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Universidade de São PauloEscola de Educação Física e Esportes –
Ribeirão Preto
Leonardo R. Silveira
EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO
DA EXPRESSÃO GÊNICA
HistóricoPrimeiras evidências de que o DNA é o material genético:
• F. Miescher, 1868- extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein).
• O. Hertwing, 1884 - demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma
–Hertwing suspeitou que “nuclein” fosse o material da hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos.
• O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em 1944 - demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético
1950:
-Não conhecia a seqüência de amino ácidos de
nenhuma proteína.
- Não sabia que os amino ácidos numa proteína
permanecem arranjados numa seqüência
exata.
Nature - 25 de abril de 1953“A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”
J. Watson and W. Crick• “We wish to suggest a structure for the salt of
deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest….”
1960: Foi definida a primeira estrutura tridimensional
de uma proteína, definida por cristalografia.
Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos de
centenas de milhares de proteínas a partir dos genes que as
codifica.
A informação genética consiste
primariamente em instruções para fazer
proteínas!
A informação genética de todos os animais é escrita na
linguagem universal das seqüências de DNA, e a
seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas
bioquímicas simples, que hoje praticamente todos os
laboratórios de pesquisa podem dominar.
cytosine
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos enroladas em hélice
• As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por
PONTES DE HIDROGÊNIO
• Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que
ser ANTIPARALELAS
• O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio
• O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio
O DNA é uma molécula com polaridade:uma extremidade 5’- P e
uma extremidade 3’-OH
• A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO
5’ 3’
Interações fracas entre macromoléculas (interações de curta distância)
• Ligações de van der Waals
• Ligações eletrostáticas
• Ligações (pontes) de Hidrogênio
• Interações Hidrofóbicas
Acetil -CoA
TCA
Cycle
GLUT
Glucose
G-6-P
Pyruvate Lactate
Extrac
Cytosol
LactateGlucose
Acetil -CoA
TCA
Cycle
GLUT
Glucose
G-6-P
Pyruvate Lactate
Extrac
Cytosol
LactateGlucose
CPT-I
FA-CoA - Oxid
CPT-II
CAT
FFAT
FFA
Facyl-CoA
CPT-I
FA-CoA -
CPT-II
CAT
FFAT
FFA
Facyl-CoA
NAD FAD
NADH FADH2
I IIIII IVe-
e- e- e-
F0
++++
+ + + + + + + + + + + +
- - - - - - - - -(Δ )
(Δ pH)
AD
P/A
TP
Tra
nsp
orte
r
-Muscle activity
-Active transporte
-Biosynthesis
-Metabolism
NAD FAD
NADH FADH2
I IIIII IVe-
e- e- e-
F0
++++
+ + + + + + + + + + + +
- - - - - - - - -(Δ )
(Δ pH)
AD
P/A
TP
Tra
nsp
orte
r
-Muscle activity
-Active transporte
-Biosynthesis
-Metabolism
O2 H2OO2 H2O
H+ H+H+
H+
H+ H+H+
H+
ADP+Pi
ATP
ADP+Pi
ATP
FFA
FFA
Fatty acyl-CoA
CPTI
CPTII
translocase
acyl-CoA-oxidation
FATp GT
Glucose-6P
Fructose-6P
Fructose-1,6-bi-P
PFK
Glucose
Pyruvate
cytosol
M. matrix
Lactate
Lactate
HK
Acetyl-CoA
oxaloacetate citrate
isocitrate
2-oxoglutarate
Succinyl-CoA
succinate
fumarate
malate
(-)
(-)
(-)
PC
(-)
FFA
Randle and Newsholme, Lancet, 1963
Malonyl-CoA
Acetyl-CoA(-)
PDH
ACC
leve
Con
sum
o d
e gl
icog
ênio
Glicose
ÁCIDOS GRAXOS
moderada intensa
Oxi
daç
ão d
e gl
icos
e e
AG
Modification in gene expression in stimulated and contralateral soleus muscle isolated one hour after electrical stimulation.
Gene bank accession
number
Gene name ES/ Ct
CL/ Ct
Metabolism
M22413 Carbonic anhydrase 3 8,5 1,3 M31788 Phosphoglycerate kinase 1 5,7 1,2 U73525 Thioredoxin 2 19,5 6,4 Y00404 Superoxide dismutase 1 23,9 5,5 M11670 Catalase 14,0 8,0
X56600 Superoxide dismutase 2 31,8 14,3 D12770 Solute carrier family 25 (mitochondrial adenine nucleotide
translocator) member 4 7,4 1,3
U09540 Cytochrome P450, subfamily 1B, polypeptide 1 4,1 1,7 M21208 Cytochrome P450, subfamily 17 13,6 6,9 L03294 Lipoprotein lipase 7,7 2,9 J04171 Glutamate oxaloacetate transaminase 1 6,7 1,4 M18467 Glutamate oxaloacetate transaminase 2 6,6 3,0 J05405 Heme oxygenase 2 6,2 3,5 D30647 Acyl-Coenzyme A dehydrogenase, very long chain 4,5 1,7 U22424 Hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2 17,1 7,7 M23995 Aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4 8,6 4,7 X15958 Enoyl Coenzyme A hydratase, short chain 1 24,7 9,4 J05029 Acetyl-Coenzyme A dehydrogenase, long-chain 15,7 7,0 D30035 Peroxiredoxin 1 20,6 6,1 X12367 Glutathione peroxidase 1 6,2 1,1
Muscle & Nerve, 2009 (in press)
• Eletroforese BidimensionalPROTEOMA
Exercício Físico
Transcrição Gênica
Adaptações celulares
Neufer PD and Dohm GL. Exercise induces a transient increase in transcription of the GLUT-4 gene in skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 265: C1597–C1603, 1993.
Transportadores de glicose
Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008
Enzima citrato sintase
Pilegaard et al., 2000
Efeito agudo do exercício na transcrição gênica
Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular
Free Radical in Biology and Medicine, 43(3):353-61, 2007.
European J. Appl. Physiol., 102(1):119-26, 2007.
Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular
Pilegaard et al., 2002
Efeito da disponibilidade de nutrientes na transcrição gênica
Efeito da elevada disponibilidade de lipídios
Silveira et al., 2008
Adaptações ao exercício Crônico
Puigserver P & Spiegelman BM (2003). Endoc Reviews 24, 78-90.
PGC- 1 (peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)- coactivator 1)
Sinalização intracelular
Hood DA et al., 2001
Hood DA et al., 2001
Narkar et al., Cell, 2008
AICAR
EFFECT OF ROS ON BASAL GENE EXPRESSION
Efeito da contração muscular e do tratamento antioxidante
EFFECT OF ROS INDUCED BY CHRONIC MUSCLE CONTRACTION AND ANTIOXIDANTS
TREATMENT ON GENE EXPRESSION
Efeito acumulativo da transcrição sobre expressão de proteína
60
80
100
1 2 3 4
20
40
Dias de Treinamento
% a
cim
a d
o c
on
tro
le
RNAm
60
80
100
1 2 3 4
20
40
Dias de Treinamento
% a
cim
a d
o c
on
tro
le
RNAm
60
80
100
1 2 3 4
20
40
Dias de Treinamento
% a
cim
a d
o c
on
tro
le
RNAm
80
100
1 2 3 4
20
40
Dias de Treinamento
% a
cim
a d
o c
on
tro
le
RNAm
80
100
1 2 3 4
20
40
Dias de Treinamento
% a
cim
a d
o c
on
tro
le
1 2 3 4
20
40
Dias de Treinamento
% a
cim
a d
o c
on
tro
le
20
40
Dias de Treinamento
% a
cim
a d
o c
on
tro
le
RNAm
proteína
Silveira, L. R. ; Pilegaard, H. ; Kusuhara, K. ; Curi R ; Hellsten, Y. BBA ( Molecular Cell Research) 1763:969-976, 2006.
Estresse oxidativo e sistema antioxidante em músculo de animais treinados
Am J Physyol, 2002
Intracellular sources of ROS and RNS in skeletal muscle
Arginine + O2 Citruline + NO
PMN
O-2 SOD H2O2
H+
·OH
O-2
H2O2
ONOO-
NO
ONOO-
H2O2
·OH
O-2
.OH
HOCl
MPO
SOD
H2OCAT
H2O
GSH-PX
intracellular extracellular
ONOO.
“Fe2+”“Fe2+”
“Fe2+”
Cl- + H2O2
O-2
O2
Lipid peroxidation
Gene expression
antioxidants
(+)
(-)Ca++
Proteinoxidation
XO
Arachidonic acid
mitochondria
Peroxysome NADPH
oxidase
XO
Arq. Bras.Endoc.Metab. 48(6):812-822, 2004
NOS
Hipótese
Alteração do balanço redox afeta o metabolismo de ácido graxo e glicose
no músculo esquelético durante a contração.
RAT SKELETAL MUSCLE CELL CULTURE
Produção de H2O2 em Células Musculares Esqueléticas
Controle NAC (1 mM)0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
***
Incubação com Amplex + HRP
Flu
ore
scê
nci
a
*
In vitro ROS detection
2O
(Flu
ore
scê
nc
ia)
GPX/GSH/CAT
*
0
50
100
150
200
control H2O2
#
0
20
40
60
80
100
130
Basal stimulated
p < 0.05
p < 0.01
p < 0.01
Control
NAC
GPX + GSH + CAT
Flu
ore
scen
ce
* ** *
#
Efeito do tratamento antioxidante na expressão e no conteúdo de GLUT4 em condição basal
0
50
100
Control NAC
NAC
GL
UT
- 4/
GA
PD
H
mR
NA
(%
) *
0
10000
20000
30000
não estimulado
Un
ida
de
s
control NAC
*
46 kDa -
A.U
Metabolismo de glicose
Expressão do GLUT4 mediada por contração
Control
Stimulated
NACStimulated + NAC
Controle
Controle
12 h
oras
Controle0
25
50
75
100
125
150
175
3h 12h 24h
p <0.05 p <0.05
*
GL
UT
- 4/
GA
PD
H m
RN
A (
%)
GL
UT
- 4/
GA
PD
H m
RN
A (
%)
0
50
100
150
p <0.05
Sem tratamento enão estimulado
H2O2
Control H2O2
*
3h
Efeito da contração no conteúdo de GLUT4
Sem NAC
NAC
Controle H2O20
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Basal Stimulated
0
10000
20000
30000
p <0.05
Un
ida
de
s
* #
Control
Basal H2O2
*
46 kDa -
46 kDa -
Transporte de glicose
0.0
0.1
0.2
0.3
Basal Stimulated 2 O 2
p <0.05
p <0.05p <0.05
Control NAC
Cap
taçã
o d
e
2-d
eso
xi-[
2.6-
3H
]-D
-glic
ose
(µm
ol/m
g d
e p
rote
ína)
H2O2
p <0.05
Expressão da HK-II mediada por contração
NAC
0
50
100
150
Control
Stimulated NAC
HK
II/G
AP
DH
mR
NA
(%
)
0
25
50
75
100
125
150
175
Sem tratamento e
3h 12h 24h
**
Stimulated + NAC
Control H2O2
3h
Atividade da HK H
ex
ok
inas
e(n
mo
l/min
/mg
de
pro
tein
a)
Control
NAC
0
1
2
3
4
Basal Stimulated
p <0.05
p <0.05
H2O2
p <0.05
Expressão da PFK-I mediada por contração
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Control H2O20.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.3
*
3h 12h 24h
PF
K/G
AP
DH
mR
NA
(%
)
Control
Stimulated
Stimulated + NAC
*
3h
Atividade da PFKP
ho
sph
ofr
uct
ok
ina
se
(nm
ol/m
in/m
g)
Control
NAC
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Basal Stimulated H2O2
*
***
Lactate
Control
NAC
(µm
ol/µ
g p
rote
in)
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
Basal Stimulated H2O2
***
*
Expressão da CPT-I
Control NAC0
50
100
150
200
250
*
CP
T-I
/GA
PD
H m
RN
A (
%)
Metabolismo de ácido graxo
Conteúdo de CPT-I
0
10000
20000
30000
AU
Control NAC
88 kDa
Expressão de CPT-I mediada por contração
0
50
100
150
200
250
0
50
100
NAC
Control
Stimulated NAC
Stimulated + NAC
3h 12h 24h
CP
T-I
/GA
PD
H m
RN
A (
%)
***
*
P > 0.05
Basal H2O2
Efeito da contração muscular no conteúdo de CPT-I
NAC
Control
0
10000
20000
30000
AU
*
88 kDa -
Basal Stimulated
*
* P < 0.05 compared to basal
0
10000
20000
30000
AU
88 kDa -
Basal H2O2
P >0.05
Oxidação de palmitato
0.00
0.05
0.10
[14 C
O2]
(um
ol/m
g p
rote
in)
prod
ucti
on
Control
NAC
Basal Stimulated H2O2
* * *#
Músculo
Experimentos in vivo
-30 0 30 60 90 120 min
- Anestesia - Cânula
Infusão - salina - AGCL
Est. Elétrico (+) Est. Elétrico (-)
S1 S4 S5S2 S3
preparação
Contrações Intensas
Efeito do tratamento antioxidante na força de contração muscular
Gra
ma-
forç
a/kg
10 20 30 40 50 600.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Tempo (s)
10 20 30 40 50 600.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
Tempo (s)
Control
NAC
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
*
Gra
ma-
forç
a/kg
Control NAC
Força de contração máxima
Resistência à Fadiga
NAC
Control
0 10 20 30 40 50 60 7050
75
100
125
Time (min)
Fo
rce
(%)
*
***
Detecção de EROs em músculo incubado em Krebs (95% O2 + 5% CO2)
Controle Contração
0
50
100
150
200
250
*
#
*
Flu
ore
scên
cia
po
r g
ram
ad
e p
eso
mu
scu
lar
(%
do
co
ntr
ole
)
NAC
Control
Conclusão
leve
Con
sum
o d
e gl
icog
ênio
Glicose
ÁCIDOS GRAXOS
moderada intensa
Oxi
daç
ão d
e gl
icos
e e
AG
- Aumento ROS
- Menor atividade antiox
-Aumento Glut-4
- Aumento Enz. glicolíticas
-Captação de glicose
- Aumento de força
- Maior ativ antioxidante
- Menor produção ROS
- Aumento de CPT-I
- Aumento da -oxidação
-Aumento da resistência
Silveira LR et al. (2008) J. Cell Physiol
Doenças metabólicas
Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008
Reid & Durham. Annual NY Acad Sci 2003.
μ H+
I II III IV
H+ATP/ADP
μ H+
I II III IV
H+ATP/ADP
e-e- e-e-
e- e-e- e-e- e-e-e- e-e-e-e-e-
e- + O2 O-2
Matriz
M. Ext
O2
H+H+H+
NADH FADH2
Δμ H+
I II III IV
H+ATP/ADP
e- e-e-+ O2 H2O
Matriz
O2
Desacoplador
H+
H+H+H+
JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY 210:7–15 (2007)
2 min2 min
20 nMoles O20 nMoles O22
10.110.1
15.815.8
16.116.1
9.49.4
SMMSMM
GDPGDP
BSABSA
LipovenosLipovenos
**
Silveira LR et al., Cell Physiol Biochem, 2007
1 - Glicose Glicose
2 - Glicose Glicose + Insulina
3 - Glicose + Insulina
Glicose + Insulina 4 - Glicose + Palmítico (1mM)
5 - Glicose
Glicose + Insulina
6 - Glicose + Insulina + Palmítico
Glicose + Insulina +Palmítico
Glicose + Insulina
PRÉ-INCUBAÇÃORADIOATIVO
0 4 5
Tempo (h)
-Glicose (5 mM)
- Insulina (100uU/mL)
- Palmítico (1 mM)
Experimentos in vitro
0
1
2
3
4
5
6
7
8C
apta
ção
de
glic
ose
um
ol/g * *
*
# #
Captação de glicose
Após 4h de incubação
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
control glucose +Ins
glucose+Palmitic
acid
glucose +Ins+ palmitic
acid
glucose +Insulin (20x)
H2O
2 (n
M)
*
*
*
NADPH oxidase – P47
47 Kda -
37 Kda -25 Kda -
N N - - + +
(+) palmitate
(N) positive control
37 kda -
29 kda -
19 kda -
c c p p
(c) control
(p) Palmitic acid
6.6 kda -
Biochimica Biophysica Acta 1757:57–66, 2006.
Cell Biochem Function, 2006
Resitência à Insulina e Atividade Mitocondrial
glucose
Citrate
glucose 6-P
Pyruvate
Citrate
Isocitrate
α-Ketoglutarate
Succinyl-CoA
Succinate
Fumarate
Malate
Oxaloacetate
Isocitrate
α-Ketoglutarate
Pyruvate
Acetyl-CoA
FFA
Acyl-CoA
Acyl-CoA
CPT2
CPT1Malonyl-CoA
Malate
NADH
NAD+
acetyl-CoA
Lipid
oxaloacetate
NADPH NADP+
malate
NADHNAD+
NADH
NAD+
NAD+
NADH
NAD+
NADH
NAD+
NADH
FADH2
FAD+ET
CcME
cME
mME
NADPH
NADP+
CoA
AT
P
PDH
MDH
PC
β-o
xid
ati
on
O2-
NADPH
NADP+
Biochem Nutrition, 2009 (submitted)
3. ANAPLEROSE COMO REGULADORA DA ATIVIDADE MITOCONDRIAL E DA SENSIBILIDADE A INSULINA EM MÚSCULO
ESQUELÉTICO Josiane Miranda
2. EFEITO DA CONTRAÇÃO MUSCULAR E DO TRATAMENTO ANTIOXIDANTE NA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA MITOCONDRIAL
E NO CONTEÚDO DOS TRANSPORTADORES DE GLICOSE (GLUT-1/4) EM CULTURA DE CÉLULAS MUSCULARES
EXPOSTAS AO ÁCIDO PALMÍTICOFelipe N Damas
1. REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA NO CICLO DO ÁCIDO TRICARBOXÍLICO E SECREÇÀO DE INSULINA EM RATOS OBESOS
Cláudio C. Zoppi
PROJETOS EM ANDAMENTO
Agradecimentos- Laboratório de Fisiologia CelularDr. Rui Curi
-Laboratório de Pâncreas e Endócrino e MetabolismoDr. Everardo M CarneiroDr. Antônio C. Boschero
- Laboratório Bioenegética Dr Aníbal VercesiDra Luciane C Alberici
-Copenhagen Muscle Research CenterDra Ylva HellestenDr. Jens BangsboDra. Heriette Pilegaard
- Fapesp, Capes e CNPq.