11

1 INTRODUÇÃO

A malária é uma doença parasitária que causou inúmeros danos a milhões

de pessoas nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Os impactos sociais,

econômicos e políticos desta doença sobre a humanidade foram enormes, durante

vários séculos. O subdesenvolvimento é uma constante nas áreas endêmicas, uma

vez que a população doente fica com sua capacidade de trabalho sensivelmente

diminuída. Esse impacto vem desde épocas remotas, haja vista que Hipócrates,

em 314-37 a.C. já descrevia e caracterizava a malária clinicamente. A descoberta

do agente etiológico se deu em 1880, por Charles Alphonse Laveran. O

conhecimento do mecanismo de transmissão através de um vetor ocorreu muitos

anos depois, pois acreditava-se que a malária era contraída através do ar

contaminado (mal-aria). Em 1897, Ronald Ross descobriu oocistos no estômago de

mosquitos que haviam se alimentado de sangue contaminado com malária. No ano

seguinte, na Índia, Ross conseguiu transmitir a malária aviária, passando o

plasmódio de ave a ave através de um vetor, um mosquito do gênero Culex

Linnaeus, 1758. Esses estudos permitiram que Grassi, Bastianelli e Bignami

concluíssem suas pesquisas sobre malária, descobrindo em 1899, que a

transmissão da malária humana ocorre através da picada de mosquitos do gênero

Anopheles Meigen, 1818 (NEVES, 2004).

1.1. MALÁRIA NO MUNDO E NO BRASIL

No mundo, há pelo menos 107 países e territórios endêmicos de malária. O

maior foco de transmissão é na África Sub-Sahariana onde ocorrem 90% dos

casos do planeta. A malária é endêmica em 53 países da África, sendo que oito

deles situam-se ao sul do continente. Nas Américas, a enfermidade é endêmica em

12

21 países, já na Europa em 04 e na região leste do Mediterrâneo aparece em 14, e

ainda no sudeste Asiático. Estima-se que, em todo o mundo, a cada ano surjam

cerca de 110 milhões de novos casos de malária, ocorrendo de 01 a 02 milhões de

óbitos. Dentre os 21 países das Américas, 11 estão ao Sul: Argentina, Bolívia,

Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana, Paraguai, Peru, Suriname e

Venezuela. Os outros 10 países são: Belize, Costa Rica, El Salvador, Guatemala,

Honduras, México, Nicarágua e Panamá, junto com República Dominicana e Haiti

(WHO, 2005).

Essa doença caracteriza-se por desencadear acessos periódicos de febres

intensas, que debilitam profundamente o doente. A malária provoca lesões no

fígado, baço e em outros órgãos, além de anemia profunda devido à destruição

maciça dos glóbulos vermelhos que são parasitados pelo Plasmodium para

reproduzir-se (NEVES, 2004).

A malária é mundialmente um dos mais sérios problemas de saúde pública,

é uma doença infecciosa febril, cujo agente etiológico é o protozoário do gênero

Plasmodium, as quatros espécies que podem causar a malária humana são:

Plasmodium vivax Grassi & Feletti, 1989.

Plasmodium falciparum Welch, 1897.

Plasmodium malariae Laveran, 1922.

Plasmodium ovale Stephens, 1922.

As três primeiras ocorrem no Brasil, porém a última é restrita ao continente

Africano, local onde esta espécie é a mais prevalente (OMS, 2005).

A malária está presente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo

(figura1), sendo que as maiores taxas de incidência são observadas na África

(onde ocorrem 90% dos casos do globo), na Ásia e nas Américas (WHO, 2005).

Um elevado índice de morbidade afeta cerca de 300 a 500 milhões de

pessoas a cada ano, contribuindo para uma elevada mortalidade, estimada em

cerca de 1 milhão de óbitos anualmente. Diariamente, na África, morrem 3000

crianças e, todos os anos, ao menos um milhão e outras centenas milhões de

pessoas adoecem gravemente, principalmente na África Subsaariana (WHO,

2005). Apesar, desses números, a malária, é hoje, uma doença focal na maior

13

parte do mundo. Apenas algumas regiões, em cada país, continuam apresentando

transmissão natural da infecção.

Figura 1. Mapa da distribuição da malária no Mundo. Fonte: OMS, 2005.

Durante os primeiros anos do século XX, a transmissão da malária ocorreu

em toda a América, desde o Canadá até Argentina e continua a existir. Calcula-se

que 175 milhões de pessoas vivem em zonas com algum risco, onde 58% habitam

em zonas de baixo risco, 24% em zonas de risco moderado e 18% em zonas de

alto risco. Aproximadamente 87 milhões de pessoas vivem em zonas onde a

transmissão ocorreu anteriormente e hoje estão expostas a um risco muito baixo

de contaminação. No entanto, cerca de 70 milhões de pessoas habitam áreas de

risco de transmissão de malária, envolve nove países que compartilham a selva

pluvial amazônica (Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana,

Peru, Suriname e Venezuela) [OPAS, 2004].

No Brasil, a malária é a mais expressiva das endemias. Está presente,

principalmente na Amazônia, cujas condições climáticas, de hidrografia abundante,

chuvas e enchentes freqüentes e ainda processos de ocupações desordenadas,

favorecem criadouros dos vetores, (TADEI, 1986, 1993, 1999; TADEI et al., 1988,

1998; BARATA, 1995). Observa-se aumento nas notificações de casos da doença

no segundo semestre do ano na Amazônia. Provavelmente, este fator está

14

associado ao período após as chuvas, pois estas propiciam condições para maior

proliferação do mosquito responsável pela transmissão da doença.

Atualmente no Brasil, a malária está concentrada na região norte, que inclui

os estados do Acre, Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins. Há

também registros de casos no Maranhão e Mato Grosso. Dessa forma abrangendo

todos os nove estados que formam a Amazônia Legal, totalizando 807 municípios e

representando 99,5% do total de casos no país (MS, 2006).

No Brasil, até 1940, a malária atingia grande parte do território nacional e se

constituía num verdadeiro desafio para a colonização. Não apenas para a

Amazônia, mas para várias áreas litorâneas do sudeste e da bacia dos rios Paraná

(estado do Paraná), São Francisco e Rio Doce (estado de Minas Gerais)

(PESSOA, 1972).

Em 1965 foi adotada pelo Brasil, a estratégia de erradicação da malária

preconizada pela OMS, baseada na ação intradomiciliar do

Diclorodifeniltricloroetano (DDT) contra os anofelinos transmissores e no uso de

drogas antimaláricas para esgotamento das fontes de infecção (seres humanos

parasitados pelos plasmódios). Esta estratégia foi capaz de eliminar a malária em

extensas áreas do território brasileiro (regiões Nordeste, Sudeste, Centro-Oeste e

Sul) onde uma parcela significativa da nossa população vivia sob o risco de contrair

a doença (LOIOLA et al., 2002).

No Brasil, o uso do DDT foi proibido desde 1985 (WHO, 1986; OPAS, 1986).

A contínua aplicação dos inseticidas, em larga escala, levou as espécies de

Anopheles, a desencadearem o processo de resistência. O primeiro caso foi

observado em 1951, com A. sacharovi, na Grécia. A OMS, em 1958, listou 18

espécies resistentes ao DDT em todo o mundo (BROWN, 1986).

A partir da década de 70, os projetos de desenvolvimento da Amazônia, que

tinha como escopo a abertura de estradas, construções de hidroelétricas,

expansão de áreas de garimpo, entre outros, promoveram uma grande migração

interna no território brasileiro, com alterações ambientais importantes e exposição

de grande contingente populacional a área malarígena. Essa situação provocou a

dispersão da infecção pelas regiões Norte e Centro-Oeste, com um aumento

significativo do número de casos, passando-se a alcançar níveis de 450 a 500 mil

casos anuais, culminando no ano de 1999, com o registro de 635.646 casos. As

novas fronteiras para o desenvolvimento da Amazônia provocaram profundas

15

alterações ambientais, suportadas em um modelo econômico de crescimento que

falhou em assegurar ao homem os mecanismos de proteção social (TADEI et al,

2007).

De acordo com os dados do SIVEP (Sistema de Vigilância Epidemiológica),

no período de 1999 até 2002, nota-se redução gradativa de casos de malária na

Amazônia Legal, em decorrência da intensificação das ações de combate a

enfermidade. No entanto, não houve sustentabilidade e o registro de casos da

doença voltou a crescer gradativamente no período de 2003 até 2005, com uma

redução em 2006, da ordem de 60 mil, isto é, 10% de redução em relação ao ano

de 2005.

A distribuição, por estados brasileiros, dos casos de malária registrados em

2006, demonstra que a ocorrência da doença não é homogênea, pois os estados

do Amazonas, Rondônia, Pará e Acre foram responsáveis por 87,9% dos casos,

sendo que três municípios, Cruzeiro do Sul, Manaus e Porto Velho, notificaram

22,5% desse percentual.

O desmatamento para extração de madeira, criação de gado, agricultura e

assentamentos não oficiais têm contribuído para o aumento da transmissão da

doença. Outro fator colaborador é o aumento dos criadouros do mosquito vetor da

malária em função da atividade de piscicultura, com a construção de tanques

artificiais, seja nos quintais dos domicílios ou nas periferias de diversas cidades da

região Amazônica (TADEI, 2001; TADEI et al., 2004).

A variação dos indicadores do ano de 2006, em relação a 2005, mostra

redução de casos em sete estados. A maior redução foi no estado do Tocantins,

em torno de 47% dos casos. Entretanto, Acre e Amapá apresentaram incremento

de 63,4% e 3,8%, respectivamente. Verificou-se que, apesar de a redução até

2002 ter sido expressiva, houve a partir desse ano um progressivo incremento,

refletindo as dificuldades na sustentação das estratégias até então utilizadas para o

controle da malária (MS, 2006).

Na Amazônia Legal, as infecções causadas pela espécie de P. vivax

prevalecem. Em 2006, foram registrados em torno de 396 mil casos de malária

causada por esta espécie, correspondendo a 73,4% das notificações (SIVEP,

2006). Este alto índice de infecção por P. vivax foi também observado por Tadei &

Dutary-Thatcher (2000), analisando os anofelinos do Amazonas. Os autores

16

relataram mosquitos infectados por P. vivax duas vezes e meia a mais em relação

a P. falciparum e quase trinta vezes a mais do que P. malarie.

A incidência parasitária anual (IPA) da malária na Amazônia Legal, no

período de 2003 até 2006, ficou entre 18,3 a 26,6 casos por mil habitantes (hab.).

Houve uma progressão deste indicador, no período de 2003 até 2005, e redução

em 2006, quando se registrou incidência de 22,9 casos para cada 1 mil habitantes

(hab.). Nesta região, no ano de 2006, os estados do Acre, Rondônia e Amazonas

foram classificados como áreas de alta risco de transmissão (IPA>50/1.000 hab.),

Roraima, Amapá e Pará como área de médio risco (IPA entre 10 – 49/1.000 hab.) e

os estados do Mato Grosso, Maranhão e Tocantins de baixo risco (IPA<10/1.000

hab.). Quando comparadas as incidências dos anos de 2006 e 2005, todos os

estados apresentaram redução, exceto o Acre (MS, 2006).

Cerca de 10% da população da Amazônia Legal, que corresponde a 2,4

milhões de pessoas, vive em áreas de alto risco de transmissão de malária,

abrangendo 90 municípios. Esse total de municípios diminuiu 15,1% em relação ao

ano de 2005, onde eram 106 municípios de alto risco de transmissão da malária

nessa região (MS, 2006).

A situação epidemiológica da malária vem agravando-se com o acréscimo

de casos em áreas urbanas (TADEI et al., 2007). A malária urbana e peri urbana,

constituem um problema da mais alta relevância na Amazônia. A transmissão da

doença é intensa na periferia dessas regiões, decorrente da proximidade com a

mata marginal e a intensidade vai se reduzindo à medida que se adentra nos

centros das cidades. A migração de populações entre áreas endêmicas e não

endêmicas de malária, associada às condições socioeconômicas, contribuem com

o aumento da incidência em áreas urbanas (TADEI, 1993, 2001; TADEI et al.,

1998, 2007; ROCHA, 2002). Algumas cidades como Manaus/AM e Porto Velho/RO

apresentam extensas áreas de aglomerados urbanos, principalmente em áreas de

periferia, devido a migração em busca de oportunidades de trabalho. Como

conseqüência, esses municípios concentraram 14,2% do total de casos de malária

ocorridos na região amazônica, em 2006. Além desses municípios, é importante

destacar também a região do Alto Juruá, no Acre, que foi responsável, em 2006,

por 14,3% das notificações, com grande concentração de casos em área urbana

(MS, 2006).

17

No estado do Amazonas, o índice de malária é crescente ao longo dos anos,

com a ampliação dos espaços de transmissão, inclusive invadindo áreas

historicamente de baixa prevalência. No período de 1999 a 2003, o comportamento

da malária oscilou entre avanços e recuos. Em 2004 e 2005 houve, no estado, um

incremento do índice de notificação da doença, apresentando os seguintes

números de casos: 1999, 167.722; 2000, 96.026; 2001, 48.385; 2002, 70.223;

2003, 140.642; 2004, 147.349 e em 2005, 222.545. No ano de 2006, durante o mês

de abril, houve uma redução de 42% nos casos de malária, o que significa que 15

mil pessoas deixaram de adoecer, mesmo assim ainda foi registrado um total de

540.000 casos na Amazônia Legal (TADEI et al., 2007).

De janeiro a outubro de 2007, segundo dados do SIVEP, foram registrados

quase 369 mil casos de malária na região Norte do Brasil e, deste total, cerca de

45% no Amazonas, estado que lidera os casos da doença no país.

No município de Presidente Figueiredo, no período de 01/01/2004 a

31/03/2007, foram notificados 15.250 casos de malária vivax, de um total de

104.285 exames realizados. Dados do resumo epidemiológico (SIVEP) para o

município de Presidente Figueiredo no ano de 2007, mostraram que foram

realizados 28.203 exames de pesquisa de plasmódio, sendo 3.003 casos positivos

e destes, 2.580 correspondem à malária por P. vivax.

De acordo com dados do SIVEP MALÁRIA, da Secretaria de Vigilância em

Saúde (SVS), a incidência da doença na Amazônia diminuiu em 2007, entretanto

continuou prejudicando o nível de saúde da população e o desenvolvimento

socioeconômico da região.

1.2. VETORES DA MALÁRIA

No Brasil a malária é transmitida por fêmeas de mosquitos do gênero

Anopheles, destacando-se pela sua importância o Anopheles darlingi Root, 1926

(DEANE et al., 1948; DEANE, 1986; TADEI et al., 1988; LOURENÇO-DE-

OLIVEIRA et al., 1989; TADEI & DUTARY-THATCHER, 2000). Nem todas as

espécies de Anopheles são transmissoras da malária humana. Entretanto, Tadei &

Dutary-Thatcher (2000) comprovaram que A. darlingi (figura 2) é o principal vetor e

que as demais espécies são vetores ocasionais, não desencadeando surtos

epidêmicos.

18

Este gênero compreende cerca de 400 espécies, das quais apenas um

número reduzido tem importância para a epidemiologia da malária, em cada região

brasileira. Cinco espécies são consideradas vetores principais no Brasil

(CABIANCA et al., 2000):

Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926.

Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis Lynch Arribalzága, 1878.

Anopheles (Nyssorhynchus) aquasalis Curry, 1932.

Anopheles (Kerteszia) cruzi Dyar & Knab, 1908.

Anopheles (Kerteszia) bellator Dyar & Knab, 1906.

Figura 2. Anopheles darlingi, principal vetor da malária no Brasil. FONTE: Laboratório de Malária e Dengue do INPA.

O Anopheles gambiae Giles, 1902 foi introduzido no nordeste brasileiro

possivelmente em 1930, e lá esteve até 1940, causando, entre 1938 e 1939, uma

das mais graves epidemias de malária registradas no Brasil. Trata-se de um

mosquito africano, cujas fêmeas são altamente antropofílicas e endófilas. Suas

larvas são normalmente encontradas em pequenas coleções de águas limpas no

solo, pobres em vegetação e bastante expostas ao sol. As cacimbas, poços rasos

feitos pelos nordestinos para obtenção de água, constituíram importantes focos

19

desse mosquito durante sua permanência no Brasil. No entanto, foi erradicado do

país em 1940. Atualmente, o Anopheles gambiae é o principal vetor da malária na

África (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994).

Comumente chamados de mosquitos, muriçocas, carapanãs e pernilongos,

esses organismos são insetos de pequeno porte e de corpo delgado,

reconhecendo-se a existência de cerca de 3600 espécies (CROSSKEY, 1988). O

desenvolvimento dos mosquitos ocorre por metamorfose completa

(holometabólica), apresentando os estágios de ovo, larva, pupa e adulto. Durante o

desenvolvimento a larva passa por quatro estádios L1, L2, L3 e L4, originando

quatro ecdises e uma pupal. Os adultos são dióicos. Todos os estágios são

aquáticos, com exceção do último (adulto). Cada espécie de culicídeo comporta-se

como se representasse duas populações distintas, ocupando ecótopos diferentes.

Na fase adulta, ocorre a reprodução e dispersão. (FORATTINI, 2002).

As fêmeas saem em busca de suas fontes alimentares, vertebrados

incluindo os seres humanos, no período crepuscular. As espécies que procuram

principal ou unicamente, o sangue de animais (mamíferos e aves, por exemplo)

são qualificadas pela maioria dos especialistas como “zoófilas”, enquanto as que

picam, freqüente ou preferencialmente, o ser humano, são ditas antropófilas. A

antropofilia é condição fundamental para que uma espécie de anofelinos seja

considerada vetora em potencial de malária humana. Anofelinos que costumam

penetrar nas habitações humanas participam mais ativamente da transmissão da

malária do que as espécies que permanecem, de preferência, no exterior (extra

domicílio). Esse traço de comportamento, qualificado como domesticidade ou

endofilia da espécie, é levado em consideração nos estudos epidemiológicos,

fornecendo um dos parâmetros para medir a eficiência dessa espécie como vetora

da doença e ajudando a planejar a aplicação de inseticidas no interior das casas

(CABIANCA et al., 2000).

Tadei & Dutary Thatcher (2000), estudaram várias espécies de Anopheles

(Nyssorhynchus) na Amazônia a fim de se determinar sua importância na

transmissão da malária. Das 33 espécies de Anopheles, de ocorrência conhecida

na Amazônia, apenas 8 foram encontradas infectadas por Plasmodium. O principal

vetor - A. darlingi mostra acentuada antropofilia e um ciclo contínuo de atividade

que dura a noite inteira, mas que tem picos ao anoitecer e ao amanhecer. O A.

nuneztovari mostrou-se ser zoófilo, crepuscular e peridomiciliar. Esses hábitos

20

podem mudar dependendo de uma série de fatores externos, densidade

populacional e aqueles relacionados às atividades humanas (TADEI et al., 1993).

1.3. O CICLO DA MALÁRIA

O ciclo de vida do Plasmodium envolve uma fase no vetor e outra no

hospedeiro que pode ser humano ou animal. O ciclo é do tipo heteroxênico, onde o

homem é o hospedeiro intermediário e o mosquito o definitivo. No homem ocorre

com reprodução assexuada do tipo esquizogonia, e no vetor com reprodução

sexuada do tipo esporogonia (NEVES, 2004).

O ciclo tem início quando uma fêmea do gênero Anopheles, ao exercer a

hematofagia, ingere as formas sanguíneas infectantes do Plasmodium, os

gametócitos (figura 3). Estes se desenvolvem no estômago do vetor, onde o

gametócito feminino amadurece e transforma-se no macrogameta e o gametócito

masculino, por um processo de exoflagelação, dá origem a vários microgametas.

Um microgameta e um macrogameta formam o ovo ou zigoto. Esta etapa dura em

torno de uma hora, após o repasto infectante. Logo após, o ovo, que se encontra

na luz do estômago, começa a migrar o epitélio estomacal, aonde irá encistar-se. A

fase móvel chama-se oocineto e a fase encistada, oocisto. Por um processo de

esporogonia, no interior do oocisto formam-se milhares de esporozoítos. Esses

rompem a parede do oocisto, invadem a cavidade geral do mosquito e chegam às

glândulas salivares. A essa etapa do ciclo, que ocorre no vetor, é dado o nome de

Esporogonia e dura em torno de 4 a 15 dias, dependendo da temperatura e

umidade do ambiente (NEVES, 2004).

O inseto, ao exercer novamente a hematofagia, inocula, juntamente com a

saliva, 10 a 20 esporozoítos que caem na corrente sanguínea do homem e migram

até os hepatócitos, iniciando o ciclo tissular ou pré-eritrocítico. No hepatócito se

multiplicam completando a esquizogonia com a reprodução de milhares de

merozoítos (10.000 para o P. vivax). Esta fase exoeritrocítica apresenta para cada

espécie de plasmódio humano os seguintes tempos médios de evolução: P.

falciparum: 6 dias, P. vivax: 8 dias e P. malarie: 14 dias. Após este período, os

hepatócitos se rompem, liberando milhares de merozoítos que chegam até a

corrente sanguínea para invadir as hemácias e iniciar o ciclo eritrocítico. O

21

merozoíto invade as hemácias, com o auxílio dos receptores moleculares, no caso

específico do Plasmodium vivax, a proteína eritrocitária DARC (DARC, o inglês:

“Duffy Antigen Receptor for Chemokines”). O ciclo eritrocítico desenvolve-se até

que após completar a esquizogonia, ocorre o rompimento das hemácias liberando

merozoítos que podem invadir novas hemácias ou diferenciar-se, para formar os

gametócitos. Estas formas sanguíneas permanecem na circulação e são chamadas

formas infectantes, pois o mosquito ao picar o homem infectado, ingere

gametócitos dando início a um novo ciclo esporogônico.

Figura 3. Ciclo de vida do Plasmodium (Disponível em:<www.dpd.cdc.gov> Acessado em: 09/05/08).

A esquizogonia sanguínea se processa em intervalos regulares para cada

espécie e está associada aos sintomas clínicos: P. falciparum: 36 a 48 horas (terçã

maligna), P. vivax: 48 horas (terçã benigna) e P. malarie: 72 horas (quartã

benigna).

22

A febre e o acesso malárico, juntamente com a anemia, são os três

elementos patognomônicos da infecção malárica. O acesso malárico ocorre, com a

intermitência característica para cada espécie de Plasmodium, após a febre

intensa, caracterizado por: calafrios, calor e suor (NEVES, 2004).

1.4. O SISTEMA DE GRUPO SANGÜÍNEO DUFFY

1.4.1. A Proteína Duffy

O grupo sanguíneo Duffy foi descoberto quando Cutbush e Ikin detectaram,

no início da década de 50, os primeiros anticorpos desse sistema. O anticorpo anti-

Fya detectado no soro de um hemofílico politransfundido, recebeu este nome em

homenagem ao paciente, Sr. Duffy, que reagia com 64% das 205 amostras de

sangue testadas de indivíduos não aparentados na população inglesa. No ano

seguinte, Ikin et al. (1951) descreveram o anti-Fyb, anticorpo que define o par

antitéticos do antígeno Fya (CUTBUSH & MOLLISON, 1950; IKIN et al., 1951).

A Sociedade Internacional de Transfusão Sangüínea (ISBT, do inglês

“International Society Blood Transfusion”) reconhece 29 sistemas de grupos

sanguíneos que agrupam antígenos expressos na membrana externa dos

eritrócitos (figura4). O Sistema de grupo sangüíneo Duffy é classificado pela ISBT

pelo número 008 (GARRATTY et al., 2000; STORRY & OLSSON, 2004; DANIELS

et al., 2004). Os antígenos eritrocitários são carboidratos ou proteínas localizados

em glicolípides ou proteínas da superfície da membrana eritrocitária ou ainda em

proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol, e atravessam uma ou múltiplas vezes a

membrana da hemácia (NEOTE et al., 1994).

Um dos aspectos interessantes do Duffy é sua função de receptor de

merozoítos de Plasmodium vivax e de Plasmodium knowlesi, que são,

respectivamente, os agentes responsáveis por diferentes formas de malária no

homem e no macaco (JENS et al., 2005). Essa função receptora foi colocada em

evidência por Miller et al. (1975), mostrando a resistência dos eritrócitos Fy (a-b-) à

invasão dos merozoítos de P. knowlesi que, naquela época, eram cultivados in

vitro. Em 1989, pesquisadores confirmaram os mesmos experimentos com o

Plasmodium vivax e puderam concluir que a glicoproteína eritrocitária carreando os

23

determinantes Duffy é necessária como ligante no processo de invasão eritrocitária

pelo merozoíto de Plasmodium vivax (BARNEWELL et al., 1989).

Figura 4. Modelo esquemático da membrana da hemácia e seus 29 sistemas de antígenos, incluindo a proteína eritrocitária Duffy com as sete hélices hidrofóbicas, um domínio amino-terminal extracelular, três alças citoplasmáticas e um domínio carboxi-terminal citoplasmático (REID, 2004).

A partir de 1989, com a purificação da proteína Duffy e a clonagem do

cDNA, foi possível intensificar os estudos relacionados aos genes que codificam o

antígeno Duffy (CHAUDHURI et al., 1989, 1993). Atualmente, sabemos que a

glicoproteína Duffy é composta de 338 aminoácidos, e é expressa na membrana

externa das hemácias, sendo um receptor de membrana heptahelical que possui

uma massa molecular de 35-43 kDa (TANNER et al., 1988). A figura 4 mostra a

proteína e a presença de sete hélices hidrofóbicas caracterizando um domínio

amino-terminal extracelular, três alças citoplasmáticas e um domínio carboxi-

terminal citoplasmático (CHAUDHURI et al., 1989; NEOTE et al., 1994).

A Glicoproteína Duffy (GPD) é N-glicosilada, a adição do sacarídeo ocorre

no nitrogênio da amida das cadeias laterais do aminoácido Asparagina (Asn).

Portanto, possui dois sítios de glicosilação, nos aminoácidos Asn 16 e Asn 27, e

NH 2 NH 2

NH 2 NH 2

NH 2

COOH

COOH

COOH COOH

P1 P P k

ABO Hh Lewis I

GPA/GPB (MNSs) GPC/GPD (Gerbich)

CD99 (Xg) CD147 (Ok) CR1 (CD35; Knops)

CD239 (Lutheran, B-CAM) ICAM-4 (LW) ERMAP (Sc) CD44 (Indian)

CD234 (Duffy)

Band 3 (Diego) Rh Kx AQP-1 (Colton) Kidd AQP-3 (GIL) CD151 (Raph)

AChE (Yt) Dombrock (ART4) DAF (CD55, Cromer) CD108 (JMH) Emm CD238 (Kell)

Carbo hidratos-

Citoplasma

Exterior

24

essa variação do grau de N-glicosilação contribui para a faixa da massa molecular

(CHAUDHURI et al., 1989).

A proteína Duffy, também chamada de DARC (DARC, do inglês: ““Duffy

Antigen Receptor for Chemokines”), é expressa na membrana de eritrócitos (RBC,

- do Inglês “red blood cell”) e em diversos tecidos não eritróides como rim, baço,

coração, pulmão, músculo, duodeno, pâncreas, placenta, cérebro, intestino,

glândula tireóide e em células de Purkinje do cerebelo, e pertence à subfamília de

receptores de citocinas (HADLEY & PEIPER, 1997).

A proteína Duffy (CD234), pertence à classe de moléculas do Complexo de

Histocompatibilidade Principal (CHP), tem como característica mais notável o seu

enorme polimorfismo. O termo polimorfismo vem da genética de populações e

significa que, numa determinada população, um lócus gênico é ocupado por duas

ou mais formas alélicas (BERNHARD et al., 1990).

Em um estudo realizado em doadores de sangue na cidade de São Paulo, a

freqüência fenotípica encontrada, para o sistema de grupo sangüíneo Duffy, foi de

19,8% em caucasóides e 14% em negros para o fenótipo Fy(a+b-). Quanto ao

fenótipo Fy(a+b+), a casuística foi de 41,4% para caucasóides e 1,6% para negros.

O fenótipo Fy(a-b+) observado foi de 37,8% para caucasóides e 17,5% para

negros. Em caucasóides, a freqüência do fenótipo Fy(a-b-) foi de 1,1%, enquanto

para os negros foi de 66,9%, sendo esse fenótipo considerado um marcador de

raça negra (NOVARETTI et al., 2000).

Cavasini et al. (2006) analisaram os fenótipos Duffy de dois grupos de

indivíduos, doadores de sangue e infectados com P. vivax, de quatro estados da

região amazônica: Amapá, Pará, Rondônia e Acre. Os dados encontrados pelos

autores mostram uma alta freqüência do fenótipo Fyab em infectados e uma

freqüência significativa do fenótipo nulo em doadores de sangue. A tabela 1 mostra

a freqüência fenotípica Duffy em doadores de sangue dos quatro estados

estudados.

25

Tabela 1 – Freqüência (%) fenotípica Duffy em doadores de sangue em quatro estados da Amazônia - 2006.

FENÓTIPOS Para Amapá Rondônia Acre TOTAL

Fya 32 37 26 26 30,25

Fyb 33 44 34 34 36,25

Fyab 27 28 37 37 32,25

Fy nulo 8 8 3 3 5,5

FONTE: CAVASINI et al. 2006.

1.4.2. O gene DUFFY , seus alelos e o equilíbrio gênico

O gene FY é constituído por dois exons e seu lócus foi mapeado no braço

longo do cromossomo 1q22-q23, cujo produto do gene é uma glicoproteína ácida,

chamada de glicoproteína Duffy (MATHEW et al., 1994). Existem dois produtos

desse gene, o transcrito maior, com 336 aminoácidos, chamado beta e o menor,

com 338 aminoácidos, chamado alfa (CHAUDHURI et al., 1993).

A figura 5 representa esquematicamente o gene de grupo sanguíneo Duffy,

incluindo a região promotora e seus dois exons (CAVASINI et al., 2001).

O sistema consiste de quatro principais alelos, cinco fenótipos e cinco

antígenos. Os alelos são FYA, FYB, FYX e FY; os fenótipos são Fy(a+b-),

Fy(a+b+), Fy(a-b+), Fy(a-b+fraco) e Fy(a-b-) e os antígenos são Fya (Fy1), Fyb

(Fy2), Fy3, Fy5 e Fy6 (PODO & CHAUDHURI, 2000).

Os antígenos Fya e Fyb são codificados por duas formas alélicas do gene

FY. Os alelos FYA e FYB diferem por uma simples substituição de bases no

nucleotídeo 125. No alelo FYA, a base é guanina (G) e no alelo FYB a base é

adenina (A). Isso produz um códon para glicina no aminoácido 42 no alelo FYA, e

um códon para ácido aspártico no alelo FYB (MALLINSON, 1995). Essa

substituição de apenas um aminoácido na posição 42 caracteriza os antígenos Fya

e Fyb (JENS et al., 2005).

26

Figura 5. Representação esquemática do gene FY, com sua região promotora GATA1 e dois exons. Os círculos em preto representam substituição de nucleotídeos e as setas indicam orientação dos iniciadores usados na genotipagem. (OLSSON et al., 1998). FONTE: CAVASINI et al., 2001.

Em 1965, foi descrito outro alelo no lócus DUFFY, FYX, co-dominante com o

FYA e recessivo com o FYB, relacionado com a fraca expressão do antígeno Fyb

(CHOWN et al., 1965). O alelo FYX foi, posteriormente, descrito com mais detalhes

por Lewis et al. (1972) onde ficou demonstrado que esse alelo não produz um

antígeno diferente dos outros do sistema Duffy, mas os eritrócitos é que reagem

mais fracamente com soros anti-Fyb, em função de uma mutação no exon 2

(C265T). A mutação relativamente rara C265T no FYB, caracterizando o alelo FYX,

responsável pela expressão muito baixa do fenótipo Fy(b) e que aparece em 2%

dos caucasianos (PARASOL et al., 1998; TOURMAMILLE et al., 1998).

Uma outra mutação G298A encontrada no FYA e FYB, parece ser

silenciosa. A alteração G298A provoca uma substituição de Alanina por Treonina

no aminoácido 100, enquanto que a C265T muda o aminoácido Arginina por uma

Cisteína na posição 89 do gene FY (TOURMAMILLE et al., 1998; PODO &

CHAUDHURI, 2000).

O alelo FY, caracterizado por uma única substituição do nucleotídeo (T33C)

da região promotora GATA-box do gene FYB, induz à não expressão do antígeno

Fyb na membrana da hemácia. Este alelo pode aparecer em heterozigose ou

homozigose: FYAFY; FYBFY e FYFY. Quando em homozigose, corresponde ao

fenótipo nulo Fy(a-b-), resultando na ausência de expressão do antígeno Fyb

apenas no eritrócito, não alterando a expressão dessa proteína em outros tecidos

(TOURNAMILLE et al., 1995; IWAMOTO et al., 1996).

O resultado de eventos naturais na região Gata-box para o alelo FYAnulo foi

encontrado em regiões endêmicas do Plasmodium vivax em Papua New Guinea

(PNG) (ZIMMERMAN et al., 1999). Indivíduos heterozigotos FYAFYAnulo têm 50%

27

menos proteína Duffy expressa na membrana dos seus eritrócitos, quando

comparados com indivíduos FYAFYA. Na PNG, uma significante redução de

infecções por P. vivax foi observada em indivíduos heterozigotos para o alelo

FYAnulo, sugerindo que esse genótipo esteja associado à diminuição da

susceptibilidade à infecção in vivo por P. vivax (KASEHAGEN et al., 2007).

Um trabalho avaliando a expressão da proteína Duffy nas hemácias de

indivíduos portadores do alelo FYX, demonstra que os heterozigotos têm 50%

menos antígeno Duffy nos seus eritrócitos e os homozigotos apresentam 1/10

desses antígenos expressos (YAZDANBAKHSH et al., 2000). Entretanto, Cavasini

et al. (2007b), sugerem que esse polimorfismo do alelo FYX não está associado

com a susceptibilidade à malária por P. vivax, pois não foram observadas

diferenças estatísticas entre pacientes infectados e doadores de sangue, em seus

estudos.

Castilho et al. (2004) estudaram 361 doadores de sangue, sendo 182

indivíduos com ancestrais africanos e 179 caucasianos. Os testes sorológicos

determinaram o fenótipo Fyb(-) em 130 africanos e em 40 caucasianos, a maioria

genotipada por PCR/RFLP como FY (mutação 33T>C) e FYX (mutação

265C>T/298G>A), respectivamente. Foram encontrados também, três indivíduos

portadores de um novo polimorfismo de simples nucleotídeo (SNP, do inglês:

“Single Nucleotide Polymorphism”) com mutação 145G>T coexistindo com 265C>T

e 298G>A. Esse SNP é marcado pela substituição de Alanina (Ala) por Serina (Ser)

no aminoácido 49 no primeiro segmento transmembrana do FYB, o que determina

a diminuição na expressão dessa proteína (Fyb) nas hemácias desses indivíduos,

observado por citometria de fluxo.

O teorema de Hardy-Weimberg foi formulado em 1908 pelos cientistas

Hardy e Weimberg e tem o seguinte enunciado: “Em uma população infinitamente

grande em que os cruzamentos ocorrem ao acaso e sobre o qual não há atuação

de fatores evolutivos, as freqüências gênicas e genotípicas permanecem

constantes ao longo das gerações”. A Lei de Hardy-Weimberg determina a

freqüência com que os alelos aparecerão nas próximas gerações, com base na

geração anterior (CABELLO & KRIEGER, 1997).

Essa teoria é válida quando não existe influência de fatores evolutivos

atuando na população. São exemplos de fatores evolutivos: mutações, seleção

natural e migrações. Se houver algum fator evolutivo que perturbe estas condições

28

então a população não estará em equilíbrio gênico e sim evoluindo. Dessa forma

podemos detectar, na prática, se uma população está evoluindo, ou não,

comparando, por exemplo, o quadrado da freqüência gênica com a freqüência do

genótipo homozigoto (FYFY). Se estes valores forem diferentes a população não

estará em equilíbrio, estará em evolução. Se forem muito próximos então a

população estará em equilíbrio gênico para este gene (CABELLO & KRIEGER,

1997).

1.4.3. A Função Biológica da proteína Duffy

A discussão sobre a função dos antígenos eritrocitários Duffy iniciou-se

quando Miller et al. (1976), observaram que os determinantes antigênicos Fya e

Fyb poderiam ser receptores para Plasmodium knowlesi e que a resistência à

invasão eritrocitária pelo merozoíto do P. vivax em negros, devia-se ao fato do

fenótipo Duffy negativo ser freqüente nessa população.

O mecanismo de entrada no eritrócito pelo Plasmodium foi estudado em

1978, por microscopia eletrônica, e observado que a porção apical do merozoíto

faz o contato inicial com o eritrócito, criando uma pequena depressão na

membrana (figura 6).

Figura 6. Microscopia eletrônica mostrando a interação entre o complexo apical do merozoíto e RBC. (Disponível em: <www.impact-, malaria.com/.../images/meroEM.gif>. Acessado em: 18 de abril de 2008).

29

Essa área começa a espessar e forma uma junção com a membrana do

parasito, então o merozoíto penetra no eritrócito por invaginação. Após a entrada

completa do Plasmodium, o orifício de entrada fecha-se (AIKAWA et al., 1978). A

invasão de hemácias pelos parasitos da malária ocorre quando o merozoíto liga-se

à superfície de hemácias não infectadas. Este processo inclui fases de

reconhecimento e ligação, seguidos por reorientação e penetração (BANNISTRE &

MITCHELL, 2003).

Os estudos sobre citocinas e seus receptores convergiram para a

investigação dos antígenos de grupo sangüíneo Duffy, demonstrando uma

importante função fisiológica para os alelos dessa proteína. As quimiocinas, são

citocinas com função de quimiotaxia, e que fazem parte da família das citocinas. E

são divididas em duas grandes subfamílias que diferem nos dois resíduos cisteínas

dos aminoácidos terminais que participam na ligação dissulfeto. Podem estar

adjacentes (C-C) ou separados por um aminoácido (C-X-C). Cada quimiocina tem

um receptor específico no qual se liga com alta afinidade (DOHLMAN et al., 1991).

Horuk et al. (1993) mostraram, em um estudo sobre receptores de

quimiocinas multiespecíficos em eritrócitos humanos, que a IL-8 liga-se

minimamente a eritrócitos Duffy negativos, que anticorpos monoclonais para

antígenos Duffy bloqueavam a ligação de IL-8 em eritrócitos Duffy positivos e que a

IL-8 também impedia a ligação e a invasão eritróide por P. knowlesi. Essas

observações indicam que os antígenos de grupo sanguíneo Duffy são receptores

de quimiocinas. Esta evidência foi comprovada por outro estudo que estabeleceu a

relação entre receptores de quimiocinas em eritrócitos e o Duffy, através de

alinhamento da seqüência da proteína Duffy com outros membros da família das

quimiocinas. Foi visto que a organização dos dois exons do gene FY é a mesma

encontrada nos genes de outros receptores de quimiocinas. A partir destes

estudos, os antígenos Duffy foram denominados DARC (CHAUDHURI et al., 1994;

NEOTE et al., 1994; MURPHY, 1994).

A IL-8 é ligante do DARC mais intensamente estudada, é de baixa massa

molecular (aproximadamente 8 KDa) e é produzida pela maioria das células do

organismo, particularmente macrófagos e células endoteliais envolvidas na

migração celular. A IL-8 é conhecida como um potente indutor de quimiotaxia para

neutrófilo (ROITTI, 1997). Após sua introdução na circulação, a IL-8 é rapidamente

ligada ao DARC eritróide, ficando incapaz de ativar os neutrófilos e isso pode

30

funcionar como um limitante da estimulação de leucócitos pela diminuição da IL-8

sangüínea (DARBONNE et al., 1991).

A expressão aumentada do RNA mensageiro da proteína Duffy durante

condições inflamatórias do rim, indica que esses antígenos são importantes em

processos biológicos (LIU et al., 1999; SEGERER et al., 2003). A diminuição da

função renal após transplante está mais associada à pacientes com fenótipo

Fy(a-b-). Tal fato pode ocorrer devido à ausência de receptores DARC, que fazem

o papel de atenuar os efeitos inflamatórios, agindo como um escoadouro de

quimiocinas (AKALIN & NEYLAN, 2003). Esta e outras associações entre função-

estrutura do DARC constituem num importante campo de investigação e

associação entre as citocinas e o Duffy na fisiologia normal e patológica, pois o

estudo da imunidade e os seus fatores são de extrema importância para

conhecermos os mecanismos de defesa do organismo frente a diferentes

patôgenos.

Outro ponto fundamental relacionado aos antígenos Duffy, é o

reconhecimento de sua participação nas reações transfusionais e na Doença

Hemolítica Peri Natal (DHPN) (LANDSTEINER, 1931; LEVINE et al., 1941). Os

anticorpos anti-Fya e anti-Fyb são predominantemente da subclasse IgG1 e

apenas 18% IgG2 e 25% da classe IgM (SZYMANSKI et al., 1982). Este fator é

importante, pois esses anticorpos são capazes de ativar complemento e

desencadear reação hemolítica pós-transfusional (DANIELS et al., 2002; KIM et al.,

2004).

É possível detectar fetos em risco de desenvolver DHPN pela determinação

do genótipo Duffy em líquido amniótico (HESSNER et al., 1999). Outra indicação

para a genotipagem do Sistema Duffy foi colocada em evidência recentemente,

quando Castilho (2007) descreveu a importância, no cenário clínico, da seleção de

pacientes que podem, seguramente, receber transfusão de sangue com fenótipo

Fyb(+), sem risco de desenvolver aloimunização, isto é, produzir anticorpos anti-

Fyb.

O significado biológico do DARC nos eritrócitos inicialmente pareceu

questionável, devido à falta de associação entre doenças e fenótipo Duffy negativo

(PODO, 2000). Porém, vários trabalhos descrevem a freqüência dos polimorfismos

eritrocitários que conferem parcial ou completa resistência à malária em

populações amazônicas, como o grupo sanguíneo Duffy negativo (NOVARETTI et

31

al., 2000; CAVASINI et al., 2001, 2006, 2007b). Este é um campo de investigação

de suscetibilidade genética à infecção, com importantes implicações, tanto para a

compreensão da patogênese como para o controle da malária.

O Sistema Sangüíneo Duffy tem sido alvo de pesquisas pelo particular

interesse fisiológico a ele relacionado, sendo considerado um dos mais

interessantes loci cromossômicos para avaliar o impacto da pressão de seleção

natural em diferentes regiões geográficas (Hamblin et al., 2002).

Portanto, estes dados confirmam a importância de se estudar a população

amazonense, pois permite obter dados das freqüências alélicas existentes, avaliar

se a população está em equilíbrio genético, com base na Lei de Hardy - Weinberg

e ainda colaborar com demais estudos relacionados à transmissão da malária na

Amazônia. Este foi o foco deste trabalho.

32

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

- O Objetivo geral do trabalho foi analisar a ocorrência de genótipos e

fenótipos do sistema de grupo sangüíneo Duffy em indivíduos de uma

população exposta à infecção por Plasmodium vivax na Amazônia.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Determinar a freqüência genotípica e fenotípica Duffy;

- Comparar a ocorrência dos alelos Duffy e a susceptibilidade à infecção

por Plasmodium vivax;

- Avaliar o percentual de concordância dos genótipos e fenótipos Duffy;

- Definir se a população estudada está em equilíbrio gênico de acordo com

a Lei de Hardy - Weimberg.

33

3 MATERIAL E MÉTODOS

O protocolo de pesquisa foi submetido à análise do Comitê de Ética em

Pesquisa com Seres Humanos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

(CEP-INPA), em 06/06/2006, sob o número do processo 046/2006 CEP-INPA, e

aprovado por unanimidade em 19/06/2006, conforme Parecer Consubstanciado e

Ofício 023/2006 - CEP/INPA (anexo A).

3.1 LOCALIDADE DE ESTUDO

Com base nos dados de positividade da malária em 2005, para o Estado do

Amazonas, do SIVEP– Malária da SVS, o município de Presidente Figueiredo/AM,

apresentou no período de 01/01/05 à 31/12/05, um total de 9.351 notificações,

representando 4,12% do total de casos de malária no Amazonas. Esta localidade,

o quarto município com o maior número de notificações de positividade para

malária no ano de 2005, depois de Manaus (64.238), Careiro (17.009) e Rio Preto

da Eva (10.144), sendo por isso selecionado para as coletas das amostras deste

estudo. A Unidade Mista Hospitalar Gama e Silva (UMHGS) de Presidente

Figueiredo, foi o ponto de coleta de dados e amostra de sangue deste projeto,

denominada “Instituição Sediadora”.

O município de Presidente Figueiredo está localizado, aproximadamente, a

100 Km da cidade de Manaus na BR 174, conforme mostra a figura 7.

34

Figura 7. Mapa mostrando a localização (seta) do município de Presidente Figueiredo - AM. Disponível em: <http://maps.google.com> Acessado em 10 de outubro de 2007.

A amostragem para estudo foi composta por dois grupos – infectados e

negativos. No grupo de Infectados incluímos os casos positivos para P. vivax,

enquanto que no outro grupo participaram pacientes negativos para P. vivax.

O tamanho da amostra foi calculado estimando-se a proporção média de

pacientes infectados no período de janeiro de 2004 até março de 2007, de acordo

com dados do SIVEP Malária da SVS. Levando-se em conta que esta proporção

média de pacientes infectados com P. vivax, no período considerado, foi de

aproximadamente 0,146, fixamos uma precisão de 0,045 (4,5%) e um nível de

confiança de 95% (HENRY, 1998).

Aplicando a fórmula abaixo (CALLEGARI-JACQUES & SIDIA, 2003),

encontramos um tamanho mínimo de amostra (n*) igual a 232,66.

V(p) = (d÷z)2 = (0,045÷1,96)2 = 0,000527

n* = p×q÷V(p) = 0,146×0,856875÷0,000527 = 232,66

35

Onde:

p= 0,146 (prevalência média no período)

q= 1-p = 0,856875

d= 0,45 (precisão)

z= 1,96 (nível de confiança de 95%)

Sobre o valor encontrado, que define o tamanho de amostra mínima (n*),

foi feita uma correção para uma população finita (N) e, desta forma, obtivemos o

valor exato de 232 para o “n”, como segue:

n = n*÷ (1+ n*÷N) = 232,66÷ (1+ 232,6591÷104285) = 232

Determinamos, ainda, uma correção para uma perda potencial de 5%.

Assim, chegou-se a um valor final para o tamanho da amostra (nf) de 244,

conforme o cálculo abaixo:

nf = n ÷ 0,95 = 244

Desta forma, ficou caracterizada uma amostragem por demanda

espontânea, com um tamanho amostral (n) de 244.

3.1.1 Critérios de inclusão da amostra

Pacientes nascidos no Estado do Amazonas, maiores de 18 anos, de ambos

os sexos, atendidos no Laboratório da UMHGS, com ou sem sintomatologia

compatível para Malária e que concordaram em assinar o Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido - TCLE (apêndice A).

A amostra para o grupo de infectados positivo foi composta de pacientes

com os critérios de inclusão e com teste da gota espessa positiva para o P. vivax e

o grupo negativo, de pacientes com os critérios de inclusão e com teste da gota

espessa negativa para o P. vivax.

36

3.1.2 Critérios de exclusão da amostra

Foram excluídos da pesquisa os pacientes que não atenderam os critérios

de inclusão: pessoas que não concordaram em assinar o TCLE, os menores de 18

anos e os não naturais do Amazonas.

3. 2 COLETAS DAS AMOSTRAS

A cada participante foram explicados os objetivos do estudo, os

procedimentos a serem realizados, a duração estimada do projeto, bem como a

possibilidade de sair do estudo a qualquer tempo sem nenhum tipo de penalidade

ou alteração no nível de atendimento de saúde recebido no município.

Foi solicitado aos participantes do projeto, na condição de objeto da

pesquisa, que assinassem o TCLE e respondessem ao questionário (apêndice B)

antes da coleta da amostra de sangue.

Coletamos 5 mL de sangue total venoso com anticoagulante EDTA 5%

(ácido etilenodiaminotetracético) dos pacientes que procuram o hospital com

suspeita de malária. Esta amostra foi acondicionada em refrigeração (2-8°C) até o

momento da fenotipagem e extração do DNA (ácido desoxirribonucléico), não

excedendo 3 dias.

3.3 O EXAME PARA PESQUISA DE PLASMÓDIO

O exame da Gota espessa para o diagnóstico de malária foi realizado no

Laboratório de Análises Clínicas da Unidade Mista Hospitalar Gama e Silva

(UMHGS), que participa do “Programa Nacional de Controle de Qualidade de

Diagnóstico de Malária”. Este programa inclui um sistema de controle e revisão das

lâminas, onde o laboratório de base, aquele realiza o diagnóstico da malária envia

ao laboratório de revisão 100% das lâminas positivas e 10% das negativas. Este

laboratório de revisão, após reavaliá-las, envia 30% das lâminas positivas e 10%

das negativas para o Laboratório Central (LACEN) em Manaus/AM (MS, 2004). No

37

município de Presidente Figueiredo, ambos os laboratórios, de base e revisão,

estão localizados na UMHGS.

Os programas de prevenção e controle de malária usam um índice

conhecido como índice Kappa, que é um indicador do controle de qualidade. Este

índice mede a concordância entre técnicas ou microscopistas levando em

consideração a probabilidade de se obter acordos simplesmente por acaso

(FLEISS, 1981). Em área endêmica espera-se uma concordância por índice Kappa,

superior a 0,8 (MS, 2005). A UMHGS esteve com seu índice Kappa dentro dos

valores esperados durante o período de coleta das amostras deste trabalho.

A Gota espessa continua sendo o padrão ouro para o diagnóstico da

malária. Sendo o método adotado oficialmente no Brasil para o diagnóstico da

doença. A técnica baseia-se na visualização do parasita através da microscopia

ótica, após a coloração com corante vital (azul de metileno e Giemsa). Desta

forma, permite a diferenciação específica dos parasitos a partir da análise da sua

morfologia e pelos seus estágios de desenvolvimento, encontrados no sangue

periférico. Essa metodologia é capaz de detectar densidades parasitárias muito

baixas, de 10 até 20 parasitas/μL de sangue e está descrita no Manual de

Diagnóstico Laboratorial da Malária (MDLM) da SVS do MS (MS, 2005).

Uma amostra de sangue (1μL aproximadamente) foi coletada diretamente

por punção digital (figura 8) e a lâmina foi corada após a amostra estar totalmente

seca. Para a secagem, as lâminas foram mantidas a temperatura ambiente por 10

minutos.

De acordo com MDLM, uma gota espessa adequada deve ter de 1 a 1,5 cm2

de superfície, que equivale, aproximadamente, de 500 a 800 campos

microscópicos, quando se trabalha com aumento de 700 a 800 vezes. Nesse caso,

é encontrada uma média de 10 a 20 leucócitos por campo (MS, 2005).

A parasitemia foi determinada analisando-se 100 campos microscópicos,

conforme descrito a seguir: +/2: 40 a 60 parasitos contados nos 100 campos; +: 1

parasito por campo; ++: de 2 a 20 parasitos por campo; +++: de 21 a 200 parasitos

por campo; ++++: mais de 200 parasitos por campo. Quando houve uma

parasitemia menor de 40 parasitos por campo, os resultados foram expressos pelo

número de parasitos contados nos 100 campos (MS, 2005).

38

Figura 8. Esquema demonstrativo da punção digital para coleta de sangue para confecção da gota espessa. Etapas: 1. Limpar o local de punção com álcool 70%, 2. Puncionar o local com uma lanceta, 3. Colocar uma gota esférica de sangue sobre a lâmina, 4. Espalhar o sangue formando um retângulo (1,2cm2). MDLM. MS, 2005.

3.3.1 Preparo de corantes e diluentes

Azul de metileno fosfatado

Azul de metileno medicinal em pó ...........................1,0g

Fosfato de potássio monobásico .............................1,0g

Fosfato de sódio bibásico ........................................3,0g

Misturar em gral seco.

Preparo da solução fosfatada de azul de metileno:

Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 250mL de água destilada.

Conservar a solução em pisseta (frasco plástico de lavagem).

39

Mistura de sais fosfatados para água tamponada

Fosfato de potássio monobásico ............................. 4,0g

Fosfato de sódio bibásico ........................................ 6,0g

Misturar em gral seco.

Preparo da água tamponada a 6/4:

Pesar 1,0g da mistura de sais fosfatados, acima descrita, e dissolver

em 1000mL de água destilada. Conservar a solução em pisseta.

Solução alcoólica de Giemsa

Giemsa em pó ...................................................... 0,75g

Glicerol PA ............................................................. 35mL

Álcool metílico PA .................................................. 65mL

Preparo da solução de Giemsa:

Colocar a solução num frasco com algumas pérolas de vidro e agitar várias

vezes ao dia, até obter a homogeneização (aproximadamente sete dias). Esta

solução deve ser feita em maior volume e mantida em estoque. Para o uso diário, a

solução alcoólica deve ser colocada em frasco pequeno, tipo conta-gotas.

3.3. 2 Coloração pela técnica de Walker Segundo o MDLM, a gota espessa é corada pela técnica de Walker (azul de

metileno e Giemsa) que permite identificar, com facilidade e precisão, a espécie do

plasmódio. Esse método possibilita também quantificar a intensidade do

parasitismo, mediante a determinação da parasitemia por volume (μL). Os

materiais necessários para a coloração são: placa de acrílico; pisseta com solução

40

fosfatada de azul de metileno; frasco conta-gotas contendo solução alcoólica de

Giemsa e uma pisseta com água tamponada

A técnica de Walker, para coloração da gota espessa, inclui duas fases:

1ª fase: Desemoglobinização pela solução hipotônica de azul de metileno

fosfatado

• Aplicar a solução de azul de metileno fosfatado sobre a gota espessa de sangue,

por dois segundos.

• Enxaguar a lâmina com água tamponada (suavemente).

2ª fase: Coloração pela solução de Giemsa

• Colocar a lâmina com o lado da gota voltado para a superfície da placa de

coloração.

• Preparar uma solução de Giemsa na proporção de uma gota de corante (50 μL de

Giemsa) para 1mL de água tamponada. Homogeneizar.

• Aplicar esta solução na placa côncava de coloração, sob a lâmina invertida.

• Deixar corar por 10 minutos.

• Enxaguar com água tamponada (suavemente).

• Secar em temperatura ambiente.

3.4 FENÓTIPO DUFFY

A metodologia da fenotipagem Duffy foi utilizada com o objetivo de pesquisar

a proteína Duffy expressa na membrana externa dos eritrócitos coletados dos

participantes. Este dado foi utilizado para confrontar fenótipo e genótipo e avaliar o

percentual de concordância entre eles.

Observar item 3.3.1 (Preparo de corantes e diluentes)

41

As amostras de sangue foram submetidas à fenotipagem pelo teste de

hemaglutinação, em cartões de gel (LAPIERRE et al., 1990), de acordo com as

especificações descritas pelo fabricante. Os ID-Cartões “Fya” e “Fyb”, juntamente

com os ID-Soros-Teste “anti-Fya” e “anti-Fyb” (figura 9), foram utilizados para

determinação dos antígenos Fya (Fy1) e Fyb (Fy2). A metodologia “Micro Typing

System (BI007270 03.06)” é descrita pela DiaMed-ID, fornecedora dos reagentes.

Figura 9. Reagentes usados para fenotipagem: ID-Cartões “Fya” e “Fyb”, e ID-Soros-Teste “anti-Fya” e “anti-Fyb” (DiaMed).

Preparamos uma suspensão de hemácias a 0,8% em ID-Diluente 2

(DiaMed-ID) e, desta, pipetamos 50uL para o microtubo do Card-ID Fya e Card-ID

Fyb (DiaMed-ID), adicionamos ainda 50uL de soro teste ID correspondente. O

Card-ID foi incubado por 15 minutos a 37°C no ID-Incubador. Após esta etapa,

centrifugamos os cartões durante 10 minutos no ID-Centrifuge (1030 rpm) e

analisamos os resultados da seguinte forma :

O teste é positivo quando os eritrócitos aglutinados formam uma linha

vermelha sobre a superfície ou aglutinados dispersos no gel. A reação é negativa

quando um botão compacto de eritrócitos é mostrado no fundo do microtubo (figura

10).

42

Reações positivas de + a +++ indicam a presença do antígeno

correspondente. Reações fortemente positivas (++++) são raras, e as negativas

indicam ausência do antígeno.

Figura 10. Cartão de gel mostrando a interpretação da reação positiva (aglutinados dispersos no gel) e negativa (botão compacto no fundo do microtubo) da fenotipagem. Amostra 133 fenotipada como Fyab: Fya(2+) Fyb(1+); 136 - Fya: Fya(1+) Fyb(-) e 29 - Fy nulo: Fya(-) Fyb(-).

3.5 GENÓTIPO DUFFY

A metodologia molecular, descrita anteriormente por Olsson et al. (1998), foi

aplicada neste estudo para genotipar o Sistema Sanguíneo Duffy. Constitui-se em

um método simples e rápido que possibilita identificar quatro possíveis alelos do

lócus FY, através da técnica de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR), sem a

utilização de enzimas de restrição.

43

3.5.1- Extração do DNA genômico dos leucócitos

O material utilizado para a extração do DNA foi sangue total (350 µL),

coletado dos participantes. A extração foi feita à medida que as coletas foram

sendo realizadas e o produto extraído estocado a -20°C, por aproximadamente seis

meses, para o uso posterior. Para a extração do DNA foi utilizado o kit Easy-DNA

(cat. no. K180001), da Invitrogen®, protocolo 2 (figura 11). Segundo o protocolo

cada 10 µL de sangue total fornece um rendimento de 20-30 ng de DNA, O

sedimento foi eluído com 150 µL de água deionizada conforme o protocolo.

Figura 11. Esquema mostrando etapas da extração de DNA pelo Easy- DNATM Kit

44

3.5.2 - Quantificação e pureza do DNA

As concentrações e purezas de DNA foram estimadas através de análise

espectrofotométrica em comprimento de onda ultravioleta (A260nm/A280nm), como

preconizado por Sambrook & Russel (2001). A leitura espectrofotométrica em 260

nm foi usada para quantificar do DNA extraído, isto é, determinar sua concentração

(1D.O. = 50 µg de DNA dupla fita/µL). Enquanto, a razão entre as absorbâncias foi

usada para avaliar a pureza do ácido nucléico.

Foram utilizadas extrações de DNA que apresentaram um grau de pureza

maior ou igual a 1,6 e menor ou igual a 1,8. Todas as amostras (sedimentos

eluídos) foram quantificadas e re-diluídas com água deionizada à mesma

concentração (10 ng/µL).

3.5.3- Reação de Polimerização em Cadeia

A Reação de Polimerização em Cadeia (PCR, - inglês “polymerase chain

reaction”.) é uma técnica de biologia molecular na qual são empregadas pequenas

seqüências de oligonucleotídeos, denominados iniciadores. Estes em condições

ideais de temperatura e substratos, como o DNA - alvo, os quatro

desoxinucleotídeos e a enzima DNA polimerase, amplificam, em magnitude

exponencial, o gene de interesse. Utilizando o equipamento de termociclagem, que

reproduz os ciclos programados de temperatura, e a reação acontece. Por

eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida os seus produtos podem ser

visualizados como bandas.

Para a amplificação dos alelos FYA, FYB, FY e FYAnulo, usamos os

seguintes iniciadores: GATAFY2, FYAB2, FYAREV e FYBREV, as seqüências

destes são mostradas na tabela 2.

Tabela 2 - Seqüência e Tm calculada dos iniciadores específicos utilizados na PCR.

PRIMER Seqüência de nucleotídeos 5’ → 3’ Tm (°C)

GATAFY2 CTCATTAGTCCTTGGCTCTTAC 64

FYAB2 CTCATTAGTCCTTGGCTCTTAT 62

FYAREV AGCTGCTTCCAGGTTGGCAC 64

FYBREV AGCTGCTTCCAGGTTGGCAT 66

FONTE: Olsson et al. (1998)

45

Quatro reações foram preparadas para cada indivíduo, usando a seguinte

combinação de iniciadores: GATAFY2 e FYAREV (A), GATAFY2 e FYBREV (B),

FYAB2 e FYAREV (C), e FYAB2 e FYBREV (D). O primeiro par de

oligonucleotídeos (A) amplifica o alelo FYAnulo (FYA com mutação Gata-box), e as

demais combinações amplificam os alelos FY (FYB com mutação Gata-box), FYA e

FYB, respectivamente (tabela 3).

Tabela 3 - Combinação de iniciadores para detecção de quatro alelos Duffy e o tamanho em pares de bases do produto de cada amplificação.

COMBINAÇÃO Iniciador For Iniciador Ver ALELO

DETECTADO TAMANHO

pb

A GATAFY2 FYAREV FYAnulo 711

B GATAFY2 FYBREV FY 711

C FYAB2 FYAREV FYA 711

D FYAB2 FYBREV FYB 711

FONTE: Olsson et al. (1998)

As temperaturas de anelamento das combinações foram estabelecidas

através da técnica de gradiente, com base no cálculo da temperatura média de

fusão (Tm, - do inglês: “melting temperature”), cujo objetivo foi de eliminar bandas

inespecíficas. Essa técnica consiste em submeter iguais misturas reacionais a

diferentes temperaturas, tendo como temperatura média a Tm calculada para cada

iniciador.

A Tm é a temperatura na qual 50% do DNA se encontra desnaturado, e foi

calculada através da fórmula de Wallace (onde A, T, G e C são as quantidades de

cada base que compõe o iniciador):

Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)

A tabela 2 mostra o valor da Tm calculada pela fórmula de Wallace para

cada oligonucleotídeo. O valor da Tm de uma molécula de DNA ou fragmento

(iniciador) aumenta cerca de 0,4°C cada vez que a quantidade do par de bases

nitrogenadas guanina-citosina (GC) aumenta 1%. Assim, cada molécula de DNA

possui uma Tm característica que depende principalmente da proporção de bases

GC. Uma vez que a energia necessária para abrir a fita de DNA, que contém

46

grande quantidade de GC é maior, pois entre as bases GC existem três ligações de

hidrogênios, enquanto que no par adenina-timina (AT) são duas ligações de

hidrogênio.

O termociclador Mastercycler gradient Eppendorff®, possui função

“gradiente”, que permite que cada coluna de seu termobloco gere e mantenha uma

temperatura própria, independente das demais.

A técnica de gradiente foi realizada inserindo uma temperatura central de 64

ºC, para uma função gradiente de G ±3, ou seja, o termociclador distribuiu entre as

doze colunas do termobloco um espectro de temperatura correspondente a 3ºC

acima e 3ºC abaixo da temperatura central programada. A temperatura calculada,

pelo termociclador, para cada uma das colunas se encontra descrita na tabela 4.

Tabela 4 - Valores de temperatura (em ºC) para cada uma das doze colunas, baseado no cálculo, pelo termociclador, da função gradiente de G ±3 para uma temperatura central de 64ºC para as combinações A, B, C e D.

Coluna Temperatura

ºC

Coluna Temperatura

ºC

Coluna Temperatura

ºC

TA1 61,2 TA5 63,3 TA9 65,3

TA2 61,8 TA6 63,7 TA10 65,7

TA3 62,2 TA7 64,2 TA11 66,2

TA4 62,8 TA8 64,8 TA12 66.8

Foram preparadas dez reações de PCR da mesma amostra para ser testada

em cada combinação (A, B,C e D) . Posteriormente os produtos foram analisados

em eletroforese de agarose a 1,2%. Dessa forma, foi possível determinar a s

temperaturas de anelamento ideal para cada combinação de iniciadores usados

para genotipar o Sistema de grupo sanguíneo Duffy.

As amostras usadas na técnica de gradiente foram escolhidas com base na

fenotipagem, isto é, para testar a combinação C foi usada uma amostra fenotipada

como Fya, pois esta combinação amplifica o antígeno Fya. Da mesma forma foi

realizado com as demais combinações.

47

Após determinar as temperaturas de anelamento ideais para cada

combinação (A, B, C e D), as amplificações das 244 amostras coletadas foram

realizadas conforme descrito a seguir:

Para cada combinação foram acrescentados controles negativos,

constituídos da mistura de reagentes e água deionizada em substituição ao DNA.

O controle positivo foi constituído de uma amostra previamente fenotipada como

Fyab e confirmada pela genotipagem como sendo FYAFYB para as combinações

C e D. No caso da combinação B, o controle positivo foi uma amostra fenotipada e

genotipada anteriormente como Fy nulo.

Cada uma das 244 amostras foram testadas para as quatros combinações

(A, B, C e D), conforme apresentado na tabela 3, em volume final de 10µL.

Portanto, foram preparadas quatro misturas diferentes de reagentes, nas mesmas

proporções. Para cada combinação foi feita uma mistura, pois o par de iniciadores

era diferente para cada uma delas. Essa mistura era constituída de: 5 µL de DNA

alvo (50 ng), 0,1 µL (0,2 µM) de cada iniciador (For e Rev, do inglês: “Forwed e

Reversed”), 0,2 µL (0,2 mM) de dNTP mix (Promega, USA), 0,4 µL (2 mM) de

MgCl2 e 0,1 µL (0,5 U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen®), 1 µL (1x) do tampão

da enzima (Invitrogen), e água deionizada para completar o volume reacional de 10

µL (tabela 5).

Tabela 5 – Concentrações e respectivos valores de reagentes usados na PCR.

Reagentes concentração estoque

Concentração final na reação

Volume do tubo da reação (µL)

Buffer 10X 1X 1,0 dNTP mix 10mM 0.2 mM 0,2 MgCl2 50mM 2 mM 0,4 Iniciador For 20µM 0,2 µM 0,1 Iniciador Rev 20µM 0,2 µM 0,1

DNA polimerase 5U/µL 0,5 U 0,1 DNA alvo 10ng/µL 50 ng 5,0 Água deionizada (H2O) q.s.p. 10 µL 3,1

TOTAL 10µL

FONTE: Olsson et al. (1998)

A etapa de amplificação para as combinações A, C e D da PCR foi realizada

no equipamento Mastercycler gradient da Eppendorff®, sob as seguintes

48

condições: 96°C/4min; 10 ciclos de 94°C/20seg, 66°/1,5min; seguida de 20 ciclos

de 94°C/20seg, 64,8°C/30seg e 72°C/1min; e 72°/5min. Para a combinação B, as

condições da PCR foram as seguintes: 96°C/4min; 10 ciclos de 94°C/20seg,

66°/1,5min; seguida de 20 ciclos de 94°C/20seg, 65,3°C/30seg e 72°C/1min; e

72°/5min.

De posse dos produtos das amplificações, seguimos para a etapa da

eletroforese para visualizarmos as bandas.

3.5.4 - Eletroforese de DNA em gel de agarose

O gel de agarose (Ultra Purê Agarose-Invitrogen) foi preparado a 1,2 % em

Tampão TAE 1x (Tris-Acetato 40 mM, Ac. Acético 20 mM, EDTA 1 mM) fundido em

microondas. Esperava-se que a temperatura da solução diminuísse para 55°C e

então era vertida no suporte da cuba com pente apropriado para conter o volume

apropriado (figura 12). O gel não foi preparado com brometo de etídio (BrEt), pois o

corante de corrida utilizado (EnVISIONTM DNA Dye as Loading Buffer da

AMRESCO) dispensa o uso deste.

Figura 12. Fotografia mostrando o preparo do gel de agarose a 1,2 %.

49

Após a polimerização (cerca de 30 min), a cuba era preenchida com tampão

TAE 1X. Os produtos da PCR foram aplicados no gel conforme demonstrado na

Figura 13, após homogeneização de 3 µL do produto da PCR com 2 µL do corante

de corrida (EnVISIONTM DNA Dye as Loading Buffer da AMRESCO). Foi utilizado

DNA ladder como marcador de peso molecular (100 pb). A eletroforese era

realizada a uma voltagem de 30 a 80 V, de acordo com o tempo de corrida.

Figura 13. Esquema mostrando a aplicação do produto da PCR e corante no gel.

A banda de 711bp correspondente ao produto amplificado foi visualizada no

gel através de um transluminador de Ultravioleta (UV). Os resultados foram

fotografados e armazenados em disquetes pelo equipamento Vilber Lourmat.

A reação negativa é definida pela ausência do fragmento de 711 bp e a

positividade pela presença da banda (711 bp) em gel de agarose (1,2%) sob

radiação UV. Em pacientes homozigotos, que possuem apenas um tipo de alelo

em dose dupla, visualizamos apenas uma banda em uma das quatro combinações,

enquanto que para heterozigotos, que possuem dois alelos diferentes, observamos

bandas de 711 bp em duas das quatro combinações, após a eletroforese.

As figuras 14 e 15 mostra a interpretação dos seis possíveis genótipos

detectáveis pela técnica aplicada, exceto os genótipos formados pelo alelo FYAnulo.

Produto da PCR + Corante

50

Figura 14. Interpretação dos genótipos FYAFYA, FYAFY e FYAFYB , em gel agarose a 1,2 %, detectados pela técnica de genotipagem do Sistema Duffy. Onde: PM (peso molecular de 100 pb), CN (controle negativo), A B C D (combinações).

Figura 15. . Interpretação dos genótipos FYBFYB, FYAFY e FYFY , em gel agarose a 1,2%, detectados pela técnica de genotipagem do Sistema Duffy. Onde: PM (peso molecular de 100pb), CN (controle negativo), A B C D (combinações). 3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos neste estudo foram analisados no programa Epi Info

3.4.3 (de 11/2007). As comparações entre freqüência genotípicas e fenotípicas

foram realizadas com base no teste qui - quadrado (X2) de Pearson, utilizando um

nível de significância de 5%. Considerou-se uma diferença significativa quando o p-

valor (P) foi menor que o nível de significância (P< α).

PM CN A B C D A B C D B A C D

FYAFYA FYAFY FYAFYB

PM CN A B C D A B C D B A C D

FYBFYB FYBFY FYFY

600 pb

600 pb

2000 pb

2000 pb

711 pb

711 pb

51

Esta pesquisa analisou quatro alelos do Sistema de Grupo Sanguíneo Duffy,

e foram encontrados apenas três deles (FYA, FYB e FY). Assim passamos a

considerar, para efeitos de análise estatística, um caso de Trialelismo Autossômico

com Dominância e Recessividade, onde um dos alelos (FY) se manifesta apenas

em homozigose. Os alelos FYA e FYB mantêm uma relação de co-dominância

entre si, de modo que os heterozigotos FYAFYB são responsáveis pelo grupo

sanguíneo Fyab. Esses dois alelos apresentam relação de dominância sobre o

alelo FY. Por isso, indivíduos homozigotos FYAFYA ou os heterozigotos FYAFY

apresentam o grupo sanguíneo Fya, da mesma forma acontece para o alelo FYB.

No caso do grupo sanguíneo Fy nulo, os indivíduos homozigotos são do genótipo

FYFY.

Partindo do exposto, foi utilizado o método proposto por Bernstein

(CABELLO & KRIEGER, 1997), para estimar as freqüências populacionais dos

alelos aqui pesquisados a partir do conhecimento da distribuição fenotípica Duffy.

No método de Bernstein parte-se do princípio de que a população está em

equilíbrio genético, de acordo com Hardy - Weimberg. Após a análise, é que

verificamos se a distribuição dos fenótipos na amostra estudada está de acordo

com a hipótese genética, isto é, se a amostra representa, realmente, uma

população em equilíbrio de Hardy - Weimberg, usando o teste qui-quadrado de

Pearson, ao nível de 5% de significância (CABELLO & KRIEGER, 1997).

52

4 RESULTADOS

4.1 AMOSTRAGEM

As amostras que originaram os dados deste trabalho foram obtidas

integralmente por demanda espontânea de pacientes, com sintomas compatíveis

com malária, que procuraram os serviços de diagnóstico na Unidade Mista

Hospitalar do município de Presidente Figueiredo no Amazonas. A amostragem foi

obtida no período de novembro de 2006 a junho de 2007 e a média etária dos

pacientes atendidos foi de 32 anos .

Considerando todos os pacientes que procuraram o hospital, e aceitaram

participar da pesquisa, totalizaram 244 indivíduos.

4.2 GOTA ESPESSA

Do total de indivíduos pesquisados, 80 foram diagnosticados como positivos

para P. vivax (32,79%) e 164 tiveram resultados negativos na gota espessa

(67,21%), conforme demonstrado no gráfico da Figura 16.

A análise das gotas espessas dos 80 indivíduos infectados por P. vivax,

demonstraram uma parasitemia média de 1 parasito por campo (+), após

observação de 100 campos microscópicos.

53

Negativos

67,21%

Infectados por

P. vivax

32,79%

Figura 16. Representação gráfica da positividade da Gota Espessa em 244 indivíduos de Presidente Figueiredo, Amazonas, 2006-2007.

4.3 FENOTIPAGEM DUFFY

Os resultados dos testes sorológicos, que pesquisaram a proteína Duffy na

membrana das hemácias coletadas dos 244 participantes através de

hemaglutinação, são mostrados na Tabela 6. Os fenótipos Duffy em ordem

decrescente de prevalência são: Fyab (36,07%), Fya (34,43%), Fyb (27,05%) e Fy

nulo (2,46%). Analisando os indivíduos com reação positiva para o antígeno Fyb

(n=154), a maioria, 56% foi reativo (1+), 34 % apresentou positividade de (2+) e

apenas 10% reagiram (3+). Reações fortemente positivas (4+) não foram

encontradas.

Tabela 6 - Freqüência fenotípicas Duffy de 244 indivíduos em Presidente Figueiredo, Amazonas, 2006-2007.

FENÓTIPO QUANTIDADE FREQÜÊNCIA %

Fya 84 34,43

Fyb 66 27,05

Fyab 88 36,07

Fy nulo 6 2,46

Total 244 100,00

54

4.4 TÉCNICA DE GRADIENTE

A técnica de gradiente foi realizada com o objetivo de padronização da

Temperatura de Anelamento (Ta) de cada par de iniciadores, isto é , determinar

uma temperatura de anelamento ideal para cada combinação para diminuir a

inespecificidade das bandas. A figura 17 mostra um gel de agarose contendo os

produtos amplificados usando a técnica de gradiente para a combinação (mix) C.

Figura 17: Eletroforese da padronização da temperatura de anelamento do Mix C. ONDE: PM (peso molecular 100pb), CNC (controle negativo Mix C), TA6 a TA12 (temperaturas anelamentos: 63,7; 64,2; 64,8; 65,3; 65,7; 66,2; 66,8)

A banda da coluna TA8, correspondente a temperatura 64,8°C apresentou

melhor qualidade e ausência de inespecificidade. Portanto, foi estabelecida como

temperatura de anelamento ideal para a combinação C.

Esse experimento foi repetido para cada uma das quatros combinações (A,

B, C e D) e a temperatura de 64,8°C foi determinada para combinações A, C e D.

Sendo que para a combinação B, a temperatura de anelamento de escolha foi

65,3°C.

Portanto, foram feitas adaptações nas concentrações da mistura e nas

temperaturas da PCR, descrita originalmente, para padronizar a técnica às

condições do nosso laboratório, sem que essas alterações interferissem na

interpretação dos resultados, apenas com o objetivo de aumentar a qualidade e

especificidade dos mesmos.

TA 8 = 64,8°C

PM CNC TA6 TA7 TA8 TA9 TA10 TA11 TA12

55

4.5 GENOTIPAGEM DUFFY

A Figura 18 mostra um gel de agarose a 1,2%, ilustrativo, de 16 das 244

amostras testadas, com a combinação D que detecta o alelo FYB, pela técnica de

genotipagem descrita por Olsson et al. (1998). E na figura 19 aparecem 15

amostras testadas, com a combinação B que detecta o alelo FY.

Figura 18. Gel de agarose a 1,2% de 16 das 244 amostras testadas, com a combinação D, pela técnica de genotipagem Duffy. Onde: PM (peso molecular de 100 pb), CN (controle negativo), CP (controle positivo), sendo 14 amostras positivas (711pb) e 2 negativas.

Figura 19. Gel de agarose a 1,2% de 15 das 244 amostras testadas, com a combinação B, pela técnica de genotipagem Duffy. Onde: PM (peso molecular de 100 pb) , CN ( controle negativo) , CP (controle positivo), sendo 6 amostras positivas (711pb) e 9 negativas.

600 pb

1500 pb 2000 pb

PM CN CP 100 101 102 103 104 113 112 122 127 128 129 133 134 135 136 139

08 09 10 11 12 13 21 22 23 24 25 26 27 28 CP CN 29 PM

600 pb

1500 pb 2000 pb

711 pb

711 pb

56

A genotipagem dos alelos FYA, FYB, FY e FYAnulo, descrita por Olsson et al.

(1998), usada neste trabalho para genotipar os 244 indivíduos de uma área

endêmica para malária no Amazonas, forneceu os dados de freqüência dos

genótipos e dos fenótipos, deduzidos a partir dos alelos encontrados, que estão na

Tabela 7.

Tabela 7 - Freqüência dos genótipos e fenótipos Duffy deduzidos de 244 indivíduos em Presidente Figueiredo, Amazonas, 2006-2007.

FENÓTIPO DEDUZIDO GENÓTIPO N.O FREQÜÊNCIA %

Fy (a+b-) FYAFYA ou FYAFY 56 23,0

Fy (a-b+) FYBFYB ou FYBFY 66 27,0

Fy (a+b+) FYAFYB 116 47,5

Fy (a-b-) ou Fy nulo FYFY 6 2,5

Total 244 100,00

Os achados mostram uma alta freqüência do genótipo FYAFYB (0,475),

seguido por FYBFY (0,156); FYAFYA (0,143); FYBFYB (0,115); FYAFY (0,086) e

com uma freqüência de 0,025 (2,5%) encontramos o genótipo FYFY. Neste caso, a

freqüência dos alelos FYA, FYB e FY foi respectivamente 45,6%, 42% e 12,4%.

Não foi encontrado nenhuma ocorrência para o alelo FYAnulo , associado à

ausência de expressão do antígeno Fya nas hemácias, nos 244 indivíduos

testados.

Os fenótipos Duffy, deduzido a partir dos alelos encontrados, em ordem

decrescente de prevalência são: Fyab (47,5%), Fyb (27%), Fya (23%) e Fynulo

(2,5%). A diferença nas ordens de prevalência dos fenótipos Duffy (tabelas 5 e 6)

caracteriza uma discrepância de resultados, obtidos através do emprego de duas

técnicas com metodologias diferentes (sorologia e biologia molecular). Os dados

revelam concordância entre genotipagem e fenotipagem apenas para os fenótipos

Fyb e Fy nulo. Um total de 28 indivíduos fenotipados como Fya (11,5%), na

realidade eram Fyab. A genotipagem revelou a existência do alelo FYB, em

heterozigose com o alelo FYA, deduzindo que esses 28 indivíduos apresentavam o

fenótipo Fyab e não Fya como mostraram os testes sorológicos.

57

4.6 COMPARATIVO ENTRE INFECTADOS E NEGATIVOS

A freqüência dos alelos FYA, FYB e FY foi respectivamente 55%, 38,8% e

6,3% nos pacientes infectados. No grupo negativo, foram de 36,3%, 45,1% e

18,6% (figura 20).

Freqüência alélica do sistema sangüíneo duffy em pacientes

negativos e infectados com P. vivax.

36,3

45,1

18,6

55,0

6,3

38,8

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

FYA FYB FY

Alelos

Fre

qü

ên

cia

alé

lica (

%)

NegativoP.vivax

Figura 20. Representação gráfica da freqüência alélica do Sistema sanguíneo Duffy em pacientes, negativos e infectados por Plasmodium vivax, de Presidente Figueiredo, Amazonas, 2006-2007.

A Tabela 8 compara os resultados dos genótipos e fenótipos deduzidos do

grupo sanguíneo Duffy, bem como as freqüências dos alelos, em 80 indivíduos

infectados por P. vivax e 164 indivíduos negativos.

Nenhum paciente infectado, mas 3,7% dos negativos para malária eram

homozigotos para o alelo FY (FYFY). Este alelo foi significativamente mais

prevalente em pacientes negativos (P< 0,05).

O alelo FYA, em homozigose, é significativamente mais freqüente em

infectados (P = 0,0064), essa diferença é menor quando este está associado ao

alelo FY (P = 0,0593) e para o genótipo FYAFYB não foram observadas diferenças

entre os dois grupos (P > 0,05). O alelo FYB em homozigose não demonstrou

diferença significativa (P> 0,05) no comparativo, infectados e negativos, porém

difere quando está associado ao alelo FY (P < 0,05).

58

59

4.7 EQUILÍBRIO GÊNICO DE HARDY-WEIMBERG

Para os cálculos de equilíbrio genético, considerando os dados obtidos de

freqüência dos fenótipos Duffy em 244 indivíduos de Presidente Figueiredo no

Amazonas, que estão no quadro a baixo:

FENÓTIPO Fy (a+b-) Fy (a-b+) Fy (a+b+) Fy (a-b-)

GENÓTIPO FYAFYA ou

FYAFY

FYBFYB ou

FYBFY

FYAFYB FYFY

N.O 56 66 116 6

% 23 27 47,5 2.5

As freqüências populacionais estimadas p, q e r dos alelos FYA, FYB e FY,

obtidas pelo método de Bernstein, são:

p = 0,431772785

q = 0,468762722

r = 0,099464492

Para verificar se a distribuição, dos fenótipos observados, está de acordo

com a hipótese genética, calculamos o qui-quadrado com um grau de liberdade

porque existem quatro classes fenotípicas (grupos Fya, Fyb, Fyab e Fy nulo) e são

necessárias três informações para calcular os valores esperados (tamanho da

amostra e as freqüências de dois genes.)

Com base no valor do qui-quadrado obtido (11,38), calculou-se a

probabilidade da população estar ou não em equilíbrio (p-valor), usando o

programa Epi Info 3.4.3, e encontramos um p-valor de 0,000742.

p-valor (P) = 0,000742 < 0,05

60

5 DISCUSSÃO

A grande diversidade de distribuição dos determinantes antigênicos Duffy,

nos diversos grupos étnicos, é característica desse sistema de grupo sangüíneo

(JENS et al., 2005). A freqüência dos alelos varia diferentemente em populações

estudadas (NOVARETTI et al., 2000; CAVASINI et al., 2001, 2006, 2007b;

CASTILHO et al., 2004). Pesquisas realizadas em regiões endêmicas de malária

mostraram que ocorrem mecanismos de defesa à infecção do P. vivax,

determinando a ocorrência de fenótipos distintos daqueles esperados (SHIMIZU et

al., 1997, 2000). Os dados de freqüências dos alelos Duffy deste trabalho, variaram

em relação aos descritos na literatura o que deve estar relacionado à presença de

pressão de seleção.

Os resultados obtidos mostraram uma alta freqüência do fenótipo Fyab

(47,5%) entre os 244 indivíduos pesquisados. Esta freqüência fenotípica detectada

assemelha-se às descritas por Cavasini et al. (2006) para Rondônia e Acre, em

que os autores descrevem as freqüências fenotípicas em quatros estados da

Amazônia Brasileira. Os resultados deste estudo, portando, são discordantes para

os estados do Pará e Amapá, uma vez que nessas localidades o fenótipo

predominante foi o Fyb com 33% e 44%, respectivamente.

Embora Cavasini et al. (2001) tenham encontrado 100% de concordância,

este trabalho apresentou 11,5% de discrepâncias entre genotipagem e

fenotipagem, em relação ao antígeno Fyb. Este fato deve-se, supostamente, à

presença do alelo FYX, que devido a sua fraca expressão na membrana da

hemácia não foi detectado pelos anticorpos anti-Fyb usados na técnica de

hemaglutinação. Outro ponto importante, que colabora para esta hipótese do

61

enfraquecimento do antígeno Fyb, foram os resultados da fenotipagem, onde

observou-se que a maioria dos indivíduos apresentou 1+ de positividade e que

reações fortemente positivas não ocorreram. Porém, estudos moleculares com

enzimas de restrição são necessários para determinar este alelo e confirmar a

suspeita da presença do SNP (265C>T/298G>A/145G>T), com vista a esclarecer a

suposta presença deste alelo na região e determinar sua prevalência.

Salienta-se a importância da genotipagem Duffy, em pacientes fenotipados

como Fyb(-), pois permite esclarecer os casos de diminuição na expressão da

proteína Duffy devido a alelos específicos.

Segundo Moulds et al. (1998), o alelo FYA é comum em indivíduos europeus

e orientais e raros em negros africanos. Enquanto que o alelo FYB é mais

freqüente em caucasóides do que em asiáticos e negros. Ambos os alelos não são

raros na população pesquisada neste trabalho. O FYA aparece com 45,5% do total

de indivíduos, seguido do FYB com 42%. Portanto, não houve diferenças

marcantes de ocorrência desses alelos na pesquisa.

O alelo FYA foi prevalente no grupo de pacientes infectados, enquanto que

no grupo negativo o alelo FYB apareceu em maior quantidade. O alelo FYA em

homozigose sugere susceptibilidade à infecção por Pv, (P < 0,05) enquanto que em

heterozigose com o FY essa susceptibilidade é diminuída, pois o alelo FY confere

proteção, como referido anteriormente. Portanto, para o genótipo FYAFY não

existe diferença entre os dois grupos (P > 0,05).

O alelo FYB não demonstrou proteção à infecção quando em homozigose

(FYBFYB), porém o efeito protetor aparece quando este se encontra associado ao

alelo FY (P < 0,05) em indivíduos heterozigotos FYBFY.

Segundo Cavasini et al. (2007b), indivíduos com o genótipo FYAFYB têm

alta susceptibilidade à malária. Os resultados desta pesquisa para este genótipo

(FYAFYB), diferentemente do esperado, não apresentaram diferenças significativas

entre os grupos estudados (P > 0,05). Desta forma, com base na análise

estatística, não é possível sugerir que este genótipo forneça proteção contra a

infecção por P. vivax, conforme descreveram Cavasini et al. (2007b).

O genótipo FYFY não foi encontrado no grupo de pacientes infectados,

coma já era esperado, pois este genótipo apresenta uma resistência à infecção por

P. vivax, descrita anteriormente (MILLER et al., 1976; MOURANT et al., 1976;

WELCH et al., 1977; MATHEUS & ARMSTRONG, 1981; CAVASINI et al., 2001),

62

embora alguns autores tenham relatado a ocorrência de malária por P. vivax em

indivíduos com o alelo FY em homozigose (RYAN et al., 2006; CAVASINI et al.,

2007b). O alelo FY teve sua ocorrência aumentada significativamente no grupo de

pacientes negativos (P < 0,05), demonstrando que essa mutação pontual pode ser

uma seleção vantajosa em populações de área endêmica para o P. vivax.

A maioria dos africanos ocidentais e cerca de 70% dos negros americanos

não expressa os antígenos Fya e Fyb em seus eritrócitos (MOURANT et al., 1976),

isto explica o motivo pelo qual a alta freqüência pré-existente do fenótipo nulo

impediu que a malária, por P. vivax, tornasse endêmica na África ocidental

(LIVINGSTONE, 1984). Observações relatadas no oeste da África e na Etiópia

demonstram uma forte correlação entre a ausência ou diminuição da endemicidade

da malária pelo P. vivax e a alta prevalência do alelo FY (WELCH et al., 1977;

MATHEWS & ARMSTRONG, 1981). No entanto, pesquisas atuais demonstraram

indícios de que o Pv conseguiu infectar 32 crianças com antígenos Duffy negativos

no Quênia (RYAN et al., 2006). Recentemente, no Brasil, outro estudo indicou

evidências de transmissão da malária em dois indivíduos Duffy negativos em Porto

Velho, estado de Rondônia (CAVASINI et al., 2007a).

Foi observada também uma redução na ocorrência do alelo FY em

heterozigose nos indivíduos infectados, como descreveram anteriormente

Kasehagen et al. (2007). Este dado sugere redução na susceptibilidade à infecção

por Pv em heterozigotos (FYAFY e FYBFY). A explicação para essa observação

está descrita num estudo de MICHON et al. (2001) com indivíduos heterozigotos

para o alelo FY, em Papua New Guinea (PNG). Os autores descobriram que as

hemácias desses indivíduos expressavam 50% menos antígenos Duffy,

acarretando uma diminuição da aderência da proteína Duffy ao seu ligante no

Plasmodium vivax, uma proteína chamada DBP (DBP, do inglês: “Duffy binding

protein”).

Embora existam relatos da presença do alelo FYAnulo na Amazônia (LANGUI

JÚNIOR et al., 2004), não foi encontrada nenhuma ocorrência deste alelo no

estudo, concordando com os achados prévios de Cavasini et al. (2001).

Com base nos conceitos de freqüência gênica (proporção de um

determinado gene) e evolução (variação na freqüência gênica de uma população),

avaliamos o equilíbrio genético da população estudada usando o Teorema de

Hardy - Weimberg. A importância desse teorema para as populações naturais está

63

no fato de ele estabelecer um modelo para o comportamento dos genes. Desse

modo, foi possível estimar freqüências fenotípicas ao longo das gerações e

compará-las com as freqüências obtidas na prática. Os valores observados foram

significativamente diferentes dos valores esperados (P < 0,05), permitindo concluir

que fatores evolutivos estão atuando sobre essa população e que ela está

evoluindo. Portanto, os resultados deste estudo demonstram que a população

amostrada de Presidente Figueiredo no Amazonas não está em equilíbrio gênico

de acordo com Hardy - Weimberg, indicando que há pressão de seleção natural

nessa população que reside em área endêmica para a malária no Amazonas.

Este trabalho determinou as freqüências dos genótipos e fenótipos Duffy em

indivíduos de uma área endêmica para malária na Amazônia. A partir dos dados

apresentados nesta pesquisa, novos estudos aprofundando a discussão sobre

malária e receptores moleculares serão desenvolvidos, permitindo uma abordagem

ampla do assunto, tendo como base de comparação as freqüências aqui descritas.

Estudos de susceptibilidade são importantes, pois determinam o nível de

exposição de uma determinada população frente a um patôgeno e auxiliam o

conhecimento da dinâmica de transmissão, bem como dos mecanismos de defesa

contra a determinada doença.

Podemos relacionar o potencial biotecnológico da técnica de genotipagem

do Sistema Duffy em três situações principais:

Para seleção de doadores de sangue, em pacientes previamente

fenotipados como Fyb(-). Nesses casos é importante determinar o genótipo Duffy

para evitar aloimunização, pois o doador pode ter um fenótipo Fyb fracamente

expresso que não é detectado pela fenotipagem, esse antígeno poderá sensibilizar

o receptor, produzindo anti-Fyb.

Em casos de suspeita de Doença hemolítica Peri Natal (DHPN), pois

os anticorpos anti-Fy são na sua maioria da classe IgM, anticorpos que atravessam

a placenta, e que podem desenvolver doença hemolítica no feto ou recém nascido.

Em estudos de susceptibilidade às doenças, através das freqüências

alélicas populacionais, podemos prever o grau de exposição de uma população a

uma determinada patologia. Nesse trabalho foi abordada apenas a malária, mas

como mencionado anteriormente os antígenos Duffy são receptores para citosinas,

principalmente a IL-8, e por esse motivo existem diversos trabalhos associando a

proteína Duffy com as mais variadas patologias.

64

6 CONCLUSÃO

Foram determinadas as freqüências genotípicas e fenotípicas do Sistema de

grupo sanguíneo Duffy em indivíduos de área endêmica para malária em

Presidente Figueiredo/AM. Os alelos estudados variam em relação aos

descritos na literatura.

Os dados mostraram alta freqüência do fenótipo Fyab na população

estudada. O genótipo FYFYB não apresentou diferença significativa entre

infectados e negativos.

O alelo FYA foi mais freqüente em infectados, e o alelo FYB nos negativos.

No entanto, na população geral, não houve diferença marcante de

ocorrência desses dois alelos.

A presença do alelo FY é uma seleção vantajosa, pois reduz os casos de

infecção pelo P. vivax em áreas endêmicas para malária no Amazonas. O

alelo FY demonstrou proteção em homozigose e em heterozigose mostrou

uma redução dessa susceptibilidade.

O fenótipo nulo não foi observado no grupo de pacientes infectados por P.

vivax , confirmando a resistência à infecção.

Não foi encontrada nenhuma ocorrência para o alelo FYAnulo no estudo.

65

Foram observados 11,5% de não concordância entre genótipo e fenótipo.

Esse dado deve-se supostamente a uma diferença de expressão do

antígeno Fyb nas hemácias dos indivíduos, o que nos leva a supor a

presença do alelo FYX e sugerir genotipagem Duffy em indivíduos

fenotipados como Fyb negativo.

A população amostrada, de Presidente Figueiredo no Amazonas, não está

em equilíbrio gênico de acordo com Hardy – Weimberg.

Salientamos a Importância biotecnológica da genotipagem do Sistema Duffy

em seleção de doadores de sangue, Doença Hemolítica Peri Natal e em

estudos de susceptibilidade.

66

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AIKAWA, M.; MILLER, L.H.; JOHNSON, J.; RABBEGE, J. Erythrocyte entry by malarial parasites: A moving junction between erythrocyte and parasite. J Cell Biol, v. 77, n.1, p. 72-82, 1978.

BANNISTRE, L. & MITCHELL, G. The ins, outs and roundabouts of malaria. Trends Parasitol, v. 19, n. 5, p. 209-213, 2003.

BARATA, R. C. Malária no Brasil: Panorama epidemiológico na última década. Cad. Saúde Públ., v. 11, n. 1, p. 128-136, 1995.

BARNEWELL, J.W.; NICHOLS, M.E.; RUBINSTEIN, P. In vitro evaluation of the role of the Duffy blood group in erythrocyte invasion by Plasmodium vivax. J Exp Med, v. 169, n. 5, p. 1795-1802, 1989.

BERNHARD, A.; et al. IVth Internatl Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens. Oxford Univ. Press, Oxford, 1990.

BRASIL. Ministério da Saúde. Programa Nacional de prevenção e Controle da Malária. Brasília: MS, 2004.

BRASIL. Ministério da Saúde. SIVEP-MALÁRIA. Situação Epidemiológica da Malária no Brasil: Projeto RAVREDA. Brasília, SVS, 2005. Disponível em: < http://portal.saude.gov.br> Acessado em: 17 de março de 2006. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária. 1 ed. Brasília: SVS, 2005. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/malaria_diag_manual_final.pdf> Acessado em: 18 de março de 2006. BRASIL. Ministério da Saúde. Sistema de Vigilância Epidemiológica do Ministério da Saúde - SIVEP-MALÁRIA. Brasília, SVS, 2006. Disponível em: <http://www.sna.saude.gov.br/?id=2900> Acessado em: 07 de maio de 2007. CABELLO, P. H.; KRIEGER, H. Genioc sistema para análises de dados de genética. FIOCRUZ, 1997. CABIANCA, A.; et al. Introdução á malaria e a doença no homem. 2000. Disponível em: <http://estudmed.com.sapo.pt/trabalhos/malaria_0.htm.> Acessado em: 19 de março de 2007. CALLEGARI-JACQUES, SIDIA M. Bioestatística: princípios e aplicações. Porto Alegre: Artmed, 2003. CASTILHO, L.; RIOS, M.; PELLEGRINO, J. Jr.; SAAD,S.T.O.; COSTA, F.F.; REID, M.E. A novel FY allele in Brazilians. Vox Sang, v. 87, n. 3, p. 190-5, 2004.

67

CASTILHO, L. The value of DNA analysis for antigens in the Duffy blood group system. Transfusion, v. 47, p. 28-31, 2007.

CAVASINI, C.E.; PEREIRA, F.J.T.; RIBEIRO, W.L.; WUNDERLICH, G.; FERREIRA, U.M. Duffy Blood group genotypes among malaria patients in Rondônia, Western Brazilian Amazon. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 34, n. 6, p. 591-595, 2001.

CAVASINI, C.E.; MATTOS, L.C.; ALVES, R.T.; COUTO, A.A.; CALVOSA, V.S.P.; DOMINGOS, C.R.B.; CASTILHO, L.; ROSSIT, A.R.B.; MACHADO, R.L.D. Frequencies of ABO, MNSs and Duffy phenotypes among blood donors and malaria patients from four Brazilian Amazon Areas. Human Biology, v. 78, n. 2, p. 215-219, 2006.

CAVASINI C.E.; MATTOS L.C.; COUTO A.A.; BONINI-DOMINGOS C.R.; VALENCIA S.H.; NEIRAS W.C.; ALVES T.A.; ROSSIT A.R.B.; CASTILHO L.; MACHADO R.L.D. Plasmodium vivax infection among Duffy antigen-negative individuals from de Brazilian Amazon region: an exception? Trans Roy Soc Trop Med Hyg, v. 101, p. 1042-1044, 2007. CAVASINI C.E.; MATTOS L.C.; COUTO, A.A.; COUTO V.A.; GOLLINO Y.; MORETTI L.J.; BONINI-DOMINGOS C.R.; ROSSIT A.R.B.; CASTILHO L.; MACHADO R.L.D. Duffy blood group gene polymorphisms among malaria vivax patients in four areas of the Brazilian Amazon region. Malaria Journal, v. 6, p. 167, 2007. CHAUDHURI, A.; ZBRZEZNA, V.; JOHNSON, C.; NICHOLS, M. ; RUBINSTEIN, W.L. ; MARSH, W.L. ; PODO, A.O. Purification and characterization of an erythrocyte membrane protein complex carrying Duffy blood group antigenicity. Possible receptor for Plasmodium vivax and Plasmodium knowlesi malaria parasite. J Biol Chem, v. 15, n. 264(23), p.13770-13774, 1989. CHAUDHURI, A.; POLYAKOVA, J.; ZBRZEZNA, V.; WILLIAMS , K.; GULATI , S.; PODO, A.O. Cloning of glycoprotein D cDNA, which encodes the major subunit of the Duffy blood group system and the receptor for the Plasmodium vivax malaria parasite. Proc Natl Acad, v. 15, n. 90(22), p.10793-10797, 1993. CHAUDHURI A.; ZBRZEZNA V.; POLYAKOVA J.; PODO, A.O.; HESSELGESSER, J.; HORUK, R. Expression of the Duffy antigen in K562 cells. Evidence that it is the human erythrocyte chemokine receptor. J Biol Chem, v. 269, p. 7835-7838, 1994. CHOWN B.; LEWIS M.; KAITA H. The Duffy blood group system in Caucasians: evidence for a new allele. American Journal of Human Genetics, v. 17, p. 384-389, 1965. CONSOLI, R.A.G.B.; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, R. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fundação Instituto Oswaldo Cruz, 1994.

68

CROSSKEY, R.W. Old tools and new taxonomic problems in Bloodsucking insects. In: SERVICE, M.W. (ed). Biosystematics of Haematophagous Insects. Oxford, Clarendon Press, p. 1-18, 1988. CUTBUSH, M.; MOLLISON, P.L. The Duffy blood group system. Heredity, v. 4, p. 383-389, 1950. DARBONNE W.C.; RICE G.C.; MOHLER M.A.; APPLE, T.; HERBERT, C.A.; VALENTE, A.J.; BAKER, J.B. Red blood cells are a sink for interleukin 8, a leukocyte chemotaxin. J Clin Invest, v. 88, n. 4, p. 1362-1369, 1991. DEANE, L. M.; CAUSEY, O.R.; DEANE, M.P. Notas sobre a biologia dos anofelinos das regiões nordestina e amazônica do Brasil. Rev Serv Esp Saúde Públ, v. 1, p. 827- 965, 1948. DEANE, L.M. Malaria vectors in Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 81 (suppl. II), p. 5-14, 1986. DANIELS G.; POOLE J.; DE SILVA M.; Callaghan, T. ; MacLennan , S. ; Smith, N. The clinical significance of blood group antibodies. Transfus Med, v. 12, p. 287-295, 2002. DANIELS, G.; FLETCHER, A.; GARRATY, G.; HENRY, S.; JØRGENSEN, J.; JUDD. W. J.; LEVENE, C.; LOMAS-FRANCIS, C.; MOULDS, J.J.; MOULDS, J.M.; MOULDS, M.; OVERBEEKE, M.; REID, M.E.; ROUGER, P.; SCOTT, M.; SISTONEN, P.; SMART, E.; TANI, Y.; WENDEL, S.; ZELINSKI, T. Blood group terminology 2004: from the International Society of Blood Transfusion committee on terminology for red cell surface antigens. Vox Sang, v. 87, n. 4, p. 304-316, 2004. DOHLMAN H.G.; THORNER J.; CARON M.G.; LEFKOWITZ R.J. Model systems for the study of seven-transmembrane-segment receptors. Annu Rev Biochem, v. 60, p. 653-688, 1991. FLEISS JL. Statistical Methods for rates and proportions. 2 ed. New York: Wiley, 1981.

FORATTINI, O. P. Culicidologia Médica: Identificação, biologia e epidemiologia. São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo, 2002. v.2, 864 p. GARRATTY, G.; DZIK, W.; ISSIT, P.D.; LUBLIN, D.M.; REID, M.E.; ZELINSKI, T. Terminology for blood group antigens and genes-historical origins and guidelines in the new millennium. Transfusion, v. 40, p. 477- 489, 2000.

HADLEY, T.J.; PEIPER, S.C. From malaria to chemokine recptor: the emerging physiologic role of the Duffy group antigen. Blood, v. 89, n. 9, p. 3077- 3091, 1997.

HENRY, G. T. Pratical sampling. In L. Bickman & D. B. Rog (Eds.), Handbook of applied social research methods. London: Sage, p. 101-126. 1998.

69

HESSNER M.J.; PIRCON R.A.; JOHNSON S.T.; LUHM R.A. Prenatal genotyping of the Duffy blood group system by allele-specific polymerase chain reaction. Prenat Diagn, v. 19, n. 1, p :41-45, 1999.

HORUK R.; CHITNIS C.E.; DARBONNE W.C.; COLBY, T.J. ; RYBICKI, A. ; HADLEY, T.J. ; MILLER, L.H. A receptor for the malarial parasite Plasmodium vivax: the erythrocyte chemokine receptor. Science v. 261, p. 1182-1184, 1993. IKIN, E.W.; MOURANT, A.E; PETTENKOFFER, H.J.; BLUMENTHAL, G. Discovery of the excepted haemagglutinin anti-Fyb. Nature, v. 168, p. 1.077, 1951. IWAMOTO, S.; Li, J.; SUGIMOTO, N.; OKUDA, H.; KAJII, E.Characterization of the Duffy gene promoter: evidence for tissue-specific abolishment of expression in Fy(a-b-) of black individuals. Biochem Biophys Res Commun, v. 24, n. 222(3), p. 852-859, 1996.

JENS, E.; PAGLIARINI, T..; NOVARETTI, M.C.Z. Duffy blood group system: Biology and transfusion practice. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 27, n. 2, p. 110-119, 2005.

KIM H.H.; PARK T.S.; OH S.H.;CHANG, C.L.; LEE, E.Y.; SON, H.C. Delayed hemolytic transfusion reaction due to anti-Fyb caused by a primary immune response: a case study and a review of the literature. Immunohematol, v. 20, n. 3, p. 184-186, 2004. KASEHAGEM, L.J.; MUELLER I.; KINIBORO B.; BOCKARIE M.J.; REEDER J.C.; KAZURA J.W.; KASTENS W.; MCNAMARA D.T.; KING C.H.; WHALEN C.C.; ZIMMERMAN P.A. Reduced Plasmodium vivax Erythrocyte Infection in PNG Duffy-Negative Heterozygote. PLoS ONE, v. 2, p. 336, 2007.

LANGUI JÚNIOR, D.M.; ALBUQUERQUE, S.; BORDIN, J.O. The presence of FYAnul allele of Duffy blood group system in blood donors and individuals from a malarial endemic region of Brazil. In: 46th Annual Meeting of The American Society of Hematology, San Diego. Blood, v. 104, p. 741a, 2004.

LAPIERRE, Y.; RIGAL, D.; ADAM, J.;JOSEF, D. ; MEYER, F. ; GREBER, S. ; DROT, C. The gel test: A new way to detect cell antigen-antibody reactions. Transfusion, v. 30, p. 109-113, 1990.

LANDSTEINER K. Individual differences in human blood. Science, v. 73, p. 405, 1931.

LEVINE P.; BURNHAM L.; KATZIN E.M.; VOGEL P. Role of iso-immunization in pathogenesis of erythroblastosis fetalis. Am J Obstet Gynecol, v. 42, p. 925, 1941.

LEWIS M.; KAITA H.; CHOWN B. The Duffy blood group system in Caucasians. A further population sample. Vox Sang, v. 23, p.523-527, 1972.

70

LIU X.H.; HADLEY T.J.; XU L.; PEIPER, S.; RAY, P.E. Up-regulation of Duffy antigen receptor expression in children with renal disease. Kidney Int, v. 55, n. 4, p. 1491-1500, 1999.

LIVINGSTONE, F.B. The Duffy blood group, vivax malaria and malaria selection in human populations: a review. Hum Bio, v. 56, n. 3, p. 413-425, 1984.

LOIOLA, C.C.P.; SILVA, C. J. Mangabeira da; TAUIL, P. L. Malaria control in Brazil: 1965 to 2001. Rev Panam Salud Publica, Washington, v. 11, n. 4, p. 235-244, 2002. LOURENÇO DE OLIVEIRA, R.; GUIMARÃES, A.E.G.; ARLÉ, M.; SILVA, T.F.; CASTRO, M.G.; MOTTA, M.A.; DEANE, L. M. Anopheline species, some of their habits and relation to malaria in endemic areas of Rondonia State, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 84, n. 4, p. 501- 514, 1989.

MALLINSON, G.; SÔO, K.S.; SCHALL, T.J.; PISACKA, M.; ANSTEE, D.J. Mutations in the erythrocyte chemokine recptor (Duffy) gene: the molecular basis of the Fya/Fyb antigens and identification of a deletion in the Duffy gene of an apparently healthy individual with the Fy(a-b-) phenotype. Br J Haematol, v. 90, p. 823-829, 1995.

MATHEW, S.; CHAUDHURI. A.; MURTY, V.V.; POGO, A.O. Confirmation of Duffy blood group antigen locus (FY) at 1q22-->q23 by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet, v. 67, n. 1, p. 68, 1994.

MATHEWS H.M.; ARMSTRONG J.C. Duffy Blood Types and vivax Malaria in Ethiopia. Am J Trop Med Hyg, v. 30, p. 299-303, 1981.

MICHON P.; WOOLEY I.; WOOD E.M.; KASTENS W.; ZIMMERMAN P.A.; ADAMS J.H. Duffy-null promoter heterozygosity reduces DARC expression and abrogates adhesion of the P. vivax ligand required for blood-stage infection. FEBS Lett , v. 495, p. 111-114, 2001.

MILLER, L.H.; MASON, S.J.; DVORAK, J.A.; et al. Erythrocyte receptors for (Plasmodium knowlesi) malaria: Duffy blood group determinants. Science, v. 189, p. 561-563, 1975.

MILLER L.H.; MASON S.J.; CLYDE D.F.; MCGINNISS M.H. The resistance factor to Plasmodium vivax in blacks. The Duffy-blood-group genotype, FyFy. N Engl J Med, v. 295, n. 6, p. 302-304, 1976.

MOURANT, A.E.; KOPEC, A.C.; DOMANIEWSKA-SOBCZAK, K. The distribution of human groups and other polymorphisms. 2 ed. Oxford University Press, Londres, 1976.

MURPHY P.M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol, v. 12, p. 593-633, 1994.

71

NEOTE, K.; MAK, J.Y.; KOLAKOWSKI, L.F.Jr.; SCHALL, T.J. Functional and biochemical analysis of the cloned Duffy antigen: identity with the red blood cell chemokine receptor. Blood, v. 84, p. 44-52, 1994. NEVES, David Pereira. Parasitologia Humana. 11 ed. São Paulo: Atheneu, 2004. 462 p. NOVARETTI, M.C.Z.; DORLHIAC-LLACER, P.E.; CHAMONE, D.A.F. Estudo de grupos sangüíneos em doadores de sangue caucasóides e negróides da cidade de São Paulo. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 22, n. 1, p. 23-32, 2000.

OLSSON, M.L.; HANSSON, C.; AVENT, N.D.; AKESSON, I.E.; GREEN, C.A.; DANIELS, G.L. A clinically applicable method for determining the three major alleles at the Duffy (FY) blood group locus using polymerase chain reaction with allele-specific primers. Transfusion, v. 38, p. 168-173, 1998.

Organización Panamericana de la Salud. Informe de la Situación de los Programas de Malaria en las Américas: baseado en dados de 2002. OPAS, 2004.

PARASOL, N.; REID, M.; RIOS, M.; CASTILHO, L.; HARARI, I.; KOSOWER, N.S. A novel mutation in the coding sequence of the FY*B allele of the Duffy chemokine receptor gene is associated with an altered erythrocyte phenotype. Blood, v. 92, p. 2237-2243, 1998.

PESSOA, Samuel Barnsley. Parasitologia médica. 8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1972. 1031 p.

PODO, A.O.; CHAUDHURI, A. The Duffy protein: a malarial and chemokine receptor. Seminars in Hematology, v. 37, p. 122-129, 2000.

REID, M.E.; MOHANDAS, N. Red blood cell. blood group antigens: structure and. function. Seminars in Hematology, v.41, p. 93-117, 2004. ROITT I.; BROSTOFF J.; MALE D. Imunologia. 4 ed. Cap 8.11, São Paulo: Manole Ltda, 1997.

RYAN, J.R.; STOUTE, J.A.; AMON, J.; DUNTON, R.F.; MTALIB, R.; KOROS, J.; OWOUR, B.; LUCKHART, S.; WIRTZ, R.A.; BARNWELL, J.W.; ROSENBERG, R. Evidence for transmission of Plasmodium vivax among a duffy antigen negative population in Western Kenya. Am J Trop Med Hyg, v. 75, n. 4, p. 575-581, 2006.

SAMBROOK, J.; RUSSEL , D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third Edition. NY: CSHL Press, 2001. SEGERER S.; BOHMIG G.A.; EXNER M.; COLIN, Y.; CARTRON, J.P.; KERJASCHKI, D.; SCHLÖNDORFF, D.; REGELE, H. When renal allografts turn DARC. Transplantation, v. 15, n. 75(7), p. 1030-1034, 2003.

72

SHIMIZU, Y.; KIMURA, M.; SETTHEETHAM-ISHIDA, W. Genotyping of Duffy blood group in several Thai ethnic groups. Southeast Asian J Trop Med Public Health, v. 28, n. 1, p. 32-35, 1997. SHIMIZU Y, A.O. H.; SOEMANTRI. A.; TIWAWECH, D. ; SETTHEETHAM-ISHIDA, W. ; KAYAME, O.W. ; KIMURA, M. ; NISHIOKA, T, ISHIDA, T. Sero- and molecular typing of Duffy blood group in Southeast Asians and Oceanians. Hum Biol, v. 2, n. 3, p. 511-518, 2000.

STORRY, J.R.; OLSSON, M.L. Genetic basis of blood group diversity British. Journal of Haematology, v. 126, n. 6, p. 759–771, 2004.

SZYMANSKI I.O.; HUFF S.R.; DELSIGNORE R. An autoanalyzer test to determine immunoglobulin class and IgG subclass of blood group antibodies. Transfusion, v. 22, n. 2, p. 90-95, 1982.

TADEI, W.P. Biologia de anofelinos amazônicos: Ocorrência de espécies de Anopheles nas áreas de influência das Hidrelétricas de Tucuruí (Pará) e Balbina (Amazonas). Rev Bras Engenh, v. 1, p. 71-78, 1986. TADEI, W.P.; SANTOS, J.M.M.; COSTA, W.L.S.; SCARPASSA, V.M. Biologia de anofelinos amazônicos: Ocorrência de espécies de Anopheles, dinâmica da transmissão e controle da malária na zona urbana de Ariquemes (Rondônia). Rev Inst Med Trop, v. 30, n. 3, p. 221-251, 1988. TADEI, W.P. Biologia de Anofelinos Amazônicos: Considerações sobre as espécies de Anopheles (Culicidae), transmissão e controle da malária na Amazônia. U.A. Série: Ciências da Saúde, v. 2, p. 31-34, 1993. TADEI, W. P.; SANTOS, J.M.M.; SCARPASSA, V. M.; RODRIGUES, I.B. Incidência, Distribuição e Aspectos Ecológicos de espécies de Anopheles (Diptera, Culidadae), em regiões naturais e sob Impacto Ambiental da Amazônia Brasileira. Bases Científicas para Estratégias de Preservação e Desenvolvimento da Amazônia. Editora Humberto Calderaro Ltda, v. 2, p.167-196, 1993. TADEI, W.P.; DUTARY-THATCHER, B.; SANTOS, M. M. J.; SCARPASSA, V.M.; RODRIGUES, I.B.; RAFAEL, M.S. Ecologic observations on anopheline vectors of malaria in the brazilian amazon. Am J Trop Med Hyg, v. 59, n. 2, p. 325-335, 1998.

TADEI, W. P.; THATCHER, B. D. Fatores determinantes da transmissão da Malária em área urbana e não urbana. Revista de Patologia Tropical, v. 28, 1999.

TADEI, W. P.; DUTARY-THATCHER, B. Malaria vectors in the Brazilian Amazon: of the subgenus Nyssorhynchus. Rev Inst Med Trop, v. 42, p. 87-94, 2000.

73

TADEI, W.P. Controle da malária na Amazônia. In: Anais/ Resumo da 7° Reunião Especial da SBPC [CD ROOM]. Manaus: Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência, p. 1-6, 2001. TADEI, W.P. O Papel da Entomologia no Controle da Malária. In: X reunião Nacional de Pesquisa em Malária. Revista Brasileira de Medicina Tropical, v. 40 (Suplemento II), p. 22-26, 2007. TANNER, M.J.; ANSTEE, D.J.; MALLINSON, G.; RIDGWELL, K.; MARTIN, P.G.; AVENT, N.D.; PARSONS, S.F. Effect of endoglycosidase F-peptidyl N-glycosidase F preparations on the surface components of the human erythrocyte. Carbohydr Res, v. 15, n. 178, p. 203-212, 1988. TOURNAMILLE C. ; LE VAN KIM C. ; GANE P. ; CARTRON, J.P. ; COLIN, Y. Molecular basis and PCR-DNA typing of the Fya/Fyb blood group polymorphism. Hum Genet, v. 95, p. 407-410, 1995. TOURMAMILLE, C.; LE VAN KIM, C.; GANE, P.; LE PENNEC, P.Y. ;

ROUBINET, F. ; BABINET, J. ; CARTRON, J.P. ; COLIN, Y. Arg89Cys substitution results in very low membrane expression of the Duffy antigen/receptor for chemokines in FYX individuals. Blood, v. 92, n. 6, p. 2147-2156, 1998.

ZIMMERMAN, P.A.; WOOLLEY, I.; MASINDE, G.L.; MILLER, S.M.; MCNAMARA, D.T.; HAZLETT, F.; MGONES, C.S.; ALPERS, M.P.; GENTON, B.; BOATIN, B.A.; KAZURA, J.W. Emergence of FY*A(null) in a Plasmodium vivax – endemic region of Papua New Guinea. Proc Natl Acad Sci USA, v. 23, n. 96(24), p. 13973-13977, 1999. WHO Roll Back Malaria Departament & UNICEF. World Malaria Report 2005. p.293. Disponível em: <http://www.who.int/wmr2005/html/1-1.htm, 2005> Acessado em: 12 de dezembro de 2006. WELCH S.G.; MCGREGOR I.A.; WILLIAMS K. The Duffy blood group and malaria prevalence in Gambian West Africans. Trans R Soc Trop Med H, v. 71, p. 295-296, 1977. YAZDANBAKHSH M.; RIOS M.; STORRY J.R.; KOSOWER N.; PARASOL N.; CHAUDHURI A.; REID M.E. Molecular mechanisms that lead to reduced expression of Duffy antigens. Transfusion, v. 40, p. 310-320, 2000.

74

APÊNDICE A- TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)

75

APÊNDICE B- QUESTIONÁRIO APLICADO AOS PACIENTES NA COLETA

76

ANEXO A - PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP/INPA