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Universidade de São Paulo Instituto de Biociências
Departamento de Fisiologia Geral
Patrícia Lacouth da Silva
Efeitos das mudanças climáticas na regulação de biomarcadores em Echinaster brasiliensis
(Echinodermata: Asteroidea)
Effects of climate changes on biomarkers regulation in Echinaster
brasiliensis (Echinodermata: Asteroidea)
.
São Paulo
2015
Patrícia Lacouth da Silva
Efeitos das mudanças climáticas na regulação de
biomarcadores em Echinaster brasiliensis (Echinodermata: Asteroidea)
Effects of climate changes on biomarkers regulation in Echinaster
brasiliensis (Echinodermata: Asteroidea) .
Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na Área de Fisiologia Geral.
Orientador:
Prof. Dr. Márcio Reis Custódio
São Paulo
2015
Lacouth, Patrícia Efeitos das mudanças climáticas na regulação de biomarcadores em Echinaster brasiliensis (Echinodermata: Asteroidea) 85 páginas Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Fisiologia. 1. Acidificação 2. Biomarcadores moleculares 3. Temperatura. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Fisiologia Geral.
Comissão Julgadora:
________________________ _____ _______________________ Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
_________________________ ____________________________ Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
Prof. Dr. Márcio Reis Custódio
Orientador
Foi assim que, bem devagar, O País das Maravilhas foi urdido
Um episódio vindo a outro se ligar E agora a história está pronta
Desvie o barco, comandante! Para casa! O sol declina, já vai se retirar.
(Lewis Carrol – Alice no País das Maravilhas)
Agradecimentos À Capes pelo apoio financeiro.
À Universidade de São Paulo e Instituto de Biociências pela infraestrutura
disponibilizada.
Ao CEBIMar/USP pelo apoio técnico nas coletas e infraestrutura disponibilizada.
Ao Prof Dr. Márcio Reis Custódio pela confiança, orientação, bom humor, paciência e
sabedoria que compartilhou comigo ao longo de toda a minha pós-graduação.
Ao Dr. Enrique Rozas, pelo auxílio, mesmo que distante,e que foi fundamental para a
realização do projeto.
Aos funcionários da USP, Instituto de Biociências e do Departamento de Fisiologia
Geral.
Aos meus pais e irmão, pelo amor, incentivo e apoio incondicionais, que mesmo com
toda a distância estiveram presente em pensamento e de coração em todos os
momentos.
Aos meus companheiros e amigos de laboratório por todos os momentos pessoais e
profissionais compartilhados.
Agradeço a muitas pessoas, que não cabem em poucas linhas mas que foram
importantes durante todos estes anos de diversas maneiras, tanto pessoalmente como
profissionalmente, para que eu trilhasse e chegasse ao fim de mais uma etapa com
muitos aprendizados. Algumas passaram e se foram, outras ficaram, mas a todas sou
grata de coração.
Muito Obrigada!
Sumário
I. Resumo ........................................................................................................ 5
II. Abstract ........................................................................................................ 6
III. Introdução...................................................................................................... 7
IV. Objetivos........................................................................................................ 24
V. Materiais e Métodos....................................................................................... 25
VI. Resultados .................................................................................................... 35
VII. Discussão ...................................................................................................... 57
VIII. Conclusões..................................................................................................... 73
IX. Referências.................................................................................................... 75
5
Resumo
Diante do quadro atual de previsões de mudanças climáticas, estudos a
respeito das possíveis respostas dos organismos a estas alterações são importantes.
Com a finalidade de prever e verificar se estas serão de fato deletérias ou se os
organismos são capazes de lidar com elas sem alterações na sua fisiologia, e
consequentemente na estrutura do ambiente, E. brasiliensis foi utilizada como modelo
para estudar possíveis impactos do aumento da temperatura e acidificação dos
oceanos na sua fisiologia. Para isso, espécimes foram expostos a 9 possíveis
combinações de temperatura (24ºC, 28ºC e 30ºC) e pH (8.0, 7.7 e 7.3) em diferentes
intervalos de tempo (1, 3, 12, 24 e 48 h). Amostras de gônadas e fluido celomático
foram coletadas para avaliar a expressão das proteínas de estresse HSP70, AIF-1 e
p38-MAPK, e a variação no número e viabilidade dos celomócitos. Nossos resultados
mostram que o modelo é sensibilizado pelas mudanças no ambiente, através da hiper-
regulação das proteínas de estresse. O cenário considerado mais extremo (30°C +
pH7.3) ocasionou a morte de 100% dos organismos após 24horas. E o segundo
cenário mais severo (30°C + pH7.7) desencadeou o desenvolvimento de ulceração de
pele. Os efeitos são mais pronunciados nos celomócitos e a acidificação da água
parece ter efeitos antagônicos com a temperatura nos celomócitos e sinérgicos nas
gônadas. Embora a resposta tenha sido sistêmica, o grau e a dinâmica foram distintos
em relação às diferentes amostras e estresses. Podendo causar modificações na
resposta imune dos organismos e consequentemente na sobrevivência da espécie a
longo prazo.
Palavras-Chaves: Acidificação; Temperatura; HSP70, AIF-1, p38-MAPK;
Celomócitos; Gônadas.
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Abstract
Under the current Climate Change context, studies about the potential responses
of the organisms to their changing environment are of extreme importance. Recent
studies point out the synergy of temperature and ocean acidification altogether. In this
study, we used the sea star E. brasiliensis to assess the physiological effects of rising
temperature, seawater acidification and the interaction of both factors. Independent
individuals (N=225) were exposed to 9 possible combinations of temperature (24ºC,
28ºC and 30ºC) and pH (8.0, 7.7 and 7.3), for 1, 3, 12, 24 and 48 h. We compared the
stress produced by these treatments measuring the expression of heat shock proteins
(HSP70), the production of the allograft inflammatory factor (AIF-1) and the activation
of mitogen kinases (MAPKs) at both gonad and celomic fluid. Furthermore, we
assessed the quantity and quality of coelomocytes. Our results demonstrated that E.
brasiliensis is vulnerable to the interaction of temperature and acidification. All the
stress proteins evaluated were upregulated. The extreme scenario (30°C + pH7.3)
caused the death of 100% of organisms after 24 hours, while the second most severe
scenario (30°C + pH7.7) triggered skin ulceration. Nevertheless, we found that water
acidification produces antagonistic effects to the temperature in coelomocytes and
synergistic effects in gonad cells. Furthermore, these effects were more pronounced in
the coelomocytes than in the gonads. The systemic response found in this study
suggest that the interactive effects of elevated temperatures in conjunction with ocean
acidification may endanger the survival of this species, and it could compromise the
ecosystem functioning at long term.
Key-Words: Ocean acidification; Ocean warming; HSP70, AIF-1; p38-MAPK;
Coelomocytes; Gonads..
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Introdução
A Terra passa por ciclos naturais de mudanças no clima como, por exemplo, as
mudanças sazonais (estações do ano), anuais (El-niño), decadais (oscilações do
Pacífico e Atlântico norte) e até milenares (eras glaciais e interglaciais). Todas essas
mudanças são e foram importantes para a definição de padrões biogeográficos bem
como nas adaptações evolutivas dos seres vivos. No entanto, as atividades antrópicas
têm acelerado e alterado esses padrões naturais.
A revolução industrial, o uso de combustíveis fósseis e as mudanças na
utilização da superfície terrestre são os grandes marcos da ação do homem na
modificação da composição atmosférica, principalmente com a emissão dos gases do
efeito estufa (GEE). Aproximadamente 78% dos gases emitidos são provenientes da
queima de combustíveis fósseis e processos industriais. A concentração de CO2 na
atmosfera aumentou de 280 partes por milhão (ppm), na era pré-industrial (1760), para
385 ppm nos dias atuais, e há projeções de que este aumento continue e atinja entre
700 e 1000 ppm no fim do século XXI. Cerca de metade da emissão de gases entre
1760 e 2011 ocorreu nos últimos 40 anos (Caldeira & Wickett 2003; IPCC 2014) e
continuam crescendo, mesmo com as políticas de mitigação adotadas recentemente.
Esta mudança na composição atmosférica provocou a desregulação de um
fenômeno natural e fundamental para a sobrevivência na terra que é o efeito estufa.
Têm sido observadas mudanças no ambiente desde 1950, tais como alterações dos
índices de precipitação, derretimento das geleiras e consequentes alterações nos
sistemas hidrológicos, mudanças na qualidade e quantidade de recursos aquáticos,
alterações no alcance geográfico, atividades sazonais, padrões migratórios,
abundância e modificação das interações ecológicas, tanto em espécie terrestres,
quanto aquáticas (IPCC, 2014).
Os oceanos cobrem cerca de 71% da superfície terrestre, sendo fundamentais
nos ciclos biogeoquímicos, na manutenção do clima, abrigam grande biodiversidade e
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são importantes para a subsistência da humanidade. Ambientes marinhos costeiros
são de extrema importância para o planeta tanto ecologicamente como
economicamente. Estima-se que habitats marinhos, desde a zona entre-marés até as
grandes profundidades, gerem trilhões de dólares em produtos, como comida e
matéria prima, e serviços, como ciclagem de nutrientes (Harley et al., 2006).
Uma série de padrões tem sido alterada nos oceanos em decorrência das
mudanças climáticas: (1) O aumento das concentrações do CO2 tem alterado a
biogeoquímica dos oceanos (Haugan e Drange, 1996); (2) O aumento da temperatura
da água prejudica processos fisiológicos e padrões de distribuição (Osovitz e
Hofmann, 2007); (3) A intensificação dos ventos, tempestades e ondas tem alterado a
salinidade, turbidez, aporte de nutrientes e poluentes de origem terrestre e provocam
distúrbios hidrodinâmicos que influenciam ambientes sensíveis, como as zonas
costeiras (Gardner et al., 2005). A mudança dos ventos também pode modificar a
ressurgência de nutrientes e sedimento e os padrões de dispersão e recrutamento de
larvas; (4) O volume dos oceanos tem expandido devido à entrada de água doce
proveniente do derretimento das geleiras e pela própria expansão térmica. Tem
ocorrido o aumento dos níveis do mar de cerca de 2mm por ano, o que também causa
o deslocamento na distribuição de espécies. Estima-se que as zonas entre-marés
sejam reduzidas entre 20 e 70% nos próximos 90 anos (IPCC 2014); e (6) a alteração
das taxas de produção primária, que tem sido influenciado pelo aumento da
temperatura, da radiação UV e da turbidez da água. Embora o aumento da
temperatura e da disponibilidade de CO2 possa influenciar positivamente a produção
primária das macroalgas, o aumento da temperatura, em alguns casos, aumenta a
taxa de consumo dessas algas por invertebrados (Lotze e Worm, 2002).
9
Aquecimento dos Oceanos
Está previsto para o final no século 21 um aumento entre 1,8 e 4°C na
temperatura média atmosférica, dependente dos cenários de emissão de gases (IPCC
2014). Uma das consequências do aumento da retenção de calor na atmosfera é o
aquecimento dos oceanos, que retém aproximadamente 90% da energia dos sistemas
climáticos. A temperatura de regiões mais rasas são as que primeiro são alteradas.
Observou-se que profundidades de até 75 metros tiveram aumento de
aproximadamente 0,1°C por década entre 1971 e 2010 (IPCC, 2014). Neste início do
século 21 os oceanos continuaram esta tendência, com os maiores aumentos
previstos para a superfície das regiões tropicais, subtropicais e hemisfério norte.
Mesmo que as emissões dos gases do efeito estufa fossem totalmente suspensas, os
oceanos ainda permaneceriam aquecendo por décadas.
A temperatura é um fator abiótico importante para organismos ectotérmicos
devido aos seus efeitos diretos em todos os processos biológicos. Pode influenciar
desde escalas moleculares até fisiológicas e comportamentais, definindo padrões de
distribuição e história evolutiva ao longo das mudanças ambientais (Pörtner, 2005).
Entre os efeitos diretos do aquecimento do ambiente estão: alteração da performance
dos organismos em relação ao crescimento, reprodução, forrageamento,
imunocompetência, comportamento e competitividade (Brockington e Clarke, 2001;
Pörtner, 2008; Pörtner et al., 2015).
A maioria dos organismos marinhos vive na sua tolerância térmica máxima, ou
pejus (Harley et al., 2006; Somero, 2012). Por isso, pequenos aumentos podem
impactar negativamente a performance e sobrevivência. Existe uma série de estudos
que já relatam diferentes complicações ocasionadas pelo aumento da temperatura da
água. O mais conhecido é o branqueamento dos corais. Cnidários recifais, que vivem
na sua temperatura pejus, tem perdido seus simbiontes e tem morrido com este
aumento (Doney et al., 2012)
10
Os efeitos podem variar de acordo com o habitat da espécie estudada. Por
exemplo, Dong et al., 2008 ao compararem duas espécies congêneres de caranguejos
que habitam nichos distintos observaram que estas respondem diferentemente ao
estresse térmico. A espécie de mesolitoral é mais termotolerante do que a segunda
espécie, que vive no infralitoral. Isto supostamente porque organismos que ocupam a
região do mesolitoral vivem constantemente na sua temperatura limite, o que
favoreceria a habilidade de ajustar sua fisiologia.
A temperatura também influencia o timing reprodutivo. Por exemplo, bivalves do
nordeste europeu tem desovado precocemente e dessincronizado com o bloom de
fitoplâncton, ocasionando um desencontro entre produção larval e disponibilidade de
alimento (Philippart et al., 2003). O aquecimento também pode provocar problemas a
nível de comunidade, como através do aumento do forrageamento e metabolismo da
estrela do mar Pisaster ochraceus, um predador-chave, que pode levar a progressiva
diminuição de bancos de algas e consequentemente de centenas de espécies
dependentes destas algas (Sanford, 1999) Além desses exemplos, o estresse térmico
altera a modulação da resposta imune em muitas espécies (Coteur et al., 2004; Ellis et
al., 2011), e desta forma o estados de saúde dos animais. Por este motivo, o
aquecimento dos oceanos pode ter aumentado a ocorrência de doenças marinhas,
pois temperaturas mais quentes tornam os hospedeiros mais vulneráveis e favorecem
o crescimento de patógenos (Bates et al., 2009; Harvell et al., 2002).
Acidificação dos Oceanos
Devido a grande área ocupada pelos oceanos e sua participação em diferentes
processos biogeoquímicos, o ambiente marinho tem sido um reservatório para o
excesso de CO2 atmosférico. Durante os últimos 200 anos os oceanos absorveram
cerca de metade do CO2 emitido pela queima de combustíveis fósseis e atividades
industriais (Royal Society 2005), mostrando o quanto são importantes na ciclagem
natural do carbono.
11
O dióxido de carbono (CO2) na atmosfera é um gás quimicamente inerte, mas
quando dissolvido na água do mar se torna mais reativo e participa de uma série de
processos químicos. Um dos efeitos da dissolução do CO2 na água do mar é o
aumento da concentração de íons hidrogênio que consequentemente alteram o pH.
Essa liberação de íons H+ é resultado da reação inicial do CO2 com a água, que forma
ácido carbônico (H2CO3), um ácido fraco que rapidamente libera mais íons H+ e forma
bicarbonato (HCO3-). A água do mar é naturalmente saturada com outra base, o íon
carbonato (CO32-), que pode reagir com os íons H+ formando mais bicarbonato (Figura
1). Íons carbonato participam da formação de carbonato de cálcio e seu cristal
aragonita, elementos essenciais nos processos de calcificação e o desvio dessa
reação diminui a quantidade de carbonato livre.
Figura 1 – Esquema do processo químico de acidificação do oceano. Modificado de National Academy of Science 2013.
O aumento da disponibilidade de CO2 já ocasionou um declínio de 0,1 unidades
de pH nos oceanos. Este valor é aparentemente baixo, mas dada a escala logarítmica
do parâmetro isso corresponde ao aumento de 30% na quantidade de íons hidrogênio
livres na água. Caso as emissões de gases do efeito estufa continuem na mesma
intensidade, é previsto para os próximos 100 anos a diminuição de 0,3 a 0,4 unidades
12
de pH (Orr et al., 2005). Mesmo se o quadro atual de emissões for revertido, os
oceanos podem levar dezenas de milhares de anos para que a sua química retorne
aos níveis pré-industriais (Royal Society 2005).
Até pouco tempo a acidificação dos oceanos era considerado um efeito adicional
das mudanças climáticas, não sendo considerados os seus sérios impactos. Enquanto
que o aumento da quantidade de CO2 atmosférico é esperado com impactos positivos
em muitas plantas terrestres, devido ao aumento da fotossíntese (IPCC 2014), muitos
organismos marinhos já estão saturados de carbono e efeitos positivos não são
esperados (Doney et al., 2012; Harley et al., 2006).
O aumento da disponibilidade de CO2 nos oceanos afeta uma série de
processos e organismos, tanto nos não calcificantes como nos calcificantes (e.g.
esponjas calcáreas, foraminíferos, moluscos, corais, equinodermos e crustáceos). A
diminuição da disponibilidade de carbonato diminui a taxa de calcificação dos
organismos e tende aumentar a solubilização do carbonato de cálcio, causando a
corrosão das estruturas e deixando-os mais vulneráveis. Estudos indicam que em
2050 as taxas de corrosão irão ultrapassar as taxas de calcificação (Orr et al., 2005).
A redução da calcificação pode ter sérios impactos negativos nos ecossistemas
marinhos, afetando as teias alimentares, disponibilidade de recursos alimentares
comercialmente importantes (mexilhões, ostras e ouriços do mar) bem como proteção
da costa contra tempestades (Doney et al., 2009).
Além de influenciar na calcificação, a acidificação dos oceanos também impacta
outros aspectos da fisiologia. A acidose dos tecidos e fluidos corporais diminui a
capacidade do transporte de gases e o uso da energia celular (Pörtner, 2005, 2008).
Também reduz as taxas de síntese protéica, o que afetará quase todos os aspectos do
funcionamento como crescimento e reprodução (Langenbuch e Pörtner, 2002, 2003).
Em uma série de animais calcificantes como equinodermos, bivalves, corais e
crustáceos, tem mostrado efeitos negativos na fertilização, clivagem, desenvolvimento
e assentamento larval e estágios reprodutivos (Kurihara, 2008).
13
Estresse fisiológico
Estresse é definido como uma condição que modifica o funcionamento normal de
um sistema biológico ou que diminui o fitness e consequentemente as populações
futuras, e pode ser tanto de fundamento ambiental como genético (Romero, 2004;
Somero, 2012).
Compreender os mecanismos pelos quais a variação ambiental impacta os
organismos na natureza é de grande interesse para biólogos e ecologistas
comparativos. O termo estresse fisiológico está relacionado a estímulos nocivos aos
quais os organismos podem ser expostos, como o aumento da temperatura,
acidificação da água, poluição por despejo de esgoto e hidrocarbonetos, mudanças na
salinidade e na disponibilidade de oxigênio (Romero, 2004). Estes estímulos não
previstos e deletérios desencadeiam uma série de respostas emergenciais que podem
ser fisiológicas e/ou comportamentais. Desta forma, a correlação entre a resposta
emergencial e as respostas normais do organismo é uma medida que pode ser
utilizada como biomarcador. Isto reflete a maneira com que os efeitos do estresse nos
mecanismos fisiológicos são traduzidos para processos como sobrevivência,
crescimento e reprodução (Helmuth, 2009).
Em relação às mudanças climáticas, informações fisiológicas sobre espécies-
chave ou membros principais de cadeias alimentares estão sendo exploradas e são
importantes para avaliar a resiliência dos organismos. Devido aos resultados das
atividades antropogênicas, como aquecimento global, poluição e desmatamento,
mudanças ambientais podem ser muito mais drásticas e imprevisíveis no futuro.
Quando os organismos se encontram em situações estressantes, podem lidar
com essas condições de diferentes maneiras. Segundo (Hofmann e Hercus, 2000),
isto é feito de três formas principais: evitando o estresse através de migração ou
processos fisiológicos gerando plasticidade fenotípica; ajustando a população através
da seleção dos organismos mais adaptados às novas condições; ou não ser apto a
14
lidar com o estresse de maneira adequada, sendo por isso sendo eventualmente
levado a extinção.
O ponto principal para prever mudanças esperadas nas comunidades animais é
entender a vulnerabilidade das espécies a um ambiente em modificação (Hofmann e
Todgham, 2010). No entanto, alguns trabalhos têm mostrado que nem todas
mudanças ambientais possuem efeito negativo direto em todos organismos. Foi
observado que cefalópodes (Sepia officinalis) e holotúrias (Apostichopus badionotus)
têm mantido suas taxas metabólicas e de crescimento enquanto que bivalves
(Crassostrea gigas) e estrelas do mar (Pisaster ochraceus) têm aumentado o
crescimento e fertilização (Dong et al., 2008a; Gooding et al., 2009; Gutowska et al.,
2008; Parker et al., 2010). Sendo assim, tem sido sugerido que as previsões das
repostas bióticas às mudanças climáticas devem considerar como os diferentes
grupos irão responder às diversas variáveis (Gooding et al., 2009)
Os equinodermos
De acordo com Bonaventura et al. 2011, estudos de monitoramento ambiental
dependem da escolha de organismos-modelo apropriados, e estes devem atender
uma série de condições tais como: abundância, disponibilidade no ambiente marinho,
relevância ecológica e facilidade de manutenção em laboratório.
Os equinodermos caracterizam-se por uma grande diversidade morfológica entre
os seus representantes. São organismos exclusivamente marinhos, distribuídos em
todos os mares e oceanos, desde a zona entre-marés até grandes profundidades. No
mundo existem cerca de 13.000 espécies fósseis e 7.000 atuais (Pawson, 2007), das
quais mais de 300 são registradas no Brasil. O filo é atualmente dividido em cinco
classes: Crinoidea (lírios-do-mar), Ophiuroidea (serpentes-do-mar), Echinoidea
(ouriços e bolachas-do-mar), Holothuroidea (pepinos-do-mar) e Concentricycloidea,
uma classe recém descoberta. Nos ambientes tropicais rasos, são um dos
invertebrados mais abundantes e diversos e em zonas abissais chegam a constituir
15
até 90% da biomassa (Hendler et al., 1995). Ocorrem em substratos consolidados ou
não, e até mesmo em epibiose com outros animais e plantas (Hyman 1955, Hendler et
al., 1995). Constituem um dos grupos de maior importância na estrutura das
comunidades bênticas marinhas, onde ocupam diversos níveis tróficos (Ventura et al.,
2006). Devido a sua abundância e sua posição na cadeia alimentar são considerados
organismos-chave em muitos ecossistemas (Saier, 2001). Portanto, alterações
populacionais neste grupo podem afetar toda a comunidade, assim como colocar em
risco o equilíbrio do ambiente em que vivem (Coteur et al., 2003).
Equinodermos também são explorados economicamente pela população,
principalmente em países asiáticos. Pepinos do mar são considerados um alimento
importante nas Filipinas, Malásia, Japão, Coréia e China (Himaya et al., 2010).
Também são usados na medicina tradicional no leste asiático para o tratamento de
asma, hipertensão e anemia (Fredalina et al., 1999; Himaya et al., 2010; Zhong et al.,
2007). Há informações de que regiões da América Central e do Sul têm apresentado
sobrepesca de alguns representantes do filo com fins de exportação para estas
regiões (Anderson et al., 2011). Em outras áreas, estrelas e ouriços do mar são
geralmente pescados também para uso em aquários ornamentais ou como objetos
decorativos (Chinnachamy et al., 2003). Para estes fins, o cultivo e manutenção em
laboratório de algumas classes de equinodermos vêm sendo estabelecidos ao longo
dos anos (Anderson et al 2011). Dada a sua importância comercial e ecológica e
considerando a sua abundância no ambiente marinho, este filo tem emergido como um
potencial modelo sentinela apto a perceber perigos ambientais.
Em vista da abundância, importância ecológica e por possuírem um esqueleto
composto por calcita, vários estudos têm sido realizados a fim de avaliar os efeitos da
acidificação dos oceanos neste grupo (Dupont e Thorndyke, 2012; Ross et al., 2011;
Wood et al., 2008). Os efeitos da acidificação da água variam entre as diversas
espécies de equinodermos em diferentes processos, estágios de vida e tempo. Já foi
observado um declínio da taxa de fertilização e clivagens nas larvas (Kurihara, 2008) e
16
a redução da taxa de crescimento em adultos (Shirayama e Thornton, 2005). Larvas
de ofiuróides tiveram 100% de mortalidade com a diminuição de 0.2 unidades de pH
(Dupont e Thorndyke, 2006). Por outro lado, outra espécie de ofiuróide (Amphiura
filiformis) teve suas taxas de crescimento e calcificação elevadas pela acidificação,
porém associadas com a perda de massa muscular (Wood et al., 2008). Os resultados
destes estudos mostram que a acidificação dos oceanos tem impactos negativos neste
filo, com possíveis consequências para todo o ecossistema. Porém, ainda há
necessidade de avaliar estes impactos nas diferentes classes bem como em espécies
que habitam regiões contrastantes.
O mesmo se aplica aos efeitos do aquecimento. Equinodermos são organismos
ectotérmicos, com uma ampla distribuição latitudinal e de profundidade. Por isso, a
localidade onde são encontrados define as suas capacidades de lidar com
determinada faixa de temperatura. Por exemplo, organismos encontrados na zona
entre-marés estão mais adaptados a variações diárias deste parâmetro do que os que
são encontrados em ambientes mais profundos (Dong et al., 2011). Trabalhos feitos
com diferentes grupos mostraram que grandes variações na temperatura podem afetar
a fertilização, o desenvolvimento inicial de larvas, a metamorfose e a gametogênese
(Byrne e Przeslawski, 2013; Chen e Chen, 1992; Kelly, 2001; Roller e Stickle, 1993;
Shpigel et al., 2004).
Adicionalmente, as alterações dos parâmetros ambientais parecem ser também
as responsáveis por desencadear o aparecimento de doenças, provavelmente devido
ao aumento da susceptibilidade dos organismos em condições estressantes (Harvell et
al., 2002).
Biomarcadores
O primeiro passo que determina a capacidade de uma espécie de lidar com as
alterações no seu ambiente é a codificação de proteínas e elementos regulatórios
necessários para o reparo de danos celulares ocasionados por estresse (Somero,
17
2012). Para detectar o impacto que alterações no ambiente podem causar têm sido
utilizadas como marcadores diversas proteínas cuja expressão é alterada de acordo
com o estresse fisiológico do organismo.
Entre alguns dos biomarcadores moleculares estão a Heat Shock Protein 70
(HSP70), a phosphorylated p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (pp38-MAPK) e o
Allograft Inflammatory Factor-1 (AIF-1) (Li et al., 2013; Pyza et al., 1997; Zilberberg et
al., 2011). Estes marcadores estão presentes desde bactérias até mamíferos e são
evolutivamente bastante conservados (Kregel, 2002), o que permite sua detecção por
imunoensaios simples (ELISA) usando anticorpos disponíveis comercialmente para
grupos mais derivados. Uma vantagem importante da utilização destes biomarcadores
moleculares para detecção de mudanças no ambiente é que os efeitos do estresse
podem ser detectados mais cedo em comparação com a avaliação de parâmetros
obtidos a posteriori, como taxas de crescimento, mortalidade e fertilidade (Sørensen et
al., 2003).
HSP70
As Heat shock proteins (HSP) são chaperonas moleculares, podendo ser
constitutivas (HSC) ou sintetizadas durante respostas a fatores de estresse. Estão
envolvidas no transporte, dobramento e desdobramento, montagem e desmontagem
de proteínas e também na degradação daquelas dobradas erroneamente ou
agregadas (Sørensen et al., 2003). Estas funções são fundamentais em condições
celulares normais. As populações naturais estão constantemente expostas a variações
ambientais e genéticas e as HSPs têm como função suavizar os efeitos da variação
ambiental, sendo importantes na manutenção da homeostase (Mayer e Bukau, 2005;
Morris et al., 2013) no entanto, o uso destas chaperonas pode ser intensificado no
caso de condições estressantes que possam potencialmente causar danos celulares e
moleculares nas estruturas da célula.
18
Os genes que codificam as HSPs foram primeiramente descobertos em
Drosophila expostas a altas temperaturas (Ritossa, 1962). E logo em seguida foram
associadas à síntese e manutenção de proteínas (Tissières et al., 1974). Os genes
das HSPs são altamente conservados evolutivamente e apresentam pouca variação
entre as espécies (Kregel, 2002; Sørensen et al., 2003). A sua baixa variabilidade e
ubiquidade mostra sua importância evolutiva e um papel de proteção às células
durante ou depois ao estresse (Feder & Hofmann, 1999).
Diferentes famílias de HSPs já foram identificada e classificadas de acordo com
o seu peso molecular em kDa. As principais são HSP100, HSP90, HSP70, HSP60,
HSP40 e HSPs menores que 30kDa. No entanto, em muitos organismos a HSP70 é
considerada a família principal, consistindo de proteínas induzidas (HSP) e
constitutivas (HSC) (Kregel, 2002). Estão presentes no citoplasma, mitocôndrias,
retículo endoplasmático e núcleo, sendo sua localização dependente do tipo de
proteína.
A regulação das HSPs ocorre através da expressão de genes induzíveis, ou
seja, genes expressos sob influência de um estressor ou substância. A expressão das
HSPs envolve uma ativação transcricional mediada por um fator de transcrição
específico, o HSF (Heat Shock Factor). Células em condições normais possuem HSF
no citoplasma e no núcleo em uma forma monomérica, que não se liga ao DNA. Em
resposta ao choque térmico e outros estresses fisiológicos, HSF é fosforilado por
proteínas quinases e formam trimeros que se acumulam dentro do núcleo. Estes se
ligam a HSE (Heat shock elements), uma sequência especifica de genes que
desencadeará a transcrição do mRNA da HSP70. Os mRNA se deslocam então para o
citosol e promovem a síntese de novas HSP70, que irão se acoplar às proteínas que
sofreram danos. O aumento da quantidade de proteínas danificadas também induz a
ativação dos HSF (Morimoto, 1993).
Desde a descoberta da HSP70 uma série de pesquisas têm utilizado a taxa de
expressão dessa proteína como marcador de estresse. Sua hiper-regulação indica a
19
presença de proteínas com sua conformação nativa e funcional alterada,
independentemente da causa. Sendo assim, é sugerida como um bom biomarcador
universal ao estresse, por ser quantificável, ubíqua, sub-letal e de interpretação
confiável (Pyza et al., 2000; Sørensen et al., 2003). Adicionalmente, a indução da sua
expressão é muito mais sensível ao estresse do que outros biomarcadores mais
tradicionais, tais como taxas de crescimento, doses letais e taxas de fertilidade
(Sørensen et al. 2003).
As HSPs têm sido consideradas ecologicamente importantes, pois além de
desempenharem um papel importante na resposta a uma variedade de condições
estressantes são fundamentais na recuperação e sobrevivência dos organismos. Já foi
demonstrado que além da resposta ao aquecimento, as HSPs podem ser induzidas
por uma série de condições estressantes tanto ambientais como genéticas. Por
exemplo, alta e baixa temperatura, radiação UV, metais pesados, pesticidas, hipóxia,
salinidade, infecções virais e bacterianas, parasitismo, atividade física, dessecação,
estresse oxidativo, senescência, injúrias, endogamia e mutações deletérias (Dong et
al., 2008b; Feder e Hofmann, 1999; Liu et al., 2014; Mayer e Bukau, 2005; Patruno et
al., 2001). Porém, o estresse necessário para induzir a expressão da HSP também
está intimamente relacionado com o nicho do organismo em questão. Por exemplo,
peixes antárticos têm a HSP induzida em temperaturas de aproximadamente 5°C,
enquanto que bactérias termofílicas a expressam na faixa de 100°C (Feder e
Hofmann, 1999; Parsell e Lindquist, 1993).
MAPK
As Mitogen-Activated Protein Kinases são uma classe de proteínas que atuam
em resposta a estímulos extracelulares. Todas as células eucarióticas possuem
múltiplas vias das MAPK que regulam uma variedade de processos celulares como
inflamação, ciclo, diferenciação e morte celular (apoptose), além do metabolismo,
desenvolvimento e expressão gênica (Caterina et al., 2008; Roux e Blenis, 2004;
20
Zarubin e Han, 2005). Fazem parte de um grupo de proteínas bem conservado ao
longo da evolução e estão presentes em diferentes tipos celulares (Graves e Krebs,
1960).
São reguladas por cascatas de fosforilação nas quais proteínas quinases
(MAK) ativadas em série levam a ativação das MAPK (Pearson et al., 2001). Cinco
diferentes grupos de MAPKs já foram extensivamente caracterizados em mamíferos:
ERK1 e 2 (extracellularly regulated kinase), JNK1 e 2 (c-jun N-terminal kinase) e
isoformas de p38. A p38-MAPK é membro da superfamília das MAP quinases,
moléculas sinalizadoras ubíquas que quando ativadas traduzem sinais iniciados por
uma variedade de estímulos extracelulares em respostas intracelulares. Seus
mecanismos regulatórios também são evolutivamente conservados e compartilhados
desde leveduras a mamíferos (Roux e Blenis, 2004).
Em especial, a p38-MAPK tem sido observada como a principal proteína
quinase responsiva a flutuações ambientais como salinidade, hipóxia/anóxia
temperatura e poluição por metais pesados (Gaitanaki et al., 2004; Kefaloyianni et al.,
2005; Larade e Storey, 2006). Também é regulada por diferentes estímulos externos
físicos ou químicos (e.g. estresse oxidativo, radiação UV, citocinas e LPS) (Roux e
Blenis, 2004). Através da regulação de substratos secundários (downstream), que
incluem proteínas quinases e fatores de transcrição, a p38 participa da transmissão,
amplificação e diversificação de sinais extracelulares (Gaitanaki et al., 2004).
A via da p38-MAPK se inicia com um estresse celular ou a sinalização de
receptores na superfície celular, que desencadeiam a fosforilação de proteínas
quinases específicas em uma sequência de ativação (MKKK/MKK/MAPK). A p38-
MAPK é então ativada por uma dupla fosforilação do Thr e Tyr no sítio de ativação
Thr-Gly-Tyr e pode então fosforilar diferentes substratos. Por exemplo, fatores
transcricionais (Ono e Han, 2000), proteínas quinase ativadas MAPK (MAPKAP), que
por sua vez fosforilam pequenas proteínas de choque térmico HSP27, assim como
outros substratos (Rouse et al., 1994).
21
Devido sua afinidade por diversos substratos concluiu-se que a p38-MAPK
participa da regulação de diferentes funções biológicas. É relacionada principalmente
às respostas imune inata e inflamatória, diferenciação celular e controle do ciclo
celular (Ono e Han, 2000; Roux e Blenis, 2004). No entanto, participa também em
respostas funcionais celulares como respiração, quimiotaxia, exocitose de grânulos,
aderência e apoptose (Kyriakis e Avruch, 1996).
Dadas às características da via da p38-MAPK, a utilização desta proteína como
biomarcador pode trazer informações a respeito do estado fisiológico de organismos
que estão sujeitos a mudanças no ambiente, bem como as estratégias que podem
estar utilizando para sua sobrevivência (Gaitanaki et al., 2004; Kefaloyianni et al.,
2005).
AIF-1
O AIF-1 é uma citocina relacionada ao reconhecimento self/non-self. Trata-se
de uma proteína citoplasmática sinalizadora de 14kDa ligante de cálcio. É
principalmente expressa em células do sistema imune e induz a expressão de
mediadores da resposta inflamatória, promovendo a proliferação e migração celular
em resposta a estímulos estressores (Utans et al., 1995; Zhao et al., 2013). Este fator
foi originalmente identificado em ratos, durante um processo de rejeição crônica a
transplantes de enxertos de coração de humanos (Utans et al., 1995). Isoformas com
alto grau de similaridade são encontradas em diversos grupos de organismos
filogeneticamente distantes, o que sugere uma alta conservação ao longo da evolução
(Miyata et al., 2001). Há evidências de que o AIF-1 também esteja envolvido na
resposta imune de espécies de invertebrados (Li et al. 2013; Zhang et al. 2013; Zhao
et al. 2013). Porém, o conhecimento existente a respeito do papel deste fator em
vertebrados não pode ser extrapolado para invertebrados, pois estes não possuem
imunidade adquirida (Li et al., 2013).
22
O primeiro gene de AIF-1 em invertebrados foi isolado de uma esponja
marinha, sendo verificado que sua expressão é aumentada em resposta a injúrias
(Kruse et al., 1999). Em polvos, o AIF-1 foi hiper-regulado em hemócitos após a
estimulação por lipopolisacarídeos (LPS - Miyata et al., 2001). Também já foi
identificado em ouriços do mar antárticos com hiper-regulação após exposição ao
LPS, estando associado com a resposta imune relacionada a primeira fase de
proliferação dos celomócitos (Ovando et al., 2012). Por outro lado, sua expressão
constitutiva foi detectada em hemócitos de outros moluscos tais como abalones,
mexilhões e ostras (Zhang et al., 2013). Observa-se que AIF-1 pode estar envolvido na
resposta imune de espécies filogeneticamente distantes, mas há poucos estudos que
relacionem a expressão do AIF-1 com o aumento da temperatura e acidificação da
água.
A fisiologia e a previsão dos futuros impactos
Na ecofisiologia tem-se bem estabelecido que processos que ocorrem a nível de
organismo, célula e genoma podem ter efeito cascata na distribuição, abundância e
fitness dos organismos em escala de micro-habitat até continental e oceânica
(Helmuth, 2009; Pörtner, 2002; Somero, 2012). Há um grande interesse em se
entender os efeitos das mudanças dos parâmetros ambientais nos organismos e suas
interações. Novas técnicas nas áreas de genômica, transcriptômica, proteômica
(Gracey e Cossins, 2003; Helmuth, 2009; Hofmann e Gaines, 2008), e indicadores
bioquímicos de estresse tem aberto novas possibilidades para mensurar as respostas
dos organismos de maneira pontual e rápida. Isto tanto no ambiente como em
laboratório (Costa e Sinervo, 2004).
Nas últimas décadas, os impactos causados pelo aquecimento e a acidificação
dos oceanos tem chamado atenção e há um consenso de que estes dois estressores
irão desencadear sérias consequências na estrutura e funcionamento do ecossistema
marinho, o que tem estimulado o interesse cientifico e da sociedade (IPCC, 2014).
23
Muitos trabalhos têm estudado os efeitos das mudanças climáticas na fisiologia de
organismos marinhos, seus mecanismos de adaptação, distribuição entre outros. No
entanto, a maioria é focada nos efeitos apenas de um estressor isolado, e é preciso
considerar de forma integrada os piores cenários para os próximos anos (Caldeira e
Wickett, 2003; Feidantsis et al., 2014). Estudos que abordem os efeitos do aumento
conjunto da temperatura e dos níveis de CO2 dissolvido podem gerar resultados mais
reais a respeitos das respostas dos organismos para os cenários ambientais futuros
(Pörtner, 2008).
Através da avaliação da variação de marcadores moleculares, este trabalho
buscou investigar como a fisiologia de um organismo-chave - a estrela do mar
Echinaster brasiliensis - pode ser alterada no quadro de mudanças climáticas. Saber
os limites de tolerância de um organismo e a que nível as alterações previstas vão
alterar sua fisiologia pode nos dar informações sobre quais espécies serão vulneráveis
e como que o ecossistema será transformado. O ponto principal para prever
mudanças esperadas nas comunidades animais é entender as respostas dos
indivíduos a um ambiente em modificação (Hofmann e Todgham, 2010). No entanto,
alguns trabalhos têm mostrado que nem todas as mudanças ambientais
desencadeiam efeitos negativos diretos em todos os organismos, como esperado
(Byrne et al., 2011; Gooding et al., 2009). Desta forma, tem sido sugerido que as
previsões das respostas bióticas a estas alterações devem considerar de que forma
diferentes tipos de organismos irão responder às diversas variáveis (Gooding et al.,
2009). Sendo assim, informações sobre o estado fisiológico de espécies-chave ou
membros principais de cadeias alimentares são importantes e precisam ser
amplamente exploradas para que seja possível identificar qual será o possível cenário
das comunidades no futuro.
24
Objetivos
O objetivo deste trabalho foi detectar possíveis alterações no estado fisiológico
de Echinaster brasiliensis, frente ao aumento da temperatura, da acidificação da água
e os efeitos cruzados destes dois fatores. Como parâmetros foram avaliadas as
variações no nível de três marcadores de estresse (HSP70, pp38-MAPK e AIF-1) nas
gônadas e celomócitos, e do número total de celomócitos. Especificamente, se buscou
responder:
1) Se a resposta às alterações é sistêmica ou afeta as gônadas e/ou celomócitos de
maneira diferencial;
2) Qual a dinâmica destes marcadores ao longo do tempo de exposição;
3) Se a exposição aos estresses e alterações observadas nos marcadores se refletem
numericamente na população de celomócitos.
4) Se o aquecimento e acidificação da água tem efeitos sinérgicos, antagônicos ou
compensatórios.
25
Materiais e Métodos
Local de coleta
O canal de São Sebastião é uma passagem marinha localizada no litoral norte
do Estado de São Paulo, entre a Ilha de São Sebastião (Ilhabela) e o continente (São
Sebastião). Possui 25km de extensão, 2 a 7km de largura e profundidade máxima de
40m (Oliveira e Marques, 2007). O clima da região é subtropical e a temperatura da
água oscila entre 15 e 28°C devido à influência de quatro diferentes massas de água
ao longo do ano, sendo superior a 20°C apenas na superfície (Silva et al 2001). A
salinidade oscila entre 34 e 36‰ pela presença de áreas estuarinas próximas, e o pH
se mantém em torno de 8.0.
Modelo de estudo
Echinaster brasiliensis (Müller e Troschel, 1842) é uma espécie comum de
estrela-do-mar no Brasil. Conhecida popularmente como estrela-vermelha, comumente
é coletada por aquariofilistas. Ocorre em todo o litoral brasileiro, com distribuição
geográfica que se estende desde a Flórida até o Golfo de San Matias, na Argentina.
Em geral é encontrada em águas rasas (2 a 5 metros) e na região entre marés, mas
não ficam expostas durante as marés baixas. São caracterizadas por apresentarem
uma marcada simetria pentaradial, com cinco braços longos e estreitos (Figura 2).
Possuem cinco pares de gônadas, um em cada braço, e apresentam uma produção
contínua de gametas em todos os meses do ano.
26
Figura 2 – Exemplar de Echinaster brasiliensis. Região dorsal.
Coleta e manutenção em laboratório
Espécimes de E. brasiliensis (tamanho médio: raio 7,5cm ±0,5) foram coletados
manualmente na região de infralitoral do canal de São Sebastião/SP. Após as coletas,
os organismos foram trazidos ao laboratório no Departamento de Fisiologia (IB/USP) e
aclimatados durante cinco dias em aquários com sistema de filtração, temperatura de
24°C, pH 8.0, salinidade 35‰, aeração constante e alimentação a cada dois dias com
Artemia salina.
Experimentos de estresse fisiológico
Para os ensaios de estresse foram selecionados como fatores as temperaturas
de 28° e 30°C e os pHs de 7.3 e 7.7, segundo as previsões de mudanças climáticas
para o final do século 21 (IPCC 2014) e as características do local de coleta. Foram
estabelecidas mudanças de acordo com as previsões do IPCC caso os níveis de
27
emissão de gases do efeito estufa sejam mantidos nos níveis atuais e um segundo
cenário levando em consideração o aumento extremo dessas emissões. Inicialmente
foram testados os efeitos apenas do aquecimento ou da acidificação da água. Para se
testar apenas o efeito da temperatura o pH dos aquários foi mantido (8.0) e a
temperatura alterada. Para verificar apenas o efeito da acidificação a temperatura dos
aquários foi mantida (24°C) e o pH alterado. Em um segundo momento, para testar se
há um efeito sinérgico ou antagônico da temperatura e do pH, os dois paramentos (pH
e temperatura) foram alterados simultaneamente cruzando os limites escolhidos.
Então foi possível avaliar se o efeito de apenas um dos fatores foi diferente do efeito
de dois fatores somados. Para os ensaios os espécimes foram divididos em nove
grupos experimentais após o período de aclimatação (Figura-3).
Figura 3 - Grupos experimentais em relação aos fatores temperatura e pH utilizados. Controle: 24°C e
pH8.0.
Os aquários foram mantidos em sala climatizada e para controlar a temperatura
da água foi utilizado um aquecedor submerso para aquários. Para modificar o pH foi
utilizado um controlador digital automático de pH (Sera) com injeção de CO2.
Em cada grupo experimental foram utilizados 35 espécimes com
aproximadamente o mesmo tamanho (12,5 cm de raio). Os organismos foram
transferidos dos aquários de manutenção para os experimentais com as mesmas
condições e só então os parâmetros foram alterados para evitar um choque de
28
temperatura ou pH. Após a transferência, a mudança dos parâmetros foi feita
gradativamente e acompanhada até que atingisse os valores desejados (entre 1 e 2
horas) e então se iniciava a contagem do tempo. Depois do início do estresse, cinco
espécimes foram retirados em cada tempo estabelecido (1, 3, 12, 24 e 48h) para a
coleta das amostras de tecido e líquido celomático. Outros parâmetros como
salinidade, quantidade de amônia, nitrato e nitrito dissolvidos também foram
mensurados periodicamente com kit de análise de água (LabconTest).
Para verificar possíveis alterações fisiológicas devido ao manuseio também
foram retiradas amostras de organismos logo após a coleta (CC) e após os cinco dias
de aclimatação no laboratório (CA). Após os experimentos, os organismos foram
retornados aos aquários de aclimatação até a regeneração parcial do braço amputado
e posteriormente devolvidos ao local de coleta.
Coletas das amostras para análises
Após serem expostos às diferentes condições de temperatura e pH, os
espécimes eram secos com papel absorvente e tinham um dos braços cortado e
congelado a -80°C para posterior dissecção da gônada. O líquido celomático foi
coletado através de gotejamento do braço amputado e adicionado a uma solução
anticoagulante (NaCl 340mM; KCl 19mM; EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)
20mM; Tris-HCl 68mM, pH 8.2 - Xing e Chia, 2000) na proporção de 1:1. Uma fração
do liquido foi utilizado para contagem e análise de viabilidade dos celomócitos e o
restante congelado a -80° C para posterior análise dos marcadores. A viabilidade dos
celomócitos foi aferida logo após a coleta utilizando Azul de Tripan e a contagem das
células feita em uma câmara de Neubauer.
Os alvos escolhidos para os ensaios foram gônadas e celomócitos do fluido
celômico, baseado nos resultados de testes anteriores e dados da literatura que
mostram a sensibilidade das gônadas ao estresse térmico e sua importância para o
29
estoque energético e fitness (Meistertzheim et al., 2009; Morris et al., 2013; Watts et
al., 2011), e a participação dos celomócitos na resposta imune e outros processos
fisiológicos relacionados ao metabolismo (Muñoz-Chápuli et al., 2005)
Quantificação das proteínas totais
a. Celomócitos
Fluido celomático coletado (2ml) foi centrifugado a 4°C (13.000 g /5 min) para a
formação de um pellet e o sobrenadante descartado. Foram adicionados 600 µL de
tampão de extração (Holm et al., 2008), composto de TBS (Tris Buffered Saline),
EDTA 1mM, 1% de Triton X-100 e coquetel inibidor de proteases (Amresco). As
amostras foram sonicadas em banho ultrasônico por 20 minutos e posteriormente
centrifugadas a 4°C (250 g /10min) e o sobrenadante coletado para determinação da
quantidade de proteínas totais através do método BCA (Bicinchoninic Acid Assay,
Walker 2009).
b. Gônadas
Fragmentos das gônadas foram coletados com aproximadamente 0,5 cm3 e
colocados em microtubos de 1,5 mL com 600 µL de tampão de extração (Zilberberg et
al., 2011), composto de TBS (Tris Buffered Saline), EDTA 1mM e coquetel inibidor de
proteases (Amresco). As amostras foram maceradas com auxílio de pistilos plásticos,
centrifugadas a 4°C (250 x g / 10 min), e o sobrenadante coletado para determinação
da quantidade de proteínas totais através do método de Bradford (Bioagency;
Bradford, 1976).
Análise da expressão das proteínas de estresse
Para a análise da expressão das proteínas relacionadas à resposta imune
foram feitos ensaios de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) utilizando um
protocolo de imunoensaio adaptado (Hernroth et al., 2011; Zilberberg et al., 2011).
30
Para isso, 100 µl do extrato das amostras descrito anteriormente, contendo 50 µg de
proteínas totais, foram adicionados por poço em placas de 96 poços e incubadas por
24 horas em geladeira a 4°C. Após este período, as placas foram lavadas três vezes
com uma solução de PBS (Phosphate Buffered Saline) contendo 0,05% de Tween-20
(PBS-T). Em seguida adicionado BSA (Albumina sérica bovina) 1% em PBS-T (100 µl/
poço) overnight a 4°C, para o bloqueio das ligações inespecíficas. Posteriormente,
foram adicionados 100 µl do anticorpo primário específico (coelho anti-HSP70, coelho
anti-pp38 ou cabra anti-AIF-1, Santa-Cruz Biotech) diluídos 1:500 em PBS-T com
0,1% de BSA e as placas incubadas por 2:30h a 29°C. As placas foram novamente
lavadas três vezes com PBS-T e receberam o anticorpo secundário específico
conjugados com peroxidase (HRP-anti-coelho ou HRP anti-cabra 1:1000, Santa-Cruz
Biotech) diluídos no mesmo tampão e incubadas por 2:30h a 29°C. As reações foram
reveladas utilizando TBM (3,3,5,5- tetrametilbenzidina, Pierce) como substrato por 10
minutos, interrompidas ao adicionar H2SO4 2M e lidas em um leitor de placas de
ELISA a 450nm. Os resultados foram expressos em unidades de absorbância.
Caracterização dos celomócitos
As células presentes no liquido celomático foram visualizadas por meio de
citocentrifugados, usando amostras de líquido celomático de 10 indivíduos. Para os
citocentrifugados, a densidade da suspensão foi verificada em uma câmara de
Neubauer, ajustada para 5 x 105 células por ml usando a solução anticoagulante, e
passada para lâminas em uma citocentrífuga (100 µl por poço – 270 x g / 5 min -
Citospin 248. FANEM). Feito isso, as lâminas foram fixadas em vapor de formol por 45
min, coradas com Tricromo de Mallory ou Azul de Toluidina 0,1%. A identificação dos
tipos celulares foi baseada nas descrições existentes na literatura (e.g. Hyman, 1955;
Bolootian e Giese,1958; Chia e Xing, 1996).
31
Para visualização dos esferulócitos em microscopia eletrônica de transmissão,
as células coletadas do líquido celomático foram fixadas por 24h em glutaraldeído
2,5%. Após a fixação, a suspensão celular foi incluída em Ágar (SIGMA) seguindo
protocolos adaptados de Dykstra (1993) e Taupin (2008). Para isso, as células fixadas
foram centrifugadas (180 x g / 5 min.) e ressuspendidas com a mesma solução
anticoagulante citada anteriormente, para retirar o fixador. A suspensão foi novamente
centrifugada e ressuspendida em uma solução de ágar dissolvido em água destilada a
30°C, e passada rapidamente para Eppendorfs, que foram submetidos a centrifugação
por 1 min a 12.000 x g. Feito isto, os tubos foram mantidos a 4oC até que o ágar
solidificasse. Posteriormente, os blocos foram retirados dos tubos e os pellets
contendo as células foram cortados. Estes foram deixados por 24h a 20°C em uma
mistura de tampão Cacodilato de Sódio 0,4 M e água do mar (4:5), sendo depois
rinsados com o mesmo tampão e pós-fixados em Tetróxido de Ósmio 2% em água do
mar (30 min. a 20°C). Para a microscopia, os pellets foram desidratados em uma série
gradativa de etanol (50, 70, 90 e 100%, 30 min. em cada) e embebidos em resina
(Embed-812, EMS). Os blocos foram então cortados em ultramicrótomo (Ultratome
NOVA, LKB) e as seções observadas em microscópio de transmissão EM 900
(ZEISS).
Análises estatísticas
Para comparação dos controles de campo e aclimatado foi realizado um teste t.
Nos três casos (anticorpos AIF-1, HPS70, PP38) foram realizadas ANOVA
multifatoriais (Fatores: amostra e tempo) para os dados corrigidos pela média de CA
(controle aclimatação) específica para cada amostra considerando o anticorpo,
permitindo assim a comparação entre estes. No caso de diferenças significativas
indicadas pela ANOVA foi realizado o teste a posteriori Tukey HSD. Também foram
feitas ANOVAS multifatoriais para comparar os fatores combinados (pH + temperatura)
e os mesmos isolados. As análises foram realizadas com o software GraphPad Prism.
32
Resultados
Os resultados da quantificação das proteínas são expressos pelos valores
médios da absorbância a 450nm. Quando necessário, os dados nos gráficos foram
deslocados no eixo x para melhor visualização.
Os testes foram letais aos organismos apenas no grupo experimental 30°C +
pH7.3 após 24h de exposição. No grupo experimental 30°C+pH7.7 observou-se o
desenvolvimento de ulcerações na epiderme das estrelas no tempo 48h (Figura 4)
A B
Figura 4 E. brasiliensis após 48 horas de exposição à temperatura 30°C e pH7.7 apresentando
ulcerações na epiderme (setas).(A) Região dorsal. (B) Região ventral Escala: 1cm.
Expressão da pp38-MAPK
a) Gônadas
A análise da quantidade pp38-MAPK expressa nos organismos no ambiente
natural (CC) e após o período de aclimatização (CA) não mostrou diferenças entre o
controle coletado em campo e o aclimatizado em laboratório (Figura 5-A).
Observou-se que o aumento da temperatura desencadeou aumento da pp38-
MAPK nas gônadas após 24 horas de exposição ao estresse. Não havendo diferença
33
de expressão do marcador entre as duas temperaturas escolhidas. Os tempos 1hx24h
e 1hx48h são significativamente diferentes (Figura 5-B). A alteração do pH da água
não alterou a expressão da pp38-MAPK. Não há diferenças da quantidade de proteína
entre os dois pHs assim como também não houve diferença significativa entres os
tempos de cada pH escolhido (Figura 5-C).
Os grupos com temperatura 28°C e alteração do pH desencadearam o aumento
da expressão de pp38-MAPK, a partir do tempo 1H, nas duas combinações
(28°C+pH7.3 e 28°C+pH7.7) e se mantém alta até o final do experimento. No entanto,
na combinação 28°C e pH7.7 o aumento do marcador foi significativamente maior
(Figura 5-D). Os grupos com temperatura 30°C e alteração do pH ocorreu aumento da
expressão da pp38-MAPK logo após o tempo 1h e as combinações diferem entre si
significativamente. No grupo 30°C e pH7.7 há maior expressão do marcador (Figura
5-E).
Quando comparados os efeitos dos fatores alterados individualmente (pH e
temperatura) com a alteração dos dois fatores ao mesmo tempo (pH+temperatura)
observa-se que nos grupos com fatores 28°C e pH 7.3 a quantidade de proteína é
maior com a alteração dos dois fatores, em todos os tempos quando comparado com
o grupo com apenas o pH alterado. E no tempo 1H quando comparado com o grupo
com apenas a temperatura alterada (Figura 6-A). No grupo com temperatura 28°C e
pH7.7 observa-se que a combinação tem maior aumento da proteína em relação aos
fatores isolados significativamente diferente (Figura 6-B).
No grupo com temperatura 30°C e pH 7.3 houve aumento na expressão do
marcador quando os fatores foram somados, diferente significativamente da
temperatura apenas no tempo 1h e do pH nos tempos 1h, 12h e 24h (Figura 6-C). Na
combinação 30°C e pH 7.7 também houve uma maior expressão nos fatores
combinados do que nos fatores isolados (Figura 6-D).
34
A
B C
D E
Figura 5 – Expressão de pp38-MAPK nas gônadas. Resultados apresentados pela média da densidade
óptica (DO) a 450nm. (A) Comparação dos organismos recém-coletados (CC) e organismos aclimatizados
em laboratório após 5 dias (CA). (B)Comparação entre as temperaturas 28° e 30°C. (C) Comparação entre
os pHs 7.3 e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura 28° com os pHs 7.3 e 7.7. (E) Comparação entre a combinação da temperatura 30°C com os pHs 7.3 e 7.7.
35
A B
C D
Figura 6 – Expressão de pp38-MAPK nas gônadas. Resultados apresentados pela média da densidade
óptica (DO) a 450nm. (A)Comparação entre a combinação 28°C+pH7.3 e os fatores 28°C e pH7.3
isolados.(B) Comparação entre a combinação 28°C+pH7.7 e os fatores 28°C e pH7.7 isolados. (C) Comparação entre a combinação 30°C+pH7.3 e os fatores 30°C e pH7.3 isolados. (D) Comparação entre a
combinação 30°C+pH7.7 e os fatores 30°C e pH7.7 isolados.
b) Celomócitos
A análise da quantidade pp38-MAPK expressa nos celomócitos dos organismos
no ambiente natural e após o período de aclimatização mostrou que há uma
diminuição do marcador nos organismos aclimatizados (Figura 7-A).
O aumento apenas da temperatura aumentou a expressão de pp38-MAPK nos
celomócitos e as duas temperaturas produziram efeitos diferentes. No grupo com a
36
temperatura 28°C o aumento da proteína é maior e ocorre entre os tempos 0h e 3h,
com pico máximo em 3H se mantendo significativamente mais alto até o fim do
experimento. No grupo com temperatura 30°C também ocorre aumento com pico em
1h que se mantém até o fim do experimento (Figura 7-B).
A acidificação da água aumentou da expressão da pp38-MAPK. No grupo com
pH 7.3 ocorreu o maior aumento a partir do tempo 1h com máximo atingido no tempo
12h e uma redução nos tempos 24h e 48h que ainda permaneceram
significativamente maiores que o controle (0h). No grupo com pH 7.7 houve também
um aumento no tempo 1h e todos os tempos diferem significativamente do controle
(Figura 7-C).
Os grupos com temperatura 28°C e alteração do pH mostraram aumento da
expressão da pp38-MAPK sendo que a combinação com o pH7.3 ocasionou aumentos
maiores. No grupo experimental 28°C e pH7.3 o aumento ocorre desde o inicio do
experimento, com pico de expressão no tempo 12h. Na combinação 28°C e pH7.7, a
expressão da proteína oscila entre o tempos, sendo significativamente maior que o
tempo 0h em todos os tempos, com exceção do tempo 12 (Figura 7-D).
Os grupos com temperatura 30°C e alteração do pH não mostraram diferenças
na expressão da proteína entre os dois grupos. Em ambos ocorre aumento da
expressão com pico no tempo 1h, que reduz depois do tempo 3h mas se mantém
maior que o controle até o final do experimento (Figura 7-E).
37
A
B C
D E
Figura 7 – Expressão de pp38-MAPK nos celomócitos. Resultados apresentados pela média da densidade
óptica (DO) a 450nm. Comparação da expressão de pp38-MAPK nos celomócitos logo após a coleta (CC)
e nos organismos aclimatizados em laboratório após 5 dias (CA). (B)Comparação entre as temperaturas
28° e 30°C. (C) Comparação entre os pHs 7.3 e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura
28° com os pHs 7.3 e 7.7. (E) Comparação entre a combinação da temperatura 28° com os pHs 7.3 e 7.7.
38
Quando comparados os efeitos da mudança de apenas um fator com os da
mudança de dois fatores observamos que na combinação 28°C e pH7.3 tanto os
efeitos isolados como combinados aumentam a expressão da pp38-MAPK, mas a
combinação dos efeitos do pH e da temperatura provoca um aumento da proteína
mais baixo porém mais rápido, no tempo 1h, comparado com os efeitos da
temperatura. E expressão maior da proteína quando comparado com o pH (Figura 8-
A).
No grupo com temperatura 28°C e pH7.7 observa-se que todos os grupos
aumentam a expressão da pp38-MAPK. Porém, a soma dos dois fatores provoca um
aumento menor quando comparado com a expressão desencadeada pela temperatura
isolada. A combinação e o pH isolado mostraram efeitos semelhantes, com diferença
significativa apenas no tempo 24h. (Figura 8-B). Observa-se que o pH diminui a
resposta desencadeada pela temperatura.
No grupo com temperatura 30°C e pH7.3 os fatores combinados geram aumento
semelhante da proteína. Mas no grupo com os dois parâmetros alterados a expressão
é maior e mais rápida (1h) do que nos grupos com apenas um parâmetro modificado
(Figura 8-C). No grupo com temperatura 30°C e pH 7.7 os fatores isolados e a
combinação apresentam os mesmos efeitos na expressão de pp38-MAPK, exceto
quando houve a variação apenas do pH onde no tempo 3h há uma diminuição da
expressão da proteína (Figura 8-D).
39
A B
C D
Figura 8 – Expressão de pp38-MAPK nos celomócitos. Resultados apresentados pela média da densidade
óptica (DO) a 450nm. (A)Comparação entre a combinação 28°C+pH7.3 e os fatores 28°C e pH7.3 isolados.(B) Comparação entre a combinação 28°C+pH7.7 e os fatores 28°C e pH7.7 isolados. (C)
Comparação entre a combinação 30°C+pH7.3 com os fatores 30°C e pH7.3 isolados. (D) Comparação
entre a combinação 30°C+pH7.7 com os fatores 30°C e pH7.7 isolados.
Expressão da HSP70
a) Gônadas
A análise da expressão de HSP70 nos organismos no ambiente natural e após o
período de aclimatização mostrou que há um aumento significativo da proteína nos
organismos mantidos em laboratório (Figura 9-A). O aumento da temperatura não
alterou significativamente a expressão da HSP70 nas gônadas e não houve diferenças
40
entre as diferentes temperaturas, nem entre os tempos de exposição (Figura 9-B). A
acidificação da água aumentou a expressão do marcador no pH7.3 no tempo 1h que
se manteve sem diferença com os próximos tempos, exceto no tempo 48h onde há
uma queda significativa na expressão da HSP70 mas que não difere do controle. No
grupo com pH 7.7 não houve mudança significativa da expressão de HSP70 nos
diferentes tempos. Ambos os pHs, estatisticamente, não mostraram diferenças entre si
mas é possível observar maior expressão no grupo com pH7.7 nos tempos 1h e 12h e
menor no tempo 48h. (Figura 9-C).
Os grupos com temperatura 28°C e alteração do pH desencadearam respostas
diferentes. A maior expressão da proteína ocorreu na combinação 28°C e pH7.3 que
aumentou gradativamente a expressão sendo significativamente maior que o controle
apenas no tempo 48H (Figura 9-D). Na combinação 28°C e pH7.7 não houve diferença
significativa da expressão da proteína entre os tempos. Os grupos com temperatura
30°C e alteração do pH mostraram diferença de entre as duas combinações . A
combinação 30°C e pH7.3 desencadeou aumento da expressão de HSP70 no tempo
1h que se manteve alto e significativamente diferente do controle até o tempo 24h. A
expressão desencadeada pela combinação 30°C e pH7.3 foi significativamente maior.
Na combinação 30°C e pH7.7 houve aumento significativo do marcador no tempo 1h
que se manteve até o tempo 48h (Figura 9-E).
41
A
B C
D E
Figura 9 – Expressão de HSP70 nas gônadas. Resultados apresentados pela média da densidade óptica
(DO) a 450nm. (A) Comparação da expressão de HSP70 nas gônadas logo após a coleta (CC) e nos organismos aclimatizados em laboratório após 5 dias (CA). (A)Comparação entre as temperaturas 28° e
30°C. (B) Comparação entre os pHs 7.3 e 7.7. (C) Comparação entre a combinação da temperatura 28°
com os pHs 7.3 e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura 28° com os pHs 7.3 e 7.7.
42
Quando comparada a alteração de apenas um fator (temperatura ou pH) com os
mesmos combinados observou-se que na combinação 28°C e pH7.3 os três grupos
não se diferenciam significativamente, mostrando alterações semelhantes (Figura 10-
A). A comparação da combinação 28°C e pH7.7 com a alteração de apenas um dos
parâmetros não mostrou diferenças significativas entres os três grupos ao longo do
tempo (Figura 10-B). A combinação 30°C e pH7.3 não se diferencia do pH isolado e é
maior do que a alteração apenas da temperatura (Figura 10-C). Na comparação da
combinação 30°C e pH7.7 observa-se que os três grupos não apresentam diferenças
significativas até o tempo 12h mas no tempo 24h há uma maior expressão de HSP70
causada pela combinação dos dois fatores (Figura 10-D).
43
A B
C D
Figura 10 – Expressão de HSP70 nas gônadas. Resultados apresentados pela média da densidade óptica
(DO) a 450nm. (A)Comparação entre a combinação 28°C+pH7.3 e os fatores 28°C e pH7.3 isolados.(B) Comparação entre a combinação 28°C+pH7.7 e os fatores 28°C e pH7.7 isolados. (C) Comparação entre
a combinação 30°C+pH7.3 com os fatores 30°C e pH7.3 isolados. (D) Comparação entre a combinação
30°C+pH7.7 com os fatores 30°C e pH7.7 isolados.
b) Celomócitos
A análise da quantidade HSP70 expressa nos celomócitos dos organismos no
ambiente natural e após o período de aclimatização mostrou que há diminuição
significativa da proteína nos organismos mantidos em laboratório (Figura 11-A). O
aumento da temperatura da água desencadeou maior expressão do marcador na
temperatura 28°C, com pico de expressão no tempo 1h e diminuição no tempo 3h até
o tempo 48h, mas em níveis significativamente maiores do que no tempo 0h. Já na
44
temperatura 30°C houve queda na expressão logo após o inicio do estresse, no tempo
1h, retornando a níveis normais no tempo 3h e aumentando até 48h sem diferenças
significativas entre eles, mas significativamente maiores do que o controle (Figura 11-
B).
A exposição aos diferentes pHs mostrou que há diferença significativa dos
efeitos de ambos na alteração da expressão da HSP70. A maior expressão foi
detectada pela exposição ao pH 7.7, houve aumento no tempo 1h que se manteve alto
até o tempo 48h. Todos os tempos são significativamente diferentes do controle mas
não há diferença entre os tempos de 1h a 48h. Já no grupo exposto ao pH 7.3 a
expressão de HSP70 se manteve sem alterações até o tempo 24h quando houve
queda significativa em relação aos outros tempos e o controle, aumentando
novamente no tempo 48h que não é diferente do controle (Figura 11-C).
A combinação da temperatura 28°C com os dois pHs não desencadeou
mudança significativa na expressão de HSP70 entre as duas combinações (Figura 9-
D). A combinação 30°C e pH7.3 reduziu a expressão de HSP70 a partir do tempo 12h.
Já a combinação 30°C e pH7.7 alterou a expressão (Figura 11-E).
45
A
A B
C D
Figura 11 – Expressão de HSP70 nos celomócitos. Resultados apresentados pela média da densidade
óptica (DO) a 450nm. (A) Comparação da expressão de AIF-1 nos celomócitos logo após a coleta (CC) e nos organismos aclimatizados em laboratório após 5 dias (CA). (B)Comparação entre as temperaturas 28°
e 30°C. (C) Comparação entre os pHs 7.3 e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura 28°
com os pHs 7.3 e 7.7. (E) Comparação entre a combinação da temperatura 28°C com os pHs 7.3 e 7.7.
46
Quando comparados os fatores isolados com os mesmos combinados observou-
se que a mudança de dois parâmetros não altera a expressão das proteínas em todos
os grupos, exceto no grupo com temperatura 30°C e pH 7.3. No qual ouve diminuição
da expressão da HSP70, semelhante ao desencadeado apenas pela alteração do pH,
no tempo 24h seguido da morte dos organismos (Figura 12- A-D)
A B
C D
Figura 12 – Expressão de HSP70 nos celomócitos. Resultados apresentados pela média da densidade
óptica (DO) a 450nm. (A)Comparação entre a combinação 28°C+pH7.3 e os fatores 28°C e pH7.3
isolados.(B) Comparação entre a combinação 28°C+pH7.7 e os fatores 28°C e pH7.7 isolados. (C) Comparação entre a combinação 30°C+pH7.3 com os fatores 30°C e pH7.3 isolados. (D) Comparação
entre a combinação 30°C+pH7.7 com os fatores 30°C e pH7.7 isolados.
47
Expressão de AIF-1
a) Gônadas
A expressão de AIF-1 nos organismos no ambiente natural e após o período de
aclimatização mostrou aumento significativo da proteína nos organismos mantidos em
laboratório (Figura 13-A).
Após a exposição às diferentes temperaturas, observou-se que ambas causaram
os mesmos efeitos na expressão do AIF-1, sem diferenças significativas entre as duas.
Houve aumento significativo da expressão na primeira hora que se manteve alto e sem
diferenças até o tempo 48h (Figura 13-B).
A acidificação da água aumentou a expressão de AIF-1 em ambos os pHs
testados. Em ambos houve um aumento significativo já na primeira hora que se
manteve até o tempo 48h. Mas no tempo 12h onde houve maior expressão em
resposta ao pH7.7. (Figura 13-C).
A combinação da temperatura 28°C com os dois pHs mostrou que a combinação
28°C e pH7.7 não altera a expressão de AIF. Já a combinação da temperatura 28°C e
pH7.3 aumentou a expressão do marcador a partir do tempo 1h até o fim do
experimento, sem diferenças significativas entre os tempos (Figura 13-D). A
combinação da temperatura 30°C com os dois pHs não alterou expressão de AIF-1
(Figura 13-E).
48
A
B C
D E
Figura 13 – Expressão de AIF-1 nas gônadas. Resultados apresentados pela média da densidade óptica
(DO) a 450nm. (A) Comparação da expressão de AIF-1 nas gônadas logo após a coleta (CC) e os
organismos aclimatizadoss em laboratório após 5 dias (CA). (A)Comparação entre as temperaturas 28° e 30°C. (B) Comparação entre os pHs 7.3 e 7.7. (C) Comparação entre a combinação da temperatura 28°
com os pHs 7.3 e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura 28° com os pHs 7.3 e 7.7.
49
A comparação dos efeitos dos fatores isolados e dos mesmos combinados
mostrou que a combinação 28°C e pH7.3 desencadeou as mesmas alterações na
expressão de AIF-1 nas gônadas que o dois fatores isolados (Figura 14 – A). Já na
combinação 28°C e pH7.7, a combinação diminuiu a expressão de AIF-1, em relação
à temperatura isolada, a partir do tempo 3h (Figura 14 – B). A combinação 30°C e
pH7.3 desencadeou expressão de AIF significativamente mais baixa do que nos
fatores isolados. O mesmo se observa na combinação 30°C e pH7.7 (Figuras 14 – C e
D).
A B
C D
Figura 14 – Expressão de AIF-1 nas gônadas. Resultados apresentados em média de densidade óptica
(DO) a 450nm. (A)Comparação entre a combinação 28°C+pH7.3 e os fatores 28°C e pH7.3 isolados.(B) Comparação entre a combinação 28°C+pH7.7 e os fatores 28°C e pH7.7 isolados. (C) Comparação entre
a combinação 30°C+pH7.3 com os fatores 30°C e pH7.3 isolados. (D) Comparação entre a combinação
30°C+pH7.7 com os fatores 30°C e pH7.7 isolados.
50
b) Celomócitos
A análise da expressão de AIF-1 nos organismos no ambiente natural e após o
período de aclimatização mostrou que não há diferença significativa entre os controles
pós-coleta e aclimatizado (Figura 15 - A). O aumento da temperatura alterou a
expressão de AIF-1 apenas no tempo 12h e foi significativamente diferente entre as
duas temperaturas. A temperatura 28°C ocasionou aumento da expressão do
marcador, enquanto que houve queda da expressão ocasionada pela temperatura
30°C (Figura 15-B).
A acidificação da água ocasionou efeitos diferentes na expressão de AIF-1 pelos
dois pH testados. No grupo com pH 7.3 houve aumento gradativo da expressão da
proteína até o tempo 48h que difere significativamente do controle. O pH7.7 não
alterou significativamente a expressão de AIF-1 durante o experimento (Figura 15-C).
A combinação da temperatura 28°C com os dois pH mostrou que a combinação
28°C e pH7.3 diminui a expressão de AIF-1 entre 3 e 24 horas, aumentando em 48
horas. Já a combinação 28° e pH7.7 não alterou a expressão do marcador (Figura 15-
D). As combinações da temperatura 30°C com os dois pH desencadearam repostas
estatisticamente diferentes apenas no tempo 3h. No grupo exposto à temperatura
30°C e pH7.7 ocorreu a diminuição da expressão AIF-1 no tempo 48h. Já no grupo
30°C e pH7.3 essa redução ocorreu mais rápida, no tempo 3h com posterior aumento
nos tempos seguintes (Figura 15-E).
51
A
B C
D E
Figura 15 – Expressão de AIF-1 nos celomócitos. Resultados apresentados em média de densidade óptica
(DO) a 450nm. (A) Comparação da expressão de AIF-1 nos celomócitos logo após a coleta (CC) e os
organismos aclimatizados em laboratório após 5 dias (CA) (A)Comparação entre as temperaturas 28° e
30°C. (B) Comparação entre os pHs 7.3 e 7.7. (C) Comparação entre a combinação da temperatura 28°
com os pHs 7.3 e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura 28°C com os pHs 7.3 e 7.7.
52
A comparação dos efeitos dos fatores isolados e dos mesmos combinados
mostrou que a combinação 28°C e pH7.3 diminui a expressão da proteína enquanto
que os fatores sozinhos aumentam (Figura 16-A). A combinação 28°C e pH7.7, não
desencadeou respostas diferentes das dos fatores sozinhos (Figura 16-B). Na
combinação 30°C e pH 7.3 os dois fatores juntos desencadeiam o efeito contrário dos
fatores isolados (Figura 16-C). Na combinação 30°C e pH 7.7 a soma dos fatores foi
significativamente diferente apenas no tempo 1h, em relação ao pH, e no tempo 48,
em relação à temperatura (Figura 16-D).
A B
C D
Figura 16 – Expressão de AIF-1 nos celomócitos. Resultados apresentados pela média da densidade
óptica (DO) a 450nm. (A)Comparação entre a combinação 28°C+pH7.3 e os fatores 28°C e pH7.3 isolados.(B) Comparação entre a combinação 28°C+pH7.7 e os fatores 28°C e pH7.7 isolados. (C)
Comparação entre a combinação 30°C+pH7.3 e os fatores 30°C e pH7.3 isolados. (D) Comparação entre
a combinação 30°C+pH7.7 e os fatores 30°C e pH7.7 isolados.
53
Contagem total do número de Celomócitos e viabilidade celular
Ao expor as estrelas ao aumento da temperatura observou-se que na
temperatura de 30°C há um aumento no número total de celomócitos a partir do tempo
1h com redução do número de células viáveis após o tempo 12 horas (Figuras 17-A e
18-A). Na temperatura de 28°C também há um aumento significativo do número de
células no tempo 1h que é seguido de uma redução significativamente menor que o
controle até o tempo 48h. (Figura 17-A), sem alterações significativas na viabilidade
das células. A acidificação da água não alterou o número total de celomócitos em
ambos os pH determinados e nos diferentes tempos (Figura 17-B). Porém, no pH mais
ácido a viabilidade foi diminuída no tempo 12h (Figura 18-B).
Na combinação da temperatura 28°C com os dois pHs escolhidos observou-se
que a associação 28°C com o pH7.7 alterou significativamente o número total de
celomócitos apenas no tempo 1h, sendo igual ao controle nos outros tempos e com
redução da viabilidade das células no tempo 12h (Figuras 17-C e 18-C. Já com o pH
mais baixo (7.3) é observado aumento significativo, no tempo 1h seguido de redução
nos tempo 12h e 24h mas no tempo 48h volta a aumentar, mas sem alteração da
viabilidade das células ao longo do experimento (Figuras 17-C e 18-C ). Entretanto, na
combinação da temperatura 30°C com os dois pHs observou-se aumento do número
de celomócitos na associação com o pH7.3 a partir do tempo 3h, com aumento de 6
vezes no tempo 24h, sem alteração na viabilidade (Figuras 17-D e 18-D ) A soma com
o pH 7.7 mostrou também um aumento após o tempo 1h até o tempo 12h e depois
ocorrendo uma diminuição a números similares ao do controle nos tempos 24h e 48h
(Figuras 17-D e 18-D ).
54
A B
C D
Figura 17 - Contagem do número total de celomócitos (CTC) presentes no líquido celomático durante os
diferentes tempos e estresses. Linha de base com o valor no controle aclimatizado. (A)Comparação entre as
temperaturas 28° e 30°C. (B) Comparação entre os pHs 7.3 e 7.7. (C) Comparação entre a combinação da
temperatura 28°C e os pHs 7.3 e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura 28°C e os pHs 7.3
e 7.7.
55
A B
C D
Figura 18 - Viabilidade dos celomócitos (CTC) presentes no líquido celomático durante os diferentes tempos
e estresses. Valores expressos em porcentagem. (A)Comparação entre as temperaturas 28° e 30°C. (B)
Comparação entre os pHs 7.3 e 7.7. (C) Comparação entre a combinação da temperatura 28°C e os pHs 7.3
e 7.7. (D) Comparação entre a combinação da temperatura 28°C e os pHs 7.3 e 7.7.
Caracterização dos Celomócitos de Echinaster brasiliensis
Foram observados três tipos celulares: fagócitos, células progenitoras e
esferulócitos. As células progenitoras (Fig. 19 - A e B) (3% da população total)
possuem formato variando de oval a esférico (13,32 ± 1,66 μm), citoplasma reduzido e
hialino, com poucas e esparsas inclusões com afinidade para o Azul de Toluidina mas
não para o Tricomo de Mallory ou Hematoxilina e Eosina. O núcleo (4,68 ± 1,63 μm) é,
geralmente , esférico e central. Os fagócitos (Fig. 19 – C e D) foram o tipo celular
encontrado em maior número no fluido celômico (93% da população total), possuem
56
formato irregular (13,62 ± 1,06 μm) e muitos pseudópodes. O citoplasma é hialino e
acidófilo, contendo muitas inclusões. O núcleo é esférico (4,23 ± 0,22 μm) e acidófilo.
Os esferulócitos (Fig. 19 – E e F) (4% da população total) tem o formato oval
(11,52 ± 3,69 μm) e citoplasma completamente preenchido por esférulas com
afinidade para o Azul de Toluidina e para o Azul de Metila do Tricomo de Mallory,
sendo que, a mesma célula pode ter afinidade também para a Fucsina Ácida do
mesmo corante. O núcleo (4,72 ± 0,5 μm) é, às vezes, encoberto pelo grande número
de esférulas.
Figura 19 – Celomócitos observados no fluido celomático de E. brasiliensis. A,C e E coradas com
Hematoxilina e Eosina. B, D e F coradas com Azul de toluidina. (A,B) Células progenitora. (C,D) Fagócitos;
(E,F) Esferulócitos. Escala:5µm.
57
Discussão
Nossos resultados mostraram que o aquecimento e acidificação da água, bem
como as diferentes combinações dos mesmos, desencadeiam respostas distintas nas
gônadas e celomócitos de E. brasiliensis. Nos celomócitos houve expressão mais
marcante das proteínas de estresse do que nas gônadas, uma diferença
possivelmente relacionada com as diferentes funções fisiológicas dos dois tecidos. A
situação considerada a mais extrema (30°C e pH7.3) provocou mortalidade após 24h
de exposição. E a segunda combinação mais grave (30°C e pH7.7) desencadeou o
aparecimento de ulcerações de pele após 48 horas de exposição ao estresse.
Sintomas semelhantes têm sido relacionados a uma doença que acomete diferentes
espécies de equinodermos em situações de estresse relacionadas às mudanças
climáticas (Bates et al., 2009; Becker et al., 2004; Tajima et al., 2007)
O estudo das respostas fisiológicas a fatores de estresse é importante para
elucidar o desenvolvimento da tolerância a alterações ambientais, bem como para
prever possíveis impactos das mudanças ambientais nas populações e comunidades
(Maltby, 1999). Os organismos respondem às mudanças no seu habitat através de
uma série de adaptações fisiológicas. É esta capacidade de resistir a mudanças,
crônicas ou agudas, de uma série de parâmetros que vai determinar a sobrevivência,
fitness e distribuição da espécie (Gourgou et al., 2010).
Biomarcadores têm sido extensivamente utilizados no monitoramento ambiental
a fim de mostrar evidências de que os organismos foram expostos e/ou afetados por
mudanças no ambiente. Geralmente, são usados como parâmetros às mudanças
bioquímicas, histológicas, morfológicas ou medidas fisiológicas, como taxas
metabólicas (Pinsino et al., 2008). Porém, dados a nível molecular, como alterações
nos ácidos nucléicos e proteínas estão sendo cada vez mais utilizados para
suplementar as informações adquiridas pelos biomarcadores mais tradicionais. Por
58
isso, proteínas que tem a sua regulação afetada por estresse têm sido cada vez mais
exploradas como potenciais ferramentas para avaliações ambientais. Considera-se
que o aumento dos níveis destas proteínas biomarcadoras é um efeito negativo
(Hernroth et al., 2012). Assim, seu acúmulo pode ser útil na identificação de tecidos
que são mais vulneráveis a danos ocasionados por um componente deletério
específico (Sanders et al., 1994).
As evidências científicas de que o aquecimento do sistema climático é real são
irrefutáveis, segundo o IPCC 2014. E o aquecimento e mudanças químicas nos
oceanos relacionadas ao aumento das emissões de dióxido de carbono de origem
antropogênica terão profundas consequências para uma ampla gama de espécies
(Godbold e Solan, 2013)
Efeitos da manutenção em laboratório
Ajustes da fisiologia de um organismo, entre eles a quantidade de proteínas
biomarcadoras também podem ocorrer devido à aclimatização ou aquisição de
tolerância, como decorrência da adaptação às mudanças no ambiente. Esta
variabilidade deve, portanto ser cuidadosamente considerada quando comparados
organismos de diferentes localidades, recém-coletados ou após períodos em
laboratório (Lewis et al., 1999).
Nos celomócitos de E. brasiliensis o período de aclimatização em laboratório (5
dias) reduziu a quantidade de p38-MAPK e HSP70 em comparação com amostras
coletadas no campo. Por outro lado, não foram observadas alterações do AIF-1 nem
no número total dos celomócitos. Esta redução ou não alteração de algumas proteínas
nos celomócitos das estrelas aclimatizadas pode estar associada à estabilidade do
ambiente ex situ, sem as alterações e desafios encontrados no ambiente natural.
Coteur et al. (2004) observaram que a estrela Asterias rubens também não
apresentava diferenças na produção de espécies reativas de oxigênio nem na
concentração de celomócitos após manuseio e manutenção em laboratório. Estes
59
resultados, entretanto não servem como regra geral. Por exemplo, Clow et al.(2000)
verificaram que ouriços da espécie Strongylocentrotus purpuratus demandavam vários
meses para estabilizar respostas moleculares relativas a expressão do componente
central do sistema complemento (C3). Nas gônadas de E. brasiliensis detectamos um
aumento da HSP70 e do AIF-1 e a manutenção dos níveis da p38-MAPK. Sendo
assim, as respostas à aclimatização e ao manuseio podem ser bastante variadas não
só entre espécies, mas também nos tecidos de um mesmo indivíduo, e devem ser
consideradas com cautela (Brun et al., 2008).
Efeitos do Aquecimento
Os organismos que vivem na região entre-marés, especialmente, lidam
periodicamente com perturbações na temperatura, dessecação, salinidade e
humidade. A temperatura é um dos principais fatores determinantes da distribuição
latitudinal e vertical, abundância e fitness (Helmuth e Hofmann, 2001). Sendo assim,
animais ectotérmicos, como os equinodermos, precisam de estratégias
compensatórias para garantir sua homeostase enquanto enfrentam mudanças neste
parâmetro.
A temperatura tem efeitos diretos em todos os processos biológicos dos
ectotermos e por isso é um fator ambiental muito importante (Pörtner, 2005). Nesse
grupo, seus níveis influenciam todos os processos fisiológicos, desde a conformação
de proteínas, fluidez da membrana, até o funcionamento de órgãos e o
comportamento (Harley et al., 2006; Pörtner et al., 2015). Existem muitos organismos
que normalmente já vivem sob variações da temperatura e próximo da sua tolerância
máxima (Harley et al., 2006; Pörtner, 2008) ou estão sujeitos a variações sazonais.
Para outros, em particular aqueles de ambientes mais estáveis, o aumento da
temperatura pode afetar negativamente a sobrevivência. Assim como outros fatores,
os efeitos do aquecimento dos oceanos variam entre espécies e estágio ontogenético,
bem como pelo tempo de exposição.
60
A HSP70 é o biomarcador mais conhecido quando se trata de estresse térmico,
no entanto também responde a uma série de outros fatores (Mayer e Bukau, 2005;
Pyza et al., 1997). Nossos resultados mostraram que apenas os celomócitos
respondem ao estresse térmico através da regulação da HSP70. No grupo com a
temperatura da água a 28°C a quantidade do marcador foi dobrada nos celomócitos
logo após uma hora do inicio do experimento. Já no grupo com a temperatura da água
a 30°C o efeito não foi tão agudo, mas lento e gradativo, sendo expressivo apenas 24h
depois do início do experimento. Aparentemente, o organismo levou mais tempo para
responder ao estresse mais severo. Este resultado é o oposto do verificado em outros
trabalhos. Por exemplo, Dong et al. (2008) observaram que aumentos de 2º e 4°C na
temperatura não alteraram a expressão destas proteínas em holotúrias, enquanto que
um aumento de 6°C elevou os níveis de HSP70 indicando alto grau de dano protéico.
Celomócitos de ouriços do mar também hiper-regulam a HSP70 após estresse térmico
severo (35°C) de forma rápida, após 1h (Matranga et al., 2000). Mas, um estudo
realizado com a exposição de moluscos (quitons) ao aumento da temperatura não
detectou uma influência direta com a expressão de HSP70, sendo que nas
temperaturas mais altas foram observados os menores níveis de HSP70 (Schill et al.,
2008). Estresses moderados ou severos desencadeiam respostas diferentes, como
também no caso de dinoflagelados associados a corais. Quando expostos ao
aquecimento moderado da água hiper-regularam a HSP70, enquanto que as
temperaturas maiores reduziram a expressão de HSP70 em 60% após 18 horas
(Rosic et al., 2011).
A hipertermia, em especial, tem sido mostrada como a principal estimuladora da
fosforilação e ativação de diversas proteínas quinases (Gourgou et al., 2010; Kyriakis
e Avruch, 1996). Não há relatos na literatura sobre a expressão da p38-MAPK em
resposta ao aquecimento da água em equinodermos adultos. No entanto, nossos
resultados mostraram que o aumento da temperatura para 28°C desencadeou uma
hiper-regulação rápida (entre 1 e 3h) da p38-MAPK tanto nas gônadas como nos
61
celomócitos de E. brasiliensis, nos quais foi mais expressivo. Corroborando com os
dados de outros filos como Molusca e Nematoda (Gourgou et al., 2010; Troemel et al.,
2006).
A regulação da AIF-1 não tem sido estudada em resposta a fatores de mudanças
climáticas, mas principalmente a presença de patógenos como bactérias (Li et al.,
2013; Ovando et al., 2012). Nossos resultados mostraram que quando a temperatura
foi aumentada, a expressão de AIF-1 nas gônadas e nos celomócitos foi alterada. A
28°C houve aumento dos seus níveis tanto nas gônadas como nos celomócitos entre 3
e 12h horas de estresse. E na temperatura de 30°C houve aumento nas gônadas,
semelhante ao observado a 28°C, e redução nos celomócitos. A alteração dos seus
níveis somente entre 3 e 12h pode estar relacionada à diminuição da resposta imune,
com uma consequente invasão de patógenos. Já foi demonstrado que o AIF-1 em
equinodermos age como fator de proliferação celular em organismos expostos a
bactérias (Ovando et al., 2012). Embora sua expressão não seja ligada diretamente
ao estresse térmico, pode ser um bom indicador do estado fisiológico geral do
organismo, via o funcionamento do seu sistema imune.
Em E. brasiliensis observamos que o aumento da temperatura da água aumenta
o número total de celomócitos já na primeira hora após o início do experimento. Com a
temperatura a 28°C esse número é duplicado enquanto que a 30°C é triplicado. Nos
tempos seguintes esses números diminuem, sendo mais baixo que o controle na
temperatura a 28°C e permanecendo altos a 30°C, mas com a viabilidade reduzida
após 12h. Isto é diferente do que ocorreu com Asterias rubens na qual as mudanças
na temperatura não alteraram o número total de celomócitos (Holm et al., 2008a).
Assim como a vasta lista de trabalhos que avaliaram a resposta ao aumento da
temperatura, E. brasiliensis é sensibilizada por este estresse, mas sem efeitos letais a
curto prazo. Além disso, observamos que o aumento mais severo da temperatura
talvez seja tão intenso que os organismos demoram a gerar uma resposta detectável.
62
Efeitos da acidificação
Uma diminuição de 0.4 unidades de pH é prevista na superfície marinha nos
próximos 85 anos. Embora pareça pequena, é uma mudança considerada rápida e
grave, e que desencadeará consequências amplamente difundidas para diversas
espécies e ecossistemas (Caldeira e Wickett, 2003; Dupont et al., 2010; IPCC, 2014;
Society, 2005). A calcificação é um dos primeiros alvos de estudos quando se fala de
acidificação da água. No entanto, outros fatores fisiológicos dos organismos podem
ser comprometidos por essa mudança, como o balanço ácido-base, metabolismo,
fitness e desenvolvimento (Pörtner, 2005).
Equinodermos são organismos com esqueleto calcário e que possuem um
sistema hidrovascular e celoma preenchido por água do mar. Alterações no pH da
água podem afetar diretamente suas células circulantes, órgãos internos, bem como a
calcificação do seu esqueleto. Por isso, entender os mecanismos de transdução de
sinais responsáveis por perceber e se ajustar a estímulos estressantes é de grande
importância.
Em E. brasiliensis a acidificação da água não alterou de forma marcante a
quantidade nem a viabilidade dos celomócitos. No entanto, outros trabalhos já
mostraram que a quantidade de celomócitos varia de acordo com a espécie ou com o
tipo de estresse. Por exemplo, a acidificação da água ocasionou aumento no número
de celomócitos em ouriços e estrelas do mar polares, diferentemente do que ocorreu
com a tropical A. rubens, que teve uma redução de 50% (Dupont e Thorndyke, 2006;
Hernroth et al., 2011).
O uso de biomarcadores moleculares para avaliar efeitos das mudanças
climáticas ainda é pouco empregado em estresses como a mudança do pH da água.
No entanto podem ser ferramentas que trazem respostas rápidas sobre o estado
fisiológico dos organismos. No nosso modelo, observamos que a expressão da p38-
MAPK não foi modificada nas gônadas, mas houve hiper-regulação nos celomócitos,
principalmente no pH mais ácido (7.3). A relação da regulação da p38-MAPK com a
63
acidificação da água ainda tem sido pouco avaliada. Hernroth et al. 2011 observaram
que a expressão desta quinase nos celomócitos de Asterias rubens, exposta ao pH7.7,
não foi alterada depois de uma semana, mas foi reduzida após exposição a longo
prazo (6 meses). Em larvas de ouriços submetidos a acidificação da água (pH7.8) foi
observada redução do marcador (Todgham e Hofmann, 2009). Esta variabilidade pode
ser comum mesmo em grupos bastante diversos. Já foi verificado que peixes marinhos
hiper-regulam HSP70 e p38-MAPK quando expostos ao aquecimento e acidificação da
água (Feidantsis et al., 2014).
A expressão da HSP70 nos celomócitos em resposta a acidificação da água teve
hiper-regulação apenas no pH 7.7. No pH mais ácido houve diminuição da expressão
entre 12 e 24 horas, sendo associada a redução do número de células e viabilidade
nos mesmos tempos. Nas gônadas houve uma rápida e baixa hiper-regulação apenas
no pH 7.3 com redução após 24 horas. Alguns trabalhos sugerem que a hiper-
regulação da HSP70 tem alto custo para estrelas do mar e que a acidificação diminui
ou inibe os processos de transcrição e tradução, pela perda de enzimas importantes
(Hernroth et al., 2011; Langenbuch et al., 2006; Todgham e Hofmann, 2009). Existem
dados, com outras espécies e filos, que observaram a redução ou não regulação da
HSP70 frente a este tipo de estresse. Por exemplo, larvas de ouriços e bivalves
tiveram uma redução da HSP70 após acidificação da água (Cummings et al., 2011;
Hofmann e Todgham, 2010). Em crustáceos gamarídeos não houve efeito da
acidificação da água na regulação deste marcador (Hauton et al., 2009). Em contraste,
estrelas-do-mar Asterias rubens expostas a acidificação da água (pH7.7) tiveram
níveis de HSP70 aumentados, nos celomócitos somente após uma semana (Hernroth
et al., 2011).
Quanto à expressão de AIF-1, não há relatos na literatura a respeito da sua
regulação como uma resposta direta ao estresse de acidificação. Portanto, os dados
obtidos com E. brasiliensis são novos para este marcador. Observamos que o padrão
de AIF-1 é alterado pelos dois pHs nas gônadas, enquanto que apenas o pH mais
64
ácido gera alteração da expressão nos celomócitos, e que em ambos os alvos as
respostas são geradas rapidamente a partir do tempo 1h. Possivelmente este aumento
da AIF-1 nos celomócitos pode estar associadas a mecanismos de proliferação celular
mediados por esta proteína (Li et al., 2013).
Frente à acidificação há uma variabilidade de respostas de acordo com a
espécie (Clark e Peck, 2009) e estágio do ciclo de vida (Byrne e Przeslawski, 2013).
Juvenis parecem ser mais vulneráveis a este fator do que os adultos, nos quais
apenas efeitos subletais foram observados (Dupont et al., 2010). A maioria dos
trabalhos que investigam as mudanças dos equinodermos em reposta à acidificação
da água avalia fatores como fertilização (Byrne et al., 2009), desenvolvimento larval
(Dupont et al., 2010), índice de mortalidade de juvenis (Shirayama e Thornton, 2005),
metabolismo, crescimento e calcificação em adultos (Wood et al., 2008). Poucos
trabalhos levam em consideração as mudanças e sinalizações celulares.
Considerando o cenário realístico do decréscimo do pH no futuro, nosso trabalho
concorda com outros estudos que concluem que os equinodermos aparentam ser um
grupo robusto na tolerância a este estresse (Dupont et al., 2010). Não observamos
mortalidade com a alteração no pH e manutenção da temperatura controle. No
entanto, de forma geral, as repostas à acidificação são moduladas por diferentes
parâmetros como tempo de exposição, pH testado, estágio de vida, tecido e espécie.
Tem sido mostrado que os adultos parecem ser mais resistentes, porém efeitos
indiretos têm surgido em experimentos a longo prazo, embora nossos resultados já
mostrem mudanças em curto intervalo de tempo. Kurihara (2008) cita em seu trabalho
que ouriços do mar que não mostraram alterações em resposta a acidificação a curto
prazo tiveram um decréscimo da taxa de reprodução, atraso do desenvolvimento
gonadal e diminuição do período de desova após 10 meses de exposição ao pH 7.8.
Apesar de não apresentar efeitos diretos na sobrevivência, exposições a longo prazo
podem afetar a abundância e sobrevivência das espécies.
65
Efeitos combinados da acidificação e hipertermia
A maior parte dos estudos a respeito dos efeitos das mudanças climáticas nos
oceanos tem extensivamente estudado o aumento da absorção de CO2 ou da
temperatura como estressores únicos, separados. Mas esta abordagem vem mudando
nos últimos anos (Feidantsis et al., 2014; Folt et al., 1999; Pörtner, 2005). Estudos que
considerem os efeitos interativos destes dois processos podem ser mais
esclarecedores para entender o cenário futuro, uma vez que no ambiente natural os
organismos estão sujeitos a múltiplos estressores. Efeitos acumulativos podem
diminuir (antagonismo), aumentar (sinergismo) ou compensar as respostas geradas
pelo organismo (Folt et al., 1999). Por exemplo, o aumento da temperatura e
diminuição do pH tem resultados antagônicos nas taxas de crescimento de ouriços do
mar, onde a temperatura reduz os efeitos negativos causados pelo pH (Byrne et al.,
2011). Por outro lado, na estrela-do-mar Pisaster ochraceus os dois parâmetros
possuem efeitos positivos quando juntos, aumentando a taxa de crescimento (Gooding
et al., 2009).
Em E. brasiliensis a combinação do pH7.3 e temperatura 30°C, considerada a
situação mais extrema, desencadeou o aumento de aproximadamente seis vezes no
número de celomócitos, depois de 12 horas. Nestes, foram observadas a redução da
expressão da HSP70 e hiper-regulação da p38-MAPK e AIF-1 entre 3 e 12 horas.
Estes resultados podem indicar um enfraquecimento do sistema imune, o que
favoreceria a proliferação de patógenos que desencadearam o aparecimento de
ulcerações na pele após 12 horas e a morte dos organismos entre 24 e 48 horas. Nas
gônadas os níveis de HSP70 e p38-MAPK foram aumentados e AIF-1 não foi alterado.
Estas ulcerações na pele são sintomas de uma doença que tem sido observada
em equinodermos desde 1978, após uma onda de calor na costa da Califórnia. Em
1982 a passagem do El-niño provocou o declínio de várias populações de
equinodermos, que continua sendo observada (Eckert et al., 1999; Jangoux, 1987). O
primeiro sinal da doença são pontos brancos no tegumento dos indivíduos, que
66
evoluem para lesões na epiderme, derme e esqueleto e se estendem rapidamente,
levando à morte (Becker et al., 2004; Eckert et al., 1999). O aquecimento global tem
sido considerado um fator desencadeador de doenças, já que as taxas de crescimento
de patógenos são aumentadas em altas temperaturas e os hospedeiros são
sensibilizados, se tornando mais susceptíveis a doenças (Harvell et al., 2002). Casos
de ulceração, ou doenças relacionadas, têm ocorrido mundialmente e em diferentes
espécies. Já foram relatados nas holotúrias Apostichopus japonicus (China),
Isostichopus fuscus (Equador) e Holothuria cabra (Austrália), na estrela do mar
Pisaster ochraceus (Canadá) e no ouriço do mar Strongylocentrotus plupuratus
(California) (Bates et al., 2009; Becker et al., 2004, 2010; Deng et al., 2009). No nosso
laboratório, estas ulcerações de pele já haviam sido observadas anteriormente em
estrelas e pepinos do mar mantidos em aquários sem um controle rígido dos
parâmetros da água. Sabe-se que é provocada por bactérias, e que pequenos
aumentos da temperatura têm contribuído para o aparecimento esta doença (Bates et
al., 2009; Becker et al., 2010).
Em E. brasiliensis, apenas o aumento da temperatura não desencadeou o
aparecimento da enfermidade, mas a acidificação da água associada com a
temperatura maior levou ao desenvolvimento dos sintomas relacionados. É possível
que apenas o aquecimento não leve ao desenvolvimento dos sinais visíveis da
doença. No entanto, o aquecimento em conjunto com o meio mais ácido e os
consequentes problemas na calcificação leve a formação das ulcerações.
Nossos resultados também mostraram que a combinação da acidificação e do
aquecimento da água desencadeou efeitos diferentes de acordo com o tecido, o
biomarcador e o pH/temperatura utilizados. Nas gônadas houve hiper-regulação da
pp38-MAPK e HSP70, mostrando um efeito sinérgico dos dois parâmetros, Mas não
alterou AIF-1, diferentemente de quando os fatores eram alterados isoladamente,
mostrando efeito compensatório do pH e da temperatura da água. Nos celomócitos a
expressão das proteínas não foi diferente (pp38-MAPK) ou diminuiu (HSP70 e AIF-1)
67
em comparação com os fatores alterados individualmente, neste caso a acidificação
parece diminuir o efeito da temperatura atuando sozinha. Em larvas do ouriço do mar
Strongylocentrotus franciscanus observou-se que a redução do pH quando somada ao
aumento da temperatura não altera a expressão da HSP70 em relação a somente a
acidificação (O’Donnell et al., 2008). Este mesmo trabalho sugere que níveis elevados
de CO2 tamponam as proteínas, protegendo-as de danos térmicos, atrasando a
necessidade de uma resposta de choque térmico. Alternativamente, a falta da
expressão da HSP70 pode estar relacionada com a redução do metabolismo durante o
estresse. Como mostrado por (Metzger et al., 2007), a acidificação da água em
conjunto com o estresse térmico reduz a capacidade metabólica e aumenta a
mortalidade de caranguejos. Porém, mais recentemente observou-se que em bivalves,
Mytilus coruscus, a soma dos dois estresses hiper-regula a HSP70 (Liu et al., 2014).
Biomarcadores x Mudanças Climáticas
P38-MAPK
As cascatas de MAPKS estão entre as mais extensivamente estudadas entre as
vias de transdução de sinais. Participam de uma série de programas celulares como,
diferenciação, movimento, divisão e morte celular, sendo em geral hiper-reguladas
quando as células são expostas a uma variedade de estímulos (Schaeffer e Weber,
1999). Além de estarem associadas às respostas celulares a diferentes estresses, as
p38-MAPKs também podem estar envolvidas em mecanismos anti ou pró-apoptóticos,
dependendo da isoforma ou tipo celular (Châtel et al., 2010; Roux e Blenis, 2004). A
redução da capacidade fagocítica dos celomócitos está associada à falta de ativação
da p38-MAPK (Hernroth et al., 2011). A regulação da p38-MAPK tem sido estudada,
principalmente, em resposta às flutuações ambientais (e.g. salinidade, hipóxia/anóxia,
temperatura e poluição por metais pesados) e a estímulos externos físicos ou
68
químicos (e.g. estresse oxidativo, radiação UV, citocinas e LPS) (Gaitanaki et al.,
2004; Gourgou et al., 2010; Kefaloyianni et al., 2005; Kyriakis e Avruch, 1996; Larade
e Storey, 2006).
Entre os invertebrados marinhos, a maioria dos trabalhos que relacionam a
regulação da p38-MAPK à resposta a estímulos de mudanças ambientais foram
realizados em bivalves da espécie Mytillus galloprovincialis. Seus resultados mostram
que a regulação da p38-MAPK é aumentada de forma rápida após períodos de anóxia
e baixa salinidade (Gaitanaki et al., 2004), ao aumento da temperatura e exposição a
metais pesados (Gourgou et al., 2010; Kefaloyianni et al., 2005), a presença de
poluentes como diesel e TBT na água (Châtel et al., 2010) e a exposição a patógenos
(Canesi et al., 2002).
Em E. brasiliensis, as diferentes respostas dadas pelas gônadas e celomócitos
indicam uma ativação diferenciada da p38-MAPK de acordo com o tecido, com o
estímulo ou com o período de exposição. A expressão da p38-MAPK foi maior nos
celomócitos do que nas gônadas. Possivelmente, essa diferença pode ser relacionada
às funções de cada tecido. Como os celomócitos desempenham variados papéis
relacionados à manutenção da homeostase, a energia seja alocada para
sobrevivência do organismo, e não para reprodução.
HSP70
As respostas dos organismos ao estresse podem ser realizadas de diferentes
formas como comportamentais, químicas entre outras. Na sua maioria, estas
respostas são espécie-específicas. Entretanto, uma via considerada universal é a
produção de proteínas de estresse, das quais as HSP são consideradas o maior grupo
(Gross, 2004). O aumento da produção de HSP70 tem um papel de proteção e,
dependendo do problema, pode ser suficiente para manter a homeostase e
metabolismo em taxas normais (Kregel, 2002).
69
Apesar da maioria dos estudos mostrarem que o aumento da expressão de
HSP70 está positivamente relacionada a ambientes estressantes, é importante levar
em conta o nicho do organismo em questão. No ambiente marinho há habitats
diversos, que proporcionam diferentes níveis de estresse ou que se modificam com
frequência (Feder e Hofmann, 1999; Patruno et al., 2001). Por exemplo, em peixes
marinhos a expressão de HSP varia sazonalmente (Feidantsis et al., 2013). Já
populações de estrelas que vivem em ambientes de infralitoral ou entre-marés
normalmente não mostram diferenças nos níveis padrões de HSP entre as duas
populações. No entanto, quando a população do infralitoral é submetida a um
estresse, como amputação, a expressão de HSP é maior e por mais tempo do que na
população bêntica (Pinsino et al., 2007). Por outro lado, crinóides e ofiuróides
coletados em diferentes localidades, mas que ocupam ambientes igualmente estáveis,
não mostram diferenças na regulação deste componente (Patruno et al., 2001).
Em Echinaster brasiliensis, a HSP70 foi hiper-regulada em resposta à
temperatura 28ºC apenas nos celomócitos. Trata-se de uma estrela típica de
infralitoral, porém na região coletada a população está submetida a variações de
temperatura sazonais e a influência de diferentes correntes de água fria, por isso a
sensibilidade delas às temperaturas mais altas. Possivelmente o aumento de 6°C na
temperatura tenha sido tão alto que os organismos levaram mais tempo para produzir
uma resposta.
AIF-1
Os níveis de citocinas como a AIF-1 têm sido bastante estudado em vertebrados
tendo em vista seu papel fundamental na comunicação entre o sistema imune
adaptativo e o inato em mamíferos (Roberts et al., 2008; Zhang et al., 2013). Nos
invertebrados, sem sistema adaptativo, estas proteínas têm sido associadas à
ativação de fagócitos em resposta a infecções. Sendo assim, a maioria dos estudos
está associada a respostas dos organismos à presença de patógenos, principalmente
70
bactérias. Recentemente, Gonzalez-Aravena et al.(2015), clonaram AIF-1 de
celomócitos de ouriços do mar antárticos, e descobriram que a exposição ao LPS
acarreta aumento da sua expressão após 24h de contato, também associado ao
aumento do número de celomócitos. Em holotúrias, mexilhões e ostras foi detectado o
aumento desta citocina nos celomócitos após a exposição a bactérias (Li et al., 2013).
As vias do AIF-1 não estão diretamente vinculadas a fatores como as mudanças
climáticas do ambiente. No entanto, a avaliação da sua expressão pode nos trazer
informações sobre se as mudanças no ambiente estão afetando o sistema imune do
organismo, deixando-o susceptível a patógenos e consequentemente ativando vias
como a da AIF-1. Como foi possível observar, neste trabalho, com o aumento da sua
expressão nas estrelas acometidas pela ulceração de pele.
Ovando et al. (2012) avaliaram o papel da AIF-1 na resposta imune do ouriço do
mar através do aumento da expressão nos celomócitos após a exposição a bactérias.
Foi observado um aumento no número total de celomócitos, associado com a remoção
dos micro-organismos do fluido celômico por fagocitose. Este aumento dos
celomócitos foi observado entre 24 e 48h, onde a expressão da AIF-1 retorna a níveis
basais. Esta diferente variação temporal entre o número de celomócitos e o AIF-1
pode ser resultado da participação da citocina na resposta imune inicial, rápida, antes
de 24h.
Nas E. brasiliensis mantidas a 28°C, em 12h há diminuição dos celomócitos e
aumento da AIF-1. Na temperatura maior, 30°C, no mesmo período ocorre um
aumento no número de celomócitos e a diminuição do AIF-1. Este aumento da AIF-1
concomitante com a redução do número de celomócitos pode estar relacionado com a
necessidade de produzir novas células. O AIF-1 induz a expressão de mediadores da
resposta inflamatória, promovendo a proliferação e migração celular em resposta a
estímulos estressores (Utans et al., 1995; Zhao et al., 2013) e estimulando a atividade
fagocítica (Zhang et al., 2013).
71
Celomócitos
Em equinodermos, os celomócitos participam de funções variadas, algumas
das quais similares às células sanguíneas, consideradas seus homólogos em
vertebrados (Muñoz-Chápuli et al., 2005). Entre as várias já descritas para
equinodermos estão a coagulação, excreção, digestão, transporte e estocagem de
nutrientes, encapsulamento, secreção de substâncias, transporte de oxigênio, além da
síntese e deposição de fibras de colágeno e da matriz extracelular (Endean, 1958;
Tahseen, 2009). Também podem ter um papel importante na resposta imune humoral
e celular, participando da fagocitose (Shimada et al., 2005) encapsulamento,
citotoxicidade e produção de agentes antimicrobianos (Gross et al., 1999; Smith,
1999). Já foi observado que a quantidade e os tipos de celomócitos podem variar
durante infecções, injúrias ou mudanças no ambiente (Matranga et al. 2000; Pinsino et
al. 2007; Holm et al. 2008).
Em E. brasiliensis foram identificados três tipos celulares circulantes no liquido
celomático, sendo os fagócitos os mais abundantes. Diferentes papéis têm sido
atribuídos a estas células: transporte de nutrientes (Smiley, 1994), coagulação do
fluído celomático, rejeição de enxertos (Canicattì et al., 1989; Smith, 1999),
encapsulamento de partículas estranhas e micro-organismos e formação dos corpos
marrons (Xing et al., 2008) e ainda a remoção de restos celulares (Glinski e Jarosz,
2000). A não observação de grandes quantidades de células inviáveis após os
estresses, mesmo com a redução do número de celomócitos total, pode estar
relacionada com a remoção destas pelos fagócitos.
A quantidade de celomócitos varia de acordo com a espécie ou com o tipo de
estresse. Por exemplo, a acidificação da água ocasionou aumento no número de
celomócitos em ouriços e estrelas do mar polares, diferentemente do que ocorreu com
A. rubens, que teve uma redução de 50% (Dupont e Thorndyke, 2012; Hernroth et al.,
2011). Já esta mesma estrela do mar submetida a situações de hipóxia, à presença de
parasitas ou injúria teve o número total de celomócitos aumentado (Pinsino et al. 2007;
72
Holm et al. 2008). Por outro lado, as mudanças na temperatura não alteraram o
número total de celomócitos nesta espécie (Holm et al. 2008). Em E. brasiliensis o
aumento do número de células ocorreu principalmente em resposta ao aumento da
temperatura e da sua combinação com a acidificação.
Considerações finais
Segundo (Byrne e Przeslawski, 2013) algumas espécies são mais resilientes que
outras e podem ter sucesso frente às mudanças climáticas. Nossos resultados
mostram que E. brasiliensis, apesar de sensibilizada, resiste às mudanças do
ambiente em laboratório. No entanto, na natureza há influência de outros inúmeros
fatores, como disponibilidade de alimento, oxigênio, salinidade e predação, e talvez a
longo prazo essa resistência pode não ser a mesma. Além disso, o oceano irá mudar
gradualmente durante as próximas décadas, diferentemente do que é realizado em
laboratório em estudos de “choques futuros”. Algumas espécies poderão ser aptas a
tolerar as mudanças previstas para o oceano através da aclimatação ou adaptação.
Mas, ainda assim, estudos que mostrem os possíveis efeitos das mudanças climáticas
na comunidade marinha servem como exemplo para a população de que a aceleração
e modificação dos ciclos da natureza podem trazer graves consequências.
73
Conclusões
• E. brasiliensis é sensibilizada pelas mudanças ambientais do pH e temperatura.
• O tempo de aclimatização em laboratório diminuiu ou não alterou a expressão das
proteínas de estresse.
• O cenário considerado o mais estressante (pH7.3/30°C) ocasionou óbito dos
organismos após 24 horas de exposição.
• O cenário pH7.7+30°C desencadeou o surgimento da doença ulceração de pele.
• A expressão das proteínas biomarcadoras de estresse varia entre gônadas e
celomócitos, tempo e grupo experimental.
• E. brasiliensis responde mais rapidamente aos estresses moderados (28°C, pH7.7)
• Os efeitos dos estresses ambientais em E. brasiliensis são mais pronunciados nos
celomócitos, e a variação da expressão das proteínas esta associada com a dinâmica
do número de células e viabilidade.
• Os celomócitos são bons indicadores para avaliar as alterações fisiológicas
desencadeadas pelas mudanças climáticas.
• As gônadas de E. brasiliensis não são sensíveis ao estresse térmico, não alterando
a expressão de HSP70 e p38-MAPK.
• O aumento da temperatura desencadeia o aumento do número total de
celomócitos, mas a acidificação da água não altera o número total de células.
• A combinação da alteração do pH e temperatura desencadeou aumento do número
de celomócitos em todos os grupos.
• Apenas o aumento da temperatura para 30°C ou diminuição do pH para 7.3
reduziram a viabilidade dos celomócitos
• O pH diminui os efeitos da temperatura na expressão de proteínas nos celomócitos.
74
• Como cada proteína de estresse responde a variados e diferentes estímulos, a
utilização de mais de um biomarcador é interessante para confirmar as alterações que
ocorrem nos organismos.
75
Referências
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