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UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
Utilização do Tanino como Fotossensibilizador na Terapia
Fotodinâmica contra Enterococcus faecalis
PAULA VANESSA DA SILVA
Orientadora: Prof.a Dra. Ângela Toshie Araki
Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Odontologia.
SÃO PAULO
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
S582u
Silva, Paula Vanessa da. Utilização de tanino como fotossensibilizador na terapia
fotodinâmica contra enterococcus faecalis / Paula Vanessa da Silva. -- São Paulo; SP: [s.n], 2014.
76 p. : il. ; 30 cm. Orientadora: Ângela Toshie Araki. Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Enterococcus faecalis
3. Endodontia 4. Azul de metileno. I. Araki, Ângela Toshie. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
CDU: 615.831:616.314(043.2)
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
Utilização do Tanino como Fotossensibilizador na Terapia
Fotodinâmica contra Enterococcus faecalis
PAULA VANESSA DA SILVA
Tese de doutorado defendida e aprovada
pela Banca Examinadora em 23/10/2014.
BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Ângela Toshie Araki
Universidade Cruzeiro do Sul
Presidente
Prof. Dr. Cacio Moura Netto
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr. Igor Prokopowitsch
Universidade Cruzeiro do Sul
Profa. Dra. Marina Beloti Ferreira
Universidade de São Paulo
Prof. Dr. Fábio Valverde Rodrigues Bastos Neto
Associação Paulista de Cirurgiões Dentistas
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus pais, Severino e Francisca
Por estarem sempre ao meu lado, pela educação que me proporcionaram e o
exemplo de família que construíram
Aos meus irmãos, Kátia, Cida, Silvano, Cláudia e Karla
Pelo carinho, respeito e confiança
Aos meus sobrinhos
Por tornarem os meus dias mais coloridos
Ao meu namorado, Sérvio Túlio
Pelas demonstrações diárias de AMOR e COMPANHEIRISMO, e por todos os
momentos inesquecíveis vividos e que viverei ao seu lado
À minha orientadora, Professora Dra. Ângela Toshie Araki Yamamoto
Pela confiança em mim depositada
Minha profunda gratidão!!!
AGRADECIMENTOS
Ao curso de pós-graduação em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul. Pela atenção e
dedicação, por todo o empenho demonstrado no decorrer do curso.
Aos meus companheiros no Doutorado: pelos momentos divertidos compartilhados durante essa
caminhada.
Aos professores do Curso de Doutorado em Odontologia, com área de concentração em
Laserterapia, que muito contribuíram para o meu aprendizado durante o curso.
Aos meus alunos da iniciação científica, por se mostrarem sempre disponíveis e me auxiliarem na
realização desta pesquisa
Aos funcionários da Universidade Cruzeiro do Sul, pela disponibilidade e atenção.
Ao Laboratório de Microbiologia das Faculdades Integradas de Patos-FIP, pela disponibilidade.
Ao Laboratório de Biologia da Uiversidade Potiguar -UNP, pelo preparo das substâncias.
Às minhas colegas professoras, pelo empenho e responsabilidade ao me substituir durante os
momentos em que precisei me ausentar.
Aos meus alunos, por compreenderem a minha ausência.
A todos que contribuíram de alguma forma para a realização desta pesquisa.
Silva PV. Utilização do tanino como fotossensibilizador na terapia fotodinâmica contra enterococcus faecalis [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2014.
RESUMO
O presente estudo teve como objetivo avaliar a redução microbiana após a terapia
fotodinâmica como coadjuvante ao preparo químico-cirúrgico, utilizando o tanino
hidrolizável como fotossensibilizador, em canais radiculares de dentes bovinos
contaminados com Enterococcus faecalis. Foram utilizados 60 dentes, divididos em
seis grupos, grupo 1, onde utilizou-se apenas o NaOCl a 2,5%, grupo 2, utilizou-se a
PDT com azul de metileno como fotossensibilizador, grupo 3, apenas o tanino,
grupo 4, utilizou-se PDT com tanino como fotossensibilizador, grupo 5, associou-se
ao NaOCL a 2,5%, a PDT com tanino e no grupo 6, associou-se ao NaOCL a 2,5% a
PDT com azul de metileno. Para a PDT utilizaram-se 3ml do fotossensibilizador na
concentração de 0,005% que permaneceram no interior do canal radicular por 5min.
Para a irradiação foi utilizado um laser semicondutor portátil (Laser DUO®, GaAlAs,
InGaAlP), comprimento de onda de 660 nm, potência de 100 mW, totalizando 1,8 J
de energia e tempo de irradiação de 180s. Após o PQC, foram realizadas três
coletas microbiológicas, denominadas inicial, intermediária e final. Após as coletas,
fez-se o plaqueamento para a contagem das UFC’s. Os resultados foram expressos
através das medidas estatísticas: média, desvio padrão, mediana, quartis e valores
mínimo e máximo. Foi utilizado o teste F (ANOVA), as comparações múltiplas de
Tamanhe e o teste de Kruswal-Wallis. A verificação da hipótese de normalidade foi
realizada através do teste de Shapiro-Wilk. O nível de significância estabelecido foi
de 5%. Verificou-se que a variação percentual da avaliação inicial para intermediária
foi menos elevada nos Grupos 2 e 3 e mais elevadas no Grupo 1. Na variação inicial
e final, verifica-se que a menor média ocorreu no Grupo 1, e foram mais elevadas no
Grupos 5 (98,33%) e Grupo 6 (88,76%) sendo verificadas diferenças significativas
entre os Grupos (p<0,001). Concluiu-se que terapia fotodinâmica, utilizando o tanino
hidrolizável como fotossensibilizador, mostrou-se eficaz, como coadjuvante ao
preparo químico-cirúrgico na redução microbiana, sendo este, uma alternativa dentre
os corantes a serem utilizados na PDT.
Palavras-Chave: Terapia fotodinâmica, Endodontia, Corantes, Tanino.
Silva PV. Use of tannin as a photosensitizer in photodynamic therapy against enterococcus faecalis [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2014.
ABSTRACT
The present study aimed to evaluate the microbial reduction after photodynamic
therapy as an adjunct to chemical-surgical preparation, using the hydrolyzable tannin
as a photosensitizer in root canals of bovine teeth infected with Enterococcus
faecalis. 60 teeth, divided into six groups, group 1, where we used only the 2.5%
NaOCl, group 2, was used to PDT with methylene blue as a photosensitizer, group 3,
only the tannin group 4 were used was used as tannin PDT with photosensitizer,
group 5, was associated with 2.5% NaOCl, PDT with tannin and group 6, was
associated with 2.5% NaOCl PDT with methylene blue. To PDT were used in 3 ml of
the photosensitizer in a concentration of 0.005% remaining in the root canal for 5
minutes. For the irradiation a laser portable semiconductor (laser DUO®, GaAlAs,
InGaAlP), wavelength 660 nm, power 100 mW, totaling 1.8 J of energy and
irradiation time of 180 seconds was used. After the PQC three microbiological
sampling, initial, intermediate and final named were performed. After collection, made
up plating to count UFC's. The results were expressed as statistical measures: mean,
standard deviation, median, quartiles and minimum and maximum values. The F-test
(ANOVA) for multiple comparisons and the Tamanhe of Kruswal-Wallis test was
used. The verification of the hypothesis of normality was performed using the
Shapiro-Wilk test. The significance level was set at 5%. It was found that the
percentage change from baseline to intermediate was lower in Groups 2 and 3, and
higher in Group 1 in initial and final variation, it appears that the smallest average
occurred in Group 1, and were higher in 5 Groups (98.33%) and Group 6 (88.76%)
significant difference was seen between the Groups (p <0.001). It was concluded that
photodynamic therapy using hydrolyzable tannin as a photosensitizer, was effective
as an aid to chemical-surgical preparation on microbial reduction, this being an
alternative among the dyes to be used in PDT.
Keywords: Photodynamic therapy, Endodontics, Dyes, Tannin.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Dente bovino com selamento apical ..................................................... 45
Figura 2 Frascos contendo os espécimes .......................................................... 45
Figura 3 Câmara de fluxo laminar. ....................................................................... 47
Figura 4 Dentes bovinos dispostos na plataforma metalica. ............................ 47
Figura 5 Coleta microbiológica com cone de papel absorvente ....................... 50
Figura 6 Eppendorf contendo cone de papel após a coleta microbiológica .... 51
Figura 7 Incubação dos espécimes; Armazenagem dos espécimes. ............... 52
Figura 8 Agitador. .................................................................................................. 52
Figura 9 Diluição e plaqueamento em triplicata ................................................. 53
Figura 10 Placas contendo UFC’s .......................................................................... 53
Gráfico 1 Média do número de colônias de bactérias (x 2 x 102) ....................... 57
Gráfico 2 Mediana do número de colônias de bactérias (x 2 x 102) ................... 58
Gráfico 3 Média da variação percentual entre a avaliação e as outras duas
avaliações segundo o grupo ................................................................. 60
Gráfico 4 Mediana da variação percentual entre a avaliação e as outras duas
avaliações segundo o grupo ................................................................. 60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição dos grupos ........................................................................ 46
Tabela 2 Estatística do número de colônias (x 2 x 102) segundo o grupo e o
tempo de avaliação ................................................................................ 56
Tabela 3 Estatísticas das variações percentuais entre a avaliação inicial com
cada avaliação em relação ao número de colônias segundo o grupo
................................................................................................................. 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PDT Photodinamic therapy
μg/ml Micrograma por mililitro
AsGAAl Arseneto de gálio e alumínio
E. faecalis Enterococcus faecalis
BHI Brain heart infusion
Ca(OH)2 Hidróxido de cálcio
CP Comprimento de patência
CRT Comprimento real de trabalho
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
FS Fotossensibilizador
J Joules
J/cm2 Joules por centímetro quadrado
MEV Microscopia eletrônico de varredura
MTAD Mixture of a Tetracycline Isomer, an Acid, and a Detergent
mW MiliWatt
N/cm Newton por centímetro
NaOC Hipoclorito de sódio
NiT Níquel-titânio
Nm Nanômetro
Pasta HPG Pasta de hidróxido de cálcio, paramonoclorofenol canforado e glicerina
PBS Phosphate-buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
PQC Preparo químico-cirúrgico
rpm Rotação por minuto
SCR Sistema de canais radiculares
TFD Terapia fotodinâmica
UFC Unidade formadora de colônia
DNA ácido desoxirribonucléico
Ca(OH)2 hidróxido de cálcio
pH potencial hidrogeniônico
NiTi Níquel- titânio
MB Azul de metileno
TBO Azul de toluidina
CNV Neovascularização coloidal
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 13
2 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................... 16
2.1 Microbiologia Endodôntica ........................................................................ 16
2.2 Preparo Químico-Cirúrgico (PQC) ............................................................. 18
2.2.1 Efeito Mecânico .......................................................................................... 18
2.2.2 Efeito Químico ............................................................................................ 19
2.3 A Terapia Fotodinâmica ............................................................................. 22
2.3.1 Histórico ...................................................................................................... 22
2.3.2 Mecanismo de interação ............................................................................ 24
2.3.3 Efeitos fototóxicos da PDT ........................................................................ 26
2.3.4 Tempo de pré- irradiação ........................................................................... 27
2.3.5 Fotossensibilizadores ................................................................................ 28
2.3.6 Fontes de energia ....................................................................................... 36
2.3.7 Pesquisas com PDT na Endodontia .......................................................... 37
3 OBJETIVOS ................................................................................................. 43
3.1 Objetivo Geral ............................................................................................. 43
3.2 Objetivos Específicos ................................................................................ 43
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 44
4.1 Tipo e Local do Estudo .............................................................................. 44
4.2 Instrumentos ............................................................................................... 44
4.2.1 Microrganismo e meio de cultura .............................................................. 44
4.2.2 Preparação dos espécimes ....................................................................... 44
4.2.3 Contaminação dos espécimes com Enterococcus faecalis ................... 45
4.3 Condições Experimentais .......................................................................... 46
4.3.1 Preparo Químico-Cirúrgico e Terapia Fotodinâmica ............................... 46
4.3.2 Grupo Controle: NaOCL a 2,5% ................................................................. 48
4.3.3 Grupo 2: PDT com Azul de Metileno ......................................................... 48
4.3.4 Grupo 3: Tanino .......................................................................................... 48
4.3.5 Grupo 4: PDT com Tanino ........................................................................ 49
4.3.6 Grupo 5: NaOCL + PDT com Tanino ........................................................ 49
4.3.7 Grupo 6: NaOCL + PDT com Azul de Metileno ........................................ 49
4.3.8 Coletas Microbiológicas: ........................................................................... 50
4.3.9 Análise Estatística ...................................................................................... 54
5 RESULTADOS ............................................................................................. 55
6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 61
7 CONCLUSÃO............................................................................................... 68
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 69
13
1 INTRODUÇÃO
A Endodontia é uma especialidade que envolve a etiologia, a prevenção, o
diagnóstico e o tratamento das alterações patológicas do endodonto e da região
apical e periapical. O objetivo do tratamento endodôntico consiste em eliminar ou
reduzir ao máximo o número de microrganismos do interior do sistema de canais
radiculares (SCR), respeitando a complexa anatomia do referido sistema (SIQUEIRA
et al., 1999). A patologia a ser tratada pelo endodontista é a lesão pulpo-periapical,
já estando bem estabelecida a relação de causa e efeito entre os microrganismos e
o desenvolvimento dessa lesão (KAKEHASHI et al., 1965; SUNDQVIST, 1976;
MÖLLER et al., 1981).
O controle microbiológico deve ocorrer em todas as etapas do tratamento,
sendo estas, elos importantes, e devem ser realizadas em um correto protocolo de
execução que envolve desde a abertura coronária, até o selamento tridimensional do
sistema de canais radiculares, conseguido com a obturação endodôntica.
(SIQUEIRA et al., 2004; BERGMANS et al., 2008).
O preparo químico-cirúrgico (PQC) é fundamental para o sucesso dos
tratamentos endodônticos, visando a limpeza e modelagem do canal radicular, a fim
de se obter um canal radicular livre de conteúdos irritantes e com um formato cônico
afunilado com maior diâmetro coronário e menor diâmetro apical. (ALMYROUDI et
al., 2002; DAMETTO et al., 2010).
Além da ação mecânica dos instrumentos, substâncias químicas auxiliares
devem ser associadas aos meios mecânicos durante o preparo químico-cirúrgico,
para facilitar a ação do instrumento, a fim de promover auxílio indispensável à
sanificação do complexo endodôntico. Estas substâncias são utilizadas antes,
durante e após a instrumentação do canal para que no ato da aspiração, os detritos
presentes sejam removidos e o número de bactérias seja reduzido, proporcionando
uma correta limpeza e desinfecção dos canais. (SEAL et al., 2002).
A solução de hipoclorito de sódio (NaOCl), em diferentes concentrações, é a
substância mais utilizada como solução irrigadora, uma vez que, além de possuir
14
propriedades clareadoras e de dissolução dos tecidos (GOMES et al., 2006), tem-se
mostrado efetivo como agente antimicrobiano (BONSOR et al., 2006a). Porém,
apresenta a desvantagem de ter efeito oxidativo nos tecidos vitais da região
periapical, desencadeando uma reação inflamatória (BERGMANS et al., 2006). E a
capacidade de o NaOCl remover smear layer tem se mostrado deficiente
(BAUMGARTNER et al., 2007; FIMPLE et al., 2008).
Maior parte das falhas no tratamento endodôntico vem da permanência de
conteúdo infectante no interior dos canais. O Enterococcus faecalis (E. faecalis),
microrganismo anaeróbio facultativo, tem sido a espécie mais prevalente em casos
de insucesso endodôntico.
As técnicas atuais para a desinfecção do SCR incluem a instrumentação, a
irrigação com agentes antimicrobianos e a medicação intracanal (SIQUEIRA et al.,
2004d). No entanto, novos procedimentos para aprimorar a desinfecção do SCR
vêm sendo desenvolvidos, dentre os quais o uso do laser de baixa potência
associado ao fotossensibilizador na terapia fotodinâmica (SEAL et al., 2002;
BONSOR et al., 2006; FONSECA et al., 2008; GARCEZ et al., 2008).
A Terapia Fotodinâmica, também conhecida como PDT, acrônimo de
Photodynamic Therapy, surge como uma promissora terapia antimicrobiana. Envolve
a utilização de um fotossensibilizador (corante), que é ativado pela luz de um
específico comprimento de onda na presença de oxigênio. A transferência de
energia do fotossensibilizador ativado para o oxigênio disponível resulta na formação
de espécies tóxicas de oxigênio, conhecido como oxigênio singleto e radicais livres.
Estes são espécimes químicos altamente reativos que danificam proteínas, lipídios,
ácidos nucléicos e outros componentes celulares microbianos (KONOPKA;
GOSLINSKI, 2007).
Para tanto, diversos corantes vêm sendo testados, nas cores roxa, marrom,
verde, entre outras. A busca de agentes fotossensibilizadores tem sido uma
constante no campo da PDT, tanto para o tratamento do câncer, como para a
redução de microrganismos. Corantes menos tóxicos, mais ressonantes com o
comprimento de onda emitido pelos lasers têm sido o ideal de diversos
pesquisadores. (CARSON et al., 2005).
15
Na endodontia, os fotossensibilizadores derivados das fenotiazinas têm sido
amplamente empregados nas pesquisas envolvendo PDT. O azul de metileno tem
sido o principal fotossensibilizador utilizado como alvo para microrganismos da
microbiota endodôntica (CASTRO at al., 2006).
Taninos, do francês tanin, são os compostos fenóis, corantes naturais que
estão entre os maiores constituintes ativos derivados dos vegetais, justificando o uso
tradicional das plantas como antinflamatórios e cicatrizantes. Quando condensados,
originam um precipitado vermelho e, em solução, desenvolvem coloração verde ou
azul (ASONGALEM et al., 2004)
Com o propósito de buscar novas formas terapêuticas, que apresentem
menor toxicidade, maior potencial antimicrobiano, sobretudo contra o E. faecalis, e
baixo custo no tratamento endodôntico, é objetivo deste trabalho quantificar a
redução da carga bacteriana de canais radiculares de dentes bovinos contaminados
por uma cepa (isolado endodôntico) de E. faecalis, aplicando a PDT, como
coadjuvante ao preparo químico-cirúrgico, utilizando o tanino como
fotossensibilizador.
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Microbiologia Endodôntica
Bactérias e seus subprodutos desempenham um importante papel no
desenvolvimento e na manutenção das lesões perirradiculares (MÖLLER et al.,
1981). A composição da microbiota e a sua localização no interior do canal radicular
dependem da disponibilidade de oxigênio, do acesso e da disponibilidade de
nutriente, do sinergismo e/ou competição entre espécies e das defesas do
hospedeiro (HAAPASALO et al., 2005).
Na infecção endodôntica, a maioria das células bacterianas encontra-se em
suspensão no canal principal, mas podem ocorrer grandes aglomerações
bacterianas aderidas às paredes do canal, formando um biofilme de multicamadas e
multiespécies, estabelecendo-se assim, portanto, uma comunidade clímax. As
bactérias desses aglomerados podem estender-se para o interior dos túbulos
dentinários, o que provoca uma infecção intratubular (SIQUEIRA et al., 2004c).
Na infecção primária, as condições favorecem a presença de bactérias
anaeróbias estritas, presentes em combinações de dez a vinte espécies. As mais
comumente encontradas pertencem aos gêneros Fusobacterium, Prevotella,
Porphyromonas, Treponema, Tannerella, Streptococcus, Peptostreptococcus,
Eubacterium, Propionibacterium, Campylobacter, Selenomonas e Actinomyces
(SIQUEIRA; RÔÇAS, 2005).
Siqueira et al. (2002a) analisaram o padrão da infecção primária de quinze
dentes unirradiculares recém-extraídos com lesão perirradicular aderidas aos
respectivos ápices. Esses dentes foram submetidos ao microscópio eletrônico de
varredura, sendo então observada intensa colonização bacteriana, com predomínio
da forma cocos, constatando-se, ainda ocasionalmente, a presença de fungos. O
padrão de colonização demonstrou uma organização de comunidade clímax em
alguns casos, com penetração de bactérias nos túbulos dentinários.
Utilizando o método da reação em cadeia da polimerase (PCR) para
investigar a prevalência de patógenos endodônticos na porção apical das raízes de
17
dentes extraídos com lesões perirradiculares, Siqueira et al. (2004b) detectaram a
presença de Pseudoramibacter alactolyticus em 44% dos casos, Treponema
denticola em 26%, Fusobacterium nucleatum em 26%, Porphyromonas endodontalis
em 17%, Filifactor alocis em 9%, Dialister pneumosintes em 4%, Porphyromonas
gingivalis em 4% e Tannerella forsythensis em 4%.
Souza et al. (2005), utilizando a técnica do checkerboard para hibridização
DNA-DNA, observaram uma incidência de 100% de Fusubacterium nucleatum ss.
vincentii em dentes com infecção primária, bem como uma grande prevalência de
Capnocytophaga sputigena, Capnocytophaga ochracea, Streptococcus constellatus,
Veillonella parvula, P. gingivalis, Prevotella melaninogenica e Streptococcus
sanguinis. As conclusões desse estudo confirmam a constatação de ser
polimicrobiana a infecção endodôntica, com predomínio de anaeróbios estritos.
No estudo realizado por Chu et al. (2005), os autores observaram que os
gêneros prevalentes foram Prevotella, Peptostreptococcus, Actinomyces e
Campylobacter, bem como que a quantidade média de espécies por canal foi de 4,6.
Esse estudo também confirmou a natureza polimicrobiana da infecção endodôntica
primária, com predomínio de espécies Gram-negativas.
Enterococcus faecalis, uma espécie bacteriana Gram-positiva anaeróbia
facultativa, é muito associada à persistência da infecção intra-radicular. A alta
resistência do E. faecalis ao hipoclorito de sódio (NaOCl) e ao hidróxido de cálcio
[Ca(OH)2] pode resultar na sua permanência após o término do tratamento
endodôntico e por isso essa espécie bacteriana está associada a infecções
persistentes (EVANS et al., 2002).
Essa espécie pode ser encontrada em monoinfecção ou estar associada a
poucas espécies, além de ser capaz de sobreviver por longos períodos sem
nutrientes. Sua alta resistência aos medicamentos utilizados durante a terapia
endodôntica, principalmente à ação antimicrobiana da pasta de Ca(OH)2 usada
como medicação intracanal, é proporcionada pela sua capacidade de sobreviver em
ambientes com pH alcalino (STUART et al. 2006).
Evans et al. (2002) observaram que o E. faecalis é resistente ao Ca(OH)2
quando este, está com pH 11,1 ou menos. Quando ocorre uma elevação no pH do
18
meio, a bactéria tende a preservar seu pH intracelular através de uma bomba de
prótons. O correto funcionamento dessa bomba é crítico para a sobrevivência do E.
faecalis em ambientes alcalinos e quando o pH atinge 11,5, esse mecanismo
mostra-se sobrecarregado, o que leva à morte do microrganismo.
Os microrganismos estabelecidos no interior do SCR não podem ser atingidos
pelos mecanismos de defesa do hospedeiro. Por isso, as infecções de origem
endodôntica devem ser tratadas tanto por procedimentos mecânicos quanto por
substâncias químicas (DAMETTO et al., 2010).
2.2 Preparo Químico-Cirúrgico (PQC)
O objetivo do tratamento endodôntico consiste em eliminar ou reduzir o
número de bactérias no interior do SCR. Essa redução é conseguida pelo preparo
químico-cirúrgico do SCR, auxiliado pelo uso da medicação intracanal (SIQUEIRA et
al.,1997). Sabe-se que nenhum protocolo atual é capaz de eliminar por completo os
microrganismos do interior do canal de modo a torná-lo estéril. Por isso, vários
estudos científicos buscam técnicas com o objetivo de reduzir ao máximo a infecção
do canal radicular (BYSTRÖM; SUNDQVIST, 1983).
2.2.1 Efeito Mecânico
Byström & Sundqvist (1981) analisaram a redução microbiana de canais
infectados após a realização do PQC com instrumentos manuais de aço inoxidável e
solução salina. Observaram que o procedimento foi eficaz na redução da contagem
de microorganismos do interior dos canais radiculares, mas metade dos casos
permaneceu apresentando bactérias viáveis.
Dalton et al. (1998) compararam a redução bacteriana do interior de canais
radiculares irrigados com solução salina e preparados com instrumentos rotatórios
de níquel-titânio (NiTi) taper 0,04 e pela técnica step-back com instrumentos de aço
inoxidável. Amostras foram coletadas antes, durante e depois do PQC. Os autores
observaram que, com o aumento progressivo do calibre dos instrumentos, a redução
microbiana foi uniforme e progressiva, independentemente da técnica utilizada. Os
resultados desse estudo indicaram não haver diferença estatística significativa entre
19
as técnicas quanto à capacidade de redução bacteriana intracanal, e que nenhuma
das técnicas conseguiu debelar totalmente as bactérias do interior dos canais
radiculares.
Com o intuito de estudar os efeitos mecânicos da instrumentação e da
irrigação, Siqueira et al. (1999) inocularam E. faecalis em dentes extraídos e os
instrumentaram com instrumentos manuais Nitiflex, GT e Profile série 29 (taper
0,06), irrigando-os com solução salina. A instrumentação com Nitiflex número 30 foi
significativamente mais eficaz do que a utilização dos instrumentos GT. Não
encontraram os autores diferença estatística quando compararam os efeitos da
Profile número 5 com a GT e com a Nitiflex número 30. O preparo apical, até a lima
Nitiflex número 40, foi significativamente mais eficaz na eliminação de bactérias do
que as outras técnicas e instrumentos testados. Os resultados desse estudo
mostraram que a instrumentação e a irrigação através da ação do fluxo e refluxo
podem remover mecanicamente mais de 90% das células bacterianas do interior do
canal radicular.
Em um estudo in vitro, Colak et al. (2005) analisaram a redução bacteriana
intracanal em canais inoculados com E. faecalis e instrumentados com instrumentos
manuais de aço inoxidável Hedströem, com limas Hedströem adaptadas ao motor de
rotação alternada Giromatic e com instrumentos rotatórios de NiTi Hero 642. Solução
salina estéril foi usada como solução irrigadora, e amostras foram coletadas antes e
depois do PQC. Todos os instrumentos testados revelaram-se aptos a reduzir o
número de células bacterianas do interior dos canais radiculares, não havendo
diferença estatística significativa entre eles, observando-se, contudo, que nenhuma
técnica neutralizou por completo a presença bacteriana.
2.2.2 Efeito Químico
A irrigação desempenha um importante papel na eliminação dos
microorganismos do canal radicular. Os irrigantes são usados durante o tratamento
endodôntico, com o objetivo de remover debris, lubrificar paredes dentinárias,
dissolver matéria orgânica e atuar como antibacteriano (SIQUEIRA et al., 2000;
SIQUEIRA et al., 2002b).
20
Os procedimentos de limpeza e desinfecção do SCR, por sua vez, estão
diretamente relacionados com efeitos químicos e mecânicos dos irrigantes. O efeito
mecânico da irrigação é gerado pela ação de fluxo e refluxo da solução no interior do
canal radicular (SIQUEIRA et al., 2000).
A escolha do agente irrigante a ser usado deve levar em consideração uma
combinação de várias propriedades, como ação antimicrobiana, capacidade de
dissolução do tecido pulpar e compatibilidade biológica com os tecidos
perirradiculares (ESTRELA et al., 2003).
O NaOCl é amplamente recomendado como irrigante no preparo químico-
cirúrgico dos SCR, devido à sua capacidade solvente de tecidos necrosados e vivos,
bem como a suas propriedades antibacterianas. Essa solução reage com os debris
orgânicos do interior do SCR, o que facilita a limpeza, mas essa reação inativa o
hipoclorito de sódio e reduz sua capacidade antibacteriana, razão por que a solução
de hipoclorito de sódio do interior do canal radicular deve ser sempre renovada
(AYHAN et al., 1999; ESTRELA et al., 2002).
Quando o NaOCl reage com a água, há a formação de hidróxido de sódio e
ácido hipocloroso (LOPES et al., 2004b). O ácido hipocloroso contém cloro ativo que
funciona como um forte agente oxidante, sendo o responsável pelo efeito
antimicrobiano através da oxidação de um grupo de enzimas importantes para o
metabolismo das bactérias (AYHAN et al., 1999; SIQUEIRA et al., 2000; ESTRELA
et al., 2002).
Byström & Sundqvist (1983) observaram uma considerável redução na
quantidade de bactérias do canal radicular após o preparo químico-cirúrgico, com o
uso de uma substância sem poder antibacteriano, mas o preparo com NaOCl a 0,5%
se mostrou mais eficaz. Segundo os mesmos autores (1985), não existe diferença
no efeito antibacteriano da irrigação com NaOCl a 0,5% e a 5%. Além disso,
observaram maior eficácia no uso combinado do EDTA com NaOCl a 5% do que na
utilização exclusiva do NaOCl. Notaram também que as bactérias sobreviventes à
instrumentação e irrigação apresentavam um rápido crescimento quando nenhuma
medicação intracanal era empregada.
21
No estudo realizado por Siqueira et al. (2000), os autores observaram que as
concentrações de NaOCl nas soluções testadas (a 1%, 2,5% e 5,25%) não
apresentaram diferença estatística significativa quanto à capacidade de remoção de
E. faecalis do interior de canais de dentes extraídos. Esses resultados sugerem que
a irrigação frequente e abundante com a concentração mais fraca de NaOCl é
suficiente para a eliminação dos microorganismos do interior do canal radicular,
questionando a necessidade do uso de soluções mais concentradas.
Gomes et al. (2001) testaram a capacidade antibacteriana do NaOCl nas
concentrações de 0,5%, 1%, 2,5%, 4% e 5,25%, bem como da clorexidina gel e
líquida com 0,2%, 1% e 2% de concentração em poços com suspensões de células
de E. faecalis em cloreto de sódio (NaCl) em diferentes tempos. Observaram que
todos os irrigantes foram eficazes contra a bactéria estudada, sendo os mais ativos
a clorexidina líquida em todas as concentrações e o NaOCl a 5,25%. Observou-se
também que o tempo necessário para a eliminação do microrganismo depende da
concentração do irrigante utilizado.
Peters et al. (2002), em um estudo in vivo, observaram que, após o PQC e a
irrigação com NaOCl a 2%, houve uma redução significativa de bactérias em relação
à contagem inicial, e 76% dos dentes apresentaram cultura negativa após esse
preparo.
Sassone et al. (2003) avaliaram o crescimento de staphylococcus aureus, e.
faecalis, escherichia coli, p. gingivalis e f. nucleatum após contato com NaOCL a 1%
e a 5% e com clorexidina a 0,12%, a 0,5% e a 1%. a clorexidina a 0,12% não
eliminou o e. faecalis, enquanto a clorexidina a 1% e o NaOCl a 1% e a 5%
eliminaram todos os microrganismos.
Dametto et al. 2010, avaliaram a redução microbiana em 20 dentes bovinos
contaminados com E. faecalis, comparando o NaOCl a 2,5% e Digluconato de
Clorexidina Líquida a 2%. Todos os espécimes foram instrumentados, através da
técnica de instrumentação manual escalonada coroa-ápice, com limas tipo K file
(Dentsply Maillefer; Baillaigues, Switzerland) até a lima #120 com comprimento real
de trabalho de 20mm, previamente determinado, através da odontometria visual.
Para irrigação, durante o PQC, foi utilizada seringa plástica estéril e agulha Endo-
22
Eze em aço inoxidável da Ultradent , de diâmetro 30 Gauge e de comprimento
médio de 24mm, sendo calibradas em 20mm, correspondentes ao CRT. Ao final do
PQC, todos os elementos foram irrigados com 10 ml de soro fisiológico para
remoção da solução testada e, posteriormente, foram feitas as coletas
microbiológicas. O NaOCL a 2,5% mostrou-se mais eficaz que o Digluconato de
Clorexidina Líquida a 2%.
A seringa, a agulha e a sua profundidade de inserção durante a irrigação,
também constitui um fator relevante na redução da contagem bacteriana intracanal.
Sedgley et al. (2005) demonstraram que 6 ml de irrigante é significativamente menos
eficaz quando a agulha de irrigação é posicionada a 5 mm do Comprimento Real de
Trabalho (CRT), em comparação quando posicionada a 1 mm do Comprimento Real
de Trabalho (CRT).
Devido à toxicidade do NaOCl, diversas soluções estão sendo testadas para
substituí-lo na irrigação do SCR, ou para serem coadjuvantes ao PQC,
potencializando o efeito antimicrobiano nesta fase do tratamento endodôntico
(SASSONE et al., 2003; CARSON et al., 2005; HAAPASALO et al., 2005; ZEHNDER
et al., 2006; DAMETTO et al., 2010).
2.3 A Terapia Fotodinâmica
2.3.1 Histórico
O termo “Terapia Fotodinâmica” é relativamente novo, mas a modalidade de
tratamento que combina a administração da droga e subsequente exposição à luz
solar é muito antiga. Existem relatos do uso de plantas ou extratos ingeridos
oralmente e luz solar para tratar doenças de pele (SETUBAL et al., 2007).
A utilização da luz como agente terapêutico tem sido empregada no
tratamento de doenças desde a antiguidade. No Egito, Índia, e China, utilizava-se a
luz solar para tratamento de doenças da pele como psoríase, vitiligo, e câncer. O
famoso médico grego Heródoto, enfatizava a importância da exposição à luz solar
para restauração da saúde (FONSECA et al.,2008).
23
O conceito de morte celular induzida pela interação de luz e substâncias
químicas é reconhecido há mais de 100 anos. No ano de 1900, as primeiras
experiências com tratamento fotodinâmico foram relatadas por Oscar Raab, um
estudante de medicina, e seu professor, Herman Von Tappeiner em Munique. Eles
estudaram o efeito do corante de acridina sobre culturas de paramécios, e
descobriram que a combinação do corante de acridina e luz foi letal para os
mesmos. Durante uma tempestade com ocorrência de muitos raios, houve alteração
das condições luminosas do ambiente no momento dos experimentos, transferência
da energia da luz para a substância química,
similar ao que ocorre nas plantas pela absorção da luz pela clorofila. Nem a
luz ou o corante isoladamente tiveram qualquer efeito aparente sobre os
paramécios, mas, juntos, eles foram altamente citotóxico (DONNELLY et al., 2008) .
De acordo com o autor supracitado, os corantes inicialmente empregados em
PDT, eosina e acridina, foram logo abandonados devido à sua toxicidade e
carcinogênese. Em 1911 Hausmann e Meyer-Betz reportaram a fototoxicidade
distinta da hematoporfirina e em 1913, Meyer-Betz se auto injetou 200mg do que se
pensava ser a hematoporfirina pura, e não sentiu nenhum efeito até que expôs-se à
luz solar, em consequência, sofreu inchaço severo e fotossensibilidade que duraram
vários meses.
No fim dos anos 60, houve um tratamento bem sucedido de uma mulher
exibindo metástase de câncer de mama com um derivado na hematoporfirina, a
HpD. Testes clínicos utilizando várias preparações do HpD foram iniciados no início
da década de 70. Dougherty et al. (1975), reportaram que o HpD em combinação
com a luz vermelha poderia erradicar o crescimento do tumor mamário em ratos.
Weishaupt et al. (1976) utilizaram a PDT como coadjuvante à terapia
antimicrobiana em ratos. A FDA (Food and Drug Administration/ EUA) aprovou, em
1998, a PDT para o tratamento do câncer e, posteriormente, huve aprovação na
Holanda, Japão, França, Itália e Alemanha.
No Brasil, a implantação da PDT envolveu no início, os físicos do Instituto de
Física de São Carlos (USP) e médicos do Hospital Amaral Carvalho de Jaú, São
Paulo. Surgiu então, de forma conjunta, a decisão de implantar no Brasil esta nova
24
modalidade terapêutica para o tratamento do câncer e como terapêutica
antimicrobiana. Até então, as várias iniciativas no país tinham sido bastante isoladas
e de caráter não-clínico. Uma equipe composta por médicos, físicos, cirurgiões-
dentistas e biomédicos se uniu para dar início à implantação clínica. (ALLISON et al.,
2004).
Desde então, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido utilizada clinicamente
para o tratamento de diversas doenças malignas e é uma terapia aprovada para a
destruição de neovascularização coroidal (CNV) em degeneração macular
relacionada com a idade (RYSKOVA et al., 2010).
No entanto, apenas recentemente, com o início da busca por tratamentos
alternativos contra agentes patogênicos resistentes aos antibióticos, a terapia
fotodinâmica (PDT) tem sido investigada mais profundamente ( DAY et al., 2012).
2.3.2 Mecanismo de interação
A Terapia Fotodinâmica, também conhecida como PDT, acrônimo de
Photodynamic Therapy, surge como uma promissora terapia antimicrobiana. Envolve
a utilização de um fotossensibilizador (corante), que é ativado pela luz de um
específico comprimento de onda na presença de oxigênio. A transferência de
energia do fotossensibilizador ativado para o oxigênio disponível resulta na formação
de espécies tóxicas de oxigênio, conhecido como oxigênio singleto e radicais livres.
Estes são espécimes químicos altamente reativos que danificam proteínas, lipídios,
ácidos nucléicos e outros componentes celulares microbianos (FIMPLE et al., 2008).
É importante que a fonte de luz seja ressonante com o corante para que a
PDT seja efetiva na inviabilização de células. A maioria das bactérias orais não
absorve a luz visível de lasers que operam em baixa potência, com exceção de
alguns microrganismos gram-positivos, Actinomyces odontolyticus e Porphyromonas
gingivalis, que sintetizam porfirinas endógenas. A utilização de um agente de
absorção óptica, não tóxico, que se fixe à parede celular bacteriana, atraindo para si
a luz laser, é necessária para que ocorra a ação antimicrobiana sobre as bactérias
orais (KONOPKA et al., 2008).
25
Quando uma molécula aromática absorve luz de certa quantidade de energia,
ela pode sofrer transição eletrônica ao estado excitado singleto (spin eletrônico
emparelhado). Dependendo da estrutura molecular e do ambiente, a molécula pode
perder sua energia por processos físicos ou eletrônicos, retornando ao seu estado
fundamental, ou pode sofrer transição ao estado excitado tripleto (spin eletrônico
desemparelhado). Neste estágio, a molécula pode sofrer novamente decaimento
eletrônico e retornar ao seu estado fundamental, sofrer reação redox com o
ambiente ou sua energia de excitação ser transferida ao oxigênio molecular
conduzindo a formação do oxigênio singleto instável (LAM et al., 2011).
Ainda, segundo o autor supracitado, neste estágio, a molécula pode sofrer
novamente decaimento eletrônico e retornar ao seu estado fundamental, sofrer
reação redox com o ambiente ou sua energia de excitação ser transferida ao
oxigênio molecular conduzindo a formação do oxigênio singleto instável. A
habilidade da molécula em formar reação redox ou oxigênio singleto depende da
produção suficiente de moléculas no estado tripleto, que por sua vez depende da
taxa de decaimento de ambos estados tripleto e singleto inicialmente formados.
Segundo Machado (2012), a reação envolvida decorre primariamente da
excitação eletrônica do corante pela luz, seguida de dois mecanismos principais de
reação a partir do seu estado excitado. Na reação do tipo I, ocorre transferência de
elétron entre o fotossensibilizador no estado tripleto excitado e, componentes do
sistema, gerando íons-radicais, que tendem a reagir com o oxigênio no estado
fundamental, resultando em produtos oxidados, como peróxido de hidrogênio, íons
hidroxila, radicais hidroxila, ânion superóxido, que são tóxicos aos microrganismos.
Na reação do tipo II, ocorre transferência de energia do fotossensibilizador no estado
tripleto, com a geração de oxigênio singleto, um agente altamente citotóxico. Em
PDT é difícil fazer distinção entre os dois tipos de mecanismos, mas em ambos, o
mecanismo de dano á célula alvo é dependente da tensão de oxigênio e
concentração do fotossensibilizador. A reação do tipo II é considerada como a
predominante no dano fotooxidativo às células microbianas.
No caso dos fotossensibilizadores, é importante que o estado tripleto seja
bem povoado (presença de muitos elétrons / fótons) e relativamente, de maior
duração. Se isto ocorrer, o fotossensibilizador excitado terá tempo de reagir com seu
26
ambiente (transferência eletrônica / reações redox) ou transferir sua energia de
excitação a uma molécula de oxigênio e produzir o altamente reativo oxigênio
singleto. Assim o fotossensibilizador danifica os alvos biológicos principalmente por
oxidação. O importante em PDT é a capacidade de excitar o fotossensibilizador em
seu alvo e com mínimo de dano no tecido circunvizinho (CASTANO et al., 2013).
2.3.3 Efeitos fototóxicos da PDT
A PDT é um tratamento de câncer e antimicrobiano, que requer a exposição
de células e tecidos a uma droga fotossensibilizante, seguida pela irradiação com luz
de comprimento de onda apropriado, usualmente na região do vermelho ou infra-
vermelho próximo e compatível com o espectro de absorção do fotossensibilizador.
(KRAMMER-MAREK et al., 2006).
A morte das células pelo agente citotóxico (oxigênio singleto ou ROS) pode se
dar pela indução de apoptose ou necrose, reações inflamatórias, reações imunes,
além da ocorrência de danos aos à vasculatura do tumor ou da célula-alvo,
resultando em morte por indução da hipóxia ou inanição. A PDT é um tratamento
adequado para doenças localizadas. A luz empregada para excitar os
fotossensibilizadores atuais pode provocar necrose fotoquimicamente induzida em
até um máximo de 10nm. Uma grande vantagem da penetração limitada da luz é
que isso protege o tecido normal saudável sob o tumor da fototoxicicidade.
(TRIESSCHEIZN et al., 2006).
Uma vez dentro da célula, a maioria dos fotossensibilizadores não se acumula
no núcleo celular, eles se ligam a matrizes celulares apolares como lisossomos,
mitocôndrias e/ou membranas plasmáticas. O oxigênio singleto e outras espécies de
ROS produzidos por PDT nas membranas causam dano foto-oxidativo a proteínas e
lipídios que residem a poucos nanômetros dos locais de ligação do
fotossensibilizador. (SIMPLICIO et al., 2002).
A destruição microbiana proporcionada pela PDT em nível molecular é bem
estabelecida em muitos casos. A reação do tipo I com água em meio microbiano
pode elevar os radicais hidroxila, que podem reagir com biomoléculas ou combinar-
se para formar peróxido de hidrogênio in situ. Os subsequentes resultados
27
citotóxicos incluem a remoção de hidrogênio de moléculas insaturadas como os
fosfolipídios da membrana citoplasmática bacteriana, alterando a permeabilidade e
integridade da membrana. A inativação de enzimas da membrana e receptores
também é possível. (DONELY et al., 2008).
Na reação do tipo II, o fotossensibilizador no estado tripleto transfere sua
energia para o oxigênio molecular, formando in situ o oxigênio singleto, que então
reage rapidamente com componentes celulares como a parede celular, ácido
nucléico, peptídeos e moléculas envolvidas na manutenção estrutura da parede
celular / membrana, tais como fosfolípedes, esteróis e peptídeos. O período curto de
vida do oxigênio singleto novamente assegura uma resposta localizada. A reação do
tipo II é geralmente aceita como o principal caminho fotooxidativo no dano celular
microbiano (HUANG et al., 2012).
A fotossensibilização de bactérias está relacionada com a carga do
fotossensibilizador. Em geral, os de carga neutra ou positiva interagem
eficientemente e inativam bactérias gram-positivas, enquanto que interagem em
alguma extensão na membrana externa de bactérias gram-negativas. A camada de
poros de peptideoglicano e ácido lipoteicóico na membrana citoplasmática externa
de bactérias gram-positivas, permite a difusão do fotossensibilizador. A membrana
externa de bactérias gram-negativas age como uma barreira física e funcional entre
as células e o meio biológico (SIREM et al., 2013).
2.3.4 Tempo de pré- irradiação
O tempo de pré-irradiação corresponde ao tempo decorrido entre a aplicação
do fotossensibilizador no alvo e sua ativação pela luz. É um ponto crítico para o
sucesso da PDT, uma vez que, se o fotossensibilizador não estiver próximo ao alvo,
sua ativação pela luz irá resultar na formação de espécies tóxicas em local não
desejado. A morfologia microbiana pode variar com as espécies causando
diferenças na localização do fotossensibilizador (LAM et al., 2011).
Segundo o autor supracitado, o tempo necessário para absorção do corante
antes da iluminação é importante para o sucesso na PDT. Nas aplicações da PDT
antimicrobiana, espera-se que o corante una-se ao microrganismo ou chegue a
28
ultrapassar a barreira da membrana celular e, neste período, o fotossensibilizador
não sofra degradação antes da ativação pela fonte de luz.
2.3.5 Fotossensibilizadores
Os fotossensibilizadores (FS) têm estruturas moleculares que são tipificadas
por ligações duplas conjugadas que contêm um sistema deslocalizado de π-
elétrons. No estado neutro (singleto), estes elétrons são emparelhados em orbitais
de spin de baixa energia. Após a aplicação da luz correspondente ao pico de
absorção do FS, o elétron que ocupa o orbital molecular de maior energia do FS fica
animado e salta para o orbital molecular desocupado, excitando o FS a um estado
singleto animado, instável e de vida curta. O mais importante para o processo da
PDT é a inversão do spin do elétron animado, conhecido como cruzamento
intersistema para originar o estado tripleto do PS. Este estado tripleto é menos
enérgico do que o estado singleto animado, mas tem uma vida útil muito mais longa
(microssegundos). O elétron animado, agora com um spin paralelo, ao contrário da
sua antiga forma (elétron emparelhado), pode não reverter imediatamente para um
nível mais baixo de energia, de acordo com o Princípio de Exclusão de Pauli. Assim,
o elétron animado no estado tripleto do PS pode mudar sua orientação de spin (um
processo relativamente lento) e emitir sua energia como fosforescência, ou,
alternativamente, o PS pode interagir imediatamente com moléculas em seu
ambiente, tais como o oxigênio molecular (DAI, T. et al., 2007).
O fotossensibilizador deve possuir uma banda de absorção ressonante com o
comprimento de onda da fonte de luz a ser utilizada. Ele deve possuir estabilidade
biológica, eficiência fotoquímica, seletividade pela célula alvo e mínimo efeito tóxico
as células normais (DONELLY et al., 2008).
Para se fazer uma escolha racional entre os milhares de fotossensibilizadores
(FS) e fontes de luz disponíveis, é necessário entender um pouco dos aspectos
mecânicos de como o FS se comporta com a iluminação e o que acontece quando é
colocado em contato com células de mamíferos em cultura de tecidos. A forma exata
como a terapia fotodinâmica PDT influencia nas vias celulares, é fortemente
regulada pela localização do FS na célula, que depende de sua natureza química,
tais como: peso molecular, lipofilicidade, anfifilicidade, carga iônica e características
29
de ligação às proteínas; a concentração de PS, o tempo de incubação, a
concentração de soro e o fenótipo da célula alvo (CASTANO et al., 2004).
Dois pontos devem ser considerados quando a eficácia do procedimento
fotodinâmico é avaliada: a concentração do fotossensibilizador e intensidade luz
incidente no tecido alvo (RYSKOVA et al., 2010). O processo de fotoinativação de
microrganismos é dependente da substância fotossensível e da luz. Não menos
importante, é o tipo de fotossensibilizador e sua concentração, o tipo de laser
(comprimento de onda do feixe de luz) e a dose de luz aplicada por irradiação
(LYON et al., 2011).
A substância fotossensível (FS), por si só, não tem ou apresenta um
insignificante efeito antimicrobiano. No entanto, após a irradiação com luz visível de
comprimento de onda apropriado, a substância em estado de repouso inicial torna-
se instável. Durante este processo, fótons (energia) são absorvidos pelo FS.
Produtos citotóxicos altamente reativos podem ser produzidos quanto houver a
presença de oxigênio. O resultado da reação do FS com o oxigênio molecular é a
produção de radicais Hidroxila (OH-) e superóxidos, radicais de oxigênio ou oxigênio
singleto (1O2). O oxigênio molecular no estado primário contém 6 elétrons na última
camada de energia, sendo dois desemparelhado. A transferência de energia pelo FS
promove a inversão do spin de um dos elétrons da molécula de oxigênio
transformando-a do estado tripleto para singleto. O oxigénio Singleto tem um
período de meia vida muito curto (nanosegundos) e sua difusão limita-se a uma
distância de até 100 nm. Por isso, sua atividade citotóxica é confinada somente ao
local onde é produzido. Em consequência disto, para que fotoativação tenha
sucesso, é necessário um período de pré-irradiação, após a aplicação, para que o
FS possa acumular-se na célula-alvo (RYSKOVA et al., 2010).
De acordo com o autor supracitado, em laboratório, o 1O2 é frequentemente
gerado por reações de fotossensibilização. Nestas reações, são utilizadas moléculas
conhecidas como fotossensibilizadores, tais como: derivados de fenotiazinas (O azul
de toluidina e azul de metileno); porfirinas (hematoporfírina, ácido delta-
aminolevulínica), xantinas (rosa bengala), clorinas (de clorina (e6)), derivados de
clorina (e6) (como poli-L-lisina e polietilenoimina); ftalocianinas (disulphonated
30
ftalocianina de alumínio, ftalocianinas catiónicas de zinco, disulphonated ftalocianina
de zinco).
As ftalocianinas são compostos heterocíclicos de um núcleo de tetrapyrrole
ligados por pontes de nitrogênio. Alguns de seus derivados são usados como
corantes para impressoras (cor azul), tintas ou plásticos. São capazes de
permanecer no estado animado por um período mais longo em comparação com
azul de metileno ou azul de toluidina. Além disso, são mais resistentes à degradação
química ou fotoquímica. Absorvem a luz a um comprimento de onda entre 660-700
nm, que beira a extremidade do espectro infravermelho. As ftalocianinas já foram
estudadas para promover descontaminação sanguínea e para a terapia fotodinâmica
de cânceres (RYSKOVA et al., 2010).
O tetrapirrol, como porfirina, clorinas e bacterioclorinas, é uma classe de
fotossensibilizador que apresenta características promissoras para ser utilizado na
terapia fotodinâmica antimicrobiana (HUANG et al., 2010).
Vários estudos mostraram a utilização de fotossensibilizadores e luz visível
para destruir bactérias. No entanto, as propriedades físico-químicas necessárias
para tornar mais efetiva à terapia fotodinâmica têm sido pouco estudadas
(DONNELLY; McCARRON; TUNNEY, 2008). Segundo Castano; Demidova;
Hamblin, (2004), as características ideais dos fotossensibilizadores são:
Devem ter baixos níveis de toxicidade para os seres humanos e animais
experimentais no escuro, e baixa incidência de toxicidade de funcionamento
durante a irradiação;
Devem absorver a luz em comprimentos de onda no vermelho ou entre a luz
vermelha e infra-vermelha, que tem a finalidade de penetrar nos tecidos;
Eles devem ter faixas de absorção relativamente elevadas (> 20.000-30.000
M-1 cm-1) para minimizar a dose do fotossensibilizador (FS) necessária para
alcançar o efeito desejado. A síntese do FS deve ser relativamente fácil e a
matéria-prima disponível para sua produção deve ser viável em larga escala.
Devem ser um composto puro com uma composição constante, prazo de
validade estável e ser solúvel em água ou em uma mistura de solventes
aquosos inofensivos.
31
Não devem agregar indevidamente em ambientes biológicos, pois isso reduz
sua eficiência fotoquímica.
A eliminação farmacocinética do paciente deve ser rápida, ou seja, deve ser
menor que um dia para que não seja necessária a proteção pós-tratamento à
exposição prolongada da luz com a pele.
Deve apresentar um intervalo de tempo curto entre a aplicação e a eliminação
para facilitar o tratamento ambulatorial que é mais agradável para o paciente
e de baixo custo.
Não trazer dor ao paciente, já que a terapia fotodinâmica, normalmente, não
requer anestesia ou sedação profunda.
Não causar mutagenicidade ou carcinogenicidade.
Habilidade de poder ser empregado com outras modalidades terapêuticas,
tanto no tratamento do câncer, como na terapêutica antimicrobiana.
Para que uma molécula possa atuar como um eficiente fotossensibilizador,
deve possuir a capacidade de absorver a luz visível, passando para um estado
excitado e transferindo esta energia para o oxigênio molecular. Moléculas que
possuem tais características são tipicamente estruturas planares rígidas possuindo
um alto grau de conjugação. Os fotossensibilizadores mais empregados na PDT
incluem as phenothiazinium, porphyrin e phthalocyanine que apresentam estruturas
planas, simples e tricíclicas, tipicamente de natureza catiônica. Os compostos mais
amplamente usados são o azul de metileno (MB) e azul de toluidina (TBO). Ambos
são eficientes na produção de oxigênio singleto e apresentam absorção máxima de
luz com comprimento de onda de 656 nm, para MB, e 625, para TBO (DONNELLY
et al., 2008).
Na endodontia, os fotossensibilizadores derivados das fenotiazinas têm sido
amplamente empregados nas pesquisas envolvendo PDT. As fenotiazinas são
compostos heteroaromáticos tricíclicos, corantes azuis, como o corante azul de
toluidina e o azul de metileno. Em baixas concentrações não produzem ação
citotóxica e a dose necessária para a morte bacteriana é menor que a dose para
causar danos a células, como queratinócitos e fibroblastos (FIMPLE et al., 2008).
Segundo Wainwright (2008), as fenotiazinas são mais efetivas contra
espécies de microrganismos gram-positivos do que contra espécies gram-negativas.
32
O azul de metileno tem sido utilizado como alvo para microrganismos da microbiota
endodôntica, sua banda de absorção da luz situa-se no comprimento de onda entre
620 nm e 660 nm. Em razão de sua natureza hidrofílica, acompanhada de baixo
peso molecular e carga positiva, permite a passagem através dos canais de
proteína-porina na membrana externa de bactérias gram-negativas. O azul de
metileno interage predominantemente com macromoléculas lipopolissacárides
aniônicas, participando assim, do processo de fotossensibilização.
Desde que foi sintetizado pela primeira vez em 1876, azul de metileno (MB)
tem sido utilizado em diferentes áreas da medicina clínica, que vão desde a
quimioterapia do cancro à desinfecção do sangue. Além disso, o MB formou a base
da quimioterapia antimicrobiana, em particular na zona dos antimaláricos. Mais
recentemente, o potencial efeito fotossensibilizante do MB e de seus congêneres foi
reconhecido, fazendo com que fossem aplicados em associação com a luz com
intuito de produzir efeito antimicrobiano, especialmente na desinfecção do sangue. A
vasta utilização do MB, como agente fotossensibilizador, está relacionada à
combinação da sua estrutura química simples com facilidade de produzir reações de
oxidação-redução in situ (WAINWRIGHT; CROSSLEY, 2002).
O azul de metileno (MB) tem sido amplamente utilizado desde o final do
século XIX em investigações biomédicas. Foi o composto utilizado em várias áreas
clínicas importantes, incluindo o tratamento da malária e esquizofrenia. A terapia
fotodinâmica (PDT) do cancro e, mais recentemente, de infecções microbianas
(quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana) também tem utilizado o azul de metileno
e os seus congêneres, entre outros tipos de produtos químicos, devido à baixa
toxicidade humana e as propriedades fotoativas deste grupo (WAINWRIGHT, 2005).
O azul de metileno (MB) tem uma forte absorção da luz em comprimentos de
onda maiores do que 620 nm, em que a penetração de luz no tecido é a ideal.
Características como baixa toxicidade, forte potencial antimicrobiano fotoativo e
utilização e aceitação no campo da medicina, faz do azul de metileno um
fotossensibilizador ideal para ser utilizado na terapia fotodinâmica contra fungos
(TEICHERT et al., 2002).
33
O azul de metileno (MB) é uma molécula, de baixa toxicidade e efeitos
colaterais reduzidos, que tem sido utilizada com diferentes finalidades na
microbiologia e farmacologia há bastante tempo. Entre suas indicações tradicionais,
pode-se utilizar para corar organismos vivos e para tratar a metemoglobinemia, que
é uma doença caracterizada pela quantidade anormal de metemoglobinemia no
sangue. Ultimamente, tem sido utilizada na terapia fotodinâmica (PDT) como droga
fotossensibilizante em associação com uma fonte de luz contínua. Suas principais
indicações incluem o tratamento de carcinoma de células basais, sarcoma de
Kaposi, melanoma, infecções virais e fúngicas. Tem características interessantes
que conferem a esta molécula um grande potencial de aplicação em PDT. Ele
absorve luz intensa na janela terapêutica e desencadeia os mecanismos tipo I e tipo
II, que danifica biomoléculas e induz a morte em vários locais nas células alvo,
tecidos e organismos. Portanto, como a irradiação, pode ser utilizado para tratar
uma variedade de doenças cancerosas e não cancerosas (TARDIVO et al., 2005).
Zeina et al. (2003) avaliaram a genotoxicidade imediata e tardia da terapia
fotodinâmica antimicrobiana (APDT) utilizando uma combinação de luz visível (42
mW/cm2) e azul de metileno (100 µg/mL). Para testar os efeitos tóxicos da terapia foi
utilizada uma linhagem celular de queratinócitos humano (H103) por meio do ensaio
cometa. Os resultados desta pesquisa mostraram que espécies microbianas
associadas à pele foram susceptíveis a PDT, utilizando luz visível e azul de
metileno, sem apresentar efeitos genotóxicos detectáveis imediatos ou tardios sobre
queratinócitos.
Os autores supracitados ainda concluíram que PDT aplicada in vivo pode
representar uma alternativa de baixo risco e ser útil para o tratamento antimicrobiano
convencional na dermatologia.
Segundo Ryscova et al. (2010), aumentando a concentração do azul de
metileno e a densidade de energia da luz (J/cm²), há um aumento na destruição
bacteriana. Os principais alvos destes fotoabsorvedores parecem ser componentes
do DNA e da membrana celular, causando aumento de sua permeabilidade.
Segundo Usacheva et al. (2003), o azul de toluidina, em um estudo in vitro,
interagiu com a endotoxina bacteriana (LPS) das bactérias gram-negativas mais
34
significativamente que o azul de metileno, o qual pode ser um dos principais fatores
determinantes no efeito fotooxidativo contra bactérias gram-negativas.
Diversos corantes artificiais e naturais vêm sendo testados, nas cores roxa,
marrom, verde, entre outras. A busca de agentes fotossensibilizadores tem sido uma
constante no campo da PDT, tanto para o tratamento do câncer, como para a
redução de microrganismos. Corantes menos tóxicos, mais ressonantes com o
comprimento de onda emitido pelos lasers têm sido o ideal de diversos
pesquisadores. E quanto mais próximos deste ideal, estes agentes se mostrarem,
mais a PDT realizará sua função na prática clínica endodôntica (CARSON et al.,
2005).
Dentre os compostos que vem sendo estudados como fotossensibilizadores
na PDT, como tratamento de câncer, está o tanino (SIBATA et al., 2000; PANDEY et
al., 2001; HANNAH et al., 2002 ; WIDER et al., 2006).
Taninos são substâncias complexas presentes em inúmeros vegetais,
classificados em hidrolisáveis e condensados. Os primeiros são constituídos por
diversas moléculas de ácidos fenólicos, como o gálico e o elágico, que estão unidos
a um resíduo de glicose central. São chamados de hidrolisáveis, uma vez que suas
ligações ésteres são passíveis de sofrerem hidrólise por ácidos ou enzimas. Em
solução desenvolvem coloração azul com cloreto férrico, assim como o ácido gálico
(RYSCOVA et al., 2010).
Segundo Lam et al. (2011), os taninos condensados incluem todos os outros
taninos verdadeiros. Suas moléculas são mais resistentes à fragmentação e estão
relacionadas com os pigmentos flavonóides, tendo uma estrutura "polimérica" do
flavan-3-ol, como a catequina, ou do flavan-3,4-diol, da leucocianidina. Sob
tratamento com ácidos ou enzimas esses compostos tendem a se polimerizar em
substâncias vermelhas insolúveis, chamadas de flobafenos. Essas substâncias são
responsáveis pela coloração vermelha de diversas cascas de plantas (p. ex. quina
vermelha). Em solução, desenvolvem coloração verde com cloreto férrico, assim
como o catecol. Ambas as classes de compostos são amplamente distribuídas na
natureza e, em algumas espécies, os dois tipos estão presentes, embora um deles
deva ser predominante. Apresentam alta toxicidade aos tecidos.
35
Os taninos são adstringentes e hemostáticos e, portanto, suas aplicações
terapêuticas estão relacionadas com essas propriedades. São empregados
principalmente na indústria de curtume e têm também aplicação na indústria de
tintas. São usados em laboratórios para detecção de proteínas e alcaloides e
empregados como antídotos em casos de envenenamento por plantas alcaloídicas
(HUANG et al., 2012).
As principais plantas que contêm taninos são: nó-de-galha (formações
nodosas resultantes da decomposição de ovos do inseto Adleria gallaetinctoria na
gema foliar do carvalho Quercus infectoria G. Olivier, Fagaceae); ratânia (raízes
de Krameria triandra Ruiz & Pav., Krameriaceae), barbatimão (cascas de
caule Stryphnodendron barbatimam Mart., Fabaceae); hamamelis (folhas
de Hamamelis virginiana L., Hamamelidaceae), goiabeira (folhas de Psidium
guajava L. Myrtaceae), espinheira-santa (folhas de Maytenus sp., Celastraceae) e a
aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi) (LAM et al., 2011).
Em um estudo de espectroscopia, para verificar a medida de absorção da luz,
realizado para buscar novos fotossensibilizadores para uso em PDT, Setubal et al.
(2009) verificaram que o tanino hidrolizável apresenta banda de absorção intensa
entre 500 e 700nm.
O tanino hidrolizável mostrou-se um promissor fotossensibilizador em testes
usando células tumorais in vitro, apresentando forte banda de absorção em 672 nm
e rápida eliminação da pele (BROWN et al., 2011)
Segundo o supracitado autor o tanino hidrolizável tem apresentado atividade
promissora sem apresentar qualquer toxicidade e possuem propriedades fotofísicas
favoráveis, com altos rendimentos do estado tripleto.
Verza et al. (2012), verificaram que o tanino hidrolizável mostrou-se eficaz
para o tratamento de degeneração macular relacionada à idade e câncer de
próstata, e a sua união com resíduo de glicose central aumenta a sua solubilidade e
a ligação da molécula às lipoproteínas de baixa densidade, tornando mais fácil a
entrada na célula-alvo.
36
2.3.6 Fontes de energia
As primeiras fontes de luz utilizadas em PDT foram lâmpadas convencionais,
emitindo luz não coerente e policromática, com um forte componente térmico
associado. O desenvolvimento dos lasers de diodo de baixa intensidade, com luz
monocromática e coerente, facilitou a associação com fotossensibilizadores com
banda de absorção ressonante com o comprimento de onda emitido pelo laser. A
dose de radiação é facilmente calculada, a área de irradiação é controlada,
focalizando o tratamento. A luz pode ser transmitida por meio de fibra óptica, sendo
que estas fibras podem receber adaptações para melhor acessar a lesão alvo, com
microlentes e difusores (TEICHERT et al., 2002).
Os lasers de Hélio-neon (He-Ne) apresentaram bons resultados na redução
microbiana de diversas culturas de bactérias e fungos, utilizando os corantes azul de
toluidina e azul de metileno, demonstrando a importância da ressonância entre o
corante e o comprimento de onda emitido pela fonte de luz (ZEINA et al., 2003).
Atualmente, são utilizados lasers de diodo, emitindo no espectro do vermelho,
em baixa intensidade, por serem bem absorvidos pelos tecidos biológicos. Na
Terapia Fotodinâmica, os efeitos obtidos não são por incremento de temperatura,
mas sim por reações fotoquímicas entre o fotossensibilizador, luz e o substrato.
Pode-se variar a densidade de potência (W/cm²), o tempo de exposição (s) ou
ambos, mantendo-se a mesma fluência ou densidade de energia (J/cm²). No
entanto, uma densidade de potência alta sobre um curto período de tempo pode
oferecer resultados diferentes em relação à destruição microbiana, quando
comparado a uma densidade de potência baixa, aplicado por um período mais
longo, embora a densidade de energia tenha sido a mesma em cada caso (ZEINA et
al., 2003).
Uma fonte de luz alternativa para a PDT são os LEDs (diodos emissores de
luz), que podem ser utilizados como fontes de ativação em PDT, apresentando um
baixo componente térmico e luz monocromática, com banda estreita de comprimento
de onda18. Nos LEDs predomina o mecanismo espontâneo de radiação, com pouca
energia para geração de luz, apresentando largo espectro de luz não coerente e
com maior divergência. reações fotoquímicas entre o fotossensibilizador, luz e o
37
substrato. Pode-se variar a densidade de potência (W/cm²), o tempo de exposição
(s) ou ambos, mantendo-se a mesma fluência ou densidade de energia (J/cm²). No
entanto, uma densidade de potência alta sobre um curto período de tempo pode
oferecer resultados diferentes em relação à destruição microbiana, quando
comparado a uma densidade de potência baixa, aplicada por um período mais
longo, embora a densidade de energia tenha sido a mesma em cada caso
(TARDIVO et al., 2005).
2.3.7 Pesquisas com PDT na Endodontia
No estudo in vitro de Seal et al. (2002), S. intermedius foi inoculado em canais
previamente instrumentados e autoclavados, com o objetivo de comparar a
capacidade antimicrobiana da combinação de diferentes concentrações do azul de
toluidina em diferentes espaços de tempo. Foi utilizado o laser hélio-neônio na
potência de 35 mW e com 632,8 nm de comprimento de onda. As concentrações do
azul de toluidina empregadas foram de 12,5, 25, 50 e 100 μg/ml. Após a coleta de
amostras com cones de papel e plaqueamento em placas de ágar-sangue, foi
realizada a contagem das unidades formadoras de colônia. Observou-se que a
concentração de 100 μg/ml no período de dez minutos alcançou a maior redução de
bactérias cultiváveis, porém esta redução não foi superior à constatada no grupo
onde se usou o NaOCl a 3% por dez minutos.
Silva Garcez et al. (2006) avaliaram in vitro a redução microbiana do
Enterococcus faecalis, submetido a PDT e com solução de hipoclorito de sódio
0.5%. Foi utilizado o fotossensibilizador pasta-base de azuleno e os canais foram
irradiados com laser emitindo no vermelho com comprimento de onda 685 nm, por
03 minutos com energia de 1.8 J. O fotossensibilizador sozinho ou laser sozinho não
apresentaram nenhum efeito bactericida. A solução química reduziu em 93.25 % a
carga microbiana. A redução microbiana proporcionada pela PDT alcançou 99.2 %
sobre o E. faecalis.
Soukos et al. (2006) avaliaram in vitro os efeitos da PDT em dentes humanos
contaminados com biofilmes de Enterococcus faecalis. Os dentes foram expostos ao
azul de metileno (25 μg/mL) por 05 minutos e em seguida foram irradiados por meio
de fibra ótica com laser emitindo no vermelho com comprimento de onda 665 nm,
38
com energia de fluência de 222 J/cm². Os resultados evidenciaram uma redução
microbiana de 97 %.
Com o objetivo de avaliar a ação antimicrobiana da PDT, Castro et al. (2006)
utilizaram o azuleno a 25% associado ao Endo-PTC como FS por cinco minutos, e o
laser diodo de AsGaAl na potência de 35 mW e 685 nm de comprimento de onda por
três minutos, de forma combinada ou separada. Em seguida, compararam os
resultados com o resultado obtido mediante o uso de NaOCl a 1% por quinze
minutos em tubos de ensaio contendo uma suspensão de E. faecalis. Concluíram
que o NaOCl apresentou uma ação bactericida, enquanto a TFD teve um efeito
bacteriostático em culturas de E. faecalis, e que o laser ou corante utilizados de
forma isolada não exercem nenhuma inibição do crescimento bacteriano.
Bonsor et al. (2006a) analisaram o efeito microbiológico da PDT como auxiliar
na desinfecção do canal radicular in vivo. Para isso, utilizaram o azul de toluidina a
12,7 μg/ml deixado no canal por um minuto e depois ativado com laser diodo por
dois minutos com 100 mW de potência. Amostras foram coletadas após o acesso
inicial, após o PQC e após a PDT. Com base nos resultados obtidos, concluíram que
a terapia estudada foi eficaz em eliminar as bactérias que permaneceram após a
terapia convencional.
Segundo Bonsor et al. (2006b), o uso do agente quelante ácido cítrico a 20%
como irrigante em conjunto com a PDT é uma alternativa eficaz à utilização do
NaOCl na desinfecção do SCR.
Soukos et al. (2006) testaram o poder antimicrobiano do laser diodo com o
uso do azul de metileno a 25 μg/ml em canais radiculares de dentes extraídos
contaminados com E. faecalis e em suspensões bacterianas de P. gingivalis, P.
intermedia, F. nucleatum nucleatum, P. micros, P. endodontalis e E. faecalis. A
instrumentação dos canais radiculares foi realizada com instrumentos rotatórios, e a
irrigação com NaOCl a 6% e EDTA a 17% para remoção da smear layer. Os dentes
foram então autoclavados e contaminados com E. faecalis por um período de três
dias. A PDT realizada nesses canais foi capaz de reduzir em 97% a quantidade de
células bacterianas viáveis, enquanto o azul de metileno ou o laser, puros reduziram
em 83,2% e 56,6% respectivamente. Após cinco minutos em contato com a
39
suspensão, o azul de metileno eliminou a P.endodontalis e P. intermedia, enquanto
o laser sozinho não apresentou nenhum efeito antibacteriano. A PDT realizada em
suspensão, por sua vez, debelou por completo P. gingivalis, F. nucleatum nucleatum
e P. micros, reduzindo a viabilidade do E. faecalis em 53%.
Williams et al. (2006) testaram a capacidade antibacteriana da PDT utilizando
o azul de metileno a 10 μg/ml como FS e laser diodo, comparando com laser e com
o FS isoladamente em canais radiculares inoculados com S. intermedius
previamente instrumentados e autoclavados. Com base nos resultados obtidos,
concluíram que a PDT foi mais eficaz que os grupos controle.
Em um experimento preliminar realizado em tubos de ensaio com o objetivo
de comparar a eficácia do NaOCl a 0,5% e do laser diodo na potência de 50 mW e
da pasta de azuleno na eliminação de E. faecalis, utilizados separadamente ou de
modo combinado, Garcez et al. (2006) concluíram que nem o laser, nem a pasta
sozinhos apresentaram efeitos bactericidas. Enquanto o NaOCl a 0,5% reduziu em
97,06% o número de células viáveis, a combinação da pasta de azuleno e laser
reduziu em 99,89%, sendo observada portanto uma diferença estatisticamente
significativa entre esses dois grupo. Posteriormente, realizaram o PQC em trinta
dentes humanos unirradiculares, contaminando-os com E. faecalis por vinte e quatro
horas e os dividindo em três grupos: NaOCl a 0,5%; PDT com laser diodo e pasta de
azuleno; controle. As coletas foram realizadas antes e após os procedimentos
específicos de cada grupo. Observaram os autores, uma redução de 93,25% no
grupo do NaOCl, de 99,2% no da PDT e um aumento da carga bacteriana no grupo
controle. Concluíram que a PDT foi eficaz na redução da população de E. faecalis
em canais radiculares, podendo ser usada como coadjuvante do tratamento
endodôntico.
Garcez et al. (2007), em um estudo ex vivo feito em incisivos e caninos
superiores, observaram que a combinação do FS PEI-ce6 com o laser diodo com
potência de 40 mW utilizado como coadjuvante à terapia endodôntica convencional
apresentou uma redução significativa da carga bacteriana, tendo principalmente
reduzido o crescimento bacteriano após vinte e quatro horas, quando comparado
com o tratamento endodôntico simples.
40
Foschi et al. (2007) investigaram os efeitos da PDT sobre espécies de
Enterococcus faecalis em canais radiculares de dentes extraídos. Os dentes foram
sensibilizados com azul de metileno (6.25 μg/ ml) por 05 minutos. Os canais foram
irradiados por meio de fibra ótica com laser emitindo no vermelho com comprimento
de onda de 665 nm e energia de fluência de 60 J/cm². A PDT alcançou uma redução
de 77.5% na viabilidade do Enterococcus faecalis.
Garcez et al. (2008) avaliaram os efeitos da PDT em 20 pacientes portadores
de dentes com necrose pulpar e lesão periapical. Amostras microbiológicas foram
obtidas após o preparo da cavidade de acesso dos canais radiculares.
Posteriormente, os canais foram preparados manualmente até uma lima tipo K # 35,
seguido da aplicação de PDT no final da primeira sessão. Os canais foram
preenchidos com pasta de hidróxido de cálcio e os pacientes atendidos após uma
semana. Novas amostras microbiológicas foram obtidas na segunda sessão antes e
após nova aplicação de PDT. Os resultados mostraram redução microbiana após
terapia endodôntica, sendo que a combinação com PDT aumentou a redução
microbiana. Neste estudo, a segunda sessão com PDT foi significativamente mais
eficiente que a primeira sessão, sugerindo que a PDT proporcionou uma redução
substancial da carga microbiana quando associado ao tratamento endodôntico.
Fonseca et al. (2008) avaliaram in vitro os efeitos da PDT em canais
radiculares de dentes humanos contaminados com Enterococcus faecalis. Os canais
foram sensibilizados com azul de toluidina em concentração de 0.0125 %. Os
espécimes foram irradiados com laser emitindo no vermelho com comprimento de
onda de 660 nm, por meio de fibra ótica com energia de fluência de 400 J/cm², por
05 minutos e 20 segundos. Os resultados obtidos evidenciaram uma redução
microbiana de 99.9% nas unidades formadoras de colônias.
Fimple et al. (2008) investigaram in vitro a resposta de infecção
polimicrobiana em canais uniradiculados de humanos, submetidos à PDT, após
sensibilização com azul de metileno e exposição à luz. Os espécimes foram
contaminados com Actinomyces israelli, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas
gingivalis e Prevotella intermedia. Os canais radiculares foram expostos ao azul de
metileno (25 μg/mL) por 10 minutos e em seguida foram irradiados por meio de fibra
ótica com laser emitindo no vermelho com comprimento de onda de 665 nm. Foram
41
feitas duas irradiações de 2.5 minutos com energia de fluência de 15 J/cm², com
intervalo de 2.5 minutos, totalizando 30 J/cm². Os resultados obtidos com a PDT
alcançaram uma redução microbiana de 80% nas unidades formadoras de colônias.
Bergmans et al. (2008) realizaram o PQC em canais radiculares de dentes
extraídos com brocas de Gates Glidden e sistema rotatório GT em uma seqüência
crown-down. O preparo apical foi finalizado com o instrumento GT 30 taper 10 a 1
mm do forame apical. As soluções irrigadoras foram o NaOCl a 2,5% e o EDTA a
17% para a remoção da smear layer. Os dentes foram autoclavados e inoculados
com uma suspensão bacteriana de Streptococcus anginosus, E. faecalis e F.
nucleatum por dois dias. Utilizando azul de toluidina a 12,7 μg/ml como FS e laser
diodo com 100 mW de potência, observaram os autores que o FS e o laser sozinhos
não apresentavam efeitos significativos, ao passo que a combinação dos dois
reduziu significativamente a contagem bacteriana.
Tendo por objetivo a investigação da eficácia da PDT em patógenos
endodônticos, Gomes et al. (2009) avaliaram a redução de E. faecalis em canais de
dentes bovinos . O PQC dos trinta e seis dentes foi feito com instrumentos manuais
tipo K e NaOCl a 0,5%, e a smear layer removida com EDTA a 17%. Em seguida os
dentes foram autoclavados e contaminados com E. faecalis por quarenta e oito
horas. Dividiram-se as amostras em dois grupos, sendo um controle, onde não foi
executado nenhum procedimento, e um teste, onde se fez a PDT com o azul de
metileno a 0,005%, tempo de pré irradiação de 3 min e irradiação com laser de
diodo AsGaAl na potência de 100 mW e 660 nm de comprimento de onda por um
tempo de180s, totalizando 1,8J de energia . Foram feitas duas coletas, sendo uma
antes e outra depois do procedimento de cada grupo, e procedeu-se à contagem de
unidades formadoras de colônias. Observaram os autores que no grupo teste houve
uma redução de 99,9% na contagem das unidades formadoras de colônias (UFCs),
enquanto no grupo controle houve um aumento de 2,6% na contagem de UFCs.
Com base nos resultados obtidos, concluíram que a PDT é um eficaz agente
bactericida.
Sarmento et al. (2013) estudaram os efeitos da PDT com azul de metileno a
25 μg/ml dissolvido em meio BHI ou PBS em dentes unirradiculares extraídos,
contaminados por um biofilme multiespécies de A. israelli, F. nucleatum nucleatum,
42
P. gingivalis e P. intermedia. Os dentes tiveram suas coroas cortadas, foram
preparados com instrumento rotatório ProTaper e irrigados com NaOCl a 6% e
EDTA para remoção da smear layer. Foram então autoclavados e contaminados
com as espécies bacterianas citadas, sendo incubados por três dias. As amostras
foram divididas aleatoriamente nos seguintes grupos: dois controles (sem laser e
sem FS); azul de metileno dissolvido em meio BHI; laser; PDT com azul de metileno
dissolvido em BHI; azul de metileno dissolvido em PBS; PDT com azul de metileno
dissolvido em PBS. Os canais foram preenchidos e imersos por dez minutos nas
soluções de FS, BHI ou PBS, de acordo com o procedimento específico de cada
grupo. O laser foi aplicado durante dois minutos e meio, seguido de um intervalo de
também dois minutos e meio, com nova aplicação do laser durante esse mesmo
tempo. A coleta da solução que saiu pelo forame apical foi realizada antes e depois
do procedimento específico de cada grupo, sendo em seguida semeada em placa
ágar-sangue e feita a contagem das UFCs.
Os autores supracitados observaram uma redução da população bacteriana
em 73% no grupo da PDT com azul de metileno dissolvido em meio BHI, e em 80%
no dissolvido em PBS. O azul de metileno dissolvido em meio BHI foi capaz de
reduzir a população bacteriana em 25%, ao passo que, dissolvido em PBS, em 34%,
enquanto o laser não apresentou eficácia na antibacteriana. O experimento
demonstra, portanto, que a PDT pode ser um eficaz auxiliar no tratamento
endodôntico convencional.
43
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
- Avaliar a redução microbiana após a PDT como coadjuvante ao PQC, utilizando o
tanino como fotossensibilizador, em canais radiculares de dentes bovinos
contaminados com Enterococcus faecalis.
3.2 Objetivos Específicos
- Comparar a redução microbiana utilizando durante o PQC apenas o NaOCl a 2,5%
e/ou, associando a este, a Terapia Fotodinâmica.
- Comparar o efeito fotossensibilizador do azul de metileno e do tanino, utilizados
como corantes durante a Terapia Fotodinâmica.
44
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Tipo e Local do Estudo
Esta pesquisa, do tipo experimental laboratorial, foi realizada no laboratório
do curso de Biomedicina das Faculdades Integradas de Patos-FIP / PB no período
de maio a agosto de 2014, sob autorização institucional, conforme anexo A, e
aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Cruzeiro
do Sul sob protocolo 041/2014, conforme anexo B.
4.2 Instrumentos
4.2.1 Microrganismo e meio de cultura
Culturas puras de Enterococcus faecalis (ATCC 29212) em caldo de BHI
foram utilizadas como contaminantes dos espécimes. Colônias isoladas foram
suspensas em tubos com tampas rosqueáveis contendo 5ml de BHI. Esta
suspensão foi agitada mecanicamente e ajustada em espectrofotômetro com
absorbância de 800nm, até obter-se a concentração equivalente a 1,0 da escala
McFarland (3,0 x 108 bactérias/ml).
4.2.2 Preparação dos espécimes
Seguindo o protocolo de Dametto (2010), foram selecionados 60 incisivos
bovinos hígidos, recentemente extraídos, com ápices completamente formados. Os
espécimes foram limpos com raspadores periodontais para remoção de tecido
periodontal ou ósseo aderidos à superfície radicular quando presentes e foi realizada
profilaxia com taça de borracha, pasta profilática e pedra-pomes. As coroas dos
dentes foram removidas na junção amelocementária com disco diamantado para
facilitar o acesso cervical, de modo que o remanescente radicular permaneceu com
21mm de comprimento. Realizou-se uma instrumentação prévia com limas tipo K 90,
para esvaziar a cavidade pulpar, utilizando-se como substância irrigadora, soro
fisiológico, padronizando-se, neste momento, através de odontometria visual, o
45
comprimento real de trabalho de 20 mm. Após o estabelecimento da odontometria,
os espécimes tiveram seus ápices vedados com resina epóxi Araldite (Brascola, São
Paulo, SP) de endurecimento rápido (FIGURA 1), a fim de prevenir o
extravasamento da cultura bacteriana após a sua contaminação.
Figura 1- Dente bovino com selamento apical
Os espécimes foram colocados em frascos (FIGURA 2) contendo Brain Heart
Infusion (BHI, Oxoid; Basinkstoke , UK) estéril, e autoclavados a 1200C, 1 atm, por
20 min. Permaneceram incubados a 370C por 24h para confirmação da esterilidade.
Figura 2- Frascos contendo os espécimes
4.2.3 Contaminação dos espécimes com Enterococcus faecalis
Os frascos contendo os espécimes estéreis foram abertos em uma câmara de
fluxo laminar. Pipetas estéreis foram utilizadas para remover 5,0 ml de BHI estéril e
substituir por 5,0ml da suspensão de E faecalis. Em seguida, o frasco foi vedado e
incubado em estufa a 370 e atmosfera de 10% de CO2 por 7 dias, com trocas de 1,0
ml de BHI contaminado por 1,0 ml de BHI estéril, a cada 2 dias, a fim de se evitar a
saturação do meio. O crescimento bacteriano durante o período de incubação foi
constatado pela presença de turbidez do meio, conforme protocolo de Gomes et al.
(2001) Menezes et al. (2004) e Dametto et al.(2010).
46
4.3 Condições Experimentais
As amostras foram distribuídas homogeneamente em 6 grupos (n=10) de
acordo com a forma de desinfecção utilizada durante o PQC, conforme
demonstrado na tabela1:
Tabela 1- Distribuição dos grupos
GRUPOS N SUBSTÂNCIAS
G1(Controle) 10 Hipoclorito de Sódio 2,5%
G2 10 PDT com Azul de Metileno
G3 10 Tanino
G4 10 PDT com Tanino
G5 10 NaOCl 2,5% + PDT com Tanino
G6 10 NaOCl 2,5% +PDT com Azul de
Metileno
Sessenta espécimes foram utilizados neste estudo, nos grupos experimentais
e grupo controle, sendo, para cada grupo, n=10.
4.3.1 Preparo Químico-Cirúrgico e Terapia Fotodinâmica
Todo o experimento foi realizado em câmara de fluxo laminar (FIGURA 3),
para evitar contaminação cruzada. Durante a realização do PQC, todos os
espécimes de cada grupo foram retirados dos frascos por meio de uma pinça estéril
e dispostos em uma plataforma metálica estéril, com pinos laterais rosqueáveis
(FIGURA 4), a fim de evitar o manuseio dos mesmos, e uma contaminação do
interior dos canais com a superfície radicular externa.
47
Figura 3 – Câmara de fluxo laminar.
Figura 4 – Dentes bovinos dispostos na plataforma metalica.
Todos os espécimes foram instrumentados, através da técnica de
instrumentação manual escalonada coroa-ápice, com limas tipo K file (Dentsply
Maillefer; Baillaigues, Switzerland) até a lima #120 com comprimento real de
trabalho de 20mm, previamente determinado, através da odontometria visual. Para
irrigação, durante o PQC, foi utilizada seringa plástica estéril, descartável, Injex (Ind.
Cirúrgica Ltda, São Paulo, Brasil) e agulha Endo-Eze em aço inoxidável da Ultradent
(Utah, EUA), de diâmetro 30 Gauge e de comprimento médio de 24mm, sendo
calibradas em 20mm, correspondentes ao CRT.
Após o PQC, os canais foram irrigados com 10ml de soro fisiológico e, nos
grupos onde foi aplicada a PDT, foram colocados no interior do canal radicular, 3ml
do fotossensibilizador na concentração de 0,005% utilizando-se seringa plástica
estéril, descartável, Injex (Ind. Cirúrgica Ltda, São Paulo, Brasil) e agulha Endo-Eze
em aço inoxidável da Ultradent (Utah, EUA), de diâmetro 30 Gauge e de
comprimento médio de 24mm, sendo calibradas em 20mm, correspondentes ao
CRT. Permaneceram no interior do canal radicular por 5min, como tempo de pré-
irradiação.
48
Decorrido este período, foi feita a irradiação na entrada dos canais
radiculares. A fonte emissora de luz foi um Laser semicondutor portátil (Laser DUO®,
GaAlAs, InGaAlP, λ880nm e λ660nm, MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP – Brasil),
com potência de saída constante em 100 mW e área do feixe de laser de 3 mm2.
Para o protocolo de irradiação, o equipamento foi ajustado para um comprimento de
onda de 660 nm, potência de 100 mW, totalizando 1,8 J de energia em área de spot
e para o tempo de irradiação 180s. No final foi feita uma irrigação com 10ml de soro
fisiológico para a remoção do corante.
Para o PQC, seguiu-se o protocolo de Dametto et al. (2010), e para a PDT,
seguiu-se o protocolo de GOMES et al. (2009)
4.3.2 Grupo Controle: NaOCL a 2,5%
No grupo do hipoclorito de sódio a 2,5%, os canais foram irrigados com 3ml
do NaOCl a 2,5% a cada troca de lima. Depois do PQC os canais foram irrigados
com 10ml de soro fisiológico, conforme protocolo definido anteriormente.
4.3.3 Grupo 2: PDT com Azul de Metileno
Neste grupo, os canais foram irrigados com 3ml de soro fisiologico a cada
troca de lima, e como irrigação final foram utilizados 10ml de soro fisiológico.
Após o PQC, para realização da PDT, foi utilizado o fotossensibilizador azul
de metileno 0.005% (Chimiolux, Hypofarma, Belo Horizonte, Brasil). Decorrido este
período, foi feita a irradiação na entrada dos canais radiculares, segundo protocolo
de GOMES et al. (2009). Sendo feita uma irrigação final com 10 ml de soro
fisiológico para a remoção total do corante.
4.3.4 Grupo 3: Tanino
Neste grupo, os canais foram irrigados com 3ml de soro fisiológico a cada
troca de lima e irrigação final com 10 ml de soro, após o PQC.
O tanino hidrolizável foi obtido por métodos fitoquímicos (Reação de Stiasny),
sendo extraído do extrato da aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi) com registro
49
03892, gentilmente cedido pela botânica do herbário da Universidade Estadual da
Paraíba, UEPB, Mariana Ramos. Após o preparo, os canais foram preenchidos com
3ml do extrato hidrolizável de tanino a 0,005% (mesma concentração do azul de
metileno) durante 5min. Após esse tempo, todo o tanino foi removido dos canais
através de uma irrigação com 10 ml de soro fisiológico.
4.3.5 Grupo 4: PDT com Tanino
Neste grupo, os canais foram irrigados com 3ml de solução salina estéril a
cada troca de lima.
Após o preparo, os canais foram preenchidos com 3ml do extrato de tanino a
0,005%, a solução foi deixada no canal por 5 minutos, como tempo de pré-irradiação
e seguiu-se com o protocolo de irradiação. Posteriormente, todo o tanino foi
novamente removido dos canais através de uma irrigação com 10 ml de soro
fisiológico.
4.3.6 Grupo 5: NaOCL + PDT com Tanino
Os canais foram irrigados com 3ml do NaOCl a 2,5% a cada troca de lima . A
irrigação final foi feita com 10ml de soro fisiológico.
Após o preparo, os canais foram preenchidos com 3ml do extrato de tanino a
0,005%, deixados no canal por 5 minutos, seguindo-se da irradiação conforme
protocolo anteriormente citado.
4.3.7 Grupo 6: NaOCL + PDT com Azul de Metileno
Os canais foram irrigados com 3ml do NaOCl a 2,5% a cada troca de lima. A
irrigação final foi feita com 10ml de soro fisiológico.
O azul de metileno 0.005% (Chimiolux, Hypofarma, Belo Horizonte, Brasil) foi
colocado no interior do canal e deixado por 5 minutos como tempo de pré-irradiação.
Decorrido este período, foi feita a irradiação na entrada dos canais radiculares. O
azul de metileno foi totalmente retirado do canal através de irrigação com 10 ml de
soro fisiológico.
50
4.3.8 Coletas Microbiológicas:
Durante o experimento, foram realizadas três coletas microbiológicas,
denominadas, de acordo com o momento em que foram realizadas em inicial, feita
antes do PQC, para confirmar a contaminação dos espécimes, intermediária,
realizada imediatamente após o PQC, para verificar a redução microbiana logo após
a realização do PQC e coleta final, realizada sete dias após o PQC, para verificar
se em algum grupo a atividade antimicrobiana permaneceu, mesmo após o PQC.
Coleta Inicial
Antes da realização do PQC, os espécimes já dispostos na plataforma
metálica, dentro câmara de fluxo laminar, foram secos, ate o CRT com pontas de
papel absorvente estéreis de tamanho FM (FIGURA 5), que permaneceram no canal
por 1min e posteriormente foram depositadas em tubos individuais tipo eppendorf
(FIGURA 6)
Figura 5- Coleta microbiológica com cone de papel absorvente
51
Figura 6- Eppendorf contendo cone de papel após a coleta
microbiológica
Coleta Intermediária
Uma vez realizada a coleta inicial, e após os protocolos serem utilizados em
cada grupo durante o PQC, os canais foram novamente secos com pontas de papel
absorvente estéreis e depositadas em eppendorfs individuais, seguindo-se as
mesmas orientações realizadas na coleta inicial.
Todos os espécimes submetidos ao tratamento foram preenchidos com BHI,
selados com guta-percha bastão, para evitar que microrganismos presentes na
superfície externa dos canais adentrassem o seu interior, e colocados em
eppendorfs individuais contendo 60 µl de BHI estéril para manutenção da hidratação,
de modo que o BHI atinjiu, apenas, até o terço médio da raiz para não infiltrar no
selamento com guta-percha que foi realizado (FIGURA 7). Posteriormente, foram
novamente incubados a 370C em atmosfera de 10% CO2 por 7 dias.
52
Figura 7-Incubação dos espécimes; Armazenagem dos espécimes.
Coleta Final
Transcorrido o período de 7dias, os espécimes foram removidos dos
eppendorfs, dispostos novamente na plataforma metálica estéril. O selamento
cervical de guta percha foi removido e os canais radiculares foram novamente secos
com pontas de papel absorvente estéreis, sendo estas, posteriormente, depositadas
em eppendorfs individuais contendo 1ml de BHI estéril.
Após a realização de cada coleta, os eppendorfs foram agitados por 60
segundos, para tornar a solução mais homogênea (FIGURA 8).
Figura 8 - Agitador.
53
Diluição e plaqueamento das coletas
Após agitação mecânica, houve diluição das amostras coletadas na
proporção de 1/10, 1/100, em BHI estéril. A seguir, 50 µl da diluição 10-2 foram
plaqueados em triplicata em BHIA Agar (FIGURA 9) e incubados a 370C em
atmosfera de 10% de CO2. Após o período de 48h, as colônias de microrganismos
que estavam presentes nestas placas, uma vez constatada a pureza das colônias,
através das características morfológicas típicas do grupo microbiano estudado,
foram contadas, determinando-se as unidades formadoras de colônias (UFC). Para
a obtenção das unidades formadoras de colônias por ml (UFC), foi necessária a
multiplicação do numero de UFC obtidas na contagem das placas em 2000 vezes,
representando assim, o número de colônias descontando-se as diluições feitas
durante o estudo (100 vezes) e o plaqueamento de 50µl (20 vezes menor que 1 ml).
A média das 3 placas de cada coleta foi utilizada como valor final da contagem
(FIGURA 10).
Figura 9- Diluição e plaqueamento em triplicata
Figura 10- Placas contendo UFC’s
54
4.3.9 Análise Estatística
Os resultados foram expressos através das medidas estatísticas: média,
desvio padrão, mediana, quartis (ou P25 e P75) e valores mínimo e máximo. Para a
comparação entre os grupos em cada avaliação foi utilizado o teste F (ANOVA) em
relação ao logaritmo decimal do número de colônias de bactérias e no caso de
diferenças significativas foram utilizadas as comparações múltiplas de Tamanhe.
Para a comparação entre os grupos em relação às variações percentuais entre a
avaliação final com cada avaliação foi utilizado o teste de Kruswal-Wallis com
comparações de múltiplas do teste.
Ressalta-se que a escolha do teste de Kruskal-Wallis foi devido à falta de
normalidade dos percentuais na maioria dos grupos. A verificação da hipótese de
normalidade foi realizada através do teste de Shapiro-Wilk e para a verificação da
hipótese de normalidade foi realizada através do teste F de Levene.
A margem de erro utilizada nas decisões dos testes estatísticos foi de 5%. Os
dados foram digitados na planilha EXCEL e o programa utilizado para obtenção dos
cálculos estatísticos foi o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na
versão 21.
55
5 RESULTADOS
Na Tabela 2 apresentam-se as estatísticas do número de bactérias (número
de colônias x 2 x 102) por avaliação e grupo. Desta tabela destaca-se que: na
avaliação inicial a média foi menos elevada no grupo 2 (56,93), seguido do grupo 3
(81,20) e grupo 1 (84,53) e variou de 100,30 a 112,73 nos outros três grupos; as três
medianas menos elevadas ocorreram nos grupos: grupo 1 (37,83), grupo 2 (46,50)
e grupo 3 (50,00) e a mais elevada ocorreu no grupo 4 (90,17), entretanto para a
margem de erro fixada não se comprova diferença entre os grupos na avaliação
inicial (p > 0,05).
Na avaliação intermediária a menor média foi registrada no grupo 1 (0,50),
seguida do grupo 5 (1,57) e a mais elevada ocorreu no grupo 2 (6,00), seguida do
grupo 3 (5,93); as medianas menos elevadas ocorreram nos grupos: 1 (0,33), 5
(1,50) e 6 (2,00) e as mais elevadas nos grupos 3 (5,17) e 2 (4,17), diferenças estas
que se mostraram significativas entre os grupos e através das comparações
múltiplas (entre pares de grupos) se comprova diferença significativa entre cada um
dos grupos 1 e 5 com cada um dos grupos 2 e 3.
Na avaliação final as médias e medianas foram correspondentemente menos
elevadas nos grupos: grupo 5 (média de 0,67 em cada medida), grupo 6 (média de
6,07 e mediana igual a 5,00) e grupo 1 (média de 11,93 e mediana de 5,33) e foram
mais elevadas no grupo 4 (média de 51,80 e mediana de 47,43) e se comprova
diferença significativa entre os grupos, sendo diferentes entre o grupo 5 com todos
os grupos, do grupo 6 com todos os grupos exceto com o grupo 6, do grupo 1 com
os grupos 3 e 4 e do grupo 2 com o grupo 4.
A variabilidade expressa através do desvio padrão de mostrou bastante
elevada dede que para alguns grupos os valores do desvio padrão foram mais
elevados dos que as médias correspondentes.
56
Tabela 2 – Estatística do número de colônias (x 2 x 102) segundo o grupo e o
tempo de avaliação
Avaliação Grupo Média ± DP Mínimo P25 Mediana P75 Máximo
Grupo 1 84,53 ± 113,91
2,33 10,92 37,83 133,75 295,00
Grupo 2 56,93 ± 26,34 31,33 37,50 50,00 70,83 114,00
Grupo 3 81,20 ± 78,79 33,00 45,25 46,50 97,25 295,00
Grupo 4 111,00 ± 80,55 27,33 54,25 90,17 159,25 265,33
Grupo 5 100,30 ± 106,39 12,67 29,00 65,00 147,00 295,00
Grupo 6 112,73 ± 112,15 20,67 26,25 68,00 238,25 295,00
Valor de p p (1)
= 0,353
Intermediária Grupo 1
0,50 ± 0,59 (A)
0,00 0,00 0,33 0,83 1,67
Grupo 2 6,00 ± 4,09 (B)
3,00 3,67 4,17 7,25 16,67
Grupo 3 5,93 ± 2,10 (B)
3,00 4,58 5,17 8,33 9,33
Grupo 4 2,67 ± 2,77 (AB)
0,00 0,00 2,33 3,67 9,33
Grupo 5 1,57 ± 0,75 (A)
0,33 1,00 1,50 2,08 3,00
Grupo 6 3,60 ± 3,78 (AB)
0,33 0,92 2,00 5,50 12,00
Valor de p p (1)
< 0,001*
Grupo 1 11,93 ± 16,86 (AF)
1,00 1,75 5,33 14,75 55,33
Grupo 2 29,53 ± 17,09 (AC)
11,33 19,58 27,17 30,83 74,33
Grupo 3 33,07 ± 18,35 (BCD)
19,00 19,58 26,33 44,00 74,33
Grupo 4 51,80 ± 13,83 (D)
38,00 40,58 47,33 63,58 80,33
Grupo 5 0,67 ± 0,52 (E)
0,00 0,25 0,67 1,00 1,67
Grupo 6 6,07 ± 2,96 (F)
2,67 4,00 5,00 7,58 11,33
Valor de p p (1)
< 0,001*
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
(1): Através do teste de F(ANOVA) com comparações de Tamanhe aplicados no logaritmo decimal no número de colônias de bactérias.
Obs.: Se todas as letras entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre os grupos correspondentes.
57
A seguir, temos dois gráficos, o GRÁFICO 1, com a média do número de
colônias de bactérias (x 2 x 102 ) nas coletas inicial, intermediária e final. No
GRÁFICO 2, encontram-se expressas as medianas do número de colônias de
bactérias (x 2 x 102), também das três coletas.
84
,53
0,5
11
,93
56
,93
6,0
0
29
,53
81
,20
5,9
3
33
,07
11
1,0
0
2,6
7
51
,80
10
0,3
0
1,5
7
0,6
7
11
2,7
3
3,6
0
6,0
7
0,0
30,0
60,0
90,0
120,0
150,0
Inicial Intermediária Final
Mé
dia
do
nú
me
ro d
e c
olô
nia
s d
e b
act
éri
as
(x 2
00
)
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Grupo 6
Gráfico 1 – Média do número de colônias de bactérias (x 2 x 102)
58
37
,83
0,3
3 5,3
3
50
,00
4,1
7
27
,17
46
,50
5,1
7
26
,33
90
,17
2,3
3
47
,33
65
,00
1,5
0
0,6
7
68
,00
2,0
0
5,0
0
0,00
30,00
60,00
90,00
120,00
150,00
Inicial Intermediária Final
Me
dia
na
do
nu
me
ro c
olô
nia
s b
acté
rias
(x
20
0)
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Grupo 6
Gráfico 2 – Mediana do número de colônias de bactérias (x 2 x 102)
Na Tabela 3 apresentam-se as estatísticas das variações percentuais entre a
avaliação inicial com cada uma das avaliações seguintes, intermediária e final. Desta
tabela se verifica que as médias e medianas da variação percentual da avaliação
inicial para intermediária foram menos elevadas nos grupos 2 (média de 88,08% e
mediana de 88,57%) e 3 (média de 89,10% e mediana de 88,89%) e as médias dos
outros grupos variaram de 94,16% a 98,55% e as medianas de 96,82% a 99,60%
nos outros 4 grupos, sendo verificadas diferenças significativas entre os grupos 2 e
3 de cada um dos outros grupos; na variação inicial e final, verifica-se que a menor
média ocorreu no grupo 1 (-1,70 o valor negativo indica um aumento no valor da
média), variaram de 28,46% a 35,36% nos grupos 2 a 4 e foram mais elevadas no
grupos 5 (98,33%) e grupo 6 (88,76%) e as medianas foram menos elevadas nos
grupos 4 (40,71%), grupo 2 (49,28%) e grupo 3 e variaram de 82,61% (Grupo 1) e
variaram de 88,19% a 98,93% (Grupo 5), sendo verificadas diferenças significativas
59
entre o grupo 5 com cada um dos outros grupos, entre o grupo 6 e os outros grupos
e entre o grupo 1 com cada um dos grupos: 2, 3, 4, 5 e 6.
A variabilidade entre a avaliação inicial e intermediária se mostrou reduzida se
comparada com os valores das médias na variação inicial menos a intermediária
oscilaram de baixa nos grupos 5 e 6 a bastante elevados (valores do desvio padrão
superiores aos valores das médias correspondentes).
Tabela 3 – Estatísticas das variações percentuais entre a avaliação inicial com
cada avaliação em relação ao número de colônias segundo o grupo
Grupo Inicial – intermediária Inicial – intermediária
Grupo 1 98,55 ± 2,13 (99,60) (A) - 1,70 ± 176,47 (82,61) (A)
Grupo 2 88,08 ± 7,88 (89,57) (B) 35,36 ± 62,87 (49,28) (B)
Grupo 3 89,10 ± 5,70 (88,89) (B) 39,74 ± 45,85 (54,18) (B)
Grupo 4 94,16 ± 9,28 (96,82) (A) 28,46 ± 43,69 (40,71) (B)
Grupo 5 96,51 ± 2,95 (97,26) (A) 98,33 ± 1,78 (98,93) (C)
Grupo 6 94,48 ± 6,04 (97,64) (A) 88,76 ± 8,61 (88,19) (A)
Valor de p p (1) < 0,001* p (1) < 0,001*
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
(1): Através do teste de Kruskal-Wallis com comparações de Tamanhe.
Obs.: Se todas as letras entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre os grupos correspondentes.
Os gráficos abaixo representam a média (GRÁFICO 3) e a mediana
(GRÁFICO 4) da variação percentual entre a avaliação inicial e as outras duas
avaliações, intermediária e final para cada grupo.
60
98,5
588
,08
35,3
6
89,1
0
39,7
4
94,1
6
28,4
6
96,5
1
98,3
3
94,4
8
88,7
6
0,0
30,0
60,0
90,0
120,0
150,0
Inicial - intermediária inicial - final
Méd
ia d
a var
iação
per
cent
ual
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Grupo 6
Gráfico 3 – Média da variação percentual entre a avaliação e as outras duas
avaliações segundo o grupo
99,6
0
82,6
1
89,5
7
49,2
8
88,8
9
54,1
8
96,8
2
40,7
1
97,2
6
98,9
3
97,6
4
88,1
9
0,0
30,0
60,0
90,0
120,0
150,0
Inicial - intermediária inicial - final
Méd
ia d
a var
iação
per
cent
ual
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Grupo 6
Gráfico 4 – Mediana da variação percentual entre a avaliação e as outras
duas avaliações segundo o grupo
61
6 DISCUSSÃO
No presente estudo foram utilizados dentes bovinos em substituição ao dente
humano, motivado por trabalhos como o de Komorowsky et al. (2000) e Lennet et al.
(2000). Reeves et al. (1995) relataram que os dentes bovinos são os que mais se
assemelham estruturalmente aos dentes humanos. Sato et al. (2009) avaliaram a
morfologia do esmalte bovino através da microscopia eletrônica de varredura, e
observaram a grande semelhança com o esmalte humano, no que concerne,
principalmente à estrutura dos prismas de esmalte e do esmalte interprismático.
Vários estudos têm utilizado o dente bovino para examinar a penetração de
bactérias nos túbulos dentinários e avaliar a ação antimicrobiana de algumas
substâncias (PEREZ et al.,1993; HAAPASALO et al., 2005).
A opção pela utilização de E. faecalis como modelo microbiano neste estudo
se deu pela forte associação desta espécie bacteriana aos fracassos endodônticos,
o que pode ser explicado por sua capacidade de sobrevivência em condições de
escassez nutricional e em ausência de oxigênio, bem como por sua capacidade de
penetração nos túbulos dentinários e de resistência a procedimentos e
medicamentos intracanais (SIQUEIRA et al., 1997; SIREN et al., 1997; GOMES et
al., 2001; EVANS et al., 2002; HAAPASALO et al., 2005).
Diversos estudos avaliaram a eficácia da PDT, fazendo uso do E. faecalis
para contaminar as amostras a serem avaliadas (CASTRO et al., 2006; SOUKOS et
al., 2006; GARCEZ et al., 2006; BERGMAN et al., 2008; FONSECA et al., 2008).
Outros estudiosos, contudo, utilizaram diferentes microorganismos, como S.
intermedius (SEAL et al., 2002; WILLIANS et al., 2006), Pseudomonas aeruginosa e
Proteus mirabilis, transformadas em bactérias bioluminescentes (GARCEZ et al.,
2007), ou ainda S. anginosus e F. nucleatum (BERGMANS et al., 2008). Fimple et
al. (2008), por sua vez, serviram-se de um biofilme multiespécies, com Actinomyces
israelli, F. nucleatum nucleatum, P. gingivalis e P. intermedia.
A cepa de E. faecalis empregada foi a isolada de canais radiculares no estudo
de Zoletti et al. (2006), sendo, portanto, uma cepa selvagem. Entre os estudos que
utilizaram o E. faecalis como marcador biológico, não existe consenso sobre o
62
período ideal de incubação, podendo este variar de vinte e quatro horas a quatro
semanas. Assim como Gomes et al. (2001), Menezes et al. (2004) e Dametto et al.
(2010), optamos por sete dias como período de incubação. Os valores obtidos com a
coleta inicial comprovam que esse tempo foi suficiente para promover a colonização
das amostras.
Para o preparo químico-cirúrgico dos canais radiculares, utilizou-se a técnica
manual, como no estudo de Dametto et al. (2010). Estudos não demonstram
diferença estatística significativa entre as técnicas manuais e rotatórias quanto à
capacidade de redução bacteriana intracanal (DALTON et al., 1998, SIQUEIRA et
al., 1999).
O NaOCl é a solução irrigadora mais recomendada e utilizada pelos dentistas,
devido não só às suas propriedades favoráveis, como eficácia antimicrobiana, mas
também por sua capacidade solvente de tecidos necrosados e vivos (BYSTRÖM;
SUNDQVIST, 1983; 1985; AYHAN et al., 1999; SIQUEIRA et al., 2000; ESTRELA et
al., 2002; SIQUEIRA et al., 2002b; BERBER et al., 2006).
No entanto, não existe consenso quanto à concentração ideal a ser utilizada,
variando de 0,5% até 5,25%. Estudos clínicos e laboratoriais não conseguiram
demonstrar diferença significativa entre as diferentes concentrações (BYSTRÖM;
SUNDQVIST, 1985; SIQUEIRA et al., 2000). A propriedade antimicrobiana e a
toxicidade do NaOCl são diretamente proporcionais à sua concentração (GOMES et
al., 2001; VIANNA et al., 2004). No presente estudo, optou-se por não usar EDTA
para remoção de smear layer, assim como também não foi utilizada nenhuma
substância quelante no estudo de Dametto et al. (2009).
Segundo Siqueira et al. (2000), o uso de grande quantidade de NaOCl e sua
renovação constante poderiam manter a eficácia antimicrobiana, compensando o
efeito da concentração. Baseando-se nesse princípio, a concentração de NaOCl
usada nesse estudo foi de 2,5%, a exemplo de diversos outros estudos (SIQUEIRA
et al., 2002b; MENEZES et al., 2004; VIANNA et al., 2006; GARCEZ et al., 2007;
SIQUEIRA et al., 2007a; BERGMANS et al., 2008; GARCEZ et al., 2008).
Os procedimentos para a coleta microbiológica descritos na literatura variam
bastante. Entre os autores que estudaram a eficácia da PDT, Bonsor et al. (2006)
63
utilizaram instrumentos com raspas de dentina do canal radicular para realização da
coleta, enquanto Soukos et al. (2006) e Fimple et al. (2008) fizeram a análise
microbiológica através da solução que extravasou do forame apical. Neste estudo,
as amostras microbiológicas foram coletadas do interior do canal radicular com o
auxílio de cones de papéis estéreis, segundo o procedimento da maioria dos autores
que estudaram a PDT (SEAL et al., 2002; GARCEZ et al., 2006; WILLIAMS et al.,
2006; BERGMANS et al., 2008; FONSECA et al., 2008; GARCEZ et al., 2008).
No presente estudo, após a coleta das amostras, como realizado por Soukos
et al. (2006) e Bergman et al. (2008), realizou-se o plaqueamento em ágar-sangue.
Garcez et al. (2006), no entanto, o fizeram em ágar BHI, enquanto Fonseca et al.
(2008), em ágar bile azida.
O protocolo para a realização da PDT ainda não está bem definido, existindo
diversas variáveis, entre as quais o tipo e a concentração do FS a ser usado e os
parâmetros do laser, bem como o tempo e a técnica de aplicação do FS e do laser.
Os FS mais utilizados pelos autores que estudaram a TFD foram o azul de metileno
(SOUKOS et al., 2006; FIMPLE et al., 2008), o azul de toluidina (SEAL et al., 2002;
BONSOR et al., 2006a; WILLIAMS et al., 2006; BERGMANS et al., 2008; FONSECA
et al., 2008; GOMES et al., 2009; SARMENTO et al., 2013) e os derivados do PEI-
ce6 (SOUKOS et al., 1998; GARCEZ et al., 2007; GARCEZ et al., 2008).
Diversos corantes artificiais e naturais vêm sendo testados como
fotossensibilizadores na PDT, tanto para o tratamento do câncer, como para a
redução de microrganismos. Corantes menos tóxicos, mais ressonantes com o
comprimento de onda emitido pelos lasers têm sido o ideal de diversos
pesquisadores. E quanto mais próximos deste ideal, estes agentes se mostrarem,
mais a PDT realizará sua função na prática clínica endodôntica (CARSON et al.,
2005).
Dentre os compostos que vem sendo estudados como fotossensibilizadores
na PDT, como tratamento de câncer, está o tanino hidrolizável (SIBATA et al., 2000;
PANDEY et al., 2001; HANNAH et al., 2002 ; WIDER et al., 2006; BROWN et al.,
2011; VERZA et al., 2012).
64
Em um estudo de espectroscopia, para verificar a medida de absorção da luz,
realizado para buscar novos fotossensibilizadores para uso em PDT, Setubal et al.
(2009) verificaram que o tanino hidrolizável apresenta banda de absorção intensa
entre 500 e 700nm. Sendo verificado por Brown et al. (2011), que o tanino
hidrolizável utilizado como fotossensibilizador em PDT em teste usando células
tumorais, apresentou forte banda de absorção em 672 nm semelhante ao azul de
metileno que apresenta forte absorção da luz em comprimentos de onda maiores
que 620nm.
No presente estudo, foram testadas a eficácia de dois corantes: o azul de
metileno, por ser o corante mais utilizado na PDT em Endodontia,
segundoWainwright et al. (1998) e Fimple et al. (2008), e o tanino hidrolizável por
apresentar atividade promissora sem apresentar qualquer toxicidade e possuem
propriedades fotofísicas favoráveis, com altos rendimentos do estado tripleto.
Na literatura, encontramos a utilização de diversas concentrações do azul de
metileno, variando de 1 μg/ml a 25 μg/ml, bem como do azul de toluidina, variando
de 12,5 μg/ml a 100 μg/ml. Os dois FS empregados neste estudo, tanino e azul de
metileno, foram utilizados na mesma concentração de 5 μg/ml, mesma concentração
em que o azul de metileno foi utilizado no estudo de Gomes et al. (2009), com o
objetivo de padronizar o experimento.
A fonte de radiação empregada foi o Twin laser, um laser diodo de baixa
potência da MMOptics. Esse aparelho emite uma luz em dois intervalos espectrais: o
visível (luz vermelha) e o infravermelho, com 660 nm e 780 nm de comprimento de
onda respectivamente. Para esse experimento, foi aplicado o laser vermelho do Twin
laser, que possui um meio ativo semicondutor de GaAlAs e potência máxima de 100
mW.
Baseando-se no protocolo proposto por GOMES et al. (2009), que também
utilizaram o Twin laser, foi estabelecido em três minutos o tempo de pré-irradiação
durante o qual o FS é deixado no canal, e em cinco minutos o tempo de aplicação
da luz do laser na entrada do canal radicular, resultando numa dosagem total de 1,8
J de energia.
65
Ao testarem a eficácia da PDT com o azul de metileno como agente FS,
Soukos et al. (2006) e Fimple et al. (2008) concluíram que essa terapia poderia ser
um eficaz auxiliar no tratamento endodôntico convencional. Fimple et al. (2008),
observaram uma redução da infecção de 80% em dentes contaminados por um
biofilme multiespécies, enquanto Soukos et al. (2006) obtiveram uma redução de
97% em dentes contaminados por E. faecalis. Esta eficácia também foi observada
no presente estudo, que mesmo o NaOCL a 2,5% mostrando-se mais eficaz na
redução microbiana entre as coletas inicial e intermediária, quando utilizou-se a PDT
com azul de metileno como coadjuvante ao PQC houve uma redução de 96,51%,
entre as coletas inicial e final.
Resultados semelhantes foram observados nos estudos in vitro em que o azul
de metileno foi aplicado como fotossensibilizador. Williams et al. (2006) observaram
que PDT com azul de metileno foi eficaz em reduzir a contagem bacteriana em
dentes contaminados por S.intermedius, entre uma coleta inicial e uma coleta
realizada 7 dias após o PQC e que o aumento da dose de energia do laser aplicada
e do tempo pré-irradiação não levaram a maior redução dessa contagem. Bergmans
et al. (2008) encontraram redução de 93,8% em dentes contaminados com S.
anginosus, de 88,4% em dentes contaminados com E. faecalis e de 98,5% nos
contaminados por F. nucleatum, o que significou uma redução estatisticamente
significativa em relação à amostra inicial. Fonseca et al. (2008) encontraram redução
da contagem bacteriana de dentes contaminados por E. faecalis de 99,9%, numa
coleta realizada 7 dias após o experimento.
Nos estudos in vivo, também se avaliou a eficácia adicional da PDT. Bonsor
et al. (2006) realizaram o PQC com instrumentos rotatórios de NiTi do sistema
Profile e irrigação alternada de NaOCl a 2,25% e ácido cítrico a 20%. Em seguida,
realizaram-se a TFD com azul de toluidina deixado no canal por um minuto, e com o
laser com 100 mW de potência por dois minutos. Fez-se apenas uma análise
quantitativa dos resultados, em que se observou que, dos quatro canais que ainda
estavam contaminados, três obtiveram cultura negativa após a PDT, numa coleta
realizada três dias após o PQC.
O resultado obtido neste estudo pelo grupo 3, em que o tanino hidrolizável foi
utilizado sozinho ao final do PQC, mostra que esta substância não é tão eficaz na
66
redução microbiana, quando comparada com a sua utilização como
fotossensibilizador na PDT, como coadjuvante ao uso do NaOCL a 2,5% no PQC.
Assim como os grupos 2 (PDT com azul de metileno) e 4 (PDT com tanino
hidrolizável), em que houve uma redução de UFC’s, esta não foi tão eficaz quanto à
associação da PDT com o NaOCl a 2,5%, como nos grupos 5 e 6, mostrando que a
PDT e o FS não são eficazes sozinhos, como no estudo de Bergman et al. (2009). A
redução microbiana nos grupos 2, 3 e 4 pode ser decorrente da própria ação
mecânica do instrumento endodôntico nas paredes do SCR e não do potencial
antimicrobiano apresentado pelas substâncias.
No presente estudo verificou-se uma redução de 98,33% entre as coletas
inicial e final, enquanto que a redução de UFC’s utilizando-se o MB como FS na
PDT, foi de 88,76%, sendo, portanto, inferior ao tanino hidrolizável, mostrando
diferença estatisticamente significativa quando foi utilizado o tanino como FS na PDT
coadjuvante ao PQC. Tal resultado pode estar fundamentado no fato da molécula do
tanino hidrolizável apresentar união com resíduo de glicose central, aumentando a
sua solubilidade e a ligação da molécula às lipoproteínas de baixa densidade,
tornando mais fácil a entrada na célula-alvo, executando com maior eficácia a sua
função de reduzir UFC’s. Tais propriedades foram observadas por Verza et al.
(2012) em seu estudo, onde o tanino hidrolizável, utilizado como FS na PDT
mostrou-se eficaz para o tratamento de degeneração macular relacionada à idade e
câncer de próstata.
Neste estudo, que obteve resultados diversos do estudo de Silva Garcez et
al. (2006), e semelhante ao resultado do estudo de Seal et al. (2002), quanto ao fato
do NaOCl a 2,5% ter se mostrado mais eficaz na redução microbiana entre as
coletas inicial e intermediária, quando comparado à sua associação com a PDT ,
reitera-se a utilização desta solução irrigadora em tratamentos endodônticos
realizados em sessão única.
Porém, em casos de retratamento endodôntico, ou de infecções persistentes,
onde a quantidade de Enterococcus faecalis no interior do SCR é maior e existe a
necessidade de múltiplas sessões, a associação da PDT, como coadjuvante ao uso
do NaOCl a 2,5% no PQC torna-se mais eficaz, sobretudo utilizando-se o tanino
hidrolizável como fotossensibilizador, visto que, neste estudo, tal substância
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mostrou-se mais eficaz que o azul de metileno, pelo fato de ter fácil obtenção, já
que encontram-se presentes em inúmeros vegetais, de apresentar boas
propriedades físico-químicas como melhor difusão entre as membranas celulares,
necessitando talvez de um menor tempo de pré-irradiação, e nenhuma
citotoxicidade, tornando-se uma alternativa dentre os corantes utilizados na Terapia
Fotodinâmica.
68
7 CONCLUSÃO
Após a realização deste estudo, concluiu-se que:
A Terapia Fotodinâmica, utilizando o tanino hidrolizável como
fotossensibilizador, mostrou-se eficaz, como coadjuvante ao preparo químico-
cirúrgico, na redução microbiana, em canais de dentes bovinos contaminados
com Enterococcus faecalis.
Houve uma maior redução microbiana, após o preparo químico-cirúrgico,
quando se associou a Terapia Fotodinâmica ao uso do NaOCl a 2,5%, sete
dias após a realização do preparo químico-cirúrgico.
No presente estudo, o tanino hidrolizável mostrou-se mais eficaz que o azul de
metileno, como fotossensibilizador na Terapia Fotodinâmica.
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