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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
SONIA NATSUMI MINAMI
DIVERSIDADE E CONTROLE BIOLÓGICO DE
Pectobacterium carotovora EM ORQUÍDEAS UTILIZANDO
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
Mogi das Cruzes SP
2006
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
SONIA NATSUMI MINAMI
DIVERSIDADE E CONTROLE BIOLÓGICO DE
Pectobacterium carotovora EM ORQUÍDEAS UTILIZANDO
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
Área de Concentração: Biológica
Profº Orientador: Dr. Welington Luiz de Araújo
Mogi das Cruzes SP
2006
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5
Dedico esse trabalho a minha
mãe, que sempre com muita
paciência e carinho, me
incentivou a sempre lutar pelos
meus objetivos com muita
dedicação.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço, ao meu orientador Professor Doutor Welington Luiz de Araújo, pela
paciência, dedicação, segurança e principalmente pela amizade nesses dois anos de
orientação.
Aos meus familiares, Edson, Roberta, Aiko, Todayoshi, minha prima Regina e
principalmente minha mãe Kiyoko, pela paciência, compreensão e apoio durante esses anos.
Agradeço ao meu noivo Fernando, pela paciência e ajuda nas horas em que sempre
precisei.
Ao Professor Doutor João Lúcio de Azevedo pelas facilidades concedidas no
Laboratório de Genética de Microrganismos ESALQ-USP.
A Professora Doutora Aline Ap. Pizzirane-Kleiner pelo convívio, carinho com que me
recebeu e pelas facilidades concedidas no Laboratório de Genética de Microrganismos
ESALQ-USP.
A Professora Doutora Elisa Espósito por ter concedido o Laboratório de Meio
Ambiente para o desenvolvimento de partes do projeto.
Ao Núcleo Integrado de Biotecnologia NIB/UMC principalmente aos Professores
Doutores Regina L. de Oliveira, Luiz R. Nunes, José L. C. Wolff e Professora Vivian
Schimith por disponibilizar o laboratório para o desenvolvimento de partes do projeto.
A Professora Doutora Norimar D. Dernadin (Laboratório de Bacteriologia Vegetal da
Universidade de Passo Fundo), A Professora Doutora Rosa Mariano (Universidade Federal
Rural de Pernambuco) e ao Professor Doutor Valmir Duarte (Departamento de Fitossanidade,
Faculdade de Agronomia, UFRGS), pelas amostras de Pectobacterium concedidos.
As irmãs Márcia e Lúcia Morimoto, por ceder dados importantes da orquidácea
Oncidium Aloha Iwanaga.
A amiga Maria Cecília Piola Brandt, pela amizade, paciência e ajuda em todas as
horas que precisei.
Aos amigos do Núcleo Integrado de Biotecnologia, Vânia, Cristina, Lucimara, Bete,
Eliandra, Emy, Aline, Fernanda Alves, Fernanda, Renata, Luis e Alex pelo carinho, amizade,
e convivência durante esses anos de desenvolvimento do projeto.
A secretária Neilce, por ter me auxiliado nos momentos em que sempre precisei e
principalmente pela amizade.
7
Ao Josué do Orquidário ESALQ/USP Piracicaba, pela ajuda com as mudas de
orquídeas e pela amizade.
Aos amigos e companheiros de trabalho do Laboratório de Genética de
Microrganismo Prof. João Lúcio de Azevedo do Departamento de Genética da ESALQ-USP,
Adalgisa, Ágata, Aldo, Beatriz, Cristina Almeida, Carol Almeida, Maria Carolina, Cristina
Maki, Claudia, Clara, Fernanda, Fernando, Joelma, Júlia, Heloize, Léia, Luciana, Mayra,
Manuella, Natalie, Priscila, Paulo Lacava, Ricardo (Pipa), Rodrigo (Xico), Rodrigo Stuart,
Uirá, Vivian, Taís, Zezo e principal a Aline Romão e Rudi, pela paciência em sempre estarem
dispostos a ajudar, pelo carinho com que me receberam e pela agradável convivência durante
esses dois anos.
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Minami, S.N. Diversidade de controle biológico de Pectobacterium carotorova em orquídeas utilizando bactérias endofíticas. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia, Univesidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, 2006, p. 62.
RESUMO Bactérias endofíticas são aquelas que habitam o interior das plantas, sendo encontradas em órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes, sem causar danos à planta hospedeira ou formar estruturas externas visíveis. Estas bactérias podem promover o crescimento vegetal, controlar patógenos ou produzir compostos de interesse biotecnológico. A bactéria Pectobacterium carotovora, agente causal da podridão mole ou canela preta em diversas espécies vegetais de interesse agrícola, pode apresentar três grupos geneticamente distintos, os quais são responsáveis por causar danos a diferentes hospedeiros. Essa bactéria produz enzimas pectinolíticas, que degradam pectatos de cálcio da lamela média junto à parede celular, causando extravasamento do conteúdo celular e, consequentemente, a podridão-mole. Em orquídeas, as lesões ocorrem inicialmente nas folhas, sob a forma de encharcamento dos tecidos, e ao atingirem o pseudocaule causam a morte da planta. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram avaliar a capacidade de bactérias endofíticas em controlar a podridão mole em Orquídeas e avaliar a especificidade deste fitopatógeno a diferentes espécies de orquídeas. Foi observado em Oncidium que a aplicação da bactéria endofítica reduziu em até 100% os sintomas da podridão mole. Entretanto, foi observado também que este controle é dependente da concentração do endófito e da planta hospedeira, visto que o controle foi efetivo para Phalaenopsis sp. e Oncidium sp., mas não foi efetivo em Miltonia sp. Já em Cattleya sp. o controle ocorreu somente quando uma concentração maior do endófito foi aplicada. Foram observados que as diferentes subespécies de Pectobacterium carotovora isoladas de tubérculos de batata, não causaram doenças nas folhas, ao contrário dos isolados de Pectobacterium de Oncidium Aloha Iwanaga e Oncidium Sherry Baby. A diversidade genética de P. carotovora foi avaliada por meio de ARDRA, permitindo a partir da combinação dos perfis obtidos com 3 enzimas de restrição (AluI, HhaI e MboI), obter 7 haplótipos diferentes: haplótipo A: P.c. carotovora, P.c. odorífera e P.c. brasiliensis , B: P.c. brasiliensis, C: P.c. atroscepticum, D: P. carotovora de Oncidium Aloha Iwanaga e Oncidium Sherry Baby, E: P.c. carotovora, F: P.c. brasiliensis e G: P.c. chrysanthemi. Mostrando que os isolados de Orquídeas se diferenciaram dos isolados de tubérculos de batata, podendo ser bactérias específicas para orquídea ou uma subespécie ainda não descrita. Palavras-chave: Oncidium, endófitos, podridão mole, ARDRA.
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Minami, S.N. Diversidade de controle biológico de Pectobacterium carotorova em orquídeas utilizando bactérias endofíticas. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia, Univesidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, 2006, p. 62.
ABSTRACT
Endophytes are all microorganisms culturable or not, that inhabit the interior of plant tissues, causing no harm to the host and that do not develop external structures, excluding in this way nodulating bacteria and mycorrhizal fungi. Endophytic bacteria may promote the plant growth, control phytopathogen or produce new compounds for biotechnological purposes. The bacterium Pectobacterium carotovora is the causal agent of soft rot and black leg on many crops. This species may be classified in three genetically distinct groups, being responsible for causing damage to different host plants. This bacterium produces pectinolitics enzymes, which degrades pectate calcium of plant walls cells, causing overflowing the cells contentsand, consequently, soft rot. In Orchids, these injuries occur first in leaves and further in pseudobulbo, resulting in plant death. Therefore the aims of the present study were to evaluate the ability of endophytic bacteria to control soft rot in Orquids and evaluate the specificity of this phytopathogen to different orquid species. It was observed in Oncidium that the application of the endophytic bacterial reduced up to 100% of the symptoms of soft rot. However, it was also observed that this control depends on the concentration of endophytic bacteria and the host plant species. Also, the results show that the endophytic bacterium was able to control soft rot in Phalaenopsis sp and Oncidium, but not in Miltonia sp., while in Cattleya sp, the control occurs only when the applied concentration of the endophytic bacteria is higher than pathogenic one. The genetic diversity of the P. carotovora was evaluated by ARDRA, through the combination of profiles obtained with 3 restriction enzymes (AluI, HhaI and MboI). This analysis showes that the evaluated population present 7 haplotypes, being A) P.c. carotovora, P.c. odorífera e P.c. brasiliensis; B): P.c. brasiliensis; C) P.c. atroscepticum; D) P. carotovora de Oncidium Aloha Iwanaga e Oncidium Sherry Baby; E) P.c. carotovora; F) P.c. brasiliensis and G) P.c. chrysanthemi. This result suggests that the P. carotovora from orchids are genetically different from potato strains, possibly indicating that these orchid strains are specific for this host or a undescribed subespecies. Keywords: Oncidium, endophytes, soft rot, ARDRA.
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LISTA DE TABELAS Tabela 1. Erwinia sp. causadores de podridão mole que passaram para o grupo
das Pectobacterium sp. .................................................................................. . 20
Tabela 2. Bactérias endofíticas isoladas de tecidos vegetais sadios. Com
potencial para o controle biológico de doenças fúngicas e bacterianas
(modificado de Araújo, 2000) .......................................................................... 28
Tabela 3. Distribuição dos haplótipos ............................................................................... . 44
11
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Oncidium Aloha Iwanaga. (A) Oncidium em vaso, (B) Haste floral, (C)
Formato grande e amarelo intenso ...................................................................18
Figura 2. Interação entre Pectobacterium carotovora e Burkholderia folhas de
Oncidium. (A) Sintoma causado pela Pectobacterium carotovora. (B) O
meio de cultura não causou danos. (C) Inibição causada pela
Burkholderia contra Pectobacterium carotovora, no local uma reação de
hipersensibilidade e (D) A Burkholderia não causou danos a planta............... 38
Figura 3. Interação endofítico e patogênico em diferentes hospedeiros e diferentes
diluições do endofítico. (A) Fragmento de Ondicium inoculados com a
mesma proporção do endófito e patógeno, mostrou inibição total,
enquanto que diminuindo aconcentração do endófito essa inibição não
ocorreu. Esse mesmo resultado foi obtido em (B) Cattleya e (C)
Phalaenopsis. Mas em (D) Miltonia não ocorreu inibição em nenhuma
das concentrações ............................................................................................40
Figura 4. Análise da especificidade de diferentes subespécies de P. carotovora, em
folhas de Oncidium Aloha Iwanaga. Pc Oncidium – P. carotovora
isolado de Oncidium. Pc Sherry Baby – P. carotovora de Sherry Baby
(Orquidaceae). Pco 1814 – P. carotovora subsp. odorífera. Pcbr 424 -
P. carotovora subsp. brasiliensis. Pcc 1113 – P. carotovora subsp.
carotovora. Pca 1819 – P. carotovora subsp. atrosceptium. Pca N - P.
carotovora subsp. atrosceptium. Pch N - P. carotovora subsp.
chrysanthemi. Pcbr 285 - P. carotovora subsp. brasiliensis. Pcbr 371
– P. carotovora subsp. brasiliensis. Pcbr 1692 - P. carotovora subsp.
brasiliensis. Pcc BAB –20 - P. carotovora subsp. carotovora .......................41
Figura 5. Interação endofítico e patógeno em vasos e deixados em estufa. (A) Planta
de Oncidium inoculado com P. carotovora. (B) Inoculado com o
endofítico, mostrando não afetar a planta e (C). A inibição do
crescimento de P. carotovora pela Burkholderia sp. ....................................42
Figura 6. Perfis de restrição do 16S rDNA de Pectobacterium sp., utilizando as
enzimas AluI, HhaI e MboI. M) Marcador DNA Ladder 100 pb
(Invitrogem). Pcbr 1692) P. carotovora subsp. brasiliensis. Pca 1819)
P. carotovora subsp. atroscepticum. SB) Sherry baby e Oncidium
12
(Orquidaceae). Pcc BAB) P. carotovora subsp. carotovora. Pch Nor.)
P. carotovora subsp. chrysanthemi. Pcbr 424) P. carotovora subsp.
brasiliensis. Pcbr 258) P. carotovora subsp. brasiliensis ...............................43
Figura 7. Dendrograma mostrando o nível de similaridade genética entre os 4
haplótipos obtidos por meio da análise de ARDRA com 3 enzimas de
restrição. A matriz de similaridade foi calculada utilizando o
coeficiente de JACCARD e o dendrograma construído pelo método de
UPGMA .....................................................................................................45
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AHL – Acil-Homoserina Lactona
ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
CyMV – vírus do mosaico do Cymbidium
hrp - Hypersensitive Response and Pathogencicity
KCl – Cloreto de Potássio
MgCl2 - Cloreto de Magnésio
NaCl – Cloreto de Sódio
NTSYS – pc – Numerical Taxonomy and Multivariante Analysis
OFV – Orchid fleck virus
ORSV – vírus da mancha anelar do Odontoglossum
Pca – Pectobacterium carotovora subsp. atrosceptium
Pcbr – Pectobacterium carotovora subsp. brasiliensis
Pcc – Pectobacterium carotovora subsp. carotovora
Pch – Pectobacterium carotovora subsp. chrysanthemi
Pco – Pectobacterium carotovora subsp. odorífera
PCR – Polymerase Chain Reaction
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
TAE – Tampão Tris- Acético EDTA
Tris-HCL – Tampão Tris-Base com pH ajustado com ácido clorídrico
TSB - Tryptone Soya Broth
TTSS – Sistema de Secreção Tipo Três
UFC – Unidade Formadora de Colônia
UPGMA - “Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average”
14
LISTA DE ANEXO Anexo I – Filogenia de Oncidium Aloha Iwanaga ........................................................... 62
15
SUMÁRIO
1. Introdução .............................................................................................................. 17
2. Revisão Bibliográfica ............................................................................................... 17
2.1.Oncidium spp ...................................................................................................... 17
2.2. Pectobacterium carotovora agente causal da Podridão mole ............................ 19
2.2.1. Aspectos Gerais ...................................................................................... 19
2.2.2. Enzimas envolvidas na patogênese de Pectobacterium .......................... 22
2.2.3. Outros mecanismos de patogênese ......................................................... 23
2.3. Diversidade genética avaliada por ARDRA ...................................................... 24
2.4. Controle biológico de fitopatógenos .................................................................. 25
2.4.1 Aspectos Gerais ........................................................................................ 25
2.4.2 Utilização de Burkholderia para o controle de doenças .......................... 29
3. Objetivos .............................................................................................................. 32
3.1. Objetivo geral ................................................................................................... 32
3.2. Objetivos específicos........................................................................................ 32
4. Métodos ................................................................................................................... 33
4.1. Isolados bacterianos e condições de cultivo ...................................................... 33
4.1.1. Isolamento de Pca e confirmação de patogênese .................................... 33
4.1.2. Interação in vitro das bactérias endofíticas e Pca ................................... 34
4.1.3. Inoculação em folhas de Oncidium ......................................................... 34
4.1.4. Controle da podridão mole na planta hospedeira ................................... 34
4.1.5. Análise da especificidade de Pectobacterium carotovora a
diferentes Hospedeiros .............................................................................................. 35
4.1.6. Análise da variabilidade genética de Pectobacterium por
ARDRA... ................................................................................................................. 35
4.1.6.1. Extração do DNA total de bactérias .................................................... 35
4.1.6.2. Amplificação do 16s rDNA................................................................. 36
4.1.6.3. Clivagem do 16s rDNA (ARDRA) ..................................................... 36
4.1.6.4. Análise dos dados ................................................................................ 36
4.2. Resultados e Discussão ................................................................................. 37
4.2.1. Isolamento de Pectobacterium carotovora ............................................ 37
16
4.2.2. Seleção in vitro de Bactérias endofíticas com habilidade de inibir o
crescimento de Pectobacterium carotovora ............................................................. 37
4.2.3. Interação em fragmentos de folha de Oncidium...................................... 37
4.2.4. Análise da especificidade de Pectobacterium carotovora a
diferentes hospedeiros .............................................................................................. 39
4.2.5. Controle de Podridão mole de Oncidium em estufa ................................ 42
4.2.6. Análise da variabilidade genética por ARDRA....................................... 43
5. Conclusões ................................................................................................................... 46
6. Referências .................................................................................................................. 47
17
1. INTRODUÇÃO
A produção de orquídeas no Brasil vem aumentando a cada ano, tanto na produção de
flores, como para colecionadores. E junto deste cultivo intensivo, um grande número de
pragas e doenças tem sido registrado atacando esta planta hospedeira. Geralmente, as
mudanças climáticas, como temperatura, umidade e modo de cultivo, também propiciam o
aumento desses inimigos naturais. Neste contexto, uma das principais doenças bacterianas de
orquídeas é a podridão mole, causada por Pectobacterium carotovora, uma enterobactéria,
anaeróbica facultativa. Essa bactéria, sob umidade elevada infecta a planta hospedeira e
produz enzimas pectinolíticas, que degradam pectatos de cálcio da lamela média junto à
parede celular, causando extravasamento do conteúdo celular e, conseqüentemente, a
podridão-mole. A disseminação dessas bactérias ocorre basicamente por insetos, água de
irrigação ou de chuva e o seu controle ocorre pela aplicação de sulfato de cobre.
Entretanto, a utilização de pesticidas, os quais são tóxicos para as plantas e para o
meio ambiente deve ser melhor avaliada, pois podem provocar problemas de saúde,
principalmente devido à intoxicações. Além disso, a utilização desses, elimina não só os
agentes nocivos, mas também os que são úteis e necessários à sanidade da planta. Atualmente
com o aumento da prática orgânica na agricultura, pretende-se também utilizar esta estratégia
para o cultivo de orquídeas, melhorando a sanidade das plantas e diminuindo possíveis danos
ambientais. Neste contexto, o desenvolvimento de estratégias de controle biológico de
doenças de orquídeas poderia reduzir os custos e minimizar a utilização de agroquímicos para
a produção de flores e plantas.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Oncidum spp.
As orquídeas são umas das mais apreciadas plantas ornamentais que possuem um alto
valor comercial (FARIA et al., 2001). No Brasil as regiões Sul e Sudeste concentram grande
parte da floricultura nacional, sendo o Estado de São Paulo o principal produtor. A produção
paulista de flores e plantas ornamentais gera aproximadamente 30 mil empregos, sendo destes
45% na produção, 7% na distribuição, 44% no comércio e 4% na indústria de apoio (KÄMPF,
1997).
18
O híbrido Oncidium Aloha Iwanaga, pertence a família Orquidaceae, sendo uma
planta obtida do cruzamento entre Oncidium Goldiana x Oncidium Star Wars, (para maiores
detalhes ver Anexo 01) realizado por Sato, M. (IWANAGA, E.) em 1990. A variedade
Oncidium A. Iwanaga foi introduzida no Brasil em 1996 pelas irmãs Márcia e Lúcia
Morimoto, por importação de mudas do Japão, tendo início então,o processo de propagação
meristemática. Atualmente são produzidas mais de 100.000 mudas por ano em toda região de
São Paulo (MORIMOTO 2005, comunicação pessoal). A Oncidium A. Iwanaga é uma planta
de cor amarelo intenso, de formato grande, e com grande valor no mercado de plantas
ornamentais, com uma renda anual de aproximadamente 1 milhão de reais. Estas plantas
podem ser produzidas em vasos ou também como flores de corte para o complemento em
arranjos florais e buquês (Figura 1).
Devido ao aumento na produção de orquídeas em todo o Brasil, estas também podem
sofrer o ataque de várias doenças e pragas, sendo os principais animais: cochonilhas, pulgões,
besouros, ácaros, moluscos (caramujos e lesmas), fungos (Colletotrichum gloeosporioides,
Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Phyllosticta sp.) bactérias
(Burkholderia gladioli, Pectobacterium carotovora subsp. carotovora e Pectobacterium
carotovora subsp. chrysanthemi) e vírus (CyMV – vírus do mosaico do Cymbidium), ORSV –
vírus da mancha anelar do Odontoglossum e OFV – (Orchid fleck vírus) (CAMPOS, 2002).
Figura 1. Oncidium Aloha Iwanaga. (A) Oncidium em vaso, (B) Haste floral, (C) Formato grande e amarelo intenso. Fonte: Fotos – Sonia N. Minami; Local: Sítio Flores Minami – Biritiba Mirim – SP.
A B C
19
A podridão mole causada por P. carotovora é uma das principais doenças encontradas
em orquídeas (CHIA-HUI et al., 2003), sendo que o cultivo intensivo, mudanças climáticas,
modo de cultivo e temperaturas, podem influenciar no alastramento dessa doença. Diante
disso, é muito importante o estudo de forma alternativas de controle dessa bactéria, visto que
atualmente, somente o controle químico, com um alto custo, apresenta resultados positivos na
prevenção da doença. Além disso, o uso intenso de agroquímicos pode causar danos a planta,
ao homem e principalmente ao meio ambiente.
Neste contexto, com o objetivo de obter plantas de Oncidium Sherry Baby resistente a
P. carotovora, Chia-Hui, et al. (2003) introduziram o gene que codifica a proteína ferrodoxina
de pimentão (pflp), via sistema de Agrobacterium tumefaciens, tornando essa planta
resistentes à podridão mole, mostrando que formas alternativas de controle dessa doença
podem ser avaliadas para se reduzir a necessidade do controle químico.
2.2. Pectobacterium carotovora agente causal da Podridão Mole
2.2.1. Aspectos Gerais
O gênero Pectobacterium foi primeiro proposto em 1945, para incluir as
Enterobacteriaceae pectinolíticas (WALDEE, 1945). Nesta proposta, P. carotovorum subsp.
atroscepticum e P. carotovorum subsp. carotovorum foram incluídas com P. cypripedii.
Brenner (1973) sustentou este conceito baseado em diferentes modelos metabólicos exibidos
por Erwinia stricto sensu e Pectobacterium, demonstrando que estes dois gêneros exibem
diferentes tipos de doenças e mostrou um alto parentesco de DNA intragrupos.
Como as pesquisas recentes têm focado na análise direta de genes e seus produtos
genéticos, comumente associado aos fenótipos tal qual como o tipo de doenças que eles
causam e a relação com o rDNA, tem induzido a dividir certos membros de Erwinia dentro
dos gêneros Enterobacter, Pectobacterium, Pantoea ou Brenneria (HAUBEN et al, 1998).
A posição filogenética do gênero Erwinia em relação a outros membros da
Enterobacteriaceae associado com plantas, foi explorado usando a comparação da seqüência
de nucleotídeos 16s rDNA (KWON et al., 1997; HAUBEN et al., 1998). A partir desta
análise foram propostos gêneros: Erwinia, Pectobacterium, Breneria e Pantoea. O gênero
Erwinia compreende, E. amylovora, E. rhapontici, E. persicina, E. psidii, E. pyrifoliae, E.
mallotivora e E. tracheiphila.
20
Tabela 1. Erwinia sp. causadores de podridão mole que passaram para o grupo das Pectobacterium sp.
Subespécies Doença Sintomas Hospedeiro Referência P. carotovora subsp. carotovora
Podridão mole pós-colheita
Maceração Colheita de grãos, tubérculos, raiz e bulbos.
HAUBEN et al, 1998
P. carotovora subsp. chrysanthemi
Queima da Haste, murcha
Murcha vascular Milho, cravo, crisântemo, plantas tropicais.
HAUBEN et al, 1998
P. carotovora subsp. atroseptica
Canela preta Murcha vascular Raízes de batata, caules baixos e tubérculos.
HAUBEN et al, 1998
P. carotovora subsp. betavasculorum
Podridão mole Maceração Beterraba HAUBEN et al, 1998
P. carotovora subsp. odoriferum
Podridão mole Maceração Endiva HAUBEN et al, 1998
P. carotovora subsp. wasabiae
Podridão mole Maceração Nabo Japonês HAUBEN et al, 1998
P. carotovora subsp. cypripedii
Podridão marrom
Maceração (Cypripedium spp.) Orquídeas
HAUBEN et al, 1998
P. catorovora subsp. brasiliensis
Podridão mole Maceração Tubérculos de batata
DUARTE et al., 2004
O gênero Pectobacterium consiste em espécies capazes de produzir enzimas
pectolíticas: P. carotovora subsp. carotovorum, P. carotovora subsp. atrosepticum, P.
carotovora subsp. betavaculorum, P. carotovora subsp. wasabiae, P. carotovora subsp.
odoriferum, P. caorotovora subsp. chrysanthemi, P. carotovora subsp. cypripedii (HAUBEN
et al., 1998) e recentemente Duarte (2004) incluiu mais uma subespécie de Pectobacterium
neste grupo, P. carotovora subsp. brasiliensis (Tabela 1).
O terceiro grupo compreende E. alni, E. nigrifluens, E. rubrifaciens, E. paradisíaca,
E. quercina e E. salicis. O terceiro grupo foi proposto para ser movido dentro do gênero
Brenneria (HAUBEN et al., 1998). Quarto grupo compreende membros que produz
metabolismo oxidativo incomum de D-glucose e produção de colônias amarelas para malva,
incluídos no gênero Pantoea (GAVINI et al., 1989: KAGEYAMA et al., 1992: MERGAERT
et al., 1993).
A podridão mole causado pela Pectobacterium ssp. representa umas das principais
doenças de orquídeas, pois sob umidade elevada esta bactéria infecta a planta hospedeira e
produz enzimas pectinolíticas, que degradam pectatos de cálcio da lamela média junto à
parede celular, causando extravasamento do conteúdo celular e, conseqüentemente, a
podridão-mole. A disseminação dessas bactérias ocorre basicamente por insetos, água de
irrigação ou de chuva. São bactérias Gram-negativas, não esporulam, anaeróbicos
21
facultativos, caracterizados pela produção de enzimas extracelulares, particularmente a
enzima pectinase (PÉROMBELON M. 2002; BELL et al., 2002). Estas bactérias causam
doenças em batatas, plantas ornamentais, frutas e vegetais (HAUBEN et al., 1998), entretanto
para estes hospedeiros, existem três principais subespécies causadoras de podridão mole e
canela preta: P. carotovora subsp. atrosepticum (Pca), P. carotovora subsp. chrysanthemi
(Pch) e P. carotovora subsp. carotovora (Pcc). Das três bactérias, só Pca e Pch podem causar
também sintomas de canela-preta, mas todas as três causam podridão mole em tubérculos de
batata (PÉROMBELON e KELMAN, 1987). A patogênese depende da temperatura ambiente,
visto que Pca possue a tendência para causar canela-preta em temperaturas abaixo de 25ºC, e
Pch, idependentemente do biovar, em altas temperaturas (PÉROMBELON e KELMAN,
1987). A subespécie Pch ocorre freqüentemente em regiões com climas subtropicais e
tropicais, podendo causar danos também em regiões de clima temperado, enquanto Pcc afeta
principalmente culturas de climas subtropicais e regiões temperadas e Pca exclusivamente em
regiões de clima temperado (PÉROMBELON e KELMAN, 1987; PÉROMBELON e
SALMOND, 1995).
Nos últimos 20 anos, com o avanço dos estudos moleculares foram obtidos progressos
significantes no entendimento desta doença (TOTH et al., 2003). As Pectobacterium podem
ser encontradas em solos e entram nas plantas por meio de ferimentos ou aberturas naturais,
permanecendo nos tecidos vasculares e espaços intracelulares ou na parede fina dos tecidos
parenquimáticos, onde permanecem sob condições ideais como disponibilidade de água e
oxigênio, bem como temperatura, e posteriormente podem desenvolver a doença
(PÉROMBELON e KELMAN, 1980; PEROMBELON e SALMOND, 1995). Outro fator
importante é a presença de água livre, pois esta pode permitir que a célula bacteriana mova-se
mais fáceis nos tecidos da planta, ou reduzir a disponibilidade de oxigênio, criando um
ambiente micro-aeróbico ou anaeróbico dentro da planta (BOLWELL e WOGTASZEK,
1997).
A habilidade da Pectobacterium causador da podridão mole em crescer em diferentes
temperaturas é claramente demonstrado in vitro, sendo importante para a diferenciação de
subespécies. Por exemplo, à 27ºC todos as subespecies crescem, mas a 33,5ºC somente Pcc e
Pch crescem, enquanto Pch cresce também a 37ºC (PÉROMBELON et al., 1987). Devido ao
crescimento em diferentes temperaturas, Pch se tornar patogênico de várias plantas
pertencentes às regiões tropicais e subtropicais, mas pode também afetar plantas (milho,
dália), pertencentes às regiões temperadas (PÉROMBELON, 2002). Ao contrário de Pca que
afeta cultura de regiões onde a temperatura é baixa (PÉROMBELON, 2002).
22
2.2.2. Enzimas envolvidas na patogênese de Pectobacterium
A degradação da parede celular é causada por enzimas extracelulares incluindo
pectinases, proteases e celulases, que liberam nutrientes para o crescimento da bactéria
(BARRAS et al., 1994; PÉROMBELON, 2002; PY et al., 1998; THOMSON et al., 1999).
Pectobacterium apresenta pelo menos dois tipos de celulases em ambos Pch (CelZ e Y) e Pcc
(CelV e S) e, embora não essenciais para patogênese, elas apresentam ação sinergética com
outras exoenzimas de várias outras classes para atacar a planta (BOCCARA et al., 1994;
BOYER et al., 1984, 1987; MÄE et al., 1995; SAARILAHTI et al., 1990; WALKER et al.,
1994). Várias proteases em Pch, e pelo menos uma em Pcc foram também descritas
(DAHLER et al., 1990; KŸOSTIÖ et al., 1991). Pectinases são as principais exoenzimas no
desenvolvimento da doença. Estas exoenzimas quebram a pectina da lamela média e da
parede celular da planta, causando colapso do tecido, dano e estravazemento celular
(BARRAS et al., 1994; PÉROMBELON, 2002). Para isso, são secretadas por três tipos de
sistemas (Tipo I, II e III), os quais são diferentes, mas que parecem ser conservados entre as
diferentes espécies bacterianas dentro e fora do gênero Pectobacterium. O sistema do tipo I
secreta protease do citoplasma para o espaço extracelular e possui um papel menor na
patogênese (DAHLER et al., 1990; DELEPELAIRE e WANDERSMAN, 1990; LÉTOFFÉ et
al., 1990). Já o sistema tipo II, é essencial para patogênese e secreta determinantes de
patogênese tal como pectinases e celulases. O sistema foi estudado em Pcc e Pch e está
também presente em Pca (ANDRO et al., 1984; JI et al., 1987; MURATA, 1990; THURN e
CHATTERJEE, 1985; SANDKVIST, 2001; THONSON et al., 1999).
O sistema de secreção tipo III (TTSS) da podridão mole não está envolvido na
secreção de exoenzima, mas mesmo assim pode ter um papel crucial na interação com a
planta (GALAN e COLLMER, 1999; HUECK, 1998; MUDGETT e STASKAWICZ, 1998).
O TTSS refere-se ao sistema de patogênese hrp (Hypersensitive Response and
Pathogencicity). O conjunto de genes hrp foi identificado em Pch (HAM et al., 1998), Pcc
(RANTAKARI et al., 2001) e Pca (BELL et al., 2002), mas diferem entre si na sua estrutura
de organização.
Outro processo que é crucial para a patogênese é o consumo de ferro, que foi
primeiramente associado à patogênese em Pch (EXPERT e TOUSSAINT, 1985). Neste
contexto, foi observado que Pch produz sideróforos (crisobactina e acromobactina) para a
captura de ions ferro em ambientes pobres neste mineral, sendo um importante fator associado
23
à patogênese da bactéria, podendo a doença se espalhar por toda a planta. Isso foi
demonstrado, pois, mutantes defectivos para o transporte de ferro mediado por crisobactina ou
acromobactina não foram capazes de se disseminar no interior da planta, permanecendo nas
regiões de infecção em folhas de violetas africanas, sugerindo um importante papel deste
sideróforo na disseminação da bactéria na planta (ENARD et al., 1988). Em Pch, genes de
pectato liase são também regulados por ferro, aumentando a complexidade de produção da
exoenzima e também demonstrando claramente a precisão com que este patógeno inicia a
doença (SAUVAGE e EXPERT, 1994). Pcc produz os sideróforos crisobactina e aerobactina,
mas o seu papel no desenvolvimento da doença não foi ainda demonstrado (BULL et al.,
1996; FRANZA et al., 1991; ISHIMARU e LOPER, 1992).
2.2.3. Outros mecanismos de patogênese
Embora podridão mole geralmente ocorra em condições anaeróbicas, quando a
resposta do hospedeiro é prejudicada (PÉROMBELON e KELMAN, 1980), a síntese de
moléculas oxidativa é uma importante forma de defesa do hospedeiro contra a
Pectobacterium (BOLWELL e WOJTASZEK, 1997). Neste contexto, vários genes
associados à patogênese estão relacionados à proteção da bactéria contra este mecanismo,
incluindo aquele que utiliza ferro. Por exemplo, o operon suf de Pch esteja envolvido na
proteção bacteriana visto que mutação em genes desse operon mostrou um aumento na
suscetibilidade para o estresse oxidativo e redução da virulência (NACHIN et al., 2001).
As bactérias possuem uma habilidade de se adaptar por constantes flutuações do meio
ambiente. Para isso podem utilizar moléculas auto-indutoras, chamadas de moléculas quorum-
sensing, as quais permitem à bactéria detectar e responder a variações no meio. Neste caso,
quando uma população de bactérias cresce produzindo a molécula autoindutora,
concentrações críticas podem ativar em cascata a expressão de inúmeros genes envolvidos
com a patogênese. Por isso, regulação no gene de expressão por quorum-sensing permite à
bactéria comportar-se diferentemente de acordo com o número de células bacterianas
presentes. Além disso, comunicação via estas moléculas possibilita à bactéria coordenar os
genes de expressão da comunidade inteira, permitindo com que a cultura bacteriana comporte-
se como um organismo multicelular (SCHAUDER et al., 2001).
A produção de Carbepenen (antifúngico e antibiótico) é dependente da densidade, e,
além disso, ocorre simultaneamente com a produção de exoenzimas. Durante a infecção,
Pectobacterium não só destrói o tecido da planta por nutrientes, mas também inibe, por meio
24
da síntese deste antibiótico, o crescimento de outras espécies de bactérias que poderiam ser
competidoras (PIERSON et al., 1999). A síntese deste antibiótico é regulada por uma
molécula sinalizadora (auto-indutora) o AHL, N-(3-oxohexanoyl) – homoserina lactona. A
partir da descoberta dessa molécula, como uns dos fatores para patogênese (ALT-MORBEE
et al., 1996; LOH et al., 2002), a inativação ou degradação de AHLs, tornou-se alvo para
controle de doenças. Várias plantas e componentes microbiais mostraram ter atividade contra
AHLs. Recentemente, duas proteínas de bactérias que degradam AHLs foram descritas. Em
espécies de Bacillus isolados de solo, AHL-lactonase codificado pelo gene aiiA foi
identificado (DONG et al., 2001; REIMMANN et al., 2002). Outra bactéria de solo,
Variovorax paradoxus, foi identificada como degradadora de AHLs, presumivelmente pela
produção de uma aminoacylase (LEADBETTER et al., 2000).
A primeira aplicação para o conhecimento do papel das moléculas auto-indutoras na
patogênese bacteriana, foi introduzir o gene aiiA, clonado de Bacillus sp. em plantas de tabaco
e batatas (DONG et al., 2001). Este gene codifica uma AHLs-lactonase, e que após
introdução na planta geneticamente, inibe o sistema de quorum-sensing de P. carotovora,
resultando no aumento de resistência da planta contra a doença (MÄE et al., 2001). Neste
contexto, Molina, et al. (2003) construíram uma linhagem de Pseudomonas fluorescens
P3/pME6863 expressando este gene aiiA da bactéria Bacillus sp. Após inoculação na planta,
P. fluorescens P3/pME6863 reduziu significantemente a podridão mole causada pela P.
carotovora e coroa de galho em tomate causada por Agrobacterium tumefaciens. A supressão
da podridão mole em batata foi observada até mesmo quando P. fluorescens P3/pME6863 foi
aplicada nos tubérculos 2 dias após o patógeno, indicando que o biocontrole não é só
preventivo, mas também curativo.
2.3. Diversidade genética avaliada por ARDRA
A evolução das metodologias de biologia molecular, e a sua aplicação ao estudo do
meio ambiente, têm contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento
sobre a diversidade microbiana. Resultados de estudos independentes de isolamento e cultivo,
baseados em amplificação e sequenciamento dos genes de rRNA como o 16S (16S rDNA),
região que é altamente conservada entre as espécies de procariotos (WOO et al., 2003),
demonstraram que a diversidade de microrganismos em amostras ambientais é vasta (HEAD,
1998; HUNTER-CEVER, 1998).
25
Técnicas moleculares como ARDRA é aplicada para o estudo da diversidade
microbiana. Essa técnica consiste na amplificação e posterior digestão do rDNA com enzimas
de restrição. Este método é baseado no princípio de que os sítios de restrição no rDNA são
conservados de acordo com padrões filogenéticos. Desta forma, pode ser utilizado o 16S
rDNA para o estudo de grupos heterogêneos, ou a região espaçadora entre o 16S e o 23S
rDNA para o estudo de grupos muito similares (HEYNDRICKX et al., 1996; VAN ELSAS et
al., 1998; RANJARD et al., 2000). Recentemente, a metodologia de ARDRA tem sido
aplicada para o estudo da diversidade microbiana associada a vegetais ou a diferentes solos
(OVREAS e TORSVIK, 1998; CHELIUS e TRIPLETT, 2001). O valor deste método está na
sua rapidez e habilidade para avaliar diferenças entre grupos filogenéticos, efetuando análises
em vários níveis de classificação, inclusive em estudos de evolução, gerando novos
marcadores para estudos de genética de populações (JORGENSEN e CLUSTER, 1989).
Torres (2005) utilizou a análise por ARDRA e sequenciamento do 16S rDNA, para
avaliar a diversidade genética de bactérias endofíticas pertencentes ao grupo de
Enterobacteriaceae obtidas de cacau, cana-de-acúcar, citros, eucalipto e soja. Baseada nas
análises de ARDRA foi observada uma alta especificidade entre o isolado e seu hospedeiro,
extremamente evidente para citros, cacau e eucalipto.
2.4. Controle biológico de fitopatógenos
2.4.1. Aspectos Gerais
Controle biológico utiliza microrganismos com propriedades antagônicas, mudanças
nas condições ambientais, reduzindo dessa forma a população da praga ou patógeno a níveis
que não causam prejuízos à produção.
O controle natural e o controle biológico de insetos e doenças de plantas de interesse
agrícola ganharam especial atenção pelo fato de apresentar menores custos e menos riscos ao
ambiente, devido a redução do o uso de produtos químicos. Controle biológico foi
freqüentemente usado para defender o desenvolvimento básico e aplicado na pesquisa não só
no Brasil, mas também na América do Sul (LEUCUONA, 1996; ALVES, 1998; MELO e
AZEVEDO, 1998). De fato, por ter uma vasta área de agricultura e o maior território de
regiões tropicais, Brasil e toda América latina, mostram ter sua agricultura severamente
afetada por pestes. O uso de agroquímico, embora diminua o ataque de insetos e
microrganismos fitopatogênicos, ainda representa um alto risco aos trabalhadores do campo e
26
consumidores. Em adesão o uso deste, em certos casos é economicamente inviável. O
controle de pestes e doenças por meio do uso de processos biológicos, por exemplo, uso de
microrganismos entomopatogênicos ou aqueles que inibe/antagonisa outros microrganismos
patogênicos das plantas, é uma alternativa que pode reduzir ou eliminar o uso de produtos
químicos na agricultura (AZEVEDO et al., 2000).
O uso de agroquímico como inseticidas e fungicidas são responsáveis pela eliminação
de importantes espécies como insetos que controla outras pestes e microrganismos que
representam um papel crucial ao meio ambiente, inibindo o crescimento e a multiplicação de
outros fungos e bactérias. Um grupo que é afetado por esta modificação antropogênica é o de
endófitos, os quais são aqueles microrganismos que habitam o interior das plantas, sem causar
danos aparentes ou estruturas externas visíveis (AZEVEDO e ARAÚJO, 2006). Nos anos 70,
os endófitos foram inicialmente considerados neutros, não causando benefícios e nem
prejudicando as plantas, sendo posteriomente avaliados e verificados que apresentam um
importante papel na proteção do hospedeiro contra predadores e patógenos (AZEVEDO et al.,
2000).
Estudos confirmam a interação mutualista entre a planta hospedeira e endófitos, na
qual a planta representa proteção e fonte de nutrientes e em contrapartida os endófitos
produzem compostos antimicrobianos (PLEBAN et al., 1997; BARKA et al., 2002;
MARCON, 2002; KUNOH, 2002; BACON e HINTON, 2002; TAECHOWISAN et al.,
2003), indução de resistência sistêmica (M’PIGA et al., 1997; BENHAMOU et al., 1998;
SIDDIQUE e SHAUKATA, 2002; LODEWYCKX et al., 2002; CLAY e SCHARDL, 2002)
ou produzindo enzimas (quitinases ou celulases) que degradam a parede celular de fungos
patogênicos (PLEBAN et al., 1997; DOWNING e THONSON, 2002; EL-TARABILY,
2003).
As bactérias endofíticas ocupam um nicho ecológico semelhante ao de fitopatógenos,
sendo por esse motivo sugerido que estes microrganismos apresentam grande potencial para o
controle biológico destes patógenos (HALLMANN et al., 1997; KUNOH, 2002; COOMBS et
al., 2004). Desde então, a partir dos anos 80, vários estudos com microrganismos endofíticos
estão sendo realizados, dentre esses, espécies economicamente importantes como citrus
(CHILDS et al., 1965; ARAÚJO et al., 2001; ARAÚJO et al., 2002), algodão (MISAGHI e
DONNDELINGER, 1990), cana-de-açúcar (DOBEREINER, 1992; DONG et al., 1994;
SUMAN et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; BODDEY et al., 2003), trigo (RUPPEL et al.,
1992; LARRAN et al., 2002; CONN e FRANCO, 2004), milho (FISHER et al., 1992;
SOUZA, 1996; ARAÚJO et al., 2000; ESTRADA et al., 2002), banana (PEREIRA et al.,
27
1999), batata (GARBEVA et al., 2000; REITER et al., 2002; LONG et al., 2003), Oncidium
Flexuosum (Orchidaceae) (BRANDT, 2004), ervilha (ELVIRA-RECUENCO), arroz
(ELBELTAGY et al., 2000; ELBELTAGY et al., 2001; JIMÉNES et al., 2003), cenoura
(SURETTE et al., 2003), soja (KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004) e eucaliptos
(PROCÓPIO, 2004).
As bactérias endofíticas podem promover também o crescimento de forma direta e
indireta. A promoção de crescimento de forma direta ocorre pela produção de fitohormônios
(PATTEN e GLICK, 2002; VERMA et al., 2001; PEDRAZA et al., 2004), fixação biológico
de nitrogênio (RIGGS et al., 2001;OLIVEIRA et al., 2002; COCKING, 2003) e solubilização
de fosfato inorgânico e mineralização de fosfato orgânico que poderá ser utilizado pela planta
(RODRIGUEZ e FRAGA, 1999; VERMA et al., 2001); Indiretamente a promoção de
crescimento ocorre devido à síntese de antibiótico (RAUPACH e KLOEPPER 1998;
BONATERRA et al., 2003) ou sideróforos (BELLIS et al., 2001) produzido pela bactéria
endofítica, os quais reduzem os efeitos deletérios causados por microrganismos
fitopatogênicos.
A comunidade endofítica é muito dinâmica, havendo interações entre as espécies
bacterianas e entre estas com o hospedeiro. Araújo et al. (2001) isolaram inúmeras bactérias
endofíticas de porta-enxertos de citros, entre elas Alcaligenes sp., Bacillus megaterium, B.
pumilus, B. subtilis, B. cepacea e P. agglomerans. Foram realizados testes in vitro de
interação entre tais bactérias e Guignardia citricarpa, a qual pode influenciar a composição
da população endofítica nas folhas deste hospedeiro. Neste estudo foi verificado que o fungo
G. citricarpa, isolado endofiticamente de folhas, inibiu inúmeras bactérias do gênero Bacillus,
e estimulou o crescimento de Erwinia herbicola (sin. P. agglomerans) (ARAÚJO et al., 2001;
AZEVEDO et al., 2000), mostrando que um microrganismo pode alterar a comunidade
endofítica da planta hospedeira.
Brandt (2004), isolou bactérias endofíticas de Oncidium flexuossum (Orchidaceae) de
folhas, pseudobulbo, rizoma e raiz para avaliar a capacidade das bactérias em produzir auxina,
solubilizar fosfato e fixar nitrogênio importantes na promoção de crescimento vegetal. Este
estudo poderá servir de subsídio para o desenvolvimento de estratégias de controle biológico
de patógenos de orquídeas, bem como avaliar o potencial biotecnológico destas bactérias na
área farmacêutica, industrial e agrícola.
Estudos têm mostrado que pelo menos 15 gêneros (Tabela 2) de bactérias são capazes
de controlar doenças fúngicas ou bacterianas, destes, Bacillus e Pseudomonas tem mostrado
um maior potencial para o controle efetivo de doenças (ARAÚJO, 2000).
28
Tabela 2. Bactérias endofíticas isoladas de tecidos vegetais sadios. Com potencial para o controle biológico de
doenças fúngicas e bacterianas (modificado de Araújo, 2000)
Endofíticos Patógeno Hospedeiro Alcaligenes piechaudii Xanthomonas campetris Repolho Arthrobacter ilicis; Agrobacterium tume faciens, Bacillus brevis; B. megateium; Cellulomonas turbata; Curtobacterium citreum; Klebsiela pneumonae; Pseudomonas cichorii; P. corrugata; X. campestris; X. orizae
Rhizoctonia solani Trevo e batata
Bacillus spp. Verticillium dabliae Acer sp. Bacillus alcalophilus; Curtobacterium luteum; Pseudomonas sp.; Serratia liquefaciens; S. plymuthica;
Pectobacterium carotovora var. atroseptica
Batata
Bacillus amyloliquefaciens Botrytis cinerea e P. carotovora var. atroseptica
Batata e Pêra
B. cereus R. solani; Sclerotium rolfsii Algodão e feijão B. pumilus Botrytis cinérea;
Colletotrichum orbiculare; Erwinia tracheiphila; Fusarium oxysporum; Pseudomonas syringae pv. Lacrymans; R. solani; Sclerotina rofsii
Pepino, pêra, tomate algodão, feijão
B. subtilis Colletotrichum orbiculare; Cryphonectria parasítica; E. tracheiphila; P. syringae pv. Lacrymans; Pythium ultimum; R. solani; S. rolfsii
Algodão, feijão, pepino, castanha, poncã
Burkholderia cepacia F. oxysporum f. sp cubense Banana C. flaccumfaciens C. orbiculare; E
tracheiphila; P. carotovora var. atroseptica; P. syringae pv. lacrymans; R. solani
Batata, pepino, trevo
Enterobacter cloacae F. moniliforme Algodão e milho Kluyvera ascorbata X. campestres pv.
campestris Repolho
Pantoea agglomerans P. carotovora var. atroseptica; E. amylovora; R. solani
Batata, pêra, trevo
Psudomonas sp. Verticillium dabliae Tomate P. aureofaciens A. tumefaciens Uva e framboesa P. denitrificans Cerotocystis fagacearum Carvalho
29
Tabela 2. Bactérias endofíticas isoladas de tecidos vegetais sadios. Com potencial para o controle biológico de
doenças fúngicas e bacterianas (modificado de Araújo, 2000) (Continuação)
Endofíticos Patógeno Hospedeiro P. fluoresens Agrobacterium tumefaciens;
C. orbiculare; F. oxysporum; Phoma tracheiphila; P. syringae pv. lachrymas; Pythium ultimum; R. solani; S. rolfsii
Algodão, arroz, cravo, framboesa, pepino, pncã, rabanete, tomate, uva
P. putida C. fagacearum; R. solani Arroz e carvalho P. solanacearum V. dalhiae Batata Streptomyces sp. Phytophthora cinnamont e
Pestalotiopsis sydowiana Rododendrom
No Brasil, o controle biológico começou a ser utilizado com o fungo entomo-
patogênico Metarhizium anisopliae, no controle das cigarrinhas da cana e das pastagens
(ATHAYDE et al., 2001; ALVES, 1998). Na cultura do cacau, o fungo Trichoderma tem sido
utilizado em restos de ramos doentes para o controle do fungo Crinipellis perniciosa, agente
causal da vassoura de bruxa, mostrando que esta estratégia se bem conduzida pode resultar em
controle efetivo de pragas e doenças.
2.4.2. Utilização de Burkholderia para o controle de doenças
Dentre os vários microrganismos endofíticos estudados e pesquisados, um grupo de
bactéria que representa grande interesse, pertence ao gênero Burkholderia. As espécies do
gênero Burkholderia possuem uma ampla distribuição, ocorrendo em solos (ACHOUAK et
al., 1999), águas (VERMIS et al., 2003) e associados com plantas (BALANDREAU et al.,
2001; BEVIVINO et al., 1998; MOULIN et al., 2001, PROCÓPIO, 2004), fungos (LIM et
al., 2003), animais e humanos (COENYE et al., 2001). Algumas espécies de Burkholderia
foram encontradas associadas a fungos. B. fungorum foi isolada do fungo Phanerochaete
chrysosporium, e foi sugerido que possa ser uma relação simbiótica entre esta bactéria e o
fungo (COENYE et al., 2001). Em outro exemplo do potencial de simbiose, Burkholderia foi
encontrado na junção de meio de intestino e no intestino de formigas Tetraponera, onde pode
estar envolvido com a reciclagem oxidativa dos resíduos metabólicos de nitrogênio-rico
(VAN BORM et al., 2002).
Em geral, espécies de Burkholderia são bactérias saprofíticas de solos, mas espécies
como B. mallei e B. pseudomallei podem causar doenças em animais e humanos (DANCE,
2000). Da mesma forma B. cepacia que pode ser isolada de amostras clínicas, principalmente
30
de pacientes com fibrose cística (FC), onde são considerados serem patógenos oportunistas
(COENYE et al., 2001).
Espécies pertencentes ao gênero Burkholderia foram identificadas como agente de
biocontrole em muitos patógenos de plantas, como, Pythium aphanidermatum, Pythium
ultimum, Fusarium sp., Phytophthora capsici e Rhizoctonia solani (CAIN et al., 2000;
HEBBAR et al., 1998; HEYDARI et al., 1998; LI et al., 2002). Além disso, um isolado de
Burkholderia sp. inibe o crescimento de bactérias e leveduras patogênicas (CAIN et al.,
2000). A habilidade de Burkholderia em reprimir doenças em plantas foram observadas em
diferentes produtos agrícolas, tais como milho, milho doce, algodão, ervilha, tomate e
pimentão (HEBBAR et al., 1998; HEYDARI et al., 1998; LI et al., 2002). Em muitos estudos
mencionados acima, o mecanismo envolvido na repressão de doenças não foi muito bem
entendido. Componentes antibióticos tal como phenazina e pyrrolnitrina podem ser
produzidos por B. phenazinium, B. pyrrocinia, B. ambifaria AMMD e B. cepacia NB-1 e um
novo lipopetídeo antifúngico foi identificado em B. cepacia variedade BC11 (EL BANNA et
al., 1998; KANG et al., 1998). Procópio (2004) avaliou em teste de interação “in vitro” um
isolado de Burkholderia cepacia (EGS15), endofítico de Eucalyptus spp., mostrando que este
isolado foi capaz de afetar o crescimento dos fungos patogênicos Rhysoctonia solani,
Cylindrocladium scoparium e Botrytis cinerea.
A fixação biológica de nitrogênio é um processo comum entre as espécies de
Burkholderia, visto que a habilidade para fixar nitrogênio atmosférico, inicialmente
observado somente em B. vietnamiensis, foi estendida para outras espécies, incluindo B.
kururiensis (ESTRADA-DE LOS SANTOS et al., 2001), B. unamae (CABALLERO-
MELLADO et al., 2004), B. tropica (REIS et al., 2004; WEBER et al., 2000) e B. brasilensis
(REIS et al., 2004; WEBER et al., 2000). As plantas de arroz produzidos no Brasil possuem a
capacidade de fixar 31% do total de nitrogênio e, quando inoculados com uma espécie
endofítica de Burkholderia, esse valor aumentou para 69% do total de fixação (BALDANI et
al., 2000). Além disso, esse aumento da fixação de nitrogênio, com a introdução de
Burkholderia diazotrófica, foi observado também em cana-de-açúcar e em milho (RIGGS et
al., 2001), mostrando que não ocorre especificidade desta bactéria ao hospedeiro.
Espécies de Burkholderia são utilizadas também como bioremediadores, um processo
em que os microrganismos trabalham para reduzir a concentração e toxicidade de poluentes
químicos do meio ambiente (DUA et al., 2002). Muitas variedades diferentes, todas
identificadas como B. cepacia, têm mostrado uma habilidade para degradar componentes
31
xenobióticos, tal como cianida e bifenilas policlorados (PCBs) (ADJEI et al., 1999;
MALTSEVA et al., 1999).
Esses estudos demostram a importância do uso de endótitos, neste caso, espécies de
Burkholderia, para o controle de doenças de interesse agrícola, bem como para a produção de
moléculas de interesse farmacêutico. Mas esta diversidade pode ser afetada principalmente
por mudanças nos manejos agrícolas, como o uso intensivo de agroquímicos, os quais podem
alterar a frequência desses microrganismos.
32
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O presente trabalho teve por objetivo avaliar a utilização de bactérias endofíticas para
o controle da podridão mole em Orquídeas, causada por Pectobacterium carotovora (Sin.:
Erwinia carotovora).
3.2. Objetivos específicos
- Selecionar bactérias endofíticas antogonistas a Pectobacterium carotovora in vitro;
- Avaliar o controle da podridão mole de Oncidium Aloha Iwanaga utilizando
bactérias endofíticas;
- Avaliar a diversidade genética de P. carotovora por meio de ARDRA;
- Avaliar a especificidade de diferentes haplótipos de P. carotovora a Oncidium
Aloha Iwanaga;
- Avaliar a especificidade de P. carotovora de Oncidium a diferentes espécies de
orquídeas.
33
4. MÉTODOS
4.1 . Isolados bacterianos e condições de cultivo
Além dos isolados de Pectobacterium sp. obtidos no presente trabalho, foram
utilizados 3 isolados de P. carotovora subsp. carotovora (Pcc), 3 de P. carotovora subsp.
atroscepticum (Pca), 2 de P. carotovora subsp. odorífera (Pco), 1 de P. carotovora subsp.
chrysanthemi (Pch) (BENELLI et al., 2004) e 6 isolados de P. carotovora subsp. brasiliensis
(Pcbr) (DUARTE et al., 2004). Os isolados foram cultivados em meio TSB 5% (Caldo Soja
Triptonado) a 28ºC por 5 dias.
As 150 bactérias endofíticas foram também isoladas de Oncidium flexuosum
(BRAND, 2004), as quais pertencem à coleção do Núcleo Integrado de Biotecnologia
(NIB/UMC, Mogi das Cruzes, São Paulo). Foram utilizados também, isolados endofíticos de
Burkholderia sp., obtidos de Eucalyptus (PROCÓPIO, 2004) e de cana-de-açúcar da coleção
do Laboratório de Genética de Microrganismos (ESALQ/USP, Piracicaba, São Paulo). As
bactérias foram cultivadas em meio TSB 5% a 28ºC por até 5 dias.
4.1.1. Isolamento de Pca e confirmação de patogênese
Para o isolamento de Pectobacterium sp. de lesões de orquídeas, foram coletadas 10
amostras de folhas e 10 pseudobulbos de Oncidium Aloha Iwanaga e 5 amostras de folhas e 5
amostras de pseudobulbos de Oncidium Sherry Baby de diferentes plantas sintomáticas. Para
isso, o tecido vegetal foi desinfectado superficialmente por meio de tratamento em álcool 70%
por 1 minuto, hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) por 1 minuto, álcool 70% por 1 minuto
e lavado com água destilada esterilizada. Foram cortados segmentos de 2 por 2cm e colocados
em placas de petri com meio TSB 5% suplementado com o fungicida Benomyl (50µg.ml-1), e
incubados a 28º C por até 5 dias.
Para confirmação da patogênese dos isolados de Pectobacterium, estes foram
cultivados em meio TSB 5% a 28ºC por 5 dias, introduzidos em frutos de pimentão verde
(Capsicum annuum L.), lavados com água destilada e esterilizada (TAKATSU et al., 1981).
Os pimentões foram colocados em bandeja, cobertos com papel pardo e incubados a 28ºC por
até 3 dias para a confirmação do sintoma de podridão mole. O pimentão é utilizado como
modelo para a detecção de bactérias pectinolíticas (TAKATSU et al., 1981).
34
4.1.2. Interação in vitro das bactérias endofíticas e Pca
Cinco linhagens de P. carotovora foram crescidas em meio TSB 5% líquido,
incubadas (150rpm) a 28ºC por 18 horas e semeadas (105 UFC.mL-1 ) sobre meio TSB 5%.
Em seguida 50 µl do sobrenadante da bactéria endofítica (crescido em meio TSB 5% por 18
horas) de interesse foram colocados em uma cavidade (0,5 cm) feita previamente no meio
TSB 5% inoculado com Pectobacterium e mantidasa 28º C por 5 dias. A inibição da bactéria
patogênica foi caracterizada pela formação de halo.
4.1.3. Inoculação em folhas de Oncidium
Os diferentes isolados de Pectobacterium sp.e a avaliação da interação de P.
carotovora (11-ORQF04F e 16-ORQF03J) com bactérias endofíticas, fragmentos (2 x 2 cm)
foram colocados em câmara úmida (5 fragmentos por câmara), em folhas de Oncidium. Para
isso, todos os isolados foram crescidos em 5ml do meio TSB 5% líquido a 28ºC por 18 horas
e 5µl da cultura bacteriana diluída (105 UFC mL-1) foram inoculados nos fragmentos
previamento perfurados com palito de madeira. Após inoculação, as amostras foram mantidas
em câmara úmida a 28ºC por até 5 dias. Todos os experimentos foram realizados com, pelo
menos, 5 repetições, e foi sempre utilizado como controle fragmentos inoculados com o
tampão PBS, somente com o patógeno ou somente com o endófito.
4.1.4. Controle da podridão mole na planta hospedeira
Mudas de Oncidium cultivadas in-vitro foram aclimatadas e cultivadas em vasos com
musgo esfagno. As mudas foram mantidas em casa de vegetação, com sombreamento de 50%
e regime de rega, duas a três vezes por semana, ou de acordo com a necessidade. Os
diferentes isolados de Pectobacterium sp. foram inoculados em pelo menos uma folha de
Oncidium. Para isso todos os isolados foram crescidos em 5ml do meio TSB 5% líquido a
28ºC por 18 horas e 5µl da cultura bacteriana diluída (105 UFC mL-1) foram inoculados nos
fragmentos previamento perfurados com palito de madeira. Após inoculação, as amostras
foram mantidas em câmara úmida a 28ºC por até 5 dias.
35
4.1.5. Análise da especificidade de Pectobacterium carotovora a diferentes
hospedeiros.
Para avaliar a especificidade dos isolados de Pectobacterium a diferentes espécies de
orquídeas, o procedimento descrito no item 4.1.4 foi repetido com plantas dos gêneros
Oncidium, Phalaenopsis, Cattleya e Miltonia. A capacidadede Burkholderia sp. em controlar
a podridão mole também foi avaliada nestas plantas. Para isso, o procedimento descrito no
item 4.1.3 foi repetido, utilizando diferentes concentrações (105; 104; 103 UFC.mL-1) da
bactéria endofítica. Em cada concentração foram inoculados 5µl de 105 UFC.mL-1, 5µl de 104
UFC.mL-1 e 5µl de 103 UFC.mL-1.
Em outro experimento as diferentes subespécies de P. carotovora. foram inoculadas
em fragmentos de folhas de Oncidium (de acordo com o item 4.1.3) para avaliar a
especificidade da planta à bactéria patogênica.
4.1.6. Análise da variabilidade genética de Pectobacterium por ARDRA
4.1.6.1. Extração do DNA total de Bactérias
As bactérias foram crescidas em 5ml de TSB 5% por 24h a 28ºC sob agitação de
(150rpm). Dois a 4ml da cultura foram centrifugados a 12000 X g por 5 minutos, descartado
o sobrenadante e ressuspendido em 500µl de TE (10ml Tris-HCL 1M pH 7,5; 2ml EDTA
0,5M pH 8,0; 1000ml de água destilada), centrifugado e ressuspendido em 500µl de TE,
adicionados 30µl de SDS 10% e 0,5g de sílica. As células foram agitadas em um
homogenizador (BeadbeaterTM, Biospec Products) por 45s a 3500 X g . Às células lisadas
foram adicionadas 250µl de fenol saturado e 250µl de clorofórmio, homogenizado por
inversão e centrifugados a 12000 X g por 5 minutos. A fase superior foi transferida para um
novo tubo e acrescentado 450µl de clorofórmio, centrifugado, transferido novamente para um
novo tubo e adicionado 0,1µl do volume de NaCL e 0,6 do volume de isopropanol, incubados
por 5 minutos a temperatura ambiente e em seguida centrifugado por 10 minutos a 12000 X g.
O precipitado do DNA foi lavado com etanol 70%, seco a 37ºC por 30 minutos,
ressuspendido com TE e deixado em banho-seco a 60ºC por 10 minutos. O DNA total foi
analisado em gel de eletroforese em gel de agarose (1,2%).
36
4.1.6.2. Amplificação do 16s rDNA
A amplificação do 16s rDNA foi realizada por meio da técnica PCR com os primers
universais P027F (5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e 1378R (5’-
CGGTGTGTACAAGGCCCGGAACG-3’). As reações apresentaram volume final de 50µl
contendo 0,5 a10ng de DNA molde; 0,1 de cada primer; 2,5mM de cada dNTPs; 3,75 mM de
MgCl2 e 0,05U da enzima Taq DNA polimerase em 20 mM de Tris-HCL pH 8,4 e 50 mM
KCL.. Em todas as reações foi utilizado um controle negativo sem o DNA molde.
A reação de amplificação foi realizada em termociclador (Perkin-Elmer GeneAmp®
PCR System 9700) programado para realizar um desnaturação inicial a 94ºC por 4 min., 25
ciclos de desnatuaração a 94ºC por 30s, anelamento a 63ºC por 1 min e extensão de primers
72ºC por 1 min., seguida de extensão final a 72ºC por 7 min. Após a amplificação, 5µl da
reação de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de agarose (1,2%) em tampão 1x TAE
e corado com brometo de etídio.
4.1.6.3. Clivagem do 16S rDNA (ARDRA)
Para a clivagem, foram utilizadas 1µg do fragmento de 16s rDNA amplificado,
clivados com as enzimas de restrição MboI, AluI e HhaI, empregando uma enzima para cada
reação de digestão. As reações de digestão foram realizadas a 37ºC por 2 horas, em volume
final de 15µl. Após a digestão, toda a reação foi analisada por eletroforese em gel de agarose
(2% p/v) em 1x TAE, juntamente com o marcador de peso molecular DNA Ladder 100pb
(Life Technologies). Em seguida o gel foi corado com brometo de etídio, observado sobre luz
ultravioleta e fotodocumentado.
4.1.6.4. Análise dos dados
Os dados obtidos nos géis de eletroforese foram transformadas em dados binários (1
para presença e 0 para ausência de bandas). Foram consideradas somente bandas fortes e com
alta reprodutibilidade. Os dados foram colocados no programa NTSYS-pc (Numerical
Taxonomy and Multivariante Analysis Systen, versão 2.02), o qual construiu uma matriz de
similaridade, utilizando o coeficiente de Jaccard (J). A partir dessa matriz foi construído o
dendrograma pelo método UPGMA (“Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic
Average”), estabelecendo a correlação genética entre os diferentes isolados.
37
4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.2.1. Isolamento de Pectobacterium carotovora
As bactérias obtidas de lesões em folhas e pseudobulbo de orquídeas foram purificadas
e colônias isoladas foram inoculadas em pimentão, para confirmar a capacidade de causar
podridão mole neste hospedeiro, típico da Pectobacterium carotovora (Pca). Todos o isolados
causaram sintomas em pimentão e, dessa forma, 5 isolados foram selecionados e reinoculados
nos hospedeiros específico (Oncidium Aloha Iwanaga) para confirmação do postulado de
Koch.
4.2.2. Seleção in vitro de Bactérias Endofítica com habilidade de inibir o
crescimento de Pectobacterium carotovora A seleção in vitro de bactérias endofíticas capazes de inibir Pca mostrou que na
população bacteriana avaliada (isolados de Oncidium flexuosum, Eucalyptus sp. e Saccharum
sp.), a freqüência de isolados produtores de substâncias antagônicas a Pca é muito baixa,
visto que de 125 isolados avaliados nenhum foi capaz de inibir o crescimento de Pca. Tendo
em vista que a inibição de um patógeno pode envolver competição e parasitismo, foram
também utilizadas para a seleção de potenciais agentes de controle da podridão mole de
orquídeas.
4.2.3. Interação em fragmentos de folha de Oncidium
Para a interação entre bactérias endofíticas e Pca, foram avaliados 28 isolados
endofíticos de O. flexuosum, juntamente com 5 isolados de Burkholderia sp. obtidos de
eucaliptos e cana-de-açúcar. Da mesma foram que observado para os experimentos in vitro,
nas análises in planta os isolados endofíticos de O. flexuosum não inibiram os patógenos, fato
este constatado pela observação dos sintomas de podridão mole nos fragmentos foliares da
planta hospedeira. Entretanto, os isolados de Burkholderia foram capazes de inibir o
aparecimento dos sintomas da podridão mole nos fragmentos foliares, sendo o isolado SpII2,
de Eucalyptus, o mais eficiente, inibindo completamente o desenvolvimento dos sintomas
causados por P. carotovorum no fragmento foliar da planta avaliada (Figura 3). Nas amostras
onde foi apenas inoculado o isolados SpII2 foi observada apenas uma reação de
38
hipersensibilidade (Figura 3), a qual poderia ser responsável pela inibição dos sintomas da
podridão mole.
Diversos trabalhos têm mostrado o potencial da utilização de Burkholderia no controle
de fitopatógenos (CAIN et al., 2000; KANG et al., 1998 e PROCÓPIO, 2004), sendo
atribuída este controle à produção de compostos antimicrobianos. Entretanto, tendo em vista
que os isolados de Burkholderia avaliados não inibiram Pca in vitro pode ser sugerido que
neste caso a inibição possa envolver outros mecanismos como competição, degradação de
moléculas sinalizadoras (quorun sensing) ou produção de composto antimicrobiano induzido
pela presença do patógeno.
Figura 2. Interação entre Pectobacterium carotovora e Burkholderia em folhas de Oncidium (A) Sintoma causado pela Pectobacterium carotovora. (B) O meio de cultura não causou lesão. (C) Inibição causada pela Burkholderia contra a Pectobacterium carotovora, no local uma reação de hipersensibilidade. (D) A Burkholderia não causou danos a planta. Fonte: Foto – Sonia N. Minami.
Patógeno
Patógeno
+
bacteria endofítica
Meio de cultura
Bactéria endofítica
A B
C D
39
4.2.4. Análise da especificidade de Pectobacterium carotovora a diferentes
hospedeiros. Nesse experimento com diferentes hospedeiros e diferentes diluições foi observado
que a inibição de Pca por Burkholderia, depende das concentrações utilizadas e também do
hospedeiro, pois em concentrações semelhantes (105 UFC ml-1) do endófito e do patógeno, foi
observada inibição total dos sintomas da podridão mole causada por P. carotovorum.
Entretanto, em concentrações menores do endófito (104 e 103 UFC ml-1) essa inibição não foi
observada em Oncidium, Cattleya e Phalaenoposis. Em Miltonia sp. a inibição não foi
observada em nenhuma das concentrações avaliadas, mostrando que este controle depende de
uma interação patógeno-endófito-hospedeiro (Figura 3).
No experimento em que foram inoculadas as diferentes subespécies de P. carotovora
em folhas de Oncidium, as subespécies patogênicas em batata, não causaram sintomas nas
folhas de Oncidium. Já os isolados de Oncidium e Sherry Baby causaram sintomas típicos de
podridão mole (Figura 4), mostrando que ocorre especificidade dos isolados de P. carotovora
ao seu hospedeiro.
Esta suscetibilidade de orquídea a somente os seus isolados, não é observado em
batata (Solanum tuberosum), visto que todas as subespécies são capazes de causar podridão
mole neste hospedeiro. P. carotovora pode causar doenças em diferentes hospedeiros, mas as
subespécies existentes podem causar doenças em hospedeiros específicos (WALDEE, 1945),
sendo que P. carotovora subsp. carotovora (Pcc) pode causar sintomas de podridão em
tecidos de uma ampla variedade de plantas (WALDEE, 1945), enquanto que P.c. subsp.
atrocepticum (Pca) causa sintomas de canela-preta em batatas e podridão em tubérculos de
batatas estocadas (WALDEE, 1945). Já P.c. subsp. betavasculorum (Pcb) causa necrose
vascular em raízes de beterraba açucareira (THOMSON et al., 1981), P.c. subsp. wasabiae
causa podridão em nabo japonês (GOTO e MATSUMOTO, 1987), P.c. subsp. odoriferum
(Pco) podridão viscosa em endivia (GALLOIS et al., 1998), e P.c. subsp. chrysanthemi causa
murcha vascular ou necrose parenquimal em uma ampla variedade de plantas ornamentais e
agrícolas, como o milho (BRENNER et al., 1973).
Recentemente, foi proposta uma nova subespécie, P.c. subsp. brasiliensis (Pcbr)
(DUARTE et al. 2004), a qual pode ser específica para o Brasil, visto que estirpes brasileiras,
identificadas como Pectobacterium carotovora subsp. atrosepticum, apresentam perfis
genético, bioquímicos, fisiológicos e sorológico diferentes que suportam uma nova subespécie
40
(DUARTE et al., 2004). Assim como a P.c. subsp. atrosepticum, a P.c. subsp. brasiliensis
causa a canela-preta em tubérculos de batata.
Figura 3. Interação endofítico e patógeno em diferentes hospedeiros e deferentes diluições do endofítico. (A) Fragmento de Oncidium inoculados com a mesma proporção do endófito e patógeno, mostrou inibição total, enquanto que diminuindo a concentração do endófito essa inibição não ocorreu. Esse mesmo resultado foi obtido em (B) Cattleya e (C) Phalaenopsis. Mas em (D) Miltonia não ocorreu inibição em nenhuma das concentrações. Fonte: Foto – Sonia N. Minami.
OOnncciiddiiuumm AAlloohhaa
IIwwaannaaggaa
CCaattttlleeyyaa
PPhhaallaaeennooppssiiss
MMiillttoonniiaa
A B
C D
TSB 5% Bc 105 Pca 105
Pca10 5 + Bc 105
Pca 105
+ Bc 104 Pca 105
+ Bc 103
TSB 5% Pca 105 Bc 105
Pca10 5 + Bc 105
Pca 105
+ Bc 104 Pca 105
+ Bc 103
TSB 5% Pca 105
Bc 105
Pca10 5 + Bc 105
Pca 105
+ Bc 104 Pca 105
+ Bc 103
TSB 5% Pca 105 Bc 105
Pca10 5 + Bc 105
Pca 105
+ Bc 104 Pca 105
+ Bc 103
41
Figura 4. Análise da especificidade de diferentes subespécies de Pectobacterium carotovora, em folhas de Oncidium Aloha Iwanaga . Pc Oncidium – P. carotovora isolado de Oncidium. Pc Sherry Baby – P. carotovora de Sherry Baby (Orquidaceae). Pco 1814 – P. carotovora subsp. odorífera. Pcbr 424 – P. carotovora subsp. brasiliensis. Pcc 1113 – P. carotovora subsp. carotovora. Pca 1819 – P. carotovora subsp. atrosceptium. Pca N – P. carotovora subsp. atrosceptium. Pch N- P. carotovora subsp. chrysanthemi. Pcbr 285 – P. carotovora subsp. brasiliensis. Pcbr 371 – P. carotovora subsp. brasiliensis. Pcbr 1692 – P. carotovora subsp. brasiliensis. Pcc BAB –20 – P. carotovora subsp. carotovora. Fonte: Foto – Sonia N. Minami.
P.c. Oncidium
P.c. Sherry Baby Pco - 1814 Pcbr - 424 Pcc - 1131 Pca - 1819
Pca - N Pch - N Pcbr - 285 Pcbr - 371 Pcbr - 1692 Pcc – BAB-20
42
4.2.5. Controle de podridão mole de Oncidium em estufa
O controle da podridão mole observado em fragmentos de folhas foi também
verificado in planta (Figura 5), visto que a inoculação conjunta de P. carotovora e
Burkholderia sp. (isolado SpII2) resultou em controle de 100% nos sintomas da doença.
Este resultado mostra que o controle da podridão mole de orquídeas por bactérias
endofíticas pode ser efetivo. Entretanto, novos experimentos deverão ser conduzidos para
determinar as melhores dosagens e condições de aplicação do endófito para controle efetivo
do patógeno em condições de cultivo comercial. À luz do conhecimento atual, este trabalho
mostra o potencial da utilização do isolado SpII2 para o controle da podridão mole de
orquídeas.
Figura 5. Interação endofítico e patógeno em vasos e deixados em estufa. (A) Planta de Oncidium inoculado com P. carotovora. (B) Inoculado com o endofítico, mostrando não afetar a planta e (C) A inibição do crescimento de P. carotovora pela Burkholderia sp. Fonte: Foto - Sonia N. Minami.
A B C
43
4.2.6. Análise da variabilidade genética por ARDRA
Para analisar a variabilidade genética das bactérias patogênicas, foram utilizadas 3
enzimas de restrição: AluI, HhaI e MboI. A partir da combinação dos perfis obtidos com estas
3 enzimas de restrição (Figura 6) foi possível obter 7 haplótipos diferentes (Tabela 3). A
figura 7 mostra o dendrograma representando o nível de similaridade genética entre esses
haplótipos. Figura 6. Perfis de restrição do 16S rDNA de Pectobacterium sp., utilizando as enzimas AluI, HhaI e MboI. M) Marcador DNA Ladder 100 pb (Invitrogem). Pcbr 1692) Pectobacterium carotovora subsp. brasiliensis. Pca 1819) Pectobacterium carotovora subsp. atroscepticum. SB) Sherry baby e Oncidium (Orquidaceae). Pcc BAB) Pectobacterium carotovora subsp. carotovora. Pch Nor.) Pectobacterium carotovora subsp. chrysanthemi. Pcbr 424) Pectobacterium carotovora subsp. brasiliensis. Pcbr 258) Pectobacterium carotovora subsp. brasiliensis.
Pcbr
1692
Pca
1819
SB
Onci
Pcc
Bab
Pch
Nor.
Pcbr
424
Pca
1819
Pcc
Bab
Pcbr
1692
SB
Onci
Pcc
Bab
Pcbr
258
Pch
Nor.
AluI HhaI MboI
600pb 600pb
M M
44
Tabela 3. Distribuição dos haplótipos
ISOLADO ESPÉCIE HAPLÓTIPO 11-ORDF04-F P. carotovora D 12-ORDF04-E P. carotovora D 15-ORDB03-K P. carotovora D 16-ORDF03-J P. carotovora D 17-ORDF02-I P. carotovora D
SBF1B P. carotovora D SBF2B P. carotovora D SBB1 P. carotovora D
SBF1A P. carotovora D 1131 P. carotovora subsp. carotovora A 1131 P. carotovora subsp. carotovora A 1814 P. carotovora subsp. odorífera A 1814 P. carotovora subsp. odorífera A 424 P. carotovora subsp. brasiliensis B 424 P. carotovora subsp. brasiliensis B 1819 P. carotovora subsp. atrosceptium C 1819 P. carotovora subsp. atrosceptium C 1692 P. carotovora subsp. brasiliensis A 1692 P. carotovora subsp. brasiliensis A
BAB-20 P. carotovora subsp. carotovora E 285 P. carotovora subsp. brasiliensis F N P. carotovora subsp. chrysanthemy G
Foi observado que os isolados obtidos de Oncidium se agrupam formando o haplótipo
D (Tabela 3), e este haplótipo é completamente diferente dos haplótipos de isolados de batata,
mostrando que são geneticamente diferentes, podendo petencer a uma subespécie não incluída
neste trabalho ou a uma nova subespécie.
Os dados também suportam os resultados de especificidade, visto que somente
isolados do haplótipo D induziram sintomas da podridão mole em Oncidium, sugerindo que
este haplótipo pode ser específico para orquídeas. Até o presente momento, não foi observado
na literatura estudo de variabilidade genético com isolados de Pca obtidos de orquídeas.
Dessa forma, o presente trabalho deverá contribui não somente para o desenvolvimento de um
controle biológico efetivo da podridão mole de orquídeas, mas também do entendimento da
variabilidade genética nestes grupos bacterianos.
45
Figura 7. Dendrograma mostrando o nível de similaridade genética entre os 4 haplótipos obtidos por meio da análise de ARDRA com 3 enzimas de restrição. A matriz de similaridade foi calculada utilizando o coeficiente de JACCARD e o dendrograma construído pelo método de UPGMA.
Pcc Pco Pcbr
Pca
Pcbr
Pcbr
Pc. de Orq.
Pcc
Pch
95,8
74,8
90,0
42,6
57,4
46
5. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que:
- A bactérias endofítica Burkholderia sp., isolada de Eucalyptus sp., controla de forma
eficiente os sintomas de podridão mole em Oncidium Aloha Iwanaga, causados por
Pectobacterium carotovora;
- O controle da podridão mole causada por P. carotovora em orquídeas é dependente da
espécie hospedeira e também da concentração da bactéria endofítica Burkholderia sp.;
- Há especificidade de genótipos de P. carotovora à orquídeas;
- A análise por ARDRA e especificidade ao hospedeiro mostraram que os isolados de P.
carotovora de Oncidium são geneticamente diferente dos isolados patogênicos a batata,
suportando a idéia de pertencem a uma subespécie diferente, denominada aqui de
Pectobacterium carotovora subsp. orchidaceae.
47
6. REFERÊNCIAS
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62
ANEXO I
Filogenia de Oncidium Aloha Iwanaga
Tabela 04. Filogienia de Oncidium Aloha Iwanaga
VARIEDADE ORIGEM
Oncidium Aloha Iwanaga Oncidium Goldiana x Oncidium Star Wars (1990)
Oncidium Goldiana Oncidium flexuosum x Oncidium sphacelatum (1940)
Oncidium Star Wars Oncidium Varimyre x Oncidium Nonamyre (1977)
Oncidium flexuosum Espécie
Oncidium sphacelatum Espécie
Oncidium Varimyre Oncidium Sultamyre x Oncidium varicosum (1963)
Oncidium Nonamyre Oncidium Nona x Oncidium Sultamyre (1964)
Oncidium Sultamyre Oncidium Sultane x Oncidium Palmyre (1959)
Oncidium varicosum Espécie
Oncidium Nona Oncidium crispum x Oncidium varicosum (1938)
Oncidium Sultane Oncidium Boissiense x Oncidium Farandole (1943)
Oncidium Palmyre Oncidium Saladin x Oncidium varicosum (1951)
Oncidium crispum Espécie
Oncidium Boissiense Oncidium fobesii x Oncidium varicosum (1924)
Oncidium Farandole Oncidium Comtesse De Bretonne x Oncidium Mantinii (1935)
Oncidium Saladin Oncidium Comtesse De Bretonne x Oncidium Farandole (1945)
Oncidium fobesii Espécie
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