminar foi avaliada
periodicamente a capacidade da emulsão EC3 em manter suas características,
comparadas aos resultados padrões pré-estabelecidos, estes estão descritos no
item 14.4. (BRASIL, 2004).
14.4.1 Avaliação das características organolépticas
A Tabela 22 mostra os resultados obtidos para os parâmetros cor, odor e
aspecto da emulsão EC3, quando esta foi submetida a diferentes condições
89
ambientais no teste de estabilidade preliminar, onde se verifica que todas as
amostras não apresentaram alterações, sendo classificadas como normais.
Tabela 22 – Avaliação das características organolépticas da emulsão EC3 durante estudo de estabilidade preliminar.
Tempo (dias)
Am
bie
nte
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15
Asp. N N N N N N N N N N N N N N N
Cor N N N N N N N N N N N N N N N
Odor N N N N N N N N N N N N N N N
Cic
lo
Asp. N N N N N N N N N N N N N N N
Cor N N N N N N N N N N N N N N N
Odor N N N N N N N N N N N N N N N
Estu
fa
Asp. N N N N N N N N N N N N N N N
Cor N N N N N N N N N N N N N N N
Odor N N N N N N N N N N N N N N N
Gela
deir
a Asp. N N N N N N N N N N N N N N N
Cor N N N N N N N N N N N N N N N
Odor N N N N N N N N N N N N N N N
Fre
ezer
Asp. N N N N N N N N N N N N N N N
Cor N N N N N N N N N N N N N N N
Odor N N N N N N N N N N N N N N N
Lu
z
Asp. N N N N N N N N N N N N N N N
Cor N N N N N N N N N N N N N N N
Odor N N N N N N N N N N N N N N N
Legenda: N – normal; L – levemente modificado; M – modificado; I – intensamente modificado
A emulsão EC3 permaneceu estável em todos os critérios avaliados, sem
alteração de cor, odor e aspecto.
14.4.2 Determinação do valor de pH
Os valores de pH, obtidos por potenciometria direta em dispersão aquosa da
emulsão EC3, estão demonstrados na Tabela 23.
90
Em relação aos valores de pH (Figura 21 A e B) os resultados mostram que
as variações nos valores de pH não são significativas, demonstrados por um desvio
padrão de 0,06 e um coeficiente de variação menor que 1% para as médias das
análises. Esses resultados são um indicativo da não formação de compostos de
degradação ácidos ou básicos, que possivelmente levariam a variações bruscas nos
valores de pH da emulsão.
Tabela 23 – Valores de pH da emulsão EC3 durante o teste de estabilidade preliminar.
Tempo (dias)
Parametros Físicos
Ambiente Estufa Ciclo Geladeira Freezer Luz
1 6,46 6,47 6,45 6,34 6,38 6,40
2 6,48 6,41 6,41 6,40 6,38 6,43
3 6,43 6,44 6,43 6,38 6,42 6,31
4 6,46 6,44 6,43 6,42 6,43 6,32
5 6,45 6,40 6,42 6,44 6,41 6,29
6 6,40 6,50 6,38 6,34 6,32 6,34
7 6,42 6,44 6,42 6,43 6,41 6,37
8 6,46 6,38 6,49 6,41 6,32 6,36
9 6,36 6,37 6,37 6,46 6,38 6,31
10 6,34 6,37 6,35 6,33 6,42 6,44
11 6,46 6,36 6,34 6,29 6,49 6,38
12 6,34 6,43 6,39 6,32 6,44 6,37
13 6,37 6,31 6,31 6,41 6,38 6,37
14 6,36 6,32 6,34 6,32 6,37 6,27
15 6,31 6,29 6,37 6,35 6,37 6,32
Média 6,41 6,40 6,39 6,38 6,39 6,35
DP 0,056 0,060 0,048 0,052 0,044 0,049
CV 0,868 0,942 0,756 0,817 0,691 0,779
* Os valores de pH são a médias das triplicatas analisadas. Legenda: DP – Desvio padrão da média; CV – coeficiente de variação
A emulsão EC3 apresentou um valor médio de pH de 6,33, com todos os
valores de pH entre 6,0 e 6,5, valores estes compatíveis com as matérias primas
utilizadas e biocompatíveis com o valor do pH fisiológico da pele (5,5 a 6,5).
Ao analisar o limite de variação de 10%, verificou-se que nenhum dos valores
de pH ultrapassou o limite superior de 7,02 e o inferior de 5,76 (Figura 21 A e B).
A análise do pH é importante no estudo de estabilidade, pois alterações
nestes valores podem ser geradas por impurezas, reações de hidrólise,
decomposição da formulação e erros no processo produtivo. Esse tipo de
91
instabilidade pode ocorrer também durante o tempo de estocagem, armazenamento
e transporte inadequados (FERREIRA, 2000; ANSEL et al., 2000)
Figura 21 – (A) Valores de pH da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente (20 °C), estufa (40 °C) e luz indireta e (B) nas condições de armazenamento em ciclo (-5 e 20 °C), geladeira (5 °C) e freezer (-5 °C), no teste de estabilidade preliminar.
14.4.3 Determinação da densidade
Uma das instabilidades mais comuns em emulsões é a sedimentação, que é
resultante da diferença de densidade entre as duas fases (O/A), podendo ocorrer a
5,8
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Val
ore
s d
e p
H
Tempo (dias)
Teste de estabilidade preliminarAnálise do pH
Ambiente
Estufa
Luz
A
5,8
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
1 7 15 30 45 60 90
Val
ore
s d
e p
H
Tempo (dias)
Teste de estabilidade aceleradoAnálise do pH
Ciclo
Geladeira
Freezer
B
92
separação de fases. Este fator ocorre principalmente em emulsões que não tenham
um bom sistema emulsionante.
Os valores da densidade obtidos pela técnica do picnometro da emulsão EC3
estão apresentados na Tabela 24 e na Figura 23.
Analisando os resultados observou-se que não houve alterações significativas
na densidade da emulsão EC3, mesmo quando colocada em estresse térmico. Os
valores das densidades mantiveram-se dentro do limite de variação de 10%.
Ao criar um sistema emulsificado sabe-se que, quanto maior a proximidade da
densidade entre a fase oleosa e a aquosa, maior a estabilidade da emulsão. Manter
a densidade inicial do sistema, sem alterações significativas, proporciona maior
estabilidade para a emulsão. Como mostra a Figura 22, a emulsão permaneceu sem
alterações, mesmo quando comparamos a densidade inicial de 0,929 (±0,015)g/mL
as densidades da emulsão no final do teste preliminar que ficaram entre 0,920 a
0,933g/mL.
Figura 22 – Fotografia da emulsão EC3 estável ao teste de estabilidade preliminar. Fonte: Acervo do autor.
Tabela 24 - Valores da densidade (g/mL) emulsão EC3 durante o teste de estabilidade preliminar.
Tempo (dias)
Parametros Físicos
Ambiente Estufa Ciclo Geladeira Freezer Luz
1 0,926 0,912 0,922 0,915 0,926 0,920
7 0,945 0,933 0,945 0,916 0,935 0,923
15 0,915 0,916 0,932 0,928 0,922 0,924
Média 0,929 0,920 0,933 0,920 0,928 0,922
DP 0,015 0,011 0,012 0,007 0,007 0,002
CV 1,634 1,212 1,236 0,787 0,718 0,226
93
Figura 23 – (A) Valores de densidade específica da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente (20 °C), estufa (40 °C) e luz indireta e (B) nas condições de armazenamento em ciclo (-5 e 20 °C), geladeira (5 °C) e freezer (-5 °C), no teste de estabilidade preliminar.
14.5 Testes de estabilidade acelerada das emulsões
Após o término dos testes de estabilidade preliminar foi realizado o teste de
estabilidade acelerada, com duração de 90 dias e com a finalidade de proporcionar
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1 7 15
De
nsi
dad
e (
g/m
L)
Tempo (dias)
Teste de estabilidade preliminarAnálise da Densidade
Ambiente
Estufa
Luz
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1 7 15
De
nsi
dad
e (
g/m
L)
Tempo (dias)
Teste de estabilidade preliminarAnálise da Densidade
Ciclo
Geladeira
Freezer
A
B
94
um estresse maior à emulsão, e assim verificar se ocorriam mudanças nas
características organolépticas, pH e densidade.
14.5.1 Avaliação das características organolépticas
A Tabela 24 demonstra os resultados obtidos para os parâmetros cor, odor e
aspecto da emulsão EC3, demonstrando se ocorreu alguma alteração progressiva
durante os 90 dias de análise, quando esta foi submetida a diferentes condições
ambientais no teste de estabilidade acelerada.
Tabela 24 – Avaliação das características organolépticas da emulsão EC3 durante a estabilidade preliminar.
Tempo (dias)
Am
bie
nte
01 07 15 30 45 60 90
Gela
deir
a
01 07 15 30 45 60 90
Asp. N N N N N N N Asp. N N N N N N N
Cor N N N N N N N Cor N N N N N N N
Odor N N N N N N N Odor N N N N N N N
Cic
lo
Asp. N N N N N N N
Fre
ezer
Asp. N N N N N N N
Cor N N N N N N N Cor N N N N N N N
Odor N N N N N N N Odor N N N N N N N
Estu
fa
Asp. N N N N N N N
Lu
z
Asp. N N N N N N N
Cor N N N N N N N Cor N N N N N N N
Odor N N N N N N N Odor N N N N N N N
Legenda: N – normal; L – levemente modificado; M – modificado; I – intensamente modificado
A emulsão EC3 permaneceu estável em todos os critérios avaliados, sem
alteração de cor, odor e aspecto.
14.5.2 Determinação do valor de pH
Os valores de pH obtidos por potenciometria direta em dispersão aquosa da
emulsão EC3 (Figura 24), estão demonstrados na Tabela 25.
95
Figura 24 – Fotografia do pHmetro com a dispersão aquosa da emulsão EC3.
Tabela 25 – Valores de pH da emulsão EC3 durante o teste de estabilidade acelerado.
Tempo (dias)
Parametros Físicos
Ambiente Estufa Ciclo Geladeira Freezer Luz
1 6,42 6,37 6,29 6,37 6,38 6,40
7 6,36 6,37 6,32 6,37 6,38 6,43
15 6,34 6,44 6,41 6,27 6,42 6,31
30 6,46 6,31 6,43 6,32 6,43 6,32
45 6,45 6,32 6,49 6,41 6,41 6,29
60 6,37 6,37 6,44 6,31 6,32 6,34
90 6,36 6,36 6,42 6,44 6,41 6,37
Média 6,39 6,36 6,40 6,36 6,39 6,35
DP 0,048 0,042 0,070 0,059 0,037 0,051
CV 0,755 0,665 1,097 0,935 0,583 0,800
* Os valores de pH são a médias das triplicatas analisadas.
Legenda: DP – Desvio padrão da média; CV – coeficiente de variação
Em relação aos valores de pH (Figuras 25) os resultados demonstraram que
não ocorreram variações significativas durante o tempo avaliado, demonstrados por
um desvio padrão menor que 0,1 nas amostras e um coeficiente de variação menor
que 1,1% para as médias das análises.
Esses resultados são um indicativo da não formação de compostos de
degradação ácidos ou básicos e todos os valores de pH estão entre 6,0 e 6,5,
valores estes compatíveis com as matérias primas utilizadas e biocompatíveis com o
valor do pH fisiológico da pele (5,5 a 6,5).
96
Ao analisar o limite de variação de 10%, verificou-se que nenhum dos valores
de pH ultrapassou o limite superior de 7,01 e o inferior de 5,77 (Figura 25).
Figura 25 – (A) Valores de pH da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente (20º C), estufa (40º C) e luz indireta e (B) nas condições de armazenamento em ciclo (-5 e 20º C), geladeira (5º C) e freezer (-5º C), no teste de estabilidade preliminar.
5,8
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
1 7 15 30 45 60 90
Val
ore
s d
e p
H
Tempo (dias)
Teste de estabilidade aceleradoAnálise do pH
Ambiente
Estufa
Luz
5,8
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
1 7 15 30 45 60 90
Val
ore
s d
e p
H
Tempo (dias)
Teste de estabilidade aceleradoAnálise do pH
Ciclo
Geladeira
Freezer
A
B
97
14.5.3 Determinação da densidade
A densidade foi determinada pela técnica do picnometro, onde foi
determinado o peso da água e peso do creme, a relação entre as massas resultou
na densidade específica.
Os valores da densidade obtidos pela técnica do picnometro da emulsão EC3
estão demonstrados na Tabela 26 e nas Figuras 26 e 27.
Tabela 26 - Valores da densidade emulsão EC3 durante o teste de estabilidade preliminar.
Tempo (dias) Parâmetros Físicos
Ambiente Estufa Ciclo Geladeira Freezer Luz
1 0,926 0,912 0,922 0,915 0,926 0,920
7 0,945 0,933 0,945 0,916 0,935 0,923
15 0,915 0,916 0,932 0,928 0,922 0,924
30 0,922 0,934 0,922 0,911 0,944 0,918
45 0,934 0,943 0,933 0,906 0,933 0,922
60 0,943 0,922 0,945 0,917 0,914 0,933
90 0,923 0,934 0,922 0,903 0,912 0,942
Média 0,930 0,928 0,932 0,914 0,927 0,926
DP 0,011 0,011 0,010 0,008 0,012 0,009
CV 1,213 1,211 1,107 0,897 1,252 0,918
Figura 26 – Valores de densidade específica da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em temperatura ambiente (20º C), estufa (40º C) e luz indireta.
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1 7 15 30 45 60 90
De
nsi
dad
e (
g/m
L)
Tempo (dias)
Teste de estabilidade aceleradoAnálise da Densidade
Ambiente
Estufa
Luz
98
Figura 27 - Valores de densidade específica da emulsão EC3 nas condições de armazenamento em ciclo (-5 e 20 °C), geladeira (5 °C) e freezer (-5 °C), no teste de estabilidade preliminar.
Dentre os tipos de estabilidades, pode-se classificar duas, as físicas e as
químicas. A estabilidade física de uma emulsão é caracterizada pela manutenção de
suas propriedades originais, tais como, textura, uniformidade, cor e odor. As
emulsões mantêm estas características quando não ocorrem quebras
macroscópicas, que são dependentes, por exemplo, da densidade e da viscosidade
da amostra (BARZOTTO et al., 2009).
Analisando os resultados verificou-se que não houve alterações significativas
na densidade da emulsão EC3, os valores das densidades mantiveram-se dentro do
limite de variação de 10%.
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1 7 15 30 45 60 90
De
nsi
dad
e (
g/m
L)
Tempo (dias)
Teste de estabilidade aceleradoAnálise da Densidade
Ciclo
Geladeira
Freezer
99
15 CONCLUSÃO PARCIAL
Ambas as emulsões apresentaram-se estáveis ao teste de centrifugação, pois
não ocorreu separação e ou precipitação de fases, podendo prever que o produto
não irá separar em função do tempo.
Como apresentado nos resultados, apesar de as três emulsões apresentarem
estabilidade quanto ao teste de centrifugação, somente a EC3 foi escolhida para dar
continuidade aos testes de estabilidade. Ao se analisar visualmente e
sensorialmente as emulsões, a EC3 foi considerada a que apresentava as melhores
características de aparência, viscosidade e sensorial.
Quando realizados os testes de estabilidade em uma emulsão, está-se
simulando fatores que podem influenciar na estabilidade da mesma. O processo de
expor a emulsão a diferentes temperaturas tende a acelerar reações físico-químicas
que acarretam na instabilidade da formulação. Diante dos resultados apresentados
pode-se concluir que a emulsão EC3 manteve-se estável quando exposta aos testes
de estabilidade preliminar e acelerada.
Existem vários fatores externos que podem influenciar a estabilidade do
produto acabado, tais como material de acondicionamento e as condições
ambientais. Analisando os resultados a emulsão EC3, deve permanecer estável
mesmo quando industrializada e vendida ao consumidor.
100
CONCLUSÃO
O desenvolvimento de uma emulsão contendo extratos vegetais deve passar
por várias etapas de pesquisa, dentre elas, a proposição de um método extrativo
para a planta, a caracterização e padronização do extrato obtido, bem como a
escolha da formulação do novo cosmético.
Ao se avaliar os resultados obtidos neste trabalho pode-se concluir que:
O método de extração este apresentou resultados aceitáveis, quando
avaliado a partir da análise do teor de extrativos, demonstrando que o método
pode ser utilizado para a produção de extratos dos frutos de Physalis
angulata L.
A caracterização fitoquímica mostrou a presença de várias classes de
compostos e em especial os flavonóides e taninos, com ação antiinflamatória
e anti-séptica descritas na literatura para a Physalis angulata L.
A validação do método para quantificação de flavonóides totais expressos em
quercetina pode ser utilizado para a determinação da concentração de
flavonóides no extrato dos frutos de Physalis angulata L., pois demonstrou ser
linear, robusto, preciso e exato.
A emulsão escolhida para os testes de estabilidade preliminar e acelerada
demonstrou permacer estável em ambos, demonstrando que o produto é
estável e pode ser avaliado quanto a estabilidade no teste de prateleira e
microbiológico.
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que os ensaios
realizados garantem a estabilidade físico-química e a qualidade da emulsão com
extrato de Physalis angulata.
101
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ANEXOS Anexo 1
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Anexo 2
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