UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA

CAMPUS DE VIDEIRA

MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA

ELIS REGINA DANA SCHUTZ

POTENCIAL DE SACARIFICAÇÃO E DESPOLIMERIZAÇÃO DE BIOMASSA DE

LEMNA MINUTA, POR HIDRÓLISE QUÍMICA E ENZIMÁTICA PARA PRODUÇÃO

DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

VIDEIRA – SC

2015

2

UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA

CAMPUS DE VIDEIRA

MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA

POTENCIAL DE SACARIFICAÇÃO E DESPOLIMERIZAÇÃO DE BIOMASSA DE

LEMNA MINUTA, POR HIDRÓLISE QUÍMICA E ENZIMÁTICA PARA PRODUÇÃO

DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

Mestranda: Elis Regina Dana Schutz

Orientadora: Prof. Dra. Sabrina Pinto Salomoni

Coorientador: Prof. Dr. Jean Carlo S.S. Menezes

Área: Biotecnologia Ambiental

Linha de Pesquisa: Otimização e Escalonamento de Bioprodutos

VIDEIRA – SC

2015

3

ELIS REGINA DANA SCHUTZ

POTENCIAL DE SACARIFICAÇÃO E DESPOLIMERIZAÇÃO DE BIOMASSA DE

LEMNA MINUTA, POR HIDRÓLISE QUÍMICA E ENZIMÁTICA NA PRODUÇÃO DE

BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e

Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa

Catarina como requisito para obtenção do grau de

Mestre.

Aprovado em ___/___/______.

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________________

Prof. Dra. Sabrina Pinto Salamoni

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC

_______________________________________________________________

Prof.Dra. Estela de Oliveira Nunes

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA Soja

_______________________________________________________________

Prof. Dra. Maria Rita Chaves Nogueira

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC

______________________________________________________________

Prof. Dr. Dirceu Scaratti

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC

_______________________________________________________________

Prof. Dra. Jane Mary Lafayette Neves Gelinski

Coordenadora PPGC&B da Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC

4

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho às três razões da minha vida: Meus Pais, Meu Esposo e Meu Filho!

5

AGRADECIMENTOS

“Sempre chegamos ao sítio aonde nos esperam!”

(Sabedoria Oriental)

No entanto, existem caminhos árduos de percorrer por serem

desconhecidos, pelas suas barreiras de hercúleos esforços, pelas encruzilhadas e

desvios que nos levam a dilemas e indecisões, pelos densos rios que temos de

superar. Mas, é tão bom chegar a esta fase da gesta e poder dizer que não explorei

sozinha o desconhecido, que não superei os obstáculos sem uma mão amiga, que

nas minhas dúvidas sempre surgiu o bom conselho a boa sugestão, que nas águas

a transpor me foi lançada a ponte salvadora.

Assim, aprendi que um caminho de tão difícil necessita sempre de apoio,

de conselhos, de ensinamentos diversos, por vezes de carinhos e porque não, de

reprimendas e censuras.

Por tudo, e especialmente pelo rumo certo, desejo expressar o meu

sincero e reconhecido agradecimento a todos os que contribuíram para a

concretização deste estudo, deste sonho.

Agradeço a Deus, por me conceder a fé que habita em meu coração. Por

guiar e iluminar o meu caminho. Pelas grandes graças que me concede nesta vida,

todos os dias, como oportunidades de convivência com pessoas especiais, pelos

momentos inesquecíveis e vivências extraordinárias.

“É preciso que a saudade desenhe tuas linhas perfeitas,

teu perfil exato e que, apenas, levemente, o vento das

horas ponha um frêmito em teus cabelos... É preciso que

a tua ausência trescale sutilmente, no ar, a trevo

machucado, as folhas de alecrim desde há muito

guardadas não se sabe por quem nalgum móvel antigo...

Mas é preciso, também, que seja como abrir uma janela

e respirar-te, azul e luminosa, no ar. É preciso a saudade

para eu sentir como sinto - em mim - a presença

misteriosa da vida... Mas quando surges és tão outra e

múltipla e imprevista que nunca te pareces com o teu

retrato... E eu tenho de fechar meus olhos para ver-te.” –

Mário Quintana

Ao meu marido e ao meu filho, um agradecimento especial pelo seu

apoio permanente,expresso ou silencioso, materializado em longos meses de

6

paciência, de sacrifício e pela minha ausência quase real, pelo tempo que não

viveram para não me deixar sozinha, pelas más disposições e nervosismos e pelo

carinho com que sempre me esperaram . Por tudo o que esse apoio representa e

que eu não consigo traduzir em palavras…

Quero deixar um agradecimento profundo aos melhores pais do mundo,

por sempre me iluminarem os caminhos obscuros com afeto e dedicação para que

os pudesse trilhar sem medo e cheia de esperança!

“Não pode haver felicidade genuína longe do lar. Nele

encontramos as melhores influências e os

relacionamentos mais doces que a vida pode nos

oferecer.” – Ezra Taft Benson

A Doutora Estela de Oliveira Nunes, pela amizade, pela preocupação e

compreensão, pelo empenhamento e presença ao longo destes meses e, por ter

aberto a primeira porta para o mundo apaixonante das macrófitas e da pesquisa .

“Àquele que injetou mais vida em nossas vidas. Pois o

saber é um patrimônio que jamais nos será subtraído...

Àquele, cujo saber jorra como água que surge do nada,

mas com estrutura de brisa que satisfaz... Àquele que,

pela busca incessante do bem comum, renunciou parte

de sua vida passando-nos sua sabedoria.” – Autor

desconhecido

A minha doce colega Marta Veronica Buss, pela incrível lição de vida, por

encher meu coração com pequenas alegrias e grandes atitudes, pelos melhores

sorrisos, por ter deixado sua marca na vida de tantas pessoas, por ter feito a

diferença na minha vida. Pela amizade sincera! A sua força foi primordial para a

realização deste trabalho.

“Cada pessoa que passa em nossa vida, passa sozinha,

é porque cada pessoa é única e nenhuma substitui a

outra! Cada pessoa que passa em nossa vida passa

sozinha e não nos deixa só porque deixa um pouco de si

e leva um pouquinho de nós. Essa é a mais bela

responsabilidade da vida e a prova de que as pessoas

não se encontram por acaso.” – Charles Chaplin

A minha orientadora, Prof. Dra. Sabrina Pinto Salamoni, pelos

ensinamentos, confiança e apoio. Por mostrar que mesmo quando estamos em

condições adversas em um ambiente de trabalho, ainda podemos, com empenho,

inteligência e inconformismo, realizar trabalhos com qualidade. Pela compreensão

7

manifestada em relação a minha situação de necessidade de conciliação das

atividades acadêmica e profissionais.

"O mais importante para o homem é crer em si mesmo.

Sem esta confiança em seus recursos, em sua

inteligência, em sua energia, ninguém alcança o triunfo a

que aspira." – Thomas Wittlam Atkinson

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Jean Carlo Salomé dos Santos Menezes

pelas construtivas trocas de ideias, grande dedicação e colaboração inestimável

com o trabalho.Por todo o apoio,confiança e incentivo.

“São eles que me fizeram entender que nada é tão difícil,

e que a vida pode ser fácil quando se tem planos para

sonhar. Fazem-me enxergar caminhos, pra eu buscar e

me entender. É só olhar com outros olhos o que temos

de melhor e viver um dia após o outro. Mostraram-me

que não existe amor se existir medo. Eu, hoje, vejo o

mundo com mais esperanças. Fui criada para ser livre,

porém, sem esquecer daqueles que fazem parte da

minha história! Que são minha essência!” – Autor

desconhecido.

Aos membros da banca de qualificação, pelas valiosas correções e

sugestões que propiciaram o enriquecimento desde trabalho. Aos professor Cesar

Milton Baratto e Dirce Scaratti pelo auxílio estatístico .

“A atenção de alguém é realmente o sol que dá vida e

produz transformações nas pessoas. Melhor ainda se a

atenção é recíproca, porque aí entramos numa dança de

criação conjunta – para mim, um dos sonhos da

educação e da vida.” – José Ângelo Gaiarça.

À Universidade do Universidade do Oeste de Santa Catarina ( UNOESC ),

minha segunda casa e minha escola de vida. O meu lugar de trabalho , onde passo

mais de 12 horas do meu dia , pela oportunidade de realizar um grande sonho .Foi

uma experiência muito enriquecedora e gratificante.

“O valor das coisas não está no tempo em que elas

duram, mas na intensidade com que acontecem. Por

isso existem momentos inesquecíveis, coisas

inexplicáveis e pessoas incomparáveis." – Fernando

Pessoa

8

Por fim, à todos que de alguma forma contribuíram com este trabalho,

acreditaram em meu potencial e torceram pelo meu sucesso. Muito obrigada!

“A suprema felicidade consiste em termos a certeza de

que somos amados. Amados pelo que somos, ou

melhor: amados apesar do que somos!” – Victor Hugo

9

EPÍGRAFE

“Ando devagar porque já tive pressa e levo

esse sorriso,porque já chorei demais.

Hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe

eu só levo a certeza de que muito pouco eu

sei, que nada sei.

Conhecer as manhas e as manhãs,

o sabor das massas e das maçãs.

É preciso amor pra poder pulsar,

É preciso paz pra poder seguir,

É preciso a chuva para florir.

Sinto que seguir a vida seja simplesmente

conhecer a marcha, e ir tocando em frente

como um velho boiadeiro levando a boiada,

eu vou tocando os dias pela longa estrada eu

vou, de estrada eu sou

Cada um de nós compõe a sua própria história,

e cada ser em si, carrega o dom de ser

capaz, de ser feliz”.

(ALMIR SATER e RENATO TEIXEIRA)

10

RESUMO

A grande dependência de fontes de energia não renováveis e altamente poluentes,

como o petróleo e seus derivados, tem levado a sociedade a buscar alternativas

para a utilização de matrizes energéticas renováveis. As pesquisas atuais sinalizam

como tecnologia emergente a produção de etanol de biomassas alternativas. Dentre

as várias matérias-primas disponíveis, as macrófitas aquáticas flutuantes, surgem

como uma alternativa sustentável, devido à elevada produtividade e à possibilidade

de cultivo ou obtenção a partir de ambientes eutrofizados. Para realização deste

trabalho inicialmente foi caracterizado o teor de carboidrato da biomassa seca de

Lemna minuta. A biomassa vegetal foi submetida ao pré-tratamento químico, com

ácido sulfúrico e clorídrico adicionado nas concentrações de 5, 10 e 15% e, em

diferentes temperaturas (100; 130 e 150°C) e tempos (20’; 40’ e 60’) de

incubação.No pré-tratamento enzimático, avaliou-se diferentes temperaturas (40; 55

e 70°C), pH (4,00; 5,00; 6,00 e 7,00) e tempos (60'; 120' e 240'). O melhor pré-

tratamento foi repetido e, o hidrolisado foi fermentado com Saccharomyces

cerevisiae chardonay por 48h a 30ºC, sendo determinada a quantidade de bioetanol

produzida. Como resultados desta pesquisa evidencia-se que a biomassa possui

36,46% de carboidratos. A hidrólise ácida foi o melhor pré-tratamento (5% de HCl, a

150ºC por 60') .

PALAVRAS-CHAVE: Macrófitas, Lemna minuta, Hidrólise, Fermentação, Bioetanol.

11

ABSTRACT

The high reliance on non-renewable energy sources and highly polluting, such as oil

and its derivatives, has led the companies to seek for alternatives to the use of

renewable energy matrices. Current research signal emerging technology as the

production of biomass ethanol for alternatives. Among the various available raw

materials, the floating aquatic weeds emerge as a sustainable alternative because of

the high productivity and the possibility of cultivation or obtain from eutrophic

environments. In this work it was initially characterized the carbohydrate content of

dry biomass Lemna minuta. The biomass was subjected to chemical pre-treatment

with sulfuric and hydrochloric acid added at concentrations of 5, 10 and 15% and at

different temperatures (100, 130 and 150°C) and incubation time (20 ', 40' and 60 ').

In the enzymatic pretreatment, different temperatures were evaluated (40, 55 and

70°C), pH (4,00; 5,00; 6,00 and 7,00) and times (60'; 120 'and 240'). The best pre-

treatment was repeated, and the hydrolyzate was fermented with Saccharomyces

cerevisiae chardonay 30°C for 48h and determined the amount of produced

bioethanol. As a result of this research it is clear that biomass has 36.46%

carbohydrates. Acid hydrolysis was the best pre-treatment (5% HCl at 150 °C for

60').

KEYWORDS: Macrophyte, Lemna minuta, Hydrolysis, Fermentation, Bioethanol.

12

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AIE - Agência Internacional de Energia

ANP - Agência Nacional de Petróleo

ANEEL - Agência Nacional de Energia Elétrica

BEN - Balanço Energético Nacional

CH4 - Metano

CO2 - Dióxido de Carbono

GEF - Gases do Efeito Estufa

ITQB - Instituto de Tecnologia Química e Biológica

LEMA - Laboratório de Experimentação em Microbiologia Ambiental

MS - Massa Seca

MTEP - Milhões de Toneladas Equivalente de Petróleo

N2O - Oxido Nitroso pH - potencial hidrogeniônico

SC - Santa Catarina

SSF - Sacarificação e Fermentação Simultâneas

UFC - Unidade Formadora de Colônia

UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul

UNOESC - Universidade do Oeste de Santa Catarina

US$ - United States (dollar)

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Classificação das macrofitas .................................................................... 21

Figura 2 - Diferenciação dos gêneros das macrofitas. (a)Wolffia sp.; (b)Lemna sp. 24

Figura 3 - Ciclo do CO2 no meio ambiente ............................................................... 26

Figura 4 - Custo da produção de Etanol, em função da matéria prima em distintos

países ........................................................................................................................ 28

Figura 5 - Fluxograma da produção de biocombustíveis de segunda geração ........ 30

Figura 6 - Fluxograma da produção de biocombustíveis de terceira geração .......... 32

Figura 7 - Fluxograma da produção de biocombustíveis de quarta geração ............ 33

Figura 8 - Fluxograma com as rotas tecnológicas para produção de etanol várias

biomassas ................................................................................................................. 42

Figura 9 - Fluxograma dos fundamentos do processos de hidrólise para conversão

e produção de etanol a partir de materiais celulósicos .............................................. 46

Figura 10 - (a) Lagoa natural com biomassa vegetal; (b) Coleta de Lemna minuta . 51

Figura 11 - Fluxograma das etapas realizadas para quantificação do teor de

carboidratos ............................................................................................................... 52

Figura 12 - Fluxograma do pré-tratamento e da quantificação dos açúcares

redutores ................................................................................................................... 53

Figura 13 - Curva padrão de açúcares redutores ..................................................... 56

Figura 14 - Fluxograma das etapas da fermentação ................................................ 57

Figura 15 - Curva padrão da densidade do crescimento microbiano ....................... 58

Figura 16 - Gráfico de superfície de resposta para a concentração de glicose após

hidrólise ácida, em função da concentração do ácido e da temperatura: (a) Ácido

clorídrico; (b) Ácido sulfúrico ..................................................................................... 64

Figura 17 - Gráfico de superfície de resposta para a concentração de glicose após

hidrólise ácida, em função da concentração do ácido e de tempo: (a) Ácido

clorídrico; (b) Ácido sulfúrico ..................................................................................... 65

Figura 18 - Perfil dos valores previstos/otimizados e da desejabilidade em relação

aos ácidos: (a) clorídrico; (b) sulfúrico ...................................................................... 66

Figura 19 - Gráfico de superfície de resposta para a eficiência na produção de

glicose após hidrólise enzimática, em função: (a) Temperatura e pH; (b) Tempo e pH

.................................................................................................................................. 69

14

Figura 20 - Perfil dos valores da desejabilidade em relação ao tempo, temperatura

e pH ........................................................................................................................... 70

Figura 21 - Produção de etanol de Lemna minuta versus consumo de açúcar redutor

total ........................................................................................................................... 71

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação dos biocombustíveis com base em suas tecnologias de

geração ..................................................................................................................... 34

Tabela 2 - Produção de biocombustíveis (2008) nos principais centros mundiais .... 35

Tabela 3 - Produção mundial de etanol, em bilhões de litros por ano ...................... 40

Tabela 4 - Planejamento experimental das hidrólises ácidas: fatorial 23 .................. 54

Tabela 5 - Hidrólises Enzimáticas: 40º, 50°C e 60°C ................................................ 55

Tabela 6 - Teor de Carboidratos na biomassa de Lemna minuta ............................. 60

Tabela 7 - Teor de açúcar redutor disponível na Lemna minuta após hidrólise com

HCL, e eficiência de Sacarificação ............................................................................ 62

Tabela 8 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise com

Ácido Sulfúrico, e eficiência (%) do método .............................................................. 63

Tabela 9 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise

enzimática com temperatura de 40°C, e eficiência (%) do método ........................... 67

Tabela 10 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise

enzimática com temperatura de 55°C, e eficiência (%) do método ........................... 67

Tabela 11 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise

enzimática com temperatura de 70°C, e eficiência (%) do método ........................... 68

Tabela 12 - Concentração de substrato, consumo e produção de etanol a partir da

fermentação alcoólica á 30ºC .................................................................................... 71

Tabela 13 - Potencial de produção de bioetanol proveniente de biomassas vegetais

.................................................................................................................................. 73

15

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 17

1.2 OBJETIVO GERAL ................................................................................... 19

1.2.1 Objetivos Específicos ............................................................................. 19

2 REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................... 20

2.1 MACRÓFITAS AQUÁTICAS .................................................................... 20

2.3 BIOCOMBUSTÍVEL: ALTERNATIVA, INOVAÇÃO E CONCORRÊNCIA . 25

2.3.1 Biocombustíveis de Primeira Geração.................................................. 28

2.3.2 Biocombustíveis de Segunda Geração ................................................. 29

2.3.3 Biocombustíveis de Terceira Geração .................................................. 30

2.3.4 Biocombustíveis de Quarta Geração .................................................. 32

2.3.5 O Mercado de Biocombustíveis ............................................................. 34

2.3.6 Tipos de biocombustíveis ...................................................................... 36

2.3.6.1 Biodiesel ................................................................................................... 37

2.3.6.2 Biogás ...................................................................................................... 38

2.3.6.3 Bio-óleo .................................................................................................... 39

2.3.6.4 Biobutanol ................................................................................................ 39

2.3.6.5 Bioálcool / Bioetanol ................................................................................. 39

2.4 BIOETANOL PRODUZIDO DE BIOMASSA DE MACRÓFITAS............... 43

2.4.1 Hidrólise ................................................................................................... 44

2.4.1.1 Hidrólise enzimática .................................................................................. 46

2.4.1.2 Hidrólise ácida ........................................................................................... 47

2.4.2 Fermentação alcoólica ........................................................................... 49

3 METODOLOGIA ...................................................................................... 51

3.1 AMOSTRAS ............................................................................................. 51

3.2 TEOR DE CARBOIBRATO DA BIOMASSA ............................................. 52

3.3 HIDRÓLISES ............................................................................................ 53

3.3.1 Pré-tratamento da biomassa .................................................................. 53

3.3.1.1 Hidrólise Ácida.......................................................................................... 53

3.3.1.2 Hidrólise Enzimática ................................................................................. 54

3.3.2 Quantificação de açúcares redutores ................................................... 55

3.4 ENSAIOS FERMENTATIVOS .................................................................. 57

3.5 QUANTIFICAÇÃO DO ETANOL .............................................................. 59

16

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS ........................................ 59

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 60

4.1 TEOR DE CARBOIDRATO ...................................................................... 60

4.2 PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA ....................................................... 61

4.2.1 Hidrólise ácida ........................................................................................ 61

4.2.1.1 Ácido Clorídrico ........................................................................................ 61

4.2.1.2 Ácida Sulfúrico......................................................................................... 63

4.2.3 Comparativo entre as hidrólises ácidas ............................................... 64

4.2.4 Hidrólise enzimática ............................................................................... 67

4.3 ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO ............................................................... 70

4.4 BIOETANOL DE LEMNA MINUTA VERSUS FONTES ALTERNATIVAS 72

5 CONCLUSÕES ........................................................................................ 74

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 75

17

1 INTRODUÇÃO

A demanda por energia cresce em ritmo acelerado, e os grandes

responsáveis pelo salto na demanda de energia são os países em desenvolvimento.

O Brasil, segundo a Agência Internacional de Energia (AIE) vai crescer até o ano de

2035, cerca de 2,2% ao ano, devendo chegar a uma demanda de 421 milhões de

toneladas equivalentes de petróleo (BIOENERGIA, 2004; HOSSAIN et al., 2008).

A atual matriz energética brasileira, segundo o Balanço Energético

Nacional (BEN, 2015), é composta por 45,52% de energia renovável. A matriz

energética mundial, segundo a Agência Internacional de Energia (AIE), possui

apenas 10% de contribuição renovável em sua matriz energética.

Apesar da grande vantagem brasileira no consumo de combustíveis

renováveis, deve-se levar em consideração a dependência por derivados do

petróleo, pois se trata de uma fonte não renovável, com reservas limitadas e

localizadas em regiões predominantemente com conflitos político-econômicos,

gerando assim distúrbios no equilíbrio de oferta e demanda, por causa da flutuação

do preço, fornecimento e distribuição.

Sendo que, os derivados do petróleo também são responsáveis pela

elevada liberação à atmosfera de gases causadores do efeito estufa, fenômeno que

resulta no aquecimento global e em alterações climáticas.

A preocupação e a exigência desta situação, tem levado a um aumento

da investigação por fontes de energia alternativas renováveis, eficientes, de baixo

custo e capazes de contribuir para a sustentabilidade econômica e ambiental

(CHISTI, 2007; JOHN et al., 2011), como é o caso da energia solar, da energia

eólica e, claro, dos biocombustíveis, dentre eles o bioetanol.

O bioetanol, etanol lignocelulósico ou etanol de segunda geração é obtido

por meio da hidrólise de polissacarídeos presentes na parede celular de biomassas.

Esses polissacarídeos são continuamente renovados na natureza mediante a

biotransformação de energia solar e CO2 através da fotossíntese (LYND et al.,

2005). A biomassa lignocelulósica (gramíneas, palha de trigo, bagaço e palha de

milho, madeira) é geograficamente distribuída e a sua conversão em bioetanol

favorece a redução das emissões dos gases do efeito estufa (GEF) em comparação

com as emissões da combustão de gasolina (DOE, 2006; RUBIN, 2008; SLADE et

al., 2009). Os processos mais empregados na conversão de biomassa em açúcares

18

fermentescíveis são a hidrólise enzimática ou hidrólise por meios ácidos (SHELLEY,

2009; SLADE et al., 2009).

Nesta pesquisa, foi avaliado o potencial da biomassa de macrófitas

aquáticas flutuantes, para produção de bioetanol de segunda geração, onde esta

foi submetida à hidrólise enzimática e hidrólise ácida, transformando unidades

celulósicas em glicosídicas que posteriormente foram fermentadas para obtenção de

álcool etílico (KARIMI et al., 2006; OGEDA et al., 2010).

Podem ser consideradas macrófitas aquáticas todas as espécies

herbáceas (Charophyta, Anthocerotophyta, Hepatophyta, Briophyta, Psilotophyta,

Lycophyta, Pteridophyta, Arthrophyta e Magnoliophyta) visíveis a olho nu, que em

condições normais podem se desenvolver em ambientes aquáticos e que possuem

suas partes fotossinteticamente ativas permanentemente, ou por diversos meses,

todos os anos, total ou parcialmente submersas em água doce ou salobra, podendo

ainda ser flutuantes (COOK, 1974; FASSET, 1957; IRGANG; GASTAL JR., 1996).

As macrófitas aquáticas incluem um conjunto diversificado de plantas que

se tenham adaptado a partir de espécies terrestres à vida integralmente, ou

parcialmente em água doce (CALOW; PETTS, 1996). Em consequência,

apresentam ainda várias características de vegetais terrestres, como a presença de

cutícula, embora fina e de estômatos, na maioria das espécies não funcionais .Com

relação à distribuição geográfica, pode-se considerar que as macrófitas aquáticas de

um modo geral apresentam distribuição cosmopolita. Tal cosmopolitismo se deve

fundamentalmente a maior homogeneidade térmica que os ambientes aquáticos

apresentam em relação aos terrestres, estes, sempre com maior endemismo

(ESTEVES, 1998).

Ainda assim, estudos sobre ecologia de macrófitas aquáticas no Brasil

são relativamente escassos. As justificativas para a necessidade atual do aumento

de número de estudos podem ser resumidas considerando-se os seguintes

aspectos: (I) existe uma grande quantidade de ecossistemas que abrigam espécies

de macrófitas aquáticas; (II) as macrófitas aquáticas desempenham diferentes

funções ecológicas; (III) as macrófitas aquáticas constituem um grupo de

organismos especialmente adequado, devido à alta biodiversidade e ao rápido

crescimento para o teste de hipóteses ecológicas e para estudos experimentais

(THOMAZ; BINI, 2003)

19

A macrófita selecionada para esse estudo pertence à família lemnaceae,

da espécie Lemna minuta (LANDOLT, 1986), tal opção adveio pela localização

geográfica (Meio Oeste de Santa Catarina) da mesma e, a facilidade da angaria e

do preparo da biomassa.

O estudo aqui apresentado assume a necessidade da busca pela

diversificação de biomassas para a produção de bioetanol de segunda geração,

devido a grande importância que o tema de bioenergia representa sob a ótica

econômica e ambiental neste novo milênio. Sendo o Brasil um país-continente rico

em recursos aquáticos, é totalmente oportuno e já estão em prática, iniciativas

envolvendo o cultivo de macrófitas para fins energéticos. O constante crescimento

econômico do Brasil acelera o desenvolvimento das indústrias, que

consequentemente aumentam o consumo de combustível (SOARES, 2010). E além

disto, mostra que estudos desta natureza devem ser desenvolvidos na busca pela

diversificação da matriz energética através de energia renovável.

Neste trabalho, a escolha recaiu sobre as macrófitas, da família

Lemnaceae, cujo gênero Lemna minuta, com o intuito de atingir um rendimento

considerável de bioetanol de segunda geração, apontando para uma proposta de

biomassa ainda não explorada no Brasil.

1.2 OBJETIVO GERAL

Avaliar potencial de sacarificação e despolimerização de biomassa de

lemna minuta, por hidrólise química e enzimática para produção de bioetanol de

segunda geração.

1.2.1 Objetivos Específicos

a) Quantificar os carboidratos presentes na biomassa da macrófita e testar

metodologias de hidrólise ácida e enzimática quanto à capacidade de sacarificação;

b) Submeter o caldo hidrolisado de macrófitas á ensaios de fermentação para

produção de bioetanol;

c) Quantificar a produção de etanol , bem como o consumo do substrato;

d) Realizar estudo cinético quanto a velocidade de produção de etanol e de

consumo de ART.

20

2 REFERENCIAL TEÓRICO

Este capítulo aborda aspectos relevantes ao uso da biomassa para fins

energéticos, destacando assuntos referentes às suas características físico-químicas,

aos métodos utilizados na extração de celulose e às aplicações deste subproduto

como biocombustível.

2.1 MACRÓFITAS AQUÁTICAS

As macrófitas aquáticas compreendem as formas macroscópicas de

vegetação aquática, incluindo: macroalgas, musgos, espécies de pteridófitas

adaptadas ao ambiente aquático e as verdadeiras angiospermas, originárias do

ambiente terrestre com adaptações para a vida na água (SPENCER; BOWES,

1993; SCREMIN-DIAS et al., 1999). Podem ser consideradas plantas que vivem na

água ou sobre a água, ou ainda, plantas de margem que têm relação com água em

abundância (POTT; POTT, 2000). Outra definição considera estes organismos como

vegetais visíveis a olho nu, cujas partes fotossinteticamente ativas estão

permanentemente (ou por diversos meses) total ou parcialmente submersas em

água doce ou salobra ou ainda flutuantes (IRGANG; GASTAL JR., 1996).

Os autores que citaram o termo “Macrófitas aquáticas” pela primeira

vez foram Weaver e Clement em 1938, como “plantas herbáceas que crescem na

água e em solos cobertos ou saturados com água”. Em 1967, Sculthorpe o

modificou, incluindo sob a denominação de Macrófitas aquáticas, diversos grupos

taxonômicos, como liquens, algas macroscópicas, plantas vasculares, musgos e

vegetais que habitam desde brejos até ambientes verdadeiramente aquáticos. Na

literatura existem vários outros termos que denominam estas plantas como,

hidrófilas, helófitas, limnófilas, plantas aquáticas e macrófitas (VIDOTTI;

ROLLEMBERG, 2004). Desta forma, o termo macrofitas foi utilizado neste estudo.

Por incluírem diversos tipos de vegetais a composição química das

macrofitas aquáticas é variada, pois, dependendo da estratégia de sobrevivência há

a necessidade diferenciada da produção de estruturas de sustentação (POTT et al.,

1999).

Distinguem-se, geralmente, três tipos principais de plantas aquáticas

quanto à posição na superfície da água (Figura 1).

21

I) submersas: plantas que ocupam áreas marginais de rios, lagos e reservatórios e

até as zonas mais profundas; porém, não superiores a 10m, devido à pressão

hidrostática e à limitação de luz. Podem estar fixas aos sedimentos por meio de

raízes, como Potamogeton, Egeria, Hydrilla e Mayaca; ou livres, acumulando-se nos

estratos próximos à superfície, tais como a Utricularia e Ceratophyllum. Ao

realizarem a fotossíntese, o oxigênio desprendido se dissolve na água auxiliando a

aeração do ambiente. Esse processo, todavia, pode não compensar os déficits de

oxigênio originados pelo acúmulo de detritos produzidos por esses vegetais;

II) emergentes: vegetais enraizados, suas folhas e flores, porém, são flutuantes

(Nymphaea, Nymphoides, Vitoria amazonica) ou emergem eretas (por exemplo:

Typha, Pontederia, Cyperus, Juncus, Eleocharis). As espécies emergentes, além de

sombrear o meio,impedem o desenvolvimento de outros vegetais e liberam o

oxigênio, gerado na fotossíntese, para fora da água;

III) flutuantes: as espécies flutuantes podem cobrir extensas áreas de lagos e

reservatórios, impedindo a penetração de luz e, por conseguinte, o desenvolvimento

de algas e da vegetação submersa. Entre os gêneros mais comuns de plantas

aquáticas flutuantes destacam-se Salvinia, Lemna, Azolla, Eichhornia e Pistia

(THOMAZ; BINI; 2003).

Fonte: Pedralli (1990)

Macrófitas aquáticas podem colonizar diversos ambientes entre os quais

se destacam: fontes termais, cachoeiras, lagos, brejos, rios, corredeiras, ambientes

salobros e salgados. Essas plantas possuem excelente capacidade de adaptação

em ambientes diversificados, o que possibilita que uma mesma espécie faça parte

Figura 1 - Classificação das macrofitas

22

de diferentes ecossistemas (POTT et al., 1999).

De acordo com Dennis (1984) as macrofitas aquáticas têm habilidade de

converter energia e nutrientes minerais em matéria orgânica , sendo utilizadas como

fonte de alimentos para muitas espécies de organismos. As macrófitas são

considerados macro e micro habitats para diversos grupos de plantas e animais

macroscópicos e microscópicos; são utilizadas como substrato para postura e áreas

berçários por vertebrados e invertebrados aquáticos, absorção e ciclagem de

nutrientes e a habilidade para construir e estabilizar substratos (ESTEVES, 1998).

As macrófitas aquáticas possuem uma ampla faixa de tolerância à

temperatura, podendo ocorrer em abundância em regiões de climas tropical e

temperado. Esses vegetais podem estar submetidos a temperaturas que vão de

próximo a zero até mais de 40 °C (BOWES et al., 1979). Embora temperaturas

elevadas favoreçam o desenvolvimento de macrófitas aquáticas de diferentes

grupos ecológicos (THOMAZ; BINI; 2003).

A região do Meio Oeste de Santa Catarina, possui seus municípios

situados na Zona Agroecológica 3A segundo a classificação do Zoneamento

Agroecológico e Socioeconômico do Estado de Santa Catarina. Nesta zona o clima

é classificado como Cfb, ou seja, clima temperado constantemente úmido, com

verão fresco, sem estação seca. As média anuais da temperatura variam de 10,8°C

à 25,8° (EPAGRI; CIRAM, 2008). Tais valores sustentam aqueles citados como

pertencentes ao intervalo térmico propicio ao desenvolvimento das macrófitas.

A movimentação da água é outro fator importante que pode limitar o

crescimento e até mesmo a ocorrência de macrófitas aquáticas. Essa variável pode

atuar diretamente sobre o vegetal ou indiretamente, interferindo na estabilidade do

sedimento. Embora a correnteza e a turbulência intensa impeçam o crescimento de

macrófitas, a movimentação moderada da água pode ser um fator positivo,

favorecendo a dispersão, o crescimento e o aumento da produtividade . O seu

crescimento excessivo no ambiente pode causar efeitos prejudiciais, pois, sob

condições ótimas crescem em média 5% ao dia. As principais consequências desse

crescimento excessivo são a eliminação de habitat de desova para peixes, a

alteração na estruturação do ambiente, a cobertura do espelho d’água, o

impedimento da navegação e irrigação (ESTEVES, 1998).

O manejo e controle do crescimento excessivo de macrófitas aquáticas

pode ser agrupado em três categorias, que poderão ser aplicadas isoladamente ou

23

em conjunto conforme a necessidade do ambiente. Podendo ser o controle

mecânico, feito através de equipamentos que podem colher, dragar, empurrar,

rebocar, picar, cortar ou realizar duas ou mais dessas funções conjuntamente tem se

tornado mais efetivo com o desenvolvimento de novos equipamentos

(MARCONDES et al., 2003). As duas principais desvantagens do emprego destes

equipamentos são os seus altos custos e o fato de que a retirada é geralmente

imperfeita . Por outro lado, não apresenta os inconvenientes do uso de agentes

químicos e biológicos (ESTEVES, 1998).

O controle químico que envolve o uso de herbicidas em meio aquático, é

uma ferramenta poderosa, mas requerem conhecimento para que sejam utilizados

de forma segura e eficaz (MURPHY; BARRETT, 1990). Este método, embora muito

empregado, traz grandes prejuízos ao meio ambiente, decorrentes de sua pouca

seletividade. Assim, sua atuação restringe-se não somente a uma macrófita aquática

específica, mas sobre toda a biota aquática e, em muitos casos, até sobre a

terrestre. No aspecto ambiental o controle biológico é o mais recomendável, pois

está inserido dentro da dinâmica natural dos ecossistemas. Além disto, possibilita a

transformação da biomassa de macrófitas aquáticas em biomassa animal através da

cadeia alimentar, podendo subsequentemente ser aproveitada pelo homem

(ESTEVES, 1998).

Dentre os diferentes animais capazes de serem utilizados no controle

biológico de macrófitas aquáticas, os peixes e mamíferos herbívoros são os mais

eficientes. Dentre estes, destacam-se, entre os peixes, a carpa (Ctenopharyngodon

idella), a tilápia (Tilapia rendali e T. zilii) e entre os mamíferos, o peixe-boi

(Trichechus inunguis) (ESTEVES, 1998).

As regiões litorâneas de ambientes lênticos como lagos e os reservatórios

podem ser consideradas importantes ecótonos (PIECZYŃSKA, 1990) e constituem

ambientes onde as taxas de produtividade primária são excepcionalmente altas,

sendo frequentemente incluídas entres as regiões mais produtivas do planeta (

WETZEL, 2000) pela presença de macrófitas aquáticas.

As macrófitas aquáticas também ocupam um papel central da dinâmica

dos ciclos biogeoquímicos das regiões litorâneas dos ecossistemas aquáticos

continentais (PIECZYŃSKA, 1990). Tais vegetais apresentam uma grande

capacidade de assimilação e estocagem de nutrientes e de carbono sendo assim,

24

responsáveis pela maior parte da produção de detritos de origem autóctone

(PIEDADE et al., 1997).

2.2 CARACTERSÍTICAS DAS LEMNÁCEAS UTILIZADAS NO ESTUDO

As macrofitas aquáticas, são frequentemente confundidas com algas, mas

pertencem às angiospermas que compreendem a divisão Anthophyta. São

monocotiledôneas aquáticas flutuantes, consideradas as menores plantas

vasculares com flores do mundo (RAVEN, 1996).

No mundo todo os estudos com macrofitas aquáticas são bastante

difundidos, porém no Brasil ainda são pioneiros e de extrema relevância, uma vez

que é um país com grandiosa riqueza de recursos hídricos ameaçada pelo

crescimento desordenado da população (MOHEDANO, 2004).

As macrofitas aquáticas popularmente conhecidas como lentilhas d´água,

duckweed ou lemnas, referenciando aqui as Lemnaceae, são as menores plantas

vasculares do mundo, espécies vegetais que se adaptaram ao ambiente aquático ao

longo de seu processo evolutivo (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).

A família Lemnaceae é composta por quatro gêneros: Wolfiella, Spirodela,

Wolfia e Lemna, representadas por 36 espécies, sendo o gênero Wolfia, o maior

com cerca de 14 espécies (JOLY, 2002). No Brasil, principalmente na região do

Pantanal do Mato Grosso existem espécies pertencentes a todos os gêneros de

Lemnáceas conhecidos. Das treze espécies existentes no Brasil, oito ocorrem no

Pantanal (POTT et al., 1999).

Nomes científicos: Lemna valdiviana, Spirodela sp., Wolffia brasiliensis,

Wolffiella sp. No Brasil os estudos relacionados à Lemna sp. e Wolffia sp. (Figura 2)

são raros quando comparados com outras famílias. Estas plantas são muito

pequenas, mas podem ser utilizadas para diversas finalidades.

Figura 2 - Diferenciação dos gêneros das macrofitas. (a)Wolffia sp.; (b)Lemna sp.

Fonte: Thomaz; Bini, 1999.

(b) (a)

25

Estas macrófitas não apresentam diferenciação de caule. São reduzidas a

um pequeno corpo talóide vegetativo, que recebe a denominação de fronde. As

espécies são andróginas, monóicas, aquáticas anuais. Elas vivem em água doce,

levemente submersa, ou flutuantes livres na superfície. Pequena parte da fronde fica

exposta ao ar ou permanece completamente submersa, aparecendo no período de

floração. A propagação é feita na maioria das vezes por processo vegetativo a partir

do tecido meristemático. Esse processo inicia-se através da formação de uma ou

duas cavidades vegetativas ou reprodutivas que dão origem a frondes filhas e essas

por sua vez a outras frondes filhas e assim por diante (LANDOLT, 1987).

Estudos mostram que algumas espécies funcionam como excelente fonte

de proteína para alimentação animal e humano (RUSSOF, et al., 1978). Alguns

autores sugerem que estas plantas apresentam alto valor nutricional, os que as

tornam boas substitutas da soja na alimentação (HAUSTEIN, et al., 1990).

Neste viés, a família Lemnaceae em estudo nesta pesquisa possui

grande potencial para ser utilizada em processos biotecnológicos (LANDOLT,1987),

incluindo remoção de nutrientes ou metais pesados da água (FUJITA et al., 1999) e

o uso em tratamentos de água. Estudo demonstraram que as espécies dos gêneros

Lemna e Spirodela, são consideradas ótimos filtros biológicos, absorvendo 97% de

retenção de coliformes, metais pesados e excesso de nutrientes (BERGMANN et al.,

2000).

Estudos relatam a capacidade de acumulação de açúcares desta

biomassa , que poderão ser utilizados como substrato para a produção de bioetanol

e que possuem uma grande capacidade de ligação com metais, devido à presença

de polissacarídeos e proteínas na superfície da parede celular, onde grupos

hidroxilo, amino, carboxilo e alquilo, marcam presença e funcionam como locais de

adsorção dos metais (LEE; LAVOIE, 2013).

2.3 BIOCOMBUSTÍVEL: ALTERNATIVA, INOVAÇÃO E CONCORRÊNCIA

A procura de recursos limpos que permitam assegurar as necessidades

energéticas futuras constitui um dos maiores desafios da atualidade. A utilização de

biomassa como fonte alternativa à energia primária, de origem fóssil revelou-se uma

excelente alternativa, pois pode permitir uma melhoria da qualidade de vida,

particularmente em países sem reservas de combustíveis fósseis, como é o caso do

Brasil, diminuindo a sua dependência econômico-energética do exterior e, reduzindo

26

os impactos negativos resultantes da sua queima (BIOENERGIA, 2004; HOSSAIN et

al., 2008).

A queima de combustíveis fósseis , assim como os demais combustíveis,

libera gás carbônico, principal responsável pelo efeito estufa. Porém, esse gás

gerado é consumido na fotossíntese por sua matéria-prima ao longo do seu

desenvolvimento, fechando assim um ciclo no qual a concentração de CO2 no meio

ambiente permanece constante, conforme ilustrado na Figura 3.

Figura 3 - Ciclo do CO2 no meio ambiente

Fonte: Mata et al. (2010)

Os biocombustíveis permitem o desenvolvimento de novas oportunidades

como a diversificação das fontes de abastecimento de combustível, desenvolvimento

da agricultura tradicional, melhoramento das condições econômicas das populações

do meio rural e, redução da dependência energética dos combustíveis fósseis

(MATA et al., 2010).

Neste esguelha, os biocombustíveis se inserem mediante a obtenção de

vantagens competitivas entre agentes, que procuram diferenciarem-se uns dos

outros nas mais variadas dimensões do processo competitivo, tanto tecnológico

quanto os de mercado. O escopo de opções da matriz energética para investimentos

diretos é muito extenso, e em algumas dessas opções o mercado precisa ser

induzido à exploração econômica, lucrativa e, portanto o Estado tem a competência

27

de ser indutor da criação de mercado e da capacidade de atrair investimentos para

alguns produtos e insumos como o biodiesel, que possui base na indústria de

agronegócio.

Existe um potencial grande a ser explorado, tanto em relação ao

aproveitamento energético de culturas temporárias e perenes, quanto ao

aproveitamento energético do óleo residual proveniente da alimentação. A

implementação de um programa energético de biocombustível abre oportunidades

para o crescimento e desenvolvimento decorrentes do alto índice de geração de

emprego por capital investido.

A ideia da produção surge com a aliança de alternativas de energia

renovável, por conta da limitação dos recursos minerais produtores de energia, a

exemplo o petróleo, com o desenvolvimento e geração de emprego e renda. A

agricultura é alternativa viável, do ponto de vista econômico, social e ambiental, para

a geração de energia renovável. A produção de álcool, a partir da cana-de-açúcar, é

um exemplo mundial de sucesso, por substituir parte substancial de gasolina no

transporte (JOHN et al., 2011; NIGAM; SINGH, 2011).

Existem grandes desafios pela frente, entre eles o desenvolvimento de

tecnologia, com a definição de plantas mais aptas, sistemas de produção eficientes

e definição de regiões com potencial para a produção. Há necessidade de novas

tecnologias industriais, que transformem biomassas em biocombustíveis.

Os principais biocombustíveis que podem substituir os tradicionais

combustíveis (diesel e gasolina) nos veículos atuais, sem que sejam necessárias

alterações significativas na sua engenharia, são o biodiesel e o bioetanol,

respectivamente (MATA et al., 2010; NAIK et al., 2010). Um outro biocombustível

que atualmente é visto como versátil e, com valia para o futuro é o bio-hidrogénio

que, pode ser utilizado como combustível num motor de combustão interna e trata-

se do único combustível verdadeiramente livre de emissões de carbono, já que da

sua oxidação resultam apenas moléculas de água (KOTAY; DAS, 2008).

Com base no tipo de matéria-prima utilizada e, na tecnologia de

conversão envolvida, os biocombustíveis são essencialmente classificados como

biocombustíveis de primeira ou segunda geração (ESCOBAR et al., 2009; NAIK et

al., 2010), embora alguns autores preconizem já uma terceira geração a partir de

matérias-primas totalmente diferentes e que se encontram fora do Reino das Plantas

(JOHN et al., 2011; NIGAM; SINGH, 2011).

28

2.3.1 Biocombustíveis de Primeira Geração

Os biocombustíveis de primeira geração (Figura 4), dominam atualmente

o mercado dos biocombustíveis com uma produção anual de 50.000 milhões de

litros (NAIK et al., 2010). Conforme Biocombustíveis (2011), estes, são

principalmente derivados de culturas alimentares ricas em sacarose (beterraba

sacarina e cana-de-açúcar), amido (batata, milho e trigo) e/ou óleos vegetais

(girassol, soja e colza), utilizando tecnologias simples e já implementadas

industrialmente (hidrólise/fermentação).

Figura 4 - Custo da produção de Etanol, em função da matéria prima em distintos países

Fonte: Adaptado de Henniges; Zeddies (2005)

As vantagens que estes combustíveis oferecem, prendem-se com baixas

emissões de CO2 , em alguns casos o balanço pode ser zero se, as emissões de

CO2 globais corresponderem à quantidade sequestrada através da fotossíntese

durante o crescimento da biomassa, resultando num ciclo fechado de carbono e,

com a ocorrência de proporcionarem uma melhoria na segurança energética

(HOSSAIN et al., 2008).

Todavia, às vantagens que caracterizam esta geração estão ligadas

algumas preocupações. A mais comum é que, à medida que aumenta a procura (e a

capacidade de produção), aumenta a competição com a agricultura por terras

aráveis para a plantação de culturas para fins alimentares. Esta pressão pode ter

consequências ao nível do preço dos bens alimentares, da biodiversidade (NAIK et

al., 2010) e, numa situação mais extrema, pode levar à escassez de alimentos, em

29

especial nos países em desenvolvimento, onde já são mais de 800 milhões de

pessoas a sofrer de fome e subnutrição (SCHENK et al., 2008).

As grandes quantidades de água que são necessárias e a sazonalidade

das culturas, são outros aspectos negativos. Estudos recentes mostraram ainda que

as grandes quantidades de N2O (Óxido Nitroso) que entram na atmosfera são

resultado da aplicação de fertilizantes azotados nas culturas. Esta situação contribui

tanto ou mais para o aquecimento global que o CO2 emitido pelos combustíveis

fósseis, porque o N2O tem 310 vezes o potencial de aquecimento global do CO2

(FERNANDO et al., 2006; LI et al., 2008). Além disso, a esta utilização pode estar

associada a poluição dos terrenos agrícolas e das fontes de água, com

consequências na segurança alimentar (BLOTTNITZ; CURRAN, 2007; JOHN et al.,

2011). Para se tornarem uma alternativa viável, os biocombustíveis devem garantir

ganho energético, benefícios ambientais (sequestração de CO2 e redução de

emissões), competitividade econômica e potencial de produção em grandes

quantidades, mas sem ameaçar a produção de bens alimentares (HILL et al., 2006).

2.3.2 Biocombustíveis de Segunda Geração

A segunda geração de biocombustíveis difere da primeira, na medida em

que propõe outras fontes de matéria-prima. Segundo Escobar et al. (2009),

nomeadamente este combustível é obtido a partir de uma biomassa que não é

tradicionalmente usada na alimentação humana ou animal como: resíduos

lenhocelulósicos de vegetais e agroindustriais.

Estes resíduos correspondem a mais de 50 % da biomassa produzida

mundialmente, sendo por isso, uma alternativa de baixo custo que, não concorrendo

com a produção de alimentos, ainda tem o potencial de poder ser utilizada para a

subsequente produção de biocombustíveis (ESCOBAR et al., 2009; JOHN et al.,

2011).

A biomassa lenhocelulósica apresenta na sua constituição celulose,

hemicelulose e legnina . A celulose é um homopolímero composto por moléculas de

glucose unidas por ligações glicosídicas do tipo β(1-4) que tornam a estrutura

compacta. A hemicelulose é um heteropolímero, cuja cadeia principal é constituída

por moléculas de xilose unidas por ligações glicosídicas do tipo β(1-4) e as

ramificações podem conter manose, arabinose, ramnose e galactose. Por fim, a

legnina diz respeito a uma associação de várias moléculas, nomeadamente, os

30

álcoois coniferílico, cumarílico, e sinapílico. Este polímero pode encontrar-se

covalentemente ligado à hemicelulose por ligações do tipo éster com ácido ferúlico

(GRAY et al., 2006). A Figura 5, apresenta as etapas da produção de bioetanol de

segunda geração.

Figura 5 - Fluxograma da produção de biocombustíveis de segunda geração

Fonte: adaptado de: <biossistemas.wordpress.com>

A compactação e complexidade destas matérias, fazem com que a

disponibilidade dos açúcares fique comprometida e, por essa razão têm de ser

submetidas a pré tratamentos muito rigorosos e a tecnologias de

hidrólise/fermentação, gaseificação ou pirólise. A maior parte destes processos, que

para além de serem difíceis ainda não atingiram padronização mínima e

características de tecnologias plenamente desenvolvidas, acarreta custos elevados,

o que faz com que a sua produção ainda não esteja implementada em larga escala

(HARUN et al., 2010b; NAIK et al., 2010).

2.3.3 Biocombustíveis de Terceira Geração

Na busca de alternativas para fornecer energia mais “verde” a custos

suportáveis, um forte entusiasmo tem vindo a ser gerado em torno do potencial

oferecido pelas algas como fonte energética. As algas desempenham um papel

essencial na biosfera, já que são as responsáveis pela produção da maior parte do

oxigênio existente na atmosfera, para além de ser uma importante fonte de alimento

31

para outros organismos aquáticos, podem ainda ser utilizadas como suplementos

alimentares e alimentos funcionais (GOUVEIA et al., 2011).

São um grupo morfologicamente diversificado de organismos

fotossintéticos, com mais de 40.000 espécies identificadas e muitas outras por

identificar. Com base em características como motilidade, tipo de pigmentos

fotossintéticos e natureza dos materiais de reserva produzidos, modo de reprodução

e composição química da parede celular (se presente), as algas podem ser

classificadas nas divisões sumarizadas (HU et al., 2008).

Alguns autores defendem, contudo, a inserção de mais divisões,

nomeadamente da divisão Cyanochloronta, onde estão contidas as cianobactérias.

O termo “algas” engloba assim uma grande variedade de organismos – as

microalgas (organismos unicelulares eucariotas produto de 3 000 milhões de anos

de evolução), as macroalgas (que representam o extenso grupo de organismos

marinhos) e as cianobactérias (organismos procariotas também designados por

algas azuis) (CANO; COLOMÉ, 1986; ROSENBERG et al., 2008; SIALVE et al.,

2009; FERREL; SARISKY-REED, 2010).

A grande maioria das microalgas apresenta um metabolismo autotrófico

fotossintético que se caracteriza pela sua capacidade de sintetizar matéria orgânica

de reserva a partir de carbono inorgânico (nomeadamente CO2 atmosférico), através

do processo de fotossíntese (RICHMOND, 2004; TSUKAHARA; SAWAYAMA, 2005;

ESHAQ et al., 2010).

O conceito de utilização de algas como matéria-prima energética remonta

ao final dos anos 50, mas o esforço concertado começou com a crise do petróleo na

década de 70. Atualmente sabe-se que as microalgas apresentam diversas

características que lhes permitem tornar-se uma alternativa auspiciosa para a

produção de biocombustíveis (CHISTI, 2007; DISMUKES et al., 2008; LI et al., 2008;

BEER et al., 2009; LARDON et al., 2009; ESHAQ et al., 2010; HARUN et al., 2010a;

PITTMAN et al., 2011). A Figura 6 apresenta as etapas da produção dos

biocombustíveis de terceira geração.

32

Figura 6 - Fluxograma da produção de biocombustíveis de terceira geração

Fonte: adaptado de: <biossistemas.wordpress.com>

Para otimizar o processo , deve-se fazer a escolha prévia do tipo e

espécie de microalga mais apropriada para o efeito que se pretende (FERREL;

SARISKY-REED, 2010). Por exemplo, para a produção de bioetanol, microalgas

como a Spirogyra sp., Dunaliella, Scenedesmus, Prymnesium e Porphyridium são

conhecidas por acumularem grandes teores de amido e glicogénio (> 50 % da

biomassa seca) no seu interior (ESHAQ et al., 2010).

2.3.4 Biocombustíveis de Quarta Geração

As células fotossintéticas em crescimento, manipuladas geneticamente,

quando expostas à luz solar e ao dióxido de carbono são capazes de produzir e

secretar gorduras ricas em energia, que podem ser refinadas diretamente em

biodiesel (ANTOLÍN; 2002). Estes são os denominados biocombustíveis de quarta

geração (Figura 7).

33

Figura 7 - Fluxograma da produção de biocombustíveis de quarta geração

Fonte: adaptado de: <biossistemas.wordpress.com>

O óleo vegetal é usado em vários motores a diesel antigos, que têm

sistemas de injeção indireta. Este óleo é também utilizado para criar o biodiesel, o

qual, quando misturado com o combustível de diesel convencional é compatível com

a maioria dos motores diesel. Óleo vegetal usado é transformado em biodiesel. Por

vezes, a água e as partículas são separadas do óleo vegetal usado e, em seguida,

este é utilizado como um combustível (BALAT, 2008).

Alguns, ônibus de São Paulo circularam em teste com mistura de 10%

deste biodiesel e 90% de óleo diesel fóssil, com comparativo com ônibus operando

apenas com diesel fóssil. A mistura apresentou em testes internos 9% de redução

nas emissões de materiais particulados à atmosfera quando comparado ao diesel

derivado do petróleo e manteve sem alteração os parâmetros de desempenho do

motor (ANTOLÍN, 2002).

O processo pode ser adaptado e complementado para a produção de

gasolina e querosene de aviação. No caso do querosene de aviação necessita-se de

moléculas mais compactas e que não formem sólidos e gelo pelos gases de

exaustão em grandes altitudes e baixas temperaturas. Neste contexto , apresenta-se

a Tabela 1, que elucida os biocombustíveis de primeira, segunda , terceira e quarta

geração.

34

Tabela 1 - Classificação dos biocombustíveis com base em suas tecnologias de geração

Geração Matéria-prima Exemplos

Primeira geração Açúcar, amido, óleos vegetais ou de

gorduras animais

Bioalcoois, óleo vegetal,

biodiesel, biogás

Segunda geração

Culturas não alimentares, palha de

trigo, milho, madeira, resíduos

sólidos, culturas energéticas

Bioalcoois, bio-óleo,

bio-hidrogênio

Terceira geração Algas Óleo vegetal, biodiesel,

Bioetanol

Quarta geração Óleo vegetal, biodiesel Biogasolina

Fonte: DEMIRBAS (2010)

2.3.5 O Mercado de Biocombustíveis

Por definição mais ampla, um biocombustível é qualquer produto usado

como fonte de energia produzido partindo-se de biomassa renovável, como o

aproveitamento de lixo residencial e comercial ou resíduos de processos industriais,

como a serragem, o bagaço e a palha da cana-de-açúcar e as cascas de árvores ou

de arroz, a grama e capins cortados e a palha e talos de milho. Nesta definição,

inclui-se o gás metano proveniente de decomposições anaeróbicas (BRAUN, 2006).

As crises de energia, juntamente com a carência de alimento e a ameaça

à ecologia, constituem os principais problemas que afligem o homem moderno. É

fácil compreender que o desenvolvimento socioeconômico e o aumento populacional

determinam acréscimos à demanda de alimento e de bens de consumo que, por sua

vez, exigem para sua produção, um correspondente aumento na quantidade de

energia e no despejo no ambiente de grandes volumes de resíduos poluentes

inaproveitáveis (MENEZES, 1980).

Esta é uma preocupação mundial , principalmente ao analisarmos até

que ponto, num horizonte próximo, os biocombustíveis podem deslocar os

combustíveis fósseis líquidos, em particular, a gasolina e o óleo diesel. Para rebater

esta problemática, é necessário primeiro comparar a dimensão do mercado destes

derivados de petróleo versus a base e os limites práticos de produção de

biocombustíveis. Dos 3.816 milhões de toneladas de petróleo processados em 2006,

33,1% foi convertido em 16 destilados médios (que incluem o óleo diesel),

representando 1263 Mtep (milhões de toneladas equivalente de petróleo), ao passo

35

que a produção de gasolina representou 23,5% do total – equivalente a 897 Mtep

(IEA, 2009).

A Tabela 2, indica os principais produtores de biocombustíveis, com o

volume de produção mundial de etanol e biodiesel em 2007.

Tabela 2 - Produção de biocombustíveis (2008) nos principais centros mundiais

Legenda: *L: litros; **MTET: Milhões de toneladas equivalentes de petróleo Fonte: FAO (2008)

Comparando com as cifras acima, nota-se que a produção combinada

destes biocombustíveis ainda representa, em termos energéticos, menos de 2% do

total da produção de gasolina e diesel, muito aquém, portanto, de seu potencial

energético. Os EUA e Brasil são os principais produtores de etanol, produzindo em

conjunto cerca de 88% do total mundial, ao passo que a União Europeia (com

destaque para a Alemanha) é a líder na produção de biodiesel, responsável pela

produção de aproximadamente 60% do total.

Além das já mencionadas vantagens ambientais e de aumento da

segurança energética, outra motivação ao fomento na produção de biocombustíveis

tem sido a possibilidade de proporcionar oportunidades para o setor agrícola, que

tem sofrido, nas últimas décadas, uma tendência declinante no preço de alimentos

em quase todo o mundo. Este fenômeno (que foi revertido no último ano) tem

causado uma depressão na produção de alimentos em boa parte das nações em

desenvolvimento, menos capazes de proteger seus produtores agrícolas com

subsídios e barreiras tarifárias, ao contrário do que ocorre em países desenvolvidos.

Assim, esta nova fonte de demanda por commodities agrícolas tem sido também

avaliada por nações do mundo em desenvolvimento, onde 75% dos pobres vivem e

que dependem da agricultura para sua subsistência (FAO, 2008b).

36

Por conta destas forças econômicas, sociais e ambientais, projeções de

demanda global de combustíveis, efetuadas por diversas agências de energia

apontam para um aumento significativo dos mesmos.

Por outro lado, de acordo com projeções da agência internacional de

energia - EIA (2008), a produção de biocombustíveis em 2030 será de 2,7 milhões

de barris de petróleo equivalentes/dia, o que corresponde a 154 MTEP (Milhões de

Toneladas Equivalente Petróleo). Esta projeção está bastante alinhada ao “cenário

de política alternativa,” de demanda de biocombustíveis elaborada pelo IEA (2006),

que estima um salto de 19 MTEP em 2005 para 164 MTEP em 2030 (aumento de

763%), quando então os biocombustíveis deverão ter uma participação de 5,9% do

total da energia usada no referido setor (FAO, 2008).

Projeções do IEA (2005) estimam que a expansão na produção de

biocombustíveis líquidos para a realização do cenário de política alternativa

(deslocamento de 10% da gasolina e diesel em 2020) irá requerer 43% da área

cultivada.

Logo, à parte a viabilidade econômica de se produzir biocombustíveis nos

territórios destes que são os principais mercados mundiais de combustíveis líquidos,

onde é possível a expansão do plantio de agroenergéticos de forma a atender o

expressivo aumento na demanda projetada de biocombustíveis, sem afetar as áreas

agrícolas hoje voltadas para a alimentação humana e animal.

Fatores como geografia, área disponível para cultivo e tecnologia são

chave para o desenvolvimento de biocombustíveis como alternativas

economicamente viáveis a gasolina e ao diesel. Enquanto a tecnologia continuará a

evoluir ao longo do tempo, tornando possível a produção de biocombustíveis a

custos decrescentes, a geografia dos países é, essencialmente, imutável e mesmo a

área disponível para cultivo não poderá mudar substancialmente, sem impactar

ecossistemas ora preservados (MARQUES, 2008).

2.3.6 Tipos de biocombustíveis

As fontes energéticas são extremamente importantes no cotidiano dos

seres humanos atuais, pois originam eletricidade e combustíveis que movimentam

as indústrias e os meios de transportes, viabilizam as atividades comerciais,

domésticas e de serviços. No entanto, a energia encontrada na natureza precisa ser

37

transformada nas refinarias de petróleo, nas usinas hidrelétricas, nas termelétricas,

nas termonucleares; entre outras (TOLMASQUIM et al., 2007).

As necessidades energéticas existentes no mundo são supridas, na sua

maioria, por fontes petroquímicas, carvão e gás natural. No entanto, em uma época

em que o aquecimento global e a poluição ambiental são fatos incontestáveis, a

necessidade de alteração da matriz energética tornou-se prioritária. Há consenso de

que a solução desta questão ambiental e o controle sobre os riscos do mau uso das

fontes energéticas presentes na natureza estão no desenvolvimento e na maior

utilização de fontes energéticas limpas e renováveis (MOLINA-GRIMA et al., 2003).

Isso excitou a busca de alternativas aos derivados de petróleo. Um bom

combustível alternativo deverá ser viável tecnicamente, economicamente

competitivo, ambientalmente seguro e prontamente disponível. Neste contexto

surgem, os combustíveis obtidos a partir de óleos vegetais e gorduras, os chamados

de biodiesel. Um combustível dessa natureza permite um bom equilíbrio entre os

desenvolvimentos agrícola, econômico e ambiental (PIGHINELLI, 2007).

A biomassa pode ser convertida em energia por métodos biológicos ou

termoquímicos. Conversão biológica inclui a fermentação dos componentes

biodegradáveis para produzir portadores de energia, como o bioetanol, o biobutanol,

biohidrogênio e biogás, ou extração de óleos para produção de biodiesel. Conversão

termoquímica inclui combustão direta de calor e eletricidade, bem como os

processos indiretos, como pirólise e gaseificação (SKJÅNES; LINDBLAD; MULLER,

2007).

A recolha da biomassa do meio de cultura é uma das etapas mais

problemáticas. Por um lado, devido ao reduzido tamanho das células e, por outro,

devido ao grande teor de água envolvido, que deve ser removido para que as etapas

seguintes sejam exequíveis. Esta etapa apresenta um custo que pode rondar os 20

a 30 % de todo o custo de produção (MOLINA-GRIMA et al., 2003). Os

biocombustíveis podem ser classificados com base em suas tecnologias de

produção conforme já descrito neste estudo em combustível de primeira, segunda,

terceira e de quarta geração.

2.3.6.1 Biodiesel

O biodiesel é um combustível feito com óleos vegetais (soja, amendoim,

mamona, dendê, etc.) que pode ser obtido em processos como esterificação . A

38

molécula de um óleo vegetal é um triglicídio com moléculas de ácidos graxos e

glicerina. O processo que consiste na mudança do óleo vegetal para biodiesel

recebe o nome de transesterificação (processo onde a glicerina se separa do óleo

vegetal) e trata-se do método mais usado atualmente para produzir esse

biocombustível. Com a transesterificação, ou seja, sem a glicerina, o óleo fica mais

fino e menos viscoso. A cor do produto se aproxima do amarelo podendo chegar a

tons mais alaranjados. O cheiro adquirido vai depender da matéria-prima utilizada

(SUAREZ, 2009).

A Agência Nacional de Petróleo (ANP) define o biodiesel como um

combustível composto de alquil ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, derivados

de óleos vegetais ou de gorduras animais. O Biodiesel é um líquido amarelo-âmbar

claro, com uma viscosidade semelhante ao diesel de petróleo. No entanto, o

biodiesel é melhor do que o diesel em termos de teor de enxofre, ponto de fulgor,

teor de aromáticos e biodegradabilidade (GOUVEIA et al., 2011).

O biodiesel é um substituto natural do diesel de petróleo, por ser oriundo

de fontes renováveis é considerado um combustível “ecologicamente correto”, pois

reduz de maneira significativa a emissão de poluentes tais como os hidrocarbonetos

não queimados e é praticamente isento de enxofre e substâncias aromáticas

cancerígenas comuns aos derivados de petróleo (SUAREZ, 2009)

2.3.6.2 Biogás

O biogás, produzido a partir da digestão anaeróbia da matéria orgânica

presente em efluentes e resíduos domésticos, industriais e agropecuários,

representa uma fonte alternativa e renovável de energia cada vez mais utilizada em

todo o mundo. No Brasil, a elevada população e sua concentração em grandes

centros urbanos e a expressiva produção agropecuária e agroindustrial indicam um

potencial significativo de produção de biogás (KAPDI, 2005).

A fração orgânica de qualquer forma de biomassa incluindo lodo de

esgoto, resíduos animais e efluentes industriais, pode ser decomposta através da

digestão anaeróbia majoritariamente na mistura de metano (CH4) e CO2, chamado

de “biogás’. O biogás é um combustível favorável ao meio ambiente e versátil

(KAPDI, 2005).

39

2.3.6.3 Bio-óleo

O bio-óleo, conhecido também como óleo de pirólise, bio-óleo bruto,

alcatrão pirolítico, alcatrão pirolenhoso, licor pirolenhoso, líquido de madeira, óleo de

madeira, condensado da fumaça, destilado da madeira, é um líquido de coloração

marrom escura, quase negra, e odor característico de fumaça com composição

elementar próxima a da biomassa. O bio-óleo é uma mistura complexa de

compostos oxigenados com uma quantidade significativa de água, originada da

umidade da biomassa e das reações, podendo conter ainda pequenas partículas de

carvão e metais alcalinos dissolvidos oriundos das cinzas. A sua composição

depende do tipo de biomassa, das condições de processo, do equipamento e da

eficiência na separação do carvão e na condensação (TAVARES, 2009).

Os principais problemas do uso de bio-óleo como combustível são a baixa

volatilidade, a alta viscosidade, formação de coque e corrosividade. Esses

problemas limitam o uso de bio-óleo a aplicações estáticas. Para queima em

motores a diesel as principais dificuldades são a difícil ignição e a corrosividade. O

bio-óleo tem sido usado com sucesso em caldeiras e tem mostrado potencial para

uso em motores a diesel e turbinas (CZERNICK; BRIDGWATER, 2004).

2.3.6.4 Biobutanol

Também pode ser produzido a partir de biomassa algal. Butanol contém

mais energia e é menos corrosivo e solúvel em água (SAVAGE, 2011) fazendo

deste composto, bem adaptado para uso com o armazenamento e a infraestrutura

de transporte de distribuição de combustíveis à base de petróleo. Butanol também

tem várias vantagens sobre o etanol como um combustível, devido ao seu teor

energético mais elevado e menor volatilidade, sendo menos higroscópico e, melhor

mistura com gasolina em qualquer proporção. Biobutanol e outros alcoóis superiores

produzidos a partir de matérias-primas de biomassa são assim conhecidos como

biocombustíveis avançados, e espera-se que, eventualmente, substituir o bioetanol

(ZHANG; RODRIGUEZ; KEASLING, 2011).

2.3.6.5 Bioálcool / Bioetanol

Os bioalcoóis mais comumente produzidos são o etanol, propanol e

butanol. Entre estes, o etanol é o mais utilizado, o butanol é utilizado

40

comparativamente menos e o propanol é usado raramente. Os combustíveis de

álcool são geralmente de natureza biológica, em vez de fontes de petróleo. Quando

obtida a partir de fontes biológicas, eles são algumas vezes conhecidos como

bioalcoóis. O etanol produzido biologicamente contém cerca de 5% de água. Esta

mistura não pode também ser purificada por destilação simples, já que forma uma

mistura azeotrópica (DEMIRBAS, 2009).

Bioetanol, um biocombustível líquido renovável, pode ser produzido a

partir de diversas fontes de biomassa diferentes, tais como de açúcar ou amido

culturas (como cana-de-açúcar, beterraba, milho e trigo) e de biomassa

lignocelulósica. A cana de açúcar é a principal matéria-prima para a produção de

bioetanol no Brasil, enquanto o milho e beterraba são os principais recursos de

Estados Unidos e União Europeia, respectivamente (CHIARAMONTI, 2007). A

produção de etanol está em ascensão em nível mundial, conforme pode ser

observado na Tabela 3.

Tabela 3 - Produção mundial de etanol, em bilhões de litros por ano

País Ano 2004 Ano 2008 Quota anual 2008(%)

E.U.A 12.88 33.85 43.8

Brasil 14.67 26.15 33.82

China 3.49 3.87 5.00

Índia 1.21 2.31 2.98

França 0,83 1,52 1,97

Canadá 0.23 0.99 1.28

Alemanha 0.23 0.83 1.10

Tailândia 2.46 0.57 0.74

Rússia 0.76 0.57 0.74

Espanha 0.34 0.49 0.63

África do Sul 0,38 0,42 0,54

Reino Unido 0,3 0,42 0,54

Outros países 5,2 5,3 6,86

Mundo 42.98 77.29 100

Fonte: Agranet FO (2009)

De acordo com a Tabela 3, a produção mundial de etanol aumentou de 43

bilhões de litros em 2004, para 77 bilhões de litros em 2008. A produção de etanol

dos EUA ultrapassou a do Brasil, sendo assim, se faz extremamente necessário a

pesquisa e desenvolvimento biotecnológico para continuar à impulsionando a

produção Brasileira.

E nesta pesquisa, o bioetanol de segunda geração será quantificado a

partir da biomassa de macrofitas aquáticas, especificamente Lemna minuta, estudo

41

este realizado em alguns países como na Turquia, cujo artigo "Second-generation

bioethanol production from water hyacinth and duckweed in Izmir: A case study "

(BAYARAKCI; KOÇAR, 2013) alavancou a referida investigação. Visto que, não

existe estudos com essa biomassa no Brasil, sendo esta pioneira.

A demanda de etanol deve mais do que dobrar nos próximos 10 anos.

Para o fornecimento estar disponível para atender a essa demanda, novas

tecnologias devem ser criadas em laboratórios para a realidade comercial. A

produção mundial de etanol é de cerca de 60% da matéria-prima a partir de culturas

de açúcar (DEMIRBAS, 2009). A Figura apresenta as rotas tecnológicas para

produção de etanol à partir de diversas biomassa.

O etanol ou álcool etílico produzido por hidrólise seguido dos processos

de fermentação a partir da biomassa é denominado bioetanol. É o biocombustível

mais utilizado no mundo, particularmente no Brasil. É utilizado em motores como um

substituto para a gasolina. Mas, principalmente, de uma mistura de etanol com

gasolina em qualquer proporção. Uma mistura de gasolina e etanol consistindo de

15% de etanol pode ser utilizado em qualquer motor a gasolina (CHIARAMONTI,

2007).

42

Figura 8 - Fluxograma com as rotas tecnológicas para produção de etanol várias biomassas

Fonte: CGEE, 2008

Materiais amiláceos (milho, trigo) produzem bioetanol a partir da

separação, limpeza e moagem do grão. A etapa de moagem pode ser úmida ou

seca, na primeira, o grão é embebido e fracionado antes da reação de conversão de

sacarificação (conversão do amido em açúcares menores). Na segunda, moagem

seca, a reação é feita durante o processo de moagem. A sacarificação é realizada

em ambos os processos por enzimas a altas temperaturas. A fermentação dos

açúcares por leveduras deve ser destilada para purificar o bioetanol (CGEE, 2008).

A utilização de resíduos agrícolas lignocelulósicos que não concorrem

com a alimentação humana, conforme os citados acima, poderia atingir a produção

491 bilhões de litros de bioetanol por ano. Esta quantidade é cerca de 16 vezes a

produção mundial de 2004 (KIM, 2004).

As maiores variedades de biomassa disponíveis são: palha de arroz (EL-

TAYEB, 2012), palha de trigo (SAHA, 2013) e bagaço de cana-de-açúcar (ROCHA,

2011). Alguns estudos apresentam fontes alternativas como o caule da planta do

café (TRIANA, 2011), serragem (KIM, 2013), resíduos de jornal (PARK, 2010), entre

outros. A composição de cada biomassa varia entre os diversos estudos, em função

de origens de cada matéria-prima, composição e estrutura. As matérias-primas

lignocelulósicas são complexos polímeros de carboidratos de celulose, hemicelulose

43

e lignina, onde a celulose e a hemicelulose compreendem aproximadamente 60% da

sua composição (LIMAYEM, 2012).

2.4 BIOETANOL PRODUZIDO DE BIOMASSA DE MACRÓFITAS

Biomassa é definida como qualquer matéria orgânica de origem vegetal,

seja esta cultivada em terra ou em água, proveniente de produtos animais e seus

resíduos, subprodutos de processamentos agrícolas e industriais, plantas aquáticas,

resíduos agrícolas e agroindustriais, resíduos de papel e madeira, entre outros,

incluindo os resíduos urbanos (NREL, 2011).

A produção de biomassa, como resultado da reação de fotossíntese,

depende essencialmente da energia solar e da presença de água e dióxido de

carbono (CO2), além de outros requisitos importantes associados à incorporação de

nutrientes, como a fertilidade do solo, por exemplo. A energia, denominada de

bioenergia, é então armazenada nas ligações químicas dos componentes estruturais

da biomassa mediante processos fotossintéticos (BNDES, 2008).

Segundo o Instituto de Tecnologia Química e Biológica (ITQB) da

Universidade Nova de Lisboa, os tradicionais combustíveis fósseis devem ser

excluídos do conceito de biomassa, pois apesar de serem derivados da vida vegetal

e animal, como o carvão mineral, o petróleo e o gás natural, são também resultado

de várias transformações que requerem milhões de anos para acontecerem. A

biomassa pode considerar-se um recurso natural renovável, enquanto que os

combustíveis fósseis não se renovam a curto prazo (ANEEL, 2003).

A produção de bioetanol envolve as seguintes etapas do processo: pré-

tratamento da biomassa, sacarificação, fermentação e recuperação do produto.

Sacarificação é um dos passos mais importantes, em que os açúcares fermentáveis

tais como glicose, são liberados e metabolizados na presença de levedura para

produzir bioetanol. Diferentes enzimas e ácidos, são usadas na fase de hidrólise e o

processo é influenciado por vários fatores incluindo a cristalinidade de celulose, a

área de superfície do substrato, a espessura da parede da célula, a porosidade, a

transferência de massa e hemicelulose (ALVIRA et al., 2009).

A produção de etanol pode ser obtida principalmente por meio de

fermentação do amido, açúcar e celulose contida na biomassa (KIM; LEE , 2006). O

44

princípio da produção de etanol por macrófitas consiste na colheita, preparo da

bimassa (pré-tratamento) para a fermentação e processo de extração do etanol.

As macrófitas são uma fonte potencial de substrato fermentável uma vez

que, de acordo com as condições de crescimento, eles podem ter altos níveis de

compostos de carbono em sua composição, diretamente disponível para a

fermentação ou após pré-tratamento (COSTA; MORAIS, 2011).

Pode-se destacar neste processo o amido que é conhecido por ser um

dos polímeros de armazenagem de energia natural mais abundante em todo o

mundo. Ele é composto, principalmente, de dois polímeros de unidades de

anidroglicose, conhecida como amilose e amilopectina. A amilose é conhecida por

constituir até 25% da massa da molécula de amido (KIM; LEE , 2006).

Uma vez que o amido intracelular é extraído, o mesmo pode ser

fermentado em etanol utilizando a tecnologia semelhante à de outras biomassas à

base de amido, que envolve dois processos, sacarificação e fermentação. A

fermentação do amido para o etanol pode ser considerada em um único passo ou

dois. Antes da fermentação, o amido precisa ser hidrolisado à açúcares simples e

este processo é chamado de sacarificação. A hidrólise pode ser ácida ou enzimática

(alfa e glucoamilase), a qual é utilizada para a conversão do amido em açúcares

simples. Os açúcares são fermentados em etanol por uma linhagem de levedura

adequada (MATSUMOTO et al., 2003; RUBIN, 2008).

Neste esguelha , a produção de bioetanol de segunda geração a partir de

macrófitas é um processo extenso que envolve as etapas recolha (para constituir

uma reserva de biomassa), secagem , ruptura celular (para quebra das paredes

celulares e libertação dos polissacáridos), sacarificação (para transformação dos

polissacáridos em açúcares fermentescíveis), fermentação e recuperação do

produto final (ANTUNES; SILVA, 2010; HARUN; DANQUAH, 2011a).

2.4.1 Hidrólise

A preparação da biomassa pode ser realizada por meio de equipamento

mecânico ou enzimas que hidrolisam as paredes das células, tornando mais

disponíveis os hidratos de carbono, bem como quebrar as grandes moléculas de

carboidratos. Quando as células são quebradas, a levedura mais adequada para

cada biomassa é adicionada e, a fermentação começa. Desta forma, o açúcar é

convertido em etanol por leveduras (COSTA; MORAIS, 2011). A sacarificação é

45

geralmente o passo limitante da velocidade na produção de biocombustíveis

utilizando materiais lignocelulósicos ou biomassa de microalgas, que contém uma

fonte de celulose (HARUN e DANQUAH, 2010).

O pré-tratamento da biomassa é um passo essencial uma vez que rompe

a estrutura cristalina da celulose , liberando os açúcares fermentáveis, de modo que

a hidrólise de hidratos de carbono pode ser obtida mais rapidamente e com maior

rendimento (MOSIER et al., 2005). Um processo de pré-tratamento adequado

também pode prevenir a formação de inibidores para a hidrólise e posterior

fermentação (CHENG e SUN, 2002).

Os principais métodos incluem o tratamento físico, tal como moagem e

trituração e, o pré-tratamento termoquímico. Hidrólise e fermentação podem ser

executadas simultaneamente em um processo conhecido como sacarificação e

fermentação simultâneas (SFS). SFS utiliza enzimas em detrimento de produtos

químicos (ácidos ou bases), para hidrolisar os carboidratos estruturais celulose e

hemicelulose em açucares fermentáveis. A SSF reduz custos do processo, em

relação aos equipamentos, por realizar a hidrólise e a fermentação em um único

reator e eliminar a necessidade de materiais dispendiosos capazes de resistir a

ácidos fortes ou outros produtos químicos (ALVIRA et al., 2009).

A SFS aumenta a taxa de hidrólise por redução do efeito de inibição do

produto, pois os açúcares são rapidamente consumidos pela levedura durante o

processo. Contudo, o fator limitante da SFS é a temperatura. Porem não existe uma

temperaturas ideal para a hidrólise enzimática ,pois cada enzima responde a uma

temperatura e um ph específico (SURYAWATI et al., 2008).

A bioconversão em monômeros de glicose necessita da ação de

celulases, que são um complexo enzimático capaz de hidrolisar celulose até

moléculas de glicose. A classificação das celulases divide-se em três grandes

grupos: endoglucanases (EnG), que clivam ligações internas da fibra celulósica,

exoglucanases (ExG), que atuam na região externa e ß-glicosidases (BG), que

hidrolisam oligossacarídeos solúveis em glicose (CASTRO, 2010).

Dois métodos de hidrólise principais são amplamente utilizados para

produzir açúcares. Estes incluem a hidrólise ácida diluída e hidrólise enzimática

(SAHA et al., 2005). Os fundamentos do processo de conversão dos materiais

lignocelulósicos em etanol através da hidrólise são apresentados na Figura 9.

46

Figura 9 - Fluxograma dos fundamentos do processos de hidrólise para conversão e produção de etanol a partir de materiais celulósicos

Fonte: CGEE, 2008

Todas as tecnologias de hidrólise requerem um tratamento físico

preliminar de eliminação de impurezas e preparo do material lignocelulósico por

redução do tamanho das partículas a tratar. Esta redução de tamanho, traz como

vantagem o aumento da superfície específica do material, acelerando assim, a

reação de hidrólise (ALVIRA et al., 2009).

Os processos em desenvolvimento para conversão da biomassa de

natureza lignocelulósica, em açúcares redutores e produção final de etanol, podem

ser agrupados em três categorias de processos principais: enzimáticos; com ácidos

concentrados e catalisados por ácidos diluídos.

2.4.1.1 Hidrólise enzimática

Processos de sacarificação enzimática, envolvendo a utilização de

celulases, amilases e glucoamilases, são amplamente utilizados para hidrolisar

macrófitas e microalgas para obtenção de açúcares (LIBESSART et al., 1995). A

hidrólise enzimática é a utilização de enzimas para liberar os açúcares fermentáveis

da biomassa (ANCHEZ et al., 2004).

O obstáculo principal da hidrólise enzimática é que os grânulos de amido

estão ligados intercelulares dentro das paredes celulares rígidas assim, uma etapa

de pré-tratamento da bimassa é necessária para hidrolisar a parede celular para

libertar polissacarídeos tais como amido, hidratos de carbono estruturais, e outros

nutrientes (LIBESSART et al., 1995).

47

Outras dificuldades encontradas na realização do processo enzimático

se relacionam com a disponibilidade e custos das enzimas utilizadas. Enzimas tais

com celulases, xilanases e pectinases são necessárias para a solubilização

completa da biomassa lignocelulósica, sendo esta etapa identificada como o passo

de mais alto custo no processo hidrolítico (CASTRO; PEREIRA JÚNIOR, 2010).

Os processos enzimáticos empregam celulase como biocatalisador de

hidrólise, que requer condições brandas, temperaturas com especificidade da

enzima, pH na faixa 4,5 à 6,0 e operação nas pressões atmosféricas, permitindo

ainda, conversões superiores às obtidas pela hidrólise química. Menor destruição de

açúcares e menor acúmulo de inibidores de fermentação, são outras das vantagens

deste processo.As principais barreiras aos processos enzimáticos são: o custo muito

elevado da enzima celulase e o longo tempo para se obter altos rendimentos; um

provável alto consumo energético para manter os grandes volumes agitados e

aquecidos por muitas horas (ALVIRA et al., 2009).

A hidrólise enzimática é mais lenta do que a hidrólise ácida, porém é um

processo ambientalmente seguro e pode obter maiores rendimentos de glicose sem

a produção de produtos de inibição.

2.4.1.2 Hidrólise ácida

Os processos por ácido concentrado empregam ácido sulfúrico ou ácido

clorídrico como agente de pré-tratamento, seguido pelo estágio de hidrólise com

ácido diluído. Assim que a estrutura da celulose passa ao estado amorfo, torna-se

possível a sua transformação completa e rápida em açúcares redutores,

empregando condições não muito severas de reação. O rendimento obtido é alto,

porém o processo exige um investimento elevado em equipamentos (SUALI;

SARBATLY, 2012).

A etapa de hidrólise gera subprodutos de reação indesejáveis, tais como:

ácidos orgânicos de baixo peso molecular e compostos furânicos e fenólicos, que

inibem a fermentação alcoólica.

Os processos que empregam ácidos diluídos, em geral, utilizam como

catalisador o ácido sulfúrico diluído a 0,1 - 0,7% ou o ácido clorídrico. A hidrólise,

acontece em dois estágios para maximizar os rendimentos em açúcares redutores

provenientes da hemicelulose e da celulose. O primeiro estágio é realizado em

condições intermediárias para hidrolisar a hemicelulose, enquanto que o segundo,

48

operando em condições mais severas, converte a celulose (COSTA; MORAIS,

2011).

O processo de sacarificação química é caracterizado pela sua rápida

reação, mas normalmente são necessárias condições de reação violentas (maior

temperatura, pressão e a adição de ácido), o que resulta na produção de inibidores

tais como o hidroximetilfurfural, o que potencialmente pode reprimir a produção de

biocombustíveis fermentáveis e também um tratamento dos resíduos custoso

(MUSSATTO; DRAGONE, 2010).

O pré-tratamento com ácido é o mais recomendado, uma vez que

proporciona uma maior eficiência na conversão de materiais celulósicos. Durante o

processo de pré-tratamento ácido, vários fatores influenciam significativamente a

quantidade total de açúcares fermentáveis liberados. Estes incluem o tempo de

processo, a temperatura, a quantidade de carregamento do substrato e da

concentração de ácido (RABELO; COSTA, 2010).

O processo de sacarificação (conversão de polissacarídeo em

monossacarídeos) por hidrólise inclui um ácido diluído, ácido concentrado (WARD;

YOUNG, 1989). O uso de ácido concentrado é limitado devido ao custo mais

elevado, a corrosão do material de contenção, e a formação de compostos que

inibem o crescimento dos microrganismos (CHENG; SUN, 2002).

No entanto, o potencial para o desenvolvimento tem sido expresso sobre

o uso do processo de hidrólise ácida por causa da rápida e fácil reação

(GROHMANN; BOTHAST, 1997). O pré-tratamento de celulose por hidrólise de

ácido diluído antes da hidrólise enzimática resulta em um rendimento mais elevado

de glicose em até 1,38% de biomassa fresca (SUALI; SARBATLY, 2012).

O processo de hidrólise que emprega ácido sulfúrico ou ácido clorídrico

tem desvantagens como baixo rendimento de álcool devido a parcial degradação

dos açucares pelo acido formando compostos que, além de não serem

fermentescíveis, podem inibir a atividade da levedura; ademais o uso frequente do

ácido ocasiona corrosões nos equipamentos e aumenta os riscos de acidentes pelo

seu manuseio (CAMACHO, 2009). Contudo, o pré-tratamento usando um catalisador

enzimático pode resultar em mais material fermentável degradado em comparação

com catalisadores ácidos e alcalinos (NAHAK; NAHAK, 2011).

49

2.4.2 Fermentação alcoólica

A fermentação de carboidratos em álcool é um dos mais antigos

processos bioquímicos conhecidos. A fermentação alcoólica é a conversão de

materiais de biomassa que contêm açúcares, amido ou celulose em etanol

(MCKENDRY, 2002).

O valor de um determinado tipo de biomassa, tal como matéria-prima para

a fermentação depende da facilidade com que ele pode ser convertido em açúcares

(DEMIRBAS, 2008). Portanto, a eficiência do processo de fermentação depende de

vários fatores tais como, escolha do microrganismo, matéria-prima, o método de pré-

tratamento, o método de hidrólise e fatores ambientais, concentração de pH,

temperatura, substrato e etanol.

Microrganismos normalmente aplicados para a produção de bioetanol não

podem utilizar todas as fontes de açúcares derivados da hidrólise. Por exemplo, a

cepa de Saccharomyces cerevisiae, é possível utilizar pentose, o que representa

uma perda de biomassa e reduz o rendimento de bioetanol. Para superar este

problema, recombinam-se diferentes coquetéis de leveduras produtoras de enzimas

celulósicas, que são introduzidas durante a fermentação para converter uma grande

variedade de ambas as hexoses e pentoses (WYMAN, 1996).

De acordo com Lima et al (2001), existem quatro reações principais

envolvidas na fermentação do bioetanol. O primeiro passo é um processo de

glicólise, em que uma molécula de açúcar, especialmente glicose (C6H12O6), divide-

se em duas moléculas de piruvato (CHCOCOO-). A glicólise provoca a redução das

coenzimas: duas moléculas de adenosina difosfato (ADP) são reduzidas a duas

moléculas de ATP e duas moléculas de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+)

são reduzidos a duas moléculas de NADH. Este processo também produz água e

íons de hidrogênio (H+).

O segundo passo é a conversão do CHCOCOO- em acetaldeído

(CH3CHO), catalisada pela piruvato descarboxilase, que produz emissões de CO2 e

de H+. O terceiro passo é a conversão do CH3CHO produzido no segundo passo em

íon etanol (C2H5O-) com o auxílio da coenzima NADH que foi produzida durante o

processo de glicólise. Finalmente, o ânion de etanol, que tem propriedades

semelhantes ao etanol convencional, é protonado pelo hidrogênio para produzir

etanol (C2H5OH).

50

O processo de fermentação é iniciado por uma mistura de uma fonte de

açúcar, água e levedura, permitindo que a levedura atue num ambiente livre de

oxigênio. Este ambiente anaeróbio força a mesma à encerrar a "queima" do açúcar e

permite-lhes, ao contrário, fermentar álcool. Durante o processo fermentativo, as

dificuldades relativas a uma fermentação preliminar e fermentação secundária

completa são encontradas. A razão destes distúrbios é a crescente concentração de

álcool que inibe o crescimento de leveduras e tem um efeito sobre a quantidade de

metabólitos de fermentação, o qual, por sua vez, tem um efeito sobre a qualidade do

produto final da fermentação, ou seja, do bioetanol (SAHA, 2005).

Os produtos finais da fermentação de biomassa podem surgir como

resultado dos componentes de proteínas, lipídios e hidratos de carbono. A

fermentação anaeróbia não só produz o biogás e bioetanol, mas também reduz a

quantidade de sólidos voláteis nos resíduos de cerca de 70% (HORAN, 1991).

A fermentação por si só não produz combustível com teor alcoólico

superior de 12 a 15%, porque a levedura da fermentação é destruída em altas

concentrações de álcool. Para produzir um composto como maior concentração de

álcool, a solução aquosa deve ser destilada.

51

3 METODOLOGIA

O presente estudo foi realizado nos laboratórios do Núcleo

Biotecnológico, da Universidade do Oeste de Santa Catarina campus Videira. Para

tanto, foram realizados ensaios de quantificação do teor de carboidratos das

amostras de macrófitas aquáticas flutuantes, pré-tratamento da biomassa vegetal

por métodos distintos (hidrólise ácida e enzimática), seguida de processo de

fermentativo para produção de bioetanol. Os rendimentos das hidrólises em termos

de sacarificação, a assimilação dos açúcares e produção de bioetanol pela levedura

Saccharomyces cerevisiae chardonay foram avaliados de forma quantitativa.

3.1 AMOSTRAS

A biomassa utilizada neste estudo foi obtida a partir da macrófita Lemna

minuta (Figura 10), coletada em lagoa de águas naturais, localizada aos

26°56'13.90" de latitude Sul e 51°15'45.07" de longitude Oeste, em uma propriedade

rural no interior do município de Videira, Santa Catarina.

Figura 10 - (a) Lagoa natural com biomassa vegetal; (b) Coleta de Lemna minuta

Fonte: A autora (2015)

Foram colhidas amostras nas 4 estações do ano (primavera/2013,

verão/2014, outono/2014 e inverno/2014), seguindo a metodologia para a realização

de colheita e acondicionamento de biomassa de macrófitas aquáticas flutuantes

adaptada de Rodrigues e Preston (1996). Após a colheita cada subamostra (25,00

Kg de massa fresca) foi seca ao sol, peneirada para a remoção de corpos estranhos,

resultando em 4 amostras simples de 2,15 kg ± 0,20 de massa seca de macrófita,

após as amostras secas foram acondicionadas em embalagens de polietileno de

baixa densidade (PEBD), e embalada à vácuo para garantir a sua preservação até a

execução dos ensaios posteriores.

(a) (b)

52

Para a composição da amostra as 4 subamostras da macrófita totalizaram

8 kg de biomassa seca, foram homogeneizadas e maceradas em cadinho de

porcelana. Posteriormente dividida em 3 partes para a execução dos experimentos:

caracterização bioquímica, hidrólises e fermentação.

3.2 TEOR DE CARBOIBRATO DA BIOMASSA

Foram realizados ensaios de caracterização bioquímica da biomassa

seca, através da metodologia clássica adaptada do Instituto Adolfo Lutz (1985). Foi

quantificado o teor de carboidratos (%) em ensaios conduzidos em triplicata

conforme a Figura 11.

Figura 11 - Fluxograma das etapas realizadas para quantificação do teor de carboidratos

Fonte: A autora (2015)

A concentração de carboidratos presentes nas amostras foi determinada

pelo método de Fehling, o qual baseia-se na hidrólise ácida com posterior titulação

(INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985). Para tanto, 2 g de cada amostra foi pesada e

adicionada em balões de fundo chato contendo 200 mL de água destilada e 5 mL de

HCl. A digestão térmica ocorre durante 3 horas, em sistema de refluxo.

As amostras digeridas, após resfriadas por 30 minutos à temperatura

ambiente, foram neutralizadas com solução de NaOH 40% para pH ±7,0.O

hidrolisado obtido foi filtrado.A fração líquida do filtrado foi titulada, com solução de

53

Fehling aquecida em ebulição até o ponto de viragem da solução por redução (de

azul para incolor com formação de precipitado vermelho de Cu2O).

3.3 HIDRÓLISES

3.3.1 Pré-tratamento da biomassa

A biomassa seca de Lemna minuta, previamente macerada foi submetida

a ensaio de pré-tratamento, com objetivo de realizar a hidrólise dos açúcares para

utilização do mesmo como substrato para a fermentação alcoólica. Para tanto,

foram testadas as metodologias de hidrólise ácida e a enzimática (Figura 12).

Figura 12 - Fluxograma do pré-tratamento e da quantificação dos açúcares redutores

Fonte: A autora (2015)

3.3.1.1 Hidrólise Ácida

Os ensaios de pré-tratamento com hidrólise ácida da biomassa de Lemna

minuta, foram realizados segundo o método de Harun e Danquah (2010), utilizando

concentração inicial de macrófitas de 60 g.L-1.

Adicionou-se 3 g de amostra, pesada em Balança analítica (Denver

Instrument Modelo APX-200), a 50 mL de água destilada. A esta mistura

54

acrescentou-se ácido (HCl / H2SO4) nas concentrações de 5, 10 e 15% (v/v),

incubadas em estufa ( Deleo Equipamentos modelo A3C) por intervalos de tempo de

15’, 30’ e 60’, sob temperaturas de 100, 130 e 150°C. A Tabela 4 apresenta o

delineamento experimental das hidrólises ácidas realizadas.

Tabela 4 - Planejamento experimental das hidrólises ácidas: fatorial 23

Níveis Axiais Tratamentos

Ácidos Temperaturas Tempos

A B C HCl / H2SO4 °C Minutos

-1 -1 -1 1 5 100 20

-1 -1 1 2 5 100 60

-1 1 -1 3 5 150 20

-1 1 1 4 5 150 60

1 -1 -1 5 15 100 20

1 -1 1 6 15 100 60

1 1 -1 7 15 150 20

1 1 1 8 15 150 60

0 0 0 9 10 125 40

0 0 0 10 10 125 40

0 0 0 11 10 125 40 Fonte: A autora (2015)

Após a incubação as soluções hidrolisadas foram resfriadas em banho de

gelo por 15’, o pH foi corrigido para 6,0 com solução de NaOH 2N aferido (phmetro

de bancada da marca Gehaka modelo PG1800). A fração líquida (contendo os

açúcares liberados) foi separada da biomassa por centrifugação à 10.800 r.p.m

durante 21’. Por fim foi realizada a quantificação dos açúcares redutores pelo

método DNS (Protocolo para determinação de açúcares totais).

3.3.1.2 Hidrólise Enzimática

Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados com a enzima

Rohalase/Barley, seguindo as condições de incubação fornecidas pelo fabricante da

enzima. A enzima é composta por celulases, xilanases e pectinases. Testou-se

diferentes concentrações de enzima sobdiferentes pHs e temperaturas para otimizar

a hidrólise. A Tabela 5, apresenta os 36 tratamentos enzimáticos realizados.

55

Tabela 5 - Hidrólises Enzimáticas: 40º, 50°C e 60°C

Trat

Temp Tempo

pH Trat

Temp Tempo

pH Trat

Temp Tempo

pH °C min °C min °C min

1 40 60 4 13 55 60 4 25 70 60 4

2 40 60 5 14 55 60 5 26 70 60 5

3 40 60 6 15 55 60 6 27 70 60 6

4 40 60 7 16 55 60 7 28 70 60 7

5 40 120 4 17 55 120 4 29 70 120 4

6 40 120 5 18 55 120 5 30 70 120 5

7 40 120 6 19 55 120 6 31 70 120 6

8 40 120 7 20 55 120 7 32 70 120 7

9 40 240 7 21 55 240 7 33 70 240 7

10 40 240 5 22 55 240 5 34 70 240 5

11 40 240 6 23 55 240 6 35 70 240 6

12 40 240 7 24 55 240 7 36 70 240 7 Legenda: Trat = Tratamentos; Temp = Temperatura; min = minutos Fonte: A autora (2015)

Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados em frascos do tipo

erlenmeyer de 250 mL ,contendo um volume de 50 mL de água destilada.

Inicialmente foram preparadas soluções tamponadas (Na2PO4 e Ácido cítrico) em

pH: 4,0 ; 5,0; 6,0 e 7,0. Após, foi adicionado a cada frasco 3g de macrófita, as

amostras foram homogeneizadas e uma alíquota retirada para a quantificação de

açúcares inicias (antes da hidrólise enzimática).

Após, a cada frasco foi adicionado 1 mL da solução enzimática e os

mesmos foram incubados a temperatura de 40, 55 e 70 Cº, mantidos sob agitação

constante. Em intervalo de 1 hora e 2 horas, determinando a concentração de

açúcares a partir do ensaio de DNS em triplicata.

3.3.2 Quantificação de açúcares redutores

O teste de DNS (ácido dinitrosalicílico) baseia-se na reação entre o

açúcar redutor e o ácido 3,5-dinitrosalicílico (cor amarelo), que é reduzido a um

composto colorido avermelhado, o ácido 3-amino- 5-nitrosalicílico, oxidando o

monossacarídeo redutor (MALDONE et al., 2013).

Sendo assim, o teor de açúcares redutores livres (AR) foi quantificado

calorimetricamente pelo método dinitrosalicílico conhecido como DNS (MILLER ,

1959). Construiu-se uma curva de calibração (Figura 13), com uma solução de

56

glicose, lendo-se a absorbância em espectrofotômetro ( Digimed DME- 21) com

comprimento de onda de 540 nm.

Figura 13 - Curva padrão de açúcares redutores

Fonte: A autora (2015)

Este foi o método utilizado como protocolo padrão para determinar a

quantidade de açúcar redutor. Onde, os grupos aldeído e grupos cetona dos

açúcares de redução reduzem o amarelo (ácido 3,5-dinitrossalicílico) à laranja (

ácido 3-amino-5-nitro salicílico). Para elaboração da curva padrão foi utilizado

glicose nas concentrações de 0,1 a 1,0 g.L-1.

As amostras previamente hidrolisadas conforme descrito nos itens 3.3.1.1

e 3.3.1.2, foram centrifugadas e, uma alíquota de 1,0 mL da amostra (sobrenadante

) foi adicionada em um tubo de ensaio ,seguido a adição de 1,0 mL do reagente

DNS. Os tubos foram agitados e aquecidos em banho-maria à 100°C (em ebulição)

por 5 minutos. Após, os tubos foram resfriados em banho de gelo por 5 minutos.

Então foram adicionados 16 mL da solução de tartarato duplo de sódio e potássio.

A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro (UV-300, Pró-análise) á

um comprimento de onda de 540 nm, o branco constitui-se da substituição da

amostra por água destilada.

57

3.4 ENSAIOS FERMENTATIVOS

Foram realizados ensaios de fermentação alcoólica em três repetições,

com a linhagem de levedura comercial Saccharomyces cerevisiae chardonay

(Proenol®), utilizada para a fermentação da biomassa seca e macerada da Lemna

minuta previamente hidrolisada (Figura 14).

Figura 14 - Fluxograma das etapas da fermentação

Fonte: A autora (2015)

A levedura foi pré-inoculada, em frasco Schott® de vidro borosilicato

tampa rosca com volume de 100mL . Contendo previamente esterilizado com 50mL

de água destilada), onde 1g de Saccharomyces cerevisiae chardonay e, 1g de

nutriente, foram adicionados e diluídos no frasco, em água destilada de diluição

previamente aquecida à 30°C. A solução foi mantida em repouso por 1 hora para

ativação em temperatura ambiente, esta foi denominada: solução de suspensão de

levedura.

Um volume de dois litros da amostra foi previamente hidrolisada, filtrada

em bomba com sistema à vácuo, após, o pH do filtrado foi corrigido para 4,5 com

solução de NaOH 2N. O volume foi fracionado e transferidos 250 mL do hidrolisado

para sete erlenmeyers de 500 mL. Na sequência os erlenmeyers foram

autoclavados por 15', resfriados à temperatura ambiente, onde foram adicionados

assepticamente 5mL da suspensão de levedura em cada erlenmeyers.

A fermentação foi realizada em incubação à 30˚C durante 48 horas . Em

intervalos regulares à cada 3 horas, foram coletadas amostras de: 4 mL para

58

determinar o consumo de açucares redutores; 2 mL para verificar a densidade

microbiana (crescimento da levedura). Para quantificar a produção de bioetanol

foram coletados 50 mL nos seguintes tempos de fermentação: 0'; 360'; 720';

1440';2880'.

Para o estabelecimento da cinética microbiana , foi realizada leitura da

absorbância da suspensão de levedura em espectrofotômetro (UV-300, Pró-análise)

a um comprimento de onda de 600 nm. O branco feito com substituição da amostra

por água destilada. Os valores das absorbâncias obtidos, foram substituídos na

equação da reta obtida com a curva de calibração (Figura 15).

Figura 15 - Curva padrão da densidade do crescimento microbiano

Fonte: A autora (2015)

Para calcular a concentração de levedura (células.mL-1) a contagem das

células viáveis Saccharomyces cerevisiae chardonay, foi realizada em câmera de

neubauer (Improved Bringt-line de 0,025 m2), com adição de 0,05 mL da amostra

da solução de levedura diluída (0,1g.L-1), foi adicionada uma gota do corante azul de

metileno (1% m.v-1) para a identificar apenas as células viáveis, após, foi realizada a

visualização em microscópio óptico (Nikon Eclipse E100) com objetiva em aumento

de 40 vezes, cuja a suspensão de levedura apresentou a concentração inicial de

células viáveis de 42.400 células.mL-1.

59

3.5 QUANTIFICAÇÃO DO ETANOL

As amostras foram encaminhadas ao Laboratório da Tecnologia de

Bebidas (LATEB), no Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial (SENAI) de

Pinheiro Preto, Santa Catarina. A quantificação do bioetanol foi realizada em

método CG/MS, equipamento Agilent composto de Cromatógrafo Gasoso (modelo

7890 A) acoplado a um detector de massas “single” quadrupolo (modelo 5975).

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS

Os resultados dos experimentos foram apresentados como média ±

desvio padrão da média (EPM). Os dados obtidos foram organizados em gráficos e

tabelas usando os programas Microsoft Office Excel 2007® e Statistica 12®.

60

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 TEOR DE CARBOIDRATO

O teor de carboidratos da Lemna minuta, utilizada no presente estudo é

apresentado na Tabela 6.

Tabela 6 - Teor de Carboidratos na biomassa de Lemna minuta

Identificação da Amostra

Peso (g)

Titulação (mL)

Teor Carboidratos (%)

01 2,002 49,6 35,67 02 2,006 50,0 35,31 03 2,005 46,0 38,39

Média± Desvio Padrão 36,46 ± 1,69 Fonte: A autora (2015)

Através da análise verificou-se que a amostra de Lemna minuta

apresentou cerca de 36% de carboidratos.

Para Zhool (2014) as biomassas de macrófitas aquáticas, constituem uma

matéria-prima promissora para a produção de biocombustíveis, principalmente

devido ao seu alto teor de celulose, amido e, baixo teor de lignina. Ao analisar a

biomassa seca dos quatro gêneros (Spirodela, Lemna, Wolffiella e Wolffia) da família

Lemnaceae, o autor afirma que estas macrófitas aquáticas podem possuir até

51,2% de carboidratos. No entanto, esse percentual menor, observado neste

trabalho pode ser explicado devido as condições de cultivo e pelo fato da análise

ter sido realizada especificamente com Lemna minuta ao passo que Zhaol (2014)

avaliou a biomassa de um pool de espécies de lemnáceas.

Graeff et al. (2008) estudaram o potencial nutritivo da macrófita aquática

Lemna minor e determinaram 6,3% de carboidratos totais. Portanto, um teor de

carboidrato 30,1% inferior à quantificação realizada neste estudo.

Silva e Camargo (2006) relatavam que a biomassa vegetal seca de E.

crassipes (aguapé) e P. stratiotes (alface d’água) apresentam 14,47% e 12,39% de

carboidrato, respectivamente. Nesta apreciação, a biomassa vegetal caracterizada

possui teor de carboidratos 21,99% superior para E. crassipes e 24,07% para P.

stratiotes. Esta maior concentração justifica-se pela espécie estudada ser da

família Lemnaceae e não Pontederiaceae.

Quando os resultados são comparados, observa-se que há coerência

entre eles, o que reafirma a descrição de Esteves (1998): "existe uma perceptível

61

diferença em relação à concentração de nutrientes na biomassa de macrófitas de

regiões distintas". Esses valores de composição bioquímica, tão variáveis, estão

associados às condições tróficas do ambiente aquático e às estações climáticas.

Salienta-se, que as mesmas demonstraram boa produtividade vegetal

quando comparada à outras culturas energéticas (cana-de açúcar e sorgo

sacarino), portanto, a somatória destas características apresentadas as tornam uma

biomassa com extraordinária promessa de substrato para produção de bioetanol de

segunda geração (ZHAO et al., 2014).

Entretanto, além da possibilidade de obter a biomassa com coleta e

remoção de lagoas naturais eutrofizadas, estas plantas diminutas, também podem

ser facilmente cultivadas em lagoas abertas de tratamento de águas residuárias

(MOHEDANO et al., 2012; BUSS, 2015).

4.2 PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA

4.2.1 Hidrólise ácida

4.2.1.1 Ácido Clorídrico

Agentes químicos, como ácidos, bases e solventes orgânicos têm sido

descritos como responsáveis por um efeito representativo na hidrólise da estrutura

nativa da biomassas. Contudo, o pré-tratamento com um agente ácido é o mais

utilizado, pois permite maior conversão de materiais celulósicos (Harun et al., 2011).

A eficiência das hidrólises ácidas foi calculada a partir do teor médio de

carboidrato (364,6 g.kg-1) disponível na biomassa de L. minuta. Os resultados

obtidos no pré-tratamento pelo método de hidrólise com Ácido clorídrico estão

apresentados na Tabela 7.

62

Tabela 7 - Teor de açúcar redutor disponível na Lemna minuta após hidrólise com HCL, e eficiência de Sacarificação

Tratamento Açúcar Redutor Total Eficiência

Hidrolisado (g.L-1± DP* ) Massa Seca (g.g-1± DP*) (%± DP*)

1 16,26 ± 0,08 0,32 ± 0,01 89,20 ± 1,31

2 16,05 ± 0,04 0,32 ± 0,00 88,05 ± 0,69

3 16,44 ± 0,01 0,33 ± 0,00 89,97 ± 0,21

4 18,09± 0,01 0,36 ± 0,00 99,20 ± 0,24

5 13,08 ± 0,06 0,26 ± 0,00 71,80 ± 0,92

6 11,67± 0,08 0,23 ± 0,01 64,06 ± 1,35

7 15,78 ± 0,03 0,31 ± 0,00 86,51 ± 0,54

8 12,03 ± 0,18 0,24 ± 0,01 65,99 ± 2,98

9 10,89 ± 0,08 0,22 ± 0,01 59,77 ± 1,27

10 9,09 ± 0,05 0,24 ± 0,00 64,69 ± 0,85

11 10,29 ± 0,26 0,21 ± 0,02 56,53 ± 4,25 Legenda: *DP = Desvio Padrão Fonte: A autora (2015 )

Dentre os 11 tratamentos com adição de HCl, o tratamento 4 (5% HCl,

150°C por 60’) foi o mais eficiente e disponibilizou 360,00g de açúcar redutor total

por kg de macrófita. Não sendo capaz de hidrolisar apenas 0,8% do carboidrato

disponível na biomassa inicial.

Enquanto, o tratamento 11 (10% HCl, 125ºC por 40’) foi o menos

eficiente, disponibilizando apenas 210,00 ± 0,60g de açúcar redutor total por kg de

macrófita. Ou seja, uma concentração 42,4% inferior ao teor de carboidrato presente

na biomassa.

Woiciechowsk et al. (2002), estudou a hidrólise acida do bagaço de

mandioca, relacionando a eficiência de recuperação de açúcar redutor com os

custos de operação, o rendimento da hidrólise ácida foi de 62,35g de açúcar redutor

a partir de 100g de bagaço, o melhor rendimento neste estudo foi de 36g de açúcar

redutor a partir de 100g de biomassa de macrófita. Apresentando este um

rendimento de 42,26% superior ao da Lemna minuta avaliada neste estudo.

Ribeiro (2009) obtiveram a sacarificação a partir do amido de batata-doce

por hidrólise ácida, utilizando ácido clorídrico concentrado, sob diferentes

quantidades de ácido. A metodologia utilizada sob altas temperaturas apresentou

resultados expressivos, mostrando que a combinação dos fatores catalisa a reação,

corroborando com o observado no presente trabalho, onde as maiores temperaturas

combinadas com menor concentração de ácido apresentaram os melhores

rendimentos.

63

4.2.1.2 Ácida Sulfúrico

Dentre os resultados obtidos no pré-tratamento pelo método de hidrólise

com Ácido Sulfúrico (Tabela 8), o tratamento 4 (5% H2SO4, 150°C por 60’), foi o mais

eficiente e disponibilizou 350,00 ± 1,26g de açúcar redutor total por kg de macrófita.

Sendo assim, este tratamento disponibilizou um teor de açúcares 7,44% inferior ao

teor de carboidrato, que fora obtido nos ensaios bioquímicos anteriores com HCL>

O tratamento 8 (15% H2SO4, 150°C por 60’) foi o menos eficiente para

estas condições, hidrolisando apenas 240,00 ± 1,05g de açúcar redutor total por kg

de macrófita. O rendimento foi 33,02% inferior ao teor de carboidrato presente na

biomassa. A diferença entre o tratamento de menor eficiência (8) e o mais eficiente

(4) está relacionada somente à concentração do ácido H2SO4, uma vez que,

ocorreram sob as mesmas condições nas variáveis tempo e temperatura.

Tabela 8 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise com Ácido Sulfúrico, e eficiência (%) do método

Tratamento Açúcar Redutor Total Eficiência

Hidrolisado (g.L-1± DP* ) Massa Seca (g.g-1± DP*) (%± DP*)

1 15,48 ± 0,03 0,31 ± 0,00 84,90 ± 0,46

2 15,51 ± 0,04 0,31 ± 0,00 85,08 ± 0,74

3 16,86 ± 0,13 0,34 ± 0,01 92,56± 2,12

4 17,55± 0,25 0,35 ± 0,02 96,34 ± 2,09

5 13,92 ± 0,15 0,28 ± 0,01 76,33 ± 2,49

6 15,45 ± 0,02 0,31 ± 0,00 84,69 ± 0,41

7 15,30 ± 0,01 0,31 ± 0,00 83,96 ± 0,16

8 12,21 ± 0,17 0,24 ± 0,01 66,98 ± 2,84

9 15,87± 0,06 0,32 ± 0,00 87,00 ± 0,92

10 16,35 ± 0,02 0,33 ± 0,00 89,70 ± 0,31

11 15,51 ± 0,05 0,31 ± 0,00 85,05 ± 0,76 Legenda: *DP = Desvio Padrão Fonte: A autora (2015)

De acordo com Freitas et al. (2011), que analisaram a hidrólise do farelo

de mandioca por tratamento com ácido sulfúrico, com tempo de reação 30 e 60

minutos, as conversões em açúcares apresentaram resultados acima de 60%.

Estes valores estão de acordo com o previsto, dado que Harun et al.

(2010b) descrevem rendimentos entre 70 a 95 % em pré-tratamentos com ácido

diluído, o que demonstra o forte potencial deste método como pré-tratamento para a

biomassa microalgal, anteriormente confirmado por Nguyen et al., 2009. Sendo este

um fator também observado neste estudo.

64

Rodomski et al., (2012) ao avaliarem o tratamento da biomassa

lignocelulósica da cadeia produtiva de dendê (Elaeis guineensis) para produção de

glicose por hidrólise ácida, verificaram que a concentração do ácido teve influencia

significativa sobre o tratamento enzimático.

De acordo com experimento em bagaço de cana desenvolvido por Jasko

et al. (2011), os melhores resultados de despolimerização, ocorreram durante a

hidrólise com ácido sulfúrico por 1 hora em autoclave a 121°C, que apresentou um

rendimento de 52% de açúcar redutor solúvel.

4.2.3 Comparativo entre as hidrólises ácidas

O efeito das variáveis independentes: temperatura e concentração de

ácido, podem ser observados na superfície de resposta ilustrada na Figura 16.

Figura 16 - Gráfico de superfície de resposta para a concentração de glicose após hidrólise ácida, em função da concentração do ácido e da temperatura: (a) Ácido clorídrico; (b) Ácido sulfúrico

Fonte: A autora (2015)

O gráfico de superfície de resposta destaca que os melhores tratamentos

são os pontos localizados nas áreas de cores mais intensas e quentes, ou seja,

pontos de maior temperatura e concentração de ácido.

Observa-se que, para a concentração de HCl e H2SO4 ambos

respondem da mesmo forma, ou seja, quanto menor a concentração de ácido maior

o rendimento. E o mesmo, acontece com a temperatura para ambos os tratamentos.

O comparativo entre os resultados obtidos entre as hidrólises ácidas, considerando

as variáveis tempo e concentração do ácido são apresentadas na Figura 17.

(a) (b)

65

Figura 17 - Gráfico de superfície de resposta para a concentração de glicose após hidrólise ácida, em função da concentração do ácido e de tempo: (a) Ácido clorídrico; (b) Ácido sulfúrico

Fonte: A autora (2015)

Considera-se o efeito das variáveis independentes: tempo e

concentração de ácido. Observa-se que, para a concentração dos ácidos HCl e

HSO4 ambos respondem da mesmo forma, ou seja quanto menor a quantidade de

ácido melhor. Porém, o mesmo não acontece com o tempo, pois para o ácido

sulfúrico quanto menor o tempo maior liberação de açúcar redutor . Sendo este,

inversamente proporcional.

Enquanto que, para o tratamento com ácido clorídrico quanto menor o

tempo, menos significativo será o resultado. Sendo assim, verificou-se que as três

variáveis são estatisticamente significativos no modelo estatístico avaliado, assim

como a interação entre eles.

Para melhor explicitar a superfície de resposta, buscou-se uma técnica

que se adaptasse a essas condições de otimização, sendo utilizada a função de

desejabilidade do programa Statistica 12, que permite obter os valores ótimos dos

parâmetros investigados.

Desta forma, a Figura 18 mostra a interação entre as três variáveis

independentes (tempo, temperatura e concentração de ácidos) que tiveram

influência no processo de sacarificação durante a hidrólise. A Figura 18a apresenta

o perfil de desejabilidade da hidrólise com ácido clorídrico e, a Figura 18b com o

ácido clorídrico.

(a) (b)

66

Figura 18 - Perfil dos valores previstos/otimizados e da desejabilidade em relação aos ácidos: (a) clorídrico; (b) sulfúrico

Fonte: A autora (2015)

Através dessa função, foi possível encontrar os valores ótimos das

variáveis independentes, que satisfizessem a variável dependente. Os 3 últimos

perfis mostram a desejabilidade individual para cada fator e a desejabilidade global

igual a 0,93 para o HCl (Figura 18a) e 0,99 para H2SO4 (Figura 18b). As linhas

verticais em vermelho presentes nos gráficos correspondem aos valores ótimos dos

parâmetros estudados e estão localizados, exatamente, nos pontos centrais.

(a)

(b)

67

4.2.4 Hidrólise enzimática

Os resultados obtidos no pré-tratamento pelo método de hidrólise

enzimática, estão apresentados nas Tabelas 9, 10 e 11.

Tabela 9 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise enzimática com temperatura de 40°C, e eficiência (%) do método

Tratamento Açúcar Redutor Total Açúcar Redutor Total Eficiência

Hidrolisado (g.L-1± DP* ) Massa Seca (g.g-1± DP*) (%± DP*)

1 0,285 ± 0,105 0,017 ± 0,008 4,693 ± 1,733

2 0,543 ± 0,059 0,033 ± 0,004 8,943 ± 0,972

3 0,520 ± 0,024 0,031 ± 0,002 8,558 ± 0,388

4 0,533 ± 0,025 0,032 ± 0,002 8,764 ± 0,414

5 0,374 ± 0,128 0,022 ± 0,009 6,151 ± 2,111

6 0,460 ± 0,008 0,028 ± 0,001 7,567 ± 0,135

7 0,514 ± 0,023 0,031 ± 0,002 8,461 ± 0,376

8 0,457 ± 0,033 0,027 ± 0,002 7,512 ± 0,548

9 0,287 ± 0,011 0,017 ± 0,001 4,721 ± 0,178

10 0,170 ± 0,009 0,010 ± 0,001 2,795 ± 0,140

11 0,320 ± 0,103 0,019 ± 0,008 5,271 ± 1,703

12 0,507 ± 0,169 0,030 ± 0,012 8,351 ± 2,77 Legenda: *DP = Desvio Padrão Fonte: A autora (2015)

Tabela 10 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise enzimática com temperatura de 55°C, e eficiência (%) do método

Tratamento Açúcar Redutor Total Açúcar Redutor Total Eficiência

Hidrolisado (g.L-1± DP* ) Massa Seca (g.g-1± DP*) (%± DP*)

13 0,500 ± 0,057 0,030 ± 0,004 8,228 ± 0,939

14 0,240 ± 0,010 0,014 ± 0,001 3,351 ± 0,166

15 0,206 ± 0,061 0,012 ± 0,004 3,387 ± 1,005

16 0,307 ± 0,019 0,018 ± 0,001 5,051 ± 0,309

17 0,103 ± 0,040 0,006 ± 0,003 1,695 ± 0,665

18 0,196 ± 0,010 0,012 ± 0,001 3,222 ± 0,159

19 0,174 ± 0,040 0,010 ± 0,003 2,864 ± 0,658

20 0,319 ± 0,178 0,019 ± 0,013 5,243 ± 2,936

21 0,260 ± 0,031 0,016 ± 0,002 4,281 ± 0,505

22 0,242 ± 0,012 0,015 ± 0,001 3,978 ± 0,202

23 0,411 ± 0,291 0,025 ± 0,021 6,756 ± 4781

24 0,376 ± 0,113 0,023 ± 0,008 6,192 ± 1,80 Legenda: *DP = Desvio Padrão Fonte: A autora (2015)

68

Tabela 11 - Teor de açúcar disponível da Lemna minuta a partir da hidrólise enzimática com temperatura de 70°C, e eficiência (%) do método

Tratamento Açúcar Redutor Total Açúcar Redutor Total Eficiência

Hidrolisado (g.L-1± DP* ) Massa Seca (g.g-1± DP*) (%± DP*)

25 0,140 ± 0,027 8,387 ± 1,963 2,300 ± 0,440

26 0,098± 0,011 5,879 ± 0,828 1,613 ± 0,186

27 0,098 ± 0,010 5,879 ± 0,711 1,613 ± 0,159

28 0,272 ± 0,039 16,309 ± 2,866 4,473 ± 0,642

29 0,124 ± 0,018 7,434 ± 1,303 2,039 ± 0,292

30 0,357 ± 0,043 21,424 ± 3,159 5,876 ± 0,707

31 0,271 ± 0,013 16,259 ± 0,919 4,459 ± 0,206

32 0,384 ± 0,139 23,028 ± 10,182 6,316 ± 2,280

33 0,159 ± 0,011 9,540 ± 0,838 2,617 ± 0,188

34 0,083 ± 0,019 4,977 ± 1,430 1,365 ±0,320

35 0,154 ± 0,009 9,239 ± 0,689 2,534 ± 0,154

36 0,093 ± 0,010 5,579± 0,711 1,530 ± 0,159 Legenda: *DP = Desvio Padrão Fonte: A autora (2015)

Conforme as Tabelas 9, 10 e 11, dentre os 36 tratamentos realizados, o

tratamento 1 (40°C; 60' e pH 5,00) foi o mais eficiente e disponibilizou 32,61 ± 1,34g

de açúcar redutor total por kg de macrófita. Sendo assim, este tratamento

disponibilizou um teor de açúcares 91,06% inferior ao teor de carboidrato presente

na biomassa de Lemna minuta.

Sendo que o tratamento 26 (70 °C; 60' e pH 5,00) disponibilizou 5,88 ±

0,83g ATR.kg-1 e, o 27 (70 °C; 60' e pH 6,00) disponibilizou 5,88 ± 0,71g ATR.kg-1 de

macrófita. Respectivamente ambos obtiveram os menores rendimentos. A diferença

entre os tratamentos de menor eficiência (26 e 27) está relacionada somente ao pH,

uma vez que, ocorreram sob as mesmas condições nas variáveis tempo e

temperatura de incubação.

Para uma melhor visualização da interação dos efeitos estimados entre a

combinação das variáveis, foi gerado o gráfico de superfície de resposta para

análise da eficiência (Figura 19). É possível observar que apenas a variável

temperatura apresentou influência significante, no nível de confiança adotado

(p<0,05). Embora a hidrólise enzimática tenha vantagens sobre a conversão química

de alto rendimento de açúcar como o baixo consumo de energia, condições de

operação brandas (pressão e temperaturas baixas), biorreatores de baixo custo e

formação mínima de subprodutos (SUN; CHENG, 2005), o custo e a baixa

produtividade da hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica é uma das

69

principais barreiras da comercialização do etanol de segunda geração (ZHENG,

2009).

Figura 19 - Gráfico de superfície de resposta para a eficiência na produção de glicose após hidrólise enzimática, em função: (a) Temperatura e pH; (b) Tempo e pH

Fonte: A autora (2015).

No referido estudo, ainda destaca-se a inexpressiva produtividade da

hidrólise enzimática, comparando-a com a hidrólise química (HCl 5% a 150ºC por 60

minutos), apresentando esta uma superioridade em liberação de açúcares redutores

totais de 90,94% sob a enzimática. Esta explicação pode estar pautada na enzima

utilizada, pois esta é industrializada e não específica para a sacarificação da

biomassa de lemna minuta (celulase). Todavia, estas enzimas são altamente

específicas, isto é, afetam apenas a celulose, ficando a hemicelulose contida na

biomassa intacta (HARUN et al., 2010b).

A Figura 20 mostra a interação entre as três variáveis independentes

(tempo, temperatura e ph) que tiveram influência no processo de sacarificação

durante a hidrólise. Apresenta o perfil de desejabilidade da hidrólise enzimática.

(a) (b)

70

Figura 20 - Perfil dos valores da desejabilidade em relação ao tempo, temperatura e pH

Fonte: A autora (2015).

A desejabilidade, aponta para os valores ótimos das variáveis

independentes, mostrando temperatura, tempo e pH mais significativo em 40°, 60' e

6,00 respectivamente.

Alvira et al. (2010) descrevem que complexos enzimáticos contribuem

eficazmente para a degradação da estrutura complexa da celulose e da pectina,

permitindo maiores rendimentos em açúcares. Estas irão atuar em características

específicas, tais como temperatura, tempo e pH.

4.3 ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO

Após a definição do melhor pré-tratamento (HCl 5% a 150ºC por 60'), o

mesmo foi repetido, o hidrolisado obtido foi submetido à fermentação, cujos

resultados provenientes da cinética da produção de bioetanol são apresentados na

Tabela 12.

71

Tabela 12 - Concentração de substrato, consumo e produção de etanol a partir da fermentação alcoólica á 30ºC

Tempo Fermentação

ART Disponível

ART Consumido

Produção Etanol

Suspensão de Levedura Levedura

(hora) (g.L-1

± DP) (g.L-1

± DP) (g.L-1

± DP) [g.L-1

± DP] [células.mL-1

]

0 7,29 ± 0,07 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,01 0,19± 0,01 79.208 ± 2.526

3 6,46 ± 0,01 0,83 ± 0,02 0,42 ± 0,01 0,18 ± 0,02 77.796 ± 7.610

6 5,35 ± 0,01 1,94 ± 0,01 0,98 ± 0,01 0,16 ± 0,01 66.497 ± 1.926

12 5,25 ± 0,01 2,04 ± 0,01 1,04 ± 0,00 0,15 ± 0,00 52.501 ± 222

24 5,21 ± 0,02 2,08 ± 0,02 1,06 ± 0,05 0,12 ± 0,01 52.501 ± 4.816

48 4,84 ± 0,03 2,45 ± 0,02 1,27 ± 0,05 0,11 ± 0,00 44.925 ± 1.334

Legenda: ART: Açúcar Redutor Total; DP= Desvio Padrão; [ ] = Concentração; NA= Não Analisado Fonte: A autora (2015)

A produção de etanol de segunda geração apresenta a cinética de

produção ilustrada na Figura 21.

Figura 21 - Produção de etanol de Lemna minuta versus consumo de açúcar redutor total

Fonte: A autora (2015)

Portanto, conforme a Figura 20, verifica-se que apenas 33,7% do total de

açúcar redutor disponível no hidrolisado foi consumido durante a fermentação,

evidencia-se o pico de maior consumo aferido nas sexta hora do processo. Onde,

houve o consumo de 79,18% do açúcar total consumido pelas leveduras. A partir

dos resultados obtidos foi possível calcular o açúcar inicial, o consumo de ART e a

velocidade da produção de etanol, conforme cálculos apresentados a seguir:

72

Açúcares Total Inicial:

1 % = − ∗ 100 / ∗ 0,538 (1)

127/3,92 = 32,39%

Açúcares consumidos:

2 % = − ∗ 100 / − ∗ 0,538 (2)

127 /1,32 = 96,21 %

Produtividade:

/ % = − ∗ 100 /( − )

127/2,45= 51,84 %

Destaca-se nesta análise que a produção máxima desta biomassa

corresponde a 53,8%, e após o pré tratamento obteve-se 51,84%. Desta forma, a

produtividade chegou a 96,35%, sendo este um resultado de grande

expressividades.

Avaliando estes dados, pode-se inferir que em uma condição de

regimento de operação, utilizando reator de fluxo contínuo ou de batelada

alimentada, a melhor alimentação do sistema seria na sexta hora, onde se obtém a

melhor taxa de conversão em g.L-1.h-1.

4.4 BIOETANOL DE LEMNA MINUTA VERSUS FONTES ALTERNATIVAS

Atualmente, os combustíveis de segunda geração já podem ser obtidos a

partir de biomassas diversas, dentre as mais utilizadas, evidencia-se a possibilidade

de aproveitamento dos resíduos agroindustriais vegetais (ESCOBAR et al., 2009).

Entretanto, as pesquisas iniciais sobre esta temática trabalhavam normalmente com

biomassas advindas de culturas vegetais altamente energéticas (BALATA et al.,

2008; MUSSATTO et al., 2010).

A Tabela 13 apresenta o potencial de produção de etanol das principias

biomassas vegetais estudadas e a produção obtida com o rendimento calculado

neste estudo.

73

Tabela 13 - Potencial de produção de bioetanol proveniente de biomassas vegetais

Cultura Potencial de produção de etanol (L.t-1)*

Produtividade em etanol (L.ha-1)***

Cana-de-açúcar 70 6190 – 7500 Beterraba 110 5010 – 6680 Batata-doce 125 NA Batata 110 NA Milho 360 3460 – 4020 Arroz 430 NA Centeio 250 NA Trigo 340 2590 Sorgo sacarino 60 3050 – 4070 Biomassa celulósica 280 NA Mandioca NA 3310 Microalgas NA 46760 – 140290 Lemna minuta*** 41,61 4000 - 8000

Legenda: NA = Não avaliado Fonte: * adaptado de Balata et al. (2008); **Mussatto et al. (2010), *** Calculado pela autora

Ao compararmos o potencial de produção de etanol obtido no presente

estudo com outras culturas vegetais (Tabela 13), verifica-se que a Lemna minuta

apresentou o rendimento mais equiparado ao etanol gerado à partir de sorgo

sacarino, entretanto nas condições experimentais realizadas neste estudo a

macrófita apresentou potencial de produção inferior em 30,65%.

BNDES/CGEE, (2008), em estudo sobre produção de bioetanol,

reportaram um valor de 460 litros de bioetanol anidro por tonelada de milho. Tasic et

al., (2009) investigou a hidrólise ácida do amido de tubérculos de batata doce

utilizando ácido clorídrico e sulfúrico em diferentes proporções de material vegetal e

reportou um valor de 31 g/l de produção de etanol obtido no processo de

fermentação. Já Hashem & Darwish (2010), utilizaram no seu estudo o fluxo de

resíduos de amido de batata produzidos durante a fabricação de chips, como fonte

econômica para a biomassa e produção de bioetanol, e verificaram no final do

processo produção de 5,52 g.L-1 de etanol.

De acordo com Bastos (2007) “no futuro, por razões econômicas, a

alcoolquímica poderá vir a substituir à petroquímica e o etanol poderá assumir o

lugar do petróleo como fonte de matérias primas”. Este setor vêm recebendo

investimentos pesados em R&D (Research & Development) principalmente no etanol

lignocelulósico em vários países da União Européia e EUA. Muitos consideram a

conversão desses materiais um dos maiores desafios dos próximos cinquenta anos,

em que os líderes serão as firmas e economias que conseguirem desenvolver

tecnologias alternativas à economia do petróleo (BASTOS, 2007).

74

5 CONCLUSÕES

Foi determinado o teor de carboidratos da biomassa de Lemna minuta,

originária da região Meio Oeste ( sendo este um valor relevante);

Dentre os pré-tratamentos, o tratamento com HCl (menor

concentração,temperatura e tempo), apresentou maior potencial de sacarificação,

disponibilizou 360,00g de açúcar redutor total por kg de Macrófitas;

Saccharomyces cerevisiae chardonay foi hábil na produção de etanol,

utilizando somente o caldo hidrolisado da biomassa, onde a maior velocidade de

produção de etanol e de consumo de ART foi na sexta hora;

Lemna minuta matéria-prima promissora para a produção de bioetanol.

Sugestões para Trabalhos Futuros

Ensilagem : pré digestão durante a armazenagem;

Transferência de escala para produção em reatores (nutrientes, fatores

inibitórios e temperatura).

75

REFERÊNCIAS

ALVIRA, E.; TOMAS-PEJA, M.; BALLESTEROS, M.J. NEGRO. Pretreatment Technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: a review. Bioresour Technol, v.101, p.4851-4861, 2009.

ANTOLIN, G.; TINAUT, F. V.; BRICENO, Y.; CASTANO, V.; PÉREZ, C.; RAMIREZ, A. I. Bioresource Technology v.82 , n.2, p.111, 2002.

ANTUNES, R.; SILVA, I. C.(2010). Utilização de algas para a produção de biocombustíveis. Instituto Nacional da Propriedade Industrial. Disponível em: <http://www.marcasepatentes.pt/files/collections/pt_PT/1/300/302/Utiliza%C3%A7%C3%A3o%20de%20algas%20para%20a%20produ%C3%A7%C3%A3o%20de%20biocombust%C3%ADveis.pdf> Acesso em: Fev. 2015.

BAYARAKCI, A. G.; KOÇAR, G. Second-generation bioethanol production from water hyacinth and duckweed in Izmir: A case study Ege University, Solar Energy Institute, 35100 Bornova, Izmir, Turkey, Elsevier Ltd. 2013.

BALAT, M.; BALAT, H.; CAHIDE, O.Z. Progress in bioethanol processing. Progress in Energy and Combustion Science, v.34, p.551-573, 2008.

BASTOS, V. D. Etanol, alcoolquímica e biorrefinarias. BNDES Setorial, Rio de Janeiro: BNDES, n.25, p.5-38, 2007.

BEN (2015). Balanço energético nacional. Disponível em <http://ben.epe.gov.br/> Acesso em: mai. 2015.

BERGMANN B. A.; CHENG J.; CLASSEN J. & STOMP A. M. In vitro selection of duckweed gegraphical isolates for potencial use in swine lagoon effluent renovation. Biresource Technology, v.73, p.13-20, 2000.

BIOCOMBUSTÍVEIS (2011). Resumo Temático | Energia e Clima: BCSD Portugal – Conselho Empresarial para o Desenvolvimento Sustentável. Disponível em:<http://www.wbcsd.org/web/publications/Biofuels-Portuguese.pdf>Acesso em: fev. 2015.

BIOENERGIA. Manual sobre tecnologias, projeto e instalação (2004). Disponível em <http://pt.scribd.com/doc/23404175/Manual-Bioenergia> Acesso em : fev. 2015.

BLOTTNITZ, H.; CURRAN, M. A. A review of assessments conducted on bio-ethanol as a transportation fuel from a net energy, greenhouse gas, and environmental lifecycle perspective. Journal of Cleaner Production, v.15, p.607-619, 2007.

BNDES e CGEE. Bioetanol de Cana de açúcar: Energia para o Desenvolvimento Sustentável; organização BNDES e CGEE; 1ª Edição; Rio de Janeiro, 2008, p.316

BRAUN, L. GORENSTIN, A.M. SCHMAL; Química Nova, p.472, 2004.

BUSS, M. V. Macrófitas aquáticas flutuantes: avaliação e indicativo do seu potencial bioenergético. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós

76

Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e Biotecnologia, Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus Videira – UNOESC, p.106, 2015.

CAMASSOLA, M.; DILLON, A. J. P. Biological Química. Instituto Militar de Engenharia. p.89, 2009.

CANO, R. J.; COLOMÉ, J. S. Microbiology. West Publishing Company; California, 1986.

CARVALHO, A. P.; MEIRELES, L. A.; MALCATA, F. X.; (2006); Microalgal Reactors: A Review of Enclosed System Designs and Performances. Biotechnology Progress v.22, n.6, p.1490-1506, 2006.

CASTRO, A.M.; PEREIRA JUNIOR, N. Produção, Propriedades e Aplicação de Celulases na Hidrólise de Resíduos Agroindustriais. Química Nova, v.33, n.1, p.181-188. 2010.

CHENG, M. C.; CHANG, R.C.; DENT, D.F.; HSIEH, P. C. Breeding an Amylolytic Yeast Strain for Alcoholic Beverage Production. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.163, n.6, p.693-706, 2011.

CHIARAMONTI, D.; OASMAA, A.; SOLANTAUSTA, Y. Power generation using fast pyrolysis liquids from biomass". Renewable and Sustainable Energy Reviews, v.11, n.6, p.1056-1086, 2007.

CHISTI, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology, v.25, p.294-306, 2007.

CHISTI, Y. Biodiesel from microalgae beats bioethanol. Trends in Biotechnology, v.26, p.126-131, 2008.

COOK, C.D.K. 1990. Aquatic Plant Book. Amsterdam. p.228.

COSTA, J.A.V.; MORAIS, M.G. The role of biochemical engineering in the production of biofuels from microalgae. Bioresource Technology, v.102, p.2-9, 2011.

CZERNIK, S.; BRIDGWATER, A. V. Overview of applications of biomass fast pyrolysis oil. Energy and Fuels, v.18, n.2, p.590-598, 2004.

DEMIRBAS, A. Mechanisms of liquefaction and pyrolysis reactions of biomass. Energy Conversion Management, v.41, p.633-646, 2004.

DEMIRBAS, M. F.; BALAT, M.; BALAT, H. Potential contribution of biomass to the sustainable energy development. Energy Conversion Management, v.50, p.1746-1760, 2009.

DENNIS, W, M. AQUATIC MACROPHYTON SAMPLING. AN OVERWIEW. IN: DENNIS, W.M., ISOM, B.G. (EDS) Ecological Assessment of macrophyton: collection, use, and meaning of data. ASTM STP 843, American Society for Testing and mayerials, p.2-6, 1984.

DOE, US (2006). Breaking the Biological Barriers to Cellulosic Ethanol: A Joint Research Agenda, DOE/SC 0095, US Department od Energy Office of Science and

77

Office of Energy Efficiency and Renewable Energy. Disponível em: <http://genomicscience.energy.gov/biofuels> Acesso em: Jun. 2014.

EL-TAYEB, T. et al. Effect of acid hydrolysis and fungal biotreatment on agro-industrial waste for obtainment of free sugars for bioethanol production. Brazilian Journal of Microbiology, p.1523-1535, 2012.

EPAGRI e CIRAM (2008). Zoneamento Agroecolólgico e socioeconômico de Santa Catarina.pdf, 1010 p. Versão eletrônica, disponibilizado em: <http://ciram.epagri.rct-sc.br:8080/cms/zoneamento/zae.> Acesso em março 2015.

ESCOBAR, J. C.; LORA, E. S.; VENTURINI, O. J.; YÁÑEZ, E. E.; CASTILLO, E. F.; ALMAZAN, O. Biofuels: Environment, technology and food security; Renewable and Sustainable Energy Reviews, v.13, p.1275-1287, 2009;

ESHAQ, F. S.; ALI, M. N.; MOHD, M. K. Spirogyra biomass a renewable source for biofuel (bioethanol) production. International Journal of Engineering Science and Technology, v.2, n.12, p.7045-7054, 2010.

ESTEVES, F. A. Fundamentos de Limnologia. 2 ed. Rio de Janeiro: FINEP, 1998, p.602.

ESTEVES, F. A. Fundamentos de Limnologia. 3 ed. Rio de Janeiro: Editora Interciência, p. 826, 2011.

FAO, Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação. State of Food and Agriculture. Roma, 2008a.

FAO, Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação. Soaring Food Prices: Facts, Perspectives, Impacts and Actions Required. Roma, 2008b.

FUGITA, M.; MORI, K.; KODERA, T. Nutrient removal and starch production through cultivation of arriza. J. Biosci. Bioeng, v.87, p.194-198, 1999.

FERNANDO, S.; ADHIKARI, S.; CHANDRAPAL, C.; MURALI, N. Biorefinery: Current status, challenges and future directions. Energy & Fuels, v.20, p.1727-1737, 2006.

FERREL, J.; SARISKY-REED, V. S. National Algal Biofuels Technology Roadmap, U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program, 2010.

CGEE (2008), Centro de Gestão e Estudos Estratégicos. Bioetanol de cana-de-açúcar: energia para o desenvolvimento sustentável. Rio de Janeiro, p.316, 2008.

GONÇALVES, R.S.; SILVEIRA, J.R.P.; BATTISTIN, A.; FERMINO, M.H; BUSNELLO, C.A. Determinação do Teor de Glicose de Diferentes Acessos de Mandioca a partir da Hidrólise Ácida das Raízes. Pesquisa Agropecuária Gaúcha. v.15, n1, 2009.

GOUVEIA, L. Microalgae as a Feedstock for Biofuels; Book Springer Briefs.Springer Berlin Heidelberg Publisher, v. 978, n.3, p.642-17997, 2011. doi: 10.1007/978-3-642-17997;

78

GRAY, K. A.; ZHAO, L.; EMPTAGE, M. Bioethanol. Current Opinion in Chemical Biology, v.10, p.141-146, 2006.

GRFA (2014), Global Renewable Fuels Alliance. Fontes de Biocombustíveis no mundo. Disponível em: <http://globalrfa.org/biofuels-map/> Acesso em: abr. 2014.

GROHMANN,K.; BOTHAST, R. J. Saccharification of corn fiber by combined treatment with dilute sulphuric acid and enzymes. Process Biochem, v.32, p.405-415, 1997.

HARUN, R.; SINGH, M.; FORDE, G.M.;DANQUAH, M.K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews, v.14, p.1037-1047, 2010.

HARUN, R.; DANQUAH, M.K. Exploring alkaline pre-treament of microalgal biomass for bioethanol production. Applied Energy, v.88, p.3464-3467, 2011.

HARUN, R.; MICHAEL, K.D.; GARETH, M.F. Microalgal biomass as a fermentation feedstock for bioethanol production. J Chem Technol Biotechnol. v.85. p.199-203, 2010.

HARUN, R.; SINGH, M.; FORDE, G. M.; DANQUAH, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews, v.14, p.1037-1047, 2010.

HASHEM, M.; DARWISH, S.M.I. Production of bioethanol and associated byproducts frompotato starch residue stream by Saccharomyces cerevisiae. Biomass and Bioen., v.34, p.953-959, 2010.

HAUSTEIN, A. T.; GILMAN, P. W.; SKILLICORN, P. W.; VERGARA, V. Duckweed, a useful strategy for feeding chickens: Performance of layers fed with sewage grown Lemnaceae species. Polt Sci, v.69, p.1835-1844, 1990.

HENNIGES, O.; ZEDDIES, J. Fuel ethanol production in the USA and Germany: a cost comparison. F. O. Licht’s World ethanol and biofuels Report, v,1,n11, 2005.

HILL, D.T.; BOLTE, J.P. Methane production from low solid concentration liquid swine waste using conventional anaerobic fermentation. Bioresource Technology, v.74, p.241-247, 2006.

HORAN, N. Biological waste water treatment systems: Theory and operation. p.223-230, 1991.

HOSSAIN, A. B. M. S.; SALLEH, A.; BOYCE, A. N.; CHOWDHURY, P.; NAQIUDDIN, M. Biodiesel Fuel Production from Algae as Renewable Energy; American Journal of Biochemistry and Biotechnology, v.4, p.250-254, 2008.

HU, Q. Industrial production of microalgal cell-mass and secondary products – major industrial species: Arthrospira (Spirulina) platensis. In: RICHMOND, A. Handbook of microalgal culture: biotechnology and applied phycology. Oxford: Blackwell Science, p. 264-272, 2008.

79

HU, Q.; SOMMERFELD, M.; JARVIS, E.; GHIRARDI, M.; POSEWITZ, M.; SEIBERT, M.; DARZINS, A. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal, v.54, n.4, p.621-639, 2008.

IEA (2005) International Energy Agency. Biogas production and utilization, Disponível em <www.novaenergie.chs> Acesso em: Jun. 2014.

IEA (2006) International Energy Agency. Renewables Information 2006. Disponível em: <www.novaenergie.chs> Acesso em: Jun. 2015.

IEA (2009) Energy Sector Methane Recovery and Use – The Importance of Policy. 44 pp. Paris, IEA.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. 4 ed. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008, p.1020.

IRGANG, BE.; GASTAL Jr. Macrófitas aquáticas da planície costeira do RS. Porto Alegre: UFRGS,1996, p.290.

JASKO, A. C. et al. Caracterização físico-química de bagaço de mandioca in natura e após tratamento hidrolítico. Revista Brasileira de Tecnologia Agroindustrial, Ponta Grossa, v.5, n.1, p. 427-441, 2011.

JOHN, R. P.; ANISHA, G. S.; NAMPOOTHIRI, K. M.; PANDEY, A. Micro and macroalgal biomass: A renewable source for bioethanol. Bioresource Technology, v.102, n.1, p.186-193, 2011.

KAPDI S.S;VIJAM V.K;RAJESH S.H;PRASAD R.Biogás scrubbing compression and starage: perspectiva and prospectus in Indian context , Renewable Energy nº30,p.1195-1202.2005

KARIMI, K.; KHERADMANDINIA, S.; TAHERZADEH, M.J. Conversion of rice straw to sugars by dilute-acid hydrolysis. Biomass & Bioenergy, v.30, p.247–253, 2006.

KIM, T.; CHOI, C.; OH, K. Bioconversion of sawdust into etanol using dilute sulfuric acid-assisted continuous twin screw-driven reactor pretreatment and fed-batch simultaneous saccharification and fermentation. Bioresource Technology, v.130, p.306-313, 2013.

KIM, S.; DALE, B. Global potential bioethanol production from wasted crops and crop residues. Biomass and Bioenergy, v.26, p.361-375, 2004.

KIM, T.H.; LEE, Y.Y., Fractionation of corn Stover by hot water and aqueous ammonia treatment. Bioresource Technology, v.97, p.224-232, 2006.

KOTAY, S. M.; DAS, D. Biohydrogen as a renewable energy resource – Prospects and potencials. Internacional Journal of Hydrogen Energy, v.33, p.258-263, 2008.

LANDOLT, E.. The family of Lemnaceae. A monographic study (v.1) Geobotanischen Instititres Stiftung Rubel, Zurich, p.566, 1986.

80

LANDOLT, E.; KANDELER. The family of Lemnaceae. A monographic study (v.2) Phitochemistry, physiology, application, bibliography. Geobotanischen Instititres Stiftung Rubel, Zurich, p.638, 1987.

LEE, R. A.; LAVOIE, J. M. From first to third-generation biofuels: Challenges of producing a commodity from a biomass of increasing complexity. Université de Cherbrooke, Quebec, Canadá. 2013.

LIBESSART, N.; MADDELEIN, M.L.; KOORNHUYSE, N.; DECQ, A.; DELRUE, B.; MOUILLE, B. S. Storage, photosynthesis and growth: the conditional nature of mutations affecting starch synthesis and structure in Chlamydomonas. Plant Cell, v.7, p.1117–1127, 1995.

LIMA, U. A.; AQUARONE. E.; BORZANI, W.; SCHIMIDELL, W. Biotecnologia industrial: processos fermentativos e enzimáticos. 1ª ed. Editora Edgar Blücher, São Paulo, v.3, p.593, 2001.

LYND, L.; WEIMER, P.J.; VAN ZYL, W.H. Microbial cellulose utilization: Fundamentals and e Biotechnology. Microbial Molecular Biology, v.66, p.506-577, 2002.

LYND, L. R.; van ZYL, W. H.; McBRIDE, J. E.; LASER, M. Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass: an Update. Elsevier, Current Opinion in Biotechnology, v.16, n.5, p.577-583, 2005.

MALDONDE, I. R.; CARVALHO, P. G.B.; FERREIRA, N. A. Protocolo para determinação de açúcares totais em hortaliças pelo método de DNS. Comunicado Técnico. Ministério da Agricultura e abastecimento. Embrapa, 2013.

MARQUES, F. O etanol do Futuro. São Paulo: Pesquisa FAPESP, v.20, p.149, 2008.

MATA, T. M.; MARTINS, A. A.; CAETANO, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, v.14, p.217-232, 2009.

MCKENDRY, P. Energy production from biomass (part 1): overview of biomass. Bioresource Technology, v.83, p.37, 2002.

MENEZES, T. J. B. Etanol o combustível do Brasil. São Paulo, Ed. Agronômica Ceres. p.229, 1980.

MILLER, G. L. Use of dinitrosalicilic acid reagente for determination of reducing sugars. Analytical Chemistry, v.31, n.3, p.426-428, 1959.

MOHEDANO, R. A. Uso de macrófitas lemnáceas (landoltia punctata) no polimento e valorização do efluente de suinocultura e na fixação de carbono. Tese de Doutorado. (Programa de pós-graduação em Engenharia Ambiental) Universidade Federal de Santa Catarina, p. 270, 2010.

81

MOHEDANO, R. A.; COSTA, R.H.R.; TAVARES, F.A. e BELLI, P.. High nutrient removal rate from swine wastes and protein biomass production by full-scale duckweed ponds. Bioresour, v.112, p.98-104, 2012.

MOLINA-GRIMA, E.; BELARBI, E. H.; ACIÉN-FERNANDÉZ, F. G.; ROBLES MEDINA, A.; CHISTI, Y. Recovery of microalgae biomass and metabolites: process options and economics. Biotechnology Advances, v.20, p.491-515, 2003.

MOSIER, N.; WYMAN, C.; DALE, B.; ELANDER, R.; LEE, Y.Y.; HOLTZAPPLE, M.; LADISCH, M. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, v.96, p.673-686, 2005.

MUSSATTO, S.I.; DRAGONE, G.; GUIMARAES, P.M.R.; SILVA, J.P.A.; CARNEIRO, L.M.; ROBERTO, I.C.; VICENTE, A.; DOMINGUES, L.. Technological trends, global market, and challenges of bio-ethanol production. Biotechnol, v.28, n.6, p.817-830, 2010.

NAHAK, S.; NAHAK, G.; PRADHAN, I.; SAHU, R.K. Bioethanol from marine algae: a solution to global warming problem. J. Appl. Environ. Boil. Sci., v1, n.4, p.74-80, 2011.

NAIK, S.N.; GOUD, V.V.; ROUT, P.K.; DALAI, A.K. Production of first and second generation biofuels: a comprehensive review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, v.14, p.578-597, 2010.

NGUYEN, N.; SUH, S.; MARSHALL, C. J.; BLACKWELL, M. Morphological and Ecological Similarities: Wood-boring Beetles Associated with Novel Xylose-fermenting Yeasts Spathaspora passalidarum gen. sp. Nov. and Candida jeffrisse sp. Nov. Mycological Research, v.110, p.1232-1241, 2006.

PARK, I. et al. Cellulose ethanol production from waste newsprint by simultaneous saccharification and fermentation using Saccharomyces Cerevisiae KNU 5377. Process Biochemistry, v.45, p.487-492, 2010.

PEDRALLI, G. Macrófitas aquáticas: técnicas e métodos de estudos. Revista Agros,Porto Alegre, v.83, p.45-51, 1990.

PIGHINELLI, A. L. M. T. Extração mecânica de óleos de amendoim e de girassol para a produção de biodiesel via catálise básica. Dissertação - (Mestrado em Engenharia Agrícola), Faculdade de Engenharia Agrícola, Universidade Estadual de Campinas, p.93, 2007.

POTT, J. V.; CERVI, A. C. A família Lemnaceae Gray no Pantanal (Mato Grosso e Mato Grosso do Sul), Brasil. Revista brasileira de Botânica, São Paulo, v.22, n.2, p.153-174, 1999.

POTT, J. V. Plantas aquáticas do pantanal. Corumbá, MS. Centro de Pesquisa Agropecuária do Pantanal. EMPRAPA, p.404, 2000.

POTT, V.J.; POTT, A. Plantas aquáticas do pantanal. Brasília: EMBRAPA,1990.

82

RABELO, S. C. Avaliação e Otimização de Pré-Tratamentos e Hidrólise Enzimática do Bagaço de Cana-de-açúcar para a Produção de Etanol de Segunda Geração. Tese de Doutorado em Engenharia Química, Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, 2010.

RADOMSKI, B. M. (2012). Caracterização da fibra energia para o desenvolvimento sustentável. Rio de de dendê (Elaeis guineensis) e estudos preliminares Janeiro, 316 p. para produção de etanol. Dissertação de mestrado .

RAVEN, P. H. Biologia vegetal. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001, p.221.

RAVEN, P.H.; EVERT, R.F.; EICHHORM, S.E. Plantas Vasculares. Biologia Vegetal. Editora Guanabara Koogan S.AA. p.295-327, 1996.

RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, v.27, n. 5, p.771-778, 2004.

RIBEIRO, N.; GODINHO, A.M.M.; MARQUES, T.A. Produção de Glicose a partir do Amido da Batata-Doce por Hidrólise Ácida. Colloquium Agrariae, v.5, n. especial, 2009.

RICHMOND, A. Handbook of microalgal culture: biotechnology and applied phycology. Oxford: Blackwell Science, 2004.

ROCHA, G. et al. Dilute mixed-acid pretreatment of sugarcane bagasse for ethanol production. Biomass & Bioenergy, v.35, p.663-670, 2011.

RODRIGUES, A.F. Avaliação da tecnologia de hidrólise ácida de bagaço de cana. Univesidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Campinas, 2007.

RUSSOF, L. L.; BLAKENEY, E. W. Jr.; CULLEY, D. D. Jr. Duckweeds (Lemnaceae family): A Potential source of protein and amino acids. J. Agric. Food Chem, v.28, p. 848-850, 1980.

RUSSOF, L. L.; GANTT, D. T.; WILLIANS, D. M.; GHOLSON, J.H. Duckweeds a potencial feedstuff for catle. J. Dairy Science, v.60, p.161-170, 1978.

SÁNCHEZ, G.; PILCHER, L.; ROSLANDER, C.; MODIG, T.; GALBE, M.; LIDEN, G. Dilute-acid hydrolysis for fermentation of the Bolivian straw material Paja Brava. Bioresour Technol, v.93, n.3, p,249-56, 2004.

SAHA, B.C.; ITEN, L.B.; COTTA, M.A.; WU, Y.V. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochemistry, v. 40, p.369- 370, 2005.

SAHA, B. et al Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochemistry, v.40, p.3693-3700, 2013.

83

SHELLEY, S. Renewable feedstocks: trading barrels for bushels. Chemical Engineering, Rockville, v.116, p.16-22, 2009.

SCHENK, P. M.; THOMAS-HALL, S. R.; STEPHENS, E.; MARX, U.C.; MUSSGNUG, J. H.; POSTEN, C.; KRUSE, O.; HANKAMER, B. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production; Bioenergy Research v.1, p.20-43, 2008.

SOARES, D. Avaliação do crescimento celular e da produtividade de lipídeos de microalgas marinhas em diferentes regimes de cultivo. Tese do Curso de Pós-Graduação em Ciências: Bioquímica (Mestrado e Doutorado) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba, p.107, 2010.

SPENCER, W. e BOWES, G. Ecophysiology of the world’s most troublesome aquatic weeds. In PIETERSE, AH. and MURPHY, KJ. ed. Aquatic weeds. Oxford: Oxford University Press, p.39-73, 1993.

SUALI, E. Conversion of microalgae to biofuel. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2011.

SUAREZ, P. A. Z.; SANTOS, A, L. F.; RODRIGUES, J. P.; ALVES, M. B. Quimica Nova,v.32, p.768, 2009.

SUN, Y.; CHENG, J. Hydrolisis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour. Technol., v.83, p.1-11, 2005.

SURYAWATI, L.; WILKINS, M.; BELLMER, D. Simultaneous Sacharification and Fermentation on Kanlow Swtchigrass Pretreated by Hidrotermolysis. Biotechenology and Bioengineering, 2008.

TASIC, M.B.; KONSTANTINOVIC, B.V.; LAZIC, M.L.; VELJKOVIC, V.B. The acid hydrolysis of potato tuber mash in bioethanol production. Biochem. Eng. J., v.43, p.208-211, 2009.

TAVARES, J. E. B. Cultivo de microalgas do género Botryococcus visando a produção de biodiesel. Tese de Mestrado em Biologia Celular e Biotecnologia; FC-UL; Lisboa, 2009.

THOMAZ, S. M.; BINI, L. M. Ecologia e manejo de macrófitas em reservatórios. Ata Limnologia Brasil , v.10, n.1, p.103-116, 1999.

TOLMASQUIM, M. T. (Org.). Fontes renováveis de energia no Brasil. Rio de Janeiro: Interciência: Cenergia, p. 515, 2007.

TRIANA, C. et al. Analysis of coffee cut-stems (CCS) as raw material for fuel ethanol production. Energy, v.36, p.4182-4190, 2011.

VIDOTTI, E. C.; ROLLEMBERG, M. C. E. Algas: da economia nos ambientes aquáticos a biorremediação e à química analítica. Química Nova, São Paulo, v.27, n.1, 2004.

84

WAYMAN, C. Handbook of Bioethanol: Production and Utilization. Taylor & Fracis, ISBN 1-56032- 553-4, Washington, USA, 1996.

WANG, S.; WANG, K.; LIU, Q.; GU, Y.; LUO, Z.; CEN, K.; FRANSSON, T. Comparison of the pyrolysis behavior of lignins from different tree species. Biotechnology Advances, v.27, p.562-567, 2009.

WOICIECHOWSKI, A. L.; NITSCHE, S.; PANDEY, A.; SOCCOL, C. R. Acid and Enzymatic Hydrolysis to Recover Reducing Sugar from Cassava Bagasse: an Economic Study. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.45, n3, p.393-400, 2002.

WOLVERTON, B. C.; MCDONALD, R. C. The water hyacinth from prolific pest to potencial provider. AMBIO, v.8, n.1, 1979.

ZHANG, S.; XU, Y.; HANNA, M. A. Pretreatment of Corn Stover with Twinscrew Extrusion Followed by Enzimatic Saccharification. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.166, p.458-469, 2011

ZHAO, X.; LIU, D. Chemical and thermal characteristics of lignins isolated from Siam weed stem by acetic acid and formic acid delignification. Industrial Crops and Products, v.32, p.284- 291, 2010

ZHAO, X.; MOATES, G. K.; WELLNER, N.; COLLINS, S. R. A.; COLEMAN, M. J.; WALDRON, K. W. chemical characterisation and analysis of the cell wall polysacacharides of duckweed (Lemna minor). Carboydrate Polymers, v. 111, p.410-418, 2014.