Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E BIOLÓGICA DE ISOLADOS DE Trypanosoma cruzi DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL
WUELTON MARCELO MONTEIRO
MANAUS
2011
i
WUELTON MARCELO MONTEIRO
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E BIOLÓGICA DE ISOLADOS DE Trypanosoma cruzi DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientadora: Profa. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa Co-orientadores: Prof. Dr. Henrique Silveira Prof. Dr. Max Jean de Ornelas Toledo
MANAUS
2011
Ficha catalográfica elaborada por Maria Eliana N. Silva – CRB- 11/248
M772c Monteiro, Wuelton Marcelo. Caracterização genética e biológica de isolados de
Trypanosoma cruzi do Estado do Amazonas, Brasil / Wuelton Marcelo Monteiro. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2011.
Xviii, 310 f. : il. Tese de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais e Infecciosas – UEA/FMT, 2011.
Orientadora: Profº. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa.
1. Trypanosoma cruzi. 2. Doença de Chagas. I. Título.
CDU: 616.92
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E BIOLÓGICA DE ISOLADOS DE Trypanosoma cruzi DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL.
WUELTON MARCELO MONTEIRO
“Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
____________________________________ Profª. Maria das Graças Vale Barbosa, Dra.
Presidente
____________________________________ Prof. Jorge Augusto de Oliveira Guerra, Dr.
Membro
_______________________________________________ Prof. Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda, Dr.
Membro
______________________________________ Prof. Max Jean de Ornelas Toledo, Dr.
Membro
______________________________________ Profª. Angela Cristina Veríssimo Junqueira, Dra.
Membro
iii
DEDICATÓRIA
Desde o primeiro ano do curso farmacêutico na Universidade Estadual de Maringá,
em 2000, sem conhecer conceito ou teoria alguma de forma profunda, me aventurei
ingenuamente como estagiário no Laboratório de Imunologia Clínica do
Departamento de Análises Clínicas. Neste ambiente de novidades, pipetava e
manipulava ainda hesitante, mas conseguindo, sob supervisão, realizar meus
primeiros ensaios para o diagnóstico laboratorial das leishmanioses e da doença de
Chagas. Em relação a estes problemas de saúde pública, tinha mais familiaridade
com o segundo. Uma década antes, meu avô paterno, Antônio Monteiro Peres,
mineiro de Montes Claros, que migrou como muitos outros conterrâneos para o norte
do Estado do Paraná, havia falecido subitamente por causa de um ataque cardíaco:
era um chagásico crônico. Outra memória perturbadora gerada pelas histórias dos
meus avôs, maternos agora, é a casa de barro lotada de barbeiros (chupanças,
conforme eles), que ora ou outra eram vistos nas camas sobre o rosto de algum dos
sete filhos, no noroeste do Estado de São Paulo, onde grassava, além do mal de
Chagas, a ferida brava e ainda a maleita. Naquele ambiente de assistência e
pesquisa, chamou-me a atenção de imediato o estudo das doenças parasitárias.
Mas não foi no estudo da doença de Chagas que ingressei na pesquisa científica.
De 2001 a 2003, fui selecionado para o Programa Institucional de Bolsas de
Iniciação Científica (PIBIC), sob orientação do professor Ueslei Teodoro, meu
grande amigo e incentivador. Estudava a epidemiologia espacial da leishmaniose
tegumentar no Estado do Paraná. No mestrado em Análises Clínicas naquela
mesma universidade, terminado em 2006, aprofundaria no tema, já tendo publicado
alguns trabalhos nesta linha. Na época, me influenciaram a teoria do foco natural
das doenças transmissíveis, de Pavlovsky, e o complexo patogênico, de Max Sorre.
Fui remetido automaticamente às obras dos mestres Pessoa, Lacaz e Milton Santos.
A doença de Chagas estava literalmente na sala da frente, em relação ao
laboratório/sala do professor Ueslei, onde eu permanecia grande parte do tempo
(escrevendo, estudando ou identificando flebotomíneos), mas não me chamava
iv
muito à atenção, exceto pela pena dos camundongos infectados pelo Trypanosoma
cruzi. Diversos outros parasitos concorriam pela atenção naquele setor.
Não sei como explicar, mas mesmo antes de defender a dissertação de mestrado,
apenas com os créditos concluídos na pressa, ainda em 2005, mudo eu e mais
quatro colegas de classe farmacêuticos-bioquímicos recém-formados para o
Amazonas. Talvez por desespero ou ansiedade: queríamos trabalhar. Algo faltava. O
fato é que havíamos feito um concurso, passado e sido convocados: éramos
funcionários da Secretaria Estadual de Saúde do Amazonas (SUSAM). Um dos
emigrantes sulistas hoje é minha esposa, Gisely. Eu voltaria ao Paraná no ano
seguinte e me tornaria mestre. Meus pais, Antônio e Cleonice, ainda mantinham a
esperança do meu retorno para casa. Mesmo agora a mantém, quando se solidifica
minha permanência neste novo lar, onde consegui uma cadeira na Universidade
Federal do Amazonas.
Não posso dizer que fiquei um ano fora do meio científico, pois em 2007 escrevi e
publiquei trabalhos. Mas era preciso mais, o doutorado era o passo evidente. O que
eu estudaria no Amazonas? Não tinha contato algum. O programa que acabou por
me seduzir foi o de Medicina Tropical, da Universidade do Estado do Amazonas e da
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Precisava de um orientador e
procurei pela coordenadora do curso: Profa. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa.
Ela aceitou ser minha orientadora após corrigir minha tarefa de casa, que foi
escrever um projeto sobre caracterização de isolados de Trypanosoma cruzi no
Estado do Amazonas. Quase que por ironia, aprendi mais sobre esta parasitose aqui
no Amazonas. Mas não é na Amazônia que a doença incide hoje em dia? Aceitei o
desafio, estudei muito, desanimei muitas vezes, pensei em desistir. Mas a
oportunidade era única.
Na tese ora apresentada, desenvolvida na Gerência de Entomologia da Fundação
de Medicina Tropical do Amazonas e no Laboratório de Doença de Chagas da
Universidade Estadual de Maringá, apresento resultados que considero preliminares
de uma pesquisa básica em doença de Chagas na Região Amazônica.
Apresentamos um pouco de biologia, mas não podemos olvidar, diante dos fatores
bio-ecológicos e genéticos que determinam a ocorrência dos ciclos primitivos do
v
Trypanosoma cruzi, todo o contexto político, social e econômico que ocasiona a
incidência da doença e particulariza as populações afetadas.
Dedico este trabalho a todos que foram citados neste texto, e também a todos que
participaram direta ou indiretamente da história da minha vida acadêmica.
Incentivando, ensinando, contribuindo ou inspirando.
O movimento pelo saneamento do Brasil, desencadeado durante a Primeira
República (1899-1930) e ainda em andamento, colocou em evidência as precárias
condições de saúde das populações rurais e ribeirinhas, no contexto Amazônico,
como um obstáculo para que o país se civilizasse e se tornasse efetivamente uma
nação. Sua origem e trajetória estiveram diretamente relacionadas à história da
doença de Chagas. Os diferentes olhares não podem se desvencilhar nestes tempos
de emergência e reemergência. Dedico, também, de forma especial, esta tese, aos
pioneiros.
Manaus, 4 de novembro de 2011
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, causa primária de todas as coisas.
Aos meus pais, Antônio Carlos Valério Monteiro e Cleonice Toneli Monteiro, porque
acreditaram em mim e investiram com amor na minha formação, sempre me
incentivando.
À minha esposa, Gisely Cardoso de Melo, pelo amor, compreensão e presença,
mesmo nos momentos difíceis e atribulados de um aluno de doutorado.
Aos meus tios, Natal Rosin e Ivete Bastos Rosin, que outrora me acolheram como
um filho, pelo amor, carinho e compreensão.
À minha orientadora, Profa. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa, pela atenção e
dedicação durante a realização deste trabalho. Sua humildade em assumir
limitações e sua firmeza ética foram suas maiores lições para este aluno.
Ao Prof. Dr. Henrique Silveira, pela presteza na realização das técnicas moleculares
e atenção dispensada na explicação da caracterização molecular dos parasitos.
Excelente companheiro na redação de artigos.
Ao Prof. Dr. Max Jean de Ornelas Toledo, que permitiu que este doutorando
aprendesse a caracterização biológica do Trypanosoma cruzi em seu laboratório, em
minha saudosa Universidade Estadual de Maringá. Continue labutando com
competência nesta intrigante área que é a relação biologia x genética do causador
da doença de Chagas.
Ao Prof. Dr. Ueslei Teodoro, presença constante na minha vida acadêmica, mesmo
que desatado dos nós formais da sua orientação. Exemplo de moral e competência.
Aos professores Dra. Antônia Ramos Franco, Dr. Jorge Augusto de Oliveira Guerra,
Dr. Ueslei Teodoro e Dr. Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda, pela participação e
vii
valiosas sugestões na banca do Exame de Qualificação. Notadamente ao último,
pelas sugestões convenientes e pelo seu exemplo de pesquisador determinado e
produtivo.
Aos técnicos e demais funcionários da Fundação de Vigilância em Saúde do
Amazonas, responsáveis pela coleta de parte dos triatomíneos e amostras de
humanos utilizadas nesta tese.
Aos alunos de graduação e pós-graduação Laylah Kelre Magalhães, Daniele dos
Reis, Ana Paula Teston, Lara Borges, Isa Pires, Josué Costa de Oliveira e Gleison
Piovezana, que foram fundamentais para a obtenção dos resultados desta tese.
Aos estagiários e profissionais da Gerência de Entomologia da Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas e do Laboratório de Parasitologia da Universidade
Estadual de Maringá, pelo auxílio e colaboração.
Aos amigos do Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, pela convivência
agradável.
Aos amigos da Maternidade Nazira Daou, do Exército Brasileiro, do Instituto de
Criminalística do Amazonas e do Departamento de Saúde Coletiva da Universidade
Federal do Amazonas, pela alegria e aprendizado na minha vida profissional.
Aos funcionários da secretaria do Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, pela disponibilidade e sempre
bom atendimento.
Às professoras Dra. Mônica Lúcia Gomes e Dra. Silvana Marques de Araújo, por
toda ajuda dispensada para este trabalho.
A estes que nominei, e a todos os outros que contribuíram indiretamente neste
trabalho, sintam-se co-responsáveis por esta humilde contribuição ao estudo da
doença de Chagas na Amazônia.
viii
Sólo le pido a Dios
Que el dolor no me sea indiferente,
Que la reseca muerte no me encuentre
Vacío y solo sin haber hecho lo suficiente.
Sólo le pido a Dios
Que lo injusto no me sea indiferente,
Que no me abofeteen la otra mejilla
Después que una garra me arañó esta suerte.
Sólo le pido a Dios
Que la guerra no me sea indiferente,
Es un monstruo grande y pisa fuerte
Toda la pobre inocencia de la gente.
Sólo le pido a Dios
Que el engaño no me sea indiferente
Si un traidor puede más que unos cuantos,
Que esos cuantos no lo olviden facilmente.
Sólo le pido a Dios
Que el futuro no me sea indiferente,
Desahuciado está el que tiene que marchar
A vivir una cultura diferente.
Sólo le pido a Dios
Que la guerra no me sea indiferente,
Es un monstruo grande y pisa fuerte
Toda la pobre inocencia de la gente.
León Gieco. Sólo le pido a Dios; 1978.
ix
RESUMO
Na Amazônia Brasileira, a doença de Chagas é um problema de saúde pública importante e emergente. Entretanto, são escassas as informações sobre o impacto da diversidade do Trypanosoma cruzi na epidemiologia e na patogênese local da infecção chagásica. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização genética e biológica de estoques de T. cruzi do Estado do Amazonas, Brasil. Foram genotipados 97 estoques procedentes de humanos (n=47), triatomíneos (n=36) e marsupiais (n=14). Entre os estoques de humanos, 27 procedem de um surto de doença aguda ocorrido no município de Coari e 15 de um surto ocorrido em Santa Isabel do Rio Negro. Para a genotipagem, utilizou-se a reação da polimerase em cadeia (PCR) dos genes do miniéxon e do 24α rRNA, polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição (RFLP) do gene da subunidade II da citocromo oxidase (COII) e o sequenciamento dos genes da COII e da glicose-fosfato isomerase. Para a caracterização biológica foram inoculados 25 estoques representantes das unidades de tipagem distintas (DTU) TcI (n=10) e TcIV (n=15), em camundongos Swiss. Foram estudados dezessete parâmetros: 1) período pré-patente (PPP); 2) período patente (PP); 3) parasitemia diária média (PDM); 4) pico máximo de parasitemia (Pmax); 5) dia do Pmax (DPmax); 6) mortalidade (%MOR) na fase aguda; 7) %MOR na fase crônica; 8) dia médio da mortalidade (DMM); 9) infecciosidade (%INF); 10) porcentagem de exames de sangue a fresco positivos (%FBE+); 11) porcentagem de hemoculturas positivas (%HC+); 12) porcentagem de PCR positivas (%PCR+); 13) porcentagem de camundongos apresentando processo inflamatório; 14) porcentagem de camundongos apresentando parasitismo tecidual; 15) porcentagem de ELISA positivos (%ELISA+) na fase aguda; 16) %ELISA+ na fase crônica; e 17) suscetibilidade ao benzonidazol. Os parasitos isolados de dois surtos de doença de Chagas aguda foram tipados como TcIV. Um surto foi promovido por diversos haplótipos da mesma DTU. Demonstrou-se introgressão mitocondrial entre TcIII e TcIV da Amazônia e que estas DTU não são facilmente distinguidas com base em marcadores mitocondriais. TcI predominou entre triatomíneos e foi a única DTU isolada de marsupiais. Verificou-se a circulação de TcI e TcIV nos mesmos ecótopos na Amazônia Ocidental Brasileira. Dos 17 parâmetros, 14 mostraram diferenças significativas entre as DTU. Observou-se que TcIV mostrou maiores valores de PP, PDM, Pmax, %MOR na fase aguda, %INF, %ESF+, %ELISA+ nas fases aguda e crônica que TcI. Por outro lado, TcI mostrou maiores valores de PPP, DPmax, %MOR na fase crônica, DMM e frequência de alterações patológicas que TcIV. TcIV foi a principal responsável pelas infecções humanas no Estado do Amazonas, ocorrendo em surtos e casos isolados. Verificou-se ainda que os surtos causados por esta DTU podem ser devidos à infecções únicas ou mistas com diferentes infrapopulações. Em camundongos, as DTU TcI e TcIV apresentaram comportamento divergente em relação às propriedades biológicas e médicas. Os resultados apóiam a hipótese de que as diferenças biológicas são proporcionais à divergência evolucionária entre as DTU e evidenciam a necessidade de se considerar a diversidade filogenética dos estoques naturais de T. cruzi circulantes nas áreas emergentes para doença de Chagas em estudos sobre a variabilidade clínica da doença, imunologia, diagnóstico, prognóstico e ensaios com drogas e vacinas. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi. Doença de Chagas. Genótipo. Virulência. Amazônia.
x
ABSTRACT
In the Brazilian Amazon Region, Chagas disease has been recognized as an important and emerging health problem. However, information is scarce on the impact of the diversity of Trypanosoma cruzi in the epidemiology and local pathogenesis of the chagasic infection. The aim of this study was to perform the genetic and biological characterization of T. cruzi stocks in the State of Amazonas, Brazil. We analyzed 97 T. cruzi samples isolated from humans (n=47), triatomines (n=36), and marsupials (n=14). Among stocks from humans, 27 came from an outbreak of acute disease occurred in the municipality of Coari and 15 from an outbreak registered in Santa Isabel do Rio Negro. Molecular characterization was performed by polymerase chain reaction (PCR) of the mini-exon and 24α ribosomal RNA genes, restriction fragment length polymorphism (RFLP) of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II (COII) gene, and by sequencing of COII and glucose-phosphate isomerase genes. Twenty five T. cruzi stocks pertaining to TcI (n=10) and TcIV (n=15) discrete typing units (DTUs) were comparatively studied in Swiss mice in order to verify its biological and medical properties. Seventeen parameters were assayed: 1) pre-patent period (PPP); 2) patent period (PP); 3) mean daily parasitemia (MDP); 4) maximum of parasitemia (Pmax); 5) day of maximum of parasitemia (DPmax); 6) mortality (%MOR) in the acute phase (AP); 7) %MOR in the chronic phase (CP); 8) day of maximum mortality (DMM); 9) infectivity (%INF); 10) percentage of positive fresh blood examination (%+FBE); 11) percentage of positive hemoculture (%+HC); 12) percentage of positive PCR (%+PCR); 13) percentage of mice with inflammatory process in any organ; 14) percentage of mice with tissue parasitism in any organ; 15) percentage of positive ELISA (%+ELISA) in the AP; 16) %+ELISA in the CP; and 17) susceptibility to benznidazole. T. cruzi parasites from the two outbreaks of acute disease were all typed as TcIV. An outbreak was triggered by several haplotypes of this DTU. We confirmed mitochondrial introgression between TcIII and TcIV stocks from Amazon and that these DTUs are not easily distinguished based on mitochondrial genes. TcI predominated among triatomines and was the unique DTU infecting marsupials. TcI and TcIV overlapped in the same ecotopes in the Western Amazon region. Statistical comparison showed that 14 out 17 parameters were significantly different between the two DTUs. TcIV showed higher values of PP, MDP, Pmax, %MOR in the AP, %INF, %+FBE, %+ELISA in the AP and in the CP than TcI. By the other hand TcI showed higher values of PPP, DPmax, %MOR in the CP, DMM, and frequency of mice with pathological lesions than TcIV. TcIV was the major responsible for the human infections in the State of Amazonas, occurring in outbreaks and sole cases. Outbreaks caused by this DTU can be due to single or mixed infections with different haplotypes. TcI and TcIV DTUs from Brazilian Amazon are divergent in terms of biological and medical properties in mice. Results strongly support the working hypothesis that biological differences are proportional to the evolutionary divergence among the DTUs, and highlight the need to take into account the phylogenetic diversity of T. cruzi natural stocks circulating in the emergent areas for Chagas disease in applied studies dealing with clinical diversity of Chagas disease, immunology, diagnosis, prognosis, and drug and vaccine trials. Key-words: Trypanosoma cruzi. Chagas disease. Genotype. Virulence. Amazon.
xi
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1: Ensaios de PCR para o gene de rRNA 24Sα e para o espaçador intergênico do gene de miniéxon permitem dividir os isolados em dois grupos. A PCR para 24Sα origina um produto de 110 pb para TcI e de 125 pb para TcII107. A PCR para miniéxon origina o produto de 350 pb para TcI e 300 pb para TcII240..............................................................................................
26
Figura 2: Mapa do Estado do Amazonas indicando a localização dos municípios de origem dos isolados de Trypanosoma cruzi caracterizados neste estudo...........................................................
39
Figura 3: Algoritmo com o desenho esquemático do estudo......................... 47 ARTIGO 1 Figure 1: Geographical location of the municipal district of Coari, Amazon
State, Brazil where the acute Chagas disease outbreak occurred. 71
Figure 2: Allocation of the Trypanosoma cruzi isolated during acute Chagas disease outbreak (Accession numbers: GU178012 to GU178029) into known phylogenetic clusters, most recently classified as TcI, TcII, TcIII and TcIV (Zingales et al. 2009). The phylogenetic analysis used the Neighbour-Joining method implemented in MEGA 4.1 (Tamura et al. 2007). The bootstrap consensus tree was inferred from 1500 replicates, and the percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together are shown next to the branches. There were a total of 400 positions in the final dataset. TcIV – strain CANIIIcl1, AF359030; TcII –strain Esmeraldo cl13, AF359035; TcI – strain Silvio X10cl4, EU302222; TcIII –strain M6241cl6, AF359032…….
72
ARTIGO 2 Figure 1: Genetic profiles from a representative set of Trypanosoma cruzi
stocks, by analysis of the ribosomal RNA gene (A) and restriction fragment length polymorphism of the mitochondrial cytochrome oxidase II gene (B) in silver-stained polyacrylamide gel. MM, 100 bp molecular weight marker. NC, negative control…………………
107
Figure 2: Allocation of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas into known phylogenetic clusters, most recently classified as TcI, TcII, TcIII and TcIV [30], based on cytochrome c oxidase subunit II gene sequencing……………………………….
108
Figure 3: Allocation of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas into known phylogenetic clusters, most recently classified as TcI, TcII, TcIII and TcIV [30], based on glucose-phosphate isomerase gene sequencing…………………………….
109
Figure 4: Haplotypes of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas, based on single-nucleotide polymorphisms identified by cytochrome c oxidase subunit II gene sequencing……………..
110
Figure 5: Haplotypes of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas, based on single-nucleotide polymorphisms identified by glucose-phosphate isomerase gene sequencing……………….
111
ARTIGO 3 Figure 1: Histopathological alterations in Swiss triggered by the stock
xii
AM49: (A) and (B) Nests of amastigotes in cardiac tissue. (C) Diffuse inflammatory process in skeletal muscle. (D) Inflammatory process and gliosis in central nervous system. Magnification 400X.........................................................................
134
ARTIGO 4 Graphical abstract 137 Figure 1: Geographic location of the municipalities of origin of the strains
belonging to TcI and TcIV DTUs of Trypanosoma cruzi from the State of Amazonas, Brazil................................................
168
Figure 2: Parasitemia curves obtained in Swiss mice for Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas.....................................
171
Figure 3: Kaplan-Meier survival analysis showing the time (in days) elapsed from the day of inoculation to the beginning of the patent period (A) and the death episodes (B), obtained from mice inoculated with Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas……………………………………………………………....
172
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Número de casos e letalidade por doença de Chagas aguda no Brasil, por estados e regiões, de 2005 a outubro de 2010................................................................................................
12
Tabela 2: Nomenclatura para as divisões de Trypanosoma cruzi conforme o consenso de 2009.......................................................................
28
Tabela 3: Amostras de Trypanosoma cruzi do estado do Amazonas, com respectiva nomenclatura internacional, código utilizado pelos laboratórios, município de origem, hospedeiro e método de isolamento empregado...................................................................
42
Tabela 4: Isolados e respectivos inóculos de tripomastigotas sanguíneas utilizados na caracterização biológica em camundongos…………
52
ARTIGO 2 Table 1: Geographical origins, hosts, isolation method, and discrete typing
units (DTUs) of Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas………………………………………………………………
104
ARTIGO 3 Table 1: Host, municipality of origin, method of isolation, and genetic
lineage of the Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas, Brazil………………………………………………………
130
Table 2: Parasitological and virulence parameters in Swiss mice inoculated with Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas, Brazil………………………………………………………
131
Table 3: Statistical comparison of eight parasitological parameters in Swiss mice inoculated with Trypanosoma cruzi stocks from different hosts in the State of Amazonas, Brazil……..
132
Table 4: Histopathological parameters (tissue parasitism and inflammatory process) in mice inoculated with Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas, Brazil…………………
133
ARTIGO 4: Table 1: Characteristics of Trypanosoma cruzi stocks from the State of
Amazonas, Brazil……………………………………………………… 166
Table 2: Mean values and standard deviations of biological parameters obtained in Swiss mice for Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas.........................................................................
169
Table 3: Parasitological and virulence parameters obtained in Swiss mice for Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas.........
170
Table 4: Number of mice infected with Trypanosoma cruzi of the DTUs TcI and TcIV presenting tissue parasitism and inflammatory process in any organ…………………………………………………..
173
Table 5: Serological parameters obtained in Swiss mice from enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas................................................
174
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome)
ASAT Aspartato aminotransferase BENEFIT BENznidazole Evaluation for Interrupting Trypanosomiasis CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico COII Gene da citocromo c oxidase subunidade II DALY Anos de vida perdidos por incapacidade
(Disability-Adjusted Life Years) d.a.i. Dias após a inoculação DNA Ácido desoxirribonucléico
(DeoxyriboNucleic Acid) Dntp Desoxinucleosídeo trifosfato DPmax Dia do pico máximo de parasitemia DMSO Dimetilsulfóxido DTU Unidade de tipagem distinta
(Discrete Typing Unit) EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) ELISA Ensaio imunoenzimático de fase sólida
(Enzyme-linked immunosorbent assay) %ELISA+ Porcentagem de camundongos com ELISA positivo ESF Exame de sangue a fresco %ESF+ Porcentagem de animais que apresentaram exame de sangue a
fresco positivo FA Fase aguda FC Fase crônica FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado GE Gerência de Entomologia GPI Gene da glicose-6-fosfato isomerase H1/AatII Gene da histona H1/AatII HAI Hemaglutinação indireta HC Hemocultura %HC+ Porcentagem de camundongos com hemocultura positiva HIV Vírus da imunodeficiência humana
(Human immunodeficiency virus) HSP60/EcoRV Gene da proteína de choque térmico 60 IBAMA Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e dos Recursos Naturais IDH Índice de Desenvolvimento Humano IFI Imunofluorescência indireta IgG Imunoglobulina da classe G %INF Taxa de infecciosidade ITS Espaçador transcrito intergênico
(Intergenic transcribed spacer) kDNA Ácido desoxirribonucléico do cinetoplasto
(Kinetoplast DeoxyriboNucleic Acid) LDCh Laboratório de Doença de Chagas
xv
LIT Meio de cultura com infusão de fígado e triptose (Liver Infusion Tryptose)
LSU Gene do 24Sα rRNA %MOR Taxa de mortalidade mRNA Ácido ribonucléico mensageiro NADPH Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato NNN Meio de cultura desenvolvido por Nicole, Novy e McNeal NR Não realizado PCR Reação da polimerase em cadeia
(Polymerase Chain Reaction) %PCR+ Porcentagem de camundongos com reação em cadeia da
polimerase positiva PDM Parasitemia diária média RFLP Polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição
(Restriction Fragment Length Polymorphism) PFGE Eletroforese em Campo Pulsado
(Pulsed-Field Gel Electrophoresis) Pmax Pico máximo de parasitemia POP Procedimento Operacional Padrão PP Período patente médio PPP Período pré-patente médio PROAP Programa de Apoio à Pós-Graduação rDNA Ácido desoxirribonucléico ribossômico
(Ribosomal DeoxyriboNucleic Acid) RNA Ácido ribonucléico
(RiboNucleic Acid) SSU Gene do ácido ribonucléico 18S TC Tripomastigota de cultura Tris Tris(hidroximetil)aminometano TM Tripomastigota metacíclica UEM Universidade Estadual de Maringá
xvi
LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
% Porcentagem °C Grau Celsius FeIII Íon férrico fg Fentograma HCl Ácido clorídrico H2O2 Peróxido de hidrogênio kb Quilobases KCl Cloreto de potássio kDa Quilodálton kg Quilograma M Molar MgCl2 Cloreto de magnésio mg Miligrama min Minuto mL Mililitro
L Microlitro
mM Milimolar mpb Mega pares de bases ng Nanograma NH2 Grupo amino nm Nanômetro NO2 Grupo nitro O2 Oxigênio molecular O2
•- Íon superóxido •OH Radical hidroxila pb Pares de bases pg Picograma pM Picomol R-NHOH Hidroxilamina R-NO2
•- Intermediário nitro radicalar r.p.m. Rotações por minuto
xvii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1 1.1 O parasito – ciclo de vida, vetores e reservatórios.............................................. 2 1.1.1 Trypanosoma cruzi........................................................................................... 2 1.1.2 Vetores............................................................................................................. 3 1.1.3 Reservatórios................................................................................................... 5 1.2 Doença de Chagas.............................................................................................. 6 1.2.1 Epidemiologia................................................................................................... 6 1.2.2 Formas clínicas................................................................................................ 13 1.2.3 Diagnóstico....................................................................................................... 16 1.2.4 Tratamento....................................................................................................... 18 1.3 Diversidade genética do Trypanosoma cruzi...................................................... 21 1.4 Propriedades biológicas do Trypanosoma cruzi.................................................. 29 1.5 Justificativa, perguntas e hipóteses..................................................................... 32 2 OBJETIVOS...........................................................................................................
34
2.1 Geral.................................................................................................................... 35 2.2 Específicos.......................................................................................................... 35 3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................
36
3.1 Área de estudo.................................................................................................... 37 3.2 Origem e isolamento das amostras de T. cruzi................................................... 39 3.3 Caracterização genética...................................................................................... 48 3.3.1 Extração do DNA.............................................................................................. 48 3.3.2 Tipagem genética nuclear................................................................................ 48 3.3.2.1 Gene do RNA ribossomal (rRNA).................................................................. 48 3.3.2.2 Gene do miniéxon......................................................................................... 49 3.3.2.3 Gene da glicose-fosfato isomerase (GPI)..................................................... 49 3.3.3 Tipagem genética mitocondrial......................................................................... 50 3.3.3.1 PCR-RFLP e sequenciamento do gene da subunidade 2 da citocromo-oxidase mitocondrial (COII).......................................................................................
50
3.3.4 Análise filogenética........................................................................................... 51 3.4 Caracterização biológica..................................................................................... 51 3.4.1 Animais............................................................................................................. 51 3.4.2 Preparo dos inóculos........................................................................................ 51 3.4.2.1 Obtenção de tripomastigotas sanguíneas (TS)............................................. 51 3.4.2.2 Obtenção de tripomastigotas metacíclicas (TM)...........................................................................................................................
52
3.4.3 Técnicas de comprovação da infecção............................................................ 53 3.4.3.1 Exame de sangue a fresco (ESF)................................................................. 53 3.4.3.2 Hemocultura (HC).......................................................................................... 54 3.4.3.3 Reação da polimerase em cadeia (PCR)...................................................... 54 3.4.3.4 Infecciosidade................................................................................................ 55 3.4.4 Mortalidade....................................................................................................... 55 3.4.5 Curva de parasitemia....................................................................................... 55 3.4.6 Resposta humoral............................................................................................ 56 3.4.7 Suscetibilidade in vivo ao benzonidazol........................................................... 57 3.4.7.1 Tratamento dos animais................................................................................ 57
xviii
3.4.7.2 Critérios de cura............................................................................................ 58 3.4.7.3 Índice de cura................................................................................................ 58 3.4.8 Parâmetros histopatológicos............................................................................ 58 3.5 Considerações Éticas.......................................................................................... 59 3.5.1 Aprovação dos experimentos com os isolados provenientes de pacientes..... 59 3.5.2 Aprovação da coleta de mamíferos silvestres e da utilização dos animais de experimentação.........................................................................................................
59
3.6 Análise estatística................................................................................................ 59 3.7 Financiamento e parcerias.................................................................................. 60 4 RESULTADOS.......................................................................................................
62
ARTIGO 1.................................................................................................................. 63 ARTIGO 2.................................................................................................................. 73 ARTIGO 3.................................................................................................................. 112 ARTIGO 4.................................................................................................................. 135 5 DISCUSSÃO..........................................................................................................
175
5.1 Contribuição para a epidemiologia molecular da doença de Chagas no Estado do Amazonas.............................................................................................................
176
5.2 Propriedades biológicas dos isolados de T. cruzi do Estado do Amazonas..................................................................................................................
183
5.3 Perspectivas futuras............................................................................................ 190 6 CONCLUSÕES......................................................................................................
193
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................
196
8 ANEXOS................................................................................................................
222
8.1 Anexo 1 PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO......................................................
223
8.2 Anexo 2 APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM SERES HUMANOS
300
8.3 Anexo 3 APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS..................
302
8.4 Anexo 4 APROVAÇÃO DA COLETA DE MAMÍFEROS SILVESTRES..................................
304
8.5 Anexo 5 ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS NA VIGÊNCIA DO CURSO......................
308
1
1 INTRODUÇÃO
2
1.1 O Parasito - Ciclo de Vida, Vetores e Reservatórios
1.1.1 Trypanosoma cruzi
Os protozoários do gênero Trypanosoma são flagelados da ordem Kinetoplastida
e família Trypanosomatidae, que infectam vertebrados de todas as ordens (peixes,
anfíbios, répteis, aves e mamíferos) e são transmitidos por vários invertebrados
hematófagos. Podem se apresentar sob as formas amastigota, epimastigota,
tripomastigota e, raramente, promastigota em seus ciclos de vida, definidas em
função da posição do cinetoplasto em relação ao núcleo e da presença ou não de
flagelo livre e membrana ondulante135.
Trypanosoma (Schyzotrypanum) cruzi (Chagas, 1909) é o agente etiológico da
doença de Chagas, uma antropozoonose frequente na América Latina, cujo ciclo
evolutivo inclui a passagem obrigatória por hospedeiros de várias classes de
mamíferos, incluindo o homem, e hemípteros hematófagos, comumente chamados
barbeiros. Nos vertebrados, o T. cruzi circula no sangue e multiplica-se nos tecidos.
Nos barbeiros, multiplica-se no tubo digestivo, de onde as formas infectantes são
eliminadas com suas fezes e urina, servindo como fonte de infecção39,43.
O ciclo de vida de T. cruzi envolve um hospedeiro mamífero e um hospedeiro
invertebrado (triatomíneos). Quando um triatomíneo, durante o repasto sanguíneo
em um hospedeiro vertebrado infectado por T. cruzi, ingere as formas
tripomastigotas sanguíneas circulantes, estas se transformam em epimastigotas que
se multiplicam no intestino médio do inseto. Estas formas migram para o intestino
posterior, onde se diferenciam para tripomastigotas metacíclicas, que são as formas
infectantes para o hospedeiro vertebrado. Ao se alimentarem do sangue de outro
mamífero, algumas espécies defecam imediatamente, depositando suas fezes com
parasitos, sobre a pele ou mucosa. A penetração dos parasitos no novo hopedeiro
pode ocorrer diretamente pelas mucosas ou via lesão tecidual ocasionada pelo
orifício ou coceira no local da picada. Os tripomastigotas sanguíneos podem invadir
uma variedade de tipos celulares, diferenciando-se em amastigotas, que se
multiplicam por divisão binária simples no citoplasma das células. No final da fase
de multiplicação, quando a célula está repleta de parasitos, os amastigotas se
3
diferenciam novamente em tripomastigotas e podem invadir outras células, serem
destruídas pelo sistema imune do hospedeiro ou serem ingeridos por um inseto
durante seu repasto, reiniciando o ciclo39,43.
Dois diferentes ecossistemas são descritos para o T. cruzi: um relacionado com
hemípteros silvestres e geralmente envolvendo mamíferos que convivem neste
ambiente (ciclo silvestre), e outro dependente de vetores domiciliados, envolvendo
primariamente humanos e animais domésticos (ciclo doméstico). A conexão entre os
dois ciclos é feita por roedores, morcegos, marsupiais e outros animais infectados
que apresentam comportamento sinantrópico. Estima-se que o parasito emergiu
como espécie há mais de 150 milhões de anos atrás, originalmente infectando
mamíferos primitivos na Laurásia e Gondwana, regiões que originaram as Américas
do Norte e do Sul, respectivamente44. O homem é um reservatório muito mais
recente de T. cruzi e o primeiro contato entre as duas espécies ocorreu no final do
Pleistoceno, 15.000-20.000 anos atrás, quando os primeiros humanos povoaram o
Continente Americano. Existem evidências da presença do DNA do parasito em
múmias exumadas, datando 9.000 anos, no norte do Chile e sul do Peru24.
1.1.2 Vetores
Os hospedeiros invertebrados e vetores de T. cruzi são insetos pertencentes à
ordem Hemiptera, subordem Heteroptera, família Reduviidae, subfamília
Triatominae. Todos os triatomíneos são obrigatoriamente hematófagos. O
Continente Americano é o centro de diversidade e, provavelmente, o centro de
origem destes vetores251. Os triatomíneos são divididos em seis tribos, 18 gêneros e
cerca de 140 espécies, das quais 105 ocorrem nas Américas. Os gêneros mais
importantes como vetores de doença de Chagas são Rhodnius, Triatoma e
Panstrongylus193.
A transmissão vetorial é a via mais importante para o homem e ocorre por
contaminação com fezes de triatomíneos. O êxito desta via de infecção depende da
frequência com que os triatomíneos defecam e se isso ocorre seguido ou não da
hematofagia234. Mais de 100 espécies de triatomíneos são consideradas vetores
potenciais de T. cruzi. No Brasil, foram descritas 52 espécies, mas cinco tem
4
importância epidemiológica particular, por seu comportamento domiciliar: T.
infestans, P. megistus, T. brasiliensis, T. pseudomaculata e T. sordida. As demais
espécies são silvestres e mantem um ciclo natural envolvendo mamíferos silvestres.
T. infestans, espécie estritamente domiciliada, foi controlada no Brasil, Chile e
Uruguai e sua erradicação ou controle em outros países da América do Sul se
encontra em progresso89,90,146.
Triatomíneos do gênero Rhodnius possuem uma história biogeográfica complexa
e uma longa associação com espécies de palmeiras na América Latina. As espécies
deste gênero estão distribuídas em três complexos de acordo com análises
baseadas em zimodemas97 e 16S rDNA mitocondrial, citocromo b e 28S
rDNA154,181,204. Os complexos de Rhodnius estão associados com palmeiras
simpátricas e possuem diferentes padrões filogeográficos: 1) complexo R.
pallescens, que compreende as espécies R. pallescens, R. colombiensis e R.
ecuadoriensis, distribuído do oeste dos Andes à América Central, norte e noroeste
da América do Sul; 2) complexo R. brethesi, constituído por R. brethesi, R. pictipes e
R. amazonicus, restritos à região amazônica, e R. stali, encontrado na Bolívia (leste
dos Andes) e regiões vizinhas no Brasil; 3) complexo R. prolixus, composto por R.
prolixus, R. robustus, R. neglectus, R. nasutus, R. domesticus e R. neivai122.
Rhodnius pictipes é um triatomíneo silvestre de ampla distribuição na América do
Sul. Tem sido encontrada no Brasil nos Estados do Acre, Amazonas, Maranhão,
Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Pará, Piauí e Tocantins105,146,233. Esta espécie foi
encontrada naturalmente infectada pelo T. cruzi, pelo T. rangeli e com infecção
mista58,202. No município de São Paulo de Olivença, na região do Alto Solimões,
onde foi registrado o primeiro caso de doença de Chagas do estado do estado do
Amazonas, Rhodnius pictipes foi a espécie predominante no intradomicílio104.
Apesar de Rhodnius robustus ser considerada de importância secundária na
transmissão do T. cruzi, na Venezuela demonstrou-se que esta espécie invade
residências e se alimenta em humanos103.
Os gêneros Triatoma e Panstrongylus são encontrados predominantemente
associados à ecótopos terrestres como rochas, abrigos de animais e ocos de
árvores. Algumas espécies de Panstrongylus são encontradas também em habitats
5
arbóreos126. T. infestans é o principal vetor de doença de Chagas e alvo de
programas de controle nos países do cone sul da América do Sul. O contínuo
controle destes insetos em áreas endêmicas levou à eliminação das populações
domésticas do vetor, com interrupção da transmissão vetorial da doença92. Até o
momento, a Bolívia é o único país com populações silvestres de T. infestans217.
Neste gênero destacam-se ainda como vetores de T. cruzi as espécies T.
brasiliensis e T. dimidiata. Na região amazônica, algumas espécies de Triatoma
ocorrem apenas nas áreas periféricas. T. maculata tem sido considerada um vetor
potencial de T. cruzi na Amazônia, uma vez que apresenta capacidade de colonizar
ecótopos naturais no peridomicílio1.
O gênero Panstrongylus compreende 14 espécies amplamente distribuídas em
todas as Américas, com registros do México até a Argentina, algumas delas com
grande importância epidemiológica como vetoras de doença de Chagas. As
distâncias genéticas entre as espécies desse gênero sugerem que o grupo seja
polifilético165. Epidemiologicamente, P. megistus é uma das mais importantes
espécies de triatomíneos no Brasil, sendo encontrada nas regiões sul, sudeste e
nordeste do país, apresentando considerável diversidade genética27. P. geniculatus
é um importante vetor silvestre146, que invade esporadicamente as
residências174,189,271, atraído pela luz174, e coloniza abrigos de suínos construídos na
proximidade ou contíguos com as habitações humanas no Estado do Pará271. Nesse
contexto, pode contribuir na transmissão domiciliar da doença de Chagas, já que em
algumas áreas tem se apresentado com elevadas taxas de infecção natural.
Também é comum na Bolívia, Colômbia e Venezuela, onde tem sido sugerida como
substituta de R. prolixus como vetor de doença de Chagas61.
1.1.3 Reservatórios
Atualmente ocorrem na América do Sul 12 ordens de mamíferos e, com exceção
de Sirenia e Cetacea, todas são potenciais reservatórios de T. cruzi no ambiente
silvestre. Os reservatórios do T. cruzi conhecidos na Amazônia Brasileira são
mamíferos pertencentes às seguintes ordens e espécies:
6
1) Marsupialia: Caluromys spp., Didelphis marsupialis, Marmosa cinerea, Metachirus
nudicaudatus, Monodelphis brevicaudata e Philander opossum79,81,82,83,140,164;
2) Chiroptera (T. cruzi e T. cruzi-like): Carollia perspicillata, Choeroniscus minor,
Glossophaga soricina, Lonchophylla mordax, Micronycteris megalotis, Molossus
major, M. ater, Phyllostomus hastatus, P. alongatus, Noctilio labialis e Saccopterix
bilineata79,81,82;
3) Rodentia (T. cruzi-like): Agouti paca, Coendou spp., Dasyprocta spp., Echymys
chrysurus, Nectomys squamipes, Oryzomys capito, Proechimys guayannensis,
Rattus rattus e Sciurus spp.80,81,140;
4) Edentata: Ciclopes didactylus, Dasypus novemcinctus, Tamandua
tetradactyla79,81,82,140,287;
5) Carnivora: Nasua nasua e Tayra barbara79,82,113,140;
6) Primates: Aotus sp., Cebuella pygmaea, Cebus albifrons, Cebus apella, Saguinus
bicolor, S. fuscicollis, S. midas, S. ustus e Saimiri sciureus63,79,81,82,161,164.
1.2 Doença de Chagas
1.2.1 Epidemiologia
A tripanossomíase americana, posteriormente denominada doença de Chagas
em homenagem ao seu descobridor, o pesquisador brasileiro Carlos Chagas64 é
uma importante doença parasitária resultante da infecção pelo T. cruzi. A distribuição
geográfica da doença de Chagas, incluindo seus vetores e reservatórios, se estende
desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina e Chile, afetando 21 países200,283,284.
O número estimado de indivíduos infectados com T. cruzi nas áreas endêmicas
da América Latina diminuiu gradualmente desde a década de 1980, de 16-18
milhões em meados desta década e início da década de 1990283 para 11 milhões na
metade desta década230; e para 7,6 milhões em 2006200. Porém, estudos ainda
indicam uma incidência de cerca de 200.000 casos por ano, representando a
terceira infecção parasitária mais comum no mundo, depois da malária e da
7
esquistossomose285. O processo de urbanização na América Latina e os movimentos
migratórios têm levado ao registro de casos da doença em áreas não-endêmicas,
incluindo países da Europa e Estados Unidos, onde, na ausência do vetor, a
infecção pode ser propagada verticalmente, por transfusão sanguínea ou por
transplantes de órgãos230.
Um levantamento realizado em 1990 mostrou que, na América Latina, a carga
imposta pela doença de Chagas foi ultrapassada apenas pelas infecções
respiratórias agudas, doenças diarréicas e AIDS. Neste ano, a carga da doença de
Chagas foi maior que a da tuberculose. No mesmo ano, a carga produzida em
conjunto pela malária, esquistossomose, leishmaniose e hanseníase foi equivalente
a 25% da causada pela doença de Chagas281. Em 2001, a carga de todas essas
doenças diminuiu, exceto para a tuberculose; contudo, a doença de Chagas teve a
maior diminuição quando se consideraram os anos de vida ajustados por
incapacidade (DALYs): de 2,7 milhões para 867.000 DALYs282. O número de mortes
atribuídas à infecção pelo T. cruzi também diminuiu, de 45.000 mortes por ano no
final da década de 1980 para 14.000 em 2001282.
As características epidemiológicas da doença de Chagas no Continente
Americano permitem agrupar os países em quatro conjuntos, de acordo com os
ciclos de transmissão e com os programas de controle vetorial e transfusional90,231:
1) O grupo I, que inclui Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Equador, Honduras,
Paraguai, Peru, Uruguai e Venezuela, é caracterizado por ciclos domésticos e
peridomésticos com zonas de alta prevalência da infecção humana; predomínio da
cardiopatia chagásica crônica; ausência ou raros casos da forma digestiva ao norte
da linha do Equador; importantes ciclos silvestres em ambientes naturais, incluindo
T. infestans em áreas restritas da Bolívia; e programas de controle vetorial e
transfusional instituídos na maioria dos países, com possibilidade de controle de T.
infestans (já conseguido no Brasil, Chile e Uruguai) e R. prolixus, espécie
eminentemente doméstica.
2) O grupo II, que inclui Colômbia, Costa Rica e México, é caracterizado por ciclos
domésticos e peridomésticos, com a presença de cardiopatia chagásica crônica;
8
ocorrência de doadores infectados; presença de ciclos silvestres; e falta ou
programas de controle incipientes.
3) O grupo III, que inclui El Salvador, Guatemala, Nicarágua e Panamá, apresenta
ciclos domésticos, peridomésticos e silvestres com pouca informação clínica e ações
de controle apenas no início na Guatemala e Nicarágua.
4) O grupo IV, que inclui as Antilhas, Bahamas, Belize, Cuba, Estados Unidos,
Guiana, Guiana Francesa, Haiti, Jamaica e Suriname, apresenta ciclos silvestres
com raros casos humanos autóctones e pouca informação clínica.
Os mecanismos de transmissão da infecção chagásica podem ser divididos em
dois grupos: 1) os mecanismos principais, por meio de vetores, transfusão
sanguínea, transmissão oral e transmissão vertical, e 2) mecanismos secundários,
em acidentes de laboratório, contato com animais infectados, transplante de órgãos
e transmissão sexual73,89.
A transmissão vetorial é responsável por mais 70% dos casos em países onde
não existe controle sistemático de vetores. Da mesma forma, a transmissão
transfusional pode responder por mais de 20% dos casos em países sem vigilância
em bancos de sangue, como na Bolívia. A transmissão congênita exibe grande
variação regional, de 0,5 a 10% dos casos em países como o Chile, Bolívia e
Paraguai. Mesmo que a transmissão oral seja acidental, atualmente esta é
considerada endêmica na Região Amazônica119,211.
Em 2006, o Ministério da Saúde do Brasil recebeu a Certificação Internacional de
Eliminação da Transmissão da Doença de Chagas pelo Triatoma infestans,
conferida pela Organização Pan-Americana da Saúde. A certificação representa
somente a eliminação da transmissão da doença, especificamente pelo T. infestans,
e não a interrupção definitiva da transmissão, pressupondo a manutenção de
alguma ação de controle e vigilância. O Consenso Brasileiro em Doença de
Chagas179 adverte para o risco de transmissão associado à emergência de novas
espécies, da transmissão endêmica na Amazônia, mecanismos excepcionais de
transmissão, além da persistência de focos residuais de T. infestans. A transmissão
9
transfusional, por sua vez, é ocasional e controlada pela triagem dos doadores em
bancos de sangue. Dados recentes demonstram um decréscimo significativo desta
via de transmissão no Brasil91. No entanto, esta forma de transmissão da doença de
Chagas tornou-se a segunda via mais importante nos centros urbanos e é
considerada a principal forma de transmissão em países não-endêmicos68.
Recentemente, foram apresentados os resultados de um inquérito de
soroprevalência de doença de Chagas realizado em amostra de 104.954 crianças,
representativa da população com idade até cinco anos de toda a área rural
brasileira, exceto o Estado do Rio de Janeiro201. Da avaliação do conjunto de testes
resultaram apenas 32 (0,03%) resultados confimados da infecção. Destas, 20
(0,02%) com positividade materna concomitante (sugerindo transmissão congênita),
11 (0,01%) com positividade apenas na criança (indicativo de provável transmissão
vetorial), e uma criança positiva cuja mãe havia falecido. As 11 crianças que
adquiriram a infecção por provável via vetorial distribuíram-se predominantemente
na região nordeste (Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba e Alagoas),
acrescidas de um caso no Amazonas e um no Paraná. Dos 20 casos com provável
transmissão congênita sobressaiu-se o Rio Grande do Sul. Os resultados deste
inquérito apontam para a virtual inexistência de transmissão de doença de Chagas
por via vetorial no Brasil em anos recentes, resultante da combinação dos
programas regulares e sistemáticos de combate à moléstia e de mudanças de
natureza socioeconômica observadas no país ao longo das últimas décadas. Por
outro lado, reforçam a necessidade de manutenção de um programa de controle que
garanta a consolidação deste grande avanço.
Na Região Amazônica, a doença de Chagas vem sendo reconhecida como uma
importante antropozoonose emergente, com centenas de casos descritos nas
últimas décadas4,76. A epidemiologia da doença nesta região envolve uma série de
determinantes biológicos e sociais. Os fatores biológicos estão ligados à grande
diversidade de reservatórios silvestres de T. cruzi, o que resulta num intenso ciclo de
transmissão silvestre2. A invasão dos domicílios pelos vetores (com taxas de
infecção superiores a 60%) é comum e a adaptação dos triatomíneos nativos no
ambiente antrópico tem sido relatada em diversas áreas4. Além disso, um fator de
risco amplamente encontrado nas áreas rurais da região amazônica é a construção
10
das residências na proximidade dos palmeirais ocupados por triatomíneos e
marsupiais, ambos frequentemente infectados com T. cruzi4,74,76. Entre os fatores
sociais, a intensa transformação da paisagem pelo desmatamento e a migração
populacional de áreas endêmicas para a Amazônia, com a possibilidade da
introdução não-intencional de cepas parasitárias e vetores alóctones, são
provavelmente os mais importantes4.
Os primeiros casos agudos de doença de Chagas na Região Amazônica foram
detectados na Guiana Francesa116,117. No Brasil, Shaw et al.232 descreveram quatro
casos agudos em Belém, capital do Pará. Desde então, centenas de casos agudos
foram relatados no norte do Brasil, a maioria deles nos estados do Pará e Amapá,
em microepidemias ou em casos isolados4,76,269. O Inquérito Sorológico Nacional
(1975-1980) revelou uma prevalência de 2,4% no Acre, 1,9% no Amazonas, 0,5% no
Pará, 0,4% em Rondônia, 0,3% em Roraima, e 0% no Amapá52. Estudos realizados
de 1991 a 2009, no Estado do Amazonas, revelaram prevalências de 1 a
13%74,75,78,159.
Conforme Aguilar et al.4, a doença de Chagas na Região Amazônica se
apresenta como um agregado de dois perfis epidemiológicos principais que se
sobrepõem no espaço e no tempo. Em ambos os casos, a transmissão do T. cruzi
depende da capacidade de dispersão ativa dos vetores silvestres a partir dos seus
ecótopos naturais para o ambiente domiciliar, onde podem estabelecer contato com
o homem ou contaminar alimentos.
1) Na primeira situação, uma transmissão contínua de baixa intensidade gera um
padrão hipoendêmico com prevalências sorológicas de 1 a 3%. Este perfil é
amplamente distribuído e moderadamente heterogêneo, sendo importante
principalmente para as populações rurais da Amazônia. O mecanismo básico deste
perfil de transmissão é a invasão esporádica dos domicílios por vetores silvestres
adultos (principalmente R. pictipes, R. robustus e P. geniculatus), que pode ser
promovida pela presença de palmeiras no peridomicílio. O desmatamento, a redução
dos reservatórios silvestres, a proliferação de mamíferos oportunistas (roedores e
marsupiais) em ambientes degradados e a introdução da luz elétrica são fatores
potencialmente envolvidos.
11
2) O segundo perfil envolve uma transmissão focal e relativamente intensa em
subregiões discretas. A maioria destes casos está ligada ao extrativismo de fibras de
piaçava no médio e alto Rio Negro (Brasil, Colômbia e Venezuela) ou ao consumo
de sucos de frutas contaminados, como de açaí e de outras palmeiras. Os coletores
de fibras e seus familiares são frequentemente atacados por populacões de R.
brethesi e a prevalência de anticorpos anti-T. cruzi neste grupo pode atingir 5%74,76.
O consumo de produtos do agroextrativismo sem certificação sanitária está
provavelmente envolvido em surtos familiares de doença de Chagas aguda
relatados em diferentes áreas da Amazônia Central e Oriental. Os sucos de frutas
aparentemente são contaminados quando triatomíneos infectados são triturados
durante o processamento dos frutos, resultando em transmissão oral, com altas
cargas parasitárias levando à doença aguda grave. Após o controle de T. infestans e
controle transfusional, a infecção por via oral tornou-se a principal forma de
aquisição da infecção humana por T. cruzi77.
3) O terceiro perfil de risco está relacionado com a tendência sinantrópica de
algumas populações de vetores em areas geográficas restritas da Amazônia e inclui
a possibilidade de introdução de populações de vetores domiciliados a partir de
outras regiões, especialmente R. prolixus, T. infestans e T. dimidiata.
Informações do Ministério da Saúde177,178 indicam a notificação de 756 casos
agudos de doença de Chagas no Brasil, de 2005 a outubro de 2010. Chama a
atenção que destes casos, 703 (93,0%) ocorreram nos estados que compõem a
Amazônia Legal. Os estados brasileiros com maior número de casos registrados
foram o Pará, com 573 casos (75,8%) e o Amapá e o Amazonas, com 54 (7,1%)
cada, todos na Região Amazônica. No mesmo período foram registrados 20 óbitos
por doença de Chagas aguda no Brasil, dos quais 14 (70,0%) ocorreram na
Amazônia Legal, principalmente no Estado do Pará (12 óbitos). O Amazonas e o
Maranhão registraram um óbito por doença de Chagas aguda cada no período
(Tabela 1).
12
Tabela 1. Número de casos e letalidade por doença de Chagas aguda no Brasil, por
estados e regiões, de 2005 a outubro de 2010.
Estadoa Número de Casos Número de Óbitos Letalidade (%)
Acre 01 00 0,0
Amapá 54 00 0,0
Amazonas 54 01 1,9
Pará 573 12 2,1
Tocantins 06 00 0,0
Região Norte 688 13 1,9
Bahia 13 02 15,4
Ceará 09 00 0,0
Maranhãob 13 01 7,7
Piauí 04 00 0,0
Região Nordeste 39 03 7,7
Mato Grossob 02 00 0,0
Região Centro-Oeste 02 00 0,0
São Paulo 03 01 33,3
Região Sudeste 03 01 33,3
Santa Catarina 24 03 12,5
Região Sul 24 03 12,5
TOTAL 756 20 2,6
Fonte: Ministério da Saúde177,178.
a: Foram representados apenas os estados que registraram casos no período.
b: Estados que em conjunto com os da Região Norte compõem a Amazônia Legal.
A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), antiga
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, tem sido a unidade de referência para
o atendimento dos casos de doenças infecciosas e parasitárias, no estado, desde a
sua criação, em 1974. O primeiro caso de doença de Chagas aguda registrado no
Estado do Amazonas, representado por uma menina de quatro anos residente em
São Paulo de Olivença, foi atendido pela instituição em 1980120. A análise de uma
série de 29 casos de doença de Chagas atendidos na FMT-HVD entre 1980 e 2006,
demonstrou que os pacientes procediam de todas as regiões do estado, com registro
13
nos municípios de Tefé, São Paulo de Olivença, Manaus, Iranduba, Anamã,
Barcelos, Carauari, Coari, Manacapuru, Maraã e Tabatinga182.
1.2.2 Formas Clínicas
A doença de Chagas apresenta duas fases sucessivas: aguda e crônica. A forma
aguda corresponde ao período inicial da infecção pelo T. cruzi no homem e em
vários mamíferos, podendo apresentar-se aparente ou inaparente. Nesta fase, a
parasitemia é detectável por exames parasitológicos diretos do sangue, com
duração geralmente efêmera no ser humano (entre três e oito semanas)6,88. A forma
clínica da doença de Chagas aguda originalmente descrita por Carlos Chagas em
Lassance, Estado de Minas Gerais, constituía uma infecção com predomínio em
crianças na primeira década de vida. Chagas descreveu minuciosamente 29 casos
agudos, todos sintomáticos, apresentando quase invariavelmente com
manifestações febris e edematosas, exame parasitológico direto positivo, além da
ocorrência de óbitos por miocardite ou meningoencefalite aguda em 37,9% deles65.
A maioria dos pacientes na fase aguda é assintomática ou oligossintomática. Na
forma aparente, os sintomas mais frequentes são febre, sonolência, mialgia, diarréia,
adenomegalia, hepatoesplenomegalia, conjuntive unilateral (sinal de Romaña),
edema e taquicardia. Pode ser fatal em até 10% dos casos graves, a grande maioria
com meningoencefalite ou miocardite, quase sempre nos menores de dois anos de
idade e em indivíduos imunocomprometidos. Contudo, a maioria dos casos agudos
tem prognóstico benigno, com remissão completa num período de 60 a 90 dias, com
ou sem intervenção medicamentosa6,88. Os achados anatomopatológicos são de
intensidade não encontrada em miocardites de outras etiologias, geralmente
acompanhadas de pericardite serosa e, raramente, endocardite264.
As descrições clínicas de casos agudos autóctones de doença de Chagas na
Região Amazônica até o momento são escassas. Contudo, independentemente de
serem casos isolados ou pertencentes a surtos, predomina uma síndrome febril
inespecífica, em geral prolongada182,191,211. Com exceção do edema de face e de
membros inferiores, os demais sinais e sintomas são inespecíficos e constituem
elementos para frequentes equívocos diagnósticos com algumas endemias
14
prevalentes na região, especialmente malária, febre tifóide e dengue. A miocardite
aguda tem sido relatada em surtos, com raros óbitos decorrentes da miocardite
aguda grave210,272. No Estado do Amazonas, foi descrito um caso de
meningoencefalite chagásica numa paciente de 16 anos, procedente do município
de Tefé169.
Depois da fase aguda da doença, os pacientes entram na forma crônica
indeterminada (quando aparecem anticorpos T. cruzi-específicos na corrente
sanguínea), que podem permanecer por toda a vida em cerca de dois terços dos
pacientes. Nesta forma os pacientes são assintomáticos e não apresentam
alterações no eletrocardiograma e na radiografia de tórax93. O terço restante dos
indivíduos cronicamente infectados desenvolve complicações cardíacas ou
digestivas anos a décadas após a infecção inicial, num estágio da doença em que o
parasitismo sanguíneo e tecidual é escasso. Cerca de 20 a 30% dos pacientes na
fase crônica desenvolvem a forma cardíaca, que pode levar à insuficiência cardíaca
ou morte súbita em 70% e 30%, respectivamente, dos pacientes apresentando
cardiomiopatia chagásica162. A cardiopatia chagásica crônica apresenta-se
clinicamente sob a forma de três síndromes fundamentais: insuficiência cardíaca,
arritmias e tromboembolismo214. Aproximadamente 8 a 10% dos pacientes
desenvolvem manifestações digestivas caracterizadas por dilatações patológicas de
gravidade variável do esôfago e cólon, frequentemente associadas com
manifestações cardíacas212.
O envolvimento cardíaco é a manifestação mais séria e frequente da doença de
Chagas crônica, sendo a causa mais comum de cardiomiopatia na América Latina e,
em áreas endêmicas, a principal causa de morte por problemas cardiovasculares em
pacientes de 30 a 50 anos. A apresentação clínica varia muito de acordo com a
duração da doença e com a extensão e localização das lesões cardíacas. A
cardiopatia chagásica crônica é um processo inflamatório caracterizado por
miocardite fibrosante crônica (focal, multifocal ou difusa) e prejuízo da função
contrátil do miocárdio214. A demonstração de componentes do parasito no miocárdio
por métodos mais sensíveis, como imuno-histoquímica e a PCR, sugere que a
presença do parasito é necessária para o desenvolvimento do processo
inflamatório134,253. Atualmente, considera-se que o principal mecanismo que contribui
15
para a patogênese da miocardiopatia chagásica é a persistência do parasito no
tecido, graças a mecanismos de escape à resposta imune do hospedeiro250.
Nas areas endêmicas, especialmente no Centro-Oeste do Brasil, 15 a 20% dos
pacientes com doença de Chagas crônica desenvolvem desordens da motilidade do
trato digestório, especialmente no esôfago e cólon, com repercussão nas funções de
secreção e absorção. Estas alterações iniciam com a diminuição do trânsito e
dificuldade de esvaziamento, seguidas pelo aumento no calibre do órgão afetado e
maior dificuldade de esvaziamento, caracterizando a presença de megaesôfago e ou
megacólon. O envolvimento do sistema nervoso autônomo parece ser um elemento
essencial e geralmente precede as alterações da motilidade desses órgãos197,212. No
Brasil Central e no Chile predomina a forma digestiva, enquanto esta é praticamente
ausente na Colômbia, Venezuela e América Central72,118,172.
O padrão evolutivo da doença de Chagas ainda não está completamente definido
e compreendido, pois a morbidade e a mortalidade atribuídas à doença variam
consideravelmente de uma área para outra. Os fatores que determinam a
variabilidade regional na carga da doença de Chagas não são bem conhecidos,
porém é consensual a idéia de que tanto a constituição genética do parasito quanto
do hospedeiro exercem papéis importantes no curso da infecção155. Diversas
avaliações transversais e longitudinais da morbidade e mortalidade pela doença de
Chagas foram conduzidas no Brasil21,32,33,34,35,69,70,71,78. Estes estudos permitiram a
distinção de áreas de alta morbidade (Minas Gerais e Piauí), áreas de baixa
morbidade (Rio de Janeiro, Paraíba e Mato Grosso do Sul) e áreas com predomínio
de infecção crônica latente (Amazonas).
No Estado do Amazonas, a doença de Chagas crônica apresenta menor
morbidade que nas áreas endêmicas clássicas, observando-se principalmente a
forma indeterminada50. Neste estado, o primeiro relato da infecção chagásica foi
realizado por Ferraroni et al.108, ao examinar 25 indivíduos que trabalhavam no
extrativismo da piaçava no município de Barcelos, encontrando seis com sorologia
positiva. A realização de inquéritos sorológicos e estudos seccionais, incluindo
avaliação clínica e eletrocardiográfica de pacientes soropositivos nas áreas urbana e
rural de Barcelos e em diversas populações ribeirinhas e piaçabais do Rio Negro e
16
seus afluentes, comprovaram a elevada prevalência de infecção chagásica nesta
região e demonstraram um perfil de baixa morbidade na fase crônica da
doença74,75,78.
Em um estudo de busca ativa de casos autóctones de cardiopatia crônica na
região do Alto e Médio Rio Negro, Estado do Amazonas, foram encontrados dois
casos de miocardiopatia dilatada grave com sorologia positiva para infecção
chagásica, os quais evoluíram para o óbito5. Posteriormente, relataram-se novos
casos com sorologia positiva para T. cruzi, com características clínicas,
eletrocardiográficas e ecocardiográficas sugestivas de cardiopatia chagásica crônica,
manifestando-se clinicamente por insuficiência cardíaca, síndrome arritmogênica e
tromboembolismo109,110,111,112,286. Mais recentemente, Brum-Soares et al.50
realizaram um estudo soroepidemiológico e clínico em 152 indivíduos residentes no
município de Barcelos, encontrando 38 (25,0%) com sorologia positiva,
principalmente em indivíduos que exercem atividades extrativistas. Estes autores
não verificaram diferença entre as proporções de alterações radiológicas entre os
grupos de soropositivos e soronegativos, confirmando a baixa morbidade na fase
crônica da doença de Chagas na região, atribuindo-a à baixa parasitemia e/ou à
menor patogenicidade do T. cruzi silvestre presente na região.
1.2.3 Diagnóstico
Na fase aguda da doença de Chagas, os parasitos circulam na corrente
sanguínea dos pacientes. Assim, durante esta fase, o diagnóstico laboratorial se
baseia na observação do parasito no sangue dos indivíduos, por meio de um exame
de sangue a fresco ou de um esfregaço sanguíneo. Os exames diretos são mais
sensíveis que as camadas delgadas coradas, sendo os testes de escolha durante a
fase aguda da infecção. Se este teste for negativo, podem ser empregados os
métodos de concentração (micro-hematócrito ou método de Strout), que tem uma
sensibilidade de 80 a 90% e são recomendados no caso de pacientes com forte
suspeita da doença de Chagas aguda com exames a fresco negativos153. Nos casos
sintomáticos há mais de 30 dias, os testes de concentração podem ser a primeira
escolha, pois a parasitemia começa a declinar neste estágio179.
17
A fase crônica da doença, que segue a fase aguda da infecção, é caracterizada
por níveis de parasitos circulantes abaixo da capacidade de detecção por meio de
exames parasitológicos convencionais e pelo aparecimento de anticorpos IgG
direcionados contra antígenos do T. cruzi. O diagnóstico nesta fase é baseado
primariamente na sorologia convencional (imunofluorescência indireta - IFI,
hemaglutinação indireta - HAI - e ELISA) ou por métodos parasitológicos indiretos
(xenodiagnóstico e hemocultura). Mesmo que específicos, os métodos
parasitológicos indiretos são pouco sensíveis (20 a 50%)153. O diagnóstico acurado
deste estágio é importante para a instituição de tratamento adequado do indivíduo e
para a prevenção da transmissão transfusional e por transplante de órgãos, que
ocorre em países endêmicos e não-endêmicos230.
Souza et al.243 descreveram um caso agudo de doença de Chagas com
envolvimento cardíaco grave ocorrido após um transplante de fígado, com doador
cadáver. Tando doador quanto receptor apresentavam sorologia negativa para T.
cruzi antes do procedimento. Este relato mostra a possibilidade de resultados
sorológicos falsos-negativos e ressalta a necessidade de melhorias nos critérios
diagnósticos, incluindo, além da sorologia, informações epidemiológicas e pesquisa
do parasito usando a PCR128. Ressalta-se que uma mesma mistura antigênica pode
apresentar desempenho diferente quando desafiada com amostras de diferentes
regiões geográficas, o que é compreensível pela heterogeneidade constitucional do
T. cruzi.
O diagnóstico durante a fase crônica da doença de Chagas deve ser realizado
usando um teste com alta sensibilidade (ELISA com antígenos totais ou frações
semipurificadas do parasito, IFI ou HAI) seguido por outro com alta especificidade
(ELISA, usando antígenos recombinantes T. cruzi-específicos). Se os resultados não
concordarem, o diagnóstico é dito inconclusivo. Nestes casos, as amostras deverão
ser retestadas usando os mesmos métodos. O Ministério da Saúde recomenda que
as amostras com resultados inconclusivos persistentes (3% da rotina laboratorial)
sejam enviadas aos laboratórios de referência, onde serão testadas usando outras
técnicas sorológicas ou métodos mais complexos, como Western blot e PCR179.
18
1.2.4 Tratamento
Mesmo que os avanços no controle vetorial nos países do Cone Sul tenham
diminuído a incidência da doença de Chagas, dois problemas ainda devem ser
considerados: o tratamento dos casos crônicos e o grande número de casos agudos
em algumas regiões da América Latina. Neste cenário, a principal meta da pesquisa
em doença de Chagas é o desenvolvimento de quimioterapia específica que possa
eliminar a infecção dos indivíduos nas fases aguda ou crônica da doença, mas ainda
não desenvolveram as formas cardíacas e/ou digestivas. A pesquisa e o
desenvolvimento de novos testes diagnósticos e drogas para o tratamento etiológico
da doença de Chagas são incipientes quando comparados com outras doenças
infecciosas não negligenciadas, como a AIDS. O benzonidazol e o nifurtimox, as
únicas drogas disponíveis para o tratamento específico da doença, apresentam
diversas limitações, como a necessidade de administração por períodos
prolongados, elevada toxicidade e efeitos adversos que podem impedir a
continuidade do tratamento274.
Conforme o Ministério da Saúde179, o tratamento da doença de Chagas é
recomendado durante a fase aguda em infecções congênitas e acidentais, na fase
crônica recente (jovens menores de 15 anos e pacientes mais velhos com evidência
de infecção crônica recente), para pacientes com AIDS ou transplantados recebendo
drogas imunossupressoras, que apresentam risco de reativação da infecção latente.
O tratamento durante a fase aguda da infecção leva à regressão dos sintomas e a
razoáveis taxas de cura parasitológica, mas sua efetividade durante as fases
indeterminada e crônica permanece incerta56. Em geral, assume-se que quanto mais
precocemente são feitos o diagnóstico e o tratamento da infecção chagásica, maior
a chance da cura parasitológica274.
O benzonidazol e o nifurtimox demonstram atividades significativas na fase aguda
da doença de Chagas, com frequências de cura parasitológica maiores que 80%16,55.
Na infecção crônica recente, foram relatadas taxas de cura parasitológica maiores
que 60% em crianças tratadas com benzonidazol no Brasil e na Argentina7,239.
Resultado semelhante foi obtido no Chile com o nifurtimox237. Estudos sobre a
evolução clínica da doença crônica após o tratamento específico são controversos e
19
metodologicamente heterogêneos em casuística, critérios de cura, tempo de
seguimento e interpretação dos dados. Nesta fase, tem sido observada uma eficácia
terapêutica limitada, em que a cura parasitológica varia de 0 a 20%48,55,144.
A eficácia do benzonidazol na prevenção de complicações em pacientes com
cardiomiopatia chagásica está sendo avaliada no estudo denominado BENEFIT, um
ensaio clínico multicêntrico, randomizado, duplo-cego, placebo-controlado, com
3.000 pacientes, conduzido pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde e pela
Organização Mundial de Saúde, em colaboração com pesquisadores da América
Latina167.
Evidências indicam que o nifurtimox e benzonidazol atuam através da formação
de radicais livres e/ou metabólitos eletrofílicos. O grupo nitro (NO2) presente nestas
moléculas é reduzido ao grupo amino (NH2) pela ação de enzimas do tipo
nitroredutases, que atuam especificamente em sistemas moleculares do tipo R-NO2.
Este processo, iniciado pela reação catalisada pela NADPH citocromo P450
redutase, leva à formação de um intermediário nitro radicalar (R-NO2•-) com
subsequente formação de hidroxilamina (R-NHOH)168.
No caso do nifurtimox, o radical reduz o oxigênio molecular (O2) formando o íon
superóxido (O2•-) e regenerando o grupo NO2 num processo conhecido como ciclo
redox168. O íon superóxido formado é captado pela enzima superóxido dismutase
gerando peróxido de hidrogênio (H2O2) que, através da reação de Haber-Weiss na
presença de íons FeIII, forma o radical hidroxila (•OH)221,263. A esta espécie tem sido
atribuído o efeito tripanocida por mecanismos que envolvem ligação a lipídeos,
proteínas e ao DNA do T. cruzi.
O benzonidazol não atua através do ciclo redox e não depende diretamente de
espécies reativas de oxigênio168. Neste caso, o radical nitro formado estaria
envolvido com seu efeito tripanocida através da formação de ligações covalentes
com macromoléculas do T. cruzi (DNA e citocromo P450)263. É descrito ainda que
durante o tratamento com benzonidazol ocorre aumento da fagocitose e lise do T.
cruzi através de um mecanismo dependente de interferon-gama231 e inibição do
crescimento parasitário através da enzima NADH-fumarato redutase266.
20
Os metabólitos eletrofílicos formados através do mecanismo de ação dos
nitroderivados podem atuar também em outros sistemas, especialmente do
hospedeiro humano, devido à sua alta reatividade. Esta baixa especificidade de
ação em vias bioquímicas definidas do parasita contribui para os efeitos citotóxicos
observados no tratamento dos pacientes. Os efeitos mais comuns para o nifurtimox
são perda de peso, sonolência, além de algumas manifestações digestivas, tais
como náuseas, vômitos e cólicas intestinais. Já para o benzonidazol, os efeitos
colaterais mais frequentes podem ser agrupados de três formas: (i) manifestações
de hipersensibilidade, como dermatite com erupção cutânea (usualmente entre o 7º
e 10º dia de tratamento), edema periorbital ou generalizado, febre, linfadenopatia,
dores musculares e articulares; (ii) depressão da medula óssea, incluindo
neutropenia, agranulocitose e púrpura trombocitopênica; e (iii) polineuropatia
periférica, representada por parestesias e polineurite62.
A resistência natural às drogas é muito comum, mesmo entre populações do
parasito sem exposição prévia, resultando em diferenças nos resultados do
tratamento em diferentes áreas geográficas14,114. Os mecanismos moleculares desta
resistência ainda não estão totalmente compreendidos. A primeira análise
proteômica da resistência do parasito ao benzonidazol9 identificou cinco proteínas
(cisteína-peptidase semelhante à calpaína, uma peptidase, peroxirredoxina, tirosina-
aminotransferase e uma proteína conservada de 26 kDa) em amostras resistentes in
vivo ao benzonidazol, e quatro proteínas (ciclofilina A, glutamato-desidrogenase,
superóxido-dismutase e nucleosídeo difosfato-quinase) numa amostra com
resistência ao benzonidazol induzida in vitro. Os mesmos autores demonstraram,
numa análise funcional, que as proteínas envolvidas na transcrição e
endereçamento de proteínas apresentam expressão aumentada nos fenótipos
resistentes.
A superexpressão das triparredoxina-peroxidases citosólica e mitocondrial192 e a
expressão diminuída da álcool-desidrogenase53 foram observadas em amostras de
T. cruzi com resistência ao benzonidazol induzida in vitro. Wilkinson et al.280
verificaram que em T. cruzi e em outros tripanosomatídeos o benzonidazol e o
nifurtimox são ativados por uma nitrorredutase tipo I mitocondrial, cuja diminuição da
21
expressão explica a resistência cruzada entre as drogas nitro-heterocíclicas. Não foi
observada relação entre a expressão da proteína de choque térmico 70 com o
fenótipo resistente187.
A avaliação da cura na doença de Chagas é um aspecto complexo do seu
tratamento, pela falta de métodos confiáveis para a avaliação da eficácia
terapêutica, levando a resultados controversos em relação aos critérios clínicos e
parasitológicos. A cura parasitológica e a soroconversão negativa são utilizadas por
alguns autores54,55, enquanto outros8,238 admitem um longo período de
soronegatividade ou mesmo baixos títulos sorológicos como critério de cura.
A presença de anticorpos líticos foi proposta como um indicativo de infecção ativa
e falha terapêutica, porém o teste requer o uso de tripomastigotas vivos e, na rotina,
não é prático para os laboratórios clínicos139. A introdução de ensaios mais
sensíveis, baseados na técnica de PCR, que detecta especificamente o DNA do T.
cruzi em amostras de sangue de pacientes infectados, abriu novas possibilidades no
diagnóstico e seguimento da quimioterapia, apesar das discrepâncias da
sensibilidade da PCR entre estudos conduzidos em diferentes áreas geográficas,
pelas diferenças genéticas entre as cepas, influenciando a parasitemia no
homem128,138,279.
1.3 Diversidade Genética do Trypanosoma cruzi
O T. cruzi, assim como os outros flagelados da ordem Kinetoplastidae, apresenta
dois genomas distintos localizados no núcleo e no cinetoplasto. O conteúdo de DNA
pode variar entre os clones do T. cruzi, na ordem de 125 a 330 fg, incluindo o DNA
do cinetoplasto, que corresponde a aproximadamente 30% do total36,131. Elevado
polimorfismo também foi observado em relação ao número e tamanho dos
cromossomos entre as diferentes populações dessa espécie131,205,206. A ausência de
condensação dos cromossomos durante a divisão celular dos tripanossomatídeos
impede a cariotipagem do parasito pelos métodos tradicionais. Contudo, por meio da
eletroforese em campo pulsado (PFGE), verificou-se uma acentuada
heterogeneidade do tamanho e do número de cromossomos entre espécies de
Trypanosoma. Devido à complexidade do seu genoma e à dificuldade de separação
22
dos cromossomos, o cariótipo do T. cruzi ainda não está bem estabelecido. Estima-
se que as diferentes cepas do parasito apresentem de 64 a 80 cromossomos57,131,
mas o número de bandas cromossômicas detectadas é variável entre diferentes
estudos já realizados36,98.
O tamanho do genoma diplóide do T. cruzi é estimado em 106,4 a 110,7 MB, dos
quais aproximadamente 50% correspondem a sequências repetitivas. Os genes
podem se apresentar repetidos em tandem ou como cópias de pseudogenes23,101,
constituídas, principalmente, por grandes famílias de genes que codificam proteínas
de superfície, retrotransposons e repetições subteloméricas. Entre as sequências
repetidas em tandem estão o DNA satélite, os minissatélites e os microssatélites que
diferem no tamanho dos motivos de repetição101.
O DNA contido no cinetoplasto (kDNA) está organizado em uma complexa rede
de moléculas concatenadas, contendo 20 a 25 cópias de maxicírculos e 5.000 a
20.000 cópias de minicírculos236. Os maxicírculos contem sequências que codificam
proteínas envolvidas na respiração celular e na síntese de rRNA188. As sequências
dos minicírculos estão envolvidas na transcrição de pequenos RNA(s) guias que
participam do processo de editoração dos mRNA(s) das enzimas mitocondriais246.
Os minicírculos são constituídos de quatro regiões conservadas intercaladas por
quatro regiões variáveis de 120 a 160pb e de 280 a 320pb, respectivamente84. As
regiões conservadas contem a origem de replicação do DNA e não se diferem entre
as distintas populações do parasito. As sequências de nucleotídeos da região
variável são consideravelmente heterogêneas entre as diferentes populações do T.
cruzi e mesmo entre diferentes minicírculos de uma mesma população, constituindo
alvos adequados para o estudo da variabilidade genética nessa espécie185. Além
disso, devido ao seu elevado número de cópias, os minicírculos têm sido utilizados
como alvos eficientes na detecção do T. cruzi em amostras biológicas247.
O genoma completo do clone CL Brener foi publicado por El-Sayed et al.101
representando um marco importante no conhecimento do parasito, uma vez que
abre perspectivas para o estudo de genes ligados a diferentes propriedades
biológicas do T. cruzi e de sua variabilidade genética. O desenvolvimento nessa área
possibilitará o estabelecimento de correlações mais específicas entre a genética e as
23
características biológicas do parasito e/ou formas clínicas da doença de Chagas.
Distintos alvos no genoma do T. cruzi já foram empregados no desenvolvimento de
metodologias capazes de caracterizar cepas do parasito, tais como as sequências
de minissatélites (impressões digitais do DNA nuclear)152, o DNA total258, o
kDNA121,185,267, a região intergênica do gene do rRNA241, a região SL do gene do
miniéxon240 e os microssatélites198,199.
A análise de isoenzimas foi a primeira abordagem aplicada no estudo da
variabilidade molecular do T. cruzi e ainda consiste em uma metodologia de referência
para o seu estudo. As variações nos perfis de bandas eletroforéticas são decorrentes
de diferenças na estrutura primária de uma mesma enzima entre as populações do
parasito e podem ser atribuídas às diferenças nos genes que codificam essas
proteínas222. Esta técnica foi aplicada inicialmente por Toyé265, que demonstrou
distintas populações de T. cruzi, denominadas posteriormente zimodemas, circulando
nos ambientes silvestres e domiciliares, revelando-se um importante método para o
estudo epidemiológico da doença de Chagas. Miles et al.173,174,175,176, estudando
isolados de T. cruzi da Bahia e do Pará, descreveram três zimodemas, denominados
Z1, Z2 e Z3. Posteriormente, foram descritos isolados de Z3 com o locus ASAT de Z1
(Z3/Z1 ASAT)172 e as linhagens híbridas da Bolívia e Paraguai66,257. Os parasitos
classificados como Z1 e Z3 foram isolados de ambientes silvestres (gambás, tatus e
triatomíneos silvestres) e de poucos casos humanos na fase aguda da doença de
Chagas, enquanto Z2 foi encontrado apenas no ciclo de transmissão doméstico
(humanos e animais domésticos). Estas conclusões foram muito encorajadoras uma
vez que os zimodemas estavam associados aos diferentes padrões de transmissão.
Romanha222 e Carneiro et al.59 caracterizaram amostras de T. cruzi isoladas de
pacientes na fase crônica da doença, na região de Bambuí, Minas Gerais,
observando a presença de quatro zimodemas (ZA, ZB, ZC e ZD). ZA demonstrou o
mesmo perfil de Z2 e ZB mostrou um padrão de heterozigose característico gerado
pela hibridização das cepas parentais ZA e ZC. Considerando-se esses achados,
estes autores sugeriram que no Brasil ocorrem pelo menos seis grupos
isoenzimáticos (Z1, Z2/ZA, Z3, ZB, ZC e ZD).
24
Tibayrenc et al.259 e Tibayrenc e Ayala255, analisando o perfil isoenzimático (15
loci) de 645 amostras de T. cruzi, isoladas de uma variedade de hospedeiros
vertebrados e invertebrados, oriundas de uma ampla área geográfica, identificaram
43 zimodemas ou clonets. Com a observação de uma elevada variabilidade
fenotípica natural e o encontro dos mesmos clonets em diferentes áreas geográficas,
os autores propuseram uma estrutura e evolução predominantemente clonais para o
parasito. Isso pressupõe que os clones do parasito devem ser considerados como
unidades genéticas estáveis no tempo e no espaço, com raros ou ausentes eventos
de recombinação genética. Essa hipótese é apoiada pela observação de que o
número de genótipos verficados para esse parasito é muito inferior em relação ao
número de combinações teóricas esperadas para cada loco, demonstrando um
grande desvio da lei de Hardy-Weinberg e desequilíbrio de ligação entre os loci. Se
os alelos, em cada um dos quinze loci analisados, fossem combinados
randomicamente, o número total de genótipos esperados seria de 7 x 1015 e, todos
poderiam ocorrer em baixa freqüência. Entretanto, foram encontrados apenas 43
zimodemas, dos quais 16 diferem por um único alelo.
Além da análise isoenzimática, outras técnicas moleculares indicaram uma
elevada diversidade genética do T. cruzi. Estes marcadores foram inicialmente
pesquisados no genoma mitocondrial, representado por uma rede complexa de
milhares de moléculas de DNA circular, denominada cinetoplasto. Em T. cruzi, o
DNA mitocondrial (kDNA) perfaz cerca de 20 a 25% do DNA total da célula e é
composto por dois tipos de moléculas, os maxicírculos e os minicírculos. Os
maxicírculos (20.000 pb; 50 cópias por célula) codificam proteínas da cadeia de
transporte de elétrons e RNA ribossômico mitocondrial. Os minicírculos (1.400 pb;
10.000 a 20.000 cópias por célula) codificam RNAs pequenos (RNAs guia) que
participam do processo de editoração dos transcritos do maxicírculo. O minicírculo
contém quatro regiões de sequência conservada separadas por quatro regiões de
seqüência variável. As últimas apresentam alta taxa de mutação, que confere
diversidade entre os isolados101.
Morel et al.185 exploraram esta característica e estabeleceram os padrões de
RFLP dos minicírculos de várias cepas de T. cruzi, aos quais denominou
esquizodemas. A metodologia original foi aperfeiçoada por Sturm et al.247, que
25
introduziram a reação de PCR para a amplificação do segmento variável do kDNA.
Posteriormente, a variabilidade deste fragmento foi estudada diretamente em tecidos
de camundongos infectados e de pacientes chagásicos crônicos, demonstrando que
as características do minicírculo oferecem a oportunidade para um ensaio molecular
altamente sensível e específico267.
Em contraposição à grande diversidade genética das cepas evidenciada pelas
técnicas acima mencionadas, a análise de sequências com uma taxa de evolução
menor: os genes que codificam o RNA 24Sα ribossômico240 - marcadores clássicos
de evolução, e os genes de miniéxon106,107 - utilizados para a taxonomia de
tripanossomatídeos, mostraram um claro dimorfismo entre os isolados (Figura 1),
determinando sua divisão em dois grupos que correspondem a grandes linhagens
filogenéticas que divergiram entre 40 e 10 milhões de anos. As duas linhagens foram
confirmadas utilizando outras metodologias e passaram a ser denominadas T. cruzi I
(TcI) e T. cruzi II (TcII). O RFLP do gene do RNA 18S ribossômico permitiu a
classificação do T. cruzi em três grupos distintos, denominados ribodemas I, II e III67.
Fernandes et al.106, utilizando o marcador do miniéxon, conseguiram determinar se o
parasito corresponde ao TcI, TcII ou T. cruzi do zimodema Z3, além de diferenciar
esta espécie do Trypanosoma rangeli.
Em 1999, em um esforço para homogeneizar a nomenclatura adotada pelos
diferentes grupos de pesquisa, as duas linhagens principais foram nomeadas de T.
cruzi (TcI) e T. cruzi (TcII), por um consenso entre especialistas reunidos na
Fundação Oswaldo Cruz, no Rio de Janeiro18. Ficou então estabelecido que, a partir
daquela data, seriam designadas como TcI as cepas equivalentes ao zimodema 1,
ao biodema III, à linhagem 2 do rDNA, ao grupo I do miniéxon, aos ribodemas II/III
ou similares. Como TcII seriam designadas as cepas equivalentes ao zimodema 2,
biodema II (ZA), à linhagem 1 do rDNA, ao grupo II do miniéxon, ao rimodema I ou
similares. Alguns isolados de T. cruzi não podem ser adequadamente agrupados em
nenhuma destas linhagens principais. Entre estes estão os pertencentes ao
zimodema Z3 e outras cepas híbridas, como as classificadas como zimodema 2b
chileno, zimodema B, biodema I, grupo 1/2 do rDNA ou clonet 39.
26
Figura 1. Ensaios de PCR para o gene de rRNA 24Sα e para o espaçador
intergênico do gene de miniéxon permitem dividir os isolados em dois grupos. A PCR
para 24Sα origina um produto de 110 pb para TcI e de 125 pb para TcII107. A PCR
para miniéxon origina o produto de 350 pb para TcI e 300 pb para TcII240.
Subsequentemente, utilizando-se a análise de um grande número de loci de
isoenzimas, RAPD e sequências do gene SSU rDNA45,47 foi proposta a subdivisão
do táxon T. cruzi em seis DTU (Discrete Typing Unit): I, IIa, IIb, IIc, IId, IIe. A DTU I
correspondente à linhagem TcI/Z1, a DTU IIb corresponde à linhagem TcII/Z2 e as
DTU IId e IIe são sublinhagens híbridas. As DTU IIa e IIc são genotipadas como Z3
devido ao padrão idêntico gerado na análise do gene do miniéxon106 e classificadas
como Z3B (DTU IIa) e Z3A (DTU IIc), com base no polimorfismo de ITS rDNA171. A
análise de um fragmento de 1,25 Kb do maxicírculo (kDNA) permitiu a identificação
de três clades mitocondriais relacionadas com as DTU158: a clade A corresponde à
DTU I; a clade B às DTU IIa e IIc-e; e a clade C, à DTU IIb.
O agrupamento de isolados de T. cruzi nas seis DTU tem sido confirmado com
análises de outros genes nucleares e mitocondriais46,121,248,277,278,
cariotipagem38,46,205,206 e polimorfismo de loci de microssatélites121. Contudo, até o
momento não foi descrito um marcador molecular que, sozinho, pudesse discriminar
todas as DTU de T. cruzi. O método mais utilizado, baseado no gene do miniéxon
distingue apenas TcI, TcIIb e Z3106. O método baseado no gene rRNA 24Sα
distingue TcI, TcIIb e TcIIa e para as linhagens híbridas (TcIId-e) resulta em dois
fragmentos de tamanhos correspondentes às linhagens TcI e TcIIb240.
O método proposto por Brisse et al.47 utiliza os genes do miniéxon e do rRNA
24Sα, que segregam cinco linhagens, exceto TcIId e TcIIe, agregando outro
27
marcador ribossômico, baseado no gene SSU rDNA, possibilitando, assim, a
diferenciação dessas duas sublinhagens. A abordagem mais recentemente
introduzida147, baseada em três ensaios de PCR-RFLP, utiliza os genes rRNA 24Sα,
da proteína de choque térmico 60 (HSP60/EcoRV) e da histona H1/AatII e glicose-6-
isomerase (GPI). A combinação dos três marcadores RFLP foi capaz de discriminar
todas as DTU. Exceções para esta regra geral ocorreram no caso dos ensaios dos
genes rRNA 24Sα e GPI, para TcIIa (cepas dos Estados Unidos). O problema
gerado por esta discrepância, que pode ser resolvido pelo sequenciamento dos loci
alvo, é causado por mutações de ponto em um sítio de restrição relevante, refletindo
uma divergência genética entre isolados da América do Norte e outros
representantes de TcIIa.
Apesar da capacidade de recombinação genética in vitro127, o T. cruzi se
reproduz predominantemente por divisão binária e consequentemente seu genótipo
apresenta graus extremos de desequilíbrio de ligação, como demonstrado por meio
de isoezimas259 e microssatélites198, exibindo estrutura populacional
predominantemente clonal. Freitas et al.121 introduziram os termos haplogrupos e
haplótipos na descrição da estrutura populacional de T. cruzi. Por meio das análises
de microssatélites e sequências do gene da citocromo oxidase II, estes autores
sugeriram que TcI (haplogrupo ZZ), TcIIb (haplogrupo YY) e TcIIc (haplogrupo XX)
são as linhagens ancestrais de T. cruzi. Ressalta-se que o haplogrupo XX
(TcIIc/TcIIa/Z3) resultou de um evento de hibridização muito antigo entre as DTUs I e
IIb278. Freitas et al.121 demonstraram que as cepas híbridas naturais, representadas
por TcIId e TcIIe (haplogrupo híbrido XY), são resultantes de eventos distintos de
hibridização mais recentes, envolvendo populações das linhagens TcIIb e TcIIc,
sendo esta última sempre a população receptora, que mantém o DNA mitocondrial,
confirmando observações anteriores46,158,240,277. Estas observações e análises dos
padrões cromossômicos206 sugerem que cepas classificadas como TcIIc
representam uma terceira linhagem principal em T. cruzi, designada T. cruzi III
(TcIII). O único isolado de TcIIa (CANIII) estudado por Freitas et al.121 não foi
acomodado entre as linhagens parentais ou híbridas, mas agrupado com TcIIc.
Os avanços no conhecimento da estrutura populacional de T. cruzi nos dez anos
que seguiram o primeiro consenso sobre sua nomenclatura suscitaram a revisão da
28
denominação das diferentes divisões do parasito. Com este objetivo, foi planejado
um segundo encontro, que ocorreu em Búzios, Estado do Rio de Janeiro, Brasil, no
dia 23 de agosto de 2009, precedendo o XIII Congresso Internacional de
Protistologia, o XXV Encontro Anual da Sociedade Brasileira de Protozoologia e o
XXXVI Encontro Anual de Pesquisa Básica em Doença de Chagas. O comitê
reconheceu que a nomenclatura das cepas de T. cruzi deveria seguir a classificação
em seis DTUs, denominadas T. cruzi I a VI. Conforme o novo consenso, TcI e TcIIb
correspondem, respectivamente, aos grupos T. cruzi I e T. cruzi II, recomendados
pelo comitê original em 1999; da mesma forma, TcIIc e TcIIa foram renomeados T.
cruzi III e IV, e os híbridos TcIId e TcIIe, renomeados T. cruzi V e VI,
respectivamente (Tabela 2). A publicação com estas decisões290 encoraja os autores
e revisores de manuscritos, bem como os editores de revistas científicas, a adotarem
esta nomenclatura.
Tabela 2. Nomenclatura para as divisões de Trypanosoma cruzi conforme o
consenso de 2009.
DTU Abreviatura Equivalência
T. cruzi I TcI T. cruzi I a e DTU I b
T. cruzi II TcII T. cruzi II a e DTU IIb b
T. cruzi III TcIII Z3/Z1 ASAT c, Z3-A d, DTU IIc b e T. cruzi III e
T. cruzi IV TcIV Z3 c, Z3-B d e DTU IIa b
T. cruzi V TcV Z2 Boliviano c, rDNA 1/2 f, clonet 39 g e DTU IId b
T. cruzi VI TcVI Z2 Paraguaio h e DTU IIe b
a: Anonymous18; b: Brisse et al.45; c: Miles et al.173; d: Mendonça et al.171; e: Freitas
et al.121; f: Souto et al.240; g: Tibayrenc e Ayala255; h: Chapman et al.66. Adaptado de
Zingales et al.290.
Estudando proteínas envolvidas na via de reparo de erros de pareamento,
Augusto-Pinto et al.25 observaram que as cepas Colombiana (TcI), JG (TcII) e CL-
Brener (TcVI) apresentam níveis distintos de instabilidade de microssatélites em
resposta ao estresse oxidativo. A linhagem TcII revelou-se mais resistente ao
tratamento com cisplatina, indicando mecanismos de reparo pouco eficientes, o que
poderia resultar na geração de maior variabilidade nas cepas deste grupo.
Entretanto, estudos baseados em marcadores bastante polimórficos demonstraram
29
uma grande homogeneidade entre isolados de uma mesma área geográfica e um
considerável polimorfismo entre isolados de TcI de regiões geográficas
diferentes196,226. Na Colômbia, Falla et al.102 e Herrera et al.132, analisando a região
intergênica do gene do miniéxon, demonstraram uma heterogeneidade genética
suficiente para dividir as cepas TcI isoladas de vetores e reservatórios em quatro
haplótipos, relacionados com diferentes ciclos de transmissão. A análise por
microssatélites de populacões silvestres de TcI, oriundas de diversas localidades de
todo o Continente Americano, demonstrou uma grande diversidade genética, com
recente expansão geográfica deste genótipo para o sul dos Estados Unidos150. No
entanto, estes autores demonstraram que a maioria dos isolados humanos desta
DTU pertencem a dois grupos distintos caracterizados por uma considerável redução
da diversidade genética em relação aos isolados silvestres.
1.4 Propriedades Biológicas do Trypanosoma cruzi
Além da diversidade genética e bioquímica, T. cruzi compreende populações
altamente heterogêneas de parasitos do ponto de vista fenotípico, incluindo
características morfológicas, biológicas (comportamento em vertebrados e
triatomíneos), patológicas (tropismo celular, virulência, intensidade das reações
inflamatórias, mortalidade etc), clínicas (formas indeterminada, cardíaca e digestiva,
com e sem megasíndromes) e imunológicas11,12,13,15,22,40,41,114,170,172.
Diferenças morfológicas nas formas tripomastigotas sanguíneas do T. cruzi
foram descritas pelo próprio Carlos Chagas, em 1909, em seu trabalho sobre a
descoberta da doença de Chagas64. O papel das formas sanguíneas delgadas e
largas foi posteriormente estudado minuciosamente por Brener39. As populações
com predominância de formas delgadas são mais infecciosas para o camundongo,
determinam parasitemias mais precoces e são mais sensíveis aos anticorpos
circulantes. Por sua vez, populações com predomínio de formas largas são menos
infecciosas e desenvolvem parasitemias mais tardias em camundongos, porém são
mais resistentes à ação de anticorpos, permanecendo mais tempo na corrente
sanguínea. As tripomastigotas delgadas infectam preferencialmente células do
sistema mononuclear fagocitário, mostrando tropismo para o baço, fígado e medula
óssea, enquanto as formas largas apresentam tropismo para as células do músculo
30
liso, esquelético e cardíaco. As diferenças imunológicas entre os isolados de T. cruzi
permitiram sua classificação em três grupos de acordo com sua reatividade com
soros heterólogos de camundongos infectados194.
Quanto ao comportamento do T. cruzi em infecções experimentais, o parasito foi
classificado em três biodemas11,12. Na infecção com o biodema tipo I, ocorre
predomínio de formas delgadas e acentuado macrofagotropismo na fase inicial da
infecção. Multiplica-se rapidamente, apresentando elevada parasitemia e
mortalidade dos camundongos, que evoluem para o óbito entre 7 e 12 dias após a
inoculação. A infecção com este biodema se acompanha de intenso processo
necrótico-inflamatório dos órgãos parasitados, principalmente do baço. O biodema II
revela predominância de formas largas, intenso parasitismo do miocárdio na fase
aguda, miocardite intensa, desintegração dos miócitos parasitados e necrose. A
multiplicação dos parasitos é relativamente lenta e os picos de parasitemia
irregulares ocorrem entre 12 e 20 dias após a infecção, período no qual a
mortalidade é máxima. O biodema III é composto por cepas com predomínio de
formas largas, com multiplicação lenta e picos de parasitemia tardios entre os dias
20 e 30 após a infecção. As cepas deste biodema determinam intensas lesões
miocárdicas e de músculo esquelético, com acentuada proliferação
intracitoplasmática de parasitos. Os diferentes biodemas se relacionam com os
zimodemas e genótipos, sendo o tipo II correspondente ao Z2 (TcII) e o tipo III ao Z1
(TcI). O tipo I ficou enquadrado como Z2b, que inclui cepas híbridas11,12,15 .
A teoria clonal pressupõe que a divergência evolucionária acumulada entre os
clones possivelmente envolve genes que governam importantes propriedades do
parasito relacionadas à sua virulência, patogenicidade e à apresentação clínica da
doença de Chagas256,259. Espera-se, dessa forma, uma associação entre a
variabilidade genética do parasito, suas propriedades biológicas e as características
da doença de Chagas. Diversos trabalhos corroboram esta hipótese e demonstram
uma forte associação entre a distância genética e as propriedades biológicas do
parasito. Esse fato foi demonstrado no estudo das propriedades de T. cruzi em
cultura celular e acelular99,143,216,227, do seu comportamento e patogenicidade em
camundongos11,12,13,15,60,142,143,227,262, desenvolvimento nos vetores123,124,141 e na
resposta à quimioterapia14,216,260,261.
31
Estudos anteriores de infecção experimental de camundongos usando diversos
isolados no Brasil, dos ambientes silvestre e doméstico, mostraram que os
provenientes de marsupiais foram geralmente mais infecciosos e determinaram
parasitemias maiores que os isolados de vetores e de outras espécies de
mamíferos31,148. De um modo geral, as populações pertencentes ao TcI apresentam
maior habilidade de infectar e completar seu ciclo de vida no inseto vetor123,124,141,
maior capacidade de diferenciação em tripomastigotas sanguíneas e maior
capacidade de multiplicação intracelular no hospedeiro vertebrado que as
populações de TcII11,12,130,148,227. Em estudos realizados in vitro28,216 e in vivo14,260,261,
verificou-se que clones pertencentes à linhagem TcI são mais resistentes ao
benzonidazol e ao nifurtimox que os pertencentes à linhagem TcII. De fato, como
observado no Brasil Central, pacientes infectados com cepas do biodema III,
apresentaram maior resistência à quimioterapia com benzonidazol quando
comparados com os infectados com o biodema II16.
Isolados de TcI são resistentes ao benzonidazol e itraconazol tanto durante a
fase aguda quanto na fase crônica da infecção experimental, enquanto isolados de
TcII são parcialmente resistentes a ambas as drogas, apesar de sua suscetibilidade
ao itraconazol durante a fase crônica260. Estes resultados concordam com os
estudos conduzidos no Chile, onde mais de 50% dos pacientes cronicamente
infectados foram curados após a quimioterapia com itraconazol20. Previamente, Apt
et al.19 haviam descrito que a maioria dos estoques de T. cruzi isolados de pacientes
humanos nestes pacientes são classificados como TcII. Murta et al.186 relataram
maior eficiência da quimioterapia com benzonidazol e nifurtimox na doença humana
em áreas com alta prevalência do zimodema B (TcVI), que apresenta perfil híbrido.
Entretanto, resultados divergentes foram descritos na literatura por Ruiz et al.224 e
Neira et al.190 referentes à infectividade e virulência, demonstrando que cepas de
TcII apresentam essas propriedades mais pronunciadas que aquelas do TcI. Lisboa
et al.148 estudando 95 cepas de T. cruzi pertencentes a ambos os grupos verificaram
uma elevada heterogeneidade genética entre os isolados, com elevada parasitemia
detectada em 64% dos isolados de TcII e em 41% de TcI. A caracterização biológica
de isolados de TcI provenientes do México também não detectou comportamento
32
peculiar para este grupo228. Grande heterogeneidade intragrupo também foi
observada nos estudos de Toledo et al.262, Laurent et al.143 e Revollo et al.216,
sugerindo que para o estabelecimento de correlações mais específicas é adequado
empregar subdivisões menores do T. cruzi. Villareal et al.275, trabalhando com
populações clonadas do parasito, não verificaram associação significativa entre a
suscetibilidade in vitro ao benzonidazol e a diversidade genética, o que poderia ser
justificado, em parte, pela variabilidade dos parâmetros biológicos dentro de uma
mesma linhagem, incluindo a suscetibilidade às drogas.
1.5 Justificativa, perguntas e hipóteses
Embora programas intensivos de controle vetorial e de vigilância transfusional
nas antigas áreas endêmicas do Brasil tenham obtido êxito, a doença de Chagas
vem incidindo na Região Amazônica em surtos relacionados com a transmissão oral.
Nesta região, um importante fator biológico interveniente na história natural e
epidemiologia da doença de Chagas é a grande diversidade de vetores e
reservatórios silvestres de T. cruzi, resultando num intenso e complexo ciclo de
transmissão silvestre, ainda pouco compreendido. Os trabalhos relacionados com a
caracterização de isolados T. cruzi no bioma amazônico são escassos e a maioria
remonta ao final da década de 1970 e início da década de 1980, quando não se
dispunha dos métodos atuais de caracterização molecular do parasito. Além disso, a
grande maioria destes trabalhos diz respeito a pesquisas realizadas no Estado do
Pará. No Estado do Amazonas, onde vêm sendo descritos diversos casos isolados e
surtos de doença de Chagas aguda, o conhecimento sobre a doença é incipiente.
Os antigos e extensos ciclos silvestres de T. cruzi constituem um enorme
reservatório do parasito, tornando vulneráveis as populações humanas que entram
em contato com os ambientes naturais na Amazônia. Assim, o entendimento da
estrutura populacional das populações desse parasito, especialmente do ciclo
silvestre, é indispensável para o planejamento e a implementação das medidas de
controle da doença. As propriedades biológicas das diferentes linhagens do parasito
podem desempenhar importante papel na patogênese da doença de Chagas e na
eficácia da quimioterapia específica. Porém, na Região Amazônica e, principalmente
no Estado do Amazonas, são escassas as informações sobre o papel da diversidade
33
do parasito na patogênese peculiar da doença de Chagas nesta região, bem como
na resposta à quimioterapia.
Estudos realizados no Estado do Amazonas, especialmente na micro-região do
Rio Negro, demonstraram uma relação desproporcional entre o número de
indivíduos com sorologia anti-T. cruzi positiva e casos clínicos aparentes da doença
de Chagas, predominando um perfil de baixa morbidade e mortalidade. Outro fato
que chama a atenção nesta região é a baixa sensibilidade de testes diagnósticos,
tanto parasitológicos quanto sorológicos. Além disso, outra característica clinico-
epidemiológica peculiar da doença de Chagas nesta área é que a única forma
aparente dos casos crônicos autóctones do Amazonas é a doença cardíaca, não
havendo o registro de alterações digestivas.
Diante do exposto, espera-se, neste trabalho, responder às seguintes questões:
1) Quais são as DTU de T. cruzi circulantes no Estado do Amazonas? 2) Como os
estoques de T. cruzi isolados neste estado se comportam em camundongos? e 3)
Existe alguma associação entre a DTU do parasito com o seu comportamento
biológico? Partindo-se do princípio que as propriedades biológicas das diferentes
DTU desempenham importante papel no predomínio da infecção chagásica crônica
latente e baixo poder imunogênico do T. cruzi circulante, levantaram-se as hipóteses
de que as cepas de T. cruzi circulantes no Estado do Amazonas são as envolvidas
no ciclo silvestre, que estas apresentam baixa virulência e patogenicidade e que
existe associação entre as DTU dos isolados de T. cruzi com os parâmetros
biológicos estudados.
34
2 OBJETIVOS
35
2.1 Objetivo Geral
Estudar a diversidade genética e biológica de isolados de T. cruzi do Estado do
Amazonas, Brasil.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Identificar as DTU de estoques de T. cruzi responsáveis por casos humanos do
Estado do Amazonas;
2.2.2 Identificar as DTU de estoques de T. cruzi isoladas de vetores e reservatórios
silvestres;
2.2.3 Caracterizar o comportamento biológico dos estoques de T. cruzi em infecções
experimentais utilizando o modelo camundongo;
2.2.4 Verificar se existe associação entre o comportamento biológico com a DTU dos
estoques.
36
3 MATERIAL E MÉTODOS
37
3.1 Área de estudo
O Estado do Amazonas situa-se na porção ocidental da Região Norte do Brasil,
entre os meridianos de 56º05‟ e 73º48‟ longitude oeste e os paralelos de 2º01‟ e
7º06‟ latitude sul, abrangendo 62 municípios, numa área de 1.570.946,8 km2. Tem
uma população estimada em 3.483.985 habitantes para o ano de 2010, com 74,2%
na zona urbana e 25,8% na zona rural. A capital Manaus tem uma população
estimada em 1.802.014 habitantes, o que representa 51,7% da população do
estado137 (Figura 2).
A vegetação original principal é a floresta perenifólia ombrófila, densa na maior
parte, em áreas de terra firme, com árvores de grande porte, cobrindo as eco-
regiões dos Interflúvios do Japurá-Solimões-Negro, Solimões-Japurá, Uatumã-
Trombetas, Juruá-Purus, Madeira-Tapajós, Purus-Madeira e Negro-Branco, bem
como as Florestas Úmidas de Caquetá e do Sudoeste da Amazônia. Às margens
dos rios ocorrem as matas de várzea, que sofrem inundação anual promovida pela
cheia dos rios, nas eco-regiões das Várzeas de Monte Alegre, Purus e Iquitos; o
porte das plantas é menor e a presença de arbustos e cipós entrelaçados dificulta a
penetração. As matas de igapó, por sua vez, encontram-se permanentemente
inundadas em águas baixas das terras baixas encharcadas pelas enchentes dos rios
ou água das chuvas. O mapa potencial de vulnerabilidade dessas eco-regiões indica
que as áreas desmatadas no estado se concentram nas margens das rodovias BR-
319, BR-174 e AM-01094.
O clima é do tipo Af de Köppen (equatorial superúmido), com precipitações acima
de 2.000 mm/ano e temperaturas médias anuais entre 26ºC e 28ºC, sem uma clara
identificação de uma estação seca e outra chuvosa e com poucas variações de
temperatura na maior parte do estado. Na sub-região do Madeira, nas porções sul e
sudeste do estado, próxima dos limites dos estados do Pará, Mato Grosso,
Rondônia e Acre, ocorre estiagem pouco pronunciada, dos meses de agosto a
novembro136.
A formação geológica do Amazonas apresenta dois tipos principais de estruturas:
a bacia Amazônica, formada predominantemente por rochas sedimentares, e a do
38
Escudo Guiano, ao norte do estado, formado por rochas cristalinas ou metamórficas.
A bacia intracratônica do Amazonas apresenta rocha sedimentar na Bacia do
Amazonas, entre Manacapuru e Parintins, na Bacia do Alto Tapajós, no extremo
sudeste do estado, e na Bacia do Solimões, na parte oeste e sudoeste, onde se
encontra a Província do Juruá-Urucu, com depósitos de gás natural e petróleo. O
Escudo Guiano, que influencia no relevo amazonense na formação dos planaltos
residuais do norte do estado, suporta sedimentos com idades que variam do Pré-
Cambriano ao Mesozoico, gerando relevos com altitudes variadas nas serras de
Pacaraima, Roraima e Parima, que culminam no Pico da Neblina (3.014 m). Nestas
áreas ocorrem as Florestas de Altitude das Guianas e os Tepuis136.
Os solos de terra firme, do tipo lateríticos, cujos elementos químicos principais
são hidróxido de alumínio e ferro, são pobres para agricultura. Os solos de várzea
são mais férteis, já que periodicamente são enriquecidos com material depositado
durante a cheia dos rios. Os solos mais propícios à utilização agrícola encontram-se
nos campos de Humaitá, Apuí e Lábrea, no sudeste do Estado136.
A maioria dos municípios do Estado do Amazonas está classificada no nível
médio inferior de desenvolvimento humano, sendo que Manaus (0,774), Presidente
Figueiredo (0,741) e Itacoatiara (0,711) são os únicos municípios com índice de
desenvolvimento humano (IDH) maior que 0,7. A composição do Produto Interno
Bruto se dá principalmente pelo setor industrial (49,89%), seguido pela prestação de
serviços (47,85%) e pelas atividades do setor silvoagropecuário (2,26%). Os setores
industriais mais importantes são os de bens de consumo duráveis, principalmente
eletroeletrônicos, bens de informática e motocicletas, e o setor químico e de
bebidas137.
39
Figura 2. Mapa do Estado do Amazonas indicando a localização dos municípios de
origem dos isolados de Trypanosoma cruzi caracterizados neste estudo.
3.2 Origem e isolamento das amostras de T. cruzi
Foram utilizadas 97 amostras de T. cruzi de humanos, vetores e reservatórios
silvestres, provenientes de cinco municípios do estado do Amazonas (Figuras 2 e 3;
Tabela 3). Destas, 70 foram isoladas em cultura e 27 foram submetidas à
caracterização genética após extração de DNA diretamente do sangue total, no caso
de pacientes na fase aguda, ou do conteúdo intestinal, no caso de triatomíneos. A
Tabela 3 apresenta a nomenclatura internacional18, o código utilizado no laboratório,
o município de origem, o hospedeiro e o método de isolamento.
As amostras de Coari estão representadas por 30 isolados de humanos na fase
aguda da doença de Chagas (20 por hemocultura, nove por xenodiagnóstico e uma
por cultura de líquor), 11 de triatomíneos, sendo oito de R. pictipes (uma isolada por
40
xenocultura) e três de R. robustus (uma isolada por xenocultura), e dois isolados de
Philander opossum obtidos por hemocultura; as amostras de Apuí estão
representadas por 21 de triatomíneos, sendo 14 de R. robustus (quatro isoladas por
inoculação do conteúdo intestinal do triatomíneo em camundongo) e sete de R.
pictipes (três isoladas por inoculação em camundongo) e uma de caso humano
agudo isolada por hemocultura; as amostras de Santa Isabel do Rio Negro estão
representadas por 15 de casos humanos agudos, sendo que 8 foram isoladas por
hemocultura e 2 por xenodiagnóstico; as amostras de Manaus estão representadas
por 12 de Didelphis marsupialis (nove isoladas por hemocultura e três por
xenodiagnóstico), três de triatomíneos (uma isolada por xenocultura) e uma de caso
humano crônico isolada por xenodiagnóstico; uma amostra provém de Maraã e foi
isolada de um exemplar de R. robustus por inoculação em camundongo (Tabela 3).
As hemoculturas dos casos humanos foram realizadas conforme a descrição do
Procedimento Operacional Padrão (POP) POP_ENT_LB_002_v01_PT, da Gerência
de Entomologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
(GE/FMT-HVD) (Anexo 1). O sangue total foi coletado por punção venosa, na
presença de EDTA, antes do início do tratamento. O procedimento para a cultura de
líquor, coletado por punção lombar, para o diagnóstico da infecção chagásica, está
detalhado no POP_ENT_LB_003_v01_PT (Anexo 1). Aproximadamente 0,5 mL do
material coletado foi semeado em tubos (3-5 para cada paciente) contendo meio
MacNeal, Novy e Nicolle (NNN), coberto por uma camada de solução salina 0,9% e
140 mg/mL de sulfato de gentamicina. A preparação deste meio de cultura está
detalhada no POP_ENT_LB_007_v01_PT (Anexo 1). As culturas foram mantidas em
estufa microbiológica a 28C e monitoradas semanalmente por dois meses, por
observação à microscopia óptica, entre lâmina e lamínula, para a verificação do
crescimento parasitário.
O xenodiagnóstico direto, realizado conforme a descrição do
POP_ENT_LB_005_v01_PT (Anexo 1), também foi feito antes do tratamento,
utilizando-se 30 ninfas de III e/ou IV estádio de Triatoma infestans ou Dipetalogaster
maximus, em jejum alimentar, conforme disponibilidade na GE/FMT-HVD. A leitura
dos xenodiagnósticos foi feita 30, 45 e 60 dias após o repasto, por compressão
abdominal e obtenção das fezes do inseto, observando-se o material à microscopia
41
óptica, entre lâmina e lamínula. Quando positivo, o material foi utilizado para
xenocultura ou inoculado em camundongos, segundo o POP_ENT_LB_004_v01_PT
(Anexo 1) e o POP_ENT_LB_008_v01_PT (Anexo 1), respectivamente. No último
caso, depois de cerca de 30 dias, coletou-se 0,5 mL de sangue total do plexo retro-
orbitário, realizando-se a hemocultura pela técnica descrita no
POP_ENT_LB_017_v01_PT (Anexo 1), visando à recuperação das amostras de T.
cruzi. Este mesmo método foi utilizado para o isolamento de amostras de T. cruzi a
partir dos triatomíneos coletados no campo.
O isolamento de T. cruzi dos mamíferos silvestres foi realizado por meio de
hemocultura em meio NNN e xenodiagnóstico direto, pelas técnicas supracitadas. O
isolamento das amostras de T. cruzi a partir de vetores e reservatórios silvestres foi
realizado a partir de exemplares coletados em localidades rurais e periurbanas.
Estes isolados provêm de um projeto maior sob título: “Doenças de Chagas no
Amazonas: Ecologia do ciclo de transmissão em Manaus, Coari e Tefé”, coordenado
pela Profa. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa. Para maiores detalhes sobre a
coleta de vetores e reservatórios, recomenda-se consultar Magalhães160.
Os parasitos isolados foram expandidos em meio LIT, preparado conforme o
POP_ENT_LB_006_v01_PT (Anexo 1), adicionado de soro bovino fetal e
criopreservados até o uso em nitrogênio líquido na coleção de culturas de T. cruzi da
GE/FMTAM e do Laboratório de Doença de Chagas, no Departamento de Ciências
Básicas da Saúde da Universidade Estadual de Maringá (LDCh/UEM). O
POP_ENT_LB_009_v01_PT (Anexo 1) e o POP_ENT_LB_010_v01_PT (Anexo 1)
descrevem, respectivamente, os processos de criopreservação dos estoques em
nitrogênio líquido e de posterior descongelamento para caracterização biológica e
genética.
A Figura 3 representa o desenho esquemático do estudo desde a coleta dos
vetores e marsupiais e recrutamento dos pacientes, até a caracterização genética e
molecular.
42
Tabela 3. Amostras de Trypanosoma cruzi do Estado do Amazonas, com respectiva nomenclatura internacional, código utilizado
pelos laboratórios, município de origem, hospedeiro e método de isolamento empregado.
Nomenclatura
internacional a
Código Município de origem Hospedeiro Método de isolamento
Humanos
MHOM/BR/2007/AM01 AM01 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM02 AM02 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM03 AM03 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM04 AM04 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM05 AM05 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM06 AM06 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM07 AM07 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM08 AM08 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM09 AM09 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM10 AM10 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM11 AM11 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM12 AM12 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM13 AM13 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM14 AM14 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM15 AM15 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM16 AM16 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
43
MHOM/BR/2007/AM17 AM17 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM18 AM18 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM19 AM19 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM20 AM20 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM21 AM21 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM22 AM22 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM23 AM23 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM24 AM24 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM25 AM25 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM26 AM26 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2007/AM27 AM27 Coari Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2008/AM49 AM49 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2008/AM50 AM50 Coari Paciente em fase aguda Cultura de líquor
MHOM/BR/2010/AM70 AM70 Coari Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AM62 AM62 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AM63 AM63 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AM64 AM64 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AM65 AM65 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AM66 AM66 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AM67 AM67 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AM68 AM68 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
44
MHOM/BR/2010/AM69 AM69 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2010/AP60 AP60 Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2010/Erlisson Erlisson Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Xenodiagnóstico
MHOM/BR/2010/D D Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Não disponível
MHOM/BR/2010/Gus Gus Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Não disponível
MHOM/BR/2010/L L Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Não disponível
MHOM/BR/2010/LM LM Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Não disponível
MHOM/BR/2010/W W Santa Isabel do Rio Negro Paciente em fase aguda Não disponível
MHOM/BR/2009/AM52 AM52 Apuí Paciente em fase aguda Hemocultura
MHOM/BR/2007/AM36 AM36 Manaus Paciente em fase crônica Xenodiagnóstico
Triatomíneos
TROB/BR/2009/AM55 AM55 Apuí Rhodnius robustus Inoculação em camundongo
TROB/BR/2009/AM56 AM56 Apuí Rhodnius robustus Inoculação em camundongo
TROB/BR/2009/AM57 AM57 Apuí Rhodnius robustus Inoculação em camundongo
TROB/BR/2009/AM58 AM58 Apuí Rhodnius robustus Inoculação em camundongo
TPIS/BR/2009/AM59 AM59 Apuí Rhodnius pictipes Inoculação em camundongo
TPIS/BR/2009/AM60 AM60 Apuí Rhodnius pictipes Inoculação em camundongo
TPIS/BR/2009/AM61 AM61 Apuí Rhodnius pictipes Inoculação em camundongo
TROB/BR/2009/AP10 AP10 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TPIS/BR/2009/AP11 AP11 Apuí Rhodnius pictipes Não disponível
TROB/BR/2009/AP12 AP12 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
45
TPIS/BR/2009/AP15 AP15 Apuí Rhodnius pictipes Não disponível
TROB/BR/2009/AP20 AP20 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TROB/BR/2009/AP21 AP21 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TPIS/BR/2009/AP24 AP24 Apuí Rhodnius pictipes Não disponível
TROB/BR/2009/AP25 AP25 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TROB/BR/2009/AP28 AP28 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TPIS/BR/2009/AP35 AP35 Apuí Rhodnius pictipes Não disponível
TROB/BR/2009/AP51 AP51 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TROB/BR/2009/AP67 AP67 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TROB/BR/2009/AP69 AP69 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TROB/BR/2009/AP70 AP70 Apuí Rhodnius robustus Não disponível
TROB/BR/2007/AM37 AM37 Coari Rhodnius robustus Xenocultura
TPIS/BR/2007/AM48 AM48 Coari Rhodnius pictipes Xenocultura
TPIS/BR/2007/TcV_1 TcV_1 Coari Rhodnius pictipes Não disponível
TPIS/BR/2007/TcV_5 TcV_5 Coari Rhodnius pictipes Não disponível
TPIS/BR/2007/TcV_6 TcV_6 Coari Rhodnius pictipes Não disponível
TROB/BR/2007/ TcV_19 TcV_19 Coari Rhodnius robustus Não disponível
TROB/BR/2007/ TcV_29 TcV_29 Coari Rhodnius robustus Não disponível
TPIS/BR/2007/TcV_35 TcV_35 Coari Rhodnius pictipes Não disponível
TPIS/BR/2007/TcV_41 TcV_41 Coari Rhodnius pictipes Não disponível
TPIS/BR/2007/TcV_47 TcV_47 Coari Rhodnius pictipes Não disponível
46
TPIS/BR/2007/TcV_98 TcV_98 Coari Rhodnius pictipes Não disponível
TPIS/BR/2007/AM33 AM33 Manaus Rhodnius pictipes Xenocultura
TROB/BR/2007/AM46 AM46 Manaus Rhodnius robustus Não disponível
TPIS/BR/2007/AM47 AM47 Manaus Rhodnius pictipes Não disponível
TROB/BR/2007/AM41 AM41 Maraã Rhodnius robustus Inoculação em camundongo
Reservatórios
MDID/BR/2007/AM28 AM28 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM29 AM29 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM30 AM30 Manaus Didelphis marsupialis Xenodiagnóstico
MDID/BR/2007/AM31 AM31 Manaus Didelphis marsupialis Xenodiagnóstico
MDID/BR/2007/AM32 AM32 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM35 AM35 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM39 AM39 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM40 AM40 Manaus Didelphis marsupialis Xenodiagnóstico
MDID/BR/2007/AM42 AM42 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM43 AM43 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM44 AM44 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MDID/BR/2007/AM45 AM45 Manaus Didelphis marsupialis Hemocultura
MPHI/BR/2007/AM34 AM34 Coari Philander opossum Hemocultura
MPHI/BR/2007/AM38 AM38 Coari Philander opossum Hemocultura
a: Conforme recomendado por Anonymous18.
47
Figura 3. Algoritmo com o desenho esquemático do estudo.
48
3.3 Caracterização genética
3.3.1 Extração do DNA
Os isolados de T. cruzi foram cultivados em meio LIT contendo 10% de soro
bovino fetal inativado, a 28°C, até atingirem a concentração aproximada de 1 x 109
células/mL. Para a extração do DNA total dos isolados foi utilizado o conjunto
PureLink Kit® (Invitrogen, Life technologies, Estados Unidos), de acordo com o
protocolo recomendado pelo fabricante. Resumidamente, para 200 µL da cultura
foram adicionados 20 µL de proteinase K e 200 µL de tampão de lise. Após completa
homogeneização em vórtex, a mistura foi incubada em banho-maria a 56°C por 10
minutos. Ao lisado foram adicionados 200 µL de etanol 96-100%, homogeneizando
em vórtex por 5 segundos para a obtenção de uma solução homogênea. Para a
purificação do DNA, a solução foi aplicada em coluna, que posteriormente foi lavada
sucessivamente com os dois tampões de lavagem. O DNA obtido foi eluído com 50
µL do tampão de eluição (POP_ENT_LB_025_v01_PT; Anexo 1).
Para algumas amostras, cujas tentativas de isolamento em cultura não deram
efeito, o DNA foi extraído diretamente do sangue total, no caso de pacientes com
doença de Chagas aguda, ou diretamente do conteúdo intestinal, para os
triatomíneos. A técnica utilizada para a extração foi a mesma descrita acima.
3.3.2 Tipagem genética nuclear
3.3.2.1 Gene do RNA ribossomal (rRNA)
A sequência do gene do 24Sα rRNA foi amplificada conforme descrito por Souto
et al.240 modificado por Macedo et al.155. Cada reação de amplificação foi realizada
em um termociclador num volume final de 12,5 μL. Em cada reação, foram utilizados
3,1 pM dos iniciadores D71 (5‟AAGGTGCGTCGACAGTGTGG) e D72
(5‟TTTTCAGAATGGCCGAACAGT). Depois da desnaturação inicial a 94°C por 1
minuto, as amostras foram submetidas a 30 ciclos (94°C por 30 segundos, 60°C por
30 segundos e 72°C por 30 segundos), com uma extensão final a 72°C por 10
minutos. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de poliacrilamida 6%
49
corado pela prata. Produtos de 110 pb podem ser produzidos tanto pela DTU TcI
quanto pela TcIII; produtos de 125 pb por TcII e TcVI; produtos de 120 ou 130 pb por
TcIV; e ambos os produtos de 110 pb e 125 pb por TcV, com menor intensidade da
banda de 125 pb47,147,240.
3.3.2.2 Gene do miniéxon
A amplificação diferencial de parte do espaçador não-transcrito do gene do
miniéxon foi realizada usando um conjunto de cinco oligonucleotídeos106. Três
iniciadores, derivados da região hipervariável do miniéxon (Tcl:
5‟ACACTTTCTGTGGCGCTGATCG; Tc2: 5‟TTGCTCGCACACTCGGCTGCAT e
Tc3: 5‟CCGCGWACAACCCCTMATAAAAATG) e um iniciador de uma região
específica do espaçador não transcrito do T. rangeli (TR:
5‟CCTATTGTGATCCCCATCTTCG) foram utilizados. Um oligonucleotídeo comum,
correspondente à sequência presente na região mais conservada do gene do
miniéxon (ME: 5‟TACCAATATAGTACAGAAACTG), foi usado como o iniciador
oposto na reação multiplex. Cada reação foi realizada com 10 ng de DNA genômico
e 100 pM de cada iniciador para um volume final de 25 μL. A amplificação consistiu
de 35 ciclos, incluindo desnaturação à 94°C, anelamento à 50°C e extensão à 72°C.
Os produtos da reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose (3%)
acrescido de brometo de etídio e visualizados com luz ultravioleta. Produtos de 250
pb são produzidos por TcII; produtos de 200 pb por TcI; produtos de 150 pb tanto
por TcIII quanto por TcIV; e produtos de 100 pb por T. rangeli.
3.3.2.3 Gene da glicose-fosfato isomerase (GPI)
A amplificação do gene da GPI foi realizada conforme descrito por Gaunt al.127.
Cada reação de amplificação foi realizada com 25 pM dos iniciadores gpi.for
(5‟CGCACACTGGCCCTATTATT) e gpi.rev (5‟TTCCATTGCTTTCCATGTCA) e 35
ng do DNA total, para um volume final de 25 μL. As amplificações foram
processadas em um termociclador e incluíram uma desnaturação inicial de 5 minutos
a 94°C, seguida por 28 ciclos (94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C
por 30 segundos), e uma extensão final de 72°C por 10 minutos. Os produtos da
PCR foram purificados usando o kit SureClean (Bioline, Reino Unido) e
50
sequenciados em ambas as direções comercialmente (Macrogen, Coréia do Sul). As
sequências foram depositadas no GenBank.
3.3.3 Tipagem genética mitocondrial
3.3.3.1 PCR-RFLP e sequenciamento do gene da subunidade 2 da citocromo-
oxidase mitocondrial (COII)
A amplificação da subunidade 2 do gene da COII foi realizada conforme descrito
por Freitas et al.121, com modificações3. Cada reação de amplificação foi realizada
com 3,1 pM dos iniciadores Tcmit-10 (5‟CCATATATTGTTGCATTATT) e Tcmit-21
(5‟TTGTAATAGGAGTCATGTTT) e 2 ng do DNA total, para um volume final da
reação de 15,0 μL. A amplificação foi processada num termociclador com uma
desnaturação inicial a 94°C por 1 minuto e 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 48°C
por 2 minutos, 72°C por 2 minutos, e extensão final a 72°C por 10 minutos. Dez
microlitros do produto de aproximadamente 400 pb de DNA do maxicírculo do T.
cruzi foram digeridos com 10 unidades da enzima de restrição AluI (Invitrogen) por
16 horas. A análise do RFLP do gene da COII foi feita em gel de poliacrilamida 4,5%
e revelado por coloração pela prata. No sítio polimórfico AluI, uma banda de
aproximadamente 300 pb é característica de TcI, uma banda de 250 pb é
característica de TcII e bandas com mais de 300 bp são características de TcIII, IV,
V e VI.
Para o sequenciamento, a amplificação do gene mitocondrial da COII foi
realizada usando os iniciadores Tcmit-31 (5'TAAATAATATATATTGTACATGAG) e
Tcmit-40 (5'CTRCATTGYCCATATATTGT), sob as mesmas condições descritas
acima. Os produtos da PCR foram purificados usando o kit SureClean (Bioline,
Reino Unido) e sequenciados comercialmente (Macrogen, Coréia do Sul). As
sequências foram depositadas no GenBank.
51
3.3.4 Análise filogenética
Para a análise filogenética, foi utilizado o método de Neighbor-Joining
implementado no software MEGA 4.1249. A árvore de consenso bootstrap foi inferida
a partir 1500 reamostragens, indicando a porcentagem de réplicas das árvores em
que houve agrupamentos semelhantes. A análise utilizou sequências com 400
posições de nucleotídeos para o gene da COII e 980 nucleotídeos para o gene da
GPI. As sequências dos genes da GPI e COII das cepas de referência para
comparação com os novos isolados foram obtidas do GenBank.
3.4 Caracterização biológica
3.4.1 Animais
Para os experimentos realizados no LDCh/UEM, foram utilizados 20
camundongos Swiss machos com 21 a 28 dias de idade, pesando entre 18 e 20g,
provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá. Os
experimentos realizados na GE/FMT-HVD utilizaram 7 camundongos Swiss machos
com 12 a 15 dias, pesando entre 10 e 15 gramas, provenientes do Biotério da FMT-
HVD. Em ambos os laboratórios, os camundongos foram mantidos em gaiolas
espaçosas, em ambiente bem ventilado e com condições adequadas de
temperatura, com disponibilidade de ração comercial para roedores e água ad
libitum.
3.4.2 Preparo dos inóculos
3.4.2.1 Obtenção de tripomastigotas sanguíneas (TS)
Um grupo de camundongos Balb/C foi inoculado por via intraperitoneal com
aproximadamente 0,3 mL de cultura em meio LIT rica em tripomastigotas. Este
grupo foi acompanhado diariamente por meio de exame de sangue a fresco para a
verificação da infecção e determinação da parasitemia. No pico de parasitemia foi
obtido sangue heparinizado do grupo de manutenção por punção do plexo venoso
retro-orbitário, conforme instruções do POP_ENT_LB_018_v01_PT (Anexo 1). O
52
sangue obtido foi examinado ao microscópio ótico para a determinação da
parasitemia pelo Método de Pizzi-Brener, conforme o POP_ENT_LB_0015_v01_PT
(Anexo 1). Conhecendo-se a parasitemia, foi padronizado o inóculo a ser utilizado na
infecção dos camundongos42. Para o procedimento completo de obtenção de
tripomastigotas sanguíneos de Trypanosoma cruzi, consultar o
POP_ENT_LB_012_v01_PT (Anexo 1).
A infecção experimental de camundongos para a caracterização biológica dos
isolados utilizando tripomastigotas sanguíneas, inoculados pela via intraperitoneal,
foi realizada no LDCh/UEM. A padronização dos inóculos para cada
experimento/isolado está descrita na Tabela 4.
Tabela 4. Isolados e respectivos inóculos de tripomastigotas sanguíneas utilizados
na caracterização biológica em camundongos.
Isolados Inóculo (TSa/animal)
AM04 1,4 x 103
AM08, AM13, AM32 e AM 39 2,8 x 103
AM64 5,0 x 103
AM05, AM14, AM15, AM18, AM30, AM57, AM62
AM67, AM68 e AM69
1,0 x 104
a: Tripomastigotas sanguíneas.
Conforme se verifica na Tabela 4, para alguns isolados não foi possível a
obtenção de um inóculo de 1,0 x 104 TS/camundongo, pois estes não determinaram
parasitemias suficientes. A opção encontrada foi trabalhar com inóculos menores,
nestes casos.
3.4.2.2 Obtenção de tripomastigotas metacíclicos (TM) de cultura
Após a cultura em meio LIT ter atingido a fase estacionária tardia, na qual ocorre
maior porcentagem de tripomastigotas, coletaram-se e centrifugaram-se cerca de 3
mL de material. Do sedimento, foram coletadas quatro gotas, colocando-as sobre
uma lâmina. A lâmina foi fixada e corada por Giemsa. Ao microscópio ótico, sob
53
imersão, determinou-se a porcentagem de epimastigotas e tripomastigotas. Em
câmara de Neubauer, realizou-se a contagem global dos parasitos, subtraindo-se o
percentual de epimastigotas encontrado para posterior padronização do inóculo que
será utilizado na infecção experimental dos camundongos. O procedimento
detalhado para manutenção das amostras em culturas acelulares e obtenção de
tripomastigotas a partir de culturas de Trypanosoma cruzi está descrito no
POP_ENT_LB_011_v01_PT (Anexo 1).
A infecção experimental de camundongos utilizando tripomastigotas obtidas por
este método, utilizando a via intraperitoneal, foi realizada para a caracterização
biológica e avaliação das alterações histopatológicas causadas pelos isolados
AM28, AM38, AM41, AM49, AM61, AM69 e AM70, em experimentos realizados na
GE/FMT-AM, utilizando um inóculo de 1,0 x 106 TM/camundongo, e para a
caracterização biológica dos isolados AM37 e AM56, no LDCh/UEM, utilizando um
inóculo de 2,0 x 106 TM/camundongo. Justifica-se o emprego de tripomastigotas de
cultura em detrimento de tripomastigotas sanguíneas nestes casos pela dificuldade
técnica de se obter as últimas formas infectantes nas parasitemias escassas
determinadas por estes isolados.
3.4.3 Técnicas de comprovação da infecção
3.4.3.1 Exame de sangue a fresco (ESF)
Para a realização do ESF foi realizada a sangria dos camundongos pela cauda
(POP_ENT_LB_019_v01_PT; Anexo 1), coletando-se 5 µL de sangue de cada
animal. O exame de sangue a fresco (ESF) foi realizado a partir do 3º dia após a
inoculação (d.a.i.) até a negativação por pelo menos três dias consecutivos em caso
de parasitemia patente, ou em um período mínimo de 30 dias no caso de
parasitemia subpatente. Depositou-se o sangue sobre uma lâmina, que foi
imediatamente levada ao microscópio, sob objetiva de 40x, percorrendo-se toda a
área da lamínula. O resultado foi expresso como positivo ou negativo. Determinou-se
a porcentagem de animais que apresentaram ESF positivo (%ESF+), para cada
isolado estudado.
54
3.4.3.2 Hemocultura (HC)
No 55º d.a.i., para os experimentos realizados no LDCh/UEM, e no 90º d.a.i., para
os experimentos realizados na GE/FMTHVD, foi coletado assepticamente 0,5 mL de
sangue do plexo retrorbitário dos camundongos. O sangue foi distribuído em dois
tubos contendo 3mL de meio LIT cada114. As culturas foram mantidas em estufa a
28ºC e monitoradas microscopicamente para a verificação do crescimento de
parasitos após 15, 30, 45 e 60 dias da semeadura (POP_ENT_LB_016_v01_PT;
Anexo 1). Com esta técnica foi obtido o parâmetro porcentagem de camundongos
com hemocultura positiva (%HC+) para cada isolado.
3.4.3.3 Reação da polimerase em cadeia (PCR)
Para os experimentos realizados no LDCh/UEM, foi realizada a PCR utilizando-se
200 µL de sangue de cada animal, coletado do plexo retro-orbitário, na mesma
ocasião da coleta de material para a HC. Ao material coletado foi acrescentado o
dobro de volume de guanidina HCl 6M + EDTA pH 8,0 200 mM. A mistura foi
conservada à temperatura ambiente. Uma semana após a coleta, o lisado foi fervido
por 7 minutos e também mantido à temperatura ambiente. De cada amostra foi
retirada uma alíquota de 100 L para extração do DNA com fenol-clorofórmio,
segundo o protocolo de Wincker et al.279, com as modificações introduzidas por
Gomes et al.129. Durante esta etapa, para cada grupo de quatro amostras, foram
acrescentados um controle negativo (sangue de camundongo não infectado) e um
controle positivo (DNA de sangue de camundongo infectado com a cepa Y de T.
cruzi) (POP_ENT_LB_020_v01_PT; Anexo 1).
A PCR foi realizada segundo o protocolo de Gomes et al.129, detalhado no
POP_ENT_LB_021_v01_PT (Anexo 1). Foram utilizados os iniciadores 121
(5‟AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA3‟) e 122 (5‟GGTTCGATTGGGG
TTGGTGTAATATA 3‟) descritos por Wincker et al.279, que amplificam um fragmento
de 330 pb do minicírculo. À mistura de reação foram aplicados 35 ciclos de
amplificação. As condições da reação foram: desnaturação do DNA a 95C por 1
minuto (com etapa inicial mais longa por 5 minutos), anelamento dos iniciadores a
55
65C por 1 minuto e extensão a 72C por 1 minuto (com etapa final de 10 minutos).
Como controle positivo da PCR foi utilizado 10 pg de DNA da cepa PR379 de T.
cruzi e como controle negativo (branco) todos os reagentes da reação exceto o
DNA. O DNA amplificado pela PCR foi visualizado por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 4,5% revelado pela prata. A visualização de uma única banda de
peso molecular 330 pb indicará a presença de kDNA de T. cruzi amplificado (PCR
positiva).
Com os resultados da PCR foi obtido o parâmetro porcentagem de camundongos
com PCR positiva (%PCR+) para cada isolado180.
3.4.3.4 Infecciosidade
O coeficiente de infecciosidade (%INF) foi calculado pela porcentagem de
animais que apresentaram exame de sangue a fresco positivo nos dois primeiros
meses após a inoculação e/ou hemocultura e/ou PCR positivas no 55º d.a.i.
3.4.4 Mortalidade
A mortalidade foi registrada diariamente ao longo da infecção e expressa em
porcentagem cumulativa (%MOR). As mortes ocorridas durante os primeiros 90 dias
após a infecção foram registradas como mortalidade na fase aguda (FA). Mortes
ocorridas após o 90º d.a.i. até o final do período de seis meses de acompanhamento
foram registradas como mortalidade da fase crônica (FC). O dia da morte dos
animais também foi registrado (POP_ENT_LB_014_v01_PT; Anexo 1).
3.4.5 Curva de parasitemia
Na mesma ocasião da realização do ESF (Vide Item 3.3.3.1), foi determinada a
parasitemia nos camundongos que se apresentaram positivos. A contagem das
formas tripomastigotas na corrente sanguínea foi realizada diariamente a partir do 3º
d.a.i. até o 60º d.a.i., em 5 μL de sangue coletado da cauda do animal42.
Estabeleceu-se uma média aritmética do número das formas sangüíneas
observadas para cada animal e calculou-se a parasitemia diária média para cada
56
grupo experimental. Traçou-se, ao final, uma curva parasitêmica, relacionando o dia
de infecção com a parasitemia diária média. O procedimento detalhado para a
determinação da parasitemia em camundongos infectados pelo T. cruzi (Método de
Pizzi-Brener) está descrito no POP_ENT_LB_015_v01_PT (Anexo 1). Os seguintes
parâmetros parasitológicos foram obtidos da curva de parasitemia:
i) Período pré-patente médio (PPP): período decorrente da inoculação até a
positivação do ESF, calculado através da média do período pré-patente em dias dos
camundongos com parasitemia patente.
ii) Período patente médio (PP): período em que o ESF manteve-se positivo,
calculado através da média do período patente em dias dos camundongos com
parasitemia patente.
iii) Parasitemia diária média (PDM): parasitemia média encontrada durante o período
patente, calculado através da média da parasitemia diária de cada camundongo com
parasitemia patente.
iv) Pico máximo de parasitemia médio (Pmax): maior valor da parasitemia
encontrado durante o período patente, calculado através da média do pico máximo
de parasitemia de cada camundongo com parasitemia patente.
v) Dia em que ocorreu o pico máximo (DPmax): calculado através da média dos dias
do pico máximo de parasitemia de cada camundongo com parasitemia patente.
A caracterização do grau de parasitemia foi feita de acordo com Devera et al.87:
parasitemia elevada - picos parasitêmicos médios maiores que 1.500 parasitos por 5
μL de sangue; parasitemia média - picos parasitêmicos médios entre 500 e 1.499
tripomastigotas por 5 μL de sangue; baixa parasitemia - picos parasitêmicos médios
inferiores a 500 formas sangüíneas por 5 μL de sangue.
3.4.6 Resposta humoral
Os camundongos dos experimentos realizados no LDCh/UEM foram submetidos
à avaliação preliminar da resposta humoral pela detecção de IgG total anti-T. cruzi
57
no soro pelo ensaio imunoenzimático de fase sólida (ELISA)276, realizado no Núcleo
de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, no
Estado de Minas Gerais. Os testes de ELISA foram realizados com amostras de soro
coletadas três e seis meses após o tratamento. Resumidamente, as placas foram
sensibilizadas com antígeno de T. cruzi preparado por extração alcalina da cepa Y
(TcII) obtida de cultura em fase de crescimento exponencial em meio LIT273. Os
anticorpos ligantes foram detectados usando conjugado anti-IgG de camundongo
marcado com peroxidase (Bethyl Laboratories, Montgomery, Estados Unidos), e as
absorbâncias foram lidas num comprimento de onda de 490 nm. Para otimizar a
diluição dos soros, as amostras foram tituladas de 1:20 a 1:1240 e os ensaios foram
realizados com quatro amostras, cada uma apresentando alta, média e baixa
reatividade, em paralelo com quatro amostras provenientes de camundongos não
infectados. Melhor discriminação foi observada a 1:100, e esta diluição foi
empregado em todos os ensaios adicionais. O ponto de corte foi tomado como a
média ± 2 desvios-padrão de amostras negativas (n = 20).
Com os resultados do ELISA foi obtido o parâmetro porcentagem de
camundongos com ELISA positivo (%ELISA+) 3 e 6 meses após o tratamento, para
cada isolado180, bem como sensibilidade, especificidade e valores preditivos deste
teste.
3.4.7 Suscetibilidade ao benzonidazol
O POP_ENT_LB_024_v01_PT (Anexo 1) descreve com detalhes todas as etapas
da quimioterapia experimental da doença de Chagas em camundongos.
3.4.7.1 Tratamento dos animais
Dez camundongos foram inoculados com cada isolado para os experimentos de
avaliação da suscetibilidade ao benzonidazol. A partir do início do período patente
de infecção (aproximadamente 5 dias após a inoculação), os animais foram tratados
por via oral com benzonidazol, 100mg/kg/dia, por 20 dias consecutivos114. Os dez
animais inoculados e não tratados, descritos anteriormente, constituíram o grupo
controle. Ambos os grupos (tratados e não tratados) foram submetidos a diferentes
58
técnicas de diagnóstico utilizadas no controle de cura para se determinar a
suscetibilidade ao benzonidazol.
3.4.7.2 Critérios de cura
Foi considerado como “curado” todo animal que apresentou ESF, HC e PCR
negativos no 55º d.a.i. Os procedimentos para a realização destes exames são os
mesmos descritos em itens anteriores. Foi considerado „dissociado‟139 o
camundongo que apresentou ESF, HC e PCR negativos e ELISA persistentemente
positiva após o término do tratamento. Para a análise estatística os animais
classificados como dissociados foram considerados como curados.
3.4.7.3 Índice de cura
A porcentagem de cura nos animais inoculados com cada isolado e tratados com
BZ foi obtida pela razão entre o número de animais considerados curados e o total
de animais tratados x 100. Para determinação da suscetibilidade in vivo dos isolados
de T. cruzi ao agente quimioterápico foi adotado critério semelhante ao de Toledo et
al.260: isolados com índices de cura de 0% a 33% foram considerados resistentes à
droga, aqueles com índices de cura entre 34% e 67% foram considerados de
sensibilidade intermediária e isolados com índices de cura acima de 67% foram
considerados sensíveis à droga.
3.4.8 Parâmetros histopatológicos
Para o estudo do tropismo tecidual, foram sacrificados, para cada isolado
inoculado, 7 animais infectados, no 90º d.a.i. Os animais foram sacrificados por
vapores de éter. Dos animais sacrificados foram retirados fragmentos dos seguintes
órgãos: cérebro, coração, músculos esqueléticos (músculos abdominais), intestino
grosso, fígado e baço. Esses fragmentos foram mantidos em formalina tamponada
por 10 dias. Após lavagem em água corrente, as peças foram submetidas aos
processos de desidratação (adição e substituição sucessiva de álcool 70%, álcool
80%, álcool 95%, álcool etílico absoluto e xilol) e diafanização para inclusão em
parafina. Secções de 5 μm de cada peça serão cortadas em micrótomo, estendidas
59
em lâminas e coradas por hematoxilina-eosina. Os procedimentos para coleta e
processamento de órgãos e tecidos de camundongos estão descritos no
POP_ENT_LB_029_v01_PT (Anexo 1).
Os cortes foram examinados ao microscópio em toda a sua extensão,
determinando-se a presença do parasito (parasitismo tecidual) e de reações
inflamatórias. A intensidade do parasitismo e do processo inflamatório foi assim
classificada: (-) = ausência de parasitismo ou de inflamação; (+) = grau discreto, com
reação inflamatória suave e focal; (++) = grau moderado, com inflamação
moderadamente difusa; e (+++) = grau intenso, com inflamação difusa grave.
3.5 Considerações Éticas
3.5.1 Aprovação dos experimentos com os isolados provenientes de pacientes
A utilização das amostras de origem humana foi aprovada pelo Comitê de Ética
em Pesquisa com Seres Humanos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
(Aprovação número 1940, de 31 de outubro de 2008; Anexo 2).
3.5.2 Aprovação da coleta de mamíferos silvestres e da utilização dos animais de
experimentação
A captura e a coleta de material de mamíferos silvestres foram autorizadas pelo
Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e dos Recursos Naturais (Registro número
1830651, de 3 de setembro de 2007; Anexo 4).
Os experimentos com animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê de
Conduta Ética no Uso de Animais em Experimentação da Universidade Estadual de
Maringá (Parecer número 113, de 3 de novembro de 2009; Anexo 3).
3.6 Análise estatística
Os dados foram analisados utilizando o programa SPSS® versão 16.0 para
Windows (SPSS Inc.® Chicago, Estados Unidos). A normalidade dos dados foi
60
verificada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Os testes do Qui-quadrado ou Fisher
foram usados para verificar diferenças nas proporções (%ESF+, %HC+, %PCR+,
%INF, %MOR, índice de cura, %ELISA+, sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo e valor preditivo negativo, freqüência de animais com processo
inflamatório e parasitismo tecidual) e o teste t-Student foi usado para verificar
diferenças nas médias (PPP, PP, PDM, Pmax, DPmax, dia da morte dos animais),
para os grupos de isolados provenientes de diferentes reservatórios, no caso do
Artigo 3, ou pertencentes a diferentes DTU de T. cruzi, para o Artigo 4.
A análise de sobrevida pelo método de Kaplan-Meier foi realizada com o objetivo
de se detectar diferenças no tempo decorrido do dia da inoculação até o dia das
mortes dos camundongos e até o início do período patente entre os grupos de
camundongos inoculados com as diferentes DTU. O teste do log-rank foi usado para
verificar as diferenças.
Todos os testes foram realizados com níveis de significância de 5%.
3.7 Financiamento e parcerias
A pesquisa teve o apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) (410398 ⁄ 2006-3), através de repasse de verbas
para o projeto “Doenças de Chagas no Amazonas: Ecologia do ciclo de transmissão
em Manaus, Coari e Tefé”, coordenado pela Profa. Dra. Maria das Graças Vale
Barbosa, e da Fundação de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do
Paraná (Fundação Araucária) (Ato da Diretoria Executiva 057/2009), através do
projeto “Comportamento Biológico e Suscetibilidade ao Benzonidazol em
Camundongo de Isolados de Trypanosoma cruzi da Amazônia Brasileira”,
coordenado pelo Prof. Dr. Max Jean de Ornelas Toledo. O projeto contou também
com auxílio do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, da Universidade Nova de
Lisboa (Portugal), para a realização do sequenciamento dos genes da COII e da GPI
dos isolados de T. cruzi, pelo Prof. Dr. Henrique Silveira.
O ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de IgG total anti-T. cruzi nos
camundongos foi realizado pela Profa. Dra. Maria Terezinha Bahia, no Núcleo de
61
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, na
cidade de Ouro Preto, Estado de Minas Gerais, com recursos desta instituição.
O treinamento para a caracterização biológica dos isolados de T. cruzi, realizado
no LDCh/UEM, na cidade de Maringá, Estado do Paraná, sob orientação do Prof. Dr.
Max Jean de Ornelas Toledo, foi beneficiado com auxílio financeiro para a compra
de passagens pelo convênio do Programa de Apoio à Pós-Graduação (PROAP), da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). A tese se
insere no Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do
Estado do Amazonas, em convênio com a FMT-HVD, beneficiando-se do auxílio
financeiro e da infraestrutura específica dessas instituições.
62
4 RESULTADOS
63
ARTIGO 1
Monteiro WM, Magalhães LK, Santana-Filho FS, Borborema M, Silveira H, Barbosa
MGV. Trypanosoma cruzi TcIII/Z3 genotype as agent of an outbreak of Chagas
disease in the Brazilian Western Amazonia. Trop Med Int Health 2010; 15: 1049-51.
64
Trypanosoma cruzi TcIII/Z3 genotype as agent of an outbreak of Chagas
disease in the Brazilian Western Amazonia
Wuelton M. Monteiro 1,2,3, Laylah K. Magalhães 1,2, Franklin S. Santana-Filho 1,2,
Maurício Borborema 1,2, Henrique Silveira 1,4 and Maria das Graças V. Barbosa
1,2,5
1 Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, Brazil
2 Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Brazil
3 Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Brazil
4 Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Centro de Malária e outras Doenças
Tropicais, UEI Malária, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal
5 Centro Universitário Nilton Lins, Manaus, Brazil
Corresponding Author Henrique Silveira, FMTAM, Av Pedro Teixeira, 25, Dom
Pedro, 69040-000 Manaus, AM, Brazil or CMDT, IHMT, Rua da Junqueira, 100,
1349-008 Lisboa, Portugal. Tel.: +351213652657; Fax: +351213622458;
E-mail:[email protected]
65
Summary
Chagas‟ disease is an emerging and neglected disease in the Brazilian Amazon
region, where T. cruzi I predominates among the acute cases of the disease; and T.
cruzi III/Z3, a population cluster from sylvatic areas of the Amazon basin, is rarely
associated with human infections. On April 23rd, 2007, the Foundation for Health
Surveillance of the State of Amazonas, Brazil reported to the Ministry of Health, an
outbreak of acute Chagas disease in the municipality of Coari, on the Solimões River
banks. Fresh blood examination confirmed the infection in 25 cases. Parasite culture
in LIT medium was successful for 18 isolates. Molecular characterization was
performed by PCR of the non-transcribed spacer of the mini-exon and by sequencing
of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II (COII) gene. The T. cruzi
isolates were all from genotype Z3, and sequencing revealed that all isolates had
equal COII sequences compatible with TcIII type, suggesting a single source of
infection. To our knowledge this is the first outbreak of acute cases caused uniquely
by the genotype TcIII/Z3. Wild vectors harboring TcIII stocks contribute to
transmission when the triatomine species reaches human food chain or when
humans invade the forest environment, where sylvatic cycle constitutes a reservoir of
parasites that might be associated with specific epidemiological and clinical traits of
the emergent Chagas disease in the Amazon.
keywords
Trypanossoma cruzi, outbreak, genotype, acute Chagas disease
66
Transmission of Chagas disease was successfully controlled in Brazil. However, it
has been recently recognized as an emerging and neglected disease in the Brazilian
Amazon, a geographic area not traditionally associated with the disease. In this
region, hundreds of cases were reported in recent decades normally associated with
oral transmission. Information from the Brazilian Ministry of Health indicates that 455
cases of acute Chagas disease were reported in Brazil from 2005 to May 2009 of
which, strikingly, 389 cases (85.5%) occurred in the north of the country. The
Brazilian states with the highest numbers of acute cases were Pará with 310 cases
(68.1%) and Amazonas with 29 (6.4%), both in the Amazon Region (Ministry of
Health,http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/tabchagascasos0509.pdf;http://1
89.28.128.102/portal/saude/visualizar_texto.cfm?idtxt=26087).
On April 23rd, 2007, the Foundation for Health Surveillance of the State of Amazonas
reported to the Ministry of Health, an outbreak of acute CD in the municipality of
Coari, on the Solimões River banks (Figure1). Patients had acute febrile illness
accompanied by headache, myalgia, epigastric pain, vomiting and oedema of the
face and lower limbs. The first cases were identified by thick blood smears performed
for malaria diagnosis, in which, Trypanosoma cruzi trypomastigote forms were seen.
Following the protocol recommended by the Ministry of Health, patients were treated
with benznidazole.
Immediately after the first case reported, the entire population (175 individuals) was
surveyed for the presence of T. cruzi in peripheral blood. Fresh blood examination or
thick blood smears confirmed the infection in 25 cases of symptomatic acute Chagas
disease. Heparinized venous blood was collected, and approximately 0.5 ml of whole
blood was placed on NNN medium, covered with an overlay of LIT medium
containing 10% foetal calf serum and 140 mg/ml of gentamycin sulphate. Cultures
were kept at 28°C and monitored microscopically for parasite growth twice a week for
2 months. Parasite culture was successful in 18 patients. This study was approved
by the Research Ethics Committee of the Tropical Medicine Foundation of Amazonas
(ref.0360/07).
To characterize genotypically the isolated parasites, extraction of total DNA from in
vitro isolates of T. cruzi was performed using the Pure Link Kit (Invitrogen, Life
technologies, USA), according to the manufacturer‟s protocol. DNA was prepared
67
from 200 µl of culture and eluted with 50 µl of milli Q water. DNA from the non-
transcribed spacer of the mini-exon was amplified according to the multiplex protocol,
as described previously (Fernandes et al. 2001). Positive and negative controls were
added to each reaction. T. cruzi mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II (COII)
was amplified using the protocol described by Freitas et al. (2006). The amplified
PCR products were purified using Sure Clean Kit (Bioline, UK) and sequenced in
both directions using the primers TcMit31 and TcMit40. PCR products were
commercially sequenced by Macrogen (Korea).
The T. cruzi isolates from the 18 patients were all from genotype Z3 (Fernandes et al.
2001), and sequencing (Accession Numbers: GU178012 to GU178029) revealed that
all isolates had equal COII sequences compatible with TcIII type (Freitas et al. 2006),
similar to clone M6241 cl6 that, according to the most recent nomenclature is
classified as DTU TcIII (Zingales et al. 2009) (Figure 2). This suggests a single
source of infection, which is consistent with the probable route of infection through
ingestion of contaminated açaí juice produced in a single location in the rural
community of Santa Maria
(MinistryofHealth,http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/tabchagascasos0509.
pdf;http://189.28.128.102/portal/saude/visualizar_texto.cfm?idtxt=26087).
Early work using independent genetic markers pointed to the division of T. cruzi into
two major groups, named as T. cruzi I (TcI) and T. cruzi II (TcII) (Anonymous 1999),
corresponding, respectively, to zymodemes Z1 and Z2, defined in pioneer studies
based on the electrophoretic profiles of isozymes (Miles et al. 1978). A third group,
zymodemeZ3, with scarce isolates from the sylvatic cycle of the Amazon region,
could not be grouped into any of the two major lineages (Miles et al. 1978). More
recent data based on microsatellite loci, COII gene sequence (Freitas et al. 2006)
and chromosome size variation (Pedroso et al. 2007) indicate that Z3 isolates from
the Brazilian Amazon constitute an independent cluster, T. cruzi III (TcIII). TcII
predominates in the domestic transmission cycle in the Southern Cone of South
America, where patients may present severe acute disease with chronic cardiac
and/or digestive involvement (Chapman et al. 1984).
68
In the Brazilian Amazon, Venezuela and Colombia, TcI is the predominant lineage
and the major cause of both acute and cardiac CD, but not "mega" syndromes (Miles
et al. 1981); while TcIII causes sporadic acute cases of CD in the Brazilian Amazon
basin (Miles et al. 1981). TcIII has associated with terrestrial ecotopes from different
reservoirs and vectors (e.g. Yeo et al. 2005; Marcili et al. 2009). Outbreaks of acute
Chagas disease caused by TcI and Z3 (TcIII or TcIV) have been reported (Valente et
al. 2009); but to our knowledge this is the first outbreak of acute cases caused
uniquely by this genotype. In contrast with data from Venezuelan localities where TcI
are responsible for acute human infection, causing severe heart failure (Añez et al.
2004); in this outbreak, there were no deaths or severe cases. Chronic disease
(cardiac/digestive form) has been reported for Z3 type parasites (Garzón et al. 2002),
which highlight the need for the characterization of epidemiological and clinical traits
associated with different genotypes of the emergent CD in the Amazon.
The data presented here represent an important contribution to the knowledge of the
epidemiology of Chagas disease in the Amazon, indicating that wild vectors
harbouring TcIII stocks may contribute to transmission of Chagas disease when the
triatomine species are accidently brought into human food chain or contact with
humans because of environmental changes.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from CNPq - National Counsel of
Technological and Scientific Development (410398/2006-3). HS was supported by a
grant from Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)
and the Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM).
References
Añez N, Crisante G, Maia-da-Silva F et al. (2004) Predominance of lineage I among
Trypanosoma cruzi isolates from Venezuelan patients with different clinical profiles of
acute Chagas‟ disease. Tropical Medicine and International Health 9, 1319–1326.
69
Anonymous (1999) Recommendations from a Satellite Meeting. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz 94, 429–432.
Chapman MD, Baggaley RC, Godfrey-Fausset PF et al. (1984) Trypanosoma cruzi
from the Paraguayan Chaco: isoenzyme profiles of strains isolated at Makthlawaiya.
Journal of Protozoology 31, 482–6.
Fernandes O, Santos SS, Cupolillo E et al. (2001) A mini-exon multiplex polymerase
chain reaction to distinguish the major groups of Trypanosoma cruzi and T. rangeli in
the Brazilian Amazon. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and
Hygiene 95, 97–99.
Freitas JM, Augusto-Pinto L, Pimenta JR et al. (2006). Ancestral genomes, sex, and
the population structure of Trypanosoma cruzi. PLoS Pathogens 2, e24.
Garzón EA, Barnabé C, Córdova X et al. (2002) Trypanosoma cruzi isoenzyme
variability in Ecuador: first observation of zymodeme III genotypes in chronic
chagasic patients. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and
Hygiene 96, 378-382.
Marcili A, Valente VC, Valente SA et al. (2009) Trypanosoma cruzi in Brazilian
Amazonia: Lineages TCI and TCIIa in wild primates, Rhodnius spp. and in humans
with Chagas disease associated with oral transmission. International Journal for
Parasitology 39, 615–623.
Miles MA, Cedillos RA, Póvoa MM, Souza AA, Prata A & Macedo V (1981) Do
radically dissimilar Trypanosoma cruzi strains (zymodemes) cause Venezuelan and
Brazilian forms of Chagas disease? Lancet 1, 1338–1340.
Miles MA, Souza A, Povoa M, Shaw JJ, Lainson R & Toyé PJ (1978) Isoenzymic
heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first autochthonous patients with Chagas‟
disease in Amazonian Brazil. Nature 272, 819–821.
70
Pedroso A, Cupolillo E & Zingales B (2007) Trypanosoma cruzi: Exploring the
nuclear genome of zymodeme 3 stocks by chromosome size polymorphism.
Experimental Parasitology 116, 71–76.
Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biological Evolution 24,
1596-1599.
Valente SAS, Valente VC, Pinto AYN et al. (2009) Analysis of an acute Chagas
disease outbreak in the Brazilian Amazon: human cases, triatomines, reservoir
mammals and parasites. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and
Hygiene 103, 291–297.
Yeo M, Acosta N, Llevellyn M et al. (2005) Origins of Chagas disease: Didelphis
species are natural hosts of Trypanosoma cruzi I and armadillos hosts of
Trypanosoma cruzi II, including hybrids. International Journal for Parasitology 35,
225–233.
Zingales B, Andrade SG, Briones MRS et al. (2009) A new consensus for
Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision meeting recommends
TcI to TcVI. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 104, 1051–1054.
71
Figure 1 Geographical location of the municipal district of Coari, Amazon State,
Brazil where the acute Chagas disease outbreak occurred.
72
Figure 2 Allocation of the Trypanosoma cruzi isolated during acute Chagas disease
outbreak (Accession numbers: GU178012 to GU178029) into known phylogenetic
clusters, most recently classified as TcI, TcII, TcIII and TcIV (Zingales et al. 2009).
The phylogenetic analysis used the Neighbour-Joining method implemented in
MEGA 4.1 (Tamura et al. 2007). The bootstrap consensus tree was inferred from
1500 replicates, and the percentage of replicate trees in which the associated taxa
clustered together are shown next to the branches. There were a total of 400
positions in the final dataset. TcIV – strain CANIIIcl1, AF359030; TcII –strain
Esmeraldo cl13, AF359035; TcI – strain Silvio X10cl4, EU302222; TcIII –strain
M6241cl6, AF359032.
73
ARTIGO 2
Monteiro WM, Magalhães LKC, Sá ARN, Gomes ML, Toledo MJO, Borges L, Pires I,
Guerra JAO, Silveira H, Barbosa MGV. Trypanosoma cruzi IV causing outbreaks of
oral transmission and mixed infections by different haplotypes in humans, Western
Brazilian Amazonia. A ser enviado para a Revista Plos Neglected Tropical Diseases.
74
Trypanosoma cruzi IV causing outbreaks of oral transmission and mixed
infections by different haplotypes in humans, Western Brazilian Amazonia
Wuelton Marcelo Monteiro 1,2,3, Laylah Kelre Costa Magalhães 1,2, Amanda Regina
Nishi de Sá 4, Mônica Lúcia Gomes 4, Max Jean de Ornelas Toledo 4, Lara Borges 5,
Isa Pires 5, Jorge Augusto de Oliveira Guerra 1,2, Henrique Silveira 1,2,5*, Maria das
Graças Vale Barbosa 1,2,6
1 Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil, 2
University of the State of Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil, 3 Federal University
of Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil, 4 State University of Maringá, Maringá,
Paraná, Brazil, 5 Hygiene Tropical Medicine Institute, Center of Malaria and other
Tropical Diseases, New University of Lisbone, Lisbone, Portugal, 6 Nilton Lins
Universitary Center, Manaus, Amazonas, Brazil
Funding: This study was supported by the National Counsel of Technological and
Scientific Development (grant number 410398/2006-3) and by the Araucária
Foundation (grant number 57/2009).
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail:[email protected]
75
Abstract
Background: Chagas disease is a neglected and emergent tropical disease in the
Brazilian Amazon Region, with an expressive increasing number of cases in recent
decades. In this region, knowledge about the sylvatic cycle of Trypanosoma cruzi
transmission, which constitutes a reservoir of parasites that might be associated with
specific molecular, epidemiological and clinical traits, has been poorly explored. The
objective of this work is to characterize genetically stocks of T. cruzi from human
cases, triatomines and reservoir mammals in the State of Amazonas, in the Western
Brazilian Amazon.
Methodology/Principal Findings: We analyzed 96 T. cruzi samples from four
municipalities located in distantly locations of the State of Amazonas. Molecular
characterization was performed by PCR of the non-transcribed spacer of the mini-
exon and of the 24α ribosomal RNA gene, RFLP of the mitochondrial cytochrome c
oxidase subunit II (COII) gene, and by sequencing of COII and glucose-phosphate
isomerase genes, from cultures in LIT medium or directly from vectors or whole
human blood. The T. cruzi parasites from two outbreaks of acute disease were all
typed as TcIV. An outbreak was triggered by several haplotypes of the same DTU.
TcIV occurred also in isolated cases and in Rhodnius robustus. Incongruence
between mitochondrial and nuclear phylogenies is likely indicative of historical
genetic exchange events resulting in mitochondrial introgression between TcIII and
TcIV DTUs from Western Brazilian Amazon.TcI predominated among triatomines and
was the unique DTU infecting marsupials.
Conclusion/Significance: DTU TcIV, rarely associated with human Chagas disease
in other areas of the Amazon basin, is the major responsible for the human infections
in the Western Brazilian Amazon, occurring in outbreaks as single or mixed infections
by different haplotypes.
76
Author Summary
Although transmission of Chagas disease was successfully controlled in ancient
endemic areas from Brazil, hundreds of acute cases have been reported from across
the Brazilian Amazon in recent decades. Trypanosoma cruzi, the causative agent of
Chagas disease, is transmitted by species of triatomines commonly found in the
Americas. In the Amazon, small family or neighborhood outbreaks of acute Chagas
disease probably result from oral transmission. The parasite is divided into six
genotypes, named TcI to TcVI. T. cruzi isolates from this region generally belong to
TcI type, causing cardiac and asymptomatic disease. Ninety six stocks of T. cruzi
were isolated in the Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado,
Manaus, State of Amazonas, between April 2006 to January 2010, from four
municipalities located in distantly regions of the State of Amazonas. Characterizing
these isolates using a set of molecular markers, we determined wich DTUs circulate
in human cases, triatomines and reservoir mammals in the State of Amazonas,
Western Brazilian Amazon. An unexpected result observed in the present study, and
until now unreported in the literature, was the predominance of TcIV strains from
patiens with acute chagasic infection in outbreaks associated with T. cruzi-
contaminated beverages. We observed also for the first time different haplotypes
responsible by a single outbreak.
77
Introduction
Chagas disease is an important parasitic disease resulting from the infection by the
flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The geographical distribution of silvatic T.
cruzi is widespread from southern United States to southern Argentina and Chile.
Domestic transmission is limited to Central and South America where domiciliated
vector species occur. Human infection occurs primarily through mucosal or broken
skin contact with contaminated triatomine faeces egested by the insect during
feeding [1,2]. More than 100 species of triatomines and about 180 species of
mammals maintain the natural cycle of T. cruzi in the sylvatic environment [3,4].
Although great advances have been reached in vectorial and transfusional
transmission, reducing the incidence of Chagas disease by more than 70%, it is
estimated that 7,6 million individuals still remain infected in Central and Latin America
[5] and 200,000 new cases occur per year in areas where the disease is endemic,
representing the third most common parasitic disease around the world, less than
malaria and schistosomiasis [6]. Considered to be a neglected tropical disease,
Chagas disease is estimated to cause 13,000 deaths per year and the loss of
649,000 disability adjusted life years (DALYs) [4]. Urbanization in Latin America and
migratory movements from this continent are leading to the communication of cases
of Chagas disease in non-endemic countries, where in the absence of vectors,
infection may be propagated via blood transmission, organ transplantation and
mother to child transmission [7].
Despite the control of the Chagas disease in the domestic and peridomestic cycles in
the ancient transmission areas from Brazil, the infection is emerging as an important
health problem in the Amazon Region of this country, with an expressive increasing
number of cases in recent decades [8,9]. Information from the Brazilian Ministry of
Health indicates that 455 cases of acute CD were reported in Brazil, from 2005 to
May 2009. Most striking that, 389 cases (85.5%) occurred in the north of the country.
The Brazilian states with the highest number of acute cases were reported in Pará,
with 310 cases (68.1%) and Amazonas, with 29 (6.4%), both in the Amazon Region
(http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/tabchagascasos0509.pdf). Natural
cycles of T. cruzi transmission are abundant and complex in the Amazon, involving a
great diversity of wild mammal reservoirs and vectors, leading to intense infection
78
rates of these hosts in the sylvatic environment [10]. The most frequent triatomine
species found are Rhodnius pictipes, R. robustus and Panstrongylus geniculatus.
Under some circumstances, these sylvatic triatomines can invade houses,
contaminate foodstuffs, or attack forest workers. Some populations of Triatoma
maculata, P. geniculatus, P. herreri, and R. stali are incipiently adapted to artificial
ecotopes in a few areas [10,11]. Furthermore, a risk factor widely found in rural areas
of this region is the building of houses close to palm tree woods occupied by
triatomines and marsupials, both frequently infected by T. cruzi [9,10].
Chagas disease is characterized by a brief acute phase, followed by a chronic phase
in which most patients remain asymptomatic. Most of the acute cases of the disease
registered in Amazon Region are associated with familiary outbreaks through oral
transmission of the parasite [12,13]. Scarce clinical descriptions of autochthonous
acute cases demonstrate the predominance of an inespecific febrile illness, mostly
prolonged [12–15]. Some studies show an exuberant acute phase with expressive
severity, specially due to acute miocarditis [12,13,16,17] and meningoencephalitis
[18].
The chronic stage of Chagas disease may be categorized into three major clinical
forms, involving cardiopathy, digestive tract pathology (“mega” syndromes), and
indeterminate (asymptomatic) form. Cardiac involvement is the most severe and
common of the chronic disease and the most frequent cause of cardiomiopathy in
Latin America [19]. There appears to be geographical variation in the development of
these clinical forms in Latin America, but in the Brazilian Amazon only indeterminate
and cardiac forms are observed [20]. Cross-sectional studies carried out in the Rio
Negro microregion demonstrated a low severity profile in the chronic phase of the
disease, attributed to the scarce parasitemia and/or to the lower pathogenic effects of
sylvatic T. cruzi stocks circulating in this region [21,22]. In the Brazilian Amazon,
prevalence of human T. cruzi infection may be estimated as 1-2%, but seems to be
substantially higher in some subregions with relatively intense transmission, mainly in
areas of Leopoldinia piassaba fibre extractivism in the Rio Negro microregion, where
the vector Rhodnius brethesi attacks workers during fibre collection activities [20–23].
79
T. cruzi is genetically highly diverse. Independent genetic markers pointed to the
division of T. cruzi into two major groups, named as T. cruzi I (TcI) and T. cruzi II
(TcII) [24], corresponding, respectively, to zymodemes Z1 and Z2, defined in pioneer
studies based on the electrophoretic profiles of isozymes [25]. A third group,
zymodeme Z3, with scarce isolates from the sylvatic cycle of the Amazon region,
could not be grouped into any of the two major lineages [26]. More recent data based
on microsatellite loci, COII gene sequence [27] and on chromosome size variation
[28] indicates that Z3 isolates from the Brazilian Amazon constitute an independent
cluster, T. cruzi III (TcIII). Multilocus genotyping consistently reveals six distinct
„discrete typing units‟ (DTUs), which have been divided into two „major subdivisions‟
termed TcI and TcII; TcII being further split into five DTUs: TcIIa to TcIIe [29]. A
recent consensus renamed these DTUs as TcIV, TcII, TcIII, TcV e TcVI, respectively
[30]. TcII, TcV and TcVI predominate in the domestic transmission cycle in the South
Cone of South America, where patients may present severe acute disease with
chronic cardiac and/or digestive involvement [31,32]. In the Brazilian Amazon,
Venezuela, Colombia, Central and North America, TcI is the predominant DTU and
the major cause of both acute and cardiac Chagas‟ disease, but rare cases of "mega"
syndromes [33–36] while TcIII and TcIV cause sporadic acute cases of Chagas‟
disease in the Brazilian Amazon basin [37].
Understanding the diversity of T. cruzi parasites circulating in the Amazon is
important to the comprehension of the emergence and expansion of Chagas disease.
Knowledge about molecular epidemiology of the emerging Chagas disease linked to
the different T. cruzi lineages in the Amazon are essential to the future institution of a
control program and to determine the relationship between specific molecular traits,
parasite biology, and clinical and epidemiological pictures in this region. The purpose
of this work, therefore, is to obtain information concerning the genetic types of T.
cruzi from human cases, triatomines and reservoir mammals in the State of
Amazonas, Western Brazilian Amazon.
80
Methods
Ethics Statement
The study was approved by the Ethical Review Board of the Tropical Medicine
Foundation of Amazonas (approval number 1940/08). Patients diagnosed with
Chagas disease were treated according to the guidelines of the Brazilian Health
Ministry.
Area of Study
State of Amazonas is located in the western North Region of Brazil (latitude 2º01‟,
longitude 73º48‟), comprising an area of 1.570.946,8 km2, with 62 municipalities. The
estimated population of the state was 3.341.096 inhabitants for 2008, with 74.2%
living in the urban zones and 25.8% in rural areas. The city of Manaus is the capital
and has an estimated population of 1.709.010 inhabitants, which represents 51.2% of
the population of the state. Original vegetation cover is mainly a dense evergreen
rain forest. Climate is classified in the equatorial superhumid type, with rainfalls over
2,000mm per annum and average annual temperatures between 26ºC and 28ºC,
without a clear distinction between dry and rainy season and a few oscilation of
temperatures throughout state area.
Parasites
We analysed 96 samples from different hosts from four municipalities located in
distantly locations of the Amazonas State (Table 1). Forty six of them came from
acute chagasic patients and one was isolated from a chronic patient living in Manaus.
Twenty seven stocks from acute cases were isolated in an outbreak in the
municipality of Coari (AM21 to AM27) and fifteen samples from another outbreak
occurred in the municipality of Santa Isabel do Rio Negro (AM62 to AM69, AP60,
Erlisson, D, Gus, L, LM, and W). Three stocks came from sole cases registered in the
municipalities of Coari and one in Apuí. Thirty five samples were obtained from
tritomines (R. robustus and R. pictipes) collected with Noireau traps [38] installed in
palm trees in sylvatic and peridomestic environments, in the municipalities of Apuí,
81
Coari, and Manaus. Fourteen samples were obtained from sylvatic reservoirs
(Didelphis marsupialis and Philander opossum) captured using Tomahawk traps with
fruits as bait, in Manaus and Coari. Handling for blood sample collection was
performed according to permits from the Brazilian Institute for Environment (IBAMA)
(approval number 1830651/07).
The T. cruzi samples, hosts, method of isolation, and their geographical origins are
shown in Table 1.
For T. cruzi isolation and culturing, heparinized blood samples from humans were
inoculated into tubes containing a biphasic medium consisting of NNN medium,
covered with an overlay of LIT medium containing 10% fetal calf serum and 140
mg/ml of gentamycin sulphate [25]. Approximately 0.5 ml of whole blood was placed
on each tube (3-5 tubes for each human/mammal). Cultures were kept at 28C and
monitored microscopically for parasite growth twice a week for two months. At the
same occasion of the hemoculture, xenodiagnosis was performed, using 20 third
instar nymphs of Triatoma infestans or Dipetalogaster maximus per patient. The
nymphs had not been fed for 60 days and were placed on the patients‟ arms and left
until feeding was considered complete. Nymphs were monitored at 30, 45 and 60
days after feeding, by abdominal compression and observation of the insect feces by
microscopy, searching for trypomastigote forms. Positive triatomines were dissected
and their intestinal contents were inoculated into the same medium used for
hemocultures. Isolates obtained by xenodiagnosis were used when hemocultures
were unsuccessful.
Field-collected triatomines were dissected, their intestinal contents were examined by
phase microscopy, and positive samples for trypanosomes were also cultured in
NNN medium.
Isolates obtained in this study are criopreservated in liquid nitrogen in the T. cruzi
culture collection of the Tropical Medicine Foundation of Amazonas. When the
parasites did not survive in culture, we used the strategy of genotyping the samples
directly from patients' blood or intestinal content of triatomines.
82
T. cruzi DNA extraction
After culturing T. cruzi parasites in LIT (liver infusion tryptose) medium containing
10% of inactivated fetal calf serum, at 28°C, up to reach a concentration about 109
cells/ml, extraction of total DNA from isolates was performed using the PureLink Kit
(Invitrogen, Life technologies, USA), according to the manufacturer‟s protocol. DNA
was prepared from 200 µl of culture and eluted with 50 µl of milliQ water. For direct
molecular characterization, DNA was extracted by the same procedure, using 200 µl
of triatomines intestinal content or whole human blood.
Mini-exon gene analysis
DNA from the non-transcribed spacer of the mini-exon was amplified according to the
multiplex protocol, as described previously [39]. Three oligonucleotides, derived from
a hypervariable region of the T. cruzi mini-exon repeat (Tcl:
5‟ACACTTTCTGTGGCGCTGATCG; Tc2: 5‟TTGCTCGCACACTCGGCTGCAT; and
Tc3: 5‟CCGCGWACAACCCCTMATAAAAATG) and an oligonucleotide from a
specific region of the T. rangeli non-transcribed spacer (TR:
5‟CCTATTGTGATCCCCATCTTCG) were used as upstream primers. A common
downstream oligonucleotide (ME: 5‟TACCAATATAGTACAGAAACTG) was used as
the opposing primer. After initial denaturing at 94°C for 1 minute, the samples were
submitted to 35 cycles (94°C for 30 seconds more, 50°C for 30 seconds, and 72°C
for 30 seconds), with a final extension at 72°C for 10 minutes. Amplified products
were analyzed by agarose gel (3.0%) electrophoresis, and visualization with
ultraviolet light after ethidium bromide staining. A 150-bp product could be produced
by TcIII or TcIV DTUs; the 200-bp product in TcI; and the 250-bp in TcII.
Ribosomal RNA (rRNA) gene analysis
The 24Sα rRNA gene sequence was amplified as described by Souto et al. [40] and
revised by Macedo et al. [41], using the primers D71
(5‟AAGGTGCGTCGACAGTGTGG) and D72 (5‟TTTTCAGAATGGCCGAACAGT).
After initial denaturing at 94°C for 1 minute, the samples were submitted to 30 cycles
(94°C for 30 seconds more, 60°C for 30 seconds, and 72°C for 30 seconds), with a
83
final extension at 72°C for 10 minutes. The amplified products were observed by
silver staining in 6% polyacrylamide gel. A 110-bp product could be produced by
either TcI or TcIII DTUs; the 125-bp product in TcII and TcVI; products between 120
and 130-bp in TcIV; and both rDNA products in TcV, with a low intensity of the 125-
bp band [40,42,43] (Figure 1A).
Glucose-phosphate isomerase (GPI) gene analysis
A c.1 kb fragment of the GPI gene was amplified according to Gaunt et al. [44] using
primers gpi.for (5‟CGCACACTGGCCCTATTATT) and gpi.rev
(5‟TTCCATTGCTTTCCATGTCA) for a set of 63 stocks. The reaction cycle involved
an initial denaturation step for five minutes at 94°C, followed by 28 amplification
cycles (94°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds) and a final
ten minutes elongation step at 72°C. PCR products were purified using SureClean Kit
(Bioline, UK) and sequenced in both directions by Macrogen (Korea).
Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II (COII) gene analysis
For restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, amplification of
subunit II of the COII gene was carried out as described by Freitas et al. [27] with
modifications, using the primers Tcmit-10 (5‟CCATATATTGTTGCATTATT) and
Tcmit-21 (5‟TTGTAATAGGAGTCATGTTT), designed to amplify a ~400 bp DNA
fragment of the T. cruzi maxicircle. The amplification was processed with initial
denaturing at 94°C for 1 minute and 30 cycles of 94°C for 30 seconds more, 48°C for
2 minutes, 72°C for 2 minutes, and final extension at 72°C for 10 minutes. Ten
microlitres of the products of the T. cruzi DNA maxicircle was digested with 10 units
of the restriction enzyme AluI (Invitrogen) for 16 hours. The RFLP analysis of the
COII gene was done in 6.0% polyacrylamide gel and revealed by silver staining. At
the polymorphic site AluI, the approximately 300-bp band is characteristic of T. cruzi
I, the 250-bp band characteristic of T. cruzi II, and the bands larger than 300-bp
characteristic of T. cruzi III, IV, V, and VI (Figure 1B).
For a set of 75 stocks, sequencing of the COII gene was performed using the primers
Tcmit-31 (5'TAAATAATATATATTGTACATGAG) e Tcmit-40
84
(5'CTRCATTGYCCATATATTGT), with the same protocol above described [27]. The
amplified PCR products were purified using SureClean Kit (Bioline, UK) and
sequenced in both direction. PCR products were commercially sequenced by
Macrogen (Korea).
Comparative genetic analysis
The band patterns obtained for T. cruzi samples by miniexon, rRNA and COII/RFLP
analyses were compared with the bands of reference samples of the six DTUs (TcI-
TcVI), according to the Second Satellite Meeting [30]: Silvio X10 and CO1 17G2
(TcI), Esmeraldo and JG (TcII), 222 and 231 (TcIII), CAN III (TcIV), SO3 cl5 (TcV),
and CL Brener (TcVI). Evolutionary relationships of the T. cruzi samples sequenced
were performed also by comparing with clones belonging to known DTUs. The
phylogenetic analysis of the GPI and COII sequences used the Neighbor-Joining
method implemented in MEGA 4.1 [45]. The bootstrap consensus tree was inferred
from 1500 replicates and the percentage of replicate trees in which the associated
taxa clustered together are shown next to the branches. There were a total of 980
positions for GPI sequences and 400 positions for COII sequences in the final
dataset. We defined haplotypes based on a set of single nucleotide polymorphisms in
both GPI and COII sequences. The nucleotide sequences of COII gene (Accession
numbers JN885398 to JN885445, GU178012 to GU178029, and JF322836) and of
the GPI gene (Accession numbers JN885310 to JN885397) were deposited in
GenBank.
Results
T. cruzi DTUs isolated from humans
Of the 47 isolates, 44 (93.6%) showed 150-bp bands of miniexon compatible with
TcIII or TcIV; 125-bp bands of rRNA compatible with TcIV; bands larger than 300-bp
in the COII/RFLP analysis characteristic of T. cruzi III, IV, V or VI; COII sequences
compatible with the third ancestral lineage according to Freitas et al. [27] (Figure 2);
and GPI sequences compatible with TcIV (Figure 3). Based on these findings we
showed that this set of samples represents a single group that share a characteristic
85
mitochondrial genome distinct from both TcI and TcII. Miniexon gene analysis also
was not able to distinguish TcIII and TcIV. However, nuclear gene analysis based on
rRNA PCR products and GPI sequences consistently support their status as the
genetically separate DTU TcIV. These T. cruzi samples were isolated from two
outbreaks occurred in the municipalities of Coari (AM01 to AM27) and Santa Isabel
do Rio Negro (AM62 to AM69, AP060, D, Erlisson, GUS, L, LM, W), from a single
case from Coari (AM70), and from an isolated case registered in the municipality of
Apuí (AM52) (Table 1; Figures 1 and 3).
For human isolates AM36 (Manaus), AM49 and AM50 (Coari), the rRNA analysis
showed an approximately 110-bp band compatible with the TcI or TcIII DTUs. All the
other molecular markers and sequencing have demonstrated similarity with TcI,
confirming the genetic lineage (Table 1; Figures 1, 2 and 3).
T. cruzi DTUs isolated from triatomines
Of the thirty five isolates, 31 were classified as TcI because they showed bands
characteristics of this DTU in the miniexon and in the COII/RFLP analysis. GPI and
COII sequences were also compatible with TcI. Analysis of rRNA was not able to
distinguish TcI and TcIII. Four samples from the municipality of Apuí, all derived from
R. robustus, showed 150-bp bands of miniexon compatible with TcIII or TcIV; 125-bp
bands of rRNA compatible with TcIV; GPI sequences compatible with TcIV; bands
larger than 300-bp in the COII/RFLP analysis characteristic of T. cruzi III, IV, V or VI;
and COII sequences compatible with the third ancestral lineage according to Freitas
et al. [27]. As above mentioned, nuclear gene analysis based on rRNA PCR products
and GPI sequences consistently support that these four triatomines harbor the DTU
TcIV (Table 1; Figures 1, 2 and 3).
T. cruzi DTUs isolated from sylvatic reservoirs
All fourteen samples from Didelphis marsupialis and Philander opossum were
classified as TcI because they showed bands characteristics of this DTU in the
miniexon and in the COII/RFLP analysis. GPI and COII sequences were also
86
compatible with TcI. Again, rRNA analysis was not able to distinguish TcI and TcIII
(Table 1; Figures 1, 2 and 3).
Haplotypes
COII sequences analysis indicates the presence of four haplotypes of TcIV (TcIII-VI
COII 1 to 4) and two haplotypes of TcI (TcI COII 1 and TcI COII 4) circulating in
humans; one haplotype of TcIV (TcIII-VI COII 1) and three haplotypes of TcI (TcI
COII 1, TcI COII 2, and TcI COII 3) in triatomines; and one haplotype of TcI (TcI COII
1) in the marsupial P. opossum (Figure 4). GPI sequencing showed one haplotype
(TcIV GPI 1) of TcIV circulating in humans and vectors; two haplotypes of TcI (TcI
GPI 1 and TcI GPI 2) circulating in humans; four haplotypes of TcI (TcI GPI 1, TcI
GPI 3, TcI GPI 4, and TcI GPI 5) harboured by triatomines; and one haplotype of TcI
(TcI GPI 1) in P. opossum (Figure 5).
Based on COII sequences obtained for TcIV human samples, haplotype TcIII-VI COII
1 was the most widely distributed, occurring in human acute cases from the
municipality of Coari, where is the unique haplotype responsible for the outbreak; in
an isolated case from Apuí (AM52); and in parallel with other haplotypes in the
outbreak reported from Santa Isabel do Rio Negro (AM69). Haplotype TcIII-VI COII 2
was verified in an isolated case from Coari (AM70). Haplotype TcIII-VI COII 3
occurred sole in the isolate AM67, from the outbreak of Santa Isabel do Rio Negro.
Haplotype TcIII-VI COII 4 was identified in the samples AM62, AM63, AM64, AM68,
AP60, D, and L, from the same outbreak. The samples AM66, LM, and W, also from
the outbreak of Santa Isabel do Rio Negro, presented a mixed population consisting
of haplotypes TcIII-VI COII 3 and TcIII-VI COII 4. GPI sequences are identical for all
samples from humans typed as TcIV, constituting a single haplotype TcIV GPI 1.
The isolate AM36, the only cultured from a non-authochthonous chronic case
showed COII gene sequence identical to the reference strain TcI Silvio X10, isolated
from an acute human case in the State of Pará, in the Easthern Amazon region,
representing here the haplotype TcI COII 4 or TcI GPI 2, on basis in COII and GPI
gene sequencing, respectively. The isolates AM49 and AM50 pertain to the
87
haplotype TcI COII 1 defined by COII gene sequencing and haplotype TcI GPI 1
defined by GPI sequence analysis.
Single base mutation identified by direct sequencing of the COII gene for TcI
samples from triatomines showed the presence of three haplotypes. All triatomines
collected in Apuí, both R. pictipes and R. robustus, harbour the haplotype TcI COII 3.
Triatomines collected in Coari presented predominantly the haplotype TcI COII 1,
harboured by R. pictipes and R. robustus. Three specimens of R. pictipes from Coari
presented the haplotype TcI COII 2. GPI gene sequencing demonstrated only the
haplotype TcI GPI 1 in triatomines from Coari. In the municipality of Apuí, by other
hand, four haplotypes were described in triatomines, predomining the TcI GPI 1,
followed by TcI GPI 5, TcI GPI 3 and TcI GPI 4. The sample AP20 presented mixed
infection by TcI GPI 1 and TcI GPI 5 haplotypes.
Four R. robustus-derived samples from the municipality of Apuí typed as TcIV
(AM57, AM58, AP21, and AP51) belong to the haplotypes TcIII-VI COII 1 and TcIV
GPI 1, according to COII and GPI sequences, respectively.
Sequencing techniques were made only for one isolate from a specimen of P.
opossum trapped in Coari, demonstrating the presence of the haplotypes TcI COII 1
and TcI GPI 1, according the COII and GPI sequences, respectively.
Discussion
T. cruzi is a heterogeneous taxon with multiple mammal hosts and vectors, besides
alternative routes of infection and infective forms. In the Brazilian Amazon region,
where domiciled triatomines have not been reported, human cases of Chagas
disease have been increasing due to uncontrolled migration and deforestation [8]. In
this work, we demonstrated that the majority of human acute cases attended in the
state of Amazonas are provenient from outbreaks, as observed previously in other
Amazonian areas. Recent outbreaks of Chagas disease attributed to oral
transmission in previously non-endemic areas of the Amazon region indicate that a
new epidemiologic profile is emerging in Brazil. The massive consumption of agro-
extractivist forest products without sanitary certification is probably involved in the
88
family outbreaks of acute Chagas disease reported from different areas throughout
Amazon [10].
In the present study, the polymorphism of the 24Sα rRNA gene and sequencing of
the GPI gene showed the presence of two DTUs, TcI, and TcIV in the sylvatic
transmission cycles in Western Amazon. We demonstrated that both TcI and TcIV
were found to circulate in the same regions and were able to infect humans, resulting
in acute infections. However, an unexpected predominance of the TcIV DTU was
demonstrated among human cases of acute Chagas disease. This lineage occurred
in both outbreak and isolated cases, suggesting its association with different
transmission frameworks. Previous studies demonstrated that the outbreaks, wich
contribute with the most cases of chagasic acute cases in the Amazon region, are
dependent of TcI type [10,13], but in our work all isolates from the outbreaks
registered in the two distantly municipalities of Coari, in the Solimões River banks,
and Santa Isabel do Rio Negro, in the Rio Negro microregion, were typed as TcIV,
demonstrating the emergence and wide distribution of this DTU in the Western
Brazilian Amazon.
Interesting, COII/RFLP analysis demonstrated that all T. cruzi samples classified as
TcIV based on nuclear gene markers present mitochondrial gene products
compatible with the third major lineage proposed by Freitas et al. [27]. In agree, COII
sequences were few polymorphic and clustered all together with the standard strains
belonging to TcIII, TcIV, TcV, and TcVI. These findings are extremely important and
confirm that TcIII and TcIV stocks from Amazon are not easily distinguished based on
mitochondrial genes, as seen previously [46]. The phylogenetic status of these two
DTUs, defined as Z3 in the Miles‟s original classification [26], are still in full debate
[27,46]. Based on mosaic patterns of nucleotide diversity across nine nuclear genes,
Westenberger et al. [47] proposed that both are the product of an early hybridization
between lineages TcI and TcII. Others argue that TcIII and TcIV represent a single
ancestral group in their own right, whereby these lineages share a characteristic
mitochondrial genome [27] and chromosome size variation [28] dissimilar from both
TcI and TcII.
89
Analysis of both COII-ND1 [46] and CYTB [48] shows there is far less mitochondrial
diversity both within and between TcIII and TcIV (from South America) than would be
expected in light of the considerable divergence observed for slower-evolving nuclear
genes. This implies a mechanism acting to homogenise maxicircle sequences while
nuclear sequences remain free to diverge. A partial explanation may stem from our
finding of multiple instances of clearly recent mitochondrial introgression between
TcIII and TcIV in South America, indicating additional recombination events involving
either substantial backcrossing or kDNA exchange without exchange of nuclear
material [49]. Our work includes TcIV from Western Brazilian Amazon into these well-
related clade based on COII analysis, but agrees that nuclear gene sequences
consistently support their status as genetically separate clade [46–51]. Flow
cytometric analysis across a panel of representative strains reveals that TcIII and
TcIV genomes are divergent in terms of their absolute size [52].
Transmission dynamics of T. cruzi populations circulating in Amazonia are quite
distinct from endemic areas of South America. Previous reports showed that most
isolates from humans, reservoirs and vectors from Amazonia belong to TcI with
scarce TcIV and TcIII isolates [33–36,53]. There are no reports of TcII, TcV and TcVI
lineages in this region, which are those that predominate in humans, domestic and
peridomestic vectors in southern South America, whereas TcI occurs in sylvatic
cycles and is only sporadically found in humans [8,9,13,26,37,39,53]. In the Brazilian
Amazon, the T. cruzi found in the outbreaks belong to DTU TcI, which has previously
been associated with human infections in this region, corresponding to the scenario
of the outbreak with human dwellings close to the primary forest [13]. However, there
have been few studies concerning genetic variability of T. cruzi from Western
Brazilian Amazonia, specialy for human isolates. Fernandes et al. [39] and Marcili et
al. [53] characterized only four stocks from this area: in Barcelos, the authors typed
two TcI and one TcIV isolates, and in the municipality of Carauari, they typed the only
TcIII stock from an acute human chagasic case in the region. This work is the first
focusing exclusively on the molecular epidemiology of Chagas disease in this area,
and demonstrated predominance of TcIV among human patients despite the
confirmation also in the State of Amazonas of the well-established TcI-Rhodnius-
marsupials association [53].
90
There are few reports concerning the ecogeographical and epidemiological traits of
TcIV, undermining any inference about the way that the aforementioned outbreaks
were triggered. Sylvatic hosts of TcIV are not conclusively known in the Amazon
Region. Despite previous records in Monodelphis, Dasypus, primates, and
Panstrongylus from molecular analyses [53–56], and although human isolates were
all identified by robust molecular markers, only seven human isolates (including
CANIII and JJ) were confirmed as TcIV prior to this work [55]. Moreover, vectors of
this lineage have also been poorly characterised, except R. brethesi, which is
restricted to Northern Amazonia [28,39,54,55,57], and R. robustus, a widely
distributed species [55]. Here, we corroborate that R. robustus (but not R. pictipes)
harbours TcIV, circulating in an arboreal transmission cycle in sympatry with TcI and
distinct from the terrestrial ecotopes usually attributed to TcIII [55]. TcIV was not
found in didelphids in this study, in agree with other authors [54,55]. There are
evidence that TcIV from South America and TcIV from North America correspond to
independent genetic lineages that circulate in distinct hosts and ecological niches. In
the USA, this DTU is commonly reported from terrestrial niches, peridomicile and
human dwellings, in racoons and dogs [58,59]. Our observation of this DTU in distinct
areas extends its known range in the vast Amazon basin. The limited data about T.
cruzi DTUs in wild reservoirs and triatomines in the Amazon are insufficient to rule
out other arboreal or even terrestrial mammals and vectors as natural hosts of TcIV.
One speculates that low parasitemia and morbidity of the chronic chagasic infection
in this state, despite a high seroprevalence in some areas [8,20], contrasting with
exuberant clinical manifestations in the acute phase of the disease [12,13,16–18], is
due to the type of parasites circulating in this area. Knowledge about biological
properties of TcIV lineage, that certainly play an important role in the Chagas disease
pathogenesis and in the response to the specific chemotherapy in the Amazon
region, represents a challenge for future investigations. Our preliminary results
indicate that Amazonian T. cruzi isolates promote scarce parasitemia and low
virulence and pathogenicity in mice in comparison to TcII strains [60,61]. At least in
Brazil, TcII and rarely TcI, appear to be exclusively responsible for tissue lesions in
chronic Chagas disease [31,35,62,63]. However, chronic disease (cardiac-digestive
form) has been reported for Z3 type parasites that clustered with CANIII (reference
strain of the DTU TcIV) in the multilocus enzyme electrophoresis analysis [64], which
91
highlight the need for the characterization of epidemiological and clinical framework
associated with different DTUs of the emergent Chagas disease in the Amazon.
Prospective studies involving acute cases caused by TcIV in order to clear the
potential of this lineage to trigger chronic manifestations and for the evaluation of
treatment efficacy are urgent.
We report the occurrence of TcI in the facultative arboreal and synanthropic
mammals Didelphis marsupialis and Philander opossum, and in the triatomine bugs
R. pictipes and R. robustus, confirming the strong association of these with
transmission cycles of TcI in the Amazon region [53-55]. TcI, which has a very large
geographical distribution from North to South America, predominates from the
Amazonian basin northwards where domestic and sylvatic triatomines species
ensure the transmission of Chagas disease in the Brazilian Amazon, Venezuela,
Colombia, Central and North America, causing acute and cardiac Chagas disease in
this area [33,35,36]. There are observed in this work that TcI genotype predominates
in isolated acute cases, but not in outbreaks. Possibly, starved Rhodnius bugs
infected with TcI, wich frequently start dispersive flights into domestic environment
[8,9], represent the main single source of Chagas disease transmission risk for these
cases.
The isolation of T. cruzi stocks with identical genetic sequences over vast
geographical distances is a strong evidence for clonal propagation, a hypothesis
already proposed for T. cruzi [65]. This suggests, by the other hand, a single source
of infection for the outbreak occurred in the municipality of Coari. However, in the
outbreak from Santa Isabel do Rio Negro, three haplotypes were registered based on
COII sequencing and, interestingly, three patient presented two haplotypes
simultaneously. Strikingly, our group verified significant differences between the
isolates from outbreaks of Coari and Santa Isabel do Rio Negro regarding
parasitological parameters in mice, suggesting higher virulence for the last [60]. This
finding suggests superinfection from discrete sources as well as the simultaneous
transmission of multiclonal parasite populations by a single triatomine. In both cases,
clonal multiplicity of infection is likely to be related to both the intensity and efficiency
of transmission [66]. Infection multiclonality has been observed also in a triatomine
from Apuí, at this time based on GPI sequence polymorphism. T. cruzi hosts and
92
vectors have occasionally been identified with mixed infections of different DTUs [67–
72] and preliminary data demonstrate that multiple variants of the same DTU could
also be present [66,70,73]. Analysis of T. cruzi isolates from an acute Chagas
disease outbreak in the State of Pará showed TcI and Z3 as concurrent causative
agents [13]. This study confirmed the wealth of parasite genetic diversity that can
exist in an outbreak likely promoted by oral transmission, and evidenced for the first
time infrapopulations in the affected patients.
Probably the multiclonality verified in this work is underestimated by two reasons.
First, the methods of parasite isolation by culturing as well as the time since isolation
probably lead to the selection of clones, as can be predicted based on pioneer
experiments [74]. Culture surviving clones would then represent a composite of a
subset of the clones present in each vector or host, generating a culture bias [66],
aggravated in mammalian samples by low circulating parasitemia triggered by
lineages from Western Brazilian Amazon [60,61]. Other limitation of this investigation
is the method employed for detecting clones. Microsatelite analysis is recommended
and have been evidenced better the multiclonal infections.
Although genetic recombination is known to occur in T. cruzi in vitro [44] and in
reservoirs [46,75], there are evidence that it does not seem a relevant source of
multiclonality according to the investigation carried out by Llewellyn et al. [66]. These
authors proposed that high clonal and genetic diversity are instead consistent with en
masse transmission of parasite populations from vector to host. Increasingly reported
oral transmission in human populations [1,2,8,10] could play a role in the
maintenance of the level of multiclonality observed in this work, which is consistent
with the probable route of infection through ingestion of contaminated fruit juices
produced in the riverine communities where outbreaks occurred. It remains to be
clarified if distinct clinical forms of Chagas disease can be correlated to specific T.
cruzi lineages and clones, transmission routes or host genetics. T.cruzi is able to
infect numerous cell types, but there is some evidence that different DTUs can
sequester in different tissue types within the same host [71,76].
The geographical area from wich we have taken T. cruzi stocks, although vast, is a
fraction of the enormous Amazonian area with natural species distribution in its
biomes and, by itself, there is no reason to doubt that the full range of genetic lineage
93
diversity within the T. cruzi isolates is more complex. In the Amazon basin, expansion
of human populations into previously undisturbed cycles of natural transmission of T.
cruzi may contribute to transmission of Chagas disease by the accidental introduction
of wild vectors harbouring TcI and TcIV into human food chain or by contact of these
vectors with humans because of environmental changes. This is the probable
mechanism explaining the emergence of this genotype in this region, evidenced by
its predominance in this work. Characterization is needed of T. cruzi from more
authochthonous chronic cases from Amazon region, particularly the reisolation and
reexamination of strains from acute cases produced by TcI and TcIV lineages.
In summary, the lineages TcIV and TcI overlapped in the Western Amazon region.
The fist DTU predominated among human cases, being responsible by triggering two
impressive outbreaks caused by oral transmission. There were instances of sharing
of identical or nearly identical mitochondrial haplotypes between TcIV strains and
strains from other DTUs (TcIII, TcV or TcVI) for which nuclear GPI sequences were
highly divergent. Such gross incongruence between mitochondrial and nuclear
phylogenies is likely indicative of historical genetic exchange events resulting in
mitochondrial introgression between DTUs. Thus, TcIV strains from the State of
Amazonas were interspersed between TcIII sequences. Furthermore, we confirmed
that outbreaks by this DTU can be due to single or mixed infections with different
haplotypes. Studies about the complexity of mixed infections within an individual host
need to be stimulated. These results could help clarify peculiarities of Chagas
disease associated with oral infection in Amazonia.
Acknowledgements
HS was supported by a grant from State of Amazonas Foundation for Support to the
Research (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM)
and to the Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado (Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado – FMT-HVD). We thank also to
personnel involved in the field-work in order to collect triatomines and reservoirs.
94
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: WMM MLG MJOT JAOG HS MdGVB.
Performed the experiments: WMM LKCM ARNdS LB IP HS. Analyzed the data:
WMM MLG MJOT HS MdGVB. Wrote the paper: WMM MLG MJOT HS MdGVB.
References
1. Coura JR (2007) Chagas disease: what is known and what is needed - A
background article. Mem Inst Oswaldo Cruz 102 Suppl: 113–122.
2. Dias JCP, Prata AR, Correia D (2008) Problems and perspectives for Chagas
disease control: in search of a realistic analysis. Rev Soc Bras Med Trop 41: 193–
196.
3. Lent H, Wygodzinsky P (1979) Revision of the Triatominae (Hemiptera,
Reduviidae), and their significance as vectors of Chagas‟ disease. Bull Am Mus Nat
Hist 163: 123–520.
4. World Health Organization (2005). Control of Chagas disease. Geneva.
5. OPAS (2006) Estimación cuantitativa de la enfermedad de Chagas en las
Américas. Rio de Janeiro.
6. WHO (2005) Control of Chagas disease. Geneva.
7. Schmunis GA (2007) Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries:
the role of international migration. Mem Inst Oswaldo Cruz 102 Suppl: 75–85.
8. Coura JR, Junqueira ACV, Fernandes O, Valente SAS, Miles MA (2002) Emerging
Chagas in Amazonian Brazil. Trends Parasitol 18: 171–176.
95
9. Teixeira ARL, Monteiro OS, Rebelo JM, Argañaraz ER, Vieira D, et al. (2001)
Emerging Chagas disease: trophic network and cycle of transmission of
Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerg Infec Dis 7: 100–112.
10. Aguilar HM, Abad-Franch F, Dias JCP, Junqueira ACV, Coura JR. Chagas
disease in the Amazon Region. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102: 47–55.
11. Valente VC, Valente SAS, Noireau F, Carrasco HJ, Miles MA (1998) Chagas
disease in the Amazon basin: association of Panstrongylus geniculatus (Hemiptera:
Reduviidae) with domestic pigs. J Med Entomol 35: 99–103.
12. Pinto AYN, Valente SAS, Valente VC, Ferreira-Junior AG, Coura JR (2008) Fase
aguda da doença de Chagas na Amazônia brasileira. Estudo de 233 casos do Pará,
Amapá e Maranhão observados entre 1988 e 2005. Rev Soc Bras Med Trop 41:
602–614.
13. Valente SAS, Valente VC, Pinto AYN, César MJB, Santos MP, et al. (2009)
Analysis of an acute Chagas disease outbreak in the Brazilian Amazon: human
cases, triatomines, reservoir mammals and parasites. Trans R Soc Trop Med Hyg
103: 291–297.
14. Monteiro WM, Barbosa MGV, Toledo MJO, Fé FA, Fé NF (2010). Série de casos
agudos de doença de Chagas atendidos num serviço terciário de Manaus,
Amazonas, de 1980 a 2006. Rev Soc Bras Med Trop 43: 207–210.
15. Nóbrega AA, Garcia MH, Tatto E, Obara MT, Costa E, et al. (2009) Oral
transmission of Chagas disease by consumption of açaí palm fruit, Brazil. Emerg
Infect Dis 15: 653–655.
16. Pinto AYN, Harada GS, Valente VC, Abud JE, Gomes FD, et al. (2001) Cardiac
attacks in patients with acute Chagas disease in a family micro-outbreak, in
Abaetetuba, Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop 34: 413–419.
96
17. Pinto AY, Valente SA, Valente VC (2004) Emerging acute Chagas disease in
Amazonian Brazil: case reports with serious cardiac involvement. Braz J Infect Dis 8:
454–460.
18. Medeiros MB, Guerra JAO, Lacerda MVG (2008) Meningoencephalitis in a
patient with acute Chagas disease in the Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop
41: 520–521.
19. Prata A (2001) Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet
Infect Dis 1: 92–100.
20. Brum-Soares LM, Xavier SS, Sousa AS, Borges-Pereira J, Ferreira JMBB, et al.
(2010) Morbidity of Chagas disease among autochthonous patients from the Rio
Negro microregion, State of Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 43: 170–177.
21. Coura JR, Junqueira ACV, Bóia MN, Fernandes O, Bonfante C, et al. (2002).
Chagas disease in the Brazilian Amazon. IV. A new cross-sectional study. Rev Inst
Med Trop São Paulo 44: 159–165.
22. Coura JR, Junqueira ACV, Bóia MN, Fernandes O (1999) Chagas disease: from
bush to huts and houses. Is it the case of the Brazilian Amazon? Mem Inst Oswaldo
Cruz 94 Suppl: 379–384.
23. Coura JR, Willcox HPF, Arboleda MN, Fernandes O, Paiva DD (1995) Chagas
disease in the Brazilian Amazon III. A cross-sectional study. Rev Inst Med Trop São
Paulo 37: 415–420.
24. Anonymous (1999) Recommendations from a satellite meeting. Mem Inst
Oswaldo Cruz 94: 429–432.
25. Miles MA, Toyé PJ, Oswaldo SC, Godfrey DC (1977) The identification by
isoenzyme patterns if two distinct strain-groups of Trypanosoma cruzi, circulating
independently in a rural area of Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 71: 217–225.
97
26. Miles MA, Souza AA, Póvoa MM, Shaw JJ, Lainson R, et al. (1978) Isozymic
heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first authochtonous patients with Chagas
disease in Amazonian Brazil. Nature 272: 819–821.
27. Freitas JM, Augusto-Pinto L, Pimenta JR, Bastos-Rodrigues L, Gonçalves VF, et
al. (2006) Ancestral genomes, sex and the population structure of Trypanosoma
cruzi. PLoS Pathog 2: e24.
28. Pedroso A, Cupolillo E, Zingales B (2007) Trypanosoma cruzi: Exploring the
nuclear genome of zymodeme 3 stocks by chromosome size polymorphism. Exp
Parasitol 116: 71–76.
29. Brisse S, Barnabé C, Tibayrenc M (2000) Identification of six Trypanosoma cruzi
phylogenetic lineages by random amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme
electrophoresis. Int J Parasitol 30: 35–44.
30. Zingales B, Andrade SG, Briones MRS, Campbell DA, Chiari E, et al. (2009) A
new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision
meeting recommends TcI to TcVI. Mem Inst Oswaldo Cruz 104: 1051–1054.
31. Chapman MD, Baggaley RC, Godfrey-Fausset PF, Malpas TJ, White G, et al.
(1984) Trypanosoma cruzi from the Paraguayan Chaco: isoenzyme profiles of strains
isolated at Makthlawaiya. J Protozool 31: 482–486.
32. del Puerto R, Nishizawa JE, Kikuchi M, Iihoshi N, Roca Y, et al. (2010). Lineage
analysis of circulating Trypanosoma cruzi parasites and their association with clinical
forms of Chagas disease in Bolivia. PLoS Negl Trop Dis 4: e687.
33. Añez N, Crisante G, Maia-da-Silva F, Rojas A, Carrasco H, et al. (2004)
Predominance of lineage I among Trypanosoma cruzi isolates from Venezuelan
patients with different clinical profiles of acute Chagas‟ disease. Trop Med Int Health
9: 1319–1326.
98
34. Flórez O, Higuera S, Barraza MF, Cabrera HB, Mantilla JC, et al. (2010)
Chagasic megacolon associated with Trypanosoma cruzi I in a Colombian patient.
Parasitol Res 107: 439–442.
35. Miles MA, Cedillos RA, Povoa MM, Souza AA, Prata A, et al. (1981) Do radically
dissimilar Trypanosoma strains (zimodemes) cause Venezuelan and cardiac forms of
Chagas‟ disease? Lancet 1: 1338–1340.
36. Ruiz-Sanchez R, Leon MP, Matta V, Reyes PA, Lopez R, et al. (2005)
Trypanosoma cruzi isolates from Mexican and Guatemalan acute and chronic
chagasic cardiopathy patients belong to Trypanosoma cruzi I. Mem Inst Oswaldo
Cruz 100: 281–283.
37. Miles MA, Póvoa MM, Souza AA, Lainson R, Shaw JJ, et al. (1981) Chagas‟
disease in the Amazon Basin. II. Distribution of Trypanosoma cruzi zymodemes 1
and 3 in Pará State, north Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 75: 667–674.
38. Noireau F, Abad-Franch F, Valente SAS, Dias-Lima A, Lopes CM, et al. (2002)
Trapping Triatominae in silvatic habitats. Mem Inst Oswaldo Cruz 97: 61–63.
39. Fernandes O, Santos SS, Cupolillo E, Mendonça B, Derre R, et al. (2001) A mini-
exon multiplex polymerase chain reaction to distinguish the major groups of
Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli in the Brazilian Amazon. Trans R Soc
Trop Med Hyg 95: 97–99.
40. Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbell DA, Zingales B (1996) DNA
markers define two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem
Parasitol 83: 41–152.
41. Macedo AM, Machado CR, Oliveira RP, Pena SDJ (2004) Trypanosoma cruzi:
Genetic structure of populations and relevance of populations and relevance of
genetic variability to the pathogenesis of Chagas Disease. Mem Inst Oswaldo Cruz
99: 1–12.
99
42. Brisse S, Verhoef J, Tibayrenc M (2001) Characterization of large and small
subunit rRNA and mini-exon genes further supports the distinction of six
Trypanosoma cruzi lineages. Int J Parasitol 31: 1218–1226.
43. Lewis MD, Ma J, Yeo M, Carrasco HJ, Llewellyn MS, et al. (2009) Genotyping of
Trypanosoma cruzi: systematic selection of assays allowing rapid and accurate
discrimination of all known lineages. Am J Trop Med Hyg 81: 1041–1049.
44. Gaunt MW, Yeo M, Frame IA, Stothard JR, Carrasco HJ, et al. (2003) Mechanism
of genetic exchange in American trypanosomes. Nature 421: 936–939.
45. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007) MEGA 4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evolution 24: 1596–1599.
46. Machado CA, Ayala FJ (2001) Nucleotide sequences provide evidence of genetic
exchange among distantly related lineages of Trypanosoma cruzi. Proc Natl Acad Sci
U S A 98: 7396–7401.
47. Westenberger SJ, Barnabe C, Campbell DA, Sturm NR (2005) Two Hybridization
Events Define the Population Structure of Trypanosoma cruzi. Genetics 171: 527–
543.
48. Brisse S, Henriksson J, Barnabé C, Douzery EJP, Berkvens D, et al. (2003)
Evidence for genetic exchange and hybridization in Trypanosoma cruzi based on
nucleotide sequences and molecular karyotype. Infect Genet Evol 2: 173 183.
49. Lewis MD, Llewellyn MS, Yeo M, Acosta N, Gaunt MW, Miles MA (2011) Recent,
Independent and Anthropogenic Origins of Trypanosoma cruzi Hybrids. PLoS Negl
Trop Dis 5(10): e1363.
50. Broutin H, Tarrieu F, Tibayrenc M, Oury B, Barnabé C (2006) Phylogenetic
analysis of the glucose-6-phosphate isomerase gene in Trypanosoma cruzi. Exp
Parasitol 113: 1–7.
100
51. Rozas M, De Doncker S, Coronado X, Barnabe C, Tibayrenc M, et al. (2008)
Evolutionary history of Trypanosoma cruzi according to antigen genes. Parasitology
135: 1157–1164.
52. Llewellyn MS, Miles MA, Carrasco HJ, Lewis MD, Yeo M, et al. (2009) Genome-
scale multilocus microsatellite typing of Trypanosoma cruzi discrete typing unit I
reveals phylogeographic structure and specific genotypes linked to human infection.
PLoS Pathog 5: e1000410.
53. Yeo M, Acosta N, Llewellyn M, Sanchez H, Adamson S, et al. (2005) Origins of
Chagas disease: Didelphis species are natural hosts of Trypanosoma cruzi I and
armadillos hosts of Trypanosoma cruzi II,including hybrids. Int J Parasitol 35: 225–
233.
54. Marcili A, Lima L, Valente V, Valente S, Batista J, et al. (2009) Comparative
phylogeography of Trypanosoma cruzi TCIIc: new hosts, association with terrestrial
ecotopes, and spatial clustering. Infect Genet Evol 9: 1265–1274.
55. Marcili A, Valente VC, Valente SA, Junqueira ACV, Maia-da-Silva F, et al. (2009)
Trypanosoma cruzi in Brazilian Amazonia: Lineages TCI and TCIIa in wild primates,
Rhodnius spp. and in humans with Chagas disease associated with oral
transmission. Int J Parasitol 39: 615–623.
56. Maia da Silva F, Naiff RD, Marcili A, Gordo M, D‟Affonseca Neto JA, et al. (2008)
Infection rates and genotypes of Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi
infecting free-ranging Saguinus bicolor (Callitrichidae), a critically endangered
primate of the Amazon Rainforest. Acta Trop 107: 168–173.
57. Mendonça MB, Nehme NS, Santos SS, Cupolillo E, Vargas N, et al. (2002) Two
main clusters within Trypanosoma cruzi zymodeme 3 are defined by distinct regions
of the ribosomal RNA cistron. Parasitology 124: 177–184.
101
58. Barnabé C, Yaeger R, Pung O, Tibayrenc M (2001) Trypanosoma cruzi: a
considerable phylogenetic divergence indicates that the agent of Chagas disease is
indigenous to the native fauna of the United States. Exp Parasitol 99: 73–79.
59. Roellig DM, Brown EL, Barnabé C, Tibayrenc M, Steurer FJ, et al. (2008)
Molecular typing of Trypanosoma cruzi isolates, United States. Emerg Infect Dis 14:
1123–1125.
60. Reis D (2011) Biological behavior in mice of Trypanosoma cruzi isolates from the
States of Amazonas and Paraná, Brazil. Maringá: Maringá State University.
61. Monteiro WM, Magalhães LKC, Oliveira JC, Guerra JAO, Silveira H, et al. (2011)
Biological behavior in mice of Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas,
Western Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop. In press.
62. Luquetti AO, Miles MA, Rassi A, Rezende JM, Souza AA, et al. (1986)
Trypanosoma cruzi: zymodemes associated with acute and chronic Chagas‟ disease
in central Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 80: 462–470.
63. Teixeira MMG, da Silva FM, Marcili A, Umezawa ES, Shikanai-Yasuda MA, et al.
(2006) Trypanosoma cruzi lineage I in endomyocardial biopsy from a north-eastern
Brazilian patient at end-stage chronic chagasic cardiomyopathy. Trop Med Int Health
11: 294–298.
64. Garzón EA, Barnabé C, Córdova X, Bowen C, Paredes W, et al. (2002)
Trypanosoma cruzi isoenzyme variability in Ecuador: first observation of zymodeme
III genotypes in chronic chagasic patients. Trans R Soc Trop Med Hyg 96: 378–382.
65. Tibayrenc M, Ward P, Moya A, Ayala FJ (1986) Natural populations of
Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, have a complex multiclonal
structure. Proc Natl Acad Sci USA 83: 1335–1339.
102
66. Llewellyn MS, Rivett-Carnac JB, Fitzpatrick S, Lewis MD, Yeo M, et al. (2011)
Extraordinary Trypanosoma cruzi diversity within single mammalian reservoir hosts
implies a mechanism of diversifying selection. Int J Parasitol 41: 609–614.
67. Bosseno MF, Telleria J, Vargas F, Yaksic N, Noireau F, et al. (1996)
Trypanosoma cruzi: study of the distribution of two widespread clonal genotypes in
Bolivian Triatoma infestans vectors shows a high frequency of mixed infections. Exp
Parasitol 83: 275–282.
68. Herrera L, D‟Andrea PS, Xavier SC, Mangia RH, Fernandes O, et al. (2005)
Trypanosoma cruzi infection in wild mammals of the National Park „Serra da
Capivara‟ and its surroundings (Piauí, Brazil), an area endemic for Chagas disease.
Trans R Soc Trop Med Hyg 99: 379–388.
69. Spitzner FL, Freitas JM, Macedo AM, Toledo MJO, Araújo SM, et al. (2007)
Trypanosoma cruzi - triatomine associations and the presence of mixed infections in
single triatomine bugs in Paraná state, Brazil. Acta Parasitol 52: 74–81.
70. Yeo M, Lewis MD, Carrasco HJ, Acosta N, Llewellyn M, et al. (2007) Resolution
of multiclonal infections of Trypanosoma cruzi from naturally infected triatomine bugs
and from experimentally infected mice by direct plating on a sensitive solid medium.
Int J Parasitol 37: 111–120.
71. Burgos JM, Begher S, Silva HM, Bisio M, Duffy T, et al. (2008) Molecular
identification of Trypanosoma cruzi I tropism for central nervous system in Chagas
reactivation due to AIDS. Am J Trop Med Hyg 78: 294–297.
72. Abolis NG, Araújo SM, Toledo MJO, Fernandez MA, Gomes ML (2011)
Trypanosoma cruzi I, II, III in southern Brazil causing individual and mixed infections
in humans, sylvatic reservoirs and triatomines. Acta Trop 120: 167–172.
73. Macedo AM, Pimenta JR, Aguiar RS, Melo AI, Chiari E, et al. (2001) Usefulness
of microsatellite typing in population genetic studies of Trypanosoma cruzi. Mem Inst
Oswaldo Cruz 96: 407–413.
103
74. Finley RW, Dvorak JA (1987) Trypanosoma cruzi: analysis of the population
dynamics of heterogeneous mixtures. J Protozool 34: 409–415.
75. Ocaña-Mayorga S, Llewellyn MS, Costales JA, Miles MA, Grijalva MJ (2010) Sex,
subdivision, and domestic dispersal of Trypanosoma cruzi lineage I in southern
Ecuador. PLoS Negl Trop Dis 4: e915.
76. Valadares HM, Pimenta JR, Freitas JM, Duffy T, Bartholomeu DC, et al. (2008)
Genetic profiling of Trypanosoma cruzi directly in infected tissues using nested PCR
of polymorphic microsatellites. Int J Parasitol 38: 839–850.
104
Table 1. Geographical origins, hosts, isolation method, and discrete typing units (DTUs) of
Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas.
Code Geographic origin Host Isolation method DTU
AM01 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM02 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM03 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM04 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM05 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM06 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM07 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM08 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM09 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM10 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM11 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM12 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM13 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM14 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM15 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM16 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM17 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM18 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM19 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM20 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM21 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM22 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM23 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM24 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM25 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM26 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM27 Coari Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
AM28 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM29 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM30 Manaus Didelphis marsupialis Xenodiagnosis TcI
AM31 Manaus Didelphis marsupialis Xenodiagnosis TcI
105
AM32 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM33 Manaus Rhodnius pictipes Xenoculture TcI
AM34 Coari Philander opossum Hemoculture TcI
AM35 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM36 Manaus Homo sapiens (a) Xenodiagnosis TcI
AM37 Coari Rhodnius robustus Xenoculture TcI
AM38 Coari Philander opossum Hemoculture TcI
AM39 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM40 Manaus Didelphis marsupialis Xenodiagnosis TcI
AM42 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM43 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM44 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM45 Manaus Didelphis marsupialis Hemoculture TcI
AM46 Manaus Rhodnius robustus Not performed TcI
AM47 Manaus Rhodnius pictipes Not performed TcI
AM48 Coari Rhodnius pictipes Xenoculture TcI
AM49 Coari Homo sapiens Hemoculture TcI
AM50 Coari Homo sapiens CSF (b) culture TcI
AM52 Apuí Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM55 Apuí Rhodnius robustus Inoculation in mice TcI
AM56 Apuí Rhodnius robustus Inoculation in mice TcI
AM57 Apuí Rhodnius robustus Inoculation in mice TcIV
AM58 Apuí Rhodnius robustus Inoculation in mice TcIV
AM59 Apuí Rhodnius pictipes Inoculation in mice TcI
AM60 Apuí Rhodnius pictipes Inoculation in mice TcI
AM61 Apuí Rhodnius pictipes Inoculation in mice TcI
AM62 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM63 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM64 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM65 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM66 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM67 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
AM68 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
106
AM69 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Hemoculture TcIV
AP60 Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
Erlisson Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Xenodiagnosis TcIV
D Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Not performed TcIV
Gus Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Not performed TcIV
L Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Not performed TcIV
LM Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Not performed TcIV
W Santa Isabel do Rio Negro Homo sapiens Not performed TcIV
AM70 Coari Homo sapiens Hemoculture TcIV
AP10 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
AP11 Apuí Rhodnius pictipes Not performed TcI
AP12 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
AP15 Apuí Rhodnius pictipes Not performed TcI
AP20 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
AP21 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcIV
AP24 Apuí Rhodnius pictipes Not performed TcI
AP25 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
AP28 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
AP35 Apuí Rhodnius pictipes Not performed TcI
AP51 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcIV
AP67 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
AP69 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
AP70 Apuí Rhodnius robustus Not performed TcI
TcV_1 Coari Rhodnius pictipes Not performed TcI
TcV_5 Coari Rhodnius pictipes Not performed TcI
TcV_6 Coari Rhodnius pictipes Not performed TcI
TcV_19 Coari Rhodnius robustus Not performed TcI
TcV_29 Coari Rhodnius robustus Not performed TcI
TcV_35 Coari Rhodnius pictipes Not performed TcI
TcV_41 Coari Rhodnius pictipes Not performed TcI
TcV_47 Coari Rhodnius pictipes Not performed TcI
TcV_98 Coari Rhodnius pictipes Not performed TcI
a: The only stock from a human in the chronic phase; b: Cerebrospinal fluid.
107
Figure 1. Genetic profiles from a representative set of Trypanosoma cruzi stocks, by
analysis of the ribosomal RNA gene (A) and restriction fragment length polymorphism
of the mitochondrial cytochrome oxidase II gene (B) in silver-stained polyacrylamide
gel. MM, 100 bp molecular weight marker. NC, negative control.
108
Figure 2. Allocation of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas into
known phylogenetic clusters, most recently classified as TcI to TcVI [30], based on
cytochrome c oxidase subunit II gene sequencing.
109
Figure 3. Allocation of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas into
known phylogenetic clusters, most recently classified as TcI to TcVI [30], based on
glucose-phosphate isomerase gene sequencing.
110
Figure 4. Geographic distribution and reservoirs of the haplotypes of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas, based on
single-nucleotide polymorphisms identified by cytochrome c oxidase subunit II gene sequencing.
111
Figure 5. Geographic distribution and reservoirs of the haplotypes of the Trypanosoma cruzi isolated in the State of Amazonas, based on
single-nucleotide polymorphisms identified by glucose-phosphate isomerase gene sequencing.
112
ARTIGO 3
Monteiro WM, Magalhães LKC, Oliveira JC, Guerra JAO, Silveira H, Ferreira LCL,
Toledo MJO, Barbosa MGV. Biological behavior in mice of Trypanosoma cruzi stocks
from the State of Amazonas, Western Brazilian Amazon. Aceito para publicação na
Revista Brasileira de Medicina Tropical.
113
Title: Biological behavior in mice of Trypanosoma cruzi stocks from the State
of Amazonas, Western Brazilian Amazon
Comportamento biológico em camundongos de isolados de Trypanosoma cruzi do
Estado do Amazonas, Amazônia Ocidental Brasileira
Running Title: Biological behavior of Trypanosoma cruzi stocks from Amazon
Region / Comportamento biológico de isolados de Trypanosoma cruzi da Amazônia
Wuelton Marcelo Monteiro (MSc)I,II, Laylah Kelre Costa Magalhães (MSc)I, Josué
Costa Oliveira (Graduate Student)I, Jorge Augusto de Oliveira Guerra (PhD)I,
Henrique Silveira (PhD)I,III, Luiz Carlos de Lima Ferreira (PhD)I,II, Max Jean de
Ornelas Toledo (PhD)IV, Maria das Graças Vale Barbosa (PhD)I
I Postgraduate Program in Tropical Medicine, State University of Amazonas/Tropical
Medicine Foundation of Amazonas, Manaus, AM, Brazil
II Faculty of Medicine, Federal University of Amazonas, Manaus, AM, Brazil
III Tropical Medicine and Hygiene Institute, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa,
Portugal
IV Basic Health Sciences Department, State University of Maringá, Maringá, PR,
Brazil
Adress to:
Prof. Wuelton Marcelo Monteiro
Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, Universidade do Estado do
Amazonas/Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus,
Amazonas, Brasil.
Av. Pedro Teixeira 25, Dom Pedro
69.040-000 Manaus, AM
Phone: 55 92 3656-8269
e-mail: [email protected]
Apoio financeiro: SUFRAMA E CNPq.
114
ABSTRACT
Introduction: Biological diversity of circulating Trypanosoma cruzi stocks in the
Amazon Region most likely plays an important role in the peculiar clinico-
epidemiological features of Chagas disease in this area. Methods: Seven stocks of
T. cruzi recently isolated in the State of Amazonas, Brazil, from humans, wild
mammal and triatomines, belonging to TcI and Z3 genotypes, were biologically
characterized in Swiss mice. Parasitological and histopathotological parameters were
determined. Results: Four stocks did not promote patent parasitemia in mice. Three
stocks produced low parasitemia, long pre-patent periods, and patent period of one
day or oscillating parasitemia. Maximum parasitemia ranged from 1,400 to 2,800
trypomastigotes/0,1 mL of blood. Mice inoculated with the T. cruzi stocks studied
showed low positivity of fresh blood examination. For the hemoculture, positivity
ranged from 0 to 100%. Heart tissue parasitism was observed in mice inoculated with
stocks AM49 and stock AM61. Stock AM49 triggered moderate inflammatory process
in heart tissue. Mild inflammatory process was observed in heart tissue for stocks
AM28, AM38, AM61 and AM69. Inflammatory process in skeletal muscle was very
frequent. Brain tissue examination revealed inflammatory foci and gliosis in mice
inoculated with the stock AM49. Conclusions: Biological and histopathological
characterization allowed demonstrating the low infectivity and virulence of the stocks
of T. cruzi from the state of Amazonas.
Key-words: Chagas disease. Trypanosoma cruzi. Virulence. Pathogenicity. Swiss
mice. Amazon.
115
RESUMO
Introdução: A diversidade biológica dos estoques Trypanosoma cruzi circulantes na
Região Amazônica pode desempenhar importante papel nas características clínico-
epidemiológicas peculiares da doença de Chagas nesta área. Métodos: Sete
isolados de T. cruzi do Estado do Amazonas provenientes de humanos, mamíferos
silvestres e triatomíneos, pertencentes aos genótipos TcI e Z3, foram biologicamente
caracterizados em camundongos Swiss. Foram avaliados parâmetros
parasitológicos e histopatológicos. Resultados: Quatro isolados não produziram
parasitemia patente em camundongos. Três isolados promoveram baixa parasitemia
com longos períodos pré-patentes, período patente de um dia ou parasitemia
oscilante. A parasitemia máxima variou de 1.400 a 2.800 tripomastigotas/0,1 mL de
sangue. Os camundongos inoculados com os isolados estudados mostraram baixa
positividade no exame a fresco, variando de 0 a 28,6%. Para a hemocultura, a
positividade variou de 0 a 100%. Parasitismo cardíaco foi observado em
camundongos inoculados com os isolados AM49 e AM61. O isolado AM49 produziu
inflamação moderada no tecido cardíaco. Processo inflamatório discreto foi
observado no tecido cardíaco de camundongos inoculados com os isolados AM28,
AM38, AM61 e AM69. Processo inflamatório em músculo esquelético foi muito
freqüente. O exame do tecido cerebral revelou focos inflamatórios e gliose em
camundongos inoculados com o isolado AM49. Conclusões: A caracterização
biológica e histopatológica demonstrou baixa infecciosidade e virulência dos
estoques de T. cruzi isolados no Estado do Amazonas.
Palavras-chaves: Doença de Chagas. Trypanosoma cruzi. Virulência.
Patogenicidade. Camundongos Swiss. Amazônia.
116
INTRODUCTION
Chagas disease is an important parasitic disease resulting from the infection by the
flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. Its evolutionary pattern is not fully defined,
because factors that determine the considerable spatial variation in morbidity and
mortality due to disease are unknown1. However, the idea that both the parasite
variability and host response play important roles in the course of the infection is
consensual2. In fact, studies show that T. cruzi comprises highly heterogeneous
populations of organisms, both in terms of genetic and phenotypic points of view,
including biological (behavior in vertebrate and triatomines), pathological (tissue
tropism, virulence, intensity of inflammatory reactions, mortality), clinical
(indeterminate and cardiac and/or digestive forms), immunological and biochemical
features2,3.
In the Amazon Region, Chagas disease has been recognized as an important
emerging anthopozoonosis. Information from the Brazilian Ministry of Health4
indicates the communication of 756 cases of acute illness in the country, from 2005
to October 2010. Most striking that, 688 (91.0%) cases occurred in the states
belonging to the Amazon Region. Brazilian states with the largest number of these
cases were Pará, with 573 cases (75.8%) and Amapá and Amazonas, with 54 (7.1%)
each, all located in Amazon. In the State of Amazonas, Chagas disease has a lower
morbidity and mortality than in the endemic classic areas, appearing mainly in the
chronic latent form1,5. Cross-sectional studies in several riverine communities and
piassava fiber collectors in the Rio Negro microregion proved the high prevalence of
the chagasic infection in this area and demonstrated a low morbidity profile in the
chronic phase of the disease6,7.
The study of biological diversity of T. cruzi stocks circulating in the Amazon Region is
essential for understanding the emergence, expansion and the peculiar clinico-
epidemiological characteristics of Chagas disease in this area. Thus, the purpose of
this preliminary work is to investigate the behavior in mice of T. cruzi stocks from the
State of Amazonas, in the Western Brazilian Amazon.
117
METHODS
Ethical considerations
The use of stocks of T. cruzi obtained from patients has been approved by the Ethics
in Research on Humans Committee of the Tropical Medicine Foundation of the State
of Amazonas (approval number 360/07). Marsupials‟ captures and handling for blood
sample collection were performed according to permits from the Brazilian Institute for
Environment (IBAMA) (approval number 1830651/07). Use of mice in this study
followed the ethical principles for animal experimentation8.
Parasites isolation
The sample T. cruzi stocks was obtained in the Tropical Medicine Foundation of
Amazonas, between April 2006 to January 2010, from six municipalities distantly
located of the State of Amazonas.
Table 1 shows the host, method of isolation, localities of origin, and genetic lineage
of the seven T. cruzi stocks studied.
For parasite isolation and culturing, heparinized blood samples from chagasic
patients in the acute phase, were inoculated into tubes containing a biphasic medium
consisting of NNN medium, covered with an overlay of LIT medium containing 10%
fetal calf serum and 140 mg/ml of gentamycin sulphate9. Approximately 0.5 ml of
whole blood was placed on each tube (3-5 tubes for each person). Cultures were
kept at 28C and monitored microscopically for parasite growth twice a week for two
months. One T. cruzi stock was isolated by cerebrospinal fluid culture from a patient
who died due to acute chagasic meningoencephalitis, resident in the municipality of
Coari (AM49), by the same method used for blood culture.
Two T. cruzi stocks were isolated from marsupials captured in Tomahawk traps with
fruits as bait. Parasite isolation from wild mammals was carried out by the same
technique applied for human blood culture.
118
To obtain the two T. cruzi stocks from triatomine bugs, specimens were collected
from palm trees in the peridomestic environment. Triatomines were dissected, their
intestinal contents were examined by phase microscopy, and positive samples for
trypanosomes were inoculated in mice for subsequent isolation by blood culture.
After isolation, stocks were immediately cryopreserved in liquid nitrogen (-193C) in
the trypanosomatid culture collection of the Department of Entomology, Tropical
Medicine Foundation of Amazonas.
To characterize genotypically the isolated parasites, extraction of total DNA from in
vitro isolates of T. cruzi was performed using the PureLink Kit (Invitrogen, Life
technologies, USA), according to the manufacturer‟s protocol. DNA was prepared
from 200 µL of culture and eluted with 50 µL of milliQ water. DNA from the
nontranscribed spacer of the mini-exon was amplified according to Fernandes et al10.
The T. cruzi isolates were typed as TcI or Z3 lineages (Monteiro et al, in preparation).
Inoculation of mice
Groups of seven male Swiss mice (age, 12 to 15 days) originating from the
Department of Venomous Animal vivarium of the Tropical Medicine Foundation of
Amazonas, were inoculated intraperitoneally with 1.0x106 metacyclic trypomastigotes
from late-stationary-phase culture in liver-infusion tryptose (LIT) medium, determined
in a Neubauer chamber. Mice were maintained in large boxes, in a well ventilated
room, with free access to a commercial pellet feed for rodents and drinking water, ad
libitum.
Parasitological parameters
(i) Fresh blood examination (FBE). Five microlitres of blood were collected daily
from the tails of the mice and were examined microscopically for living
trypomastigotes. The level of parasitemia was measured daily from the 3th day after
inoculation as described by Brener11. The results were also expressed as
percentages of mice with positive FBE (%+FBE). The pre-patent period (PPP), patent
119
period (PP), maximum of parasitaemia (MP) and the day of maximum parasitaemia
(DMP) were determined, according with Toledo et al12.
(ii) Hemoculture (HC). Ninety days after the inoculation (d.a.i.), a blood sample
collected by cardiac puncture was cultured as aforementioned, in duplicate. The
hemocultures were maintained at 28°C and examined 15, 30, 60 and 90 days later
for the detection of parasites. The results were expressed as percentages of mice
with positive hemoculture (%+HC)12.
Infectivity and mortality
Infectivity (%INF) was determined as percentage of mice that presented positive
fresh blood examination and/or hemoculture in the first three months after the
inoculation12.
Mortality (%MOR) was registered daily after the inoculation and expressed in
cumulative percentage of death.
Histopathological parameters
For each T. cruzi stock, all surviving mice were necropsied ninety d.a.i. for
histopathological studies. The following organs and tissues were collected: (1) heart,
(2) skeletal muscle, (3) lungs, (4) large intestine, (5) brain, (6) liver and (7) spleen.
This material was routinely processed and embedded in paraffin. Five-micrometer
sections of three blocks containing every organ of each mouse were obtained for
further evaluation. These preparations were stained with hematoxylin-eosin for
microscopic examination. The tissue parasitism (TP) and inflammatory process (IP)
displayed by different organs or tissues were classified as absent (–), mild (+),
moderate (++) and severe (+++).
Statistical analysis
Data were analyzed using SPSS® version 16.0 for Windows (SPSS Inc.® Chicago, IL,
USA). Chi-square test was used to test differences in proportions, and Student t test
120
was used to test differences in means. Statistical significance was considered if
p<0.05.
RESULTS
Four of the stocks evaluated (AM28, AM41, AM69 and AM70) did not lead to patent
parasitemias. Parasitological parameters, infectivity and mortality obtained from
isolates are demonstrated in the Table 2. Stock AM49 promoted intense lethargy,
hind limb paralysis and ruffed coat in mice. For stocks AM41, AM49 and AM69,
deaths occurred in 68°, 49° and 46° d.a.i., respectively. Deaths occurred in 28° and
35° d.a.i. for the stock AM28. One of the seven stocks (AM61) resulted in higher
%MOR in mice (71.4%) and all deaths occurred in the 17° d.a.i. This stock led to
intense lethargy and ruffed coat in mice.
Stock isolated from marsupial Philander opossum showed significantly higher mean
PPP than the stocks obtained from human and triatomine (p < 0.001); for the stock
from human this parameter was higher than that from triatomine (p < 0.001). Mean
PP was higher for stock from triatomines (p < 0.005). These stocks led to MP
significantly higher in comparison with stocks derived from others hosts (p = 0.015).
The DMP did not differed significantly among stocks from different hosts (Table 3).
Stocks obtained from Rhodnius robustus showed significantly higher %+FBE than
human- and marsupial-derived stocks (p < 0.05). The parameters %+HC and %INF
were higher for stocks from marsupials in relation to the others (p < 0.05). Stocks
isolated from triatomines led to higher %MOR than stocks from humans (p = 0.021)
(Table 3).
Heart tissue parasitism was observed for two mice (28,6%) infected with stocks
AM49 (Figure 1) and for one mouse (14,3%) infected with stock AM61. Tissue
parasitism was not verified in the other organs examined. All mice inoculated with the
stock AM49 showed focal and moderate inflammatory process in heart tissue (Figure
1). Focal and mild inflammatory process was observed in heart tissue of mice
inoculated with stocks AM28, AM38, AM61 and AM69. Inflammatory process in
skeletal muscle was diffuse and intense in mice inoculated with stock AM49,
121
moderate with stocks AM28 and AM38, and mild with stocks AM61, AM69 and AM70
(Table 4). Brain tissue examination revealed inflammatory foci and gliosis in four
(57.1%) mice inoculated with the stock AM49 (Figure 1). Inflammatory process was
not observed in spleen, liver, lungs and large intestine for any group of mice (Table
4).
DISCUSSION
In the State of Amazonas, chronic Chagas disease has lower morbidity than in
classic endemic areas, appearing mainly in the latent form1,5. In this state, chagasic
infection was first reported by Ferraroni et al13, that examined 25 individual who
worked in piassava fiber extractivism in the municipality of Barcelos, has found six
with positive serological tests. Cross-sectional assessments, including clinical and
radiological evaluation of anti-T. cruzi seropositive patients, carried out in the Rio
Negro micro-region, ratified the high chagasic infection seroprevalence in this region
and showed a profile of low morbidity and mortality in the chronic phase of the
disease5-7.
T. cruzi stocks have been characterized on the basis on biological behavior in
mice14,15. The present study with stocks from the State of Amazonas, an area non
endemic but emerging for Chagas disease, showed four (AM28, AM41, AM69 and
AM70) of seven stocks studied with subpatent parasitemias. Furthermore, the other
three stocks that caused patent infections in mice produced a low and late
parasitemia, with peaks not exceeding 2,800 trypomastigotes/0.1 mL of blood. In
relation to the parasitemia, we observed that this profile was very different from
endemic areas, where stocks with variable parasitemias circulate, but with frequent
rates of patent infections, in particular for stocks isolated from chronic patients14-18. In
this study low parasitemia, very long pre-patent period and short patent period
indicates a low virulence of the strains from Western Amazon Region. These findings
agree with the hypothesis of several authors who suggested that the framework of
chronic latent infection in the State of Amazonas is due to the low parasitemia and
lower virulence and pathogenicity of the wild parasites in this area.
122
An important practical aspect that can be explained by the low parasitemia
determined by T. cruzi stocks isolated from the Amazon Region is the low
performance of the diagnostic methods for Chagas disease in this area. In Bolivia
and in the elderly Brazilian endemic areas, where TcII genotype circulates, infection
courses with high parasitemias and diagnostic tests are very sensible, contrasting
with areas from Amazonia and Mexico, where TcI occurs5,19-21. In the Brazilian
Amazon and Venezuela, diagnostic tests employed in the acute phase of Chagas
disease showed low sensibility22-24. Brum-Soares et al5 also verified that chronic
chagasic patients from the Rio Negro micro-region presented low IgG anti-T. cruzi
seric levels, probably due to the low parasite load and/or low antigenic power of the
circulating parasites. Interestingly, our findings corroborate the first suggestion.
Stocks AM41, AM69 and AM70 were not infective for mice, both in FBE and
hemoculture, confirming low virulence for these isolates. For the stocks AM28, AM38,
AM49 and AM61 we found high infectivity rates by hemoculture, despite the low
parasitemias. If this features reproduces in human hosts, an important implication is
the lack or delay in diagnosis of acute Chagas disease, since direct methods are
being used and recommended in the Amazon Region, because that are the same
carried out in the detection of malaria cases, which would make a parallel program
control. These data support previous studies, which reported that sylvatic stocks from
the United States, where TcI and zymodeme 3 circulate as in the Brazilian Amazon,
were largely avirulent and did not cause morbidity or mortality in rodent models25. In
contrast, T. cruzi stocks from elderly endemic areas of South America readily infect a
wide variety of laboratory mice strains and many cause significant morbidity and
mortality12,16,26.
Stocks from marsupials (AM28 and AM38) infected all mice inoculated, although the
low parasitemia. Previous mouse infection studies using several sylvatic- and
domestic-derived isolates from Brazil showed that those from marsupials were
generally more infective and generated higher parasitemias than those from vectors
or placental mammals16,26. Stock AM61, originated from a specimen of Rhodnius
robustus collected in the municipality of Apuí, was the other infective isolate and the
only one that promoted high mortality rate, highlighting the southern Amazon Region
as an area that needs more studies about the eco-epidemiology of Chagas disease.
123
More sensible methods like molecular detection by polymerase chain reaction (PCR)
may increase the T. cruzi infectivity when applied to experimental studies in mice.
Thus, we recognize this limitation, although the great number of researches using the
same methods for detecting infection, and claim for caution when these data will be
compared with other results. T. cruzi infection can be diagnosed by demonstrating
the presence of the parasite by direct and indirect parasitological methods,
immunodiagnosis being used to detect specific antibodies against T. cruzi, or by
molecular methods that search for parasite DNA. The high PCR positivity suggested
this methodology as a diagnostic tool for detection of T. cruzi DNA in blood of
different host species27.
Although the report that the majority of the sylvatic and human stocks from the
Western Amazon were largely non virulent and did not cause morbidity or mortality in
our model, we noted an interesting result in the experimental infection with the stock
AM49. This strain was isolated from cerebrospinal fluid of an infant misdiagnosed
primarily as skin abscesses, which evolved to fatal outcome due to acute Chagas
disease meningoencephalitis (unpublished information) and was the unique infective
isolate from patients for mice. Group of mice infected with this isolate showed relative
low mortality and parasitemia, despite the high infectivity and frequency of
observable physical or behavioral changes indicative of Chagas disease, such as
lethargy, hind limb paralysis and ruffed coat. Histopathological alterations triggered
by this stock included intense inflammatory process of skeletal muscles, moderate
inflammation and parasitism of heart and, surprisingly, inflammation and gliosis in the
brain of the infected mice. These results suggest that this stock could belong to the
biodeme III3, with a dissimilar neurotropic behavior.
Inflammatory process or tissue parasitism was not observed in liver and spleen of
infected mice. However, even in animals with no evident parasitemia, inflammatory
process was observed in skeletal muscle tissue and, less frequently, in cardiac
tissue. In addition, two stocks also promoted tissue parasitism in rodents, indicating
that some stocks of T. cruzi from the State of Amazonas can behave as to the
biodeme III3. In fact, infrequent chronic cardiac cases of Chagas disease confirms
that parasites circulating in this area cause miocardiopathy, appearing clinically as
124
cardiac insufficiency, arhythmogenic syndrome or thrombo-embolism28-33. Absence of
histopathological alterations in large intestine indicates that parasites studied did not
presented capacity to cause the digestive Chagas disease, in agree with no records
of „mega‟ syndromes in Amazonian countries and Central and North America34.
CONCLUSION
Our data suggest that the biological characteristics of T. cruzi stocks from the
Western Amazon Region may vary considerably. The disproportion between the
number of cases of infection and clinical disease in this region may result of the
predominance of non virulent strains. However, our study demonstrated the
occurrence of stocks that can cause cardiac and nervous involvement. So, we
recommend the biological characterization of a great number of stocks to define the
real potential of emergence of Chagas disease as a public health problem in the
Amazonian context.
The belief that the Chagas disease may be benign in some geographic areas, as in
the Amazon Region, derives from misinformation or lack of more throughout
investigation. Under no circumstances should it serve to postpone control measures
once the risk of transmission to men has been established.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank to Yolanda Nouguth, Carlos Jatobá, Nelson Fé, Flávio Fé and Sandra
Caranhas for technical assistance, and to Gisely Cardoso de Melo for statistical
analysis.
CONFLICT OF INTEREST
The authors declare that there are no conflicts of interest.
125
FINANCIAL SUPPORT
This research was funded by Superintendência da Zona Franca de Manaus
(SUFRAMA) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq).
REFERENCES
1. Coura JR, Borges-Pereira J, Araújo RM. Morbidity and regional variation of
Chagas disease in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999; 94:26-27.
2. Macedo AM, Machado C, Oliveira R, Pena S. Trypanosoma cruzi: genetic
structure of populations and relevance of genetic variability to the pathogenesis of
Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 99:1-12.
3. Andrade SG, Magalhães JB. Biodemes and zymodemes of Trypanosoma cruzi
strains: correlations with clinical data and experimental pathology. Rev Soc Bras Med
Trop 1997; 30:27-35.
4. Ministério da Saúde [Internet]. Brasília: Casos de Doença de Chagas Aguda. 2005
a 2010, Brasil. [2011 march 3]. Available from:
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/casos_brasil_2005_a_2010.pdf/.
5. Brum-Soares LM, Xavier SS, Sousa AS, Borges-Pereira J, Ferreira JMBB, Costa
IR, Junqueira ACV, et al. Morbidity of Chagas disease among autochthonous
patients from the Rio Negro microregion, State of Amazonas. Rev Soc Bras Med
Trop 2010; 43:170-177.
6. Coura JR, Junqueira ACV, Bóia MN, Fernandes O, Bonfante C, Campos JE, et al.
Chagas disease in the Brazilian Amazon. IV. A new cross-sectional study. Rev Inst
Med Trop São Paulo 2002; 44:159-165.
126
7. Coura JR, Junqueira ACV, Bóia MN, Fernandes O. Chagas disease: from bush to
huts and houses. Is it the case of the Brazilian Amazon? Mem Inst Oswaldo Cruz
1999; 94:379-384.
8. Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. Princípios Éticos na
Experimentação Animal. São Paulo: COBEA; 1991. p. 1.
9. Miles MA, Toyé PJ, Oswaldo SC, Godfrey DC. The identification by isoenzyme
patterns if two distinct strain-groups of Trypanosoma cruzi, circulating independently
in a rural area of Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 1977; 71:217-225.
10. Fernandes O, Santos SS, Cupolillo E, Mendonça B, Derre R, Junqueira AC, et al.
A mini-exon multiplex polymerase chain reaction to distinguish the major groups of
Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli in the Brazilian Amazon. Trans R Soc
Trop Med Hyg 2001; 95:97-99.
11. Brener Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally
infected with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop São Paulo 1962; 4:389-396.
12. Toledo MJO, Lana M, Carneiro CM, Bahia MT, Machado-Coelho GLL, Veloso
VM, et al. Impact of Trypanosoma cruzi clonal evolution on its biological properties in
mice. Exp Parasitol 2002; 100:161-172.
13. Ferraroni JJ, Melo JAN, Camargo ME. Moléstia de Chagas na Amazônia.
Ocorrência de seis casos suspeitos, sorologicamente positivos. Acta Amaz 1977; 7:
438-440.
14. Andrade SG, Magalhães JB. Biodemes and zymodemes of Trypanosoma cruzi
strains: correlations with clinical data and experimental pathology. Rev Soc Bras Med
Trop 1997; 30:27-35.
15. Andrade SG. Morphological and behavioural characterization of Trypanosoma
cruzi strains. Rev Soc Bras Med Trop 1985; 18:39-46.
127
16. Bértoli M, Andó MH, Toledo MJO, Araújo SM, Gomes ML. Infectivity for mice of
Trypanosoma cruzi I and II strains isolated from different hosts. Parasitol Res 2006;
99:7-13.
17. Devera R, Illarramendi X, Montoya-Araújo R, Pirmez C, Fernandes O, Coura JR.
Biodemas de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas de humanos de três áreas
endêmicas de Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop 2002; 35:323-330.
18. Oliveira EC, Stefani MMA, Luquetti AO, Vêncio EF, Moreira MAR, Souza C, et al.
Trypanosoma cruzi and experimental Chagas‟ disease: characterization of a stock
isolated from a patient with associated digestive and cardiac form. Rev Soc Bras
Med Trop 1993; 26:25-33.
19. Aguilar HM, Abad-Franch F, Dias JCP, Junqueira ACV, Coura JR. Chagas
disease in the Amazon Region. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102:47-55.
20. Wincker P, Bosseno MF, Britto C, Yaksic N, Cardoso MA, Morel CM, et al. High
correlation between Chagas‟ disease serology and PCR-based detection of
Trypanosoma cruzi kinetoplast DNA in Bolivian children living in an endemic area.
FEMS Microbiol Lett 1994; 124:419-423.
21. Wincker P, Britto C, Pereira JB, Cardoso MA, Oelemann W, Morel CM. Use of a
simplified polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in blood
samples patients in a rural endemic area. Am J Trop Med Hyg 1994; 71:771-777.
22. Monteiro WM, Barbosa MGV, Toledo MJO, Fé FA, Fé NF. Série de casos agudos
de doença de Chagas atendidos num serviço terciário de Manaus, Amazonas, de
1980 a 2006. Rev Soc Bras Med Trop 2010; 43:207-210.
23. Pinto AYN, Valente SAS, Valente VC, Ferreira-Junior AG, Coura JR. Fase aguda
da doença de Chagas na Amazônia brasileira. Estudo de 233 casos do Pará, Amapá
e Maranhão observados entre 1988 e 2005. Rev Soc Bras Med Trop 2008; 41:602-
614.
128
24. Parada H, Carrasco HA, Añez N, Fuenmayor C, Inglessis I. Cardiac involvement
is a constant finding in acute Chagas‟ disease: a clinical, parasitological and
histopathological study. Int J Cardiol 1997; 60:49-54.
25. Roellig DM, Yabsley MJ. Infectivity, pathogenicity, and virulence of Trypanosoma
cruzi isolates from sylvatic animals and vectors, and domestic dogs from the United
States in ICR Strain Mice and SD Strain Rats. Am J Trop Med Hyg 2010; 83:519-
522.
26. Lisboa CV, Pinho AP, Monteiro RV, Jansen AM. Trypanosoma cruzi
(Kinetoplastida: Trypanosomatidae): biological heterogeneity in the isolates derived
from wild hosts. Exp Parasitol 2007; 116:150-155.
27. Miyamoto CT, Gomes ML, Marangon AV, Araújo SM, Bahia MT, Lana M, et al.
Trypanosoma cruzi: Sensitivity of the polymerase chain reaction for detecting the
parasite in the blood of mice infected with different clonal genotypes. Exp
Parasitology 2006; 112:198-201.
28. Albajar PV, Laredo SV, Terrazas MB, Coura JR. Miocardiopatia dilatada em
pacientes com infecção chagásica crônica. Relato de dois casos fatais autóctones
do Rio Negro, Estado do Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 2003; 36:401-407.
29. Ferreira JMB, Guerra JAO, Barbosa MGV. Ventricular aneurysm in a chronic
Chagas disease patient from the Brazilian Amazona region. Rev Soc Bras Med Trop
2009; 42:474-475.
30. Ferreira JMB, Guerra JAO, Santana-Filho FS, Magalhães BML, Coelho LIARC,
Barbosa MGV. Cardiac Involvement in Acute Chagas‟ Disease Cases in the Amazon
Region. Arq Bras Cardiol 2010; 94:e147-e149.
31. Ferreira JMB, Guerra JAO, Magalhães BML, Coelho LIARC, Maciel MG, Barbosa
MGV. Chronic Chagasic Cardiopathy in Amazon Region: an Etiology to Remember.
Arq Bras Cardiol 2009; 93:e107-e109.
129
32. Ferreira JMB, Nobre AF, Maldonado JGA, Borges-Pereira J, Zauza PL, Coura
JR. Acidente vascular encefálico isquêmico em paciente chagásico crônico
autóctone da Amazônia Brasileira. Rev Soc Bras Med Trop 2010; 43:751-753.
33. Xavier SS, Souza AS, Viñas PA, Junqueira ACV, Bóia MN, Coura JR.
Cardiopatia chagásica crônica no Rio Negro, Estado do Amazonas. Relato de três
novos casos autóctones, comprovados por exames sorológicos, clínicos,
radiográficos do tórax, eletro e ecocardiográficos. Rev Soc Bras Med Trop 2006;
39:211-216.
34. Miles MA, Cedillos RA, Póvoa MM, Souza AA, Prata A, Macedo V. Do radically
dissimilar Trypanosoma cruzi strains (zymodemes) cause Venezuelan and Brazilian
forms of Chagas disease? Lancet 1981; 1: 1338-1340.
130
TABLE 1 - Host, municipality of origin, method of isolation, and genetic lineage of the
Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas, Brazil.
T. cruzi stock
Host Municipality of origin Method of isolation
Lineagec
AM28 Didelphis marsupialis Manaus Hemoculture TcI
AM38 Philander opossum Coari Hemoculture TcI
AM41 Rhodnius robustus Maraã Xenoculture TcI
AM49 Humana Coari CSFb culture TcI
AM61 Rhodnius pictipes Apuí Inoculation in mice TcI
AM69 Humana Santa Isabel do Rio Negro Hemoculture TcI
AM70 Humana Coari Hemoculture Z3
a Patient in acute phase; b Cerebrospinal fluid; c Molecular characterization performed by PCR of
the non-transcribed spacer of the mini-exon gene according to Fernandes et al10.
131
TABLE 2 - Parasitological and virulence parameters in Swiss mice inoculated with Trypanosoma cruzi stocks from the State of
Amazonas, Brazil.
T. cruzi stock
Mean pre-patent period (days)
Mean patent period (days)
Peak of maximum
parasitemiaa
Day of maximum
parasitemia
%+FBEb %+HCc %INFd %MORe
AM28 - 0 0 0 0/7 (0.0) 5/5 (100.0) 100.0 2/7 (28.6)
AM38 78 1 1,400 78 1/7 (14.3) 7/7 (100.0) 100.0 0/7 (0.0)
AM41 - 0 0 0 0/7 (0.0) 0/6 (0.0) 0.0 1/7 (14.3)
AM49 74 1 1,400 74 1/7 (14.3) 5/6 (83.3) 83.3 1/7 (14.3)
AM61 23 15 2,800 35 2/7 (28.6) 2/2 (100.0) 100.0 5/7 (71.4)
AM69 - 0 0 0 0/7 (0.0) 0/6 (0.0) 0.0 1/7 (14.3)
AM70 - 0 0 0 0/7 (0.0) 0/7 (0.0) 0.0 0/7 (0.0)
a Number of trypomastigotes/0,1 mL of blood; b percentages of mice with positive fresh blood examination; c percentages of positive
hemoculture for surviving mice; d infectivity rate; e cumulative mortality rate.
132
TABLE 3 - Statistical comparison of eight parasitological parameters in Swiss mice inoculated with Trypanosoma cruzi stocks from
different hosts in the State of Amazonas, Brazil.
Parameter Human x Triatomines Human x Marsupials Triatomines x Marsupials
nH x nT P nH x nM p nT x nM p
Mean pre-patent period (days)a 74 x 23 < 0.001 74 x 78 < 0.001 23 x 78 < 0.001
Mean patent period (days) 0.33 x 7.5 < 0.001 0.33 x 0.5 NS 7.5 x 0.5 0.002
Peak of maximum parasitemiab 466.7 x 1,400 0.015 466.7 x 700 NS 1,400 x 700 NS
Day of maximum parasitemia 24.7 x 17.5 NS 24.7 x 39 NS 17.5 x 39 NS
%+FBEc 4.7 x 14.3 0.012 4.8 x 7.1 NS 14.3 x 7.1 0.012
%+HCd 26.3 x 25 NS 26.3 x 100 < 0.001 25 x 100 0.002
%INFe 26,3 x 25 NS 26,3 x 100 < 0.001 25 x 100 0.002
%MORf 9.5 x 42.9 0.021 9.5 x 14.3 NS 42.9 x 14.3 NS
Number of significative differences 5 3 5
a Only for stocks AM38, AM49 and AM61; b Number of trypomastigotes/0,1 mL of blood; c percentages of mice with positive fresh
blood examination; d percentages of positive hemoculture for surviving mice; e infectivity rate; f cumulative mortality rate.
p < 0.05: significative difference; NS = not significant.
133
TABLE 4 - Histopathological parameters (tissue parasitism and inflammatory
process) in mice inoculated with Trypanosoma cruzi stocks from the State of
Amazonas, Brazil.
T. cruzi stock
Organ
Heart Skeletal muscles
Spleen Liver Lungs Large
intestine
Brain
AM28 + ++ - - - - -
AM38 + ++ - - - - -
AM41 - - - - - - -
AM49 ++* +++ - - - - +
AM61 +* + - - - - -
AM69 + + - - - - -
AM70 - + - - - - -
- (absent); + (mild); ++ (moderate); +++ (severe); * The only showing mild tissue parasitism.
134
(A)
(D)(C)
(B)
FIGURE 1 - Histopathological alterations in Swiss mice triggered by the stock AM49:
(A) and (B) Nests of amastigotes in cardiac tissue. (C) Diffuse inflammatory process
in skeletal muscle. (D) Inflammatory process and gliosis in central nervous system.
Magnification 400X.
135
ARTIGO 4
Monteiro WM, Teston APM, Reis D, Gomes ML, Araújo SM, Bahia MT, Magalhães
LKC, Guerra JAO, Silveira H, Toledo MJO, Barbosa MGV. Trypanosoma cruzi stocks
belonging to TcI and TcIV DTUs from Brazilian Amazon are divergent in terms of
biological and medical properties in mice. A ser enviado para a revista International
Journal for Parasitology.
136
Trypanosoma cruzi stocks belonging to TcI and TcIV DTUs from Brazilian
Amazon are divergent in terms of biological and medical properties in mice
Wuelton M. Monteiroa,b, Ana Paula M. Testonc, Daniele dos Reisc, Mônica L.
Gomesc, Silvana M. Araújoc, Maria T. Bahiad, Laylah K. C. Magalhãesa, Jorge A. O.
Guerraa, Henrique Silveiraa,e, Max J. O. Toledoc,*, Maria G. V. Barbosaa
aPostgraduate Program in Tropical Medicine, State University of Amazonas/Tropical
Medicine Foundation of Amazonas, Av. Pedro Teixeira 25, 69.040-000 Manaus, AM,
Brazil
bFaculty of Medicine, Federal University of Amazonas, Rua Afonso Pena 1053,
69020-170 Manaus, AM, Brazil
cBasic Health Sciences Department, State University of Maringá, Av. Colombo 5790,
87020-900, Maringá, PR, Brazil
dBiological Sciences Department, Federal University of Ouro Preto, Campus do
Morro do Cruzeiro, 35400-000,Ouro Preto, MG, Brazil
eTropical Medicine and Hygiene Institute, Universidade Nova de Lisboa, Rua da
Junqueira 100, 1349-008 Lisbon, Portugal
* Corresponding author. Tel.: 55-44-3011-4918; fax: 55-44-3011-5941.
E-mail address: [email protected] (M.J.O. Toledo).
137
Graphical abstract
Research highlights—► We report the biological behavior of the TcI and TcIV
DTUs of Trypanosoma cruzi from Western Brazilian Amazon. ► Seventeen
biological parameters were tested in mice. ► Fourteen parameters presented
dissimilar characteristics between TcI and TcIV. ► TcI and TcIV stocks were
divergent in its biological and medical properties in mice. ► We propose that the
clonal model remains valid among Amazonian T. cruzi natural stocks.
Abbreviations: DTU, discrete typing unit; LIT, liver infusion tryptose; FBE, fresh
blood examination; HC, hemoculture; d.a.i., day after inoculation; PCR, polymerase
chain reaction; kDNA, kinetoplastid DNA; ELISA, enzyme-linked immunosorbent
assay; PPP, pre-patent period; PP, patent period; MDP, mean daily parasitemia;
Pmax, maximum of parasitemia; DPmax, day of maximum of parasitemia; %MOR,
mortality rate; DMM, day of maximum mortality; %INF, infectivity rate; %+FBE,
percentage of positive FBE; %+HC, percentage of positive HC; %+PCR, percentage
of positive PCR; %+ELISA, percentage of positive ELISA; TP, tissue parasitism; IP,
inflammatory process; TcI, Trypanosoma cruzi I; TcIV, T. cruzi IV.
138
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from CNPq - National Counsel of
Technological and Scientific Development (410398/2006-3) and from Araucária
Foundation (057/2009). H.S. was supported by a grant from FAPEAM - State of
Amazonas Foundation for Support to Research and the Tropical Medicine
Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado. M.J.O.T. was supported by a grant from CNPq
- National Counsel of Technological and Scientific Development. A.P.M.T. and D.R.
were supported by CAPES - Coordination for the Improvement of Higher Level
Personnel.
Abstract
In the Brazilian Amazon, clinical and epidemiological frameworks of Chagas disease
are very dissimilar in relation to the endemic classical areas of transmission, possibly
due to genetic and biological characteristics of the circulating Trypanosoma cruzi
stocks. In this work, twenty five T. cruzi stocks from Western Amazon Region
attributed to the TcI and TcIV DTUs were comparatively studied in Swiss mice to test
the hypothesis that T. cruzi clonal structure has a major impact on its biological and
medical properties. Seventeen parameters were assayed: (1) pre-patent period
(PPP); (2) patent period (PP); (3) mean daily parasitemia (MDP); (4) maximum of
parasitemia (Pmax); (5) day of maximum of parasitemia (DPmax); (6) mortality
(%MOR) in the acute phase; (7) %MOR in the chronic phase; (8) day of maximum
mortality (DMM); (9) infectivity (%INF); (10) percentage of positive fresh blood
examination (%+FBE); (11) percentage of positive hemoculture (%+HC); (12)
percentage of positive PCR (%+PCR); (13) percentage of mice with inflammatory
process in any organ; (14) percentage of mice with tissue parasitism in any organ;
(15) percentage of positive ELISA (%+ELISA) in the acute phase; (16) %+ELISA in
the chronic phase; and (17) in vivo susceptibility to benznidazole. Statistical
comparisons showed that 14 out 17 parameters were significantly different between
the two DTUs. TcIV showed higher values of PP, MDP, Pmax, %MOR in the acute
phase, %INF, %+FBE, %+ELISA in the acute phase, and %+ELISA in the chronic
phase than TcI. On the other hand TcI showed higher values of PPP, DPmax,
%MOR in the chronic phase, DMM, frequency of mice with inflammatory process in
139
any organ and frequency of mice with tissue parasitism in any organ than TcIV.
Concluding, T. cruzi stocks belonging to TcI and TcIV DTUs from Brazilian Amazon
are divergent in terms of biological and medical properties in mice.
Keywords
Trypansoma cruzi lineages TcI and TcIV; Chagas disease; Amazonia; Experimental
infection; Biological properties; Mice.
1. Introduction
Chagas disease is an important health problem, affecting 8–9 million individuals, with
approximately 50,000 new cases annually, in Central and Latin America (Hotez et al.,
2008). The illness is caused by Trypanosoma cruzi and has a variable clinical course
that may include symptomless infection, overwhelming acute disease or a severe
chronic condition. The latter may be hallmarked by cardiovascular and/or
gastrointestinal involvement (megaesophagus or megacolon). In the search for
improved sources of income, agriculture, livestock rearing, and other socioeconomic
activities, human populations began migrating into the natural wild habitats where T.
cruzi infection was enzootic (Coura, 2007). Ultimately, poverty, poor housing and
sub-standard living conditions, deforestation, and other ecological factors promoted
an incipient adaptation of triatomine vectors to both humans and domestic animals,
with increased efficiencies of the wild, domestic, and peridomestic cycles of T. cruzi
transmission (Teixeira et al., 2001; Coura, 2007). Once humans became infected and
acted as a reservoir for the infection, other forms of transmission also evolved
through blood transfusion, congenital transmission, and organ transplantation. In
some settings, oral transmission through contaminated food is now considered an
important mode of transmission (Aguilar et al., 2007).
In the Brazilian Amazon Region, Chagas disease has been recognized as an
important and emerging problem (Coura et al., 2002; Aguilar et al., 2007). The
epidemiological situation of Chagas disease in the Amazon, where enzootic T. cruzi
transmission cycles involve a great diversity of vectors and reservoir hosts (Coura et
al., 2002; Abad-Franch e Monteiro, 2007), suitably illustrates the concerns about the
consolidation of Chagas disease control. Adventitious adult triatomines maintain
140
continuous, low-intensity transmission in rural settings; as a result, human infection is
hypoendemic in the region, with about 100,000 to 300,000 people chronically
carrying T. cruzi (Aguilar et al., 2007). Sylvatic triatomines are also involved in
localized disease outbreaks related to oral T. cruzi transmission via contaminated
foodstuffs, and account for the relatively high infection prevalence (4–5%) reported
among extractivist forest workers such as piaçava palm fiber collectors (Coura et al.,
2002; Aguilar et al., 2007). The vast majority of these transmission events are
mediated by triatomines of the genus Rhodnius, which are primarily associated with
palm trees (Lent e Wygodzinsky, 1979; Abad-Franch et al., 2010).
Independent genetic markers pointed to the division of T. cruzi into two major groups,
named as T. cruzi I (TcI) and T. cruzi II (TcII) (Anonymous, 1999), corresponding,
respectively, to zymodemes Z1 and Z2, defined in pioneer studies based on the
electrophoretic profiles of isozymes (Miles et al., 1977). A third group, zymodeme Z3,
with scarce isolates from the sylvatic cycle of the Amazon region, could not be
grouped into any of the two major lineages (Miles et al., 1978). Multilocus genotyping
consistently reveals six distinct „discrete typing units‟ (DTUs), which have been
divided into two „major subdivisions‟ termed TcI and TcII; TcII being further split into
five DTUs: TcIIa to TcIIe (Brisse et al., 2000). A recent consensus renamed these
DTUs as TcIV, TcII, TcIII, TcV e TcVI, respectively (Zingales et al., 2009). TcII, TcV
and TcVI predominate in the domestic transmission cycle in the South Cone of South
America, where patients may present severe acute disease with chronic cardiac
and/or digestive involvement (Chapman et al., 1984; del Puerto et al., 2010). In the
Brazilian Amazon, Venezuela, Colombia, Central and North America, TcI is the
predominant genotype and the major cause of both acute and cardiac Chagas‟
disease, but rare cases of "mega" syndromes (Miles et al., 1981a; Añez et al., 2004;
Ruiz-Sánchez et al., 2005; Flórez et al., 2010) while TcIII and TcIV cause sporadic
acute cases of Chagas‟ disease in the Brazilian Amazon basin (Miles et al., 1981b;
Marcili et al, 2009b; Monteiro et al., 2010).
The diverse clinical outcome of human T. cruzi infection has been attributed to the
genetic heterogeneity of parasite populations and to the host‟s genetic background
(Macedo et al., 2004). Miles et al. (1981a) have suggested that the variability of
clinical manifestations of the disease could be in part explained by the parasite‟s
141
genetic diversity. Several studies involving T. cruzi infection have confirmed that
genetic diversity is correlated with the intrinsic characteristics of the parasite such as
the behavior in vitro (Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998), in the vector (Lana et
al., 1998), and in the vertebrate host, namely virulence, parasitemia, capacity to
induce host mortality (Toledo et al., 2002, Roellig et al., 2010), pathological
alterations and tropism toward specific organs (de Diego et al., 1998; Toledo et al.,
2002; Toledo et al., 2004). There are no published studies exploring the genetic and
biological framework of stocks of T. cruzi from the Western Brazilian Amazon, where
Chagas disease has a profile of lower morbidity and mortality than in the endemic
classic areas, appearing mainly in the chronic latent form (Coura et al., 1999; Brum-
Soares et al., 2010).
To understand the diverse phenotypic differences among different T. cruzi strains
and the potential connection between that variability and different manifestations of
Chagas disease, it is essential to have a correct reconstruction of the evolutionary
history of T. cruzi. A classification that represents evolutionary relationships is highly
desirable because it may play an important role in strategic decisions about control
and prophylaxis of Chagas disease. T. cruzi undergoes predominant clonal evolution
with only rare events of genetic recombination (Tibayrenc and Ayala, 1988; Gaunt et
al., 2003). This clonal model predicts a parallel evolution between biological
differences and genetic divergence among T. cruzi natural clones. The aim of this
work is to carry out the biological characterization of T. cruzi isolates belonging to TcI
and TcIV DTUs from the State of Amazonas, Western Brazilian Amazon, testing if the
clonal model remains valid in a well-defined area where the Chagas disease
molecular epidemiology is very dissimilar in relation to the endemic classical areas of
transmission.
2. Materials and methods
2.1 Parasites stocks
The use of stocks of T. cruzi obtained from patients has been approved by the Ethics
in Research on Humans Committee of the Tropical Medicine Foundation of the State
of Amazonas (approval number 360/07). Marsupials‟ captures and handling for blood
142
sample collection were performed according to permits from the Brazilian Institute for
Environment (approval number 1830651/07). Use of mice in this study was approved
by the Ethics in Research on Animal Committee of the State University of Maringá
(approval number 113/09).
All the stocks biologically characterized in this investigation are provenient from
municipalities distantly located in the State of Amazonas (Fig. 1) and were genotyped
previously as TcI or TcIV (Monteiro et al., 2010; Monteiro et al., unpublished data).
Molecular characterization was performed by PCR of the non-transcribed spacer of
the mini-exon (Fernandes et al., 2001) and by sequencing of the mitochondrial
cytochrome c oxidase subunit II (de Freitas et al., 2006) and glucose-phosphate
isomerase (Gaunt et al., 2003; Broutin et al., 2006) genes. According to the
nomenclature recently proposed (Zingales et al., 2009), we included a set of ten
stocks belonging to DTU TcI (zymodeme 1 of Miles et al., 1981b; genetic grou T.
cruzi I of Anonymous, 1999; lineage TcI of Brisse et al., 2000; lineage 2 of Souto et
al., 1996) and a set of fifteen stocks of the DTU TcIV (zymodeme 3 of Miles et al.,
1981b; considered as a hybrid clonal genotype by Souto et al., 1996 and
Anonymous, 1999; lineage TcIIa of Brisse et al., 2000; the third ancestral lineage of
de Freitas et al., 2006). Information on the laboratory code, host, method of isolation,
geographic origin, and DTU of these stocks is given in Table 1.
2.2 Inoculation of mice
For each T. cruzi isolate, a group of 20 male Swiss mice aged 21-28 days and
weighting between 18 g and 20 g was used. All the animals were supplied by the
central bioterium of the State University of Maringá and were kept under suitable
temperature, humidity, and availability of water and food ad libitum. Inoculation was
performed intraperitoneally and the inocula were calculated according to Brener
(1962), ranging from 1,4 x 103 to 1.0 x 104 blood trypomastigotes per animal (Table
1). For experiments with nine isolates (AM28, AM37, AM38, AM41, AM49, AM56,
AM61, AM69, and AM70) presenting subpatent parasitemia in Swiss mice, inoculum
of metacyclic trypomastigotes from late-stationary-phase culture in LIT medium
(Araújo et al., 1999) was employed. The number of parasites was calculated by using
143
a Neubauer chamber, with the subsequent calculation of the percentage of
trypomastigotes in random counts of 500 forms on a Giemsa-stained slide (Table 1).
2.3 Parasitological parameters
The parasitemia curve was based on the search on trypomastigotes forms in the
bloodstream. Fresh blood examination (FBE) was daily carried out from the 3th day
after inoculation (d.a.i.) until negativation for at least three consecutive days in the
case of patent parasitemia or for a 30-day period in the case of subpatent
parasitemia. Counting of parasites was performed on 5 µL of blood collected from the
animal‟s tail as described by Brener (1962). In addition to determining the percentage
of animals presenting positive FBE (%+FBE), mean pre-patent period (PPP), mean
patent period (PP), mean daily parasitemia (MDP), maximum peak of parasitemia
(Pmax) and day of maximum peak of parasitemia (DPmax) were obtained for each
DTU (Toledo et al., 2002).
2.4 Hemoculture (HC)
On the 55th d.a.i., 0.5 mL of blood was aseptically collected from the retro-orbital
plexus and placed in two tubes containing 3mL of LIT medium each, according to
Filardi and Brener (1987). The cultures were kept at 28oC and monitored with
microscopy for parasite growth at 30, 45, and 60 days after seeding. This technique
allowed the percentage of mice presenting positive hemoculture (%+HC) to be
obtained for each DTU.
2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR)
For PCR, blood samples were obtained at the same time that HC was carried out.
Two hundred microliters of blood from each animal was added to double the volume
of 6.0M/0.2M guanidine/EDTA and stored at room temperature (Ávila et al., 1991).
The lysate was boiled for 7min (Britto et al., 1993) and the DNA extraction carried out
in an aliquot of 100 µL using the Wincker et al. (1994) protocol as modified by Gomes
et al. (1998). The DNA solution was then washed with 70% ethanol prior to
precipitation in order to remove potential PCR inhibitors. Finally, the DNA was
144
resuspended in 10 µL H2O MiliQ. During this stage, one negative and one positive
control were added to each group of 4 samples. PCR amplification was performed in
a total volume of 10 µL, using 121 (5-AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA-3)
and 122 (5-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3) primers to amplify a specific
fragment of 330 base pairs (bp) of kinetoplast DNA (kDNA) of T. cruzi. The reaction
mixture was submitted to 35 amplification cycles with a thermocycler (Techne TC-
512, UK), using 95 °C for 1min for denaturation with a longer initial time of 5min,
65°C for 1min for primer annealing, and 72 °C for 1min for extension with a final
incubation at 72°C for 10min. In this step, as a contamination control, two negative
and two positive controls from the extraction step were added to every 8 samples,
and one negative and one positive control to the PCR. All the stages were carried out
in separate environments with reagents, materials, and equipment exclusive to each
area. The PCR products were visualized in 4.5% polyacrylamide silver-stained gel.
With the PCR results was obtained the parameter percentage of mice with positive
PCR (%+PCR) for each DTU (Miyamoto et al., 2006).
2.6 Infectivity and mortality
The infectivity rate (%INF) was calculated as the percentage of animals presenting
positive FBE within the first two months following inoculation and/or positive HC
and/or PCR on the 55th d.a.i. Cumulative mortality (%MOR) was recorded every day
during the infection course, being calculated as the percentage of deaths observed in
the acute (from inoculation until the 90th d.a.i) and chronic phases (from the 90th until
the 180th d.a.i.). Day of maximum mortality (DMM) was determined by the mean of
the day when occurred the deaths for each DTU.
2.7 Histopathological parameters
Histopathological analysis was carried out only on animals from experiments with the
strains AM28, AM38, AM41, AM49, AM61, AM69, and AM70. For each T. cruzi
strain, all surviving mice were necropsied on the 90th d.a.i. for histopathological
studies. The following organs and tissues were collected: (1) heart, (2) skeletal
muscle, (3) lungs, (4) large intestine, (5) brain, (6) liver and (7) spleen. This material
145
was routinely processed and embedded in paraffin. Five-micrometer sections of three
blocks containing every organ of each mouse were obtained for further evaluation.
These preparations were stained with hematoxylin-eosin for microscopic
examination. The tissue parasitism (TP) and inflammatory process (IP) displayed by
different organs or tissues were classified as absent (–), mild (+), moderate (++) and
severe (+++). With these results was obtained the frequency of mice with
inflammatory process and tissue parasitism for each DTU.
2.8 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
An ELISA modified according to Voller et al. (1980) was used. Alkaline antigen of the
T. cruzi Y (TcII) strain obtained in the exponential growth phase in LIT medium, and
peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin G conjugated (Bethyl Laboratories,
Montgomery, AL, USA) were used. Samples of serum collected in the early chronic
phase (90th d.a.i.) and in the late chronic phase (180th d.a.i.) and diluted to 1:100 in
phosphate-buffered saline, were used. The mean absorbance for 10 negative-control
serum samples plus 2 standard deviations was used as the cut-off to discriminate
positive and negative results.
With the ELISA results was obtained the parameter percentage of mice with positive
ELISA (%+ELISA) for each DTU (Miyamoto et al., 2006). Concordance, sensitivity,
especificity, and predictive values were obtained using %INF as standard.
2.9 Susceptibility to benznidazole
After detection of infection, the animals were divided into two groups: 10 treated (T)
and 10 untreated controls (NT). The first group was treated orally with daily doses of
benznidazole (Lafepe, Brazil) 100 mg/kg of body weight for 20 consecutive days.
Benznidazole was suspended in distilled water using arabic gum and this suspension
was administered by gavage.
Mice that had FBE, HC and PCR negative at the 30th day after treatment were
considered cured. The procedures for conducting these tests are the same as
described in previous items.
146
The cure rate in animals inoculated with each strain and treated with benznidazole
was obtained by the ratio between the number of animals considered cured and the
total treated animals x 100. To determine the in vivo susceptibility of T. cruzi strains
to the chemotherapeutic agent was adopted criterion similar to Toledo et al. (2003):
isolates with cure rates of 0% to 33% were resistant to the drug, those with cure rates
between 34% and 67% were considered intermediate sensitivity and insulated with
cure rates above 67% were considered sensitive to the drug.
2.10 Statistical analysis
Data were analyzed using SPSS® version 16.0 for Windows (SPSS Inc.® Chicago, IL,
USA). Normal distribution of data was evaluated with the Kolmogorov-Smirnov test.
Chi-square or Fisher‟s test was used to test differences in proportions, and Student t
test was used to test differences in means. A Kaplan-Meier survival analysis was
performed in order to detect differences in the time elapsed from the day of
inoculation to the death episodes and the beginning of the patent period between
mice inoculated with TcI and TcIV DTUs of T. cruzi. Log-rank test was used to test
differences. Statistical significance was considered if p<0.05.
3. Results and discussion
A great standard deviation was observed in biological parameters, mainly in PP,
MDP, Pmax, and DMM showing that stocks of the same genetic group are not
homogeneous in their characteristics (Table 2). This result is in full agreement with
previous data obtained from TcI and TcII lineages (Anonymous, 1999) by several
authors (Dvorak, 1984; Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998; Toledo et al., 2002),
which found that these genetic groups do not behave homogeneously for the
biological parameters under study. We strongly believe that the intra-lineage genetic
variability can help explain this framework. In Colombia, for example, TcI DTU
showed a considerable genetic heterogeneity in the intergenic region of the mini-
exon gene enough to classify these strains within four haplotypes, associated with
different transmission cycles (Falla et al., 2009; Herrera et al., 2007). The
microsatellite analysis of wild populations of TcI from several locations throughout the
147
Americas confirmed the great genetic diversity of this DTU (Llevellyn et al., 2009). By
the same way, polymorphisms of ssrDNA, randomly amplified polymorphic DNA
(RAPD) patterns, cytochrome b (Marcili et al., 2009b), and glucose-phosphate
isomerase gene sequences (Monteiro et al., unpublished observations) disclosed
small intra-lineage polymorphisms among isolates from Amazonia typed as TcIV.
Significant mean and frequency differences are apparent for biological and virulence
parameters among the two groups of stocks. The statistical comparison evidenced
that 14 out 17 parameters demonstrated significant differences between the DTUs
(Tables 2 and 3). DTU TcIV showed higher values of PP, MDP, Pmax, %MOR in the
acute phase, %INF, %+FBE, %+ELISA in the acute phase, and %+ELISA in the
chronic phase than DTU TcI. On the other hand DTU TcI showed higher values of
PPP, DPmax, %MOR in the chronic phase, DMM, frequency of mice with
inflammatory process in any organ and frequency of mice with tissue parasitism in
any organ than DTU TcIV (Table 3). The notable exception comes from parameters
obtained through parasitological amplification methods of diagnosis (%+HC and
%+PCR), and susceptibility to benznidazole, for which no result is statistically
significant.
Clonal theory assumes that an evolutionary divergence accumulated between
different lineages possibly involves genes that govern important properties related to
the parasite virulence, pathogenicity, and clinical presentation of Chagas disease
(Tibayrenc et al., 1986; Tibayrenc and Ayala, 1988). Several studies support this
hypothesis and demonstrate a strong association between genetic distance and the
biological and medical properties of the parasite. This was demonstrated in studying
the properties of T. cruzi in cell and acellular cultures (Dvorak et al. 1980, Sanchez et
al. 1990, Laurent et al., 1997; Revollo et al., 1998), virulence and pathogenicity in
mice (Andrade, 1985, Sanchez et al., 1990; Carneiro et al., 1991; Andrade e
Magalhães, 1997; Laurent et al., 1997; Lana et al., 2000; Toledo et al., 2002),
development in vectors (Garcia and Dvorak 1982; Garcia and Azambuja, 1991; Lana
et al., 1998) and response to specific chemotherapy (Andrade et al., 1985; Revollo et
al., 1998; Toledo et al., 2003; Toledo et al., 2004).
148
Although the above-mentioned studies have brought significant contributions, none of
them relied on a population genetic framework representative of the emergent
Chagas disease areas, represented in Brazil by the Amazon region, which accounts
the vast majority of notified acute cases in this country (Brazilian Ministry of Health,
2011). Furthermore, to our knowledge, this is the first investigation focusing on
biological and medical properties of TcIV strains from Amazon Region. The present
work aimed to fill up this gap. The position of zimodeme 3 (TcIII and TcIV DTUs) in
relation to the other DTUs of T. cruzi has been debated. According to some authors,
zimodeme 3 would be closer to TcI (Miles et al., 1981b; Fernandes et al., 1998;
Kawashita et al., 2001), whereas others consider this group distributed into two T.
cruzi II sub-groups (Brisse et al., 2000). The last classification is the basis for the
recent nomenclature, and TcIV constitutes a separate DTU (Zingales et al., 2009).
Knowledge of the epidemiology, transmission cycles, and clinical forms related to this
DTU are scarce. There are reports that TcIV is common in wild monkeys, Rhodnius
robustus and R. brethesi in Brazilian Amazonia, circulating in an arboreal
transmission cycle distinct from the terrestrial cycle usually attributed to TcIII (Marcili
et al., 2009b; Monteiro et al., unpublished data). Human acute Chagas disease
caused by this DTU has been described (Marcili et al., 2009b) and recently, our
group reported that the majority of the acute cases in the Western Brazilian Amazon,
including outbreaks by oral transmission, were triggered by TcIV (Monteiro et al.,
unpublished data).
Differential infectivity of T. cruzi strains for mammals and cultured cells derived from
them has been largely noted. In this work it is possible to distinguish dissimilar
behaviors for important variables of virulence. TcIV showed clearly higher virulence in
comparison with DTU TcI, as demonstrated by the higher values of parasitemia
parameters (MDP, Pmax, %+FBE), higher PP, and shortest PPP (Tables 1 and 2).
TcI stocks promoted predominatly subpatent and intermittent parasitemias, in agree
with the results obtained from previous experimental studies using TcI from the
Amazon region (Lisboa et al., 2007). Furthermore, TcIV parasites were more infective
for mice and promoted higher %MOR in the acute phase, while TcI led to higher
%MOR in the chronic phase. However, taking to account the %MOR parameter, we
suggest that both DTUs had low virulence, since a previous report demonstrated that
T. cruzi stocks (both TcI and TcII) isolated from patients in the acute phase killed
149
100% of the animals (Oliveira et al., 1997). Fig. 3 evidences that there was difference
in the time elapsed from the day of inoculation until the beginning of the patent period
and for the death episodes, confirming the results obtained by T-Student test and
reinforcing the contrasting biological behavior between the DTUs. This study showed
that TcIV promoted higher mortality in parallel with the patent period, but the effect of
parasite burden on the mortality rate of mice remains to be better investigated.
Nevertheless, our results demonstrated that mortality reflects the heterogeneity of T.
cruzi DTUs.
There is no information in the literature on virulence of TcIV, but if we consider this
DTU more closely related to T. cruzi II than T. cruzi I (Anonymous, 1999; Brisse et
al., 2000), our data are in agree with previous reports. T. cruzi II strains infected
human and monkey cells fourfold better than T. cruzi I strains, correlating differences
in cultured cells infectivity with the profile of parasite surface glycoproteins and their
differential capacity to trigger intracellular signaling events involved in the invasion
process (Ruiz et al., 1998; Neira et al., 2002). Mouse infection assays were on the
same line: while TcII and TcVI metacyclic trypomastigotes (Y and CL strains) were
highly infective, the same inoculum with TcI (G strain) metacyclic trypomastigotes did
not render patent parasitemias (Yoshida, 1983). Biological analysis revealed that,
compared with TcI, TcII strains display higher infective and multiplicative ability as
well as lower doubling time inside macrophages (Pena et al., 2011).
It has to be mentioned that some discrepant results were reported as well. Revollo et
al. (1998), for instance, showed that TcI parasites displayed a higher infection rate to
Vero cell monolayers than TcII stocks. Previous experimental studies in mice using
several strains from Brazil have shown that isolates from marsupials (host associated
with TcI) were generally more infectious and that parasitic load was greater than the
determined by isolates from vectors and other species of mammals (Bértoli et al.,
2006; Lisboa et al., 2007). Some works demonstrated that strains belonging to the
TcI have a greater ability to infect and complete its life cycle in the insect vector
(Garcia and Dvorak, 1982; Garcia and Azambuja; 1991; Lana et al., 1998), a greater
capacity to differentiate into blood trypomastigotes and a higher capacity for
intracellular multiplication in the vertebrate host populations, leading to higher
parasitemias in comparison to TcII (Andrade and Magalhães, 1997; Sánchez et al.,
150
1990; González et al., 1995; Toledo et al., 2002; Miyamoto et al., 2006; Lisboa et al.,
2007). This discrepancy to the general consensus might be attributed to different
selected strains, variation in the assay conditions, high intra-group biological
diversity, and immune response of the respective infected host, that play an
important role in the course of this infection (Revollo et al., 1998; Dost et al., 2002;
Toledo et al., 2002).
In a study conducted with TcI and TcIV isolates from United States, the two T. cruzi
DTUs caused differential infection dynamics in mice and rats as determined by PCR
detection of T. cruzi DNA in the blood and tissues (Roellig et al., 2010). These
authors found that sylvatic TcI isolates from the United States had greater infectivity
to laboratory rodents than TcIV isolates, contradicting our results with isolates from
Brazilian Amazon. Despite being indistinguishable by traditional genotyping and
generally being assigned to Z3, there are evidences that TcIV from South America
and TcIV from North America correspond to independent lineages using cytochrome
b and SSU rDNA sequences, which circulate in distinct hosts and ecological niches
(Marcili et al., 2009a). More comprehensive studies involving additional stocks from
different geographic origins are required in order to verify if regional characteristics
and intra-lineage genetic variability explain these discrepancies.
The histopathological results revealed in general the presence of few amastigotes
nests and mild inflammatory lesions. TcI triggered inflammatory process in skeletal
muscle, heart and brain, while TcIV promoted mild inflammatory process uniquely in
skeletal muscle. Parasitism was observed only in 4 mice examined, all infected by
two TcI strains (AM49 and AM61), that presented well-limited pseudocysts
surrounded by mild inflammatory reaction. Moreover, severe inflammatory process
occurred only in skeletal muscle of mice infected by TcI (Table 4). Histopathological
alterations were not observed in large intestine, liver and, spleen of infected mice.
Thus, although the lower values of parasitemia, TcI determined relatively most
severe inflammatory process and higher frequency of tissue parasitism in mice than
TcIV (Table 3).
In the Brazilian Amazon TcI is the predominant DTU and the major cause of cardiac
Chagas disease (Miles et al., 1981a; Aguilar et al., 2007), confirming the tropism of
151
some clones of this region to heart muscle. Preliminary biological observations from
experimental infections by TcI showed a peculiar behavior, leading to its
classification in the biodeme III. This biodeme consists of strains with a
predominance of broad forms with slow multiplication, determining late peaks of
parasitemia between 20 and 30 days after infection, and intense myocardial and
skeletal muscle injury (Andrade, 1985; Andrade e Magalhães, 1997), in complete
accordance with our results. Chronic cardiac cases of Chagas disease in the
Western Brazilian Amazon confirms that parasites circulating in this area cause
miocardiopathy, clinically diagnosed as cardiac insufficiency, arhythmogenic
syndrome or thrombo-embolism (Albajar et al., 2003; Ferreira et al., 2009; Ferreira et
al., 2010; Xavier et al., 2006).
The present study with stocks from the State of Amazonas has shown several stocks
of TcI with subpatent parasitemia, very long pre-patent period, short patent period,
and low frequency and intensity of histopathological lesions. Although TcIV stocks
have been demonstrated higher virulence than TcI, its pathogenicity was also
incipient. These data taken together emphasize that the biological and medical
properties of the stocks from this area are crucial to be considered in researches
about the clinical end epidemiological picture of Chagas disease in the Amazon
context. These profiles agree with the hypothesis of authors who suggested that the
framework of chronic latent infection and a relative low performance of diagnostic
tests in the State of Amazonas are due to the lower parasitemia, virulence, and
pathogenicity of the wild parasites in this area (Coura et al., 1999; Brum-Soares et
al., 2010).
From a therapeutic and prognostic standpoint, one critical aspect would be to find a
linkage between the DTU of the infecting strain and the clinical outcome of Chagas
disease. For this purpose, the putative role of various immune cell populations and
their products during T. cruzi infection has been barely evaluated in relation to the
differential behavior of the T. cruzi DTUs in the vertebrate host. For example, there
was an increase in the frequency of the population of Foxp3+ CD25HighCD4+ cells
that was also IL-10+ in the group with latent chronic Chagas disease in relation to the
cardiac group (reviewed by de Araújo et al., 2011), suggesting this profile as the
predominant in the host infected by T. cruzi strains circulating in the Western
152
Brazilian Amazon. The physiopathology of Chagas disease has been poorly defined
for non-virulent or attenuated strains biasing researches on the parasite diversity.
Studies with Sylvio X10/4 parasites showed that this clone induces no acute phase
but in C3H/He mice leads to chronic myocarditis resembling the human disease
(Marinho et al., 2009). Leguizamón et al. (1994) reported that administration of 50
bloodstream RA parasites (TcII) are often lethal to mice, whereas inoculation with 5 x
104 bloodstream K98 parasites (TcI) leads to the establishment of a chronic model for
the disease.
Absence of histopathological alterations in large intestine suggests that parasites
studied did not presented capacity to cause the digestive Chagas disease, in agree
with no records of „mega‟ syndromes in Amazonian countries and Central and North
America (Miles et al., 1981a). Furthermore, pathogenicity triggered by TcIV should be
interpreted with caution, since there were documented cases of chronic Chagas
heart disease caused by TcI/TcIV mixed infections in Colombia (Ramirez et al.,
2010), and two cases of chronic disease with cardiac/digestive involvement
associated with Z3 parasite that clustered with CANIII (prototype of the TcIV DTU) at
the isoenzymic analysis in Ecuador (Garzón et al., 2002). More extensive studies,
specialy using prospective methodologies, are needed to clarify the straightforward
potential of TcI and TcIV DTUs to develop chronic Chagas disease.
Frequency of susceptibility to benznidazole was not significative between TcI (75.0%)
and TcIV (63.0%) (Table 3). However, the character resistance to the drug was
verified only amongst TcIV strains (AM14, AM18, and AM57). In vitro (Barnabé et al.,
1983; Revollo et al., 1998) and in vivo (Andrade et al., 1985; Toledo et al., 2003;
2004) previous studies found that clones belonging to the lineage TcI are more
resistant to benznidazole and nifurtimox than that belonging to the lineage TcII.
Actually, as observed in central Brazil, patients infected with TcI strains showed
higher resistance to chemotherapy with benznidazole compared with those infected
with TcII (Andrade et al., 1992). Murta et al. (1998) reported higher efficiency of
chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in human disease in areas with high
prevalence of TcV, which features hybrid profile. Preliminary data about the response
to specific chemotherapy in patients from outbreaks related to oral transmission in
areas of predominance of TcI in the Amazon Region have been shown high
153
parasitological cure rates and decrease of antibody titres (Pinto et al., 2009; Valente
et al., 2009), reinforcing that TcI isolates from Brazilian Amazon poses a a dissimilar
behavior when compared to other areas. Natural resistance in TcIV strains deserves
attention because this DTU are involved with outbreaks of acute Chagas disease in
the Western Brazilian Amazonia according to our unpublished informations.
The shortest PP and lowest %INF during the infection suggest the higher
susceptibility to host‟s immune response for TcI. However, %ELISA was significantly
lower in mice infected by this DTU in both acute and chronic phases (Table 3). This
finding suggests then that specific humoral response plays an important protective
role early in the TcI infection, sufficient to control bloodstream parasitemia but not the
tissue parasitism and inflammatory lesions, most possibly due to differential tissue
tropism and mechanisms of immune evasion by some clones (Andrade et al., 2010).
In the course of infection by TcI antibody levels will go away down, which does not
occur in the infection by TcIV that remains stimulating humoral response due to the
persistent blood parasitemia. We noted also that serological parameters of
concordance, sensitivity, specificity, and predictive values calculated using %INF as
standard, presented satisfactory values (Table 5). These results evidence the
importance of the search by specific anti-T. cruzi antibodies as markers of infection
by Amazonian strains, irrespective the DTUs.
The seminal biological studies have demonstrated the huge heterogeneity of T. cruzi
parasites, but were probably hampered by the fact that recent and unexpanded
isolates from wild environment were not frequently used. Our work contributes to
diminish this biased sampling and includes non- or low-passaged parasite natural
stocks. Results strongly support the working hypothesis that biological differences
are proportional to the evolutionary divergence among the DTUs, and highlight the
need to take into account the phylogenetic diversity of T. cruzi natural stocks
circulating in the emergent areas for Chagas disease in all applied studies dealing
with clinical diversity of Chagas disease, immunology, diagnosis, prognosis, and drug
and vaccine trials. This shows that evolutionary divergence and biological differences
do not evolve independently, and can be statistically predicted from each other to a
large extent. The potential of the two lineages in terms of severity and clinical
manifestations remains to be determined in humans.
154
4. References
Abad-Franch, F., Ferraz, G., Campos, C., Palomeque, F.S., Grijalva, M.J., Aguilar
H.M., Miles MA., 2010. Modeling Disease Vector Occurrence when Detection Is
Imperfect: Infestation of Amazonian Palm Trees by Triatomine Bugs at Three Spatial
Scales. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e620.
Abad-Franch, F., Monteiro, F.A., 2007. Biogeography and evolution of Amazonian
triatomines (Heteroptera: Reduviidae): implications for Chagas disease surveillance
in humid forest ecoregions. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 102 (Suppl.1), 57-69.
Aguilar, H.M., Abad-Franch, F., Dias, J.C.P., Junqueira, A.C.V., Coura, J.R., 2007.
Chagas disease in the Amazon region. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 102 (Suppl.1), 47-
55.
Albajar, P.V., Laredo, S.V., Terrazas, M.B., Coura, J.R., 2003. Miocardiopatia
dilatada em pacientes com infecção chagásica crônica. Relato de dois casos fatais
autóctones do Rio Negro, Estado do Amazonas. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 36, 401-
407.
Andrade, L.O., Galvão, L.M., Meirelles, M.N., Chiari, E., Pena, S.D., Macedo, A.M.,
2010. Differential tissue tropism of Trypanosoma cruzi strains: an in vitro study. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz 105, 834-837.
Andrade, S.G., Magalhães, J.B., 1997. Biodemes and zymodemes of Trypanosoma
cruzi strains: correlations with clinical data and experimental pathology. Rev. Soc.
Bras. Med. Trop. 30, 27-35.
Andrade, S.G., Magalhães, J.B., Pontes, A.L., 1985. Evaluation of chemotherapy
with benznidazole and nifurtimox in mice infected with Trypanosoma cruzi strains of
different types. Bull. Wld. Hlth. Org. 63, 721-726.
155
Andrade, S.G., Rassi, A., Magalhães, J.B., Ferriolli-Filho, F., Luquetti, A.O., 1992.
Specific chemotherapy of Chagas disease: a comparison between the response in
patients and experimental animals inoculated with the same strains. Trans. R. Soc.
Trop. Med. Hyg. 86, 624-626.
Andrade, S.G., 1985. Morphological and behavioural characterization of
Trypanosoma cruzi strains. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 18 (Suppl. 1): 39-46.
Añez, N., Crisante, G., Maia-da-Silva, F., Rojas, A., Carrasco, H., Umezawa, E.S.,
Stolf, A.M., Ramírez, J.L., Teixeira, M.M., 2004. Predominance of lineage I among
Trypanosoma cruzi isolates from Venezuelan patients with different clinical profiles of
acute Chagas‟ disease. Trop. Med. Int. Health 9: 1319-1326.
Anonymous, 1999. Recommendations from a satellite meeting. Mem. Inst. Oswaldo
Cruz 94: 429-432.
Araújo, S.M., Guilherme, A.L.F., Toledo, M.J.O., Oliveira, P.J.G., Silva, J.C., Gomes,
M.L., 1999. Biology of Trypanosoma cruzi strains isolated from chagasic patients
from different geographic origins residing in northwestern region of the state of
Paraná, Brazil. Acta Scientiarum 21, 229-235.
Ávila, H.A., Sigman, D., Cohen, L., Millikan, R., Simpson, L., 1991. Polymerase chain
reaction of Trypanosoma cruzi kinetoplast minicircle DNA isolated from whole blood
lysate: diagnosis of chronic Chagas‟ disease. Mol. Biochem. Parasitol. 48, 211-222.
Barnabé, C., Tibayrenc, M., Dujardin, J.P., 1983. Trypanosoma cruzi. A
pharmacological comparison of some Bolivian isoenzymic strains. Ann. Soc. Belg.
Med. Trop. 63, 319-324.
Bértoli, M., Andó, M.H., Toledo, M.J.O., Araújo, S.M., Gomes, M.L., 2006. Infectivity
for mice of Trypanosoma cruzi I and II strains isolated from different hosts. Parasitol.
Res. 99, 7-13.
156
Brazilian Ministry of Health. Brasília: Casos de Doença de Chagas Aguda. 2005 a
2010, Brasil. [2011 march 3]. Available from:
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/casos_brasil_2005_a_2010.pdf/.
Brener, Z., 1962. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally
infected with Trypanosoma cruzi. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo 4, 389-396.
Brisse, S., Barnabé, C., Tibayrenc, M., 2000. Identification of six Trypanosoma cruzi
phylogenetic lineages by random amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme
electrophoresis. Int. J. Parasitol. 30, 35-44.
Britto, C., Cardoso, M.A., Wincker, P., Morel, C.K., 1993. A simple protocol for the
physical cleavage of Trypanosoma cruzi kinetoplast DNA present in blood samples
and its use in polymerase chain reaction (PCR)-based diagnosis of chronic Chagas
disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 88, 171-172.
Broutin, H., Tarrieu, F., Tibayrenc, M., Oury, B., Barnabé, C., 2006. Phylogenetic
analysis of the glucose-6-phosphate isomerase gene in Trypanosoma cruzi. Exp.
Parasitol. 113, 1-7.
Brum-Soares, L.M., Xavier, S.S., Sousa, A.S., Borges-Pereira, J., Ferreira, J.M.B.B.,
Costa, I.R., Junqueira, A.C.V., Coura J.R., 2010. Morbidity of Chagas disease among
autochthonous patients from the Rio Negro microregion, State of Amazonas. Rev.
Soc. Bras. Med. Trop. 43, 170-177.
Carneiro, M., Romanha, A.J., Chiari, E., 1991. Biological characterization of
Trypanosoma cruzi strains from different zymodemes and schizodemes. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz 86, 387-93.
Chapman, M.D., Baggaley, R.C., Godfrey-Fausset, P.F., Malpas, T.J., White, G.,
Canese L., Miles M.A., 1984. Trypanosoma cruzi from the Paraguayan Chaco:
isoenzyme profiles of strains isolated at Makthlawaiya. J. Protozool. 31, 482-486.
157
Coura, J.R., Borges-Pereira, J., Araújo, R.M., 1999. Morbidity and regional variation
of Chagas disease in Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 94, 26-27.
Coura J.R., 2007. Chagas disease: what is known and what is needed - a
background article. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 102, 113-122.
Coura, J.R., Junqueira, A.C.V., Fernandes, O., Valente, S.A.S., Miles, M.A., 2002.
Emerging Chagas disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitol. 18, 171-176.
de Araújo, F.F., Vitelli-Avelar, D.M., Teixeira-Carvalho, A., Antas, P.R.Z., Gomes,
J.A.S., Sathler-Avelar, R., Rocha, M.O.C., Elói-Santos, S.M., Pinho, R.T., Correa-
Oliveira, R., Martins-Filho, O.A., 2011. Regulatory T Cells Phenotype in Different
Clinical Forms of Chagas‟ Disease. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e992.
de Diego, J.A., Palau, M.T., Gamallo, C., Penin, P., 1998. Relationships between
histopathological findings and phylogenetic divergence in Trypanosoma cruzi. Trop.
Med. Int. Health 3, 222-233.
de Freitas, J.M., Augusto-Pinto, L., Pimenta, J.R., Bastos-Rodrigues, L., Gonçalves,
V.F., Teixeira, S.M.R., Chiari, E., Junqueira, A.C.V. Fernandes, O., Macedo, A.M.,
Machado, C.R., Pena, S.D.J., 2006. Ancestral genomes, sex and the population
structure of Trypanosoma cruzi. PLoS Pathog. 2, e24.
del Puerto R., Nishizawa, J.E., Kikuchi, M., Iihoshi, N., Roca, Y., Avilas, C., Gianella,
A., Lora, J., Velarde, F.U., Renjel, L.A., Miura, S., Higo, H., Komiya, N., Maemura, K.,
Hirayama, K., 2010. Lineage analysis of circulating Trypanosoma cruzi parasites and
their association with clinical forms of Chagas disease in Bolivia. PLoS Negl. Trop.
Dis. 4, e687.
Dost, C., Albuquerque S., Hemleben V., Engels W., Prado Jr J., 2002. Molecular
genetic characterization of different Trypanosoma cruzi strains and comparison of
their development in Mus Musculus and Calomys callosus, Parasitol. Res. 88, 609-
616.
158
Dvorak, J.A., Hartman, D.L., Miles, M.A., 1980. Trypanosoma cruzi: correlation of
growth kinetics to zymodeme type in clones derived from various sources. J
Protozool. 27, 472-474.
Dvorak, J.A., 1984. The natural heterogeneity of Trypanosoma cruzi: Biological and
medical implications. J. Cell. Biochem. 24, 357-371.
Falla, A., Herrera, C., Fajardo, A., Montilla, M., Vallejo, G.A., Guhl, F., 2009.
Haplotype identification within Trypanosoma cruzi I in Colombian isolates from
several reservoirs, vectors and humans. Acta Trop. 110, 15-21.
Fernandes, O., Santos, S.S., Cupolillo, E., Mendonça, B., Derre, R., Junqueira, A.C.,
Santos, L.C., Sturm, N.R., Naiff, R.D., Barret, T.V., Campbell, D.A., Coura, J.R.,
2001a. A mini-exon multiplex polymerase chain reaction to distinguish the major
groups of Trypanosoma cruzi and T. rangeli in the Brazilian Amazon. Trans. R. Soc.
Trop. Med. Hyg. 95, 97-99.
Fernandes, O., Sturm, N.R., Derre, R., Campbell, D.A., 1998b. The mini-exon gene:
a genetic marker for zymodeme III of Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem. Parasitol.
95, 129-133.
Ferreira, J.M.B., Guerra, J.A.O., Barbosa, M.G.V., 2009. Ventricular aneurysm in a
chronic Chagas disease patient from the Brazilian Amazona region. Rev. Soc. Bras.
Med. Trop. 42, 474-475.
Ferreira, J.M.B., Nobre, A.F., Maldonado, J.G.A., Borges-Pereira, J., Zauza, P.L.,
Coura, J.R., 2010. Acidente vascular encefálico isquêmico em paciente chagásico
crônico autóctone da Amazônia Brasileira. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 43, 751-753.
Filardi, L., Brener, Z., 1987. Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma
cruzi strains to drugs used clinically in Chagas‟ disease. Trans. R. Soc. Trop. Med.
Hyg. 81, 755-9.
159
Flórez, O., Higuera, S., Barraza, M.F., Cabrera, H.B., Mantilla, J.C., Rugeles C.I.,
2010. Chagasic megacolon associated with Trypanosoma cruzi I in a Colombian
patient. Parasitol Res. 107: 439-442.
Garcia, E.S., Azambuja, P., 1991. Development and interaction of Trypanosoma
cruzi within the insect vector. Parasitol. Today 7, 240-244.
Garcia, E.S., Dvorak, J.A., 1982. Growth and development of two Trypanosoma cruzi
clones in the arthropod Dipetalogaster maximus. Am. J. Trop. Med. Hyg. 31, 259-
262.
Garzón, E.A., Barnabé, C., Córdova, X., Bowen, C., Paredes, W., Gómez, E.,
Ouaissi, A., Tibayrenc, M., Guevara, A.G., 2002. Trypanosoma cruzi isoenzyme
variability in Ecuador: first observation of zymodeme III genotypes in chronic
chagasic patients. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 96, 378-382.
Gaunt, M.W., Yeo, M., Frame, I.A., Stothard, J.R., Carrasco, H.J., Taylor, M.C.,
Mena, S.S., Veazey, P., Miles, G.A., Acosta, N., de Arias, A.R., Miles, M.A., 2003.
Mechanism of genetic exchange in American trypanosomes. Nature 421, 936-939.
Gomes. M.L., Macedo, A.M., Vago, A.R., Pena, S.D., Galvão, L.M., Chiari, E. 1998.
Trypanosoma cruzi: optimization of polymerase chain reaction for detection in
human blood. Exp. Parasitol. 88, 28-33.
González, J., Muñoz, S., Ortiz, S., Anacona, D., Salgado, S., Galleguillos, M., Neira,
I., Sagua, H., Solari, A., 1995. Biochemical, immunological and biological
characterization of Trypanosoma cruzi populations of the Andean North of Chile. Exp
Parasitol. 81, 125-135.
Herrera, C., Bargues, M.D., Fajardo, A., Montilla, M., Triana, O., Vallejo, G.A., Guhl,
F., 2007. Identifying four Trypanosoma cruzi I isolate haplotypes from different
geographic regions in Colombia. Infect. Genet. Evol. 7, 535-539.
160
Hotez, P.J., Bottazzi, M.E., Franco-Paredes, C., Ault, S.K., Roses-Periago, M., 2008.
The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: estimated
disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS
Negl. Trop. Dis., 2, e300.
Kawashita, S.Y., Sanson, G.F.O., Fernandes, O., Zingales, B., Briones, M.R.S.,
2001. Maximum-likelihood divergence data estimates based on rRNA gene
sequences suggest two scenarios of Trypanosoma cruzi intraspecific evolution. Mol.
Biol. Evol. 18, 2250-2259.
Lana, M., Pinto, A.S., Barnabé, C., Quesney, V., Noel, S., Tibayrenc, M., 1998.
Trypanosoma cruzi: compared vectorial transmissibility of three major clonal
genotypes by Triatoma infestans. Exp. Parasitol. 89, 1-5.
Lana, M., Pinto, A.S., Bastrenta, B., Barnabé, C., Noel, S., Tibayrenc, M., 2000.
Trypanosoma cruzi: Infectivity of clonal genotypes infections in acute and chronic
phases in mice. Exp. Parasitol. 96, 61-66.
Laurent, J.P., Barnabé, C., Quesney, V., Noel, S., Tibayrenc, M., 1997. Impact of
clonal evolution on the biological diversity of Trypanosoma cruzi. Exp. Parasitol. 114
(Suppl. 3), 213-218.
Leguizamón, M., Campetella, O., González-Cappa, S., Frasch A., 1994. Mice
infected with Trypanosoma cruzi produce antibodies against the enzymatic domain of
trans-sialidase that inhibit its activity, Infect. Immun. 62, 3441-3446.
Lent, H., Wygodzinsky, P., 1979. Revision of the Triatominae (Hemiptera,
Reduviidae), and their significance as vectors of Chagas‟ disease. Bull. Am. Mus.
Nat. Hist., 163, 123-520.
Lisboa, C.V., Pinho, A.P., Monteiro, R.V., Jansen, A.M., 2007. Trypanosoma cruzi
(Kinetoplastida: Trypanosomatidae): biological heterogeneity in the isolates derived
from wild hosts. Exp. Parasitol. 116, 150-155.
161
Llevellyn, M.S., Miles, M.A., Carrasco, H.J., Lewis, M.D., Yeo, M., Vargas, J., Torrico,
F., Diosque, P., Valente, V., Valente, S.A., Gaunt, M.W., 2009. Genome-scale
multilocus microsatellite typing of Trypanosoma cruzi discrete typing unit I reveals
phylogeographic structure and specific genotypes linked to human infection. PLoS
Pathog. 5, e1000410.
Macedo, A.M., Machado, C., Oliveira, R., Pena, S., 2004. Trypanosoma cruzi:
genetic structure of populations and relevance of genetic variability to the
pathogenesis of Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 99, 1-12.
Marcili, A., Lima, L., Valente, V., Valente, S., Batista, J., Junqueira, A.C., Souza, A.I.,
da Rosa, J.A., Campaner, M., Lewis, M.D., Llewellyn, M.S., Miles, M.A., Teixeira,
M.M., 2009a. Comparative phylogeography of Trypanosoma cruzi TCIIc: new hosts,
association with terrestrial ecotopes, and spatial clustering. Infect. Genet. Evol. 9,
1265-1274.
Marcili, A., Valente, V.C., Valente, S.A., Junqueira, A.C.V., Maia-da-Silva, F., Pinto,
A.Y.N., Naiff, R.D., Campaner, M., Coura, J.R., Camargo, E.P., Miles, M.A., Teixeira,
M.M.G., 2009b. Trypanosoma cruzi in Brazilian Amazonia: Lineages TCI and TCIIa in
wild primates, Rhodnius spp. And in humans with Chagas disease associated with
oral transmission. Int. J. Parasitol. 39, 615-623.
Marinho, C.R., Nuñez-Apaza, L.N., Bortoluci, K.R., Bombeiro, A.L., Bucci, D.Z.,
Grisotto, M.G., Sardinha, L.R., Jorquera, C.E., Lira, S., Lima, M.R., Alvarez, J.M.,
2009. Infection by the Sylvio X10/4 clone of Trypanosoma cruzi: relevance of a low-
virulence model of Chagas' disease. Microbes Infect. 11, 1037-1045.
Miles, M.A., Cedillos, R.A., Póvoa, M.M., Souza, A.A., Prata, A., Macedo, V., 1981a.
Do radically dissimilar Trypanosoma strains (zimodemes) cause Venezuelan and
cardiac forms of Chagas‟ disease? Lancet 1, 1338-1340.
Miles, M.A., Póvoa, M.M., Souza, A.A., Lainson, R., Shaw, J.J., Ketteridge, D.S.,
1981b. Chagas‟ disease in the Amazon Basin. II. Distribution of Trypanosoma cruzi
162
zymodemes 1 and 3 in Pará State, north Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 75,
667-674.
Miles, M.A., Souza, A.A., Póvoa, M.M., Shaw, J.J., Lainson, R., Toyé, P.J., 1978.
Isozymic heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first authochtonous patients with
Chagas disease in Amazonian Brazil. Nature 272, 819-821.
Miles, M.A., Toyé, P.J., Oswaldo, S.C., Godfrey, D.C., 1977. The identification by
isoenzyme patterns if two distinct strain-groups of Trypanosoma cruzi, circulating
independently in a rural area of Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 71, 217-225.
Miyamoto, C.T., Gomes, M.L., Marangon, A.V., Araújo, S.M., Bahia, M.T., Lana, M.,
Toledo, M.J.O., 2006. Trypanosoma cruzi: Sensitivity of the polymerase chain
reaction for detecting the parasite in the blood of mice infected with different clonal
genotypes. Exp. Parasitol. 112, 198-201.
Monteiro, W.M., Magalhães, L.K., Medeiros, M.B., Simões, F., Silveira, H., Barbosa,
M.G.V., 2010. Trypanosoma cruzi TcIII/Z3 genotype as agent of an outbreak of
Chagas disease in the Brazilian Western Amazonia. Trop. Med. Int. Health 15, 1049-
1051.
Murta, S.M.F., Gazzinelli, R.T., Brener, Z., Romanha, A.J., 1998. Molecular
characterization of susceptible and naturally resistant strains of Trypanosoma cruzi to
benznidazole and nifurtimox. Mol. Biochem. Parasitol. 93, 203-214.
Neira, I., Ferreira A., Yoshida N., 2002. Activation of distinct signal transduction
pathways in Trypanosoma cruzi isolates with differential capacity to invade host cells.
Int. J. Parasitol. 32, 405-414.
Oliveira, E.C., Stefani, M.M.A., Campos, D.E., Andrade, A.L.S.S., Silva, S.A., Rassi,
A., Luquetti, A.O., 1997. Trypanosoma cruzi stocks isolated from acute Chagas
disease patients lead to lethal murine infection. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91,
25-27.
163
Pedroso, A., Cupolillo, E., Zingales, B., 2007. Trypanosoma cruzi: Exploring the
nuclear genome of zymodeme 3 stocks by chromosome size polymorphism. Exp.
Parasitol. 116, 71-76.
Pena, D.A., Eger, I., Nogueira, L., Heck, N., Menin, Á., Báfica, A., Steindel, M., 2011.
Selection of TcII Trypanosoma cruzi population following macrophage infection. J.
Infect. Dis. 204, 478-486.
Pinto, A.Y.N., Ferreira, A.G., Valente, V.C., Harada, G.S., Valente, S.A.S., 2009.
Urban outbreak of acute Chagas disease in Amazon region of Brazil: four-year
follow-up after treatment with benznidazole. Rev. Panam. Salud Publica 25, 77-83.
Ramírez, J.D., Guhl, F., Rendón, L.M., Rosas, F., Marin-Neto, J.A., Morillo, C.A.,
2010. Chagas Cardiomyopathy Manifestations and Trypanosoma cruzi Genotypes
Circulating in Chronic Chagasic Patients. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e899.
Revollo, S., Oury, B., Laurent, J., Barnabé, C., Quesney, V., Carrière, B., Noël, S.,
Tibayrenc, M., 1998. Trypanosoma cruzi: impact of clonal evolution of the parasite on
its biological and medical properties. Exp. Parasitol. 89, 30-39.
Roellig, D.M., Yabsley, M.J., 2010. Infectivity, pathogenicity, and virulence of
Trypanosoma cruzi isolates from sylvatic animals and vectors, and domestic dogs
from the United States in ICR Strain Mice and SD Strain Rats. Am. J. Trop. Med.
Hyg. 83, 519-522.
Ruiz, R., Favoreto Jr S., Dorta M., Oshiro M., Ferreira A., Manque P., Yoshida N.,
1998. Infectivity of Trypanosoma cruzi strains is associated with differential
expression of surface glycoproteins with differential Ca++ signalling activity. Biochem.
J. 330, 505-511.
Ruiz-Sanchez, R., León, M.P., Matta, V., Reyes, P.A., López, R., David, J., Monteón,
V.M., 2005. Trypanosoma cruzi isolates from Mexican and Guatemalan acute and
chronic chagasic cardiopathy patients belong to Trypanosoma cruzi I. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz 100, 281-283.
164
Sánchez, G., Wallace, A., Olivares, M., Díaz, N., Aguilera, X., Apt, W., Solari, A.,
1990. Biological characterization of Trypanosoma cruzi zymodemes: in vitro
differentiation of epimastigotes and infectivity of culture metacyclic trypomastigotes to
mice. Exp. Parasitol. 71, 125-133.
Souto, R.P., Fernandes, O., Macedo, A.M., Campbell, D.A., Zingales, B., 1996. DNA
markers define two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Mol.
Biochem. Parasitol. 83, 141-152.
Teixeira, A.R.L., Monteiro, O.S., Rebelo, J.M., Argañaraz, E.R., Vieira, D., Lauria-
Pires, L., Nascimento, R., Vexenat, C.A., Silva, A.R., Ault, S.K., Costa, J.M., 2001.
Emerging Chagas disease: trophic network and cycle of transmission of
Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerg. Infec. Dis. 7, 100-112.
Tibayrenc, M., Ward, P., Moya, A., Ayala, F.J., 1986. Natural populations of
Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, have a complex multiclonal
structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1335-1339.
Tibayrenc, M., Ayala, F.J., 1988. Isozyme variability in Trypanosoma cruzi, the agent
of Chagas disease: genetical, taxonomical, and epidemiological significance.
Evolution 42, 277-292.
Toledo, M.J., Bahia, M.T., Carneiro, C.M., Martins-Filho, O.A., Tibayrenc, M.,
Barnabé, C., Tafuri, W.L., Lana, M., 2003. Chemotherapy with benznidazole and
itraconazole for mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal genotypes.
Antimicrob. Agents Chemother. 47, 223-230.
Toledo, M.J., Bahia, M.T., Veloso, V.M., Carneiro, C.M., Machado-Coelho, G.L.,
Alves, C.F., Martins, H.R., Cruz, R.E., Tafuri, W.L., Lana, M., 2004. Effects of specific
treatment on parasitological and histopathological parameters in mice infected with
different Trypanosoma cruzi clonal genotypes. J. Antimicrob. Chemother. 53, 1045-
1053.
165
Toledo, M.J.O., Lana, M., Carneiro, C.M., Bahia, M.T., Machado-Coelho, G.L.,
Veloso, V.M., Barnabé, C., Tibayrenc, M., Tafuri, W.L., 2002. Impact of Trypanosoma
cruzi clonal evolution on its biological properties in mice. Experimental Parasitology
100, 61-172.
Voller, A., Bidwell, D., Bartlet, A., 1980. Enzyme linked immunosorbent assay. In:
Rose, N.R., Friedman, R. (Eds.), Manual of Clinical Immunology. American Society
for Microbiology, USA, pp. 359-371.
Wincker, P., Britto, C., Pereira, J.B., Cardoso, M.A., Oelemann, W., Morel, C.M.,
1994. Use of a simplified polymerase chain reaction procedure to detect
Trypanosoma cruzi in blood samples patients in a rural endemic area. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 71, 771-777.
Valente, S.A.S., Valente, V.C., Pinto, A.Y.N., César, M.J.B., Santos, M.P., Miranda,
C.O.S., Cuervo, P., Fernandes, O., 2009. Analysis of an acute Chagas disease
outbreak in the Brazilian Amazon: human cases, triatomines, reservoir mammals and
parasites. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 103, 291-297.
Xavier, S.S., Souza, A.S., Viñas, P.A., Junqueira, A.C.V., Bóia, M.N., Coura, J.R.,
2006. Cardiopatia chagásica crônica no Rio Negro, Estado do Amazonas. Relato de
três novos casos autóctones, comprovados por exames sorológicos, clínicos,
radiográficos do tórax, eletro e ecocardiográficos. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 39,
211-216.
Yoshida, N., 1983. Surface antigens of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma
cruzi. Infect. Immun. 40, 836-839.
Zingales, B., Andrade, S.G., Briones, M.R.S., Campbell, D.A., Chiari, E., Fernandes
O., Guhl, F., Lages-Silva, E., Macedo, A.M, Machado, C.R., Miles, M.A., Romanha,
A.J., Sturm, N.R., Tibayrenc, M., Schijman, A.G., 2009. A new consensus for
Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision meeting recommends
TcI to TcVI. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 104, 1051-1054.
166
Table 1
Characteristics of Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas, Brazil.
International
nomenclature (a)
Laboratory
code
Municipality of origin Method of
isolation
Host Inoculum DTU
MDID/BR/2007/AM28 AM28 Manaus Hemoculture Didelphis marsupialis 1,0 x 106 (d) TcI
MDID/BR/2007/AM30 AM30 Manaus Xenodiagnosis Didelphis marsupialis 1,0 x 104 (c) TcI
MDID/BR/2007/AM32 AM32 Manaus Hemoculture Didelphis marsupialis 2,8 x 103 (c) TcI
TROB/BR/2007/AM37 AM37 Coari Xenoculture Rhodnius robustus 2,0 x 106 (d) TcI
MPHI/BR/2007/AM38 AM38 Coari Hemoculture Philander opossum 1,0 x 106 (d) TcI
MDID/BR/2007/AM39 AM39 Manaus Hemoculture Didelphis marsupialis 2,8 x 103 (c) TcI
TROB/BR/2007/AM41 AM41 Maraã Xenoculture Rhodnius robustus 1,0 x 106 (d) TcI
MHOM/BR/2008/AM49 AM49 Coari CSF (b) culture Human – acute phase 1,0 x 106 (d) TcI
TROB/BR/2009/AM56 AM56 Apuí Inoculation in mice Rhodnius robustus 2,0 x 106 (d) TcI
TPIS/BR/2009/AM61 AM61 Apuí Inoculation in mice Rhodnius pictipes 1,0 x 106 (d) TcI
MHOM/BR/2007/AM04 AM04 Coari Hemoculture Human – acute phase 1,4 x 103 (c) TcIV
MHOM/BR/2007/AM05 AM05 Coari Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
MHOM/BR/2007/AM08 AM08 Coari Hemoculture Human – acute phase 2,8 x 103 (c) TcIV
MHOM/BR/2007/AM13 AM13 Coari Hemoculture Human – acute phase 2,8 x 103 (c) TcIV
MHOM/BR/2007/AM14 AM14 Coari Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
MHOM/BR/2007/AM15 AM15 Coari Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
167
MHOM/BR/2007/AM18 AM18 Coari Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
TROB/BR/2009/AM57 AM57 Apuí Inoculation in mice Rhodnius robustus 1,0 x 104 (c) TcIV
MHOM/BR/2009/AM62 AM62 Santa Isabel do Rio Negro Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
MHOM/BR/2009/AM64 AM64 Santa Isabel do Rio Negro Hemoculture Human – acute phase 5,0 x 103 (c) TcIV
MHOM/BR/2009/AM67 AM67 Santa Isabel do Rio Negro Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
MHOM/BR/2009/AM68 AM68 Santa Isabel do Rio Negro Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
MHOM/BR/2009/AM69 AM69 Santa Isabel do Rio Negro Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 104 (c) TcIV
MHOM/BR/2009/AM69 AM69 Santa Isabel do Rio Negro Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 106 (d) TcIV
MHOM/BR/2009/AM70 AM70 Coari Hemoculture Human – acute phase 1,0 x 106 (d) TcIV
a Based on Anonymous (1999); b Cerebrospinal fluid; c Number of blood trypomastigotes/animal; d Number of metacyclic trypomastigotes in LIT/
animal.
168
STATE OF AMAZONAS
BRAZILSanta Isabel do Rio Negro
Apuí
Maraã
Coari
TcI
TcIV
Manaus
Fig. 1. Geographic location of the municipalities of origin of the strains belonging to
TcI and TcIV DTUs of Trypanosoma cruzi from the State of Amazonas, Brazil.
169
Table 2
Mean values and standard deviations of biological parameters obtained in Swiss mice for
Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas.
Parameter
DTU
p (b) TcI TcIV
Mean pre-patent period (in days) 12.9 ± 0.7 5.8 ± 2.5 0.000
Mean patent period (in days) 0.4 ± 0.9 3.4 ± 3.1 0.000
Mean daily parasitemia (a) 10.3 ± 33.3 1484.3 ± 2543.8 0.009
Peak of maximum parasitemia (a) 254.5 ± 509 7923.3 ± 11993.5 0.015
Day of maximum parasitemia 15 ± 0.8 7.8 ± 1.2 0.000
Day of maximum mortality 134 ± 47.3 28.9 ± 29.2 0.018
Number of significative differences 6/6
a Number of trypomastigotes/0,1 mL of blood.
b p < 0.05: significative difference.
170
Table 3
Virulence parameters obtained in Swiss mice for Trypanosoma cruzi I and IV from the State
of Amazonas.
Parameter
DTU
p (f) TcI TcIV
Mortality rate in the acute phase (%) (a) 2.4 12.3 0.047
Mortality rate in the chronic phase (%) (b) 9.8 1.2 0.014
Infectivity rate (%) (c) 56.1 75.4 0.014
Mice with positive fresh blood examination (%) 17.1 71.3 0.000
Mice with positive hemoculture (%) 57.1 46.2 N.S.
Mice with positive PCR (%) 54.5 49.4 N.S.
Mice with inflammatory process in any organ (%) 81.3 28.6 0.005
Mice with parasitism in any organ (%) 12.5 0.0 0.027
Susceptibility to benznidazole (%) 75.0 63.0 N.S.
%+ELISA in the acute phase (d) 53.8 82.8 0.022
%+ELISA in the chronic phase (e) 20.0 87.5 0.003
Number of significative differences 8/11
a Cumulative mortality from inoculation until the 90th day after inoculation (d.a.i); b Cumulative
mortality from the 90th until the 180th d.a.i.; c Percentage of animals presenting positive fresh
blood examination within the first two months following inoculation and/or positive
hemoculture and/or PCR on the 55th day; d Percentage of animals presenting positive ELISA
in the 90th day after treatment; e Percentage of animals presenting positive ELISA in the 180th
day after treatment.
f p < 0.05: significative difference; N.S.: not significant.
171
Fig. 2. Parasitemia curves obtained in Swiss mice for Trypanosoma cruzi I and IV from the State
of Amazonas.
172
Log-rank test
p˂0.001
TcIV
TcI
A)
Log-rank test
p=0.001
TcI
TcIV
B)
Fig. 3. Kaplan-Meier survival analysis showing the time (in days) elapsed from the day of
inoculation to the beginning of the patent period (A) and the death episodes (B), obtained
from mice inoculated with Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas.
173
Table 4
Number of mice infected with Trypanosoma cruzi of the DTUs TcI and
TcIV presenting tissue parasitism and inflammatory process in any
organ.
Parameter Intensity DTU
TcI (n = 32) TcIV (n = 7)
Tissue parasitism + 4 0
- 28 7
Inflammatory process +++ 7 0
++ 12 0
+ 7 2
- 6 5
- (absent); + (mild); ++ (moderate); +++ (severe).
174
Table 5
Serological parameters obtained in Swiss mice from enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) for Trypanosoma cruzi I and IV from the State of Amazonas.
Parameter (a) 90th day post treatment 180th day post treatment
nTcI x nTcIV P nTcI x nTcIV p
Concordance (%) 92.3 x 87.5 1.000 100.0 x 91.7 1.000
Sensitivity (%) 87.5 x 82.8 0.518 100.0 x 100.0 1.000
Specificity (%) 100.0 x 63.6 0.245 100.0 x 60.0 0.251
Positive predictive value (%) 100.0 x 92.5 1.000 100.0 x 90.5 1.000
Negative predictive value (%) 83.3 x 63.6 0.600 100.0 x 100.0 1.000
a Obtained using infectivity rate (%INF) as standard.
175
5 DISCUSSÃO
176
5.1 Contribuição para a epidemiologia molecular da doença de Chagas no
Estado do Amazonas
Marcadores genéticos independentes apontam para a divisão de T. cruzi em dois
grupos principais, denominados T. cruzi I e T. cruzi II18, correspondendo,
respectivamente, aos zimodemas Z1 e Z2, definidos em estudos pioneiros baseados
no perfil eletroforético de isoenzimas176. Um terceiro grupo, o zimodema Z3, com
escassos isolados a partir do ciclo silvestre na Região Amazônica, não pôde ser
agrupado em nenhuma das linhagens principais175. A genotipagem multilócus revela
consistentemente seis „unidades de tipagem distintas‟ (DTU), que foram agrupadas
em dois grupos genéticos principais denominados TcI e TcII; TcII apresenta cinco
DTU: TcIIa a TcIIe45. Um consenso recente renomeou estas DTU como TcIV, TcII,
TcIII, TcV e TcVI, respectivamente290. TcII, TcV e TcVI predominam no ciclo de
transmissão doméstico no Cone Sul da América do Sul, onde os pacientes podem
apresentar doença aguda grave com evolução para as formas cardíaca e/ou
digestiva66,85. Na Amazônia Brasileira, Venezuela, Colômbia, América Central e
América do Norte, TcI é a DTU predominante e o principal agente da forma aguda e
cardíaca da doença de Chagas, com raros casos de megassíndromes17,118,172,225,
enquanto TcIII e TcIV provocam casos agudos esporádicos de doença de Chagas
na Amazônia Brasileira173,164,183.
T. cruzi é um táxon complexo com muitos vetores e reservatórios mamíferos,
além de rotas alternativas de infecção. Na Região Amazônica brasileira, onde ainda
não foi relatada a domiciliação de triatomíneos, os casos humanos de doença de
Chagas tem aumentado em paralelo com a migração descontrolada e com o
desmatamento76. Neste trabalho, foi demonstrado que a maioria dos casos humanos
agudos foi proveniente de surtos, como observado anteriormente em outras áreas da
região. Os surtos recentes de doença de Chagas atribuídos à transmissão oral em
áreas não endêmicas da Amazônia indicam que um novo perfil epidemiológico é
emergente no Brasil. Entre os casos estudados por Pinto et al.211, provenientes dos
Estados do Pará, Amapá e Maranhão, 78,5% faziam parte de surtos e 21,5% eram
casos isolados. O expressivo consumo de produtos do agro-extrativismo produzidos
de forma artesanal para a própria subsistência está provavelmente envolvido nos
surtos familiares de doença de Chagas aguda na Amazônia4.
177
Na Amazônia Brasileira, o primeiro surto registrado, que acometeu quatro
indivíduos da mesma família, foi registrado em Belém, no Estado do Pará, em
1969232. Passados 20 anos, em novo surto familiar de doença aguda na Amazônia,
Rodrigues e cols relataram aquele que pode ser considerado o segundo registro de
surto familiar de doença de Chagas aguda na região Amazônica218. A doença foi
descrita em oito pessoas pertencentes a duas famílias originárias de Macapá, no
Amapá. Casos esporádicos ocorridos nesta região, até a década de 1990,
freqüentemente são descritos como doença febril aguda, geralmente em crianças e
quase sempre relacionados à presença de vetores peridomiciliares26,182,235,242. A
partir de meados da década de 1990 o aspecto peculiar de ocorrência simultânea
em três a cinco pessoas, de convivência muito próxima, passou a ser mais
evidente30,182,191,209,210,211,270.
Apesar do amplo reconhecimento de que os surtos de transmissão oral, de
surgimento imprevisível, representem atualmente o perfil de transmissão dominante
na epidemiologia da doença de Chagas, especialmente na Amazônia Brasileira e
nos países do noroeste da América do Sul, pouca atenção tem sido dada à
caracterização genética dos isolados de T. cruzi provenientes dos pacientes
envolvidos. No maior surto de doença de Chagas aguda já registrado, ocorrido na
área urbana de Caracas, na Venezuela, foram acometidos 103 indivíduos. A análise
genética dos genes do miniéxon e do rRNA 24Sα de três isolados do parasito
obtidos de pacientes e de um isolado obtido de um triatomínio capturado no local da
preparação do suco de goiaba incriminado na transmissão, mostrou homogeneidade
genética, com todos os isolados pertencendo ao genótipo TcI, o que é consistente
com uma fonte única de infecção86. No surto de transmissão oral ocorrido em
Mazagão, no Estado do Amapá, no qual 17 indivíduos apresentaram a doença
aguda, a análise do gene do miniéxon para oito isolados humanos revelou que seis
pertenciam ao zimodema Z3 e dois à linhagem TcI, demonstrando a circulação de
pelo menos dois genótipos na localidade270. Contudo, o método de tipagem utilizado
pelos autores não permite a distinção de Z3 em TcIII ou TcIV. No surto registrado no
Estado de Santa Catarina, que totalizou 24 casos agudos, cuja fonte de transmissão
foi o caldo de cana, a caracterização isoenzimática e a análise do rRNA 24Sα
demonstrou que a infecção humana foi causada pela DTU TcII245.
178
Neste trabalho, o polimorfismo do gene do 24Sα rRNA e o sequenciamento do
gene da GPI mostraram a presença das DTU TcI e TcIV no ciclos silvestres da
Amazônia Ocidental brasileira. Demonstrou-se também que estas DTU circulam nas
mesmas áreas e que ambas são capazes de infectar humanos, resultando em
doença aguda. Contudo, foi observado um predomínio inesperado de TcIV entre os
casos humanos. Esta DTU ocorreu em casos isolados e nos surtos registrados em
Coari e em Santa Isabel do Rio Negro, sugerindo sua associação com diferentes
perfis de transmissão. Estudos anteriores demonstraram que os surtos, que
contribuem com a maioria dos casos de doença de Chagas aguda na Região
Amazônica, são dependentes da DTU TcI4,270, mas em nosso trabalho todos os
isolados provenientes de surtos ocorridos em dois municípios distantemente
localizados foram tipados como TcIV, demonstrando a ampla distribuição e o perfil
emergente desta DTU na região do estudo.
Um achado interessante na análise por RFLP do gene da COII foi que todas as
amostras de T. cruzi classificadas como TcIV com base em marcadores genéticos
nucleares apresentaram produtos do gene mitocondrial compatíveis com a terceira
linhagem ancestral principal proposta por Freitas et al.121. Em concordância, as
sequências do gene da COII foram pouco polimórficas e se agruparam todas em
conjunto com as cepas padrão representantes das DTU TcIII, TcIV, TcV e TcVI.
Estes resultados são importantes e confirmam que TcIII e TcIV não são facilmente
distinguidas com o uso de genes mitocondriais, como verificado anteriormente158. A
posição filogenética destas duas DTU, definidas como Z3 na classificação original de
Miles175, ainda permanece em franco debate121,158. Com base em padrões de
diversidade de nucleotídeos em mosaico de nove genes nucleares, Westenberger et
al.277 propuseram que TcIII e TcIV são os produtos de uma hibridização entre as
DTU TcI e TcII. Outros autores argumentam que TcIII e TcIV representam um único
grupo ancestral, já que compartilham um genoma mitocondrial característico121 e
variação do tamanho de cromossomos diferente de TcI e TcII206. Ao contrário destes
pesquisadores que classificaram a terceira linhagem ancestral como TcIII121, nosso
trabalho inclui TcIV neste grupo de cepas com base na análise do gene da COII.
Contudo, este estudo concorda que os genes nucleares apóiam com consistência
que TcIII e TcIV constituem clades geneticamente separadas49,158,223,277. A análise
179
por citometria de fluxo utilizando um painel de cepas representativas revela que os
genomas de TcIII e TcIV são divergentes no seu tamanho absoluto149.
A dinâmica de transmissão das populações de T. cruzi que circulam na Região
Amazônica é muito distinta das áreas endêmicas da América do Sul. Estudos
anteriores mostraram que a maioria dos isolados de humanos, reservatórios e
vetores da Amazônia pertence à DTU TcI, com raros isolados de TcIII e
TcIV17,118,172,225. Não há relatos de TcII, TcV e TcVI nesta região, que são as
predominantes em humanos e vetores domiciliados e peridomésticos no Cone Sul
do Continente, onde TcI ocorre no ciclo silvestre e é somente esporadicamente
encontrado em humanos76,106,173,175,252,270,287. Na Amazônia Ocidental Brasileira
existem poucos estudos a respeito da variabilidade genética do T. cruzi,
especialmente com isolados de humanos. Estes trabalhos demonstraram que a DTU
responsável pelos surtos é TcI, previamente associada com a doença de Chagas
nesta região, correspondendo ao cenário que ocorre nas habitações humanas
contruídas na proximidade da floresta primária270. Fernandes et al.106 e Marcili et
al.163,164 caracterizaram somente quarto estoques de humanos nesta area: em
Barcelos, os autores tiparam dois isolados como TcI e um como TcIV, e no município
de Carauari, verificaram o único estoque de TcIII num paciente desta região. Este
trabalho é o primeiro que foca exclusivamente a epidemiologia molecular da doença
de Chagas nesta area, demonstrando o predomínio de TcIV entre os casos agudos
apesar da confirmação também no Estado do Amazonas da associação bem
estabelecida entre TcI, Rhodnius e marsupiais287.
Existem poucos relatos a respeito dos padrões ecogeográficos e epidemiológicos
da DTU TcIV, prejudicando alguma inferência sobre o modo pelo qual os dois surtos
supramencionados foram desencadeados. Os hospedeiros silvestres desta linhagem
não são conclusivamente conhecidos na Região Amazônica. Apesar dos registros
prévios em Monodelphis, Dasypus, primatas (Aotus sp., Cebus albifrons, Saguinus
fuscicollis, S. labiatus, S. ustus) e Panstrongylus a partir de análises
moleculares161,163,164,287, e mesmo que os isolados humanos tenham sido todos
identificados por robustos marcadores moleculares, somente sete isolados humanos
(incluindo CANIII e JJ) foram confirmados como TcIV antes deste trabalho164. Além
disso, os vetores desta DTU também têm sido pouco caracterizados, exceto R.
180
brethesi, que é restrito ao norte da Amazônia106,163,164,171,206, e R. robustus, uma
espécie amplamente distribuída164.
Esta investigação corrobora que R. robustus (mas não R. pictipes) pode ser
encontrado naturalmente infectado por TcIV e circula num ciclo de transmissão
arbóreo em simpatria com TcI, ao contrário dos ecótopos terrestres usualmente
atribuídos a TcIII164. TcIV não foi encontrada em didelfídeos neste estudo,
concordando com outros autores163,164. Existem evidências que TcIV da América do
Sul e TcIV da América do Norte correspondem a linhagens genéticas independentes
que circulam em hospedeiros e nichos ecológicos distintos. Nos Estados Unidos,
esta DTU é comumente registrada em nichos terrestres e nos ambientes domiciliares
e peridomiciliares, em guaxinins e cães29,219. Observou-se neste trabalho esta DTU
em distintas áreas do Estado do Amazonas, estendendo a amplitude conhecida de
sua distribuição na vasta bacia amazônica. Os dados limitados sobre as DTU de T.
cruzi em triatomíneos e reservatórios silvestres na Amazônia são insuficientes para
descartar outros vetores e mamíferos arbóreos e mesmo terrestres, do ciclo de
transmissão de TcIV.
Especula-se que a baixa parasitemia e morbidade da doença de Chagas crônica
no Estado do Amazonas, apesar da elevada soroprevalência em algumas
regiões50,76, contrastando com as manifestações clínicas exuberantes na fase aguda
da doença169,209,210,211,270, deve-se ao tipo de parasito circulante nesta área. O
conhecimento sobre as propriedades biológicas da DTU TcIV, que possivelmente
desempenham importante papel na patogênese da doença de Chagas e na resposta
terapêutica à quimioterapia específica na Região Amazônica, representa um desafio
para futuras investigações.
Nossos resultados preliminares indicam que os isolados amazônicos de T. cruzi
promovem escassa parasitemia e baixa virulência e patogenicidade em
camundongos184,215. Pelo menos no Brasil, TcII e raramente TcI, parecem ser
exclusivamente responsáveis pelas lesões teciduais na forma crônica da doença de
Chagas66,152,172,254. Contudo, a doença de Chagas crônica (forma mista cardíaco-
digestiva) já foi relatada para isolados de Z3 que agruparam com CANIII (cepa TcIV
de referência) na análise isoenzimática125, o que ressalta a necessidade da
181
caracterização do perfil clínico e epidemiológico associado com as diferentes DTU.
Estudos prospectivos envolvendo os casos humanos agudos causados por TcIV
com a finalidade de esclarecer o potencial deste genótipo de provocar
manifestações crônicas e para a avaliação da eficácia terapêutica são urgentes.
Registrou-se a ocorrência de TcI nos marsupiais sinantrópicos Didelphis
marsupialis e Philander opossum e nos triatomíneos R. pictipes e R. robustus,
confirmando a forte associação destes reservatórios com os ciclos de transmissão
de TcI na Região Amazônica163,164,287. Esta DTU, que se distribui amplamente por
toda a América do Sul até os sul dos Estados Unidos, predominam ao norte da Bacia
Amazônica onde triatomínios silvestres ou domiciliados asseguram a transmissão da
doença de Chagas na Amazônia Brasileira, Venezuela, Colômbia, América Central e
México, causando as formas aguda e cardíaca nestas áreas17,172,225. Observou-se
ainda neste estudo que TcI não ocorreu nos surtos, mas apenas entre os casos
isolados. Possivelmente, espécies de Rhodnius infectados por TcI, que
frequentemente realizam vôos dispersivos no intradomicílio em busca de fontes
alimentares76,252, representam a principal fonte para os casos isolados de doença de
Chagas.
O isolamento de estoques de T. cruzi com sequencias genéticas idênticas em
vastas distâncias geográficas é uma forte evidência para a propagação clonal, uma
hipótese proposta para o T. cruzi259. Isto sugere, por outro lado, uma fonte única de
infecção no surto ocorrido no município de Coari. Contudo, no surto de Santa Isabel
do Rio Negro, foram detectados três haplótipos com base no sequenciamento do
gene da COII e, interessantemente, três pacientes apresentaram dois haplótipos
simultaneamente. Nosso grupo verificou diferenças significantes entre os isolados
dos dois surtos com respeito aos parâmetros parasitológicos em camundongos,
sugerindo maior virulência para os isolados de Santa Isabel do Rio Negro215. Este
resultado sugere a superinfecção a partir de fontes distintas ou a transmissão
simultânea de populações multiclonais por um único triatomínio. Em ambos os
casos, a multiplicidade clonal da infecção está provavelmente relacionada com a
intensidade e eficiência da transmissão151.
182
A infecção multiclonal também foi observada em um triatomíneo coletado em
Apuí, com base no polimorfismo das sequências do gene da GPI. Os hospedeiros e
vetores de T. cruzi têm sido ocasionalmente observados com infecções mistas por
diferentes DTU3,37,51,133,244,288. Informações preliminares ainda demonstraram que
múltiplas variantes de uma mesma DTU também podem estar presentes num
mesmo hospedeiro ou vetor151,157,288. Acreditamos que este estudo demonstra pela
primeira vez a infecção multiclonal em pacientes de um mesmo surto de transmissão
oral.
Provavelmente, a multiclonalidade verificada neste trabalho está subestimada por
duas razões. Primeiro, os métodos de isolamento parasitário e manutenção em
cultura podem ter levado à seleção de clones, como pode ser previsto com base nos
resultados de experimentos pioneiros115. Os clones que sobrevivem nas culturas
representariam um subgrupo dos clones presentes no vetor ou reservatório, gerando
um viés de cultura151, agravado em amostras originadas de mamíferos pela baixa
parasitemia promovida pelas DTU da Amazônia Brasileira185,215. Outra limitação
desta investigação é o método empregado na detecção dos haplótipos. A análise por
microssatélites é recomendada e tem evidenciado melhor as infecções multiclonais.
Mesmo que a recombinação genética seja conhecida em T. cruzi in vitro127 e em
reservatórios158,195, há evidências de que este mecanismo não represente uma fonte
relevante de multiclonalidade, de acordo com investigações conduzidas por
Llewellyn et al.151. Estes autores propuseram que a elevada diversidade genética é
consistente com a transmissão em massa de populações do parasito do vetor para o
hospedeiro. Dessa forma, o aumento relativo da transmissão oral na população
humana4,73,76,91 poderia ter papel na manutenção do nível diversidade e
multiclonalidade observada nos casos humanos. Ainda precisa ser esclarecido se as
distintas formas clínicas da doença de Chagas podem estar associadas com DTU e
clones específicos do T. cruzi, com as rotas de transmissão ou com a genética do
hospedeiro. O T. cruzi é capaz de infectar numerosos tipos de células, mas há pouca
evidência sobre o tropismo diferencial que as diferentes DTU apresentam num
mesmo hospedeiro51,268.
A area geográfica a partir da qual foram provenientes os estoques de T. cruzi,
apesar de vasta, é uma fração da enorme Região Amazônica com sua elevada
183
biodiversidade e, por isso mesmo, muito provavelmente a diversidade genética do
parasito deve ser muito mais complexa. Na Bacia Amazônica, a expansão das
populações humanas em ciclos naturais de transmissão pode contribuir para a
transmissão da doença de Chagas pela introdução acidental de vetores silvestres
infectados por TcI e TcIV na cadeia alimentar humana ou pelo contato direto destes
vetores com os seres humanos em decorrência de mudanças ambientais.
5.2 Propriedades biológicas dos isolados de T. cruzi do Estado do Amazonas
A grande divergência genética entre as linhagens de T. cruzi é refletida nas suas
propriedades biológicas e, consequentemente, em muitos aspectos clínicos,
patológicos e epidemiológicos da doença de Chagas. Em países do cone sul da
América do Sul (Argentina, Brasil, Bolívia, Chile, Paraguai e Uruguai), onde a doença
de Chagas se apresenta com formas crônicas mais graves, TcI é associada ao ciclo
silvestre, infectando principalmente mamíferos arbóreos, enquanto TcII predomina
nos ciclos domésticos, infectando o homem e outros mamíferos terrestres66,85,95.
Evidências epidemiológicas e genotipagem de parasitos diretamente de tecidos
humanos infectados têm demonstrado que as linhagens TcII, TcV e TcVI são os
agentes causais responsáveis pela doença de Chagas nestes países. Na Amazônia
Ocidental Brasileira, onde a doença de Chagas tem um perfil de menor morbidade e
mortalidade que nas áreas endêmicas clássicas, predominando a forma crônica
latente, existem poucos dados sobre os aspectos biológicos dos estoques de T. cruzi
circulantes50,72.
Neste trabalho, foi observado um grande desvio padrão para os parâmetros
biológicos estudados, especialmente para o PP, PDM, Pmax e o dia médio da morte
dos animais, mostrando que estoques da mesma DTU não são homogêneos nas
suas características. Este resultado concorda com informações anteriores obtidas a
com as linhagens principais T. cruzi I e T. cruzi II18 por diversos autores100,143,216,262,
que encontraram que estes genótipos variam muito nas suas propriedades
biológicas. Acreditamos que a variabilidade genetic intra-linhagem pode ajudar a
explicar este quadro. Na Colômbia, por exemplo, a DTU TcI demonstrou uma
considerável heterogeneidade na região intergênica do gene do miniéxon, suficiente
para classificar as cepas em quatro haplótipos, associados com diferentes ciclos de
184
transmissão102,132. A análise por microssatélites de populações silvestres de TcI de
diversas localidades do Continente Americano confirmou a elevada diversidade
genética desta DTU150. Da mesma forma, os polimorfismos do gene do rRNA, os
padrões de RAPD e o sequenciamento dos genes da COII164 e da GPI (conforme
nossos resultados) evidenciaram polimorfismo genético intra-linhagem entre isolados
amazônicos da DTU TcIV.
A comparação estatística mostrou que 14 dos 17 parâmetos estudados
demonstraram diferenças significativas entre TcI e TcIV. TcIV demonstrou valores
mais elevados de PP, PDM, Pmax, %MOR na fase aguda, %INF, %ESF+ e
%ELISA+ nas fases aguda e crônica que TcI. Por outro lado, TcI demonstrou valores
maiores para PPP, DPmax, %MOR na fase crônica, dia médio da morte dos animais,
frequência de camundongos com processo inflamatório e freqüência de
camundongos com parasitismo tecidual que TcIV. Exceções foram observadas para
os parâmetros obtidos a partir de métodos de amplificação parasitária (%HC+ e
%PCR+) e suscetibilidade in vivo ao benzonidazol, para os quais não foram
verificados resultados com diferenças significativas.
A teoria clonal assume que a divergência evolucionária acumulada entre as
diferentes linhagens possivelmente envolve gene responsáveis por importantes
propriedades relacionadas com a virulência, patogenicidade e apresentação clínica
da doença de Chagas255,259. Diversos estudos apóiam esta hipótese e demonstram
uma forte associação entre a distância genética e as propriedades biológicas e
médicas do parasito. Esta relação foi demonstrada em estudos sobre o
comportamento do T. cruzi em culturas celulares e acelulares99,143,216,227, virulência e
patogenicidade em camundongos12,15,60,142143,227,262, desenvolvimento nos
triatomíneos123,124,141 e resposta à quimioterpia específica14,216,260,261.
Os estudos supramencionados trouxeram importantes contribuições, porém
nenhum deles explorou o comportamento biológico de cepas representativas das
DTU circulantes na Amazônia Brasileira, onde a doença de Chagas apresenta perfil
emergente, sendo responsável pela grande maioria dos casos agudos notificados no
país nos últimos anos177. Pelo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a
respeito das propriedades e médicas da DTU TcIV da América do Sul. TcIV mostrou
185
maior virulência em comparação com DTU TcI, conforme demonstrado pelos
maiores valores dos parâmetros de parasitemia (PDM, Pmax, %+FBE+), maior PP e
menor PPP. Além disso, TcIV apresentou maior infecciosidade para camundongos e
promoveu mortalidade mais elevada na fase aguda. A análise de sobrevida
evidenciou que houve diferença no tempo decorrido do dia da inoculação até o início
do período patente e até o dia da ocorrência das mortes, confirmando os resultados
obtidos pelo teste de T-Student e reforçando a diferença no comportamento entre as
DTU.
Não há informação na literatura sobre a virulência de TcIV, porém considerando-
se que esta DTU é genticamente mais relacionada com T. cruzi II do que com T.
cruzi I18,45, nossos resultados concordam com outros autores. As cepas de T. cruzi II
infectam células de humanos e de macacos quatro vezes mais que T. cruzi I,
havendo uma correlação entre as diferenças na infecciosidade com o perfil de
glicoproteínas de superfície do parasito e suas diferentes capacidades para
promover eventos de sinalização intracelular envolvidos no processo de
invasão190,224. Os experimentos utilizando o modelo camundongo demonstram
resultados no mesmo sentido: enquanto tripomastigotas metacíclicas das DTU TcII e
TcVI (cepas Y e CL) foram altamente infecciosas, o mesmo inóculo de TcI (cepa G)
não rendeu parasitemias patentes289. A análise biológica revelou que as cepas de
TcII apresentam-se com maior infecciosidade e capacidade de multiplicação em
macrófagos em comparação com TcI207.
Porém, deve ser mencionado que existem diversos estudos demonstrando
resultados contraditórios. Revollo et al.216, por exemplo, mostraram que TcI
apresentou taxas de infecção para células Vero maiores TcII. Em estudos anteriores
com camundongos usando cepas do Brasil, a partir de ambientes silvestres e
domiciliares, verificou-se que isolados de marsupiais (hospedeiros associados com
TcI) foram geralmente mais infecciosos e que a parasitemia foi maior que a
determinada por isolados de vetores e outras espécies de mamíferos31,148. Alguns
trabalhos demonstraram que TcI apresenta uma maior capacidade de infectar e
completer seu ciclo de vida no inseto vetor123,124,141, de se diferenciar em
tripomastigotas sanguíneas e de multiplicação intracelular no hospedeiro
vertebrado, levando a maiores parasitemias em comparação com
186
TcII12,130,148,180,227,262. Estas discrepâncias podem ser atribuídas às diferentes cepas
selecionadas, à variação dos modelos experimentais, à diversidade biológica intra-
linhagem e à resposta imune dos hospediros infectados, que podem desempenhar
um importante papel no curso da infecção96,216,262.
Num estudo conduzido com isolados de TcI e TcIV dos Estados Unidos, as duas
DTU determinaram diferentes dinâmicas de infecção em camundongos e ratos
conforme resultados obtidos pela detecção do DNA do T. cruzi por PCR no sangue
nos tecidos220. Estes autores encontraram maior infecciosidade nos camundongos
inoculados com TcI, contradizendo nossos resultados utilizando isolados da
Amazônia Brasileira pertencentes às mesmas DTU. Apesar de serem intistinguíveis
por métodos de genotipagem tradicionais e geralmente classificados como Z3,
existem evidências que os isolados de TcIV da América do Norte e da América do
Sul correspondem a linhagens independentes usando sequências dos genes da
COII e do rRNA163. Novamente, as diferenças genéticas podem ajudar a explicar as
diferenças no comportamento biológico entre isolados de uma mesma DTU nos
modelos experimentais da doença de Chagas. A investigação de estoques
adicionais a partir de diferentes origens geográficas é necessária para confirmar se
características regionais e a variabilidade intra-linhagem pode explicar estas
discrepâncias.
A análise histopatológica revelou em geral a presença de poucos ninhos de
amastigotas e um processo inflamatório discreto. TcI desencadeou processo
inflamatório em músculo esquelético, músculo cardíaco e cérebro, enquanto TcIV
promoveu processo inflamatório leve unicamente em músculo esquelético. O
parasitismo foi observado em apenas quarto camundongos examinados, todos
infectados por duas cepas TcI (AM49 e AM61). Além disso, inflamação intensa foi
detectada apenas em músculo esquelético de camundongos infectados por TcI.
Nenhuma alteração patológica foi observada no intestine grosso, fígado ou baço.
Assim, apesar dos menores valores de parasitemia, TcI determinou processo
inflamatório mais intenso e maior freqüência de parasitismo tecidual que TcIV. Na
Amazônia Brasileira TcI é a DTU predominante e a principal causa da forma
cardíaca da doença de Chagas4,172, confirmando os achados histopatológicos deste
trabalho. A patofisiologia da doença de Chagas tem sido amplamente estudada
187
utilizando o modelo murino com cepas virulentas que representam apenas
parcialmente a diversidade parasitária. Estudos com o clone Sylvio X10/4
demonstram que este clone não induz fase aguda, mas leva à miocardite crônica em
camundongos, reproduzindo a doença humana166. Leguizamón et al.145 relataram
que a administração de 50 tripomastigotas sanguíneas do clone RA (TcII) é mais
letal para camundongos que a inoculação de 5 x 104 tripomastigotas sanguíneas do
clone K98 (TcI), sendo que este último inóculo leva ao estabelecimento da forma
crônica da doença.
O presente estudo com estoques do Estado do Amazonas mostrou diversos
isolados de TcI com parasitemia subpatente, período pré-patente muito longo,
paríodo patente curto e baixa freqüência e intensidade das alterções
histopatológicas. Mesmo que os estoques de TcIV tenham demonstrado maior
virulência que TcI, sua patogenicidade também foi incipiente. Estes dados em
conjunto enfatizam que as propriedades biológicas e médicas dos estoques desta
área devem ser consideradas em pesquisas sobre o quadro clínico e epidemiológico
da doença de Chagas no contexto amazônico. Este perfil concorda com a hipótese
de autores que sugeriram que a infecção crônica latente e o baixo desempenho dos
testes diagnósticos no Estado do Amazonas são devidos à baixa parasitemia,
virulência e patogenicidade dos parasitos silvestres circulantes nesta área50,72. Em
contraste, estoques de T. cruzi das areas endêmicas clássicas da América do Sul
infectam prontamente uma ampla variedade de animais de laboratório causando
significativa morbididade e mortalidade12,87,148,262.
Apesar do relato de que a maioria dos estoques caracterizados não foram
virulentos e não causaram morbidade e mortalidade no modelo utilizado, verificou-se
um interessante resultado para o experimento com o estoque AM49. Esta cepa foi
isolada do líquor de uma criança diagnosticada inicialmente com abscesso de pele e
que evoluiu com desfecho fatal em decorrência de doença de Chagas aguda. O
grupo de camundongos infectado com este estoque demonstrou baixa mortalidade e
parasitemia, apesar da infectividade e freqüência de sinais cínicos indicatvos da
doença de Chagas aguda, como letargia e paralisia dos membros. As alterações
histopatológicas provocadas por este estoque incluiu intenso processo inflamatório
do músculo esquelético, inflamação moderada e parasitismo do músculo cardíaco e
188
inflamação e gliose no tecido cerebral. Estes achados indicam que este estoque
pertence ao biodema III, com um peculiar comportamento neurotrópico.
O desempenho das diferentes técnicas diagnósticas é um tema controverso na
Região Amazônica. No Estado do Pará e na Venezuela, os testes empregados para
o diagnóstico da fase aguda demonstraram menor sensibilidade203,211. Chama
atenção a considerável proporção de indivíduos com parasitemia evidente em
sangue periférico, porém com resultados negativos de xenodiagnóstico ou
hemocultura, na Amazônia Brasileira74,76,182,211. Brum-Soares et al.50, no Amazonas,
verificaram um baixo desempenho da hemocultura, do xenodiagnóstico e da PCR na
fase crônica da doença, em relação aos valores encontrados por outros autores em
áreas endêmicas das regiões Sudeste e Nordeste. Estes autores verificaram ainda
que os indivíduos chagásicos da região estudada apresentam baixos níveis séricos
de IgG anti-T. cruzi, decorrente provavelmente da baixa carga parasitária com baixo
potencial antigênico do parasito circulante. Com base em infecções experimentais,
admite-se que o genótipo do parasito influencia na resposta imune do hospedeiro,
determinando os níveis e a composição de subclasses de IgG específicas, o que
poderia se traduzir inclusive em diferenças na sensibilidade dos ensaios sorológicos
utilizados no diagnóstico da doença de Chagas229.
As observações biológicas preliminaries obtidas de infecções experimentais por
TcI mostraram um comportamento peculiar, levando à sua classificação no biodema
III. Este biodema consiste de cepas com predominância de formas largas com
multiplicação lenta, determinando picos tardios de parasitemia entre os dias 20 e 30
dias após a infecção e intensas lesões miocárdicas e esqueléticas12,15, em
concordância com nossos resultados. Os casos da forma crônica cardíaca da
doença de Chagas na Amazônia Ocidental Brasileira confirmam que os parasitos
circulantes nesta área causam miocardiopatia, clinicamente diagnosticada como
insuficiência cardíaca, síndrome arritmogênica ou tromboembolismo5,109,110,111,112,286.
A ausência de alterações histopatológicas no intestino grosso sugere que os
parasitos estudados não apresentam a capacidade de causar a forma digestiva da
doença de Chagas, concordando com escassez de registros de megassíndromes
nos países amazônicos e nas Américas Central e do Norte172. No entanto, a
189
patogenicidade da DTU TcIV deve ser interpretada com cuidado, já que existem
casos documentados de doença de Chagas crônica causada por infecções mistas
TcI/TcIV na Colômbia213, e dois casos de doença crônica com envolvimento
cardiodigestório associado com Z3 que se agruparam com CANIII (protótipo da DTU
TcIV) na análise isoenzimática, no Equador125.
As frequências da suscetibilidade ao benzonidazol não diferiram de froma
significativa entre TcI e TcIV. Contudo, o caráter de resistência à esta droga foi
verificado somente entre cepas de TcIV (AM14, AM18 e AM57). Estudos anteriores
in vitro28,216 e in vivo14,260,261 demonstraram que clones pertencentes à linhagem T.
cruzi I são mais resistentes ao benzonidazol e o nifurtimox que os pertencentes à
linhagem T. cruzi II. De fato, como observado no Brasil Central, os pacientes
infectados por T. cruzi I demonstraram maior resistência à quimioterapia com
benzonidazol quando comparados com aqueles infectados com T. cruzi II16. Murta et
al.186 relataram maior eficiência do tratamento com benzonidazol e nifurtimox nas
áreas onde predomina o TcVI, que possui perfil híbrido.
As informações sobre a eficácia do tratamento da doença de Chagas com
benzonidazol na Região Amazônica são insipientes. Acompanhando por quatro anos
11 casos de doença de Chagas pertencentes a um surto de transmissão oral
ocorrido na zona urbana de Belém, Pará, Pinto et al.208 verificaram que todos os
pacientes apresentaram exames parasitológicos negativos e diminuição dos títulos
de anticorpos IgG anti-T. cruzi em relação ao início do tratamento. Apesar de três
pacientes apresentarem anormalidades no ecocardiograma consistentes com
doença de Chagas crônica e com seqüelas da doença aguda ao final do
acompanhamento, os autores consideraram a resposta terapêutica satisfatória. Num
outro surto de transmissão oral ocorrido em Mazagão, Amapá, os 26 pacientes
acometidos pela infecção aguda foram tratados com benzonidazol, resultando numa
progressiva diminuição da parasitemia e dos títulos de anticorpos IgG anti-T. cruzi,
que se negativaram ao final de sete anos de seguimento270. Estes estudos em
localidades de predomínio de TcI reforçam que os isolados pertencentes a esta DTU
circulantes na Amazônia Brasileira possuem um comportamento diferente quando
compararados com isolados de outras áreas. A resistência natural de cepas de TcIV
190
merece atenção, já que esta DTU está envolvida com surtos de doença de Chagas
aguda no Estado do Amazonas, conforme demonstrado anteriormente.
Os menores PP e %INF durante a infecção sugere uma maior suscetibilidade à
resposta imune do hospedeiro para TcI. Contudo, %ELISA+ foi significativamente
menor em camundongos infectados por esta DTU tanto na fase aguda como na fase
crônica da infecção. Este resultado indica que a resposta imune humoral
desempenha importante papel protetor na infecção recente por TcI, suficiente para
controlar a parasitemia sanguínea mas não o parasitismo tecidual e as lesões
inflamatórias, muito possivelmente devido ao tropismo diferencial para os tecidos e
aos mecanismos de evasão imune por alguns clones10. No curso da infecção por TcI
os níveis de anticorpos decaem, o que não ocorre na infecção por TcIV, que
continua estimulando a resposta humoral com sua parasitemia maior e mais
persistente. Notou-se que os parâmetros sorológicos de concordância, sensibilidade,
especificidade e valores preditivos, calculados usando a %INF como referência,
apresentaram valores satisfatórios. Estes resultados evidenciam a importância da
pesquisa de anticorpos específicos anti-T. cruzi como marcadores de infecção por
cepas da Amazônia em camundongos, independente da DTU.
5.4 Perspectivas futuras
A situação epidemiológica da doença de Chagas na Amazônia vem sendo
substancialmente alterada, em função de mudanças resultantes de transformações
ambientais e de ordem econômica e social. Nesse sentido, os parasitos que
circulavam estritamente no ciclo silvestre podem, seja através da transmissão
vetorial ou oral, levar à infecção humana. No andamento deste projeto evidenciou-se
completa ausência ou informações não conclusivas sobre os seguintes temas, que
merecem ser investigados futuramente:
1) A dinâmica e as peculiaridades no ciclo de transmissão de estoques silvestres de
T. cruzi, com especial atenção para os mecanismos pelos quais as populações
humanas são envolvidas neste ciclo, especialmente das DTU TcI e TcIV, cuja
importância na etiologia da doença de Chagas vem sendo reforçada, como
191
demonstrado neste trabalho, especialmente pelo aumento na sua freqüência relativa
após o controle vetorial nas antigas áreas endêmicas, onde predominava TcII.
2) O potencial da DTU TcIV na determinação da doença crônica humana. Esta
questão pode ser resolvida utilizando metodologia prospectiva, acompanhando os
casos agudos com isolados caracterizados geneticamente, e pela busca ativa de
casos crônicos na Região Amazônica, dos quais poderia ser realizada a
genotipagem após isolamento do parasito ou diretamente do sangue.
3) A característica dos estoques desencadeadores dos novos surtos de transmissão
oral deve ser investigada, afim de se estabelecer se são de fonte única e se suas
populações são de natureza policlonal. A caracterização por microssatélites
certamente acrescentaria valiosa informação no estudo dos isolados dos surtos que
ocorrem na Amazônia.
4) O estudo da resposta imunológica desencadeada por estoques de T. cruzi
isolados na Região Amazônica, em animais experimentalmente infectados, durante
as fases aguda e crônica, pela avaliação da cinética da produção das
imunoglobulinas, de suas subclasses e de anticorpos líticos, da resposta proliferativa
das células mononucleares do sangue periférico e da produção de citocinas (IL-10,
TNF, INF-gama) no soro e tecidos (in situ).
5) A aplicação de técnicas mais sensíveis que o exame histopatológico
convencional, como a imuno-histoquímica e a PCR de tecidos dos animais
infectados experimentalmente, que permitirá conclusões mais confiáveis sobre a
patogenicidade do T. cruzi circulante na Amazônia.
6) O estudo da evolução da infecção após a infecção experimental pelo T. cruzi
inoculado por via oral, principal mecanismo registrado na Região Amazônica.
7) A caracterização de um maior número de isolados da Amazônia e o emprego de
marcadores moleculares mais polimórficos e representativos do genoma de T. cruzi,
que adicionarão robustez nos estudos sobre a relação entre a genética e a biologia
do parasito.
192
8) A investigação da resposta terapêutica dos pacientes autóctones da Amazônia
frente ao tratamento com benzonidazol, que possibilitará grande avanço em relação
ao estudo da quimioterapia experimental em camundongos.
9) A avaliação do desempenho dos testes diagnósticos empregados no diagnóstico
da infecção chagásica, incluindo a investigação de espécies de triatomíneos que
possam ser utilizadas no xenodiagnóstico, o desenvolvimento de metodologias
moleculares que aumentem a sensibilidade e, especialmente, a verificação da
acurácia dos testes sorológicos empregados no diagnóstico da fase crônica e nos
serviços de vigilância transfusional, na Região Amazônica.
10) A verificação da suscetibilidade dos estoques de T. cruzi isolados na Amazônia
frente a outras drogas que demonstraram atividade contra o parasito em estudos
prévios, como os inibidores da síntese de esteróis, ligantes de DNA, inibidores da via
da tripanotiona, inibidores da cruzipaína, entre outros.
193
6 CONCLUSÕES
194
1) Demonstrou-se a presença das DTU TcI e TcIV no ciclo de transmissão silvestre
do T. cruzi na Amazônia Ocidental Brasileira. TcI e TcIV circulam em simpatria em
ciclos arbóreos que se sobrepõe nos mesmos tipos de ecótopos, com a participação
de R. robustus como vetor.
2) As DTU TcI e TcIV são capazes de infectar humanos, respondendo pelos casos
de doença de Chagas no Estado do Amazonas. Não houve relatos de TcII, TcV e
TcVI neste estado, que são as DTU predominantes em humanos e vetores
domiciliados e peridomésticos no Cone Sul do Continente.
3) Observou-se um predomínio de TcIV entre os casos humanos. Esta DTU ocorreu
em casos isolados e nos surtos, sugerindo sua associação com diferentes perfis de
transmissão. A ocorrência de TcIV em surtos contraria estudos anteriores que
afirmam que os surtos são dependentes de TcI.
4) Todos os estoques de T. cruzi classificados como TcIV com base em marcadores
genéticos nucleares apresentaram produtos do gene mitocondrial compatíveis com a
terceira linhagem ancestral principal proposta por Freitas et al.121. Houve casos de
partilha de haplótipos idênticos ou muito similares, com base no gene da COII, entre
os estoques de TcIV do Estado do Amazonas e as linhagens de outras DTU (TcIII,
TcV ou TcVI), para as quais as seqüências nucleares (GPI e rDNA) foram altamente
divergentes.
5) Registrou-se a ocorrência de TcI nos marsupiais sinantrópicos Didelphis
marsupialis e Philander opossum e nos triatomíneos R. pictipes e R. robustus,
confirmando a forte associação destes vetores e reservatórios com os ciclos de
transmissão de TcI na Região Amazônica.
6) O isolamento de estoques de T. cruzi com sequencias genéticas idênticas em
vastas distâncias geográficas é uma forte evidência para a propagação clonal.
7) Foram identificadas superinfecções em três pacientes do surto de Santa Isabel do
Rio Negro, demonstrando pela primeira vez a infecção multiclonal em pacientes de
um mesmo surto de transmissão oral. O aumento relativo da transmissão oral na
195
população humana pode ter papel na manutenção do nível diversidade e na
multiclonalidade observada nos casos humanos.
8) Os isolados de T. cruzi do Estado do Amazonas apresentaram comportamento
variável nas infecções experimentais, porém geralmente promoveram escassa
parasitemia e baixa virulência e patogenicidade em camundongos, concordando
com o perfil de baixa parasitemia e morbidade da doença de Chagas e com o baixo
desempenho dos métodos diagnósticos, neste estado.
9) Dos 17 parâmetros, 14 mostraram diferenças significativas entre as DTU. TcIV
mostrou maiores valores de PP, PDM, Pmax, %MOR na fase aguda, %INF, %ESF+,
%ELISA+ nas fases aguda e crônica que TcI. Por outro lado, TcI mostrou maiores
valores de PPP, DPmax, %MOR na fase crônica, DMM e frequência de alterações
patológicas que TcIV. Assim, TcI e TcIV apresentaram comportamento divergente
em relação às propriedades biológicas e médicas em camundongos.
10) As observações biológicas preliminares obtidas de infecções experimentais por
TcI mostraram um comportamento miotrópico peculiar, levando à sua classificação
no biodema III. Não se verificam alterações histopatológicas no intestino grosso dos
camundongos, concordando com falta de registros de megassíndromes na Região
Amazônica.
11) As frequências da suscetibilidade ao benzonidazol não diferiram de froma
significativa entre TcI e TcIV. Contudo, o caráter de resistência à esta droga foi
verificado somente entre cepas de TcIV (AM14, AM18 e AM57).
12) Os resultados apoiam fortemente a hipótese de que diferenças biológicas são
proporcionais à divergência evolutiva entre as DTU e destacam a necessidade de
levar em conta a diversidade filogenética dos estoques naturais de T. cruzi
circulantes nas áreas emergentes para a doença de Chagas, nos estudos sobre a
diversidade clínica da doença, imunologia, diagnóstico, prognóstico e
desenvolvimento de drogas e vacinas.
196
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
197
1. Abad-Franch F, Monteiro FA. Biogeography and evolution of Amazonian triatomines (Heteroptera: Reduviidae): implications for Chagas disease surveillance in humid forest ecoregions. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102: 57-70. 2. Abad-Franch F, Salvattela R, Bazzani R. Memorias de la 2o Reunión de la Iniciativa Intergubernamental de Vigilancia y Prevención de la Enfermedad de Chagas em la Amazonia. Montevideo: IDRC-OPAS-FIOCRUZ; 2006. 3. Abolis NG, Araújo SM, Toledo MJO, Fernandez MA, Gomes ML. Trypanosoma cruzi I-III in southern Brazil causing individual and mixed infections in humans, sylvatic reservoirs and triatomines. Acta Trop 2011; 120: 167-72.
4. Aguilar HM, Abad-Franch F, Dias JCP, Junqueira ACV, Coura JR. Chagas disease in the Amazon Region. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102: 47-55. 5. Albajar PV, Laredo SV, Terrazas MB, Coura JR. Miocardiopatia dilatada em pacientes com infecção chagásica crônica. Relato de dois casos fatais autóctones do Rio Negro, Estado do Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 2003; 36: 401-7. 6. Amato-Neto V, Shikanai-Yasuda MA, Amato WS. Doença de Chagas aguda. In: Dias JCP, Coura JR, editores. Clínica e Terapêutica da Doença de Chagas. Uma abordagem prática para o clínico geral. Rio de Janeiro: Editora da Fundação Oswaldo Cruz; 1997. p. 323-52. 7. Andrade AL, Martelli CM, Oliveira RM, Silva SA, Aires AI, Soussumi LM, Covas DT, Silva LS, Andrade JG, Travassos LR, Almeida IC. Short report: benznidazole efficacy among Trypanosoma cruzi-infected adolescents after a six-year follow-up. Am J Trop Med Hyg 2004; 71: 594-7. 8. Andrade AL, Zicker F, Oliveira RM, Almeida-Silva S, Luquetti A, Travassos LR, Almeida IC, Andrade SS, Andrade JG, Martelli CM. Randomized trial of efficacy of benznidazole in treatment of early Trypanosoma cruzi infection. Lancet 1996; 348: 1407-13.
9. Andrade HM, Murta SMF, Chapeaurouge A, Perales J, Nirdé P, Romanha AJ. Proteomic Analysis of Trypanosoma cruzi Resistance to Benznidazole. J Proteome Research 2008; 7: 2357-67.
10. Andrade LO, Galvão LM, Meirelles MN, Chiari E, Pena SD, Macedo AM. Differential tissue tropism of Trypanosoma cruzi strains: an in vitro study. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2010; 105: 834-7. 11. Andrade SG. Caracterização de cepas do Trypanosoma cruzi isoladas no Recôncavo Baiano. Rev Pat Trop 1974; 3: 165-221. 12. Andrade SG, Magalhães JB. Biodemes and zymodemes of Trypanosoma cruzi strains: correlations with clinical data and experimental pathology. Rev Soc Bras Med Trop 1997; 30: 27-35.
198
13. Andrade SG, Andrade V, Rocha-Filho FD, Barral-Netto M. Análise antigênica de diferentes cepas do Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop São Paulo 1981; 23: 245-50. 14. Andrade SG, Magalhães JB, Pontes AL. Evaluation of chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in mice infected with Trypanosoma cruzi strains of different types. Bull Wld Hlth Org 1985; 63:721-6. 15. Andrade SG. Morphological and behavioural characterization of Trypanosoma cruzi strains. Rev Soc Bras Med Trop 1985; 18: 39-46. 16. Andrade SG, Rassi A, Magalhaes JB, Ferriolli Filho F, Luquetti AO. Specific chemotherapy of Chagas disease: a comparison between the response in patients and experimental animals inoculated with the same strains. Trans R Soc Trop Med Hyg 1992; 86: 624-6. 17. Añez N, Crisante G, Maia-da-Silva F, Rojas A, Carrasco H, Umezawa ES, Stolf AM, Ramirez JL, Teixeira MM. Predominance of lineage I among Trypanosoma cruzi isolates from Venezuelan patients with different clinical profiles of acute Chagas‟ disease. Trop Med Int Health 2004; 9:1319-26. 18. Anonymous. Recommendations from a satellite meeting. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999; 94, 429-32. 19. Apt W, Aguilera X, Arribada A, Gomez L, Miles M, Widmer G. Epidemiology of Chagas disease in Northern Chile: isozyme profiles of Trypanosoma cruzi from domestic and sylvatic transmission cycles and their association with cardiopathy. Am J Trop Med Hyg 1987; 37: 302-7. 20. Apt W, Aguilera X, Arribada A, Perez C, Miranda C, Sanchez G, Zulantay I, Cortes P, Rodriguez J, Juri D. Treatment of chronic Chagas disease with itraconazole and allopurinol. Am J Trop Med Hyg 1998; 59: 133-8. 21. Araújo RM. Morbidade da doença de Chagas no município de Berilo, Minas Gerais, Brasil. Estudo seccional e evolutivo de 10 anos (1987-1997) [Tese]. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 1998. 22. Araújo SM, Chiari E. Biological characterization of clones of the Y, CL and MR strains of Trypanosoma cruzi in inbred C3H mice. Mem Inst Oswaldo Cruz 1988, 83:175-81. 23. Arner E, Kindlund E, Nilsson D, Farzana F, Ferella M, Tammi MT, Andersson B. Database of Trypanosoma cruzi repeated genes: 20,000 additional gene variants. BMC Genomics 2007; 8: 391. 24. Aufderheide AC, Salo W, Madden M, Streitz J, Buikstra J, Guhl F, Arriaza B, Renier C, Wittmer LE Jr, Fornaciari G, Allison. A 9,000-year record of Chagas‟ disease. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 2034-9.
199
25. Augusto-Pinto L, Teixeira SM, Pena SD, Machado CR. Single-nucleotide Polymorphisms of the Trypanosoma cruzi MSH2 gene support the existence of three phylogenetic lineages presenting differences in mismatch-repair efficiency. Genetics 2003; 164: 117-26. 26. Barata JMS, Rocha, RM, Rodrigues, Ferraz Filho NA. Primeiro caso autóctone de tripanossomíase americana do estado do Acre (Brasil) e sua correlação com as cepas isoladas do caso humano e de triatomíneos silvestres da área. Rev Saúde Públ 1988; 22: 401-10. 27. Barbosa SE, Belisário CJ, Souza RC, Paula AS, Linardi PM, Romanha AJ, Diotaiuti L. Biogeography of Brazilian populations of Panstrongylus megistus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) based on molecular marker and paleo-vegetational data. Acta Trop 2006; 99: 144-54. 28. Barnabé C, Tibayrenc M, Dujardin JP. Trypanosoma cruzi. A pharmacological comparison of some Bolivian isoenzymic strains. Ann Soc Belg Med Trop 1983; 63: 319-24. 29. Barnabé C, Yaeger R, Pung O, Tibayrenc M. Trypanosoma cruzi: a considerable phylogenetic divergence indicates that the agent of Chagas disease is indigenous to the native fauna of the United States. Exp Parasitol 2001; 99: 73-9. 30. Beltrão HB, Cerroni MP, Freitas DR, Pinto AY, Valente VC, Valente SA, Costa EG, Sobel J. Investigation of two outbreaks of suspected oral transmission of acute Chagas disease in the Amazon region, Pará State, Brazil, in 2007. Trop Doct 2009; 39 (4): 231-2. 31. Bértoli M, Andó MH, Toledo MJO, de Araújo SM, Gomes ML. Infectivity for mice of Trypanosoma cruzi I and II strains isolated from different hosts. Parasitol Res 2006; 99: 7-13. 32. Borges-Pereira J, 1998. Doença de Chagas Humana: Estudo da infecção crônica, morbidade e mortalidade em Virgem da Lapa, MG, Brasil (1976-1996) [Tese]. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 1998. 33. Borges-Pereira J, Coura JR. Morbidade da doença de Chagas. Estudo seccional em uma área endemica, Virgem da Lapa, Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop 1986; 19: 139-48. 34. Borges-Pereira J, Coura JR. Morbidade da doença de Chagas em populações urbanas do Sertão da Paraíba. Rev Soc Bras Med Trop 1987; 20: 101-7. 35. Borges-Pereira J, Cunha RV, Willcox HPF, Coura JR. Evolução da cardiopatia chagásica crônica humana no Sertão da Paraíba, Brasil, no período de 4-5 anos. Rev Soc Bras Med Trop 1990; 23: 141-7. 36. Borst P, van der Ploeg M, van Hoek JFM, Tas J, James J. On the DNA content and ploidy of trypanosomes. Mol Biochem Parasitol 1982; 6: 13-23.
200
37. Bosseno MF, Telleria J, Vargas F, Yaksic N, Noireau F, Morin A, Brenière SF. Trypanosoma cruzi: study of the distribution of two widespread clonal genotypes in Bolivian Triatoma infestans vectors shows a high frequency of mixed infections. Exp Parasitol 1996; 83: 275-82. 38. Branche C, Ochaya S, Aslund L, Andersson B. Comparative karyotyping as a tool for genome structure analysis of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 2006; 147: 30-8. 39. Brener Z. Biology of Trypanosoma cruzi. Ann Rev Microbiol 1973; 27: 347-82. 40. Brener Z, Chiari E. Variações morfológicas observadas em diferentes amostras de Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop São Paulo 1963; 5:220-4. 41. Brener Z, Costa CAG, Chiari C. Differences in susceptibility of Trypanosoma cruzi strains to active chemotherapeutic agents. Rev Inst Med Trop São Paulo 1976; 18: 450-5. 42. Brener Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop São Paulo 1962; 4: 389-96. 43. Brener Z. Trypanosoma cruzi: morfologia e ciclo evolutivo. In: Dias JCP, Coura JR, editores. Clínica e Terapêutica da Doença de Chagas. Um Manual Prático para o Clínico Geral. Rio de Janeiro: Editora da Fundação Oswaldo Cruz; 1997. p. 25-31. 44. Briones MR, Souto RP, Stolf BS, Zingales B. The evolution of two Trypanosoma cruzi subgroups inferred from rRNA genes can be correlated with the interchange of American mammalian faunas in the Cenozoic and has implications to pathogenicity and host specificity. Mol Biochem Parasitol 1999; 104: 219-32. 45. Brisse S, Barnabé C, Tibayrenc M. Identification of six Trypanosoma cruzi phylogenetic lineages by random amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis. Int J Parasitol 2000; 30: 35-44. 46. Brisse S, Henriksson J, Barnabé C, Douzery EJ, Berkvens D, Serrano M, Carvalho MR, Buck GA, Dujardin JM, Tibayrenc M. Evidence for genetic exchange and hybridization in Trypanosoma cruzi based on nucleotide sequences and molecular karyotype. Infect Genet Evol 2003; 2: 173-83. 47. Brisse S, Verhoef J, Tibayrenc M. Characterisation of large and small subunit rRNA and mini-exon genes further supports the distinction of six Trypanosoma cruzi lineages. Int J Parasitol 2001; 31: 1218-26. 48. Britto CC, Silveira C, Cardoso MA, Marques P, Luquetti A, Macedo V, Fernandes O. Parasite persistence in treated chagasic patients revealed by xenodiagnosis and polymerase chain reaction. Mem Inst Oswaldo Cruz 2001; 96: 823-6. 49. Broutin H, Tarrieu F, Tibayrenc M, Oury B, Barnabé C. Phylogenetic analysis of the glucose-6-phosphate isomerase gene in Trypanosoma cruzi. Exp Parasitol 2006; 113: 1-7.
201
50. Brum-Soares LM, Xavier SS, Sousa AS, Borges-Pereira J, Ferreira JMBB, Costa IR, Junqueira ACV, Coura JR. Morbidity of Chagas disease among autochthonous patients from the Rio Negro microregion, State of Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 2010; 43:170-7. 51. Burgos JM, Begher S, Silva HM, Bisio M, Duffy T, Levin MJ, Macedo AM, Schijman AG. Molecular identification of Trypanosoma cruzi I tropism for central nervous system in Chagas reactivation due to AIDS. Am J Trop Med Hyg 2008; 78: 294-7. 52. Camargo ME, Silva GR, Castilho EA, Silveira AC. Inquérito sorológico da prevalência da infecção chagásica no Brasil, 1975-1980. Rev Inst Med Trop São Paulo 1984; 26: 192-204. 53. Campos FM, Liarte DB, Mortara RA, Romanha AJ, Murta SM. Characterization of a gene encoding alcohol dehydrogenase in benznidazole-susceptible and –resistant populations of Trypanosoma cruzi. Acta Trop 2009; 111: 56-63. 54. Cançado JR. Aspectos clínicos na padronização dos métodos de avaliação terapêutica na doença de Chagas. Rev Goiana Med 1963; 9: 212-32. 55. Cançado JR. Long term evaluation of etiological treatment of Chagas disease with benznidazole. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 2002; 44: 29-37. 56. Cançado JR. Tratamento específico da doença de Chagas. In: Cançado JR, Chuster M. Cardiopatia chagásica. Belo Horizonte: Fundação Carlos Chagas; 1985. p.327-55. 57. Cano MI, Gruber A, Vazquez M, Cortés A, Levin MJ, Gonzalez A, Degrave W, Rondinelli E, Zingales B, Ramirez JL, Alonso C, Requena JM, Silveira JF. Molecular karyotype of clone CL Brener chosen for the Trypanosoma cruzi genome. Mol Biochem Parasitol 1995; 71: 273-8. 58. Carcavallo RU, Martinez-Silva R, Otero MAA, Tonn RJ. Infección natural de Rhodnius robustus Larrouse y Rhodnius pictipes Stal por T. cruzi y T. rangeli en Venezuela. Bol Dir Malariol Saneamiento Ambiental 1975; 15:117-20. 59. Carneiro M, Chiari E, Gonçalves AM, da Silva Pereira AA, Morel CM, Romanha AJ. Changes in the isoenzyme and kinetoplast DNA patterns of Trypanosoma cruzi strains induced by maintenance in mice. Acta Trop 1990; 47: 35-45. 60. Carneiro M, Romanha AJ, Chiari E. Biological characterization of Trypanosoma cruzi strains from different zymodemes and schizodemes. Mem Inst Oswaldo Cruz 1991; 86: 387-93. 61. Carrasco HJ, Torrellas A, García C, Segovia M, Feliciangeli MD. Risk of Trypanosoma cruzi I (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) transmission by Panstrongylus geniculatus (Hemiptera: Reduviidae) in Caracas (Metropolitan District) and neighboring States, Venezuela. Int J Parasitol 2005; 35: 1379-84.
202
62. Castro JA, Meca MM, Bartel LC. Toxic side effects of drugs used to treat Chagas‟ disease (American Trypanosomiasis). Hum Exp Toxicol 2006; 25: 471. 63. Chagas C. Infection naturelle des singes du Pará (Crysotrix sciureus) par Trypanosoma cruzi. C R Soc Biol (Paris) 1924; 90: 873. 64. Chagas C. Nova tripanozomiaze humana. Estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n.gen. n.sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Mem Inst Oswaldo Cruz 1909; 1: 159-218. 65. Chagas C. Tripanosomiase americana: forma aguda da molestia. Mem Inst Oswaldo Cruz 1916; 8: 37-60. 66. Chapman MD, Baggaley RC, Godfrey-Fausset PF, Malpas TJ, White G, Canese J, Miles MA. Trypanosoma cruzi from the Paraguayan Chaco: isoenzyme profiles of strains isolated at Makthlawaiya. J Protozool 1984; 31: 482-6. 67. Clark CG, Pung OJ. Host specificity of ribosomal DNA variation in sylvatic Trypanosoma cruzi from North America. Mol Biochem Parasitol 1994; 66: 175-9. 68. Click-Lambert R, Kolivras KN, Resler LM, Brewster CC, Paulson SL. The potential for emergence of Chagas disease in the United States. Geospat Health 2008; 2: 227-39. 69. Coura JR, Abreu LL, Dubois LEG, Correia-Lima F, Arruda Jr. E, Willcox HPF, Anunziato N, Petana W. Morbidade da doença de Chagas. II-Estudos seccionais em quatro áreas de campo no Brasil. Mem Inst Oswaldo Cruz 1984; 79: 101-24. 70. Coura JR, Anunziato N, Willcox HPF. Morbidade da doença de Chagas. I-Estudo de casos procedentes de vários estados do Brasil, observados no Rio de Janeiro. Mem Inst Oswaldo Cruz 1983; 78: 363-72. 71. Coura JR, Borges-Pereira J. A follow-up evaluation of Chagas disease in two endemic areas in Brasil. Mem. Instituto Oswaldo Cruz 1984; 79: 107-12. 72. Coura JR, Borges-Pereira J, Araújo RM. Morbidity and regional variation of Chagas disease in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999a; 94: 26-7. 73. Coura JR. Chagas disease: what is known and what is needed - A background article. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102: 113-22. 74. Coura JR, Junqueira ACV, Bóia MN, Fernandes O, Bonfante C, Campos JE, Santos L, Devera R. Chagas disease in the Brazilian Amazon. IV. A new cross-sectional study. Rev Inst Med Trop São Paulo 2002a; 44: 159-65. 75. Coura JR, Junqueira ACV, Boia MN, Fernandes O. Chagas disease: from bush to huts and houses. Is it the case of the Brazilian Amazon? Mem Inst Oswaldo Cruz 1999b: 94: 379-84.
203
76. Coura JR, Junqueira ACV, Fernandes O, Valente SAS, Miles MA. Emerging Chagas in Amazonian Brazil. Trends Parasitol 2002b; 18: 171-6. 77. Coura JR. Transmissão da infecção chagásica por via oral na história natural da doença de Chagas. Rev Soc Bras de Med Trop 2006; 39: 113-7. 78. Coura JR, Willcox HPF, Arboleda MN, Fernandes O, Paiva DD. Chagas disease in the Brazilian Amazon III. A cross-sectional study. Rev Inst Med Trop São Paulo 1995; 37: 415-20. 79. Deane LM. Animal reservoirs of Trypanosoma cruzi in Brazil. Rev Bras Malariol D Trop. 1964a; 16: 27-48. 80. Deane LM. Sobre um tripanossoma do tipo T. cruzi encontrado em rato silvestre no Estado do Pará. Rev Bras Malariol D Trop. 1960; 12: 87-102. 81. Deane LM. Tripanossomídeos de mamíferos da região Amazônica. I. Alguns flagelados encontrados no sangue dos mamíferos silvestres do Estado do Pará. Rev Inst Med Trop São Paulo 1961; 3: 15-28. 82. Deane LM. Tripanossomídeos de mamíferos da região Amazônica. III. Hemoscopia e xenodiagnóstico de animais silvestres dos arredores de Belém, Pará. Rev Inst Med Trop São Paulo 1964b; 8:225-32. 83. Deane LM. Tripanossomídeos de mamíferos da região Amazônica. IV. Hemoscopia e xenodiagnóstico de animais silvestres da estrada Belém-Brasília. Rev Inst Med Trop São Paulo 1967; 9:143-48. 84. Degrave W, Fragoso SP, Britto C, van Heuverswyn H, Kidane GZ, Cardoso MA, Mueller RU, Simpson L, Morel CM. Peculiar sequence organization of kinetoplast DNA minicircles from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol1988; 27: 63-70. 85. del Puerto R, Nishizawa JE, Kikuchi M, Iihoshi N, Roca Y, Avilas C, Gianella A, Lora J, Velarde FU, Renjel LA, Miura S, Higo H, Komiya N, Maemura K, Hirayama K. Lineage analysis of circulating Trypanosoma cruzi parasites and their association with clinical forms of Chagas disease in Bolivia. PLoS Negl Trop Dis 2010; 4: e687. 86. de Noya BA, Díaz-Bello Z, Colmenares C, Ruiz-Guevara R, Mauriello L, Zavala-Jaspe R, Suarez JA, Abate T, Naranjo L, Paiva M, Rivas L, Castro J, Márques J, Mendoza I, Acquatella H, Torres J, Noya O. Large urban outbreak of orally acquired acute Chagas disease at a school in Caracas, Venezuela. J Infect Dis 2010; 501: 1308-15. 87. Devera R, Illarramendi X, Montoya-Araújo R, Pirmez C, Fernandes O, Coura JR. Biodemas de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas de humanos de três áreas endêmicas de Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop 2002; 35: 323-30. 88. Dias JCP. Acute Chagas Disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 1984; 79: 85-79.
204
89. Dias JCP, Coura JR. Epidemiologia. In JCP Dias, JR Coura, editores. Clínica e terapêutica da doença de Chagas. Rio de Janeiro: Editora da Fundação Oswaldo Cruz; 1997. p. 33-66. 90. Dias JCP, Macedo VO. Doença de Chagas. In: Coura JR., editor. Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan; 2005, v. 1. p. 557-593. 91. Dias JCP, Prata AR, Correia D. Problems and perspectives for Chagas disease control: in search of a realistic analysis. Rev Soc Bras Med Trop 2008; 41: 193-6. 92. Dias JCP, Silveira AC, Schofield CJ. The impact of Chagas dis- The impact of Chagas disease control in Latin America: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz 2002; 97: 603-12. 93. Dias JCP. The indeterminate form of human chronic Chagas disease. A clinical epidemiological review. Rev Soc Bras Med Trop 1989; 22: 147-56. 94. Dinerstein E, Olson DM, Graham DJ, Webster AL, Primm SA, Book-Binder MP. Conservation assessment of the terrestrial eco-region of Latin America and the Caribbean. Washington: World Bank; 1995. 95. Diosque P, Barnabé C, Padilla AM, Marco JD, Cardozo RM, Cimino RO, Nasser JR, Tibayrenc M, Basombrio MA. Multilocus enzyme electrophoresis analysis of Trypanosoma cruzi isolates from a geographically restricted endemic area of Chagas‟ disease in Argentina. Int J Parasitol 2003; 33: 997-1003. 96. Dost C, Albuquerque S, Hemleben V, Engels W, Prado Jr J. Molecular genetic characterization of different Trypanosoma cruzi strains and comparison of their development in Mus Musculus and Calomys callosus, Parasitol. Res. 2002; 88: 609-16. 97. Dujardin JP, Chavez T, Moreno JM. Comparison of isoenzyme electrophoresis and morphometric analysis for phylogenetic reconstruction of the Rhodniini (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). J Med Entomol 1999; 36: 653-9. 98. Dvorak JA, Hall TE, Crane MS, Engel JC, McDaniel JP, Uriegas R. Trypanosoma cruzi flow cytometric analysis. I. Analysis of total DNA/organism by means of mitramycin-induced fluorescence. J Protozool 1982; 24: 430-7. 99. Dvorak JA, Hartman DL, Miles MA. Trypanosoma cruzi: correlation of growth kinetics to zymodeme type in clones derived from various sources. J Protozool 1980; 27: 472-4. 100. Dvorak JA. The natural heterogeneity of Trypanosoma cruzi: Biological and medical implications. J Cell Biochem 1984; 24: 357-71. 101. El-Sayed NM, Myler PJ, Bartholomeu DC, Nilsson D, Aggarwal G, Tran AN, Ghedin E, Worthey EA, Delcher AL, Blandin G, Westenberger SJ, Caler E, Cerqueira GC, Branche C, Haas B, Anupama A, Arner E, Aslund L, Attipoe P, Bontempi E,
205
Bringaud F, Burton P, Cadag E, Campbell DA, Carrington M, Crabtree J, Darban H, da Silveira JF, de Jong P, Edwards K, Englund PT, Fazelina G, Feldblyum T, Ferella M, Frasch AC, Gull K, Horn D, Hou L, Huang Y, Kindlund E, Klingbeil M, Kluge S, Koo H, Lacerda D, Levin MJ, Lorenzi H, Louie T, Machado CR, McCulloch R, McKenna A, Mizuno Y, Mottram JC, Nelson S, Ochaya S, Osoegawa K, Pai G, Parsons M, Pentony M, Pettersson U, Pop M, Ramirez JL, Rinta J, Robertson L, Salzberg SL, Sanchez DO, Seyler A, Sharma R, Shetty J, Simpson AJ, Sisk E, Tammi MT, Tarleton R, Teixeira S, Van Aken S, Vogt C, Ward PN, Wickstead B, Wortman J, White O, Fraser CM, Stuart KD, Andersson B. The genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease. Science 2005; 15: 309: 409-15. 102. Falla A, Herrera C, Fajardo A, Montilla M, Vallejo GA, Guhl F. Haplotype identification within Trypanosoma cruzi I in Colombian isolates from several reservoirs, vectors and humans. Acta Trop 2009; 110: 15-21. 103. Feliciangeli MD, Dujardin JP, Bastrenta B, Mazzarri M, Villegas J, Flores M, Muñoz M. Is Rhodnius robustus (Hemiptera: Reduviidae) responsible for Chagas disease transmission in Western Venezuela? Trop Med Int Health 2002; 7: 280-7. 104. Fé NF, França MS, Carvalho-Costa FA. Reassessing the entomological investigation around the first autochthonous case of Chagas disease in Western Brazilian Amazon. Mem Inst Oswaldo Cruz 2009a; 104: 121-3. 105. Fé NF, Magalhães LK, Fé FA, Arakian SK, Monteiro WM, Barbosa MGV. Ocorrência de triatomíneos em ambientes silvestres e domiciliares do município de Manaus, Estado do Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 2009b; 42: 642-6. 106. Fernandes O, Santos SS, Cupolillo E, Mendonça B, Derre R, Junqueira ACV, Santos LC, Sturm NR, Naiff RD, Barret TV, Campbell DA, Coura JR. A mini-exon multiplex polymerase chain reaction to distinguish the major groups of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli in the Brazilian Amazon. Trans R Soc Trop Med Hyg 2001; 95: 97-99. 107. Fernandes O, Souto RP, Castro JÁ, Pereira JB, Fernandes NC, Junqueira AC, Naiff RD, Barret TV, Degrave W, Zingales B, Campbell DA, Coura JR. Brazilian isolates of Trypanosoma cruzi from humans and triatomines classified into two lineages using the mini-exon and ribosomal RNA sequences. Am J Trop Med Hyg 1998; 58: 807-11. 108. Ferraroni JJ, Nunes de Melo JÁ, Camargo ME. Moléstia de Chagas na Amazônia. Ocorrência de seis casos suspeitos, sorologicamente positivos. Acta Amazonica 1977; 7: 438-40. 109. Ferreira JMB, Guerra JAO, Barbosa MGV. Ventricular aneurysm in a chronic Chagas disease patient from the Brazilian Amazona region. Rev Soc Bras Med Trop 2009a; 42: 474-5.
206
110. Ferreira JMB, Guerra JAO, Santana-Filho FS, Magalhães BML, Coelho LIARC, Barbosa MGV. Acometimento Cardíaco em Casos de Doença de Chagas Aguda da Amazônia. Arq Bras Cardiol 2010a; 94: e147-e149. 111. Ferreira JMB, Guerra JAO, Magalhães BML, Coelho LIARC, Maciel MG, Barbosa MGV. Cardiopatia Chagásica Crônica na Amazônia: uma Etiologia a ser Lembrada Chronic Chagasic Cardiopathy in Amazon Region: an Etiology to Remember. Arq Bras Cardiol 2009b; 93: e107-e109. 112. Ferreira JMB, Nobre AF, Maldonado JGA, Borges-Pereira J, Zauza PL, Coura JR. Acidente vascular encefálico isquêmico em paciente chagásico crônico autóctone da Amazônia Brasileira. Rev Soc Bras Med Trop 2010b; 43: 751-3. 113. Ferreira LC, Deane LM. Novo depositário silvestre do Schizotrypanum cruzi (Chagas, 1909): a Irara, Tayra barbara. Brasil-Méd 1938; 52: 1159-61. 114. Filardi LS, Brener Z. Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma cruzi strains to drugs used clinically in Chagas disease. Trans R Soc Trop Med Hyg 1987; 81: 755-9. 115. Finley RW, Dvorak JA. Trypanosoma cruzi: Analysis of the population dynamics of heterogeneous mixtures. J Protozool 1987; 34: 409-15. 116. Floch H, Camain R. Deux nouveaux cas de maladie de chagas em Guyane Française. Bull Soc Path Exot 1948; 47: 22-5. 117. Floch H, Tasque P. Un cas de maladie de Chagas en Guyane Française. Bull Soc Path Exot 1941; 40: 36-7. 118. Flórez O, Higuera S, Barraza MF, Cabrera HB, Mantilla JC, Rugeles CI. Chagasic megacolon associated with Trypanosoma cruzi I in a Colombian patient. Parasitol Res 2010; 107: 439-42. 119. Fraiha-Neto H, Valente SAS, Valente VC, Pinto AYN. Doença de Chagas - endêmica na Amazônia? An Acad Med Pará 1995; 6: 5357. 120. França MS, Frade JM, Konasugawa K, Almeida FB. Doença de Chagas – primeiro caso autóctone na Amazônia Ocidental – Amazonas – Brasil. Acta Amazonica 1980; 10: 759-62. 121. Freitas JM, Augusto-Pinto L, Pimenta JR, Bastos-Rodrigues L, Gonçalves VF, Teixeira SMR, Chiari E, Junqueira ACV,Fernandes O, Macedo AM, Machado CR, Pena SDJ. Ancestral genomes, sex and the population structure of Trypanosoma cruzi. PLoS Pathogens 2006; 2: e24. 122. Galvão C, Carcavallo R, Rocha DS, Jurberg J. A checklist of the current valid species of the subfamily Triatominae Jeannel, 1919 (Hemiptera, Reduviidae) and their geographical distribution, with nomenclatural and taxonomic notes. Zootaxa 2003; 202: 1-36.
207
123. García ES, Azambuja P. Development and interaction of Trypanosoma cruzi within the insect vector. Parasitol Today 1991; 7: 240-4. 124. García ES, Dvorak JA. Growth and development of two Trypanosoma cruzi clones in the arthropod Dipetalogaster maximus. Am J Trop Med Hyg 1982; 31: 259-62.
125. Garzón EA, Barnabé C, Córdova X, Bowen C, Paredes W, Gómez E, Ouaissi A, Tibayrenc M, Guevara AG. Trypanosoma cruzi isoenzyme variability in Ecuador: first observation of zymodeme III genotypes in chronic chagasic patients. Trans R Soc Trop Med Hyg 2002; 96: 378-82.
126. Gaunt MW, Miles M. The ecotopes and evolution of triatomine bugs (Triatominae) and their associated trypanosomes. Mem Inst Oswaldo Cruz 2000; 95 (4): 557-65. 127. Gaunt MW, Yeo M, Frame IA, Stothard JR, Carrasco HJ, Taylor MC, Mena SS, Veazey P, Miles GA, Acosta N, Arias AR, Miles MA. Mechanism of genetic exchange in American trypanosomes. Nature 2003; 241: 936-9. 128. Gomes ML, Galvão LM, Macedo AM, Pena SD, Chiari E. Chagas disease diagnosis: comparative analysis of parasitologic, molecular and serologic methods. Am J Trop Med Hyg 1999; 60: 205-10. 129. Gomes ML, Macedo AM, Vago AR, Pena SD, Galvão LM, Chiari E. Trypanosoma cruzi: optimization of polymerase chain reaction for detection in human blood. Exp Parasitol 1998; 88: 28-33. 130. González J, Muñoz S, Ortiz S, Anacona D, Salgado S, Galleguillos M, Neira I, Sagua H, Solari A. Biochemical, immunological and biological characterization of Trypanosoma cruzi populations of the Andean North of Chile. Exp Parasitol 1995; 81: 125-35. 131. Henriksson J, Aslund L, Macina RA, Franke de Cazzulo BM, Cazzulo JJ, Frasch AC, Pettersson U. Chromosomal localization of seven cloned antigen genes provides evidence of diploidy and further demonstration of karyotype variability in Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 1990; 42: 213-24. 132. Herrera C, Bargues MD, Fajardo A, Montilla M, Triana O, Vallejo GA, Guhl F. Identifying four Trypanosoma cruzi I isolate haplotypes from different geographic regions in Colombia. Infect Genet Evol 2007; 7: 535-9. 133. Herrera L, D‟Andrea PS, Xavier SC, Mangia RH, Fernandes O, Jansen AM. Trypanosoma cruzi infection in wild mammals of the National Park „Serra da Capivara‟ and its surroundings (Piauí, Brazil), an area endemic for Chagas disease. Trans R Soc Trop Med Hyg 2005; 99: 379-88. 134. Higuchi ML, Brito T, Reis M, Bellotti G, Pereira-Barreto AC, Pileggi F. Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammation in
208
human chronic chagasic myocardits. Light microscopy and immune-histochemical findings. Cardiovasc Pathol 1993; 2: 101-6. 135. Hoare CA. The trypanosomes of mammals: a zoological monograph. Oxford: Blackwell Scientific Publications; 1972. 136. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Geociências (http://www.ibge.gov.br/home/mapa_site/mapa_site.php#geociencias, acessado em 18/Out/2011). 137. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Unidades da Federação: Amazonas (http://www.ibge.gov.br/estadosat/perfil.php?sigla=am, acessado em 18/Out/2011). 138. Junqueira ACV, Chiari E, Wincker P. Comparison of the polymerase chain reaction with two classical parasitological methods for the diagnosis of Chagas disease in endemic region of North-Eastern Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 1996; 90: 129-32. 139. Krettli AU, Cançado JR, Brener Z. Effect of specific chemotherapy on the levels of lytic antibodies in Chagas‟ disease. Trans R Soc Trop Med Hyg 1982; 76: 334-40. 140. Lainson R, Shaw JJ, Frahia H, Miles MA, Draper CC. Chagas disease in the Amazon Basin. I. Trypanosoma cruzi in silvatic mammals, triatomine bugs and man in the State of Pará, north Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 1979; 73: 193-204. 141. Lana M, Pinto AS, Barnabé C, Quesney V, Noel S, Tibayrenc M. Trypanosoma cruzi: compared vectorial transmissibility of three major clonal genotypes by Triatoma infestans. Exp Parasitol 1998; 89: 1-5. 142. Lana M, Pinto AS, Bastrenta B, Barnabé C, Noel S, Tibayrenc M. Trypanosoma cruzi: Infectivity of clonal genotypes infections in acute and chronic phases in mice. Exp Parasitol 2000; 96: 61-6. 143. Laurent JP, Barnabe C, Quesney V, Noel S, Tibayrenc M. Impact of clonal evolution on the biological diversity of Trypanosoma cruzi. Parasitol 1997; 114: 213-8. 144. Lauria-Pires L, Braga MS, Vexenat AC, Nitz N, Simões-Barbosa A, Tinoco DL, Teixeira AR. Progressive chronic Chagas heart disease ten years after treatment with anti-Trypanosoma cruzi nitroderivatives. Am J Trop Med Hyg 2000; 63: 111-8. 145. Leguizamón M, Campetella O, González-Cappa S, Frasch A. Mice infected with Trypanosoma cruzi produce antibodies against the enzymatic domain of trans-sialidase that inhibit its activity, Infect. Immun. 1994; 62: 3441-6. 146. Lent H, Wygodzinsky P. Revision of the Triatominae (Hemiptera, Reduviidae), and their significance as vectors of Chagas‟ disease. Bulletin of the American Museum of Natural History 1979; 163: 123-520.
209
147. Lewis MD, Ma J, Yeo M, Carrasco HJ, Llewellyn MS, Miles MA. Genotyping of
Trypanosoma cruzi: systematic selection of assays allowing rapid and accurate
discrimination of all known lineages. Am J Trop Med Hyg 2009; 81: 1041-9.
148. Lisboa CV, Pinho AP, Monteiro RV, Jansen AM. Trypanosoma cruzi
(Kinetoplastida: Trypanosomatidae): biological heterogeneity in the isolates derived
from wild hosts. Exp Parasitol 2007; 116: 150-5.
149. Llevellyn MS, Lewis MD, Acosta N, Yeo M, Carrasco HJ, Segovia M, Vargas J, Torrico F, Miles MA, Gaunt MW. Trypanosoma cruzi IIc: Phylogenetic and phylogeographic insights from sequence and microsatellite analysis and potential impact on emergent Chagas disease. PLoS Negl Trop Dis 2009a; 3 (9): e510. 150. Llevellyn MS, Miles MA, Carrasco HJ, Lewis MD, Yeo M, Vargas J, Torrico F, Diosque P, Valente V, Valente SA, Gaunt MW. Genome-scale multilocus microsatellite typing of Trypanosoma cruzi discrete typing unit I reveals phylogeographic structure and specific genotypes linked to human infection. PLoS Pathog 2009b; 5: e1000410. 151. Llewellyn MS, Rivett-Carnac JB, Fitzpatrick S, Lewis MD, Yeo M, Gaunt MW, Miles MA. Extraordinary Trypanosoma cruzi diversity within single mammalian reservoir hosts implies a mechanism of diversifying selection. Int J Parasitol 2011; 41: 609-14.
152. Luquetti AO, Miles MA, Rassi A, Rezende JM, Souza AA, Póvoa MM, Rodrigues I. Trypanosoma cruzi: zymodemes associated with acute and chronic Chagas‟ disease in central Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 1986; 80, 462-70. 153. Luquetti AO, Rassi A. Diagnóstico laboratorial da infecção pelo Trypanosoma cruzi. In Z Brener, Z Andrade, M Barral-Netto (Org.). Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan; 2000. p. 344-348. 154. Lyman DF, Monteiro FA, Escalante AA, Cordon-Rosales C, Wesson DM, Dujardin JP, Beard CB. Mitochondrial DNA sequence variation among triatomine vectors of Chagas‟ disease. Am J Trop Med Hyg 1999; 60 (3): 377-86. 155. Macedo AM, Machado C, Oliveira R, Pena S. Trypanosoma cruzi: genetic structure of populations and relevance of genetic variability to the pathogenesis of Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 99: 1-12. 156. Macedo AM, Martins MS, Chiari E, Pena SDJ. DNA fingerprinting of Trypanosoma cruzi: a new tool for characterization of strains and clones. Mol Biochem Parasitol 1992; 55: 147-54. 157. Macedo AM, Pimenta JR, Aguiar RS, Melo AI, Chiari E, Zingales B, Pena SDJ, Oliveira RP. Usefulness of microsatellite typing in population genetic studies of Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz 2001; 96: 407-13.
210
158. Machado CA, Ayala FJ. Nucleotide sequences provide evidence of genetic exchange among distantly related lineages of Trypanosoma cruzi. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 7396-401. 159. Magalhães BML. Doença de Chagas no Amazonas: Prevalência sorológica em área rural de Manaus [Dissertação]. Manaus: Universidade do Estado do Amazonas. Escola Superior de Ciências da Saúde, 2009. 160. Magalhães LKC. Estudo sobre vetores e reservatórios silvestres de Trypanosoma cruzi em três municípios do Amazonas, Brasil [Dissertação]. Manaus: Universidade do Estado do Amazonas. Escola Superior de Ciências da Saúde, 2009. 161. Maia-da-Silva F, Naiff RD, Marcili A, Gordo M, D‟Affonseca Neto JÁ, Naiff MF, Franco AMR, Campanera M, Valente V, Valente SA, Camargo EP, Teixeira MMG, Miles MA. Infection rates and genotypes of Trypanosoma rangeli and T. cruzi infecting free-ranging Saguinus bicolor (Callitrichidae), a critically endangered primate of the Amazon Rainforest. Acta Trop 2008; 107: 168-73. 162. Manzullo EC, Chuit R. Risk of death due to chronic chagasic cardiopathy. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999; 94: 317-20. 163. Marcili A, Lima L, Valente V, Valente S, Batista J, Junqueira AC, Souza AI, da Rosa JA, Campaner M, Lewis MD, Llewellyn MS, Miles MA, Teixeira MM. Comparative phylogeography of Trypanosoma cruzi TCIIc: new hosts, association with terrestrial ecotopes, and spatial clustering. Infect Genet Evol 2009a; 9: 1265-74. 164. Marcili A, Valente VC, Valente SA, Junqueira ACV, Maia-da-Silva F, Pinto AYN, Naiff RD, Campaner M, Coura JR, Camargo EP, Miles MA, Teixeira MMG. Trypanosoma cruzi in Brazilian Amazonia: Lineages TCI and TCIIa in wild primates, Rhodnius spp. and in humans with Chagas disease associated with oral transmission. Int J Parasitol 2009b; 39: 615-23. 165. Marcilla A, Bargues MD, Abad-Franch F, Panzera F, Carcavallo RU, Noireau F, Galvão C, Jurberg J, Miles MA, Dujardin JP, Mas-Coma S. Nuclear rDNA ITS-2 sequences reveal polyphyly of Panstrongylus species (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae), vectors of Trypanosoma cruzi. Infect Genet Evol 2002; 1: 225-35. 166. Marinho CR, Nuñez-Apaza LN, Bortoluci KR, Bombeiro AL, Bucci DZ, Grisotto MG, Sardinha LR, Jorquera CE, Lira S, Lima MR, Alvarez JM. Infection by the Sylvio X10/4 clone of Trypanosoma cruzi: relevance of a low-virulence model of Chagas' disease. Microbes Infect. 2009; 11: 1037-45. 167. Marin-Neto JA, Rassi A Jr, Morillo CA, Avezum A, Connolly SJ, Sosa-Estani S, Rosas F, Yusuf S, BENEFIT Investigators. Rationale and design of a randomized placebo-controlled trial assessing the effects of etiologic treatment in Chagas‟ cardiomyopathy: the BENznidazole Evaluation for Interrupting Trypanosomiasis (BENEFIT). Am Heart J 2008; 156: 37-43.
211
168. Maya JD, Bollo S, Nuñez-Vergara LJ, Squella JÁ, Repetto Y, Morello A, Périé J, Chauvière G. Trypanosoma cruzi: effect and mode of action of nitroimidazole and nitrofuran derivatives. Biochem Pharmacol 2003; 65: 999. 169. Medeiros MB, Guerra JAO, Lacerda MVG. Meningoencephalitis in a patient with acute Chagas disease in the Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop 2008; 41: 520-1. 170. Melo RC, Brener Z. Tissue tropismo of different Trypanosoma cruzi strains. J Parasitol 1978; 64: 475-82. 171. Mendonça MBA, Neheme NS, Santos SS, Cupolillo E, Vargas N, Junqueira A, Naiff RD, Barret TV, Coura JR, Zingales B, Fernandes O. Two main clusters within Trypanosoma cruzi zymodeme 3 are defined by distinct regions of the ribosomal RNA cistron. Parasitol 2002; 124, 177-84. 172. Miles MA, Cedillos RA, Povoa MM, Souza AA, Prata A, Macedo V. Do radically dissimilar Trypanosoma strains (zimodemes) cause Venezuelan and cardiac forms of Chagas‟ disease? Lancet 1981a;1: 1338-40. 173. Miles MA, Póvoa MM, Souza AA, Lainson R, Shaw JJ, Ketteridge DS. Chagas‟ disease in the Amazon Basin. II. Distribution of Trypanosoma cruzi zymodemes 1 and 3 in Pará State, north Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 1981b; 75, 667-74. 174. Miles MA, Souza AA, Póvoa MM. Chagas‟ disease in the Amazon Basin. III. Ecotopes of ten triatomine bug species (Hemiptera, Reduviidae) from the vicinity of Belém, Pará State, Brazil. J Med Entomol 1981c; 18: 266-78. 175. Miles MA, Souza AA, Póvoa MM, Shaw JJ, Lainson R, Toyé PJ. Isozymic heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first authochtonous patients with Chagas`disease in Amazonian Brazil. Nature 1978; 272:819-21. 176. Miles MA, Toyé PJ, Oswaldo SC, Godfrey DC. The identification by isoenzyme patterns if two distinct strain-groups of Trypanosoma cruzi, circulating independently in a rural area of Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 1977; 71: 217-25. 177. Ministério da Saúde. Casos de Doença de Chagas Aguda. 2005 a 2010, Brasil. Disponível em http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/casos_brasil_2005_a_2010.pdf, acessado em 3/3/2011). 178. Ministério da Saúde. Óbitos por Doença de Chagas Aguda, 2005 a 2010, Brasil. Disponível em http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/obitos_brasil_de_05_10.pdf, acessado em 3/3/2011). 179. Ministério da Saúde. Consenso Brasileiro em Doença de Chagas. Rev Soc Bras Med Trop 2005; 30: 12-4.
212
180. Miyamoto CT, Gomes ML, Marangon AV, Araújo SM, Bahia MT, Lana M, Toledo MJO. Trypanosoma cruzi: Sensitivity of the polymerase chain reaction for detecting the parasite in the blood of mice infected with different clonal genotypes. Exp Parasitology 2006; 112:198-201. 181. Monteiro FA, Wesson DM, Dotson EM, Schofield CJ, Beard CB. Phylogeny and molecular taxonomy of the Rhodniini derived from mitochondrial and nuclear DNA sequences. Am J Trop Med Hyg 2000; 62: 460-5. 182. Monteiro WM, Barbosa MGV, Toledo MJO, Fé FA, Fé NF. Série de casos agudos de doença de Chagas atendidos num serviço terciário de Manaus, Amazonas, de 1980 a 2006. Rev Soc Bras Med Trop 2010a; 43: 207-10. 183. Monteiro WM, Magalhães LKC, Medeiros MB, Simões F, Silveira H, Barbosa MGV. Trypanosoma cruzi TcIII/Z3 genotype as agent of an outbreak of Chagas disease in the Brazilian Western Amazonia. Trop Med Int Health 2010b; 15: 1049-51. 184. Monteiro WM, Magalhães LKC, Oliveira JC, Guerra JAO, Silveira H, Ferreira LCL, Toledo MJO, Barbosa MGV. Biological behavior in mice of Trypanosoma cruzi stocks from the State of Amazonas, Western Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop. No prelo.
185. Morel CM, Chiari E, Camargo EP, Mattei DM, Romanha AJ, Simpson L. Strains and clones of Trypanosoma cruzi can be characterized by pattern of restriction endonuclease products of kinetoplast DNA minicircles. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77: 6810-4. 186. Murta SMF, Gazzinelli RT, Brener Z, Romanha AJ. Molecular characterization of susceptible and naturally resistant strains of Trypanosoma cruzi to benznidazole and nifurtimox. Mol Biochem Parasitol 1998; 93: 203-14. 187. Murta SM, Nogueira FB, Santos PF, Campos FM, Volpe C, Liarte DB, Nirdé P, Probst CM, Krieger MA, Goldenberg S, Romanha AJ. Differential gene expression in Trypanosoma cruzi populations susceptible and resistant to benznidazole. Acta Trop 2008; 107: 59-65. 188. Myler PJ. Molecular variation in trypanosomes. Acta Trop 1993; 53: 205-25. 189. Naiff MF, Naiff RD, Barrett TV. Vetores selváticos de doença de Chagas na área urbana de Manaus (AM): atividade de vôo nas estações secas e chuvosas. Rev Soc Bras Med Trop 1998; 31: 103-5. 190. Neira I, Ferreira AT, Yoshida N. Activation of distinct signal transduction
pathways in Trypanosoma cruzi isolates with differential capacity to invade host cells.
Int J Parasitol 2002; 32: 405-14.
191. Nóbrega AA, Garcia MH, Tatto E, Obara MT, Costa E, Sobel J, Araújo WN. Oral transmission of Chagas disease by consumption of açaí palm fruit, Brazil. Emerg Infect Dis 2009; 15: 653-55.
213
192. Nogueira FB, Ruiz JC, Robello C, Romanha AJ, Murta SM. Molecular characterization of cytosolic and mithochondrial tryparedoxin peroxidase in Trypanosoma cruzi populations susceptible and resistant to benznidazole. Parasitol Res 2009; 104: 835-44.
193. Noireau F, Carbajal-de-la-Fuente AL, Lopes CM, Diotaiuti L. Some considerations about the ecology of Triatominae. An Acad Bras Ciênc 2005; 77: 431-6. 194. Nusseinzweig V, Goble FC. Further studies on the antigenic constitution of strains of Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi. Exp Parasitol 1966; 18: 224-30. 195. Ocaña-Mayorga S, Llewellyn MS, Costales JA, Miles MA, Grijalva MJ (2010) Sex, subdivision, and domestic dispersal of Trypanosoma cruzi lineage I in southern Ecuador. PLoS Negl Trop Dis 2010; 4: e915. 196. O‟Connor O, Bosseno MF, Barnabé C, Douzery EJ, Brenière SJ. Genetic clusterig of Trypanosoma cruzi I lineage evidenced by intergenic mini-exon gene sequencing. Infect Genet Evol 2007; 7 (5): 587-93. 197. Oliveira RB, Troncon LEA, Dantas RO, Meneghelli UG. Gastrointestinal manifestations of Chagas‟ disease. Am J Gastroenterol 1998; 93: 884-9. 198. Oliveira RP, Broude NE, Macedo AM, Cantor CR, Smith CL, Pena SDJ. Probing the genetic population structure of Trypanosoma cruzi with polymorphic microsatellites. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 3776-80. 199. Oliveira RP, Macedo AM, Chiari E, Pena SDJ. Intraespecific genetic variability of parasites revealed by single sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Parasitol Today 1997; 13: 96-200. 200. Organización Panamericana de la Salud. Estimación cuantitativa de la enfermedad de Chagas en las Américas. Rio de Janeiro: PAHO; 2006. 201. Ostermayer AL, Passos ADC, Silveira AC, Ferreira AW, Macedo V, Prata AR. O inquérito nacional de soroprevalência de avaliação do controle da doença de Chagas no Brasil (2001-2008). Rev Soc Bras Med Trop 2011; 44: 108-21. 202. Otero AMA, Carcavallo RU, Tonn RJ. Notas sobre la biología, ecología y distribucción geográfica de Rhodnius pictipes Stal, 1872 (Hemiptera, Reduviidae). Bol Dir Malariol Saneamiento Ambiental 1976; 16: 163-8. 203. Parada H, Carrasco HA, Añez N, Fuenmayor C, Inglessis I. Cardiac involvement is a constant finding in acute Chagas‟ disease: a clinical, parasitological and histopathological study. Int J Cardiol 1997; 60: 49-54. 204. Paula AS, Diotaiuti L, Galvão C. Systematic and biogeography of Rhodniini (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) based on 16S mitochondrial rDNA sequences. J Biogeogr 2006; 34: 699-712.
214
205. Pedroso A, Cupolillo E, Zingales B. Evaluation of Trypanosoma cruzi hybrid stocks based on chromosomal size variation. Mol Biochem Parasitol 2003; 129:79-90. 206. Pedroso A, Cupolillo E, Zingales B. Trypanosoma cruzi: Exploring the nuclear genome of zymodeme 3 stocks by chromosome size polymorphism. Exp Parasitol 2007; 116: 71-6. 207. Pena DA, Eger I, Nogueira L, Heck N, Menin Á, Báfica A, Steindel M. Selection of TcII Trypanosoma cruzi population following macrophage infection. J Infect Dis 2011; 204: 478-486. 208. Pinto AYN, Ferreira AG, Valente VC, Harada GS, Valente SAS. Urban outbreak of acute Chagas disease in Amazon region of Brazil: four-year follow-up after treatment with benznidazole. Rev Panam Salud Publica 2009; 25: 77-83. 209. Pinto AYN, Harada GS, Valente VC, Abud JE, Gomes FD, Souza GC, Valente SAS. Cardiac attacks in patients with acute Chagas disease in a family micro-outbreak, in Abaetetuba, Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop 2001; 34:413-9. 210. Pinto AYN, Valente SA, Valente VC. Emerging acute Chagas disease in Amazonian Brazil: case reports with serious cardiac involvement. Braz J Infect Dis 2004; 8: 454-60. 211. Pinto AYN, Valente SAS, Valente VC, Ferreira-Junior AG, Coura JR. Fase aguda da doença de Chagas na Amazônia brasileira. Estudo de 233 casos do Pará, Amapá e Maranhão observados entre 1988 e 2005. Rev Soc Bras Med Trop 2008; 41: 602-14. 212. Prata A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet Infect Dis 2001; 1: 92-100. 213. Ramírez JD, Guhl F, Rendón LM, Rosas F, Marin-Neto JA, Morillo CA. Chagas Cardiomyopathy Manifestations and Trypanosoma cruzi Genotypes Circulating in Chronic Chagasic Patients. PLoS Negl Trop Dis 2010; 4: e899. 214. Rassi A Jr, Rassi A, Little WC. Chagas‟ heart disease. Clin Cardiol 2000; 23: 883-9. 215. Reis D. Comportamento biológico em camundongos de isolados de Trypanosoma cruzi dos estados do Amazonas e Paraná, Brasil [Dissertação]. Maringá: Universidade Estadual de Maringá. Centro de Ciências da Saúde, 2011.
216. Revollo S, Oury B, Laurent J, Barnabé C, Quesney V, Carrière B, Noël S, Tibayrenc M. Trypanosoma cruzi: impact of clonal evolution of the parasite on its biological and medical properties. Exp Parasitol 1998; 89: 30-9. 217. Richer W, Kengne P, Cortez MR, Perrineau MM, Cohuet A, Fontenille P, Noireau F. Active dispersal by wild Triatoma infestans in the Bolivian Andes. Trop Med Int Health 2007; 12: 759-64.
215
218. Rodrigues IRC, Souza AA, Terceros R, Valente S. Doença de Chagas na Amazônia I. Registro de 8 casos autóctones em Macapá. Rev Soc Bras Med Trop1988; 21: 193-7. 219. Roellig DM, Brown EL, Barnabé C, Tibayrenc M, Steurer FJ, Yabsley MJ. Molecular typing of Trypanosoma cruzi isolates, United States. Emerg Infect Dis 2008; 14: 1123-5. 220. Roellig DM, Yabsley MJ. Infectivity, pathogenicity, and virulence of Trypanosoma cruzi isolates from sylvatic animals and vectors, and domestic dogs from the United States in ICR Strain Mice and SD Strain Rats. Am J Trop Med Hyg 2010; 83: 519-22. 221. Romanha AJ, Alves RO, Murta SM, Silva JS, Ropert C, Gazzinelli RT. Experimental chemotherapy against Trypanosoma cruzi infection: Essential role of endogenous interferon-γ in mediating parasitologic cure. J Infec Diseases 2002; 186: 823. 222. Romanha AJ. Heterogeneidade Enzimática em Trypanosoma cruzi [Tese]. Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina, 1982. 223. Rozas M, Doncker S, Coronado X, Barnabé C, Tibayrenc M, Solari A, Dujardin JC. Evolutionary history of Trypanosoma cruzi according to antigen genes. Parasitol 2008; 135: 1157-64. 224. Ruíz RC, Favoreto S Jr, Dorta ML, Oshiro ME, Ferreira AT, Manque PM,
Yoshida N. Infectivity of Trypanosoma cruzi strains is associated with differential
expression of surface glycoproteins with differential Ca2+ signalling activity. Biochem
J 1998; 330: 505-11.
225. Ruíz-Sánchez R, León MP, Matta V, Reyes PA, López R, Jay D, Monteón VM. Trypanosoma cruzi isolates from Mexican and Guatemalan acute and chronic chagasic cardiopathy patients belong to Trypanosoma cruzi I. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005; 100: 281-3.
226. Salazar A, Schijman AG, Triana O. High variability of Colombian Trypanosoma cruzi lineage I stocks as revealed by low-stringency single primer-PCR minicircle signatures. Acta Trop 2006; 100: 110-8. 227. Sánchez G, Wallace A, Olivares M, Diaz N, Aguilera X, Apt W, Solari A.
Biological characterization of Trypanosoma cruzi zymodemes: in vitro differentiation
of epimastigotes and infectivity of culture metacyclic trypomastigotes to mice. Exp
Parasitol 1990; 71: 125-33.
228. Sánchez-Guillén MC, Bernabé C, Tibayrenc M, Zavala-Castro J, Totolhua JL, Méndez-López J, González-Mejía ME, Torres-Rasgado E, López-Colombo A, Pérez-Fuentes R. Trypanosoma cruzi strains isolated from human, vector, and animal reservoir in the same endemic region in Mexico and typed as T. cruzi I, discrete
216
typing unit 1 exhibit considerable biological diversity. Mem Inst Oswaldo Cruz 2006; 101: 585-90. 229. Santos DM, Talvani A, Guedes PMM, Machado-Coelho GLL, Lana M, Bahia MT. Trypanosoma cruzi: Genetic diversity influences the profile of immunoglobulins during experimental infection. Exp Parasitol 2009; 121: 8-14. 230. Schmunis GA. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries: the role of international migration. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102: 75-85. 231. Schmunis GA. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas‟ disease: status in the blood supply in endemic and non endemic countries. Transfusion 1991; 31: 547-57. 232. Shaw J, Lainson R, Fraiha H. Considerações sobre a epidemiologia dos primeiros casos autóctones de doença de Chagas registrados em Belém, Pará, Brasil. Rev Saúde Publ 1969; 3: 153-7. 233. Silveira AC, Feitosa VR, Borges R. Distribuição de triatomíneos capturados no ambiente domiciliar, no período de 1975/83, Brasil. Rev Bras Malariol D Trop 1984; 36: 15-312. 234. Silveira AC. Profilaxia. In: Z Brener, ZA Andrade, M Barral Neto (editores), Trypanosoma cruzi e doença de Chagas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2000. p. 75-87. 235. Silveira FT, Dias MG, Parda P, Lobão AO, Melo GB. Nono caso autóctone de doença de Chagas registrado no estado do Pará, Brasil (Nota prévia). Hiléia Médica 1979; 1: 61-62. 236. Simpson L. The mitochondrial genome of kinetoplastid protozoa: genomic organization, transcription, replication, and evolution. Annu Rev Microbiol 1987; 41: 363-82. 237. Solari A, Campillay R, Ortíz S, Wallace A. Identification of Trypanosoma cruzi genotypes circulating in Chilean chagasic patients. Exp Parasitol 2001; 97: 226-33. 238. Sosa-Estani S, Segura EL, Ruiz AM, Velazquez E, Porcel BM, Yampotis C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas disease. Am J Trop Med Hyg 1998; 59: 526-9. 239. Sosa-Estani S, Segura EL. Treatment of Trypanosoma cruzi infection in the undetermined phase. Experience and current guidelines of treatment in Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999; 94: 363-5. 240. Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbell DA, Zingales B. DNA markers define two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 1996; 83: 41-152.
217
241. Souto RP, Zingales B. Sensitive detection and strain classification of Trypanosoma cruzi by amplification of a ribosomal RNA sequence. Mol Biochem Parasitol 1993; 62: 45-52. 242. Souza AAA, Nepomuceno WNP, Lima JAN, Póvoa MM, Valente SAS, Braga RR, Correa ZJC. Doença de Chagas na Amazônia, ocorrência de um novo caso autóctone no Estado do Pará. Acta Amazônica 1990; 20: 137-74. 243. Souza FF, Castro-E-Silva O, Marin-Neto JA, Sankarankutty AK, Teixeira AC, Martinelli AL, Gaspar GG, Melo L, Figueiredo JF, Romano MM, Maciel BC, Passos AD, Rossi MA. Acute chagasic myocardiopathy after orthotopic liver transplantation with donor and recipient serologically negative for Trypanosoma cruzi: a case report. Transplant Proc 2008; 40: 875-8. 244. Spitzner FL, Freitas JM, Macedo AM, Toledo MJO, Araújo SM, Prioli AJ, Gomes ML. Trypanosoma cruzi - triatomine associations and the presence of mixed infections in single triatomine bugs in Paraná state, Brazil. Acta Parasitol 2007; 52: 74-81. 245. Steindel M, Kramer-Pacheco L, Scholl D, Soares M, Moraes MH, Eger I, Kosmann C, Sincero TC, Stoco PH, Murta SM, Carvalho-Pinto CJ, Grisard EC. Characterization of Trypanosoma cruzi isoled from humans, vectors, and animal reservoirs following an outbreak of acute Chagas disease in Santa Catarina State, Brazil. Diagn Microbiol Infect Dis 2008; 60: 25-32. 246. Stuart KD, Schnaufer A, Ernst NL, Panigrahi AK. Complex management: RNA editing in trypanosomes. Trends Biochem Sci 2005; 30: 97-105. 247. Sturm NR, Degrave W, Morel CM, Simpson L. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequence: use in diagnosis of Chagas disease. Mol Biochem Parasitol 1989; 33: 205-14. 248. Sturm NR, Vargas NS, Westenberger SJ, Zingales B, Campbell DA. Evidence for multiple hybrid groups in Trypanosoma cruzi. Int J Parasitol 2003; 33: 269-79. 249. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evolution 2007; 24: 1596-9. 250. Tarleton RL. Chagas disease: a role for autoimmunity? Trends Parasitol 2003; 19: 447-51. 251. Tartarotti E, Azeredo-Oliveira MT, Ceron CR. Phylogenetic approach to the study of Triatomines (Triatominae, Heteroptera). Braz J Biol 2006; 66: 703-8. 252. Teixeira ARL, Monteiro OS, Rebelo JM, Argañaraz ER, Vieira D, Lauria-Pires L, Nascimento R, Vexenat CA, Silva AR, Ault SK, Costa JM. Emerging Chagas disease: trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerg Infec Dis 2001; 7: 100-12.
218
253. Teixeira ARL, Nascimento RJ, Sturm NR. Evolution and pathology in Chagas disease - A Review. Mem Inst Oswaldo Cruz 2006; 101: 463-91. 254. Teixeira MMG, da Silva FM, Marcili A, Umezawa ES, Shikanai-Yasuda MA, Cunha-Neto E, Kalil J, Stolf N, Stolf AM. Trypanosoma cruzi lineage I in endomyocardial biopsy from a north-eastern Brazilian patient at end-stage chronic chagasic cardiomyopathy. Trop Med Int Health 2006; 11: 294-8. 255. Tibayrenc M, Ayala FJ. Isozyme variability in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease: genetical, taxonomical, and epidemiological significance. Evolution 1988; 42: 277-92. 256. Tibayrenc M, Ayala FJ. Towards a population genetics of microorganisms: the clonal theory of parasitic protozoa. Parasitol Today 1991; 7: 228-32. 257. Tibayrenc M, Miles MA. A genetic comparison of Brazilian and Bolivian zymodemes of Trypanosoma cruzi. Trans R Soc Trop Med Hyg 1983; 77: 76-83. 258. Tibayrenc M, Neubauer K, Barnabé C, Guerrini F, Skarecky D, Ayala F. Genetic characterization of six parasitic protozoa: Parity between random-primer DNA typing and multilocus enzyme electrophoresis. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 1335-9. 259. Tibayrenc M, Ward P, Moya A, Ayala FJ. Natural populations of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, have a complex multiclonal structure. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 1335-9. 260. Toledo MJ, Bahia MT, Carneiro CM, Martins-Filho OA, Tibayrenc M, Barnabé C, Tafuri WL, Lana M. Chemotherapy with benznidazole and itraconazole for mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal genotypes. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 223-30. 261. Toledo MJ, Bahia MT, Veloso VM, Carneiro CM, Machado-Coelho GL, Alves CF, Martins HR, Cruz RE, Tafuri WL, Lana M. Effects of specific treatment on parasitological and histopathological parameters in mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal genotypes. J Antimicrob Chemother 2004; 53: 1045-53. 262. Toledo MJO, Lana M, Carneiro CM, Bahia MT, Machado-Coelho GLL, Veloso VM, Barnabé C, Tibayrenc M, Tafuri WL. Impact of Trypanosoma cruzi clonal evolution on its biological properties in mice. Exp Parasitol 2002; 100: 161-72. 263. Toranzo EGD, Castro JA, Cazzulo BMF, Cazzulo JJ. Interaction of benznidazole reactive metabolites with nuclear and kinetoplastic DNA, proteins and lipids fromTrypanosoma cruzi . Experientia 1988; 44: 880. 264. Torres CM. Sobre a anatomia patológica da doença de Chagas. Mem Inst Oswaldo Cruz 1941;36: 391-404. 265. Toyé PJ. Isoenzyme variation in isolates of Trypanosoma cruzi. Trans R Soc Trop Med Hyg 1974; 68: 147.
219
266. Turrens JF, Watts Jr BP, Zhong L, Docampo, R. Inhibition of Trypanosoma cruzi and T. brucei NADH fumarate reductase by benznidazole and anthelmintic imidazole derivatives. Mol Biochem Parasitol 1996; 82: 125. 267. Vago AR, Macedo AM, Oliveira RP, Andrade LO, Chiari E, Galvão LMC, Reis DA, Pereira MES, Simpson AJG, Tostes S, Pena SDJ. kDNA signatures of Trypanosoma cruzi strains obtained directly from infected tissues. Am J Pathol 1996; 149: 2153-9. 268. Valadares HM, Pimenta JR, Freitas JM, Duffy T, Bartholomeu DC, Oliveira RP, Chiari E, Moreira MC, Filho GB, Schijman AG, Franco GR, Machado CR, Pena SD, Macedo AM. Genetic profiling of Trypanosoma cruzi directly in infected tissues using nested PCR of polymorphic microsatellites. Int J Parasitol 2008: 839-50. 269. Valente SAS, Valente VC, Fraiha-Neto H. Considerations on the epidemiology of Chagas disease in the Brazilian Amazon. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999: 94: 395-8. 270. Valente SAS, Valente VC, Pinto AYN, César MJB, Santos MP, Miranda COS, Cuervo P, Fernandes O. Analysis of an acute Chagas disease outbreak in the Brazilian Amazon: human cases, triatomines, reservoir mammals and parasites. Trans R Soc Trop Med Hyg 2009; 103: 291-7. 271. Valente VC, Valente SAS, Noireau F, Carrasco HJ, Miles MA. Chagas disease in the Amazon basin: association of Panstrongylus geniculatus (Hemiptera: Reduviidae) with domestic pigs. J Med Entomol 1998; 35: 99-103. 272. Viana S, Farias E, Lima F, Batista L, Vieira A, Silva L, Lobato C, Nascimento S, Chalub S. Doença de Chagas no Estado do Acre: registro de três casos de miocardiopatia chagásica aguda autóctone no Município de Rio Branco, 1994. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 1994; 27: 77. 273. Victor R, Chiari E. Avaliação de antígenos de Trypanosoma cruzi para reação de hemoaglutinação indireta em diferentes extratos antigênicos. Rev Inst Med Trop São Paulo 1987; 29: 6531-5. 274. Villa L, Morote S, Bernal O, Bulla D, Albajar-Vinas P. Access to diagnosis and treatment of Chagas disease/infection in endemic and non-endemic countries in the XXI century. Mem Inst Oswaldo Cruz 2007; 102: 87-93. 275. Villarreal D, Christian Barnabé C, Sereno D, Tibayrenc M. Lack of correlation between in vitro susceptibility to Benznidazole and phylogenetic diversity of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease. Exp Parasitol 2004; 108: 24-31. 276. Voller A, Bidwell D, Bartlet A. Enzyme linked immunosorbent assay. In: Rose, N.R., Friedman, R. (Orgs.), Manual of Clinical Immunology. Ed. American Society for Microbiology, USA; 2005, p. 359-371.
220
277. Westenberger SJ, Barnabé C, Campbell DA, Sturm NR. Two hybridization events define the population structure of Trypanosoma cruzi. Genetics 2005; 171: 527-43. 278. Westenberger SJ, Cerqueira GC, El-Sayed NM, Zingales B, Campbell DA, Sturm NR. Trypanosoma cruzi 5S rRNA arrays define five groups and indicate the geographic origins of an ancestor of the heterozygous hybrids. Int J Parasitol 2006; 36: 337-46. 279. Wincker P, Britto C, Pereira JB, Cardoso MA, Oelemann W, Morel CM. Use of a simplified polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in blood samples patients in a rural endemic area. Am J Trop Med Hyg 1994; 71: 771-7.
280. Wilkinson SR, Taylor MC, Horn DH, Kelly JM, Cheeseman I. A mechanism for cross-resistance to nifurtimox and benznidazole in trypanosomes. PNAS 2008; 105: 5022-7.
281. World Bank. World Development Report. Investing in Health. The World Bank/Oxford University Press; 1993. 282. World Bank. Global burden of disease and risk factors. In: Lopez AD, Mathers CD, Ezzati M, Jamison DT, Murray CJL. The World Bank/Oxford University Press; 2006; p. 144-228. 283. World Health Organization. Control of Chagas disease. Geneva: WHO; 1991. 284. World Health Organization. Control of Chagas disease. Geneva: WHO; 2002. 285. World Health Organization. Control of Chagas disease. Geneva: WHO; 2005. 286. Xavier SS, Souza AS, Viñas PA, Junqueira ACV, Bóia MN, Coura JR. Cardiopatia chagásica crônica no Rio Negro, Estado do Amazonas. Relato de três novos casos autóctones, comprovados por exames sorológicos, clínicos, radiográficos do tórax, eletro e ecocardiográficos. Rev Soc Bras Med. Trop. 2006; 39: 211-6. 287. Yeo M, Acosta N, Llevellyn M, Sánchez H, Adamson S, Miles GA, López E, González N, Patterson JS, Gaunt MW, de Arias AR, Miles MA. Origins of Chagas disease: Didelphis species are natural hosts of Trypanosoma cruzi I and armadillos hosts of Trypanosoma cruzi II, including hybrids. Int J Parasitol 2005; 35: 225-33. 288. Yeo M, Lewis MD, Carrasco HJ, Acosta N, Llewellyn M, Valente SAS, Valente VC, Arias AR, Miles MA. Resolution of multiclonal infections of Trypanosoma cruzi from naturally infected triatomine bugs and from experimentally infected mice by direct plating on a sensitive solid medium. Int J Parasitol 2007; 37: 111-20. 289. Yoshida N. Surface antigens of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi. Infect Immun 1983; 40: 836-9.
221
290. Zingales B, Andrade SG, Briones MRS, Campbell DA, Chiari E, Fernandes O, Guhl F, Lages-Silva E, Macedo AM, Machado CR, Miles MA, Romanha AJ, Sturm NR, Tibayrenc M, Schijman AG. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision meeting recommends TcI to TcVI. Mem Inst Oswaldo Cruz 2009; 104: 1051-4.
222
8 ANEXOS
223
8.1 Anexo 1
PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO (POP)
224
Código POP POP_ENT_LB_002_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento da hemocultura para o diagnóstico da doença de Chagas em meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro
Data & assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Data & assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o diagnóstico parasitológico da doença de Chagas pelo cultivo de Trypanosoma cruzi a
partir de amostras de sangue humano em meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
2. DEFINIÇÕES
Hemocultura: Método parasitológico indireto que permite a multiplicação dos parasitos em meios
artificiais aumentando a sensibilidade do diagnóstico.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e diagnóstico laboratorial de rotina.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_007_v02_PT Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. e Trypanosoma cruzi.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Micropipeta para 10 µL
6.1.2 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.3 Adaptador de plástico para tubo de coleta a vácuo
6.1.4 Tubos para coleta a vácuo de 10 mL com anticoagulante
6.1.5 Garrote
6.1.6 Algodão embebido em álcool a 70%
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
225
Código POP POP_ENT_LB_002_v02_PT Página 2/3
6.1.7 Pipetas tipo Pasteur de vidro com bulbo de látex
6.1.8 Lâminas para microscopia
6.1.9 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm
6.1.10 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.11 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.12 Frasco lavador com álcool 70%
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.2.4 Microscópio ótico comum
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN)
Vide POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Trypanosoma cruzi.
7. PROCEDIMENTOS (3)
7.1 Obtenção do sangue
7.1.1 Coletar, por punção venosa, em condições assépticas, 5 mL de sangue de cada indivíduo, com
tubos de coleta a vácuo contendo anticoagulante.
7.2 Processo de cultura
Este procedimento deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo laminar, para evitar
contaminação.
7.2.1 Inocular aproximadamente 0,5 mL de sangue total em tubos (3 a 5 para cada paciente)
contendo o meio NNN completo (bifásico).
7.2.2 Transferir os tubos semeados para uma estufa B.O.D. regulada a 28ºC.
7.2.3 Homogeneizar os tubos uma vez por semana.
7.3 Período e forma de leitura
7.3.1 Realizar a leitura retirando-se alíquotas de 10 µL da suspensão de cada tubo e examinando-as
em intervalos de 7 dias até um total de 2 meses após o cultivo, entre lâmina e lamínula, ao
microscópio ótico com aumento de 400x.
7.3.2 Após a última leitura, os tubos que permanecerem negativos devem ser centrifugados a 2.500
rpm por 15 min para que o sedimento seja reexaminado.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
226
Código POP POP_ENT_LB_002_v02_PT Página 3/3
8. LIMITAÇÕES
A hemocultura requer condições assépticas para a colheita e manuseio da amostra de sangue, o que
a torna pouco prática para os trabalhos de campo.
Embora apresente alta especificidade, a sensibilidade da hemocultura, baseada em apenas um
exame, varia de 40% a 50%, sendo mais baixa na fase crônica da doença de Chagas (2).
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Bronfen E, de Assis Rocha FS, Machado GB, Perillo MM, Romanha AJ, Chiari E. Isolation of
Trypanosoma cruzi samples by xenodiagnosis and hemoculture from patients with chronic Chagas‟
disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 1989; 84(2): 237-40.
3. Miles MA, Póvoa MM, Souza AA, Lainson R, Shaw JJ, Ketteridge DS. Chagas‟ disease in the
Amazon Basin. II. Distribution of Trypanosoma cruzi zymodemes 1 and 3 in Pará State, north Brazil.
Trans R Soc Trop Med Hyg 1981; 75, 667-74.
10. ANEXOS
Não se aplica.
227
Código POP POP_ENT_LB_003_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento da cultura de líquor para o diagnóstico do acometimento do sistema nervoso central na infecção chagásica em meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento de cultura de líquor para o diagnóstico do acometimento do sistema
nervoso central na infecção chagásica em meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica ao diagnóstico laboratorial.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. e Trypanosoma cruzi.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Micropipeta para 10 µL
6.1.2 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.3 Seringa estéril com agulha para coleta
6.1.4 Frasco coletor estéril para líquor
6.1.5 Algodão embebido em álcool a 70%
6.1.6 Pipetas tipo Pasteur de vidro com bulbo de látex
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
228
Código POP POP_ENT_LB_003_v02_PT Página 2/3
6.1.7 Lâminas para microscopia
6.1.8 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm
6.1.9 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.10 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.11 Frasco lavador com álcool 70%
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.2.4 Microscópio ótico comum
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN)
Vide POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. e Trypanosoma cruzi.
7. PROCEDIMENTOS
7.1 Obtenção do sangue
7.1.1 Coletar, por punção lombar, em condições assépticas, 3 mL de líquor do indivíduo.
7.1.2 Encaminhar imediatamente para o laboratório na própria seringa.
7.2 Processo de cultura
Este procedimento deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo laminar, para evitar
contaminação.
7.2.1 Inocular aproximadamente 0,5 mL de líquor em tubos (6 para cada paciente) contendo o meio
NNN completo (bifásico).
7.2.2 Transferir os tubos semeados para uma estufa B.O.D. regulada a 28ºC.
7.2.3 Homogeneizar os tubos uma vez por semana.
7.3 Período e forma de leitura
7.3.1 Realizar a leitura retirando-se alíquotas de 10 µL da suspensão de cada tubo e examinando-as
em intervalos de 7 dias até um total de 2 meses após o cultivo, entre lâmina e lamínula, ao
microscópio ótico com aumento de 400x.
7.3.2 Após a última leitura, os tubos que permanecerem negativos devem ser centrifugados a 2.500
rpm por 15 min para que o sedimento seja reexaminado.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
229
Código POP POP_ENT_LB_003_v02_PT Página 3/3
8. LIMITAÇÕES
A cultura de líquor requer condições assépticas para a colheita e manuseio da amostra.
A contaminação do líquor com sangue no momento da coleta torna o material inviável de ser
semeado.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
10. ANEXOS
Não se aplica.
230
Código POP POP_ENT_LB_004_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento da xenocultura para isolamento de estoques de Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o isolamento direto de estoques de Trypanosoma cruzi a partir do tubo digestivo ou fezes
de triatomíneos coletados ou utilizados em xenodiagnóstico.
2. DEFINIÇÕES
Xenocultura: semeadura do tubo digestivo ou fezes do triatomíneo em um meio de cultura (2).
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental e ao controle de qualidade do diagnóstico
laboratorial.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_005_v02_PT: Procedimento do xenodiagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
para cultura de Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS:
6.1 Materiais:
6.1.1 Béquer
6.1.2 Vidro relógio
6.1.3 Pinça
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
231
Código POP POP_ENT_LB_004_v02_PT Página 2/3
6.1.4 Tesoura pequena
6.1.5 Pipetas tipo Pasteur
6.1.6 Pipeta graduada de 10 µL
6.1.7 Proveta graduada de 1 L
6.1.8 Seringa de 2 mL com agulha
6.1.9 Bastão de vidro
6.1.10 Erlenmeyer de 1 L
6.1.11 Lâminas para microscopia
6.1.12 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm
6.1.13 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.14 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.15 Frasco lavador com álcool 70%
6.1.16 Soro fisiológico
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Destilador de água
6.2.2 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Balança semi-analítica
6.2.4 Filtro a vácuo
6.2.5 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.2.6 Agitador
6.2.7 Autoclave
6.2.8 Geladeira
6.2.9 Microscópio ótico comum
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Solução esterilizante de White
6.3.1.1 Fórmula:
Reagente Quantidade
HgCl2 0,25 g
NaCl 6,50 g
HCl concentrado 25 mL
Etanol a 5% 250 mL
H2O destilada estéril 750 mL
6.3.1.2 Preparação:
Dissolver as substâncias na H2O destilada, sob agitação, em um erlenmeyer.
232
Código POP POP_ENT_LB_004_v02_PT Página 3/3
6.3.2 Meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
Vide POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose
(LIT) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6.3.3 Meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN)
Vide POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6.3.4 Solução salina estéril adicionada de antibiótico (NaCl 0.85% + 140 mg/mL de gentamicina).
7. PROCEDIMENTOS (2)
7.1 Imergir o inseto em solução de White por cerca de 30 minutos. Este processo mata o inseto e
esteriliza a parte externa do mesmo.
7.2 Em ambiente estéril, recortar a cutícula em torno da ampola retal do inseto, retirando a mesma e
repousando em uma lâmina de vidro contendo solução salina estéril adicionada de antibiótico (NaCl
0.85% + 140 mg/mL de gentamicina).
7.3 Romper o tubo digestivo com auxílio de uma pipeta de Pasteur estéril.
7.4 Realizar a leitura de 10 µL da suspensão, entre lâmina e lamínula, ao microscópio ótico com
aumento de 400x, para verificar a presença de formas flageladas.
7.5 Semear a suspensão em meio NNN ou LIT ou inocular em camundongo, se o objetivo for o
isolamento do estoque.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Bronfen E, de Assis Rocha FS, Machado GB, Perillo MM, Romanha AJ, Chiari E. Isolation of
Trypanosoma cruzi samples by xenodiagnosis and hemoculture from patients with chronic Chagas‟
disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 1989; 84(2): 237-40.
8. ANEXOS
Não se aplica.
233
Código POP POP_ENT_LB_005_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento do xenodiagnóstico direto da infecção humana pelo Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento do xenodiagnóstico direto da infecção humana pelo Trypanosoma cruzi.
2. DEFINIÇÕES
Xenodiagnóstico: Método parasitológico indireto que permite a multiplicação dos parasitos no trato
digestivo do triatomíneo.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa clínica, trabalhos de campo e diagnóstico laboratorial de rotina.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_004_v02_PT. Procedimento da xenocultura para isolamento de estoques de
Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
para cultura de Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Ninfas de III ou IV estágio do triatomíneo escolhido, em jejum alimentar (dez para cada caixa)
Não existe consenso sobre a espécie de triatomíneo que deve ser empregada no xenodiagnóstico.
Esta Gerência utiliza Triatoma infestans ou Dipetalogaster maximus, dependendo da disponibilidade.
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
234
Código POP POP_ENT_LB_005_v02_PT Página 2/3
6.1.2 Recipientes com tela para os triatomíneos se alimentarem
6.1.3 Frascos para a manutenção das ninfas após a alimentação
6.1.4 Galinha para alimentação dos insetos aos 23 dias após o teste
6.1.5 Pinças
6.1.6 Tesoura
6.1.7 Bastão de vidro
6.1.8 Vidro relógio
6.1.9 Micropipeta para 10 µL
6.1.10 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.11 Soro fisiológico
6.1.12 Algodão embebido em álcool a 70%
6.1.13 Pipetas tipo Pasteur
6.1.14 Lâminas para microscopia
6.1.15 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm
6.1.16 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.17 Frasco lavador com álcool 70%
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Microscópio ótico comum
7. PROCEDIMENTOS (2,3,4)
7.1 Aplicação das ninfas:
7.1.1 Separar 30 ninfas de III e/ou IV estádio do triatomíneo escolhido e deixar as mesmas em jejum
alimentar de duas ou três semanas.
7.1.2 Acondicioná-las em três recipientes cobertos com tela na parte superior.
7.1.3 Colocar sobre a parte interna do antebraço de cada indivíduo durante 30 min.
7.1.4 Verificar o número de ninfas que se alimentaram em cada recipiente, desprezando as que não
ingeriram sangue.
7.1.5 Transferir as ninfas que se alimentaram para frascos maiores, mantendo-os à temperatura e
umidade ambientes.
7.1.6 Aos 23 dias, contados a partir da aplicação, submetê-los a uma única alimentação em galinha.
7.2 Leitura do xenodiagnóstico
7.2.1 Realizar a leitura dos xenodiagnósticos 30, 45 e 60 dias após o repasto.
7.2.2 Obter fezes de cada triatomíneo por compressão abdominal.
7.2.3 Das ninfas negativas, realizar a dissecção, que consiste na retirada de todo o trato digestivo,
com auxílio de duas pinças e uma tesoura, macerando o material com bastão de vidro.
235
Código POP POP_ENT_LB_005_v02_PT Página 3/3
7.2.4 Depositar as fezes ou o trato digestivo sobre uma lâmina, acrescentando-se 10 µL de soro
fisiológico.
7.2.5 Cobrir o material com lamínula 20 x 20 mm e realizar a leitura microscópica com aumento de
400x, percorrendo todos os campos em busca de formas flagelares.
Quando positivo, o material retirado do triatomíneo pode ser utilizado para xenocultura ou inoculação
em camundongos, para o isolamento dos estoques. Para tanto, vide POP_ENT_LB_004_v02_PT
(Procedimento da xenocultura para isolamento de estoques de Trypanosoma cruzi) ou
POP_ENT_LB_008_v02_PT (Procedimento de isolamento de estoques de Trypanosoma cruzi por
inoculação em camundongo).
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
A técnica requer espaço físico e condições para a criação de triatomíneos.
A picada dos triatomíneos nos pacientes pode ocasionar com certa freqüência reações alérgicas
decorrentes da saliva dos mesmos, levando à rejeição do exame pelo paciente.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Brumpt E. O xenodiagnóstico. Aplicação ao diagnóstico de algumas infecções parasitárias e, em
particular, à tripanosomose de Chagas. An Paul Med Cirurg 1914; 3:97-102.
3. Cerisolla JÁ, Rohweidder RW, del Prado CE. Rendimiento del xenodiagnostico em la infección
chagásica cronica humana utilizando ninfas de diferentes especies de triatomíneos. Bol Chil
Parasitologia 1971; 26:57-8.
4. Schenone H. Xenodiagnosis. Mem Inst Oswaldo Cruz 1999; 94:289-94.
10. ANEXOS
Não se aplica.
236
Código POP POP_ENT_LB_006_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT) para cultura de Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT) para cultura de
Trypanosoma cruzi.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa clinica e diagnóstico laboratorial de rotina.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_001_v02_PT: Procedimento da hemocultura para o diagnóstico da doença de Chagas
em meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
POP_ENT_LB_004_v02_PT: Procedimento da xenocultura para isolamento de estoques de
Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_016_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Bastão de vidro
6.1.2 Membranas para filtração 1,2 mm, 0,45 mm e 0,2 mm, não estéreis
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
237
Código POP POP_ENT_LB_006_v02_PT Página 2/3
6.1.3 Garrafas estéreis
6.1.4 Pipetas tipo Pasteur
6.1.5 Proveta de 1 L
6.1.6 Proveta de 100 mL
6.1.7 Pipetas de vidro
6.1.8 Tubos com tampa de rosca
6.1.9 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Balança de precisão
6.2.2 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Potenciômetro
6.2.4 Agitador
6.2.5 Geladeira
6.2.6 Destilador
6.2.7 Freezer
6.3 Reagentes, meios e soluções:
Reagente Quantidade
NaHPO4.7H20 11,6 g
NaCl 4 g
KCl 0,4 g
Glicose 2,2 g
Triptose 5 g
Caldo de infuso de fígado 5 g
Extrato de levedura 15 g
Hemina 25 mg/20 mL Tris Base 0,1 N
Soro fetal bovino 100 mL
Penicilina 200.000 U
Estreptomicina/gentamicina 50 mg
H2O qsp 1.000 mL
7. PROCEDIMENTOS (2,3)
7.1 Preparo do meio
7.1.1 Dissolver as substâncias, sob agitação, em aproximadamente 850 mL de H2O destilada.
7.1.2 Ajustar o pH para 7,2-7,5 com HCl.
7.1.3 Adicionar o soro fetal bovino.
7.1.4 Completar o volume para 1.000 mL.
238
Código POP POP_ENT_LB_006_v02_PT Página 3/3
7.1.5 Inativar todo o meio a 68°C por 60 minutos.
7.1.6 Filtrar sucessivamente, com membranas de 1,2 mm, 0,45 mm e 0,2 mm (não estéreis).
7.1.7 Filtrar com membrana estéril de 0,2 mm.
7.1.8 Distribuir o meio em garrafas estéreis.
7.2 Armazenamento
7.2.1 Manter à 4°C (caso for utilizado dentro de duas semanas) ou congelar a -20°C por até seis
meses.
7.3 Controle de esterilidade
7.3.1 Recolher duas alíquotas em tubos com roscas, deixando um à temperatura ambiente e outro na
geladeira.
7.3.1 Observar a formação de precipitados e turvação, indicativos de contaminação..
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de assepsia total (em câmara de fluxo
laminar) (1).
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Barbosa HS. Manutenção e obtenção de diferentes estágios evolutivos em laboratório. In: Araújo-
Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de Janeiro:
Editora FIOCRUZ 2000, p. 184-95.
2. Camargo EP. Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic trypanosomes
in liquid media. Rev Inst Med Trop São Paulo 1964; 6:93-100.
3. Yaeger RG. A method of isolating trypanosomes from blood. J Parasitol 1960; 46:288.
10. ANEXOS
Não se aplica.
239
Código POP POP_ENT_LB_007_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN) para cultura de Leishmania sp. e Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN) para cultura de
Leishmania sp. Trypanosoma cruzi (1,2).
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e diagnóstico laboratorial de rotina.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_002_v02_PT: Procedimento da hemocultura para o diagnóstico da doença de Chagas
em meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
POP_ENT_LB_004_v02_PT: Procedimento da xenocultura para isolamento de estoques de
Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_017_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Pipetas sorológicas de 10 mL
6.1.2 Tubos de ensaio com tampa de rosca
6.1.3 Balão de fundo chato
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
240
Código POP POP_ENT_LB_007_v02_PT Página 2/3
6.1.4 Proveta graduada de 1L
6.1.5 Erlenmayer de 125 mL
6.1.6 Pérolas de vidro
6.1.4 Dispensador automático
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Destilador
6.2.2 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Banho-maria
6.2.4 Geladeira
6.2.5 Autoclave
6.2.6 Balança de precisão
6.2.7 Agitador magnético
6.2.8 Forno de Pasteur
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 BHI (Brain and Heart Infusion Agar) ágar (Sigma P7278)
6.3.2 Penicilina G potássica (100 UI/mL) – Estreptomicina (100 µg/mL)
6.3.3 Água destilada q.s.p. 1L
6.3.4 Sangue estéril e desfibrinado de coelho obtido da Gerência de Ofidismo da Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas.
7. PROCEDIMENTOS (3,4)
7.1 Preparo das vidrarias
7.1.1 Esterilizar os tubos de ensaio com tampas rosqueáveis, erlenmeyers e as provetas por
autoclavação por 30 min a 121ºC. 7.1.2 Secar a vidraria por dois dias no forno de Pasteur.
7.2 Preparo do sangue de coelho
7.2.1 Cobrir o fundo de um erlenmeyer de 125 mL com pérolas de vidro com 2 a 3 mm de diâmetro.
7.2.2 Autoclavar por 30 min a 121ºC e secar em forno de Pasteur.
7.2.3 Colher assepticamente, por punção cardíaca, sangue do coelho.
7.2.4 Transferir imediatamente o sangue para um erlenmeyer estéril com as pérolas de vidro.
7.2.5 Desfibrinar por 10 min o sangue pela agitação contínua por meio de movimentos circulares.
7.2.6 Adicionar ao sangue 0,75 mL de penicilina – estreptomicina para cada 40 mL de sangue.
7.2.7 Manter o sangue sob agitação até a incorporação do meio.
241
Código POP POP_ENT_LB_007_v02_PT Página 3/3
7.3 Meio básico
7.3.1 Pesar 52 g de BHI.
7.3.2 Colocar o BHI num balão de fundo chato.
7.3.3 Adicionar 1 L de água destilada.
7.3.4 Autoclavar por 15 min a 121ºC.
7.3.5 Resfriar em banho-maria a 40ºC.
7.3.6 Adicionar 100 mL de sangue de coelho desfibrinado e estéril.
7.3.7 Manter o meio a 40ºC em banho-maria controlado.
7.3.8 Transferir o meio para os tubos de ensaio com tampa de rosca com o auxílio de dispensador
automático.
7.3.9 Manter os tubos inclinados a 45 graus até a solidificação do meio.
7.3.10 Deixar em teste de esterilidade por 2 dias.
7.3.11 Armazenar na geladeira a 4ºC por até 30 dias.
7.4 Meio completo
7.4.1 No momento do uso, deixar os tubos com ágar (meio básico) à temperatura ambiente até
estabilização da temperatura.
7.4.2 Adicionar aos tubos com NNN suficiente quantidade de meio LIT contendo 10% de soro bovino
fetal e 140 mg/mL de gentamicina para cobrir o bisel de ágar sangue.
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Miles MA, Póvoa MM, Souza AA, Lainson R, Shaw JJ, Ketteridge DS. Chagas‟ disease in the
Amazon Basin. II. Distribution of Trypanosoma cruzi zymodemes 1 and 3 in Pará State, north Brazil.
Trans R Soc Trop Med Hyg 1981; 75, 667-74.
2. Steindel M, Grisard EC. Cultivo de Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rangeli e Leishmania spp. In:
De Carli GA. Parasitologia Clínica: Seleção de Métodos e Técnicas de Laboratório para o Diagnóstico
das Parasitoses Humanas. 2ed. São Paulo: Atheneu 2007; p. 455-64.
10. ANEXOS
Não se aplica.
242
Código POP POP_ENT_LB_008_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento de isolamento de estoques de Trypanosoma cruzi por inoculação em camundongo.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento de isolamento de estoques de Trypanosoma cruzi por inoculação em
camundongo.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e diagnóstico laboratorial.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_016_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
POP_ENT_LB_017_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Amostra de sangue humano ou de reservatório a ser testado ou amostra de conteúdo intestinal
de triatomíneo a ser testada
6.1.2 Seringa de 1 mL com agulha 13 x 4,5
6.1.3 Algodão embebido em álcool a 70%
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
243
Código POP POP_ENT_LB_008_v02_PT Página 2/3
6.1.4 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.5 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.6 Frasco lavador com álcool 70%
6.1.7 Gaiolas e outros materiais necessários para a manutenção dos animais
6.1.8 Adaptador de plástico para tubo de coleta a vácuo
6.1.9 Tubos para coleta a vácuo com anticoagulante
6.1.10 Garrote
6.1.11 Vidro relógio
6.1.12 Pinça
6.1.13 Tesoura pequena
6.1.14 Pipetas tipo Pasteur
6.1.15 Bastão de vidro
6.2 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Solução salina estéril adicionada de antibiótico (NaCl 0.85% + 140 mg/mL de gentamicina).
7. PROCEDIMENTOS
7.1 Obtenção do sangue a ser testado
7.1.1 Coletar, por punção venosa, em condições assépticas, 10 mL de sangue de cada indivíduo,
com tubos de coleta a vácuo contendo anticoagulante.
7.2 Obtenção da amostra de conteúdo intestinal de triatomíneo a ser testada
7.2.1 Recortar a cutícula em torno da ampola retal do inseto, retirando a mesma e repousando em um
vidro relógio contendo solução salina estéril adicionada de antibiótico (NaCl 0.85% + 140 mg/mL de
gentamicina).
7.2.2 Romper o tubo digestivo com auxílio de uma pipeta de Pasteur estéril.
7.2.3 Recolher o material no vidro relógio.
7.3 Inoculação dos camundongos
7.3.1 Com a seringa de 1 mL, inocular em cada camundongo cerca de 200 µL da amostra de sangue
humano ou de reservatório a ser testado ou amostra de conteúdo intestinal de triatomíneo a ser
testada, por via intraperitoneal.
7.4 Período e forma de leitura
7.4.1 Realizar a leitura por meio de exame de sangue a fresco, conforme
POP_ENT_LB_0015_v02_PT (Procedimento para o exame a fresco e determinação da parasitemia
direta em camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi (Método de Pizzi-Brener)).
244
Código POP POP_ENT_LB_008_v02_PT Página 3/3
7.5 Isolamento do estoque de Trypanosoma cruzi
7.5.1 Realizar o isolamento dos estoques de Trypanosoma cruzi por meio de hemocultura, conforme
os seguintes procedimentos:
POP_ENT_LB_016_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
POP_ENT_LB_017_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Este tipo de procedimento deverá ser submetido às Comissões de Ética que regulamentam os
procedimentos que envolvem o uso de animais em laboratório, indicando a adequação destes às
normas vigentes.
O procedimento requer espaço adequado para a manutenção dos camundongos.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
10. ANEXOS
Não se aplica.
245
Código POP POP_ENT_LB_009_v02_PT Página ¼
Título Procedimento para criopreservação de estoques de Trypanosoma cruzi em nitrogênio líquido (- 196 ºC).
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para criopreservação de estoques de Trypanosoma cruzi em nitrogênio
líquido (- 196 ºC).
2. DEFINIÇÕES
Criopreservação: Conservação de material biológico a temperaturas ultrabaixas, geralmente em
nitrogênio líquido a - 196oC, ou em sua fase de vapor a - 150°C (2).
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e a procedimentos de rotina para preservação de células e
tecidos.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
para cultura de Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_010_v02_PT: Procedimento para descongelamento de estoques de Trypanosoma
cruzi criopreservadas em nitrogênio líquido (- 196 ºC).
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Pipetador automático
6.1.2 Pipetas automáticas
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
246
Código POP POP_ENT_LB_009_v02_PT Página 2/4
6.1.3 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.4 Pipetas sorológicas plásticas
6.1.5 Garrafas de cultura celular de 25 cm3
6.1.6 Câmara de Neubauer
6.1.7 Tubos tipo Eppendorff
6.1.8 Tubos para criopreservação
6.1.9 Tubo cônico com tampa de rosca para centrífuga
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Freezer
6.2.2 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Container de nitrogênio líquido
6.2.4 Centrífuga refrigerada
6.2.5 Microscópio ótico
6.2.6 Autoclave
6.2.7 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
Vide POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose
(LIT) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6.3.2 Nitrogênio líquido (N2)
6.3.3 Gelo seco
6.3.4 Solução de criopreservação
6.3.4.1 Fórmula:
Reagente Quantidade
Soro fetal bovino 30 mL
Glicerol estéril1
8 mL
Meio LIT2
62 mL
1 Esterilizado por autoclavação (30 min/121
oC)
2 Vide POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose
(LIT) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6.3.4.2 Preparação:
Adicionar, com o auxílio de um pipetador automático, os reagentes em uma garrafa estéril, própria
para o armazenamento de soluções.
Homogeneizar a solução e deixar a mistura por 20 min à temperatura ambiente.
Armazenar a solução em freezer a uma temperatura de – 20oC.
247
Código POP POP_ENT_LB_009_v02_PT Página 3/4
6.4 Equipamentos de proteção individuais especiais:
6.4.1 Máscara de proteção para criopreservação
6.4.2 Luvas para manipulação de material de criopreservação
7. PROCEDIMENTOS
7.1 Etapa 1
7.1.1 Transferir para garrafas plásticas próprias para cultivo de células de 25 cm
3 o material de cultura
a ser criopreservado, com o auxílio de um pipetador automático, utilizando pipetas volumétricas
plásticas descartáveis, para que se obtenha massa celular suficiente para o procedimento de
criogenia.
7.1.2 Adicionar às garrafas meio de cultivo LIT na proporção de uma parte de material em cultura
para três partes de meio fresco.
7.1.3 Acondicionar o material por 48 h em estufa BOD por 28oC.
7.1.4 Após as 48 h de incubação, fazer uma lâmina com uma gota do material a ser criopreservado
para avaliação microscópica de possíveis contaminantes biológicos.
7.1.5 Após a observação, retirar todo o conteúdo das garrafas de cultura, com o auxílio de um
pipetador automático e transferir para um tubo cônico de centrífuga.
7.1.6 Centrifugar o material a 4.000 rpm por 10 min a 4oC.
7.1.7 Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 mL de meio LIT.
7.1.8 Fazer diluição de 1/100 em eppendorf para realização da contagem de parasitos.
7.1.9 Colocar 10 µL da solução diluída na câmara de Neubauer e realizar a contagem em microscópio
ótico.
7.1.10 Fazer o cálculo para se obter a concentração de 5 x 107 parasitas/mL.
7.1.11 Retirar da solução a quantidade necessária de parasitas para o volume final de 1,5 mL por
tubo de criopreservação.
7.1.12 Transferir para um tubo cônico e centrifugar a 4.000 rpm por 10 min a 4oC.
7.1.13 Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento no volume necessário de solução de
criopreservação.
7.1.14 Transferir o material para os tubos de criopreservação e iniciar imediatamente o procedimento
de congelamento.
7.2 Etapa 2
7.2.1 Os tubos de criopreservação contendo as amostras a serem criopreservadas devem ser
colocados por 1 h no congelador na temperatura de – 20oC.
7.2.2 Após esse período, as amostras são colocadas por 2 h no freezer – 70oC ou em caixa de isopor
contendo gelo seco.
7.2.3 Transferir as amostras para container de nitrogênio líquido.
248
Código POP POP_ENT_LB_009_v02_PT Página 4/4
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
O nível de nitrogênio líquido no conteiner deve ser monitorado rigorosamente.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Kartha KK. Meristem culture and germplasm preservation. In: Kartha KK. Cryopreservation of plant
cells and organs. Boca Raton: CRC Press, 1985; p.115-134.
10. ANEXOS
Não se aplica.
249
Código POP POP_ENT_LB_010_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento para descongelamento de estoques de Trypanosoma cruzi criopreservadas em nitrogênio líquido (- 196 ºC).
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para descongelamento de estoques de Trypanosoma cruzi
criopreservadas em nitrogênio líquido (- 196 ºC).
2. DEFINIÇÕES
Criopreservação: Conservação de material biológico a temperaturas ultrabaixas, geralmente em
nitrogênio líquido a - 196oC, ou em sua fase de vapor a - 150°C (2).
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e a procedimentos de rotina para preservação de células e
tecidos.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
para cultura de Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_009_v02_PT Procedimento para criopreservação de estoques de Trypanosoma cruzi
em nitrogênio líquido (- 196 ºC).
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Pipetas Pasteur de vidro com bulbo de látex
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
250
Código POP POP_ENT_LB_010_v02_PT Página 2/3
6.1.2 Lâminas
6.1.3 Lamínulas
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Banho-maria
6.2.2 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Microscópio ótico
6.2.6 Autoclave
6.2.7 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
Vide POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose
(LIT) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6.3.2 Meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN)
POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. Trypanosoma cruzi.
6.4 Equipamentos de proteção individuais especiais:
6.4.1 Máscara de proteção para criopreservação
6.4.2 Luvas para manipulação de material de criopreservação
7. PROCEDIMENTOS
7.1 Descongelamento:
7.1.1 Retirar os tubos com meios de cultura (LIT ou NNN) previamente da geladeira e deixar à
temperatura ambiente até estabilização.
7.1.2 Retirar o tubo de criopreservação com a amostra do container de nitrogênio líquido.
7.1.3 Levar o tubo com a mostra imediatamente para o banho-maria a 37oC até o completo
descongelamento.
7.1.4 Para a prova de congelamento: Com o auxílio de uma pipeta Pasteur encaixada no bulbo de
látex, retirar uma gota do conteúdo do tubo de criopreservação e colocar sobre uma lâmina seca e
limpa.
7.1.5 Colocar uma lamínula sobre a gota de cultura e observar a viabilidade da amostra ao
microscópio ótico.
7.1.6 Para a prova de crescimento: Retirar o conteúdo do tubo de criopreservação e transferir para
o tubo com meio de cultura escolhido.
7.1.7 Incubar as amostras inoculadas em estufa BOD à 28oC.
7.1.8 Observar periodicamente as culturas, para observar a viabilidade celular das mesmas.
7.1.9 Repicar a cultura quando o crescimento chegar à fase ideal.
251
Código POP POP_ENT_LB_010_v02_PT Página 3/3
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Kartha KK. Meristem culture and germplasm preservation. In: Kartha KK. Cryopreservation of plant
cells and organs. Boca Raton: CRC Press, 1985; p.115-134.
10. ANEXOS
Não se aplica.
252
Código POP POP_ENT_LB_011_v02_PT Página ¼
Título Procedimento para manutenção das amostras em culturas acelulares e obtenção de tripomastigotas de culturas de Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para manutenção das amostras em culturas acelulares e obtenção de
tripomastigotas de culturas de Trypanosoma cruzi.
2. DEFINIÇÕES
Tripomastigotas: formas flageladas de Trypanosoma cruzi encontradas no sangue periférico dos
mamíferos, de onde podem ser fagocitados ou invadir os mais variados tipos de células dos
hospedeiros, especialmente as do sistema fagocítico mononuclear, fibras musculares estriadas, tanto
cardíacas como esqueléticas, fibras musculares lisas e células nervosas. O núcleo destas formas
ocupa o segmento médio do corpo celular, entre o cinetoplasto e o flagelo. É a forma infectante para
os triatomíneos, quando estes sugam o sangue do hospedeiro vertebrado. Nos trabalhos de infecção
experimental, são utilizadas como formas infectantes. Estas formas, em conjunto com as formas
epimastigotas, podem aparecer nos meios de cultura acelulares convencionais utilizados para a
cultura de Trypanosoma cruzi.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e diagnóstico laboratorial de rotina.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
para cultura de Trypanosoma cruzi.
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
253
Código POP POP_ENT_LB_011_v02_PT Página 2/4
POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. Trypanosoma cruzi.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Erlenmayer de 250 mL
6.1.2 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.3 Pipetas Pasteur de vidro
6.1.4 Bulbos de látex
6.1.5 Lâminas para microscopia
6.1.6 Lamínulas para microscopia
6.1.7 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.8 Câmara de Neubauer
6.1.9 Ponteiras descartáveis de 10 µL em suporte apropriado
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Câmara de fluxo laminar
6.2.2 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.2.3 Microscópio ótico comum
6.2.4 Geladeira
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
Vide POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose
(LIT) para cultura de Trypanosoma cruzi.
6.3.2 Meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN)
Vide POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. Trypanosoma cruzi.
7. PROCEDIMENTOS (3,4)
7.1 Manutenção de amostras
7.1.1 Retirar o meio de cultura escolhido previamente da geladeira, para que sejam utilizados em
temperatura ambiente.
7.1.2 Com o auxílio de uma pipeta Pasteur encaixada ao bulbo de látex, deve ser retirada uma gota
da amostra a ser mantida no laboratório e colocá-la sobre uma lâmina de vidro própria para
microscopia.
254
Código POP POP_ENT_LB_011_v02_PT Página ¾
7.1.3 Uma lamínula de vidro deve ser colocada sobre a gota de cultura para que possas ser avaliada
a viabilidade celular da amostra recebida através de observação por microscopia ótica, com o auxílio
de um microscópio ótico.
7.1.4 Após a avaliação da viabilidade celular, as amostras a serem mantidas no laboratório são
transferidas para um tubo de ensaio contendo meio de cultura, sempre em proporção de 1 para 3.
7.1.5 As amostras são então armazenadas em estufa incubadora BOD a 28oC, por um período de 7
dias.
7.1.6 A manutenção das amostras é realizada por passagens seriadas a cada sete dias, seguindo
sempre o procedimento descrito acima, até a liberação dos resultados dos ensaios realizados.
7.2 Obtenção de tripomastigotas em meio LIT (2)
7.2.1 O inóculo inicial em meio LIT deve ser cerca de 7,5 x 106 parasitos/mL de meio.
7.2.2 As culturas de T. cruzi são mantidas de 26-28°C.
7.2.3 Quando a cultura atinge sua fase final de crescimento exponencial, em torno de 72-96 horas, o
número de tripomastigotas metacíclicos aumenta alcançando seu nível mais alto, com 3-4 x 107
parasitos/mL.
7.2.4 Quando a cultura atingir a fase estacionária tardia, onde ocorre maior porcentagem de
tripomastigotas, levar a cultura para uma câmara de fluxo laminar, coletando-se 3 mL de material.
7.2.5 Centrifugar o material a 1.000 rpm por cinco minutos.
7.2.6 Coletar 4 gotas do sedimento, com o auxílio de uma pipeta Pasteur de vidro, colocando-as
sobre uma lâmina.
7.2.7 Fixar com álcool metílico.
7.2.8 Corar por Giemsa (3):
Pingar uma gota da cultura em uma lâmina para microscopia e espalhar (usar pipeta Pasteur de
plástico);
Secar ao ar;
Depois de seca, cobrir a lâmina com metanol por 1 a 3 minutos;
Secar ao ar;
Enquanto a lâmina seca, montar o corante de Giemsa: para cada 1 mL de água adicionar 2 gotas de
corante Giemsa (para cada lâmina necessita-se de 3 mL de preparado);
Cobrir toda a lâmina com o preparado (sem formar bolha) por 20 minutos;
Secar ao ar.
7.2.9 Ao microscópio ótico, sob objetiva de 100x, determinar a porcentagem de tripomastigotas.
7.2.10 Em câmara de Neubauer, realizar a contagem global dos parasitos, nos quatro quadrantes
externos, multiplicando o valor encontrado por 106.
7.2.11 Subtrair o percentual de epimastigotas encontrado e padronizar o inóculo por diluição ou
centrifugação se necessário.
255
Código POP POP_ENT_LB_011_v02_PT Página 4/4
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Camargo EP. Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic trypanosomes
in liquid media. Rev Inst Med Trop São Paulo 1964; 6:93-100.
3. Rosenfeld G. Corante pancrômico para hematologia e citologia clínica. Nova combinação dos
componentes do May-Grunwald e do Giemsa num só corante de emprego rápido. Mem Inst Butantan
1947; 20:329-34.
10. ANEXOS
Não se aplica.
256
Código POP POP_ENT_LB_012_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento para a obtenção de tripomastigotas sanguíneos de Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o para a obtenção de tripomastigotas sanguíneos de Trypanosoma cruzi.
2. DEFINIÇÕES
Tripomastigotas sanguíneos: formas flageladas de Trypanosoma cruzi encontradas no sangue
periférico dos mamíferos, de onde podem ser fagocitados ou invadir os mais variados tipos de células
dos hospedeiros, especialmente as do sistema fagocítico mononuclear, fibras musculares estriadas,
tanto cardíacas quanto esqueléticas, fibras musculares lisas e células nervosas. O núcleo destas
formas ocupa o segmento médio do corpo celular, entre o cinetoplasto e o flagelo. É a forma
infectante para os triatomíneos, quando estes sugam o sangue do hospedeiro vertebrado. Nos
trabalhos de infecção experimental, são utilizadas como formas infectantes.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_011_v02_PT: Procedimento para obtenção de tripomastigotas de culturas de
Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_022_v02_PT: Procedimento de inoculação de estoques de Trypanosoma cruzi em
camundongos para caracterização biológica.
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
257
Código POP POP_ENT_LB_012_v02_PT Página 2/3
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Câmara anestésica com éter
6.1.2 Placa de cortiça
6.1.3 Agulhas
6.1.4 Heparina
6.1.5 Frasco lavador com álcool 70%
6.1.6 Seringas de 1 mL
6.1.7 Algodão ou gaze
6.1.8 Álcool a 70%
6.1.9 Pipeta Pasteur de vidro
6.1.10 Borracha de sucção para pipeta Pasteur de vidro
6.1.12 Micropipetas para 5 µL
6.1.13 Ponteiras descartáveis
6.1.14 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.15 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Câmara de fluxo laminar
6.2.2 Microscópio ótico comum
7. PROCEDIMENTOS (3,4)
7.1 Método:
7.1.1 Grupo de manutenção: inocular por via intraperitoneal um grupo de camundongos Balb/C com
aproximadamente 0,3 mL de cultura em meio LIT rica em tripomastigotas.
Para a obtenção de tripomastigotas de cultura vide POP_ENT_LB_011_v02_PT (Procedimento para
manutenção das amostras em culturas acelulares e obtenção de tripomastigotas de culturas de
Trypanosoma cruzi).
7.1.2 Acompanhar diariamente o grupo de manutenção por meio de exame de sangue a fresco para a
verificação da infecção e determinação da parasitemia.
Vide POP_ENT_LB_0015_v02_PT (Procedimento para o exame a fresco e determinação da
parasitemia direta em camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi (Método de Pizzi-Brener)).
7.1.3 Quando a parasitemia se tornar patente, ou de preferência no pico de parasitemia (para as
cepas já estudadas), obter o sangue do grupo manutenção por punção do plexo venoso retro-
orbitário, utilizando uma gota de heparina como anticoagulante.
Vide POP_ENT_LB_018_v02_PT (Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-
orbitário).
258
Código POP POP_ENT_LB_012_v02_PT Página 3/3
7.1.4 Examinar 5 µL entre lâmina e lamínula ao microscópio ótico para a determinação da parasitemia
pelo Método de Pizzi-Brener.
Vide POP_ENT_LB_0015_v02_PT (Procedimento para o exame a fresco e determinação da
parasitemia direta em camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi (Método de Pizzi-Brener)).
7.1.5 Padronizar o inóculo, diluindo em meio LIT ou centrifugando para concentração se necessário.
7.1.6 Inocular o grupo experimental por via intraperitoneal.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Barbosa HS. Manutenção e obtenção de diferentes estágios evolutivos em laboratório. In: Araújo-
Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de Janeiro:
Editora FIOCRUZ 2000, p. 184-95.
3. Rey L. Parasitologia. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan 2008; 883 p.
10. ANEXOS
Não se aplica.
259
Código POP POP_ENT_LB_014_v02_PT Página 1/2
Título Procedimento para avaliação dos parâmetros populacionais de mortalidade em camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever a avaliação dos parâmetros populacionais de mortalidade em camundongos infectados
pelo Trypanosoma cruzi.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_013_v02_PT: Procedimento da avaliação da infecciosidade de estoques de
Trypanosoma cruzi em camundongos.
POP_ENT_LB_022_v02_PT: Procedimento de inoculação de estoques de Trypanosoma cruzi em
camundongos para caracterização biológica.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Gaiolas para criação de camundongos
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
260
Código POP POP_ENT_LB_014_v02_PT Página 2/2
7. PROCEDIMENTOS (2)
7.1 Mortalidade cumulativa
7.1.1 Inocular os camundongos com o estoque de Trypanosoma cruzi a ser caracterizado.
Vide POP_ENT_LB_022_v02_PT: Procedimento de inoculação de estoques de Trypanosoma cruzi
em camundongos para caracterização biológica.
7.1.2 Observar diariamente quantos animais morrem após a infecção.
7.1.3 Confeccionar uma planilha com a data da morte e o número de que morreram.
7.1.4 Calcular o percentual do número total de animais com os quais o experimento foi iniciado,
excluindo aqueles que tiverem apresentado alguma alteração nos parâmetros de higidez (avaliação
hematológicas anormais, especialmente indicativas de infecções bacterianas) ou problemas
dermatológicos detectáveis.
7.1.5 Calcular o dia em que morreram 50% dos animais de experimentação (M50).
7.1.6 Construir curvas de sobrevida, comparando-se os diferentes grupos de experimentação, se for o
caso.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
A avaliação requer a avaliação diária dos animais, incluindo avaliação da higidez dos mesmos.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Castro SL, Araújo-Jorge TC, Rivera MT, L, Junqueira ACV. Avaliação de parâmetros
parasitológicos e de mortalidade. In: Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para
experimentação animal. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 219-36.
10. ANEXOS
Não se aplica.
261
Código POP POP_ENT_LB_015_v02_PT Página 1/4
Título Procedimento para o exame a fresco e determinação da parasitemia em camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi (Método de Pizzi-Brener).
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para o exame de sangue a fresco e determinação da parasitemia em
camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_0019_v02_PT: Procedimento para sangria de camundongos pela cauda.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Caixa de contenção do animal
6.1.2 Tesoura de ponta fina e afiada
6.1.3 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.4 Micropipeta para 5 µL
6.1.5 Placa de Petri com tampa
6.1.6 Fósforos
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
262
Código POP POP_ENT_LB_015_v02_PT Página 2/4
6.1.7 Algodão embebido em álcool a 70%
6.1.8 Lâminas para microscopia (ou câmara de Neubauer)
6.1.9 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm
6.1.10 Solução de lise de hemácias: cloreto de amônia a 0,85% em água destilada
6.1.11 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.12 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.13 Frasco lavador com álcool 70%
6.1.14 Lâmina micrométrica
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Microscópio ótico comum
7. PROCEDIMENTOS (2,3)
7.1 Método de Pizzi-Brener
7.1.1 Colocar o camundongo infectado na caixa de retenção, com a cauda para fora.
7.1.2 Com uma das mãos, massagear a cauda no sentido da base para a ponta e segurar na ponta.
7.1.3 Com a tesoura na outra mão, cortar 1 mm ou menos da ponta da cauda deixando o sangue
correr formando uma gota. Sobre a placa de Petri, colocar a primeira gota, que será desprezada (ou
utilizada para a confecção de um esfregaço), e colocar a seu lado a segunda gota. Manter a cauda do
camundongo segura até que seja cauterizada.
7.1.4 Deixar a tesoura sobre algodão embebido em álcool 70% e pegar a micropipeta com ponteira
para 5 µL.
7.1.5 Tomar 5 µL da segunda gota que está sobre a placa de Petri e depositar sobre a lâmina e
desprezar a ponteira na cuba apropriada. Imediatamente recobrir com a lamínula, deixando espalhar
completamente o sangue sem qualquer pressão. Se o espalhamento não ficar bom, repetir o
procedimento em outra lâmina.
7.1.6 Acender o fósforo e tocar com a base da chama no ponto de corte da cauda do animal até
cauterizar.
7.1.7 Soltar o camundongo e desprezar o fósforo utilizado.
7.1.8 Levar a lâmina ao microscópio, sob objetiva de 40x, e contar o número de parasitas móveis em
50 campos aleatoriamente observados, cobrindo toda a área da lamínula.
7.1.9 No caso do exame de sangue a fresco para avaliação da infectividade, o resultado é expresso
como positivo ou negativo.
7.1.10 Calcular o número de parasitas por mL de sangue de acordo com o procedimento descrito no
Item 7.2.
7.1.11 No caso de parasitemias muito altas, pode ser feita uma diluição inicial em solução de lise.
Nesse caso, deve-se preparar um tubo com o volume apropriado de solução de lise: 20 µL ou 45 µL,
respectivamente para uma diluição de 1/5 ou 1/10 (para 5 µL de sangue).
263
Código POP POP_ENT_LB_015_v02_PT Página 3/4
Obs: pode-se utilizar câmaras de Neubauer para a contagem. Nesse caso encher a câmara com o
sangue diluído e hemolisado, contar os quatro quadrantes, calcular a média do número de parasitas
por quadrante e multiplicar pelo fator da câmara (104).
7.2 Cálculo do fator de correção e da parasitemia
7.2.1 Medir o diâmetro (d) do campo microscópico com o qual se vai fazer as contagens. Utilizar para
isso uma lâmina micrométrica colocada na platina do microscópio.
7.2.2 Calcular a área de um campo microscópico observado:
Área do campo observado (Ac) = πr2 mm
2
exemplo
d = X mm
r = d/2 mm
0,42 mm
0,21 mm
Ac = 0,138474 mm2
π = 3,14
7.2.3 Calcular a concentração de parasitas no sangue (usar fator de correção): por exemplo, para a
lamínula de 20 x 20 mm sob objetiva cujo campo microscópico mede 0,42 mm de diâmetro.
Sendo n = número de parasitas contados em 50 campos, calcular sucessivamente:
i) n' = número de parasitas em 1 campo (Ac = 0,138474 mm2) (n‟ = n/50)
ii) n’’ = número de parasitas em toda a lamínula (Área da lamínula = 20 mm x 20 mm = 400
mm2)
n’’ = n’ x (400/0,138474) = n’ x 2888,6289 = n’ x 2,89 x 103
Obs: n‟‟ corresponde ao número total de parasitas na lamínula em um volume de 5 µL.
iii) n’’’ = concentração de parasitas, isto é, número de parasitas em 1.000 µL (como temos o
número em 5 µL, deve-se multiplicar por 200)
n’’’ = n’’ x 200 = n’ x 2,89 x 103 x 200 = n’ x 57,8 x 10
4
iv) assim, o fator 57,8 x 104 (só válido para aquele microscópio, com a mesma objetiva, para a
lamínula de 20 mm x 20 mm e para um volume de sangue de 5 µL.
v) desta forma, basta multiplicar o número de parasitas/campo por 57,8 e já se obterá a
concentração de parasitas no sangue expressa em 104 parasitas/mL
vi) se a amostra de sangue tiver sido diluída, multiplicar ainda pela diluição.
7.3 Construção da curva de parasitemia
7.3.1 Inocular os camundongos com o estoque de Trypanosoma cruzi a ser caracterizado.
Vide POP_ENT_LB_022_v02_PT: Procedimento de inoculação de estoques de Trypanosoma cruzi
em camundongos para caracterização biológica.
7.3.2 Observar diariamente a parasitemia do grupo de camundongos inoculado com o estoque ou
isolado.
7.3.3 Calcular a parasitemia diária média.
7.3.4 Confeccionar uma planilha com as parasitemias diárias médias.
264
Código POP POP_ENT_LB_015_v02_PT Página 4/4
7.3.5 Criar um gráfico de linhas relacionando o dia de infecção com a parasitemia diária média.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Algumas cepas podem não produzir parasitemias patentes, dada a baixa sensibilidade das técnicas
parasitológicas diretas.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Castro SL, Araújo-Jorge TC, Rivera MT, L, Junqueira ACV. Avaliação de parâmetros
parasitológicos e de mortalidade. In: Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para
experimentação animal. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 219-36.
3. Pizzi T, Agosin M, Christen R, Hoecker G, Negme A. Influencia de la constitución genética em la
resistência de la laucha a la infección experimental por Trypanosoma cruzi. Biologica 1998; 8: 43-53.
10. ANEXOS
Não se aplica.
265
Código POP POP_ENT_LB_016_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo Trypanosoma cruzi em
camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
2. DEFINIÇÕES
Hemocultura: Método parasitológico indireto que permite a multiplicação dos parasitos em meios
artificiais aumentando a sensibilidade do diagnóstico.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
para cultura de Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Micropipeta para 10 µL
6.1.2 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
266
Código POP POP_ENT_LB_016_v02_PT Página 2/3
6.1.3 Pipetas tipo Pasteur de vidro com bulbo de látex
6.1.4 Lâminas para microscopia
6.1.5 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm
6.1.6 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.7 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.8 Frasco lavador com álcool 70%
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.2.4 Microscópio ótico comum
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
Vide POP_ENT_LB_006_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio Liver Infusion Tryptose
(LIT) para cultura de Trypanosoma cruzi.
7. PROCEDIMENTOS (3,4)
7.1 Obtenção do sangue do camundongo
7.1.1 Vide:
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
7.1.2 No mesmo dia da coleta, o volume de sangue obtido deverá ser centrifugado a 2.500 rpm por
15 min.
7.2 Processo de cultura
Este procedimento deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo laminar, para evitar
contaminação.
7.2.1 Após a centrifugação do sangue, retirar o plasma, que pode ser aproveitado para sorologia, e
adicionar à camada de hemácias e leucócitos igual quantidade de meio LIT.
7.2.2 Promover uma nova centrifugação a 2.500 rpm por 20 min.
7.2.3 Remover o sobrenadante e distribuir o sedimento em 3 tubos, contendo 2 mL de LIT.
7.2.4 Transferir os tubos semeados para uma estufa B.O.D. regulada a 28ºC.
7.2.5 Homogeneizar os tubos uma vez por semana.
7.3 Período e forma de leitura
7.3.1 Realizar a leitura retirando-se alíquotas de 10 µL da suspensão de cada tubo e examinando-as
em intervalos de 15 dias até um total de 2 meses após o cultivo, entre lâmina e lamínula, ao
microscópio ótico com aumento de 400x.
267
Código POP POP_ENT_LB_016_v02_PT Página 3/3
7.3.2 Após a última leitura, os tubos que permanecerem negativos devem ser centrifugados a 2.500
rpm por 15 min para que o sedimento seja reexaminado (2).
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Embora apresente alta especificidade, a sensibilidade da hemocultura, baseada em apenas um
exame, varia de 40% a 50%, sendo mais baixa na fase crônica da doença de Chagas (4).
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Bronfen E, de Assis Rocha FS, Machado GB, Perillo MM, Romanha AJ, Chiari E. Isolation of
Trypanosoma cruzi samples by xenodiagnosis and hemoculture from patients with chronic Chagas‟
disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 1989; 84:237-40.
3. Camargo EP. Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic trypanosomes
in liquid media. Rev Inst Med Trop São Paulo 1964; 6:93-100.
4. Filardi L, Brener Z. Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma cruzi strains to drugs used
clinically in Chagas‟ disease. Trans R Soc Trop Med Hyg 1987; 81:755-9.
10. ANEXOS
Não se aplica.
268
Código POP POP_ENT_LB_017_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo Trypanosoma cruzi em
camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
2. DEFINIÇÕES
Hemocultura: Método parasitológico indireto que permite a multiplicação dos parasitos em meios
artificiais aumentando a sensibilidade do diagnóstico.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_007_v02_PT Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Leishmania sp. e Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Micropipeta para 10 µL
6.1.2 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
269
Código POP POP_ENT_LB_017_v02_PT Página 2/3
6.1.3 Pipetas tipo Pasteur de vidro com bulbo de látex
6.1.4 Lâminas para microscopia
6.1.5 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm
6.1.6 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.7 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.8 Frasco lavador com álcool 70%
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC
6.2.4 Microscópio ótico comum
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN)
Vide POP_ENT_LB_007_v02_PT: Procedimento para a preparação do meio MacNeal, Novy e Nicolle
(NNN) para cultura de Trypanosoma cruzi.
7. PROCEDIMENTOS
7.1 Obtenção do sangue do camundongo
Vide:
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
7.2 Processo de cultura (3)
Este procedimento deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo laminar, para evitar
contaminação.
7.2.1 Inocular aproximadamente 0,5 mL de sangue total em tubos (3 a 5 para cada camundongo)
contendo o meio NNN completo (bifásico).
7.2.2 Transferir os tubos semeados para uma estufa B.O.D. regulada a 28ºC.
7.2.3 Homogeneizar os tubos uma vez por semana.
7.3 Período e forma de leitura
7.3.1 Realizar a leitura retirando-se alíquotas de 10 µL da suspensão de cada tubo e examinando-as
em intervalos de 7 dias até um total de 2 meses após o cultivo, entre lâmina e lamínula, ao
microscópio ótico com aumento de 400x.
7.3.2 Após a última leitura, os tubos que permanecerem negativos devem ser centrifugados a 2.500
rpm por 15 min para que o sedimento seja reexaminado.
270
Código POP POP_ENT_LB_017_v02_PT Página 3/3
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Embora apresente alta especificidade, a sensibilidade da hemocultura, baseada em apenas um
exame, varia de 40% a 50%, sendo mais baixa na fase crônica da doença de Chagas (2).
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Bronfen E, de Assis Rocha FS, Machado GB, Perillo MM, Romanha AJ, Chiari E. Isolation of
Trypanosoma cruzi samples by xenodiagnosis and hemoculture from patients with chronic Chagas‟
disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 1989; 84(2): 237-40.
3. Miles MA, Póvoa MM, Souza AA, Lainson R, Shaw JJ, Ketteridge DS. Chagas‟ disease in the
Amazon Basin. II. Distribution of Trypanosoma cruzi zymodemes 1 and 3 in Pará State, north Brazil.
Trans R Soc Trop Med Hyg 1981; 75, 667-74.
10. ANEXOS
Não se aplica.
271
Código POP POP_ENT_LB_018_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário. O procedimento
serve para a análise hematológica e sorológica, preparo do inóculo de tripomastigotas sanguíneas
para infecção experimental e para hemocultura.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_016_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
POP_ENT_LB_017_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
POP_ENT_LB_0019_v02_PT: Procedimento para sangria de camundongos pela cauda e
determinação da parasitemia.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Caixa de contenção do animal
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
272
Código POP POP_ENT_LB_018_v02_PT Página 2/3
6.1.2 Colírio anestésico (cloridrato de proximetacaína 0,5%)
6.1.3 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.4 Pipeta Pasteur de vidro
6.1.5 Borracha de sucção para a pipeta
6.1.6 Algodão embebido em álcool a 70% ou álcool iodado
6.1.7 Lâminas para microscopia
6.1.8 Lamínulas para microscopia 22 x 22 mm
6.1.9 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.10 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.11 Frasco lavador com álcool 70%
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Centrífuga de micro-hematócrito
6.2.2 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Microscópio ótico comum
7. PROCEDIMENTOS (2,3)
7.1 Obtenção do sangue:
Realizar o procedimento em câmara de fluxo laminar ou próximo do bico de Bunsen.
7.1.1 Identificar os tubos que serão utilizados para o recolhimento do sangue dos diferentes
camundongos.
7.1.2 A contenção do animal é realizada pela região cervical, de modo que automaticamente
provoque uma estase venosa na região cefálica, levando a exteriorização do globo ocular.
7.1.3 Após a exteriorização do globo ocular, instilar uma pequena gota do colírio anestésico.
7.1.4 Introduzir a ponta da pipeta verticalmente entre o globo ocular exposto e o fundo da cavidade
orbitária. Realizar uma ligeira pressão acompanhada de movimento de rotação da pipeta.
Assim que o plexo retro-orbitário é puncionado, o sangue preenche espontaneamente a pipeta. O
relaxamento da pressão exercida sobre a região cervical, utilizada para conter o animal, faz cessar
consideravelmente o fluxo sanguíneo.
7.1.5 Transferir o sangue recolhido para um tubo de microcentrífuga previamente identificado.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
O procedimento exige experiência por parte do indivíduo que vai realizar a coleta, para que não haja
lesões graves do camundongo.
273
Código POP POP_ENT_LB_018_v02_PT Página 3/3
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Araújo-Jorge TC, Rivera MT, Castro SL, Marques MAP. Sangria de animais e preparo de inóculos
para infecção experimental. In: Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para
experimentação animal. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 215-8.
3. Hoffmann G. Les animaux de laboratoire. Paris: Vigot Fréres; 1963.
10. ANEXOS
Não se aplica.
274
Código POP POP_ENT_LB_019_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento para sangria de camundongos pela cauda.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para sangria de camundongos pela cauda. Este procedimento serve para
a obtenção de sangue a para o exame de sangue a fresco, confecção de esfregaços, determinação
da parasitemia, para o estudo hematológico e sorológico e para hemocultura.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_016_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
POP_ENT_LB_017_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN).
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
POP_ENT_LB_0029_v02_PT: Procedimento para determinação da parasitemia direta em
camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi (Método de Pizzi-Brener).
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
275
Código POP POP_ENT_LB_019_v02_PT Página 2/3
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Caixa de contenção do animal
6.1.2 Tesoura de ponta fina e afiada
6.1.3 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.1.4 Capilares heparinizados
6.1.5 Borracha de sucção do capilar
6.1.6 Massa plástica para vedação de capilar
6.1.7 Suporte plástico para capilar com marcação milimetrada
6.1.8 Fósforos
6.1.9 Caneta de diamante,
6.1.10 Algodão embebido em álcool a 70%
6.1.11 Lâminas para microscopia
6.1.12 Lamínulas para microscopia 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm
6.1.13 Caixa de descarte de material perfurocortante
6.1.14 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.15 Frasco lavador com álcool 70%
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Centrífuga de micro-hematócrito
6.2.2 Câmara de fluxo laminar
6.2.3 Microscópio ótico comum
7. PROCEDIMENTOS (2,3)
7.1 Obtenção do sangue
Realizar o procedimento em câmara de fluxo laminar.
7.1.1 Identificar os capilares, as lâminas e os tubos que serão utilizados para o recolhimento do
sangue dos diferentes camundongos.
7.1.2 Colocar o camundongo na caixa de contenção, com a cauda para fora.
7.1.3 Com uma das mãos, massagear a cauda no sentido da base para a ponta e segurar na ponta.
7.1.4 Com a tesoura na outra mão, cortar 1 mm ou menos da ponta da cauda.
7.1.5 Recolher 1 gota para o preparo do esfregaço, que deve ser feito imediatamente por uma
segunda pessoa.
7.1.6 Segurar a cauda do animal com as duas mãos e tornar a repetir o massageamento da base
para a ponta, até aparecer nova gota, que será recolhida no capilar heparinizado.
7.1.7 Cauterizar a cauda do camundongo com fósforo.
276
Código POP POP_ENT_LB_019_v02_PT Página 3/3
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
A quantidade de sangue obtida por este procedimento é menor que a obtida por outras técnicas de
sangria.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Araújo-Jorge TC, Rivera MT, Castro SL, Marques MAP. Sangria de animais e preparo de inóculos
para infecção experimental. In: Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para
experimentação animal. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 215-8.
3. Hoffmann G. Les animaux de laboratoire. Paris: Vigot Fréres; 1963.
10. ANEXOS
Não se aplica.
277
Código POP POP_ENT_LB_020_v02_PT Página 1/4
Título Procedimento para extração de DNA de Trypanosoma cruzi a partir de sangue total com fenol-clorofórmio.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para extração de DNA de Trypanosoma cruzi a partir de sangue total com
fenol-clorofórmio.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
POP_ENT_LB_0019_v02_PT: Procedimento para sangria de camundongos pela cauda.
POP_ENT_LB_021_v02_PT: Procedimento da PCR (reação em cadeia da polimerase) para o
diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Material para coleta de sangue de camundongos
6.1.2 Algodão embebido em álcool a 70%
6.1.3 Caixa de descarte de material perfurocortante
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
278
Código POP POP_ENT_LB_020_v02_PT Página 2/4
6.1.4 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.5 Frasco lavador com álcool 70%
6.1.6 Tubos de polipropileno para coleta de sangue com solução de 6M guanidina HCl + 200 mM
EDTA pH 8,0.
6.1.7 Tubos tipo Eppendorf
6.1.8 Frasco com água deionizada
6.1.9 Micropipetas
6.1.10 Ponteiras descartáveis em suporte apropriado
6.2 Equipamentos:
6.2.1 Banho-maria a 100ºC com água fervente
6.2.2 Centrífugas para tubos tipo Eppendorf
6.2.3 Deionizador
6.2.4 Placa de aquecimento a 70ºC
6.2.5 Freezer
6.2.6 Centrífuga clínica
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Solução de fenol:clorofórmio 1:1 (v/v)
6.3.2 Solução de acetato de sódio a 3M
6.3.3 Etanol absoluto
6.3.4 Água deionizada ou mili-Q
7. PROCEDIMENTOS (2,3,4)
7.1 Obtenção do sangue
7.1.1 Vide os seguintes procedimentos para coleta de sangue venoso:
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
POP_ENT_LB_0019_v02_PT: Procedimento para sangria de camundongos pela cauda.
POP_ENT_LB_023_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos por punção cardíaca.
7.1.2 Transferir a amostra para um frasco de polipropileno contendo o dobro do volume da solução de
6M guanidina HCl + 200 mM EDTA pH 8,0.
7.1.3 A solução de guanidina-EDTA permite que o sangue possa ser estocado por um prazo de 30
dias em temperatura ambiente, até o momento de ser transferido para o laboratório onde será
processado.
7.1.4 Estocar o material a 4ºC até a etapa seguinte.
279
Código POP POP_ENT_LB_020_v02_PT Página 3/4
7.2 Extração do DNA
7.2.1 Os tubos contendo sangue + guanidina-EDTA deverão ser parcialmente imersos em água e
fervidos por 7 min.
Realizar em duplicata, a partir da etapa seguinte, todos os procedimentos, e a cada série de quatro
amostras extraídas, incluir uma amostra de sangue de camundongo comprovadamente negativo, para
servir de controle da presença de contaminantes durante as futuras etapas da PCR.
7.2.2 Para a extração do DNA de cada amostra de sangue fervido, retirar duas alíquotas de 100 µL.
Obs: as diferentes alíquotas da mesma amostras devem ser extraídas em momentos distintos.
7.2.3 Submeter as alíquotas a um processo de desproteinização empregando fenol tamponado-
clorofórmio na proporção 1:1 (v/v).
7.2.4 Centrifugar por 5 min a 10.000 rpm.
7.2.5 Recolher o sobrenadante para outro tubo Eppendorf.
7.2.6 Adicionar 75 µL de água mili-Q no tubo original e centrifugar por 5 min a 10.000 rpm.
7.2.7 Recolher o sobrenadante e juntar ao sobrenadante recolhido anteriormente.
7.2.8 Adicionar 300 µL de clorofórmio gelado.
7.2.9 Centrifugar por 5 min a 10.000 rpm.
7.2.10 Recolher o sobrenadante para outro tubo Eppendorf e medir seu volume.
7.2.11 Precipitar a fase aquosa obtida, acrescentando 10% de acetato de sódio a 3 M (300 mM de
concentração final), mais dois volumes de etanol absoluto e deixar 15 min em banho de gelo.
7.2.12 Centrifugar o volume total a 10.000 rpm por 15 min.
7.2.13 Desprezar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o sedimento sobre uma placa de
aquecimento, regulada para 70ºC, por 10 min.
7.2.14 Ressuspender o sedimento em 20 µL de água deionizada.
7.2.15 Armazenar o DNA por 24-36 horas à temperatura de 4ºC.
7.3 Lavagem do DNA
7.3.1 Dar um spin na amostra de DNA extraído.
7.3.2 Lavar com álcool 70% na proporção de 2 volumes (40 µL).
7.3.3 Precipitar o DNA em banho de gelo por 20 min.
7.3.4 Centrifugar por 20 min a 10.000 r.p.m.
7.3.5 Desprezar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o sedimento sobre uma placa de
aquecimento, regulada para 70ºC, por 10 min.
7.3.6 Ressuspender em 10 µL de água mili-Q.
7.3.7 Estocar a 4ºC por 24-36 horas até a amplificação.
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
280
Código POP POP_ENT_LB_020_v02_PT Página 4/4
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Ávila HÁ, Sigman DS, Cohen LM, Millikan RC, Simpson L. Polymerase chain reaction amplification
of Trypanosoma cruzi kinetoplast minicircle DNA isolated from whole blood lysates: Diagnosis of
chronic Chagas disease. Mol Biochem Parasitol 1991; 48:211-22.
3. Gomes ML, Macedo AM, Vago AR, Pena SD, Galvão LM, Chiari E. Trypanosoma cruzi:
optimization of polymerase chain reaction for detection in human blood. Exp Parasitol 1998; 88: 28-
33.
4. Wincker P, Britto C, Pereira JB, Cardoso MA, Oelemann W, Morel CM. Use of a simplified
polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in blood samples patients in a rural
endemic area. Am J Trop Med Hyg 1994; 71: 771-7.
10. ANEXOS
Não se aplica.
281
Código POP POP_ENT_LB_021_v02_PT Página 1/7
Título Procedimento da PCR (reação em cadeia da polimerase) para o diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro Ana Paula M. Teston
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Max Jean de Ornelas Toledo
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento da PCR (reação em cadeia da polimerase) para o diagnóstico da infecção
pelo Trypanosoma cruzi.
2. DEFINIÇÕES
Reação em cadeia da polimerase: Técnica molecular que permite a amplificação de pequenas
quantidades de um DNA específico a partir de um molde de DNA, por meio de uma reação
enzimática, na ausência de um organismo vivo.
Iniciador ou primer: pequena sequência de DNA ou RNA a partir da qual pode se iniciar a replicação
do DNA.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e ao diagnóstico laboratorial.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
POP_ENT_LB_020_v02_PT: Procedimento para extração de DNA de Trypanosoma cruzi a partir de
sangue total com fenol-clorofórmio.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 DNA extraído:
Vide POP_ENT_LB_020_v02_PT: Procedimento para extração de DNA de Trypanosoma cruzi a
partir de sangue total com fenol-clorofórmio.
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
282
Código POP POP_ENT_LB_021_v02_PT Página 2/7
6.2 Materiais:
6.2.1 Tubo tipo Eppendorf de 0,5 mL e 1,5 mL
6.2.2 Ponteiras descartáveis com filtro em suporte apropriado
6.2.3 Pipetas de 2, 10, 100 e 1.000 µL
6.2.4 Caixa de descarte de material com hipoclorito de sódio
6.2.5 Frasco lavador com álcool 70%
6.3 Equipamentos:
6.3.1 Câmara de fluxo laminar
6.3.3 Termociclador (Techne TC-512)
6.3.4 Fonte de eletroforese
6.3.5 Agitador de tubos
6.4 Reagentes, meios e soluções:
6.4.1 Frasco com água deionizada e mili-Q
6.4.2 Tampão Taq Polymerase 10x
6.4.3 MgCl2 25 mM
6.4.4 Nucleotídeos dATP + dCTP + dTTP + dGTP 2,5 mM
6.4.5 Oligonucleotídeos 121 100 ng/µL (5‟-AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA-3‟)
6.4.6 Oligonucleotídeos 122 100 ng/µL (5‟-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3‟)
6.4.7 Enzima Taq Polymerase Platinum 2,5 U
6.4.8 Marcador de peso molecular
Água mili-Q 392 µL
PM a 1 µg/µL 10 µL
Homogeneizar esses reagentes na sala de amplificação e acondicionar em um tubo tipo Eppendorf
de 1,5 ml.
Na sala de eletroforese acrescentar 98 µl de Ficol 5X.
6.4.9 Solução de acrilamida
Acrilamida (24%) 29 g 290 g
Bis Acrilamida (1%) 1 g 10 g
Água mili-Q q.s.p. 100 mL 1000 mL
Homogenizar os reagentes e acondicionar em tubos Falcon de 50mL.
283
Código POP POP_ENT_LB_021_v02_PT Página 3/7
6.4.10 Tampão Tris 5x (tris-ácido bórico, EDTA) pH 8,0 (TBE 5x)
Tris Base 54 g 108 g
Ácido Bórico 27,5 g 55 g
EDTA 0,5M pH 8,0 20 mL 40 mL
Água deionizada q.s.p 1000 mL 2000 mL
Dissolver os reagentes.
Filtrar a solução em papel filtro.
Autoclavar a solução.
Estocar a temperatura ambiente.
6.4.11 Solução tampão para eletroforese
Dilui o TBE 5x para 1x (100 mL de TBE 5x + 400 mL de água deionizada)
6.4.12 Azul de bromofenol
6.4.13 Solução Fixadora
Etanol absoluto 50 mL
Ácido acético glacial 2,5 mL
Água deionizada q.s.p. 500 mL
Homogenizar os reagentes.
6.4.14 Solução para coloração
Nitrato de prata 0,300 g
Solução Fixadora 50 mL
Água deionizada q.s.p. 150 mL
Dissolver os reagentes.
6.4.15 Solução Reveladora
Hidróxido de sódio 6 g
Formaldeído 600 µL
Água deionizada q.s.p. 200 mL
Dissolver os reagentes.
284
Código POP POP_ENT_LB_021_v02_PT Página 4/7
6.4.16 Persulfato de amônio (PA) 10%
Persulfato de amônio (pó) 5 g
Água deionizada autoclavada q.s.p. 50 mL
Homogeneizar e aliquotar a solução em tubos autoclavados tipo Eppendorf de 1,5 mL.
6.4.17 TEMED (N, N, N‟ – tetrametiletilenodiamina)
7. PROCEDIMENTOS (1-4)
7.1 Pré-amplificação:
7.1.1 Primeira Fase
As quantidades fornecidas a seguir e na próxima fase correspondem a valores empregados em
apenas uma reação de amplificação, ou seja, 2 µL de DNA ressuspendido.
7.1.1.1 Em um tubo tipo Eppendorf, acrescentar os seguintes produtos:
Reagente Quantidade (µL)
H2O mili-Q 5,27
Tampão Taq Polimerase 10x 1,0
MgCl2 50 Mm 0,7
Nucleotídeos dATP + dCTP + dTTP + dGTP
2,5 mM
0,8
Oligonucleotídeos 121 25 pmol/µL 0,4
Oligonucleotídeos 122 25 pmol/µL 0,4
KCl 750 mM 0,33
Taq Polimerase Platinum 0,1
Obs: Adicionar os reagentes na ordem do maior volume para o menor, deixando a Taq Polimerase
Platinum por último. A mistura deve ser realizada o tempo todo no gelo.
7.1.1.2 Após homogeneização, transferir 9 µL da mistura anterior para um tubo Eppendorf de 0,2 mL.
7.1.1.3 Adicionar 2 µL do DNA extraído.
285
Código POP POP_ENT_LB_021_v02_PT Página 5/7
7.2 Ciclos térmicos:
7.2.1 Introduzir os tubos no termociclador, programado para os seguintes ciclos de temperatura e
tempo:
35 ciclos 1o
2o
3o
Denaturação
Extensão
1‟
1‟
1‟
4‟
10‟
94oC
65oC
72oC
94oC
72oC
7.3 Controles:
7.3.1 A cada série de quatro amplificações, incluir uma alíquota de amostra comprovadamente
negativa e uma positiva, além do controle positivo da amplificação e do branco da reação.
7.4 Eletroforese:
7.4.1 Preparar o gel de poliacrilamida 4,5%:
Solução de acrilamida 10 mL
TBE 5x 10 mL
Água deionizada q.s.p. 50 mL
PA 600 µL
TEMED 60 µL
Homogeneizar os reagentes na ordem supracitada.
7.4.2 Verter o gel para uma placa de vidro até a polimerização (cerca de 1 hora em geladeira).
7.4.3 Colocar a placa com o gel na cuba de eletroforese.
7.4.4 Adicionar o tampão de eletroforese (TBE 1x).
7.4.5 Adicionar ao tubo com o DNA amplificado 2 µL de azul de bromofenol.
7.4.6 Aplicar o DNA amplificado, os controles (positivos e negativos da extração e da amplificação), e
o marcador de peso molecular no gel.
7.4.7 Promover uma corrida de aproximadamente 1h30min a 100V (volts), utilizando uma fonte com
duas entradas e duas saídas.
7.5 Revelação:
7.5.1 Retirar o gel da placa de vidro e transferir para um recipiente contendo a solução fixadora.
7.5.2 Deixar o recipiente em agitação por 10 min.
7.5.3 Desprezar a solução fixadora.
7.5.4 Lavar o gel com água deionizada.
286
Código POP POP_ENT_LB_021_v02_PT Página 6/7
7.5.5 Acrescentar a solução de coloração no recipiente e agitar por 10 min.
7.5.6 Desprezar a solução de coloração.
7.5.7 Lavar o gel com água deionizada por 3 min sob agitação.
7.5.8 Desprezar a água deionizada.
7.5.9 Adicionar a solução reveladora e deixar por 10 min sob agitação.
7.5.10 Desprezar a solução reveladora.
7.5.11 Adicionar a solução fixadora e deixar por 10 min sob agitação.
7.5.12 A visualização de uma única banda de peso molecular 330 pb indicará a presença de kDNA de
Trypanosoma cruzi amplificado (PCR positiva).
8. LIMITAÇÕES E CUIDADOS A SEREM TOMADOS
Vários procedimentos devem ser seguidos para evitar a contaminação das amostras submetidas a
PCR:
- executar o isolamento e a amplificação do DNA em câmaras de fluxo laminar individualizadas.
- empregar materiais de consumo novos (não reciclados).
- distribuir os reagentes em pequenas alíquotas, incluído o kit com a enzima.
- utilizar apenas ponteiras protegidas por filtros.
- empregar tubos tipo Eppendorf que apresentem um sistema de lacre para evitar extravasamento de
amostras durante a homogeneização.
- todo o material permanente deverá ser limpo com hipoclorito de sódio e submetido à luz UV.
- durante toda a execução da técnica, usar luvas que deverão ser descartadas a cada amostra
processada.
- realizar o manuseio do produto amplificado em sala separada, com equipamentos também
individualizados e geralmente por um profissional que não tenha trabalhado na extração e preparação
dos reagentes.
- na etapa da pré-amplificação, todos os tubos com reagentes deverão ser deixados em banho de
gelo até o momento de serem introduzidos no termociclador.
9. REFERÊNCIAS
1. Ávila HÁ, Sigman DS, Cohen LM, Millikan RC, Simpson L. Polymerase chain reaction amplification
of Trypanosoma cruzi kinetoplast minicircle DNA isolated from whole blood lysates: Diagnosis of
chronic Chagas disease. Mol Biochem Parasitol 1991; 48:211-22.
2. Gomes ML, Macedo AM, Vago AR, Pena SD, Galvão LM, Chiari E. Trypanosoma cruzi:
optimization of polymerase chain reaction for detection in human blood. Exp Parasitol 1998; 88: 28-
33.
3. Sturm NR, Degrave W, Morel CM, Simpson L. Sensitive detection and schizodeme classification of
Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequence: use in diagnosis of
Chagas disease. Mol Biochem Parasitol 1989; 33: 205-14.
287
Código POP POP_ENT_LB_021_v02_PT Página 7/7
4. Wincker P, Britto C, Pereira JB, Cardoso MA, Oelemann W, Morel CM. Use of a simplified
polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in blood samples patients in a rural
endemic area. Am J Trop Med Hyg 1994; 71: 771-7.
10. ANEXOS
Não se aplica.
288
Código POP POP_ENT_LB_024_v02_PT Página 1/4
Título Procedimento para a quimioterapia experimental de camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi com benzonidazol.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Ana Paula M. Teston Wuelton Marcelo Monteiro Data & assinatura
Revisado e Aprovado por: Max Jean de Ornelas Toledo Data & assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para a quimioterapia experimental de camundongos infectados pelo
Trypanosoma cruzi com benzonidazol.
2. DEFINIÇÕES
Benzonidazol (N-benzyl-2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)-acetamida): medicamento usado para a
quimioterapia específica da doença de Chagas. O benzonidazol provavelmente atua através do
mecanismo de estresse redutivo, envolvendo modificação covalente de macromoléculas, como as de
DNA, por intermediários nitroredutores, levando à perda da capacidade de multiplicação do
Trypanosoma cruzi.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
Vide texto na íntegra.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Benzonidazol 100 mg/comprimido (LAFEPE)
6.2 Materiais:
6.2.1 Gaiolas para camundongos
6.2.2 Cânula para gavage
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
289
Código POP POP_ENT_LB_024_v02_PT Página 2/4
6.2.3 Gral e pistilo
6.2.4 Béquer
6.2.5 Pipeta graduada de 10 mL
6.2.6 Pêra de borracha para sucção
6.2.7 Seringas estéreis de 1 mL para inoculação e para tratamento
6.2.8 Espátula de alumínio
6.2.9 Materiais para a preparação dos inóculos de tripomastigotas de cultura ou sanguíneas.
Vide:
POP_ENT_LB_011_v02_PT: Procedimento para manutenção das amostras em culturas acelulares e
obtenção de tripomastigotas de culturas de Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_012_v02_PT: Procedimento para a obtenção de tripomastigotas sanguíneos de
Trypanosoma cruzi.
6.2.10 Material para realização de exame de sangue a fresco e determinação da parasitemia
POP_ENT_LB_015_v02_PT: Procedimento para o exame a fresco e determinação da parasitemia em
camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi (Método de Pizzi-Brener).
6.2.11 Material para realização de hemocultura
Vide POP_ENT_LB_016_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
6.2.12 Material para a realização de extração de DNA e da reação de PCR
Vide:
POP_ENT_LB_020_v02_PT: Procedimento para extração de DNA de Trypanosoma cruzi a partir de
sangue total com fenol-clorofórmio.
POP_ENT_LB_021_v02_PT: Procedimento da PCR (reação em cadeia da polimerase) para o
diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi.
6.2.13 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.2.14 Frasco lavador com álcool 70%
6.3 Equipamentos:
6.3.1 Balança analítica
6.3.2 Equipamentos para realização de exame de sangue a fresco e determinação da parasitemia
POP_ENT_LB_015_v02_PT: Procedimento para o exame a fresco e determinação da parasitemia em
camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi (Método de Pizzi-Brener).
6.3.3 Equipamentos para realização de hemocultura
Vide POP_ENT_LB_016_v02_PT: Procedimento da hemocultura para a verificação da infecção pelo
Trypanosoma cruzi em camundongos utilizando meio Liver Infusion Tryptose (LIT).
6.3.4 Equipamentos para a realização de extração de DNA e da reação de PCR
290
Código POP POP_ENT_LB_024_v02_PT Página 3/4
Vide:
POP_ENT_LB_020_v02_PT: Procedimento para extração de DNA de Trypanosoma cruzi a partir de
sangue total com fenol-clorofórmio.
POP_ENT_LB_021_v02_PT: Procedimento da PCR (reação em cadeia da polimerase) para o
diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi.
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Goma arábica em pó, pura, teor mínimo 85% (Dinâmica®)
6.3.2 Água destilada
7. PROCEDIMENTOS
7.1 Inoculação dos grupos experimentais
7.1.1 Definir o número de camundongos no grupo tratado e no grupo controle
7.1.2 Padronizar o inóculo de tripomastigotas do experimento.
Vide:
POP_ENT_LB_011_v02_PT: Procedimento para manutenção das amostras em culturas acelulares e
obtenção de tripomastigotas de culturas de Trypanosoma cruzi.
POP_ENT_LB_012_v02_PT: Procedimento para a obtenção de tripomastigotas sanguíneos de
Trypanosoma cruzi.
7.1.3 Inocular o grupo tratado e o grupo controle de camundongos com o inóculo padrão do
experimento, por via intraperitoneal
7.1.4 Definir o início do período patente da infecção, pelo exame de sangue a fresco dos grupos de
camundongos inoculados
7.2 Preparo da suspensão de benzonidazol (10 mg/mL)
7.2.1 Triturar um comprimido de benzonidazol (100 mg) com auxilio do gral e o pistilo.
7.2.2 Com a espátula de alumínio adicionar a goma arábica na mesma proporção do BZ
7.2.3 Adicionar 10 mL de água destilada e homogeneizar
7.3 Tratamento dos animais
7.3.1 Pesar os camundongos no dia do início do tratamento.
7.3.2 Iniciar o tratamento do grupo experimental com o benzonidazol (100 mg/kg).
OBS: realizar o tratamento por gavage, a partir do 5º dia de inoculação, e proceder da mesma
maneira por 20 dias consecutivos, respeitando os mesmos horários diariamente.
7.3.3 Acompanhar os camundongos por meio do exame de sangue a fresco para construção da curva
de parasitemia
7.3.4 No 55o dia após a inoculação, coletar sangue para a realização da hemocultura e PCR, por
punção retrorbitária.
291
Código POP POP_ENT_LB_024_v02_PT Página 4/4
7 3.5 Três e seis meses após o tratamento, realizar a coleta de sangue do plexo venos retrorbital para
realização do ELISA.
Vide:
POP_ENT_LB_018_v02_PT: Procedimento da sangria de camundongos pelo plexo retro-orbitário.
7.4 Controle de cura
7.4.1 Considerar como curado todo animal que apresentar exame de sangue a fresco, hemocultura,
PCR e ELISA negativos após o término do tratamento.
7.4.2 Considerar dissociado o camundongo que apresentar ESF, HC e PCR negativos e ELISA
persistentemente positiva após o término do tratamento.(2)
7.4.3 Considerar não curado o camundongo que apresentar pelo menos um dos exames positivos.
7.4.3 Calcular a porcentagem de cura pela razão entre o número de animais curados e o total de
animais tratados x 100.
7.4 Interpretação
7.4.1 Isolados com índices de cura de 0% a 33% serão considerados resistentes ao benzonidazol,
aqueles com índices de cura entre 34% e 67% serão considerados de sensibilidade intermediária e
isolados com índices de cura acima de 67% serão considerados sensíveis à droga (3).
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Krettli AU, Cançado JR, Brener Z. Effect of specific chemotherapy on the levels of lytic antibodies in
Chagas‟ disease. Trans R Soc Trop Med Hyg 1982; 76: 334-40.
3. Toledo MJ, Bahia MT, Carneiro CM, Martins-Filho OA, Tibayrenc M, Barnabé C, Tafuri WL, Lana M.
Chemotherapy with benznidazole and itraconazole for mice infected with different Trypanosoma cruzi
clonal genotypes. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 223-30.
10. ANEXOS
Não se aplica.
292
Código POP POP_ENT_LB_025_v02_PT Página 1/3
Título Procedimento de extração de DNA utilizando o kit PureLink (Invitrogen, Life technologies, USA)
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton Marcelo Monteiro
Data & assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Data & assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento de extração de DNA utilizando o kit PureLink (Invitrogen, Life technologies,
USA).
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa e ao diagnóstico laboratorial.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
Não se aplica.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Amostra: Culturas de Trypanosoma cruzi em meio LIT ou NNN, conteúdo do tubo
digestório de triatomíneos ou sangue total de pacientes com doença de Chagas aguda.
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
293
Código POP POP_ENT_LB_025_v02_PT Página 2/3
6.2 Materiais:
6.2.1 Kit PureLink (Invitrogen, Life technologies, USA), com os seguintes componentes:
Reagente Armazenamento
1. Tampão lise dos tecidos (Tampão ATL) Temperatura ambiente
2. Proteinase K Temperatura ambiente
3. Tampão de lise (Tampão AL) Temperatura ambiente
4. Etanol 95% PA Temperatura ambiente
5. Tampão de lavagem 1 (Tampão AW1) Temperatura ambiente
6. Tampão de lavagem 2 (Tampão AW2) Temperatura ambiente
7. Tampão de eluição (Tampão AE) Temperatura ambiente
6.2.2 Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL e 1000 µL
6.2.3 Ponteiras com filtro para pipetas automáticas
6.2.4 Tubos tipo Eppendorf de 1,5 e 2,0 mL
6.1.5 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.6 Frasco lavador com álcool 70%
6.3 Equipamentos
6.3.1 Centrífuga
6.3.2 Agitador de tubos
6.3.3 Banho Maria
6.3.4 Freezer a -20°C
7. PROCEDIMENTOS
7.1 Pipetar 20 µL de Proteinase K (2) num tubo Eppendorf de 1,5 mL.
7.2 Adicionar 200 µL de amostra ao tubo.
Obs: se não houver 200 µL de amostra, adicionar o volume apropriado de PBS.
7.3 Adicionar 200 µL de Tampão AL (3).
7.4 Vortexar até completa homogeneização.
7.5 Incubar a mistura em banho-maria a 56°C por 10 minutos.
7.6 Adicionar 200 µL de etanol 96-100% ao lisado.
7.7 Agitar o tubo imediatamente para completa homogeneização.
7.8 Remover as bolhas por centrifugação.
7.9 Cuidadosamente transferir o conteúdo do tubo para o tubo filtro.
7.10 Tampar e centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.
7.11 Desprezar o líquido filtrado com o tubo coletor.
7.12 Colocar o filtro em um novo tubo coletor.
294
Código POP POP_ENT_LB_025_v02_PT Página 3/3
7.13 Cuidadosamente adicionar 500 µL de tampão AW1 e centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. 7.14
Desprezar o líquido filtrado com o tubo coletor.
7.15 Colocar o filtro em um novo tubo coletor.
7.16 Cuidadosamente adicionar 500 µL de tampão AW2 e centrifugar a 14000 rpm por 3 minutos.
7.17 Desprezar o líquido filtrado com o tubo coletor.
7.18 Colocar o tubo filtro em novo tubo coletor e centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto.
7.19 Descartar o filtrado e o tubo coletor.
7.20 Colocar o tubo filtro em um tubo Eppendorf de 1,5 mL novo.
7.21 Adicionar cuidadosamente 50 µL de tampão AE ou água mili-Q e incubar à temperatura
ambiente por 1 minuto.
7.22 Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.
7. Armazenar o líquido filtrado, contendo o DNA, a -20°C até o uso.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
10. ANEXOS
Não se aplica.
295
Código POP POP_ENT_LB_029_v02_PT Página 1/5
Título Procedimento para coleta e processamento de órgãos e tecidos para avaliação da infecção pelo Trypanosoma cruzi em camundongos.
Idioma da versão original Português
Elaborado por: Wuelton M. Monteiro
Data e assinatura
Revisado e Aprovado por:
Maria das Graças Vale Barbosa
Luiz Carlos de Lima Ferreira
Data e assinatura
Data de aplicação:
05 de julho de 2011
Data da próxima revisão:
05 de julho de 2012
1. OBJETIVOS
Descrever o procedimento para coleta e processamento de órgãos e tecidos para avaliação da
infecção pelo Trypanosoma cruzi em camundongos.
2. DEFINIÇÕES
Não se aplica.
3. APLICÁVEL A
O procedimento se aplica à pesquisa experimental.
4. RESPONSABILIDADES
Gerente da unidade, responsável pela subunidade e pessoal técnico.
5. POP’S RELACIONADOS
Não se aplica.
6. RECURSOS NECESSÁRIOS
6.1 Materiais:
6.1.1 Placa de cortiça com quatro agulhas para fixação do animal
6.1.2 Câmara de anestesia (vidro de boca larga com tampa, e algodão no fundo)
6.1.3 Éter etílico para anestesia
6.1.4 Pinça anatômica
6.1.5 Pinça dente de rato
6.1.6 Placa de Petri
6.1.7 Pipetas Pasteur
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
GERÊNCIA DE ENTOMOLOGIA
S
296
Código POP POP_ENT_LB_029_v02_PT Página 2/5
6.1.8 Sacos plástico para o descarte de carcaças
6.1.9 Tesoura de ponta afiada
6.1.10 Caixa de descarte de material com solução desinfetante
6.1.11 Frasco lavador com álcool 70%
6.1.12 Pinça de relojoeiro
6.1.13 Recipiente para a fixação do material
6.1.14 Cestinhos para conter o material a ser processado (cassetes)
6.1.15 Formas para inclusão em parafina
6.1.16 Porta-bloco
6.1.17 Navalha descartável
6.1.18 Cubas de gelo
6.1.19 Lâminas limpas e desengorduradas
6.1.20 Pincel com cerdas macias
6.1.21 Lamínula
6.1.22 Bálsamo do Canadá
6.2 Equipamentos
6.2.1 Bico de Bunsen
6.2.2 Freezer
6.2.3 Estufa na faixa de 56 a 58oC para derreter a parafina
6.2.4 Micrótomo
6.2.5 Banho-maria a 45oC
6.2.6 Destilador
6.2.7 Microscópio ótico
6.3 Reagentes, meios e soluções:
6.3.1 Solução salina (NaCl 0,85%)
6.3.2 Formalina 10%
6.3.3 Álcool 70%
6.3.4 Álcool 80%
6.3.5 Álcool 90%
6.3.6 Álcool absoluto
6.3.7 Xilol
6.3.8 Parafina filtrada (pastilhas Merck)
6.3.9 Albumina 30%
6.3.10 Água destilada
6.3.11 Hematoxilina de Harris
6.3.12 Eosina Y
6.3.13 Álcool clorídrico 1%
297
Código POP POP_ENT_LB_029_v02_PT Página 3/5
6.3.14 Água acética 1%
7. PROCEDIMENTOS (2)
7.1 Coleta para histologia convencional em parafina
7.1.1 Colocar o camundongo infectado na câmara de anestesia.
7.1.2 Fixar o camundongo na placa de cortiça, em posição de cruz.
7.1.3 Aplicar jatos de álcool 70% no corpo do animal antes de dissecá-lo.
7.1.4 Abrir primeiramente a pele do animal e em seguida o peritônio, usando uma pinça para cada
revestimento.
7.1.5 Retirar os órgãos evitando seu pinçamento e esmagamento.
7.1.6 Lavar os órgãos com solução salina, pois excesso de sangue e de muco na sua superfície
forma um filme que impede a penetração adequada do fixador.
7.1.7 Recortar os órgãos em fatias delgadas para que o fixador penetre rápida e homogeneamente.
Obs: o cérebro deve ser fixado por inteiro e somente depois clivado.
7.1.8 Colocar o material em recipiente que permita que o volume do líquido fixador seja de 10 a 20
vezes maior que o do espécime.
7.1.9 Acrescentar a formalina 10% (líquido fixador).
7.1.10 O tecido pode permanecer por tempo indeterminado até o seu processamento.
7.2 Desidratação e diafanização
7.2.1 Após a fixação, remover o excesso de líquido fixador, lavando em água corrente por um período
de 30 min a 1 h.
7.2.2 Passar os tecidos em soluções alcoólicas de concentrações crescentes, até o álcool absoluto,
quando a água é totalmente removida.
Obs: são seis banhos sucessivos de 1 h cada, nas seguintes soluções: álcool 70%, álcool 80%, álcool
90%, álcool absoluto I, II e III.
7.2.3 Para diafanização, passar o material no xilol, pois o álcool, como a água, não é miscível com a
parafina, havendo assim a necessidade de ser substituído por um solvente da parafina.
Obs: são três banhos sucessivos de 1h cada (xilol I, II e III).
7.3 Infiltração e inclusão em parafina
7.3.1 Transferir o material do agente diafanizador para a parafina derretida, mantida suficientemente
aquecida.
Obs: para a infiltração do material por parafina, usam-se dois banhos sucessivos de 1 h cada nas
soluções parafina I e parafina II.
7.3.2 A inclusão consiste em colocar, através de pinça aquecida, os tecidos previamente infiltrados,
com a superfície clivada no fundo da forma preenchida com parafina derretida (parafina III).
7.3.3 Depois da inclusão, as formas devem ser resfriadas no freezer ou chapa refrigerada.
298
Código POP POP_ENT_LB_029_v02_PT Página 4/5
7.4 Microtomia e montagem dos cortes na lâmina
7.4.1 Montar o bloco no porta-bloco antes de seccioná-lo. A face do bloco a ser cortada deve ser
plana e conter bastante parafina para que se possa desbastá-la até chegar ao tecido.
7.4.2 Regular o micrótomo em 5 mm.
7.4.3 Resfriar bem a superfície do bloco com um cubo de gelo antes de ser cortado, para evitar cortes
ressecados.
7.4.4 Operar o micrótomo com movimentos delicados, contínuos e relativamente lentos, para se obter
fitas de cortes uniformes.
7.4.5 Estender os cortes que se apresentam ligeiramente enrugados em uma cuba em banho-maria.
7.4.6 Para espalhar os cortes nas lâminas, faz-se o seguinte procedimento:
- colocar um segmento da fita de cortes, com auxílio de um pincel de cerdas macias, para flutuar na
superfície da água aquecida (10o C abaixo do ponto de fusão da parafina).
- transferir os cortes para as lâminas revestidas com albumina, que tem propriedades adesivas e
propicia uma melhor fixação do corte na lâmina.
- colocar as lâminas em uma placa aquecida ou em estufa a 55o
C, para a secagem da água e
coagulação do filme adesivo.
- manter o material à temperatura ambiente, protegido da poeira, até a desparafinização.
7.5 Desparafinização e reidratação
7.5.1 Antes de corar os cortes, remover a parafina residual, passando as lâminas por banhos
sucessivos de 3 min nas seguintes soluções: xilol I, II e III.
7.5.2 Passar as lâminas por banhos sucessivos de 3 min cada nas seguintes soluções: álcool
absoluto I, II e III, álcool 90%, 80%, 70% e água destilada.
7.6 Coloração por hematoxilina e eosina
7.6.1 Corar as lâminas nesta sequência:
- hematoxilina (15 min)
- álcool clorídrico 1% (três mergulhos)
- água corrente (até ficar violeta)
- eosina (2,5 min)
- água acética 1% (três mergulhos)
7.6.2 Banhar as lâminas sucessivamente nas seguintes soluções (3 min cada):
- álcool 70%, 80% e 90%
- álcool absoluto I, II e III
- xilol I, II e III
7.7 Montagem dos cortes entre lâmina e lamínula
7.7.1 Retirar, cuidadosamente, sem danificar o tecido, uma lâmina do último banho de xilol, com o
auxílio de uma pinça, permitindo o escoamento do excesso de xilol.
299
Código POP POP_ENT_LB_029_v02_PT Página 5/5
7.7.2 Manter a lâmina em uma posição moderadamente inclinada e colocar uma gota de bálsamo do
Canadá próximo à borda do corte.
7.7.3 Colocar a lamínula de tamanho apropriado, em um ângulo próximo à borda da lâmina, e permitir
que a mesma se deposite sobre o corte.
Obs: deve-se tomar cuidado para evitar a formação de bolhas de ar, presas entre a lâmina e a
lamínula. Caso isto ocorra, as bolhas podem ser retiradas, aplicando-se uma pressão leve sobre a
lamínula, com o auxílio de uma pinça. Caso as bolhas persistam, recolocar a lâmina no banho de xilol
e quando a lamínula for descolada, remontar o corte.
7.7.4 Após a montagem do corte entre a lâmina e lamínula, a lâmina deve ser levada ao microscópio
ótico a fim de verificar aparecimento de “dentes”, “microdentes”, ressecamento e artefatos. A
depender dos defeitos encontrados, um novo corte do bloco de parafina deverá ser feito.
Todo o procedimento deve ser realizado sob as condições de biossegurança requeridas durante o
trabalho com o Trypanosoma cruzi (1).
8. LIMITAÇÕES
Não se aplica.
9. REFERÊNCIAS
1. Araújo-Jorge TC, Pirmez C. Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi. In:
Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas: manual para experimentação animal. Rio de
Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 125-132.
2. Souza AP, Côrte-Real Faria S, Coutinho CMLM, Soeiro MNC, Pirmez C. Coleta e processamento
de órgãos e tecidos para avaliação da infecção. In: Araújo-Jorge TC, Castro SL. Doença de Chagas:
manual para experimentação animal. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ 2000, p. 265-88.
10. ANEXOS
Não se aplica.
300
8.2 Anexo 2
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
COM SERES HUMANOS
301
302
8.3 Anexo 3
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
COM ANIMAIS
303
304
8.4 Anexo 4
APROVAÇÃO PARA A COLETA DE MAMÍFEROS
SILVESTRES
305
306
307
308
8.5 Anexo 5
ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS NA VIGÊNCIA
DO CURSO
309
1. Barbosa MGV, Fé NF, Jesus RDB, Rodriguez IC, Monteiro WM, Mourão MPG,
Guerra JAO. Aedes aegypti e fauna associada em área rural de Manaus, na
Amazônia brasileira. Rev Soc Bras Med Trop 2009; 42: 213-6.
2. Barbosa MGV, Fé NF, Marcião AHR, Silva APT, Monteiro WM, Guerra JAO.
Fauna de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) em um foco de leishmaniose
tegumentar americana na área periurbana de Manaus, Estado do Amazonas. Rev
Soc Bras Med Trop 2008; 41: 485-91.
3. Barbosa MGV, Fé NF, Marcião AHR, Silva APT, Monteiro WM, Guerra MVF,
Guerra JAO. Registro de Culicidae de importância epidemiológica na área rural de
Manaus, Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 2008; 41: 658-63.
4. Fé NF, Magalhães LK, Fé FA, Arakian SK, Monteiro WM, Barbosa MGV.
Ocorrência de triatomíneos em ambientes silvestres e domiciliares do município de
Manaus, Estado do Amazonas. Rev Soc Bras Med Trop 2009; 42: 642-6.
5. Melo GC, Reyes-Lecca RC, Vitor-Silva S, Monteiro WM, Martins M, Benzecry SG,
Alecrim MGC, Lacerda MVG. Concurrent Helminthic Infection Protects
Schoolchildren with Plasmodium vivax from Anemia. PLoS ONE 2010; 5: e11206.
6. Monteiro WM, Barbosa MGV, Toledo MJO, Flávio Augusto Fé FA, Fé NF. Série de
casos agudos de doença de Chagas atendidos num serviço terciário de Manaus,
Estado do Amazonas, de 1980 a 2006. Rev Soc Bras Med Trop 2010; 43: 207-10.
7. Monteiro WM, Magalhães LKC, Oliveira JC, Guerra JAO, Silveira H, Ferreira LCL,
Toledo MJO, Barbosa MGV. Biological behavior in mice of Trypanosoma cruzi stocks
from the State of Amazonas, Western Brazilian Amazon. Rev Bras Med Trop. No
prelo.
8. Monteiro WM, Magalhães LK, Santana-Filho FS, Borborema M, Silveira H,
Barbosa MGV. Trypanosoma cruzi TcIII/Z3 genotype as agent of an outbreak of
Chagas disease in the Brazilian Western Amazonia. Trop Med Int Health 2010; 15:
1049-51.
310
9. Monteiro WM, Neitzke-Abreu HC, Ferreira MEMC, Melo GC, Barbosa MGV,
Lonardoni MVC, Silveira TGV, Teodoro U. Mobilidade populacional e produção da
leishmaniose tegumentar americana no Estado do Paraná, sul do Brasil. Rev Soc
Bras Med Trop 2009; 42: 509-14.
10. Monteiro WM, Neitzke HC, Lonardoni MVC, Silveira TGV, Ferreira MEMC,
Teodoro U. Distribuição geográfica e características epidemiológicas da
leishmaniose tegumentar americana em áreas de colonização antiga do Estado do
Paraná, Sul do Brasil. Cad Saúde Pública 2008; 24: 1291-303.
11. Monteiro WM, Neitzke HC, Silveira TGV, Lonardoni MVC, Teodoro U, Ferreira
MEMC. Pólos de produção de leishmaniose tegumentar americana no norte do
Estado do Paraná, Brasil. Cad Saúde Pública 2009; 25: 1083-92.
12. Teodoro U, Santos DR, Silva AM, Massafera R, Imazu LE, Monteiro WM,
Neitzke-Abreu HC. Fauna de flebotomíneos em municípios do Norte Pioneiro do
Estado do Paraná, Brasil. Rev Patol Trop 2010; 39: 322-30.
