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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
JAIME ANTÔNIO MACHADO FARIAS
ESTUDO DO POTENCIAL PROTETOR DE Achyrocline satureioides
NA COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR DEXTRANO SULFATO DE
SÓDIO (DSS) EM CAMUNDONGOS.
Itajaí
2016
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
JAIME ANTÔNIO MACHADO FARIAS
ESTUDO DO POTENCIAL PROTETOR DE Achyrocline satureioides
NA COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR DEXTRANO SULFATO DE
SÓDIO (DSS) EM CAMUNDONGOS.
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade
Itajaí, Julho 2016
FICHA CATALOGRÁFICA
F226
Farias, Jaime Antônio Machado, 1991- Estudo do potencial protetor de Achyrocline stureioides na colite ulcerativa induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS) em camundongos / Jaime AntônioMachado Farias, 2016. 87f. ; il., tab. ; fig. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador : Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade” Bibliografia : p. 65-87 1. Doenças Inflamatórias Intestinas. 2. Colite Ulcerativa. 3. Colite. 4. Achyrocline stureioides. 5. Marcela. 6. Química Farmacêutica. 6. Produtos Naturais. I. Título. CDU: 615.32
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
ESTUDO DO POTENCIAL PROTETOR DE Achyrocline satureioides
NA COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR DEXTRANO SULFATO DE
SÓDIO (DSS) EM CAMUNDONGOS.
JAIME ANTÔNIO MACHADO FARIAS
Julho/2016
Orientador: Dr. Sérgio Faloni de Andrade Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 87.
Resumo
Marcela ou Macela (Achyrocline satureioides) é uma planta nativa da América do
Sul e distribuída na Europa e na África. É popularmente usada para tratar doenças
inflamatórias e gastrointestinais. Neste trabalho, foram estudados os efeitos do extrato
hidroalcoólico de Achyrocline satureioides (EHAS), na colite induzida por dextrano sulfato
de sódio (DSS) em camundongos. A colite foi desenvolvida nas cobaias pela administração de
DSS (3%) em água potável. Simultaneamente, os animais foram tratados oralmente com
veículo ou com o extrato (100 mg/kg). Ao final do período de tratamento, os sinais clínicos da
colite foram avaliados, assim como, os aspectos histopatológicos do tecido colônico. Os
níveis de glutationa reduzida e lipoperóxidos (LOOH), a atividade do superóxido dismutase
(SOD) e da mieloperoxidase (MPO) no cólon e no fígado, além dos níveis plasmáticos da
aspartato aminotransferase plasmática (AST) e alanina aminotransferase (ALT) também
foram avaliados, e acrescidos da determinação dos efeitos do extrato no trânsito intestinal de
camundongos. O EHAS apresentou melhora do tecido do cólon nos aspectos macro e
microscópicos. A atividade da SOD, bem como, o acúmulo dos níveis de LOOH e MPO no
cólon também foram normalizados pelo extrato. O grupo tratado com EHAS apresentou
aumento da atividade da SOD no fígado e níveis normalizados de AST no plasma. O extrato
não alterou o trânsito intestinal de camundongos. Juntos, estes resultados sugerem que a
Achyrocline satureioides é uma promissora fonte de fitocompostos que podem ser utilizados
no tratamento de doenças inflamatórias intestinais.
Palavras-chave: Achyrocline satureioides, marcela, fitocompostos, colite.
STUDY OF THE PROTECTIVE POTENTIAL OF Achyrocline
satureioides IN ULCERATIVE CHOLITIS INDUCED BY DEXTRAN
SULPHATE SODIUM (DSS) IN MICE.
JAIME ANTÔNIO MACHADO FARIAS
July, 2016
Supervisor: Dr. Sérgio Faloni de Andrade Area of concentration: National Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 87.
Abstract
Marcela or Macela (Achyrocline satureioides) is a South American plant that is
distributed in Europe and Africa and is used to treat inflammatory and gastrointestinal
diseases. This work studied the effects of a hydroalcoholic extract of A. satureoides on colitis
induced by dextran sulfate sodium (DSS) in mice. Colitis was induced in the mice by DSS
(3%) in drinking water. Simultaneously, the animals were treated orally with vehicle or the
extract (100 mg/kg). At the end of the treatment period, the clinical signs of colitis were
evaluated, as well as the histopathological parameters of the colonic tissue. Levels of reduced
glutathione and lipoperoxides (LOOH) and superoxide dismutase (SOD) and
myeloperoxidase (MPO) activity in the colon and liver were determined. Plasma aspartate
aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were also measured.
Additionally, the effects of the extract on intestinal transit in mice were determined. The A.
satureoides extract improved the colonic tissue at both macroscopic and histological levels.
SOD activity, as well as the accumulation of LOOH and MPO in the colon was also
normalized by the extract. The group treated with A. satureoides showed increased SOD
activity in the liver and a normalized AST levels in the plasma. The extract did not alter the
intestinal transit in mice. Together, these results show that Achyrocline satureioides is a
promising source of metabolites that could be used in the treatment of inflammatory bowel
disease.
Keywords: Achyrocline satureioides, inflammatory bowel disease, colitis
LISTA DE ABREVIATURAS 5-ASA ̶ Ácido 5-aminossalicílico
6-MP ̶ 6-mercaptopurina
6-TGN ̶ 6-tioguanina
ASA ̶ Aminossalicilato
AZA ̶ Tiopurinasazatriopina
CMI ̶ Imunidade mediada por células
COX-2 ̶ Ciclo-oxigenase 2
DC ̶ Doença de Crohn
DSS ̶ Dextrano sulfato de sódio
DTNB ̶ 5'5-ditiobis-2-ácido nitro benzoico
EHAS ̶ Extrato hidro alcoólico de Achyrocline satureioides
ERO ̶ espécies reativas de oxigênio
GSH ̶ Glutationa
H2O2 ̶ Peróxido de hidrogênio
IAD ̶ Índice de atividade da doença
IFN-y ̶ Interferon gama
IFX – Infliximab
iNOS ̶ Óxido nítrico sintetase induzida
IL-1β ̶ Interleucina 1β
IL-2 ̶ Interleucina 2
IL-4 ̶ Interleucina 4
IL-5 ̶ Interleucina 5
IL-6 ̶ Interleucina 6
IL-9 ̶ Interleucina 9
Il-10 ̶ Interleucina 10
IL-11 ̶ Interleucina 11
IL-12 ̶ Interleucina 12
IL-13 ̶ Interleucina 13
IL-23 ̶ Interleucina 23
LAP ̶ Peptídeo associado a latência
LOOH ̶ Hidroperoxidos lipídicos
LPS ̶ Lipopolissacrídeo
MAPK ̶ Proteína ativada por mitógeno quinase
MDP ̶ Muramil dipeptídeo
MHC II ̶ Molécula de hitocompatibilidade de classe II
MPO ̶ mieloperoxidase
MTX ̶ Metotrexato
NF-κB ̶ Fator nuclear κB
NO ̶ Óxido nítrico
NOD2 ̶ Oligomerização nucleotídica 2
O2 ̶ Oxigênio molecular
O2- ̶ Radical superóxido
PGE2 ̶ Prostaglandina E2
SOD ̶ Superóxido dismutase
TGF-B ̶ Fator de transformação do crescimento B
TNBS ̶ Ácido 2,4,6-trinitrobenzenico
TNF ̶ Fator de necrose tumoral
Th1 ̶ Célula T helper 1
Th2 ̶ Célula T helper 2
Treg ̶ Células T reguladoras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Inflorescências de Achyrocline satureioides em habitat natural. Fonte:
Retta, 2012 ................................................................................................................ 17
Figura 2: Estruturas moleculares dos compostos encontrados em Achyrocline
satureioides. (1): ácido clorogênico; (2): ácido cafeico; (3): quercetina ; (4): éter 3-
metil-quercetina; (5): luteolina; (6) α-pineno; (7): β-cariofileno; (8): aquirofurano.
Fonte: Retta, 2012. .................................................................................................... 19
Figura 3: Fisiopatologia da colite ulcerativa - adaptado de Ordás (2012) ................. 27
Figura 4: Representação esquemática da colite ulcerativa induzida por DSS -
adaptado de Chassaing et al (2015) ......................................................................... 37
Figura 5: Modelo de colite ulcerativa induzida por DSS .......................................... 43
Figura 6: Efeito do EHAS no IAD e na perda de peso de camundongos com colite
induzida por DSS. ..................................................................................................... 49
Figura 7: Efeito do EHAS na presença de sangue oculto nas fezes de camundongos
com colite induzida por DSS. .................................................................................... 52
Figura 8: Efeito do EHAS (100 mg/kg) nas alterações histológicas no cólon de
camundongos com colite induzida por DSS. ............................................................. 53
Figura 10: Níveis mucina pelo método de PAS no cólon de camundongos com colite
induzida por DSS. ..................................................................................................... 54
Figura 12: Quantificação do efeito do EHAS nos níveis séricos de AST (TGO) e ALT
(TGP) de camundongos com colite induzida por DSS. ............................................. 58
Figura 13: Efeito do EHAS sobre o trânsito intestinal dos camundongos. ............... 59
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Sinais e sintomas clínicos, endoscópicos e histológicos apresentados em
quadros de colite ulcerativa. ...................................................................................... 30
Tabela 2: Classificação da extensão e gravidade da colite ulcerativa. ..................... 31
Tabela 3: Parâmetros utilizados no IAD. .................................................................. 44
Tabela 4: Critérios para avaliação microscópica. ..................................................... 45
Tabela 5: Efeito do EHAS no comprimento e peso colônico e no peso do baço e
fígado de camundongos com colite induzida por DSS. ............................................. 51
Tabela 6: Efeito do EHAS na atividade da MPO e SOD e nos níveis de GSH e
LOOH no cólon de camundongos com colite induzida por DSS. .............................. 55
Tabela 7: Efeito do EHAS na atividade da SOD e nos níveis de GSH no fígado de
camundongos com colite induzida por DSS. ............................................................. 56
Tabela 8: Atividade da MPO no tecido colônico e hepático de camundongos com
colite induzida por DSS. ............................................................................................ 57
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 15
2.1 Objetivo Geral: ......................................................................................... 15
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 16
3.1 Plantas medicinais .................................................................................. 16
3.2 Achyrocline satureioides (Asteraceae) ................................................. 17
3.2.1 Potencial terapêutico da Achyrocline satureioides .......................... 20
3.3 Colite ulcerativa ....................................................................................... 21
3.3.1 Epidemiologia ....................................................................................... 22
3.3.2 Fatores genéticos ................................................................................. 23
3.3.3 Fatores Ambientais .............................................................................. 24
3.3.4 Fisiopatologia ....................................................................................... 25
3.3.6 Tratamento ............................................................................................ 31
3.3.7 Potencial terapêutico de produtos naturais para o tratamento da
colite ulcerativa .............................................................................................. 34
3.4 Modelos experimentais da colite ulcerativa ......................................... 36
3.4.1 Modelo de colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS) ..... 36
3.4.2 Modelo de colite induzida pelo ácido trinitrobenzeno sulfônico
(TNBS) ............................................................................................................. 38
3.4.3 Modelo de colite ulcerativa induzida por oxazolona ......................... 39
3.4.4 Modelo de colite ulcerativa induzida por transferência adotiva de
células ............................................................................................................. 40
3.4.5 Modelo de colite ulcerativa em camundongos knockout para
interleucina- 10 (IL-10) ................................................................................... 40
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 42
4.1 Material vegetal ........................................................................................ 42
4.1.1 Preparação do extrato hidroalcoólico das inflorescências ............. 42
4.2 Animais ..................................................................................................... 42
4.2.1 Grupos experimentais .......................................................................... 43
4.3 Modelo de Indução de Colite Ulcerativa ................................................ 43
4.4 Avaliação do índice de atividade da doença ........................................ 44
4.5 Avaliação Microscópica .......................................................................... 44
4.6 Avaliação do conteúdo de mucinas ...................................................... 45
4.7 Avaliação bioquímica .............................................................................. 46
4.7.1 Quantificação de grupos sulfidrílicos não proteicos (GSH) ............ 46
4.7.2 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) .......................... 46
4.7.3 Quantificação dos níveis enzimáticos de mieloperoxidase (MPO) . 47
4.7.4 Quantificação dos níveis de superóxido dismutase (SOD) ............. 47
4.8.Quantificação de proteínas..................................................................... 47
4.9 Sangue oculto nas fezes ......................................................................... 48
4.10 AVALIAÇÃO DO TRANSITO INTESTINAL ..................................................... 48
4.11 Análise estatística ................................................................................. 48
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 49
5.1 Efeito do EHAS sobre os sinais clínicos da colite ulcerativa induzida
por DSS ........................................................................................................... 49
5.2 Efeito do EHAS nas alterações histopatológicas induzidas pelo DSS
no cólon .......................................................................................................... 52
5.3 Efeito do EHAS nas alterações induzidas pelo DSS nos níveis de
mucina no cólon ............................................................................................ 53
5.4 Efeito do EHAS no estresse oxidativo no cólon e fígado de
camundongos com colite induzida por DSS .............................................. 54
5.5 Efeito do EHAS na atividade da MPO no cólon e fígado de
camundongos com colite induzida por DSS .............................................. 56
5.6 Efeito do EHAS nos níveis plasmáticos de AST (TGO) e ALT (TGP) de
camundongos com colite induzida por DSS. ............................................. 57
5.7 Efeito do EHAS no transito intestinal de camundongos. .................... 59
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 60
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 65
8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 66
12
1. INTRODUÇÃO
A colite ulcerativa é uma inflamação difusa e crônica que afeta as membranas
que compõem o intestino, sendo assim definida como uma doença intestinal
inflamatória juntamente com a doença de Crohn (DC). Apesar desta definição,
apenas a DC se classifica como doença inflamatória transmural, ou seja, lesiona
todas as camadas em praticamente toda a extensão do intestino, diferente da colite
ulcerativa, cuja lesão se restringe a algumas regiões do cólon e ocorre apenas na
camada mais superficial denominada mucosa. Os sintomas da colite ulcerativa
consistem em diarreia sanguinolenta, dor abdominal e eliminação de pus e/ou muco
durante as evacuações (VITOR, 2009; WEYLANDT, 2007).
A colite ulcerativa é uma doença global cuja incidência encontra-se em
diferentes frequências que dependem da idade, grupo étnico e localização
geográfica. As taxas de prevalência são de 90 a 505 a cada 100.000 pessoas no
norte da Europa e na América do Norte, respectivamente, sendo que os caucasianos
compreendem a maior parte de casos anuais da colite ulcerativa (PONDER, 2013).
Conrad et al (2014) cita que a incidência é um pouco menor em outras regiões da
Europa e cerca de dez vezes menor na população asiática, africana e oriental,
embora estes grupos estejam apresentando um aumento gradual de incidência e
prevalência da colite ulcerativa, bem como no Brasil, onde a região sudeste
apresentou incidência maior sugerindo fatores patogênicos adicionais relacionados a
efeitos ambientais e ao estilo de vida (DA SILVA et al, 2014).
A relação da doença entre indivíduos do sexo masculino e do sexo feminino
não possui uma diferença considerável, o que indica que a colite ulcerativa não é
especifica para determinado sexo. Qualquer faixa etária pode ser afetada, desde
crianças até idosos, porém, há um pico de idade para o surgimento da doença que
varia entre 15 e 30 anos, tendo um segundo pico menor que varia entre 50 e 70
anos (CONRAD, 2014; HANAUER, 2006).
Embora os fatores etiológicos da colite ulcerativa ainda sejam
desconhecidos, vários fatores imunológicos, genéticos e ambientais contribuem para
sua instalação. A inflamação causada pela doença está relacionada a disfunções na
resposta imune, especialmente das células T presentes na mucosa intestinal, além
13
do desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias, tais como o fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-1 beta (IL-1β), IL-6 e IL-12, e citocinas anti-inflamatórias,
tais como IL -4, IL-10, IL-11 e de expressão de proteínas inflamatórias que incluem
ciclo-oxigenase 2 (COX-2) e óxido nítrico sintetase induzida (iNOS), os quais
desempenham um papel importante na inflamação patológica (SAKTHIVEL E
GURUVAYOORAPPAN , 2014).
O principal objetivo do tratamento da colite ulcerativa consiste em uma
indução rápida do grau remissivo, livre de esteroides, e na prevenção das
complicações que a própria doença e o tratamento podem acarretar. Levando em
consideração que a colite ulcerativa é uma doença curável, a abordagem terapêutica
mais favorável é a terapia piramidal, na qual é utilizado como base o ácido 5-
aminossalicílico (5-ASA) e posteriormente, se necessário, esteroides e imuno-
moduladores, que intensificam a eficácia do tratamento, tais como o infliximab (IFX),
inibidores da calcineurina (ciclosporina A, tacrolimus) ou procedimentos cirúrgicos,
dependendo o grau da doença (KORNBLUTH E SACHAR, 2010). Visto os
problemas existentes com o atual tratamento, podendo-se citar o baixo índice de
remissão quando utilizado aminossalicilatos, efeitos lesivos apresentados pelo uso
ou dependência de esteróides, é evidente a necessidade de pesquisa por novos
tratamentos que atuem no alvo terapêutico, sendo mais efetivos e apresentando
menos efeitos colaterais (AWAADI et al, 2013).
Desde os primórdios, o homem vem utilizando plantas medicinais em busca
de cura ou de uma melhora em diversas doenças, baseado na medicina popular de
vários grupos étnicos e em dados etnofarmacológicos. Além de seu uso na medicina
popular para tais finalidades terapêuticas, as plantas medicinais vêm contribuindo
para a obtenção de diversas compostos que são utilizadas na produção de novos
fármacos (CESTARI, 2008; FOGLIO et al, 2006).
O gênero Achyrocline é composto por cerca de 40 espécies, onde a grande
maioria se encontra nas Américas tropical e subtropical (25 espécies foram descritas
no Brasil). A espécie Achyrocline satureioides, pertencente à família Asteraceae,
popularmente conhecida como marcela ou macela é utilizada como anti-inflamatória,
antiespasmódica, hipoglicemiante e em outras diversas doenças, incluindo distúrbios
gastrointestinais (RETTA, 2012). Em relação ao seu perfil fitoquímico, foram
identificados diversos constituintes, tais como, polifenóis e flavonoides (DELLACASA
et al, 1993), aquirofurano (CARNEY et al, 2002), chalconas (HOLZSCHUH et al,
14
2010), cumarinas (REINECKE et al, 1995), poliacetilenos (DEMBISTSKY et al, 2003)
e polissacarídeos (PUHLMANN et al, 1992).
Com base nesta necessidade de pesquisa de métodos alternativos e menos
lesivos para o tratamento da colite ulcerativa, assim como a falta de elucidação do
potencial da A. satureioides como fonte terapêutica para a doença, o presente
trabalho teve como objetivo avaliar o potencial anti-inflamatório intestinal do extrato
de A. satureioides no modelo de colite ulcerativa induzida com dextrano sulfato de
sódio (DSS) em camundongos.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar, pré-clinicamente, o efeito anti-inflamatório intestinal do extrato de A.
satureioides, utilizando o modelo de colite ulcerativa induzida por DSS em
camundongos.
2.2 Objetivos Específicos:
a) Avaliar o atividade anti-inflamatória do extrato hidoalcoólico.
b) Avaliar a atividade do extrato sobre o índice de atividade da doença.
c) Avaliar o potencial antioxidante do extrato in vitro.
d) Avaliar os efeitos do extrato a nível histológico.
e) Avaliar o efeito do extrato sobre o conteúdo de mucinas.
f) Avaliar o efeito do extrato sobre o trânsito intestinal.
16
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Plantas medicinais
As plantas medicinais e seus compostos ativos são utilizados na
prevenção ou no tratamento de diversas doenças crônicas. Este conhecimento
está fundamentado na medicina tradicional de diferentes grupos étnicos. Nas
últimas décadas, o interesse por estudos etnofarmacológicos com o objetivo de
identificar produtos naturais com propriedades terapêuticas é crescente (SILVA
et al, 1997). De fato, inúmeros compostos obtidas de plantas e microorganismos
proporcionam importantíssimas fontes para a pesquisa e o desenvolvimento de
novos medicamentos.
De acordo com Aziz et al, (2014) e a Organização Mundial de Saúde (OMS),
cerca de 80% da população mundial faz uso de plantas medicinais como única
forma de acesso para suas necessidades básicas de saúde. Em paralelo à
descoberta de novos fármacos ou mesmo de novos alvos terapêuticos, a pesquisa
fundamentada no conhecimento da medicina popular também contribui para a
validação de eficácia e segurança no uso das plantas medicinais.
As plantas são importantes matérias-primas para a obtenção de novos
medicamentos, seja como um fitoterápico padronizado ou como fonte de novos
fármacos. Muitas classes de medicamentos incluem um protótipo de produto natural,
como por exemplo, a aspirina e a atropina (GILANI et al, 1992). Segundo Barnes
(2005), as plantas possuem diversos compostos bioativos, sendo a maioria oriunda
do metabolismo secundário, incluindo fitoesteróis, fitoestrógenos, polifenóis e ácidos
graxos poliinsaturados. Esses compostos ativos podem interferir direta ou
indiretamente com vários mediadores inflamatórios, na produção e ação de
segundos mensageiros, na expressão de fatores de transcrição e protooncongenes
e na expressão de mediadores proinflamatórios (CALIXTO et al, 2003; MECHANICK,
2005).
17
3.2 Achyrocline satureioides (Asteraceae)
A família Asteraceae foi descrita por Teofrasto em 300 a.C. e inicialmente
denominada de Compositae por Giseke em 1792. No entanto, o código internacional
de nomenclatura botânica empregou o nome Asteraceae em 1822 (SANTIN et al,
2010). Compreende aproximadamente 1535 gêneros e cerca de 23000 espécies,
dividida em três subfamílias e é considerada a maior família das dicotiledôneas.
Essa família encontra-se distribuída nas regiões de clima tropical, subtropical e
temperado, frequentemente em habitat de campo aberto e matas nebulares. As
plantas que compõe a família podem ser de pequeno ou de grande porte, podendo,
inclusive, atingir 30 metros (BARATA et al, 2013).
A A. satureioides (Figura 1), popularmente conhecida como “macela” ou
“marcela’ é um subarbusto aromático e perene que pode crescer até 80 cm de
altura. A palavra Achyrocline vem das palavras gregas achyros que significa mato e
kline que significa cama, provavelmente devido a seu receptáculo fimbriado. É nativa
do sudeste da América do sul e cresce em solos pedregosos ou arenosos em
terreno montanhoso ou planície. É comum no Brasil (a partir de Minas Gerais até o
Rio Grande do Sul), Uruguai e nas regiões centrais e nordeste da Argentina
(LORENZO et al, 2000; DE SOUZA et al, 2007). Também é encontrada na
Venezuela, Colômbia, Paraguai, Peru e nas regiões centrais e ao sul da Bolívia,
onde pode crescer em altitudes de 3.900 m acima do nível do mar (GIRAULT, 1984;
VELASCO-NEGUERUELA et al, 1995).
Figura 1: Inflorescências de Achyrocline satureioides em habitat natural. Fonte: Retta, 2012
18
Suas folhas são simples, alternas e sésseis, podendo ser lineares ou linear-
lanceoladas, apresentando borda lisa e chegando a medir 5 cm de comprimento e
até 4mm de largura, possuindo uma nervura pinada e felpuda. Suas flores são
pequenas e numerosas com capítulos cilíndricos, formando densos glomérulos
terminais com coloração amarelada, amarelo-cinzenta ou dourada. Flores marginais
femininas são menos frequentes, com corola filiforme e denteada e divisão no ápice.
As flores centrais, em menor número, possuem uma corola tubular estreita, com
borda denteada. Os frutos são aquênios e ligam-se à planta por um papilho
(DAVIES, 2004).
As inflorescências e partes aéreas de A. satureioides são tradicionalmente
utilizadas graças ao seu efeito digestivo, anti-inflamatório, antiespasmódico,
antidiabético e antiasmático (RATERA e RATERA, 1980; HEINZEN e DAJAS, 2002),
estimulante, emenagogo, (ALONSO PAZ et al, 2008) e antipiréticas (DIMITRI, 2004).
Também possui propriedades anti-helmínticas e é utilizada no tratamento de
distúrbios digestivos e intestinais, cólicas, diarreia, irregularidades menstruais e o
estudo realizado por Joray et al, (2015) demonstrou seu potencial antibacteriano
(LORENZI E MATOS, 2002; RETTA et al, 2012). Também foi relatado seu potencial
sedativo, ansiolítico além de seus efeitos no tratamento de asma brônquica
(WANNMACHER et al, 1990).
Na Venezuela a infusão de A. satureioides é utilizada como antidiabético,
antiartrítico e antipirético (HIDALGO BAEZ et al, 1999). Na Bolívia é utilizada como
expectorante, sudorífico, antipirético e o resíduo das flores cozidas são usadas para
aliviar a tosse, principalmente em crianças (IBISCH, 2001), e na Colômbia o material
vegetal tem sido utilizado no tratamento de tumores (VAN WYK E WINK, 2015).
Vários compostos pertencentes a diversos grupos fitoquímicos foram
isolados a partir das partes aéreas e inflorescências de A. satureioides. Além dos
principais compostos indicados na figura 2, foram indentificados outros grupos
fitoquímicos como polifenóis e flavonoides, incluindo ácido clorogênico, ácido
cafeico, dois ésteres de calerianina com ácido cafeico e ácido protocatecuico,
respectivamente, galangina, éter 3-metil-galangina, quercetina, éter 3-metil-
quercetina (DELLACASSA et al, 1993; UPADHYAY E MOHAN RAO, 2013),
gnafalina, isognafalina, 3-metil-7-éter díglicosídeo, tamarixetina, tamarixetina-7-
glicosídeo, ácido 3-cafeiolquinico, ácido 4-cafeolquinico, ácido 3,5-dicafeoilquínico,
ácido 4,5-dicafeoilquínico (UPADHYAY E MOHAN RAO, 2013), luteolina, escorparol
19
(SEVERIN, et al, 2008), 5,8-dihidroxi-3,7-dimetoxiflavona, 3-metoxiquercetina,
3,5,7,8-tetrametoxi-flavona, 5,7,8-metoxiquercetina, 3,5,7,8-tetrametoxi-flavona,
5,7,8-trimetoxiflavona, 7-hidroxi-3-5-8-trimetoxiflavona e uma nova chalcona:
achyrobichalcona (CARINI et al, 2014).
Figura 2: Estruturas moleculares dos compostos encontrados em Achyrocline satureioides. (1): ácido
clorogênico; (2): ácido cafeico; (3): quercetina ; (4): éter 3-metil-quercetina; (5): luteolina; (6) α-pineno;
(7): β-cariofileno; (8): aquirofurano. Fonte: Retta, 2012.
Outros compostos verificados incluem cumarinas (REINECKE et al, 1995),
polissacarídeos (PUHLMANN et al, 1992), aquirofurano (CARNEY et al, 2002),
lactonas (SCHMEDA HIRSCHMANN) e poliacetilenos (DEMBITSKY, 2003), além de
cinco possíveis glicolipideos (MENDES et al, 2006). O α-pineno e o β-cariofileno são
os compostos mais abundantes, com base na composição de outros compostos,
podendo haver variação da concentração destes compostos dependendo a região e
20
método de extração (LABUCKAS et al, 1999; LAMATY et al, 1991; LORENZO et al,
2000).
3.2.1 Potencial terapêutico da Achyrocline satureioides A grande concentração de flavonoides presentes na composição da A.
satureioides e seu efeito antioxidante, foi descrito por Zorzi et al (2015),
principalmente devido a capacidade de neutralizar os radicais superóxido, hidróxido
e peróxido, além de inibir a ação de enzimas chave na atividade da mitocôndria e de
impedir a oxidação de proteínas de baixa densidade. Um dos principais flavonoides
presentes é a quercetina que impede a lipo-peroxidação neutralizando as espécies
reativas de oxigênio (EROs) e agindo como um quelante em íons metálicos
responsáveis pela formação de radicais livres (BIDONE et al, 2015). Desmarchelier
et al (1998) demonstraram que extratos aquosos e metanólicos de A. satureioides
apresentaram uma significante ação neutralizadora de radicais livre e atividade
antioxidante in vivo quando submetidos a diferentes bioensaios para determinar o
seu efeito de neutrlizador de (EROs) e sua capacidade de reduzir a peroxidação
lipídica e o dano ao DNA dependente de ferro (II) (VOGT et al, 2015).
A ação hepatoprotetora apresentada pelo extrato aquoso da A. satureioides
provavelmente está associada à atividade antioxidante, atuando na neutralização de
radicais livres mesmo quando os níveis de glutationa reduzida estão baixos. A
melhora das funções do fígado e lesões hepáticas previamente descritas por
Kadarian et al (2002), após o tratamento com A. satureioides deve-se à presença de
flavonoides, que protegem tal órgão contra alterações de sua membrana plasmática,
confirmando seu uso popular como um agente digestivo e hepatoprotetor (QADRIE
et al, 2015).
Um estudo realizado por Baldissera et al (2014), investigou os efeitos do
óleo essencial da A. satureioides como tratamento para tripanossomíase. A infecção
pelo Typanosoma evansi leva a formação de infiltrados inflamatórios e necrose dos
hepatócitos, efeitos que não foram observados em animais tratados com o óleo
essencial da A. satureioides. O fígado e os rins dos animais infectados
apresentaram um aumento dos níveis de peroxidação lipídica ocasionado pela
afinidade do T. evansi aos tecidos levando a inflamação. Apesar de não eliminar os
parasitas da circulação sanguínea, o tratamento com o óleo essencial da A.
21
satureioides reduziu a parasitemia e não foi demonstrado aumento nos níveis de
peroxidação lipídica no fígado ou nos rins dos animais que receberam o tratamento,
além de apresentarem menos dano em uma avaliação histológica, indicando o
envolvimento da ação antioxidante dos constituintes da A. satureioides.
O potencial gastroprotetor do extrato de Achyrocline satureioides foi
comprovado após experimentos realizados utilizando os modelos de úlcera induzida
por etanol e indometacina. Ambos os modelos provocam alterações na circulação do
estômago e solubilizam os componentes da camada de muco, induzindo o estresse
oxidativo e lesionando o tecido. Entretanto, o tratamento com o extrato de A.
satureioides reduziu significativamente o grau das lesões, indicando que o efeito
gastroprotetor do extrato está relacionado a atividade citoprotetora, além de atuar no
mecanismo que leva a produção de muco (SANTIN, et al, 2010).
O estudo realizado por Joray et al (2013), demonstrou o potencial
antimicrobiano de metabólitos isolados através do fracionamento biomonitorado do
extrato etanólico de A. satureioides. O efeito combinado da 23-metil-6-O-desmetil
auricepirona, quercetina e 3-O-metilquercetina foi avaliado contra Staphylococcus
aureus e Escherichia coli, onde foi demonstrado um efeito maior da quercetina e da
3-O-metilquercetina quando associadas contra S. aureus. Porém a combinação dos
três compostos testados demonstrou uma interação mais ativa contra E. coli. Os
resultados obtidos indicam interações sinérgicas entre os componentes do extrato
da A. satureioides para o controle de bactérias patogênicas (CESPEDES et al,
2015).
3.3 Colite ulcerativa
A colite ulcerativa, juntamente com a DC, faz parte de um grupo de doenças
conhecidas com doenças intestinais inflamatórias que se caracterizam por uma
inflamação crônica intestinal. Conforme Ordás et al (2012) apesar de compartilharem
algumas características, as doenças intestinais inflamatórias são distinguidas pelas
diferenças na predisposição genética, fatores de risco, além de aspectos clínicos,
endoscópicos e histológicos. Também é marcada por períodos de aumento seguido
de um período prolongado de diminuição nos sintomas, marcados por ulceração,
infiltração de neutrófilos na mucosa, desconforto ou dor abdominal com hábitos
intestinais alterados (GITNICK, 1996; SINGH et al, 2003).
22
Segundo Collins e Croitoru (2005), a inflamação presente na colite ulcerativa
é caracterizada por encontrar-se restrita à camada mucosa do cólon, onde são
encontrados infiltrados de linfócitos e granulócitos, apresentando também, abcessos
com infiltração de neutrófilos nas criptas, iniciando no reto se estendendo de
maneira contínua por todo o órgão. A DC diferencia-se da colite ulcerativa, pela
agregação de macrófagos, que frequentemente formam granulomas e a inflamação
pode localizar-se em qualquer parte do trato gastrointestinal, no entanto, a lesão do
íleo terminal é a lesão mais frequente (XAVIER e PODOLSKY, 2007).
A colite ulcerativa pode ser classificada em três padrões distributivos –
proctite, colite distal e pancolite – que caracterizam os quatro graus de atividade da
doença, classificados como: remissiva, leve, moderada e severa. Esta classificação
tem como objetivo a melhor abordagem terapêutica a ser adotada dependendo do
grau, a atividade da doença e a adaptação do paciente com o tratamento escolhido
(MEIER e STURM, 2011).
Apesar de sua etiologia ainda não ser totalmente elucidada, trata-se de uma
doença multifatorial, onde a alteração da função epitelial e microbiota intestinal,
assim como fatores genéticos, ambientais e uma desregulação do sistema imune
refletem o seu desenvolvimento (MAYER, 2010; SU et al, 2009).
3.3.1 Epidemiologia
A colite ulcerativa apresenta uma prevalência maior que a DC. O norte da
Europa e a América do norte apresentam as maiores taxas de incidência e
prevalência de colite ulcerativa, com uma incidência que varia de 9 a 20 casos a
cada 100.000 pessoas ao ano e as taxas de prevalência apresentam 90 a 505 a
cada 100.000 casos. Estas taxas apresentam-se menores no hemisfério sul e países
orientais. A incidência aumentou em países que adotaram um estilo de vida
industrializado, o que sugere que os fatores ambientais sejam cruciais para o início
da doença (ORDÁS et al, 2012; PONDER e LONG, 2013).
A relação da doença entre indivíduos do sexo masculino e feminino não
possui uma diferença considerável, o que indica que a colite ulcerativa não é
especifica para determinado sexo. Qualquer faixa etária pode ser afetada, desde
crianças até idosos, porém, há um pico de idade para o surgimento da doença que
varia entre 15 e 30 anos; e um segundo pico menor que varia entre 50 e 70 anos.
23
20% a 30% dos pacientes acometidos pela colite ulcerativa e pela DC apresentam
os sintomas com idade inferior a 18 anos, embora seu diagnóstico seja, muitas
vezes, tardio (CONRAD et al, 2014; HANAUER, 2006).
3.3.2 Fatores genéticos
A colite ulcerativa possui uma heritabilidade baixa se comparada a DC (10-
15% para a ocorrência em familiares para colite ulcerativa e 20-35% para DC).
Avanços em testes genéticos permitiram a conclusão de diversos estudos de
associação do genoma. Um meta-análise envolvendo 75.000 indivíduos identificou
163 loci associados as doenças intestinais inflamatórias, os quais 110 são
associados à ambas as doenças, sendo 30 específicos para a DC e 23 para colite
ulcerativa (JOSTINS et al, 2012).
Para a colite ulcerativa, estes dados apontam que estes genes estão
principalmente relacionados com a integridade epitelial (HNF4A, CDH1, LAMB1,
ECM1), imunidade inata (PLA2G2E, CARD9), função da regulação imunológica
(região HLA, IL-10, BTNL2, IFNγ-IL25, NKX2-3) e homeostase celular em resposta
ao stress do retículo endoplasmático (ORMDL3). Associações na principal região do
complexo de histocompatibilidade classe II (MHC II) próximo a HLA-DRA (cadeia α)
são os que apresentaram maior significância. A susceptibilidade de sobreposição
com genes relacionados a DC é notavelmente nos genes da via de sinalização da
IL-23 (IL23R, I12B, JAK2 E STAT3), que estão envolvidos na via de sinalização da
IL-23/Th17, cujo papel na patogênese das doenças intestinais inflamatórias já está
consolidado. (HO et al, 2015).
Um mapeamento detalhado do cromossomo 16 identificou polimorfismos no
gene NOD2 (também denominado CARD15 ou IBD1) que é principalmente expresso
por macrófagos (INOHARA E NUNEZ, 2003). Este gene codifica uma proteína
citoplasmática, contendo uma ligação a um domínio de oligomerização de
nucleotídeos. Seu papel essencial é iniciar a resposta imune inata através da
exposição intracelular ao muramil dipeptídeo (MDP), um produto da degradação dos
peptidoglicanos presentes na parede celular de bactérias gram positivas e gram
negativas, levando a ativação das vias de sinalização do NF-kB e MAPK (PHILPOTT
et al, 2014).
24
Análises genéticas demonstraram que polimorfismos nos genes ATG16L1 e
IRGM, cujas funções estão envolvidas nas vias de autofagia, estão intimamente
ligadas às doenças intestinais inflamatórias (HAMPE, 2007; RIOUX et al, 2007).
Autofagia é um processo celular que envolve a degradação lisossomal das bactérias
ingeridas e também da auto digestão das organelas. A ativação da sinalização do
NOD2 é capaz de iniciar o processo de autofagia. Para o pleno funcionamento da
digestão intracelular e a remoção das bactérias, tanto as funções do NOD2 como as
do ATG16L1 são necessárias (CORRIDONI et al, 2014).
3.3.3 Fatores Ambientais
A inflamação ocasionada pela colite ulcerativa também pode ser decorrente
de diversos fatores ambientais que enfraquecem as respostas imunes presentes na
mucosa, tais como: tabagismo, drogas para emagrecimento, stress social e fatores
microbianos. Ainda não há total concordância quanto as implicações da dieta como
causa das doenças intestinais inflamatórias, apesar de dados terem sugerido que o
estilo “ocidental” de alimentação estar relacionado ao aumento da incidência de
ambas as doenças, assim como o consumo de carne vermelha e processada, álcool,
e poucas fibras também possa estar associado com o aumento de risco (ROGLER E
VAVRICKA, 2015).
Uma comparação feita nas áreas rurais e urbanas de países desenvolvidos e
em desenvolvimento demostrou uma incidência maior de colite ulcerativa em países
desenvolvidos. Isso se dá por conta da facilidade no acesso a assistência médica e
aos registros médicos, além da sanitização disponível nestes países onde há a
industrialização. Isso reduz a exposição a infecções entéricas durante a infância e,
com isso, suprime a maturação do sistema imune da mucosa, resultando em uma
resposta imune inapropriada quando houver uma exposição a estes micro-
organismos na idade adulta (BERNSTEIN et al, 2006; LÓPEZ-SERRANO et al,
2010).
Diversos fatores atuam como protetores para a colite ulcerativa e o mais
consistente dentre eles é o tabagismo. A colite ulcerativa vem sendo associada a
não fumantes e ex-fumantes, assim como o menor risco de desenvolver a doença
em fumantes longevos comparado aos não-fumantes. Apesar disso, ex-fumantes
têm aproximadamente 1,7 vezes mais chances de desenvolver a colite ulcerativa do
25
que aquele que nunca fumaram (BRANDT et al, 2015). Uma meta-análise realizada
por Mahid et al (2006) comprovou que o ato de fumar é protetor, em comparação
àqueles que não fumam. Pacientes fumantes com colite ulcerativa tendem a
apresentar os sinais da doença de uma maneira mais leve do que nos pacientes não
fumantes. A atividade da doença aumentou naqueles que pararam de fumar (DE
BIE, et al 2015; KARCZEWSKI et al, 2015).
Infecções intestinais prévias por Salmonella spp, Shigella spp e
Campylobacter spp dobram o risco do desenvolvimento subsequente da colite
ulcerativa, sugerindo que a infecção aguda possa levar a alterações na microbiota
intestinal, levando à ativação de um processo inflamatório crônico em indivíduos
geneticamente predispostos (GARCÍA RODRIGUEZ et al, 2006; PORTER et al,
2006).
3.3.4 Fisiopatologia
Uma combinação complexa de antígenos originados da dieta, da microbiota
normal e de seus produtos, circunda a mucosa intestinal, podendo, então,
representar potenciais patógenos. Portanto, é essencial que o sistema imune da
mucosa seja capaz de discriminar estímulos prejudiciais dos inofensivos, prevenindo
assim a entrada maciça de patógenos e não produzindo a resposta imune frente aos
agentes inofensivos (DI STASI et al, 2015).
A maior e mais importante barreira do organismo com o meio externo é o
epitélio intestinal, cuja função é oferecer ao organismo uma barreira eficaz contra
toxinas, antígenos e bactérias, assim como macromoléculas nocivas e outros micro-
organismos. Por outro lado, precisa ser permeável aos nutrientes, eletrólitos e a
água. Chiclowski (2008) descreve que a funcionalidade desta barreira seletiva é
mantida pela formação de complexos denominados desmossomos - que ligam as
células umas às outras - junções de aderência e zônulas oclusivas. É essencial
haver a integridade do epitélio intestinal para o perfeito funcionamento do trato
gastrointestinal (GROSCHWITZ E HOGAN, 2009).
A barreira epitelial é recoberta por uma camada mucosa, que confere defesa
física entre as células imunes e a microbiota intestinal, além de sintetizar peptídeos
antimicrobianos. Na colite ulcerativa, a síntese e a alteração na sulfatação de alguns
tipos de mucinas intestinais são diminuídas (GERSEMANN et al, 2012). O aumento
26
da permeabilidade do epitélio intestinal é consequência dos danos sofridos pela
mucosa, o que acaba levando a diminuição na função desta barreira. Esta disfunção
na barreira epitelial, junto com a inflamação, são fatores que contribuem com a
patogênese das doenças intestinais inflamatórias, permitindo uma maior exposição
aos antígenos, consequentemente, ativando o sistema imune e liberando as
citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-12, IL-23, IL-6 e IL-1β), que induzem a disfunção
na barreira epitelial, por exemplo, o TNF, que age desregulando as zônulas
oclusivas. O aumento da permeabilidade do epitélio intestinal pode ser o fator
etiológico mais importante no desenvolvimento, progressão e recidiva destas
doenças (HYUN E MAYER, 2006; LIU, et al, 2014; VAN SCHAIK et al, 2013;
TURNER, 2006).
Como demonstra a figura 3, após o rompimento das zônulas oclusivas e da
camada mucosa, a permeabilidade do epitélio intestinal aumenta e resulta no
aumento de antígenos luminais. Macrófagos e células dendríticas reconhecem
bactérias comensais (não patogênicas) através dos receptores tipo toll, que são
responsáveis pelo reconhecimento de várias vias de padrões de reconhecimento de
antígenos, alterando seu estado funcional tolerogênico para um fenótipo ativado,
que, por sua vez, ativa vias de NF-kB, estimulando a transcrição de genes pró-
inflamatórios, resultando no aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias
(ORDÁS et al, 2012).
Após o processamento de antígenos, os macrófagos e as células dendríticas
apresentá-los a células T CD4 + ativando-as, sendo agora denominadas de células
T-helper (Th) que desempenham um papel importante na mediação e regulação dos
mecanismos da resposta imune. As células Th1 ativadas produzem IL-2, interferon
gama (IFN-γ) e linfotoxina-α e atuam primariamente na imunidade mediada por
células (CMI), que está relacionado com a neutralização de alguns agentes
patogênicos. Já as células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 e atuam
controlando ou diminuindo a ação dos mediadores inflamatórios. Há também as
células natural killer, que são a principal fonte de IL-13 e estão associadas ao
rompimento da barreira epitelial (STROBER et al, 2010).
Este mecanismo imunitário não só envolve a ativação de células T e
consequentemente a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como também envolve
a ativação de macrófagos intersticiais e outros leucócitos fagocíticos, que também
liberam citocinas pró-inflamatórias, tais como (TNF), IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12 e,
27
consequentemente, radicais livres como (ROS) e óxido nítrico (NO). O resultado da
ativação das células Th1 e do CMI é o recrutamento de leucócitos fagocíticos para o
interstício intestinal onde absorvem e neutralizam micro-organismos invasores. Este
é o principal mecanismo de defesa do intestino contra agentes patogênicos e a
incapacidade de regular esta resposta protetora pode ser a chave envolvida na
patogênese da colite ulcerativa (FIOCCHI, 1998; HUANG et al, 2013).
Figura 3: Fisiopatologia da colite ulcerativa - adaptado de Ordás (2012)
O rompimento das zônulas oclusivas da camada mucosa ocasiona o aumento da permeabilidade do
epitélio intestinal, aumentando a absorção de antígenos presentes na luz intestinal. Macrófagos e
células dendríticas fazem o reconhecimento de bactérias comensais através de receptores dotipo
Toll, alterando seu estado funcional. A ativação das vias do NF-kB estimula a transcrição de genes
pró-inflamatórios, resultando no aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias. Após o
processamento dos antígenos, os macrófagos e as células dendtríticas os apresentam às células T
CD4 que se diferenciam em células efetoras Th2, caracterizada pela produção de IL-14. As células
NK são a principal fonte de IL-13, que é associada aorompimento da barreira epitelial. Células T
circulantes, ligam-se a integrina-α4β7 através da molécula de adesão intercelular-1 presente nas
células endoteliais da microvasculatura do cólon, cuja expressão é aumentada no tecido colônico
inflamado, ocasionando a entrada de células T específicas do intestino para a lâmina própria. Com
isso, ocorre a regulação positiva de quimiocinas inflamatórias como CXCL1, CXCL3 e CXCL8,
levando ao recrutamento de leucócitos circulantes e assim perpetuando o ciclo da inflamação.
28
Sabe-se que ainda há outro grupo de células-T CD4+ imunorreguladoras
denominadas células-T reguladoras (Treg), que são capazes de inibir diversos
estímulos de doenças auto-imunes, incluindo a colite ulcerativa. As Treg necessitam
de IL-10 e TGF-β para o funcionamento de sua atividade reguladora e ambas as
citocinas desempenham um papel importante na regulação da inflamação e lesão
nas doenças intestinais inflamatórias. Porém estas citocinas suprimem a síntese de
citocinas derivadas de macrófagos e células Th1, diminuindo a ação das células de
defesa, levando a inflamação crônica (ELSON et al, 1995; PAVLICK et al, 2002).
Células T circulantes ligam-se a integrina-α4β7 das células endoteliais dos
vasos intestinais através da molécula de adesão celular adressina da mucosa do
tipo 1 (MAdCAM-1), cuja expressão se encontra aumentada no intestino inflamado,
facilitando a entrada das células T na mucosa através da lâmina própria. A
regulação aumentada de quimiocinas inflamatórias como CXCL1, CXCL3 e CXCL8
levam ao recrutamento de leucócitos circulantes e assim perpetuando o ciclo da
inflamação (ORDÁS et al, 2012).
O mecanismo de perpetuação do ciclo da inflamação desregula a resposta
imune e, apesar de seu mecanismo não ser completamente elucidado, sabe-se que
a inflamação crônica é associada com o aumento da produção de metabólitos
reativos de oxigênio e nitrogênio, que em conjunto às citocinas pró-inflamatórias
implicam tanto na etiologia como na progressão da colite ulcerativa em longo prazo
(SERIL et al, 2003). A infiltração de leucócitos eleva os níveis da enzima MPO
conforme foi observado por Kruidenier et al (2003), na mucosa de pacientes com
colite ulcerativa. Também foi observada uma atenuação significativa dos efeitos da
doença em camundongos que não possuíam o gene NOS2 (KRINGLSTEIN et al,
2001). Na colite ulcerativa, a iNOS é considerada a responsável pelo aumento na
produção de NO no epitélio e no foco da inflamação associada à nitrotirosina. O NO
derivado da iNOS estimula a produção do TNF nas regiões medial e distal do cólon,
promovendo a infiltração de neutrófilos através do estímulo da síntese de moléculas
de adesão intracelular ICAM e P-selectina, lesando o tecido (PIECHOTA-
POLANCZYK E FICHNA, 2014; YASUKAWA et al, 2012). O recrutamento de
leucócitos e a ativação de vias de sinalização como o NF-κB aumentam a resposta
inflamatória no tecido lesionado; sendo que o inibidor do NF-kB, quando positivo,
serve como controle. O NF-κB quando ativado, transloca-se para o núcleo, liga-se
29
ao DNA e subsequentemente ativa a expressão de genes envolvidos na inflamação
da mucosa responsáveis pela produção de citocinas, tais como IL-6, IL-8, IL-1β,
IL10, TNF e ICAM (YASUKAWA et al, 2012).
Uma característica histológica da colite ulcerativa é a severa infiltração
leucocitária na mucosa intestinal. Linfócitos, plasmócitos, granulócitos e macrófagos
produzem concentrações altas de EROs (GRISHAM, 1991). Por outro lado, os
mecanismos de defesa antioxidantes encontram-se debilitados nas doenças
intestinais inflamatórias. Lih-Brody et al (1996) relatou uma redução nos níveis
superóxido dismutase (SOD) em pacientes com doenças intestinais inflamatórias.
Buffington e Doe (1995) também observaram a diminuição da glutationa total na
mucosa inflamada de pacientes com colite ulcerativa e, consequentemente os níveis
de glutationa oxidada apresentaram-se aumentados (HOLMES et al, 1998). Com
isso, é possível concluir que as EROs causam um considerável estresse oxidativo na
inflamação crônica da mucosa intestinal (ROESSNER et al, 2008).
Junto a este desequilíbrio, o epitélio intestinal contribui com células
hospedeiras produzindo peptídeos antimicrobianos denominados defensinas que
atuam controlando a invasão bacteriana. Porém, não se sabe se a produção das
defensinas é induzida pelos micro-organismos ou citocinas inflamatórias (RAHMAN
et al, 2011).
O diagnóstico da colite ulcerativa é baseado em alguns sinais e sintomas
clínicos, endoscópicos e histológicos como previamente descritos por Ordás et al
(2012).
30
Tabela 1: Sinais e sintomas clínicos, endoscópicos e histológicos apresentados em quadros de colite ulcerativa.
Sinais clínicos Sangramento retal
Diarreia
Urgência ao evacuar
Tenesmo
Dor Abdominal
Febre
Manisfestações extraintestinais
Aspectos endoscópicos Perda do padrão vascular
Eritema
Granularidade
Erosões
Ulcerações
Sangramentos espontâneos
Aspectos patológicos Distorções na arquitetura das criptas
Abcessos nas criptas
Infiltrado celular na lamina própria
Encurtamento das criptas
Depleção de mucina
Erosões
Ulcerações
Diarreias infecciosas e não infecciosas devem ser contidas antes do
diagnóstico ser realizado. O processo inflamatório inicia-se no reto e estende-se
proximalmente em um padrão ininterrupto envolvendo partes ou o todo o intestino.
Dependendo da região acometida pela doença e sua extensão, a colite ulcerativa
pode ser classificada como proctite, colite do lado esquerdo ou pancolite. A extensão
deve ser avaliada no diagnóstico, pois a avaliação da extensão da inflamação na
mucosa é essencial para a seleção de tratamentos apropriados administrados pela
31
via tópica, tendo implicações no prognóstico de curto e longo prazo (D’HAENS et al,
1997; ORDÁS et al, 2012).
A classificação da gravidade da doença é baseada no número de evacuações
diárias e à presença (ou ausência) de sinais sistêmicos de inflamação, tais como
febre e taquicardia, como mostra o quadro. Pacientes com pancolite podem, por
vezes, mostram inflamação difusa em poucos centímetros da porção terminal do íleo
(ORDÁS et al, 2012)
3.3.6 Tratamento
Os objetivos do tratamento farmacológico ou biológico das doenças
inflamatórias intestinais consistem na diminuição do processo inflamatório durante
os processos de reincidência e aumentando o período em que o paciente apresenta
a remissão dos sinais clínicos das doenças. O tratamento depende do equilíbrio
entre a eficácia e os efeitos colaterais das drogas utilizadas e resposta do paciente
em tratamentos anteriores. A terapia ainda é influenciada por outros fatores como a
área lesionada, atividade da doença e o quadro clínico geral apresentado por cada
paciente (LEE, 2012).
Tabela 2: Classificação da extensão e gravidade da colite ulcerativa.
E1: Proctite: inflamação limitada ao reto;
E2: Colite do lado esquerdo: inflamação limitada ao ângulo esplênico;
E3: Pancolite: inflamação estende-se além do ângulo esplênico;
E0: Remissão: não há sintomas;
G1: Leve: quatro evacuações diárias (com ou sem sangue) ou menos, ausência de
sintomas sistêmicos, marcadores inflamatórios normais;
G2: Moderado: quatro evacuações diárias, sinais e sintomas sistêmicos mínimos;
G3: Severo: seis evacuações diárias ou mais com presença de sangue, batimentos
cardíacos >90, temperatura corporal > 37,5, concentração de hemoglobina < 105
g/L, velocidade de hemossedimentação > 30mm/h
32
As terapias farmacológicas para as doenças intestinais inflamatórias
geralmente incluem drogas conhecidas e reconhecidas como tratamento
convencional que compreendem cinco classe de medicamentos distintas:
aminossalicilatos, antibióticos, corticoides, tiopurinas e antagonistas do ácido fólico
como o metotrexato (SALES-CAMPOS et al, 2015; TAYLOR E IRVING, 2011).
Aminossalicilatos (ASA) são um grupo de drogas que possuem, como
princípio ativo, o ácido 5-aminossalicilico (5-ASA). Os efeitos benéficos relatados
incluem a inibição da quimiotaxia de macrófagos e o aumento da proliferação das
células epiteliais da parede intestinal devido a inibição dos efeitos do TNF e na
diminuição da regulação das vias de sinalização da proteína ativada por mitógeno
(MAP) quinase e do NF-κB (O’CONNOR et al, 2015).
Os aminossalicilatos prescritos com maior frequência são a messalazina,
sulfassalazina, olsalazina e balsalazida, porem estes tratamentos apresentam
alguns efeitos colaterais, bem como os efeitos secundários podem variar em cada
indivíduo (LOFTUS et al, 2004).
Sabe-se que pacientes com doenças intestinais inflamatórias possuem uma
contagem elevada de bactérias intestinais em relação a indivíduos saudáveis, essa
carga microbiana possivelmente está relacionada a um aumento na gravidade da
doença (THORKILDSEN et al, 2013). Antibióticos como o metronidazol e
ciprofloxacino têm sido utilizados no tratamento adjuvante do crescimento excessivo
de bactérias, com o intuito de reduzir a translocação bacteriana e com isso reduzir o
grau de gravidade da doença (SALES-CAMPOS et al, 2015).
Corticoides são uma das melhores opções para o tratamento da colite
ulcerativa, já que eles atuam diminuindo a transcrição de genes pro-inflamatórios
envolvidos na produção de citocinas, inibindo o recrutamento de leucócitos e a
expressão de moléculas de adesão no tecido inflamado. Porém, o uso a longo-prazo
de corticoides, mesmo que em doses baixas, aumenta a ocorrência e diversos
efeitos como osteoporose, síndrome metabólica, doenças cardiovasculares,
infecções, osteonecrose e catarata (FORD et al, 2011).
Os imunossupressores da classe das tiopurinas azatriopina (AZA) e 6-
mercaptopurina (6-MP) são drogas fundamentais no tratamento das doenças
intestinais inflamatórias e vêm sendo utilizados na indução e manutenção há cerca
de 40 anos (THOMAS et al, 2005). Estes compostos são utilizados em casos de
abuso de corticoides (PEYRIN-BIROULET et al. 2015; SALES-CAMPOS et al, 2015).
33
O mecanismo de ação das tiopurinas não está completamente elucidado no
tratamento das doenças intestinais inflamatórias, seus efeitos estão relacionados
com a inibição da síntese de nucleotídeos ou proteínas e na proliferação de
leucócitos. As tiopurinas podem agir induzindo a apoptose de linfócitos-T ativos,
podendo reduzir o processo inflamatório devido ao bloqueio de moléculas como o
ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF (TRAIL) e o membro 7 (TNFRS7) e
α4-integrina que pertencem à superfamília de receptores de TNF através de um
metabólito comum do AZA e da 6MP conhecido como nucleotídeo 6-tioguanina (6-
TGN) (THOMAS et al, 2005, SALES-CAMPOS et al, 2015).
O metotrexato (MTX) é o principal antagonista de ácido fólico utilizado no
tratamento de doenças autoimunes. É utilizado em casos de refração ou intolerância
ao tratamento com tiopurinas, porém, possui pouca eficácia no tratamento em longo
prazo (SUARES, 2011). Seu mecanismo de ação consiste na inibição de algumas
enzimas relacionadas ao metabolismo do folato e está envolvida na síntese de
purinas e pirimidinas, esta inibição aumenta os níveis intracelulares de adenosina,
relacionado ao efeito anti-inflamatório do MTX (CRONSTEIN et al, 1993).
A administração de citocinas anti-inflamatórias e a indução da morte celular
podem contribuir na prevenção da ativação, proliferação e recrutamento de células
T. Apesar de ser muito eficaz, a terapia biológica ainda está sendo investigada, além
de ser um tratamento que possui custo elevado se comparado a outros métodos
utilizados em casos de doenças inflamatórias intestinais (VALATAS et al, 2015).
Os anticorpos monoclonais específicos de TNF foram desenvolvidos como
novo método para o tratamento da doença em casos de ausência de resposta ou
contraindicação a outros tratamentos. Os principais anticorpos anti-TNF utilizados no
tratamento da colite ulcerativa são o infliximab, cujo mecanismo de ação consiste na
ligação com TNF solúvel com a membrana do TNF, consequentemente inibindo a
atividade biológica da citocina; adalimubab, utilizado no tratamento de pacientes
intolerantes ao infliximab (DIGNASS et al, 2011); certolimubabpegol e golimubab
(SALES-CAMPOS et al, 2015).
34
3.3.7 Potencial terapêutico de produtos naturais para o tratamento da colite ulcerativa
Devido aos efeitos colaterais proporcionados pelos medicamentos utilizados
na terapêutica, a obtenção de novos compostos para o tratamento da colite
ulcerativa, baseados na atividade antioxidante, representa uma grande estratégia na
pesquisa de novos fármacos. Inúmeros estudos demonstram os efeitos benéficos de
vários compostos com propriedades antioxidantes em modelos experimentais de
colite, incluindo flavonoides como a quercetina, rutosídeo, silimarina, morina,
diosmina, hesperidina, além do tempol e da vitamina E (SANCHEZ DE MEDINA et
al, 2002; GÁLVEZ et al, 2001; CRESPO et al, 1999; GONZÁLEZ et al, 2001).
Diversas plantas já foram testadas e apresentaram efeito no tratamento
alternativo da colite ulcerativa, como por exemplo, o extrato de Ginko biloba, que é
um antioxidante cujos estudos demonstraram uma supressão da ativação dos
macrófagos, além de modular os mediadores inflamatórios (KOTAKADI et al, 2008).
Dos Reis et al (2009) citam que o extrato de Garcinia cambogia trouxe efeitos
gastroprotetores. A atividade anti-inflamatória do extrato alcoólico foi investigada,
revelando uma melhora significativa ao dano macroscópico causado e a uma
redução considerável na atividade das enzimas MPO, COX-2 e na expressão de
iNOS. O tratamento com o extrato ainda demonstrou ação na diminuição dos níveis
de PGE2 e IL-1β no intestino grosso.
O papel potencial demonstrado nas pesquisas com o extrato de Zingiber
Officinale Roscoe, onde foi avaliada a modulação da extensão e a gravidade da
colite ulcerativa, revelou que o extrato de gengibre foi eficaz contra a colite ulcerativa
induzida por ácido acético, provavelmente por suas atividades antioxidante e anti-
inflamatória (EL-ABHAR et al, 2008).
Os efeitos protetores dos polissacarídeos de Angelica sinensis foram
parcialmente elucidados pelo stress oxidativo e pela depleção da (GSH), que estão
diretamente ligados à fisiopatologia da colite ulcerativa. Os polissacarídeos de A.
sinensis estão relacionados com a prevenção do stress oxidativo, o qual ocorre
durante a infiltração de neutrófilos decorrente do processo patológico da colite
ulcerativa (WONG et al, 2008).
O chá verde (Camelia sinensis) demonstrou efetividade no tratamento da
colite ulcerativa, atenuando sintomas como diarreia e perda de peso. O mecanismo
35
de ação foi associado a uma notável melhoria no rompimento da arquitetura
colônica, diminuição significativa na redução de MPO intestinal e na produção do
TNF (MAZZON et al, 2005).
Um estudo realizado com a Arctium lappa demonstrou que graças a uma
porção lactona sesquiterpeno, presente em sua composição, houve uma diminuição
na gravidade e extensão nos danos causados ao intestino no modelo de colite
induzida por TNBS. Além disso, ainda houve uma diminuição na incidência de
diarreia e na perda de peso dos animais (DE ALMEIDA et al, 2013).
O extrato das folhas da Folium syringae demonstrou uma melhora significativa
na gravidade da colite ulcerativa. O provável efeito protetor desta planta é atribuído
à glicosídeos iridoides presentes em sua composição que atuam capturando os
radicais livres, diminuindo o recrutamento de leucócitos e regulando uma série de
citocinas pro inflamatórias, bloqueando a ativação do NF-kB no processo
inflamatório (LIU E WANG, 2011).
Mishra et al (2012) demonstraram a eficácia da administração do extrato
aquoso dos corpos de frutificação dos cogumelos Lonotus obliquus. Foi observada a
redução da inflamação intestinal, erosão na mucosa, distorções e perda das criptas
no modelo de colite aguda induzida por DSS. Os resultados demonstraram uma
melhora nos resultados histológicos, além da diminuição de níveis de iNOS e na
expressão de citocinas pro inflamatórias como o TNF, IL-1β, IL-6 e IFN-γ.
A Phellinus linteus demonstrou uma melhora nas características patológicas
da colite, como o encurtamento do intestino e uma melhora na da doença. A planta
tem como efeito reduzir a expressão do NF-kB, iNOS e proteínas da COX-2 no
modelos de colite induzida por DSS (SONG E PARK, 2014).
Resultados obtidos no estudo da administração do extrato metanólico da
Patrinias cabiosaefolia demonstraram uma atenuação nos sinais clínicos da doença
e no acumulo da MPO no tecido, que implica na supressão da perda de peso,
diarreia, sangramentos e infiltração leucocitária. Também foi demonstrado que o
encurtamento do intestino e aumento do baço foram menores em comparação aos
grupos controle. Avaliações histológicas indicaram a diminuição de edemas, danos
na mucosa e perda das criptas, além disso, o extrato de P. cabiosaefolia ainda
diminuiu a expressão de TNF, IL-1β e IL-6 (CHO et al, 2010).
36
3.4 Modelos experimentais da colite ulcerativa
Durante as últimas décadas, um significativo número de modelos
experimentais para doenças inflamatórias intestinais foram criados. Isto, para que
haja um melhor entendimento do mecanismo da manutenção da homeostase da
mucosa e funções imunológicas envolvidas na melhora da capacidade de interpretar
as respostas complexas que desencadeiam a inflamação (VALATAS et al, 2015).
Os principais métodos de indução baseiam-se nas alterações genéticas, onde
se origina um número de vias comuns de imunopatogênese; na microbiota que,
quando desequilibrada, pode induzir uma inflamação intestinal; na perda da
tolerância oral e o rompimento da barreira epitelial, contribuindo para o
desenvolvimento da inflamação, além de modelos baseados na resposta de células
T auxiliares polarizadas ou nas deficiências na resposta imune inata (GEEM, et al,
2015).
Apesar disso, nenhum modelo enquadra a complexidade das doenças
inflamatórias intestinais em humanos, mas cada modelo fornece informações sobre
um ou outro aspecto das doenças que, juntas levam à definição dos princípios da
patogênese das doenças inflamatórias intestinais (KIESLER et al, 2015).
3.4.1 Modelo de colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS)
O rompimento da barreira epitelial no cólon e a consequente exposição de
bactérias ou antígenos bacterianos presentes na luz intestinal à mucosa é
estabelecido como um dos principais mecanismos para a instalação da colite
ulcerativa, pois acaba facilitando a indução da inflamação intestinal ou ocorre
espontaneamente em outros modelos experimentais devidos a anormalidades
moleculares que causam a perda de camada mucosa (CARLSSON et al, 2013).
A importância da integridade do epitélio para prevenir a inflamação intestinal
foi inicialmente descrita por Herminston e Gordon (1995), onde os resultados
demonstraram que a inflamação ocorreu na lâmina própria dos animais, mas
somente em áreas subjacentes ao epitélio previamente lesionado, sugerindo que a
entrada de micro-organismos comensais na lamina própria pode induzir a resposta
inflamatória de outra maneira.
37
Um fenômeno similar ocorre na colite ulcerativa induzida pelo DSS, embora
que neste caso, a lesão epitelial seja causada pelo polissacarídeo tóxico à mucosa
que resulta na resposta imune que altera a função da barreira ao longo do epitélio
intestinal conforme mostra a figura 4. A administração do DSS na água de beber dos
animais por determinado período de tempo resulta na indução que reproduz a
inflamação aguda restrita ao cólon e caracterizada por ulcerações, erosões,
diminuição da criptas e infiltração de leucócitos (ALGIERI et al, 2015).
Figura 4: Representação esquemática da colite ulcerativa induzida por DSS - adaptado de Chassaing et al (2015)
A inflamação ocasionada pelo DSS se desenvolve na ausência de células T
mediadas pela imunidade adaptativa. Com isso, a colite induzida por DSS se torna
um modelo proveitoso para o estudo dos mecanismos envolvidos no
desenvolvimento da inflamação intestinal (CHAMI et al, 2014). De fato, estudos
38
salientam o papel de células como macrófagos, que são importantes fontes de
citocinas que regulam a função da barreira epitelial e proliferação de neutrófilos, que
contribuem para o dano tecidual (KIESLER et al, 2015).
Embora a colite induzida pelo DSS seja causada principalmente pelo
rompimento do epitélio e pela ativação de macrófagos e neutrófilos, a ação das
células T pode agravar a resposta inflamatória quando a imunidade inata e a
adaptativa estão íntegras. A resposta das células Th1 polarizadas foi observada na
fase aguda da doença e uma resposta conjunta de células Th1 e Th2 foi descrita por
Jones-Hall e Grisham (2014) no estágio crônico da colite induzida pelo DSS,
alcançada após vários ciclos de administração de DSS. Esta resposta das células T
resulta numa produção de citocinas efetoras que contribuem para o aumento dos
níveis de TNF e IL-6 produzidos por macrófagos nas duas formas da colite induzida
por DSS (TSANG et al, 2015).
3.4.2 Modelo de colite induzida pelo ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS)
A administração do agente haptenizante ácido TNBS torna as proteínas
imunogênicas do sistema imune do animal iniciando assim a resposta imune na
mucosa que induz a colite em animais susceptíveis. A administração intra-retal de
TNBS em camundongos SJL/J ou C57BL/10 leva a colite transmural, principalmente
induzida pela resposta imune mediada por células Th1 e caracterizada pela
infiltração de células T CD4+, macrófagos e neutrófilos na lamina propria, além do
surgimento de diarreia severa, perda de peso e prolapso retal (ZUNDLER E
NEURATH, 2015). Algumas destas características assemelham-se à DC, portanto, o
modelo de colite ulcerativa induzida pelo TNBS tem sido utilizado no estudo de
aspectos imunológicos relevantes à doença, incluindo padrões de produção de
citocinas, mecanismos de tolerância oral e efeitos do potencial da imunoterapia
(KIESLER et al, 2015).
O modelo de colite ulcerativa induzida pelo TNBS tem sido amplamente
utilizada para a elucidação dos mecanismos de homeostase da mucosa junto ao
papel da proteína de domínio de oligomerização nucleotídica 2 (NOD2), que é um
sensor bacteriano intracelular que reconhece o peptidoglicano muramil dispeptidase.
O NOD2 controla as células Treg com peptídeo associada a latência (LAP) na
lamina própria que é uma molécula que se liga ao fator de transformação do
39
crescimento β (TGF-β), com isso, as células T reguladoras proliferam em resposta à
entrada das bactérias luminais e seus produtos na lâmina própria, gerando assim o
processo inflamatório (AMENDOLA et al, 2014).
As respostas às citocinas são elementos chave no controle dos mecanismos
fundamentais da inflamação intestinal. De fato, foi observada a síntese de interferon-
γ (IFN-γ), que é uma característica da doença de Crohn. Porém, altos níveis de IFN-
γ, em conjunto a prevenção da produção de IFN pelo tratamento com anti-IL-12p40,
anulou os efeitos da colite ulcerativa (TERAI et al, 2014).
O modelo de colite ulcerativa induzido pelo TNBS demonstrou que os padrões
de expressão das citocinas são dinâmicos e alteram a evolução da doença. Assim, o
processo inflamatório é caracteriza por uma resposta sequencial, onde a resposta
inicial das células Th1 acompanhada de altos níveis de IL-12 e IFN-γ que é
subsequentemente substituída por uma resposta persistente das células Th17 junto
a IL-13 e a secreção de TGF-β. Alguns destes processos também são evidentes nas
doenças inflamatórias intestinais em humanos (FICHTNER-FEIGL et al, 2014).
3.4.3 Modelo de colite ulcerativa induzida por oxazolona
Era esperado que a administração intra-retal de outros agentes
haptenizantes ocasionaria um quadro de colite ulcerativa semelhante à indução com
TNBS, porém a administração com a oxazolona (4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazoli-5-
ona) ocasionou uma reação tardia na mucosa provocando a inflamação no cólon
diferenciando-se muito dos efeitos ocasionados pelo TNBS tendo mais
características relacionadas à colite ulcerativa. Uma única dose de oxazolona leva a
uma inflamação superficial da mucosa no cólon distal que caracteriza-se pela
infiltração de linfócitos e neutrófilos, edema submucoso e ulcerações (STROBER et
al, 2014).
As respostas celulares e das citocinas referentes a colite ulcerativa induzida
pela oxazolona diferencia-se da colite induzida pelo TNBS, principalmente pela alta
produção de IL-13 originária das células T CD4+ natural killer (NKT) presentes na
lamina própria ao invés de produzirem IFN-γ, conforme o convencional. Apesar
disso, tanto a IL-13 quanto as NKT estão envolvidas na colite ulcerativa induzida
pela oxazolona (KIESLER et al, 2015).
40
3.4.4 Modelo de colite ulcerativa induzida por transferência adotiva de células
Um grande avanço no desenvolvimento de modelos de inflamação intestinal
surgiu com a descoberta de que a doação de células T CD4+ naive (células T
CD4+CD4RB high) para camundongos singênicos imunodeficientes SCID ou Rag-/-
provoca uma doença debilitante e uma inflamação intestinal que se desenvolve de
cinco a dez semanas de pós-tratamento. Por outro lado, a transferência de células T
CD4+CD45RB low ou a cotransferência de células T maduras em um camundongo
receptor não apresentou o quadro de colite ulcerativa (SHALE et al, 2013).
As célulasTreg suprimem e antagonizam as células T efetoras na mucosa
intestinal através da produção de IL-10, TGF-β, e IL-35. O papel imuno-regulador da
IL-10 foi demonstrado com a administração de anticorpos anti-receptor de IL-10 e
com a transferência de células T CD4+ em hospedeiros deficientes em IL-10, que
não geraram um quadro infalamatório (ZIGMOND et al, 2014). Apesar disso, o papel
da IL-10 no funcionamento das células Treg não suprime o papel do TGF-β, porém
as células Treg não proporcionaram proteção quando células T CD4+CD25+
deficientes em TGF-β foram co-transferidas em camundongos receptores. Ainda foi
observado que a administração sistêmica de anticorpos anti-TGF-β bloqueou a ação
das células T CD4+25+ em atenuar a colite (CANAVAN et al, 2015).
. Devido ao papel crucial das células T reguladores neste modelo
experimental e a importância do entendimento dos mecanismos que controlam a
homeostase intestinal, o modelo de transferência adotiva de células é um dos
modelos mais utilizados atualmente (GOYAL et al, 2014)
3.4.5 Modelo de colite ulcerativa em camundongos knockout para interleucina- 10 (IL-10)
Camundongos com um poliformismo no locus da IL-10 (Il10-/-) desenvolvem
a inflamação intestinal espontaneamente, caracterizada pela presença de infiltrado
inflamatório formado por linfócitos, macrófagos e neutrófilos (TAKAGI et al, 2015). A
inflamação é acionada pela resposta pró-inflamatória das células Th1, que
apresentou melhora após a administração sistêmica do anticorpo anti-IL-12p40.
Também apresentou melhora após a administração do anticorpo anti-IFN-γ, porém,
em menor escala após a administração do anticorpo anti-IFN-γ. Por razões
41
desconhecidas, a produção de IL-12 e IFN-γ diminui ao longo do tempo e as células
Th2 aumentam progressivamente a produção de IL-4 e IL-13 (VALATAS et al, 2015).
A supressão de IL-10 em todas as células T ou especificamente em células
T reguladoras Foxp3 + também resulta na colite espontânea, indicando que a IL-10
derivada destas células é importante para a manutenção da homeostase do
intestino. Este modelo demonstrou a relevância da função da IL-10 na patogênese
da colite ulcerativa, além do conhecimento que polimorfismos genéticos no locus da
IL-10 trazem um aumento de risco tanto pra colite ulcerativa quanto para a doença
de Crohn (RAY et al, 2015).
42
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
As inflorescências de A. satureioides foram coletadas no município de Bom
Retiro (Latitude: 27° 48' 29'' S e Longitude: 49° 32' 1'' W), estado de Santa Catarina,
Brasil, localizado na região da Serra Catarinense, onde a planta é encontrada em
abundância, pois faz parte da vegetação nativa da região.
As inflorescências foram identificadas por comparação com uma exsicata
depositada no herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí/SC), sob o número 50130.
O material vegetal foi seco em estufa de ar circulante a 40° C, as amostras
foram submetidas à moagem em triturador após a secagem, resultando em 2 kg de
material seco.
4.1.1 Preparação do extrato hidroalcoólico das inflorescências
O extrato vegetal foi produzido e disponibilizado pelo professor Rivaldo Niero,
no laboratório de fitoquímica da UNIVALI.
As inflorescências de A. satureioides (2 kg) foram maceradas em solução
hidroalcoólica a 70% durante sete dias. Após filtração, a solução obtida foi
submetida à redução e evaporação dos solventes utilizados em evaporador à
pressão reduzida, rendendo 192,6 g (9,6%) de extrato hidroalcoólico das
inflorescências de A. satureioides (EHAS).
4.2 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss Webster (30 - 40g), provenientes do biotério da UNIVALI, aclimatados às condições do mesmo por pelo
menos sete dias antes da manipulação experimental, sob a temperatura de
aproximadamente 23°C e ciclo claro escuro de 12 horas controlado. Os animais
foram alimentados com ração e água ad libitum. Todos os experimentos
obedeceram aos protocolos experimentais previamente aprovados pela Comissão
de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Itajaí com o número de parecer
035/15.
43
4.2.1 Grupos experimentais
Foi utilizado um total de dezoito camundongos, distribuídos aleatoriamente
em três grupos contendo seis animais, divididos dessa forma, para a melhor
avaliação do experimento:
Controle não-colítico: formado por animais que não receberam tratamento
com DSS 3%;
Controle colítico: formado por animais que receberam solução contendo
DSS 3% e foram tratados oralmente com veículo (água + Tween 80 1%, 10 ml/kg);
Colítico tratado com EHAS: formado por animais que receberam o
tratamento com solução contendo DSS 3% e sucessivas administrações de uma
solução contendo o EHAS (100 mg/kg, v.o.).
4.3 Modelo de Indução de Colite Ulcerativa
O modelo selecionado consiste na diluição do dextrano sulfato de sódio (DSS,
de peso molecular: 40.000, obtida da Alfa Aesar, Ward Hill, MA, EUA em uma
concentração de 3% na água de beber. Conforme mostra a figura 5,os animais
receberam a solução contendo DSS 3% ad libitum num período de cinco dias,
seguido por um período de dois dias recendo apenas água filtrada. Durante os sete
dias, os animais receberam o tratamento designado conforme a divisão dos grupos
uma vez ao dia. Após este período os animais foram sacrificados, tiveram seus
fígados e intestinos removidos e lavados em solução salina (0,9%).
Figura 5: Modelo de colite ulcerativa induzida por DSS
44
4.4 Avaliação do índice de atividade da doença
Foram avaliados diariamente diferentes parâmetros de caráter geral
individualmente, tais como peso corporal, aparecimento de fezes diarreicas e
sangramentos. Cada parâmetro foi atribuído a um escore de acordo adaptado de
Utrilla (2015) que foram utilizados para calcular uma média diária do índice da
atividade da doença (IAD) conforme mostra a tabela 1. Ao final, os animais foram
sacrificados, uma amostra de sangue foi coletada, os intestinos foram removidos,
tiveram seus comprimentos medidos e foram pesados com e sem fezes, que foram
coletadas para análise de sangue oculto nas fezes. O fígado e o baço dos animais
também foram removidos e pesados.
Tabela 3: Parâmetros utilizados no IAD.
Escore Perda de peso Consistência das fezes Sangramento
0 Não significativa Normal Ausente
1 1-5%
2 5-10% Fezes moles
3 10-20%
4 >20% Diarreia Severo
4.5 Avaliação Microscópica
Após a avaliação macroscópica do processo inflamatório, amostras de tecido
(0,5 mm) adjacentes à área de lesão foram coletadas para processamento
histológico e fixadas em solução ALFAC (85% etanol 80%; 10% formol e 5% ácido
acético) por 24 horas sendo, depois desidratadas em séries alcoólicas crescentes,
diafanizadas em xilol, para posteriormente serem incluídas em parafina e
preparadas para a microtomia. Os cortes, com aproximadamente 6 µm de
espessura, foram desparafinizados e reidratados utilizando série alcoólica etílica
decrescente. O dano tecidual foi analisado por um patologista que avaliou a
presença de ulceração, infiltração, edema e a condição das criptas. O tecido foi
avaliado conforme os critérios citados por Utrilla (2015) que variam de 0 (tecido
saudável) a 3 ou 4 (lesão grave), conforme demonstrado na tabela a seguir:
45
Tabela 4: Critérios para avaliação microscópica. Mucosa e lamina propria
Ulceração: ausente (0); leve (1); moderada (2); severa (3); extensa (4);
Infiltrado de células polimorfonucleares;
Infiltrado de células mononucleares e fibrose;
Edema;
Criptas
Atividade mitótica: terço inferior (0); leve no terço médio (1); moderada no terço médio (2); terço
superior (3)
Dilatação;
Depleção de goblet cells;
Submucosa
Infiltração de células polimorfonucleares;
Infiltração de células monucleares;
Edema;
Vascularização;
Camada muscular
Infiltração de células polimorfonucleares
Infiltração de células mononucleares
Edema
Infiltração na camada serosa
4.6 Avaliação do conteúdo de mucinas
O material foi preparado conforme descrito no item 5.6, porém, as lâminas
foram oxidadas em água com ácido periódico a 0,5% em temperatura ambiente por
5 minutos, lavadas em água corrente e imersas no reagente se Schiff por 20
minutos, lavados em água corrente por cinco minutos e mergulhadas três vezes em
meta-bissulfito de sódio a 0,5% antes da última lavagem em água. Para revelação
das glicoproteínas, as amostras foram contra coradas com hematoxilina por 20
segundos, desidratadas, limpas e as lâminas foram confeccionadas.
As lâminas foram lidas em microscópio óptico e fotografadas para serem
analisadas com o programa Image J® que quantificou as glicoproteínas. Os
resultados foram expressos em pixels/campo.
46
4.7 Avaliação bioquímica
Amostras de fígado e intestino dos diferentes grupos experimentais foram
homogeneizadas em tampão fosfato 200 mM pH, 6,5. O homogenato obtido foi
imediatamente utilizado para a quantificação dos níveis de GSH e LOOH, depois foi
submetido à centrifugação por 20 minutos a 9.000 g a 4º C e no sobrenadante
quantificou-se a atividade da enzima SOD enquanto que a atividade da enzima MPO
foi quantificada no precipitado resultante.
Toda a preparação do homogenato e de todos os procedimentos indicados
neste item foram realizados a 4º C.
4.7.1 Quantificação de grupos sulfidrílicos não proteicos (GSH)
Em tubos de plástico foram adicionados 50 µL do homogenato e 40 µL de
ATC 12%, agitados em homogeneizador de tubos e centrifugados por 15 minutos a
4.000 rpm a 4ºC.
Em uma placa de 96 poços foram adicionados 10 µL do sobrenadante
(preparado como descrito anteriormente), 290 µL de tampão TRIS 0,4 M (pH 8,9) e 5
µL de solução 3,96 mg/mL de DTNB (5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzoico) em metanol.
Após 15 minutos foi realizada a leitura em espectrofotômetro com
comprimento de onda de 420 nm. Os valores individuais foram interpolados numa
curva padrão de GSH (1,25-10 µg/ml) expressos em µg GSH/g tecido.
4.7.2 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH)
Em tubos de plástico foram adicionados 10 µL de metanol e 100 µL do
homogenato, em seguida foram agitados em homogeneizador e centrifugados a
9.000 g por 20 minutos a 4º C em ultracentrifuga.
Em uma placa de 96 poços foram colocados 30 µL do sobrenadante e 140 µL
de meio reacional (Xilenol laranja, ferro II, hidroxitolueno butilado solubilizados em
metanol) incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. A leitura foi realizada
em espectrofotômetro com comprimento de onda a 560 nm e a concentração de
LOOH foi determinada para cada 1 mg de proteína presente no homogenato. Os
resultados foram expressos em mmol/mg de tecido.
47
4.7.3 Quantificação dos níveis enzimáticos de mieloperoxidase (MPO)
O precipitado proveniente das diferentes amostras, obtido como descrito
anteriormente, foi ressuspendido com 1 mL de tampão fosfato de potássio 0,08 M
junto a 0,5% de hexadeciltrimetilamônio (HTAB). Depois de agitadas em
homogeneizador de tubos, as amostras foram centrifugadas a 11.000 g por 20
minutos a 4º C. Em placas de 96 poços foram adicionados em duplicatas 30 µL do
sobrenadante de cada amostra, junto a 200 µL de solução reacional (100 µL de
tampão fosfato 0,08 M, 85 µL de tampão fosfato 0,22 M e 15 µL de H2O2 0,017%).
4.7.4 Quantificação dos níveis de superóxido dismutase (SOD)
Em tubos de plástico foram adicionados 20 µL da amostra com 442 µL de
tampão TRIS HCl 1 mM com EDTA 5 mM com pH 8,5 e agitado em
homogeneizador. Em seguida, foram adicionados 25 µL de Pirogalol 1 mM e
incubados por 20 minutos. A reação foi interrompida com 12,5 µL de HCl 1 N.
Os tubos foram centrifugados por 4 minutos a 14.000 rpm e 200 µL do
sobrenadante foram pipetados para uma placa de 96 poços e lidos em
espectrofotômetro com o comprimento de onda de 205 nm.
Os controles utilizados foram o tampão TRIS-EDTA + amostra e tampão
TRIS-EDTA + pirogalol em triplicata. A média dos dois controles foi calculada e
somada, sendo o valor encontrado igual a 100% - 2 unidades de SOD e a média das
absorbâncias da amostra 50% 1 unidade de SOD. Os resultados foram expressos
em U de SOD/mg de proteína.
4.8.Quantificação de proteínas
A concentração de proteína foi determinada em placa de 96 poços onde foi
adicionado 5 µL de amostra e 200 µL de reagente de Bradford a 25%, realizando a
leitura da absorbância em espectrofotômetro com o comprimento de onda 540nm. A
curva de albumina bovina sérica (0,1 µL – 0,0125 µg/mL) foi utilizada para interpolar
as médias de cada amostra.
48
4.9 Sangue oculto nas fezes As amostras foram coletadas durante a remoção do intestino para a pesagem e em
seguida foram diluídas em 5 ml de água; posteriormente, foram transferidas para um
tubo de ensaio e foi adicionado 0,5 ml do reativo de Meyer-Johannessen e duas
gotas de água oxigenada. As diferentes variações da coloração avermelhada são
classificadas em positivas de uma a quatro cruzes para a presença de sangue oculto
nas fezes. O número de amostras positivas por grupo foi verificada em três
experimentos.
4.10 Avaliação do transito intestinal
Para avaliar os efeitos do EHAS na motilidade intestinal, os animais foram tratados
com água (1 mL/kg), atropina (3 mg/kg) ou EHAS (100 mg/kg) 30 minutos antes da
administração de 0,5 mL de uma solução marcadora semissólida contendo 0,05% de
vermelho de fenol e 1,5% de carboximetilcelulose. Depois de 20 minutos, os animais
foram sacrificados e o intestino delgado foi dissecado do piloro até a junção ileocecal
para a determinação do trânsito intestinal. O comprimento total do intestino e o
comprimento da área marcada com o vermelho fenol foram medidas. O transito
intestinal foi expresso em porcentagem calculada por: TI=X/Yx100, onde X=distância
percorrida pelo vermelho de fenol e Y=comprimento total do intestino delgado.
4.11 Análise estatística
Os resultados expressos foram apresentados média ± erro padrão das médias de
n=6. A análise estatística foi efetuada utilizando análise de uma ou duas vias da
variância (ANOVA), quando aplicável, seguida pelo método de Bonferroni. O teste
de Mann-whitney foi utilizado para avaliação dos testes não-paramétricos. As
análises foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 5.0 (San Diego,
EUA). Valores p <0,05 foram considerados significativos.
49
5 RESULTADOS
5.1 Efeito do EHAS sobre os sinais clínicos da colite ulcerativa induzida por DSS
Para avaliar o efeito anti-inflamatório intestinal do EHAS, foi utilizado o
modelo de colite ulcerativa induzida por DSS conforme Utrilla et al (2015), que
mimetiza a fase aguda da colite ulcerativa em humanos. Neste modelo, diversos
sinais clínicos foram analisados e em conjunto quantificados conforme o sistema
de escore denominado índice de atividade da doença (IAD). Como demonstrado
na figura 4A, no oitavo dia experimental, os animais do grupo colítico tratados
somente com veículo alcançaram um escore de IAD de 8 ± 0,6 (correspondente
à diarreia grave com intenso sangramento anal) e 6,3% de perda de peso em
relação ao primeiro dia experimental (figura 6B). Por outro lado, os animais
tratados com 100 mg/kg de EHAS, uma vez ao dia, durante sete dias,
demonstraram escore IAD significativamente menor do que o classificado no
grupo colítico tratado com veículo alcançando um valor aproximado de 3 ± 0,9
(figura 6A) e 1,4% de perda de peso em relação ao primeiro dia experimental
(figura 6B).
Figura 6: Efeito do EHAS no IAD e na perda de peso de camundongos com colite induzida por DSS.
0 2 4 6 8 10
0
2
4
6
8
10
Veículo não-colíticoVeículo colíticoEHAS (100 mg/kg)
Tempo (dias)
###
###
#
***
###
***
A
Índ
ice
de
ativ
idad
e d
a d
oen
ça (
IAD
)
50
Os animais foram divididos em grupos não-colítico tratado com veículo (água), colítico tratado
com veículo e colítico tratado com EHAS (100 mg/kg). A análise estatística foi realizada utilizando
ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni. ### p<0.001 quando comparado ao grupo
veículo não colítico. ** p<0.01 e *** p<0.001 quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo.
Em termos gerais, no modelo de colite experimentalmente induzida por
DSS, o encurtamento do cólon indica a extensão do dano tecidual nos animais
experimentais (HENDRICKSON et al, 2002). De fato, o grupo não-colítico
demonstrou um comprimento médio de cólon de 102 ± 3,7 mm e o grupo colítico
tratado com veículo apresentou uma redução do comprimento do cólon para 63 ±
4,0 mm, como demonstrado na tabela 3.
Adicionalmente, como observado na tabela 3, o peso colônico também foi
47% menor no grupo colítico tratado com veículo quando comparado ao grupo
não-colítico (1,7± 0,07mg/100 g de peso). Confirmando que o tratamento com o
extrato reduziu a gravidade da colite ulcerativa induzida por DSS, de forma
similar ao observado no comprimento colônico, o tratamento com EHAS também
diminuiu a extensão da perda de peso do cólon vazio para valores com média de
1,4 ± 0,14 mg/100 g de peso.
2 4 6 8 10
-10
-5
0
5
Veículo não-colíticoVeículo colíticoEHAS (100 mg/kg, v.o)
Tempo (dias)
***
######
######**
BPe
rda
de p
eso
( %
)
51
Similarmente ao descrito por Zhang et al (2015), o baço dos camundongos
pertencentes ao grupo colítico tratado com veículo apresentou um aumento de
peso, caracterizando a presença de esplenomegalia, alcançando um peso 50%
maior comparado ao grupo não-colítico (0,4 ± 0,02 mg/100 g de peso); esta
alteração não foi observada nos animais colíticos tratados com EHAS (tabela 3).
Não foi observada diferença significativa entre o peso dos fígados entre os
grupos experimentais (tabela 5). O tratamento com EHAS também reduziu
significativamente a presença de sangue oculto nas fezes dos camundongos
colíticos (figura 7).
Tabela 5: Efeito do EHAS no comprimento e peso colônico e no peso do baço e fígado de camundongos com colite induzida por DSS.
Tratamento
Comprimento do
cólon(mm)
Peso do cólon
(g/100g)
Peso do baço (g/100g)
Peso do fígado (g/100g)
Não-colítico Veículo 102 ± 3.7 1.7 ± 0.07 0.4 ± 0.02 4.3 ± 0.29
Colítico Veículo 63 ± 4.0a 0.9 ± 0.14a 0.6 ± 0.06a 3.6 ± 0.08
EHAS (100 mg/kg) 84 ± 3.1b 1.4 ± 0.14b 0.4 ± 0.01b 4.0 ± 0.38
a. p< 0,05 vs. grupo não colitico b. p< 0,05 vs. grupo colitico tratado com veículo
52
Figura 7: Efeito do EHAS na presença de sangue oculto nas fezes de camundongos com colite induzida por DSS.
Veículo EHAS0
2
4
6
*
San
gu
e o
cult
o n
as f
ezes
(sc
ore
)
As amostras coletadas foram submetidas ao teste de Meyer-Johannessen, sendo então
classificadas. O resultado foi expresso conforme análise de um escore padrão e submetido ao teste
de Mann-Whitney. * p<0,05 quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo.
5.2 Efeito do EHAS nas alterações histopatológicas induzidas pelo DSS no cólon
A arquitetura do cólon dos camundongos dos diferentes grupos experimentais
foram analisados após coloração com H/E. Nos animais não colíticos, como
esperado, as estruturas da parede instestinal, submucosa e criptas estavam
normais, como representado na figura 8A. Em contrapartida, o cólon dos animais do
grupo colítico tratado com veículo exibiram alterações patológicas como perda da
barreira epitelial, redução do número de criptas e a presença de edema submucoso,
como indicado na figura 8B. Estas alterações patológicas foram atenuadas com o
tratamento com o EHAS, como é possível verificar na figura 8C.
As alterações histológicas foram determinadas utilizando um sistema de
escore padrão, onde a classificação do grupo colítico tratado com EHAS
demonstrou-se significativamente menor comparadas ao grupo colítico tratado com
veículo, conforme observado na figura 9.
53
Figura 8: Efeito do EHAS (100 mg/kg) nas alterações histológicas no cólon de camundongos com
colite induzida por DSS.
Vei EHAS0
5
10
15
**
Alt
eraç
ões
his
toló
gica
s (S
core
)
A - grupo não-colítico tratado com veículo; B – grupo colítico tratado com veículo; C – grupo
colítico tratado com EHAS (100mg/kg). Os animais foram divididos em grupos não-colítico tratado
com veículo (água), colítico tratado com veículo e colítico tratado com EHAS (100 mg/kg). O resultado
foi expresso conforme análise de um escore padrão expresso como mediana e intervalo de
interquartis e submetido ao teste de Mann-Whitney. ** p<0,01 quando comparado ao grupo colítico
tratado com veículo.
5.3 Efeito do EHAS nas alterações induzidas pelo DSS nos níveis de mucina no cólon
A coloração histoquímica PAS é uma técnica clássica utilizada na detecção
da presença de glicoproteínas, principalmente a mucina, que possui papel protetor
na mucosa intestinal. Conforme observado na figura 10, a coloração PAS no cólon
dos animais pertencentes ao grupo colítico tratados com veículo apresentou 59% de
diminuição quando comparada ao grupo colítico tratado com veículo (Vei: 7,6 ± 0,5 x
54
105 pixels/campo). O grupo colítico tratado com EHAS (100 mg/kg) demonstrou
índice 313% maior quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo e 68%
maior quando comparado ao grupo não colítico tratado com veículo.
Figura 9: Níveis mucina pelo método de PAS no cólon de camundongos com colite induzida por DSS.
Naive Vei EHAS
0
5
10
15
3% DSS
###
***##
Pix
els
X 1
05 /
cam
po
A - grupo não-colítico tratado com veículo; B – grupo colítico tratado com veículo; C – grupo colítico
tratado com EHAS (100mg/kg). Os animais foram divididos em grupos não-colítico tratado com
veículo, colítico tratado com veículo e colítico tratado com EHAS (100 mg/kg). As imagens capturadas
em microscópio óptico foram analisadas com o auxílio do programa Image J®. O resultado foi
expresso em pixels/campo. ### p<0,001 quando comparado ao grupo não colítico.*** p<0,01 quando
comparado ao grupo colítico tratado com veículo.
5.4 Efeito do EHAS no estresse oxidativo no cólon e fígado de camundongos com colite induzida por DSS
Conforme descrito na tabela 6, a disponibilidade do antioxidante GSH e da
atividade da enzima SOD apresentou-se diminuída no tecido colônico dos animais
colíticos tratados com veículo em 66% e 85% quando comparado ao grupo não-
colítico (808 ± 193 µg de GSH/mg de tecido e 1,3 ± 0,2 U SOD/mg de proteína,
55
respectivamente). Além disso, os níveis de LOOH apresentaram-se 160% maiores
no grupo colítico tratado com veículo, quando comparados ao grupo não-colítico (0,5
± 0,2 mmol de LOOH/mg de tecido). O tratamento com EHAS não aumentou os
níveis de GSH no tecido do cólon dos animais do grupo colítico, mas reduziu o
conteúdo de LOOH e a atividade da SOD a níveis basais.
Tabela 6: Efeito do EHAS na atividade da MPO e SOD e nos níveis de GSH e LOOH no cólon de camundongos com colite induzida por DSS.
a. p<0.001 vs. grupo não-colítico tratado com veículo. b. p<0.01 vs. grupo colítico tratado com veículo. c. p<0.05 vs. grupo colítico tratado com veículo.
O tratamento com DSS também promoveu o dano oxidativo no tecido
hepático reduzindo os níveis de GSH de 4337 ± 125 para 3552 ± 234 µg de GSH/mg
de tecido. Contudo, os níveis de atividade da enzima SOD não foram alterados pela
administração de DSS. De forma não esperada, o tratamento com EHAS aumentou
a atividade da SOD no fígado de 0,2 ± 0,05 para 0,6 ± 0,18 U SOD/mg de proteína.
Por outro lado, a diminuição dos níveis da GSH no tecido hepático não foi revertida
com a administração do EHAS, como observado na tabela 7.
Tratamento
Dose (mg/kg)
SOD (U/mg de tecido)
GSH (µg/mg de tecido)
LOOH (mmol/mg de tecido)
Não-colítico Veículo
- 1.3 ± 0.21 808 ± 193 0.5 ± 0.2
Colítico Veículo
- 0.2 ± 0.02a 268 ± 29a 1.3 ± 0.3a
EHAS
100 1.3 ± 0.64b 368 ± 55 a 0.3 ± 0.1 b
56
Tabela 7: Efeito do EHAS na atividade da SOD e nos níveis de GSH no fígado de camundongos com colite induzida por DSS.
a. p<0.001 vs. grupo não-colítico tratado com veículo.
5.5 Efeito do EHAS na atividade da MPO no cólon e fígado de camundongos com colite induzida por DSS
A atividade da MPO é utilizada como marcador de inflamação aguda devido a
sua relação com a infiltração de neutrófilos. A atividade da MPO no tecido colônico e
hepático de animais do grupo colítico tratado com veículo apresentou-se 282% e
172% maiores, se comparados ao grupo não-colítico (1,1 ± 0,5 D.O/mg de proteína e
0,1 ± 0,02 D.O/mg de proteína, respectivamente). Por outro lado, este aumento da
atividade da MPO no intestino e no fígado foi suprimido no grupo colítico tratado com
EHAS, como demonstrado na tabela 8.
Tratamento Dose (mg/kg)
SOD (U/mg de tecido)
GSH (µg/mg de tecido)
Não-colítico Veículo - 0.19 ± 0.06 4337 ± 125
Colítico Veículo - 0.12 ± 0.06 3552 ± 234a
EHAS 100 0.60 ± 0.18a 3922 ± 133
57
Tabela 8: Atividade da MPO no tecido colônico e hepático de camundongos com colite induzida por DSS.
a. p<0.05 vs. grupo não-colítico tratado com veículo. b. p<0.05 vs. grupo colítico tratado com veículo.
5.6 Efeito do EHAS nos níveis plasmáticos de AST (TGO) e ALT (TGP) de camundongos com colite induzida por DSS.
Os níveis séricos das enzimas AST (TGO) e ALT (TGP) são utilizados
como marcador de dano hepático. Os níveis de ambas as enzimas foram
aumentados no grupo colítico tratado com veículo em 75% e 245%,
respectivamente, se comparados ao grupo não-colítico (43,9 ± 3,2 U/L e 38,4 ± 6,3
U/L, respectivamente). Somente o aumento dos níveis séricos de TGP foi suprimido
no grupo colítico tratado com EHAS, como demonstrado na figura 12.
Tratamento
Dose (mg/kg)
Atividade da MPO no tecido colônico (mD.O/mg de
proteína)
Atividade da MPO no tecido hepático (mD.O/mg de
proteína)
Não-colítico Veículo - 1,1 ± 0,5 0.11 ± 0.02
Colítico Veículo - 4,2 ± 0,7ᵃ 0.30 ± 0.03a
EHAS 100 1,2 ± 0,4 ᵇ 0.09 ± 0.02b
58
Figura 10: Quantificação do efeito do EHAS nos níveis séricos de AST (TGO) e ALT (TGP) de camundongos com colite induzida por DSS.
Os animais foram divididos em grupos e após receberem o tratamento, o soro foi coletado para quantificação das enzimas. Os resultados foram expressos em U/L. ### p<0,001 quando comparado ao grupo veículo não colítico. * p<0,05 e *** p<0,01 quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo.
59
5.7 Efeito do EHAS no transito intestinal de camundongos.
O trânsito intestinal foi quantificado 15 minutos após a administração do
marcador. O grupo controle apresentou taxa de transito intestinal com média de 62,3
± 3,5%; enquanto que o grupo tratado com EHAS (100 mg/kg) apresentou taxa de
transito intestinal com média de 68,7 ± 2,5%. Como esperado, o grupo tratado com
atropina (controle positivo) reduziu o transito intestinal em 66% quando comparado
ao grupo veículo, alcançando taxa de transito intestinal com média de 21,0 ± 5,2%
(figura 13).
Figura 11: Efeito do EHAS sobre o trânsito intestinal dos camundongos.
Vei Atro EHAS
0
20
40
60
80
***
Tra
nsi
to in
test
inal
(%
)
Os animais foram tratados por via oral com veículo (água 1 mL/kg) ou EHAS (100 mg/kg) e
por via subcutânea com atropina (3 mg/kg) 30 minutos antes da administração da solução marcadora
contendo vermelho de fenol (0,05%) e carboximetilcelulose (1,5 %). Os resultados foram expressos
em porcentagem calculada por: TI=X/Yx100, onde X=distância percorrida pelo vermelho de fenol e
Y=comprimento total do intestino delgado. *** p<0,01 quando comparado ao grupo tratado com água.
60
6 DISCUSSÃO
Nos estudos anteriores de nosso grupo de pesquisa com o EHAS,
verificaram-se os efeitos gastroprotetores desse extrato contra diversos agentes
nocivos no modelo de úlcera induzida por etanol em ratos (SANTIN et al, 2010).
Segundo Barioni et al (2013), foi demonstrado que o extrato possui a capacidade de
inibir a migração de neutrófilos e a secreção de mediadores quimiotáticos, estando
relacionado com a resposta imune inata. Estas evidências corroboram com o uso
popular da A. satureioides em doenças do trato gastrointestinal e em condições
inflamatórias.
A colite ulcerativa é uma doença inflamatória intestinal crônica caracterizada
por uma inflamação difusa que afeta a camada mucosa do cólon. Sua etiologia ainda
é desconhecida, porém, acredita-se que a inflamação seja decorrente de uma
complexa interação entre os componentes do sistema imune inato, fatores
ambientais e da microbiota que regula a homeostase intestinal, que se encontra
desequilibrada na colite ulcerativa (HO et al, 2009).
O tratamento convencional para a colite ulcerativa inclui drogas anti-
inflamatórias (aminossalicilatos e esteroides), imunossupressores, antibióticos e
agentes biológicos (FEUERSTEIN E CHEIFETZ, 2014). A terapia é realizada de
acordo com a gravidade dos sintomas e visam induzir e manter a remissão da
doença, bem como, a melhora da qualidade de vida do paciente (KORNBLUTH E
SACHAR, 2010). No entanto, a refratariedade e intolerância de drogas, além dos
efeitos adversos e respostas fracas ao tratamento estão relacionadas com a terapia
atual da colite ulcerativa. Devido a tais motivos, tratamentos que diminuam a
inflamação causada pela Colite Ulcerativa efetivamente e que possuam menos
efeitos colaterais são necessários. Por isso a utilização de plantas medicinais para
as doenças inflamatórias intestinais está sendo adotada mundialmente como terapia
alternativa ou complementar, pois são uma fonte para a descoberta de novas drogas
mais eficazes e seguras para o tratamento da colite ulcerativa (SALES-CAMPOS et
al, 2015).
Os efeitos benéficos do EHAS foram confirmados no modelo de colite
ulcerativa induzida por DSS em camundongos. Como esperado, a administração do
DSS em camundongos induziu sinais clínicos semelhantes aos da colite ulcerativa
61
em humanos, tais como fezes sanguinolentas, diarreia, perda de peso e
encurtamento do cólon. Em contrapartida, o tratamento com o EHAS demonstrou
melhora no quadro de colite ulcerativa induzida por DSS impedindo o encurtamento
do cólon, a perda de peso, reduzindo o IAD e os escores histopatológicos
associados à colite ulcerativa.
Em nosso estudo poderíamos utilizar como controle positivo drogas da
classe dos salicilatos tais como a sulfassalazina e a messalazina ou anti-
inflamatórios esteroidais, principalmente a betametasona. Contudo, alguns autores
observaram que estas drogas não possuem plena eficácia no modelos de colite
ulcerativa induzida por DSS (CHOI, et al, 2015), por este motivo não é usual utilizar
controle positivo neste modelo (DU et al, 2014; HUANG et al, 2013; KIESLER et al,
2015).
Além do tradicional uso popular, diversos estudos comprovam muitas atividades
biológicas para extratos de A. satureioides, incluindo seu potencial antioxidante
(RETTA et al, 2012), antimicrobiano (JORAY et al, 2013), anti-inflamatório (BARIONI
et al, 2013), gastroprotetor (SANTIN et al, 2014), inseticida (GONZALEZ et al, 2015),
anti-herpético (BIDONE et al, 2015) e tripanossomicida (BALDISERRA et al, 2014).
As propriedades funcionais de agentes naturais estão associadas a sua composição
fitoquímica, e o perfil fitoquímico do EHAS, foi anteriormente caracterizado e descrito
por SANTIN et al (2010) e BARIONI et al (2013). Nestes estudos, foi verificada a
presença dos flavonoides luteolina e quercetina, que foram confirmados em análises
em HPLC (BARIONI et al, 2013, SANTIN et al, 2014). Uma análise realizada em CG-
MS ainda demonstrou que o EHAS possui diversos esteroides e ácidos graxos
(BARIONI et al, 2013).
Um estudo realizado por Sotnikova et al (2013) demonstrou que derivados da
quercetina reduziram o processo inflamatório no tecido intestinal no modelo de colite
ulcerativa induzida por ácido acético, reduzindo os escores, bem como, a extensão
da lesão. Tais efeitos foram ocasionados pelas condições demonstradas in vitro,
onde a quercetina diminuiu a resposta inflamatória, pois inibiu a produção das
enzimas ciclo-oxigenase e lipo-oxigenase, além de seu potencial em inibir a
produção do TNF, óxido nítrico e a expressão de óxido nítrico sintetase (CHUANG et
al, 2010; ORTEGA et al, 2010).
Baseado nessas observações, a hipótese de que o EHAS pode representar uma
fonte de novos produtos vegetais para o tratamento das doenças inflamatórias
62
intestinais foi testada. Em paralelo às observações macroscópicas e achados
presentes na análise histopatológica, verificou-se que o DSS causou diversas
alterações como perda da barreira epitelial, redução do número de criptas, redução
das células de Goblet e a presença de edema submucoso. De fato, o tratamento
com o EHAS reduz significativamente tais alterações, conforme (UTRILLA et al,
2015).
O baço é um órgão imune periférico que possui uma grande variedade de
células imunes. Sabe-se que diversas infecções e doenças contribuem para o
aumento do baço (PILLARISETY et al, 2004). Zhang et al (2015) descreveram um
aumento considerável no baço de animais que sofreram a indução da Colite
Ulcerativa pelo DSS. Similarmente, no presente estudo, também foi detectado um
aumento no peso do baço e o tratamento com o EHAS preveniu tal alteração. Com
isso, pode-se sugerir que o EHAS possui efeitos benéficos sobre a resposta imune.
As principais células imunes relacionadas à inflamação são os neutrófilos, que
possuem dois tipos de granulações em seu citoplasma, sendo formados em estágios
de maturação diferentes. Os grânulos principais, denominados azurófilos, possuem
enzimas proteolíticas e proteínas bactericidas incluindo catepdina G, elastase,
mieloperoxidase (MPO) e lisozima. Os grânulos secundários, denominados
específicos, contêm lactoferrina, lisozima, colagenase e lipocalinas. Quando
ativados, os neutrófilos geram radicais livres chamados espécies reativas de
oxigênio (EROs), como o radical superóxido (O2-˙) que é convertido em peróxido de
hidrogênio (H2O2) por dismutação espontânea ou pela enzima superóxido dismutase
(SOD) e radicais hidroxilo (OH) que são formados por reações secundárias. As
EROs são extremamente reativas e quando geradas próximas às membranas
celulares, induzem o stress oxidativo e a peroxidação lipídica, que são importantes
causas de dano e destruição da membrana celular. Estes processos podem
continuar em reação em cadeia (TAKAGI et al, 2014).
O estresse oxidativo desencadeia um papel importante na patogênese das
doenças inflamatórias intestinais e ocorre quando a produção de espécies reativas
de oxigênio excede as reservas dos antioxidantes presentes no tecido (PIECHOTA-
POLANCZYK E FICHNA, 2014). No tecido inflamado, as espécies reativas de
oxigênio são produzidas pela ativação de neutrófilos e macrófagos e pode ser
estimada pela dosagem dos níveis de lipoperoxidação (LOOH). A lipoperoxidação
ocorre quando uma cadeia de ácidos graxos polinsaturados dos fosfolipídeos da
63
membrana celular é agredida por uma espécie química que possua reatividade
suficiente, como as EROs, levando a degradação da membrana. A fosfolipase
ativada pelas espécies tóxicas desintegra os fosfolipídeos, liberando ácidos graxos
não saturados resultando diversos fatores lesivos (RAJENDRAN et al, 2014).
De fato, os animais colíticos tratados com veículo exibiram uma elevação dos
níveis de LOOH e esta alteração foi acompanhada pela redução dos níveis de GSH,
uma defesa antioxidante não enzimática. Além disso, os níveis de atividade da
superóxido dismutase (SOD) foram reduzidos no cólon dos animais pertencentes ao
grupo colítico tratado com veículo. A SOD é uma enzima que catalisa a dismutação
do radical superóxido (O2-) em ambos os radicais de oxigênio normal molecular (O2)
ou peróxido de hidrogênio (H2O2). O superóxido é produzido como um subproduto
do metabolismo do oxigênio e, se não regulado, faz com que ocorram muitos tipos
de danos celulares (PIECHOTA-POLANCZYK E FICHNA, 2014).
Estes achados caracterizam uma dano oxidativo intenso no tecido colônico
provocado pela administração do DSS. Por outro lado, o tratamento com o EHAS
promoveu efeitos benéficos nos níveis de atividade da SOD e da LOOH em
amostras coletadas do grupo colítico. O tratamento com EHAS não demonstrou
nenhum efeito sobre os níveis de GSH. Porém, a redução do dano oxidativo no
tecido colônico promovida pelo EHAS foi evidenciada pela diminuição nos níveis de
LOOH.
O tratamento com o EHAS promoveu uma diminuição da infiltração de
neutrófilos no tecido colônico. Esse efeito foi indiretamente mensurado através da
uma diminuição dos níveis da atividade da MPO. Classicamente, a atividade da
MPO, é um marcador para o recrutamento de neutrófilos em condições inflamatórias.
Como esperado, a administração de DSS promoveu um considerável aumento nos
níveis de ativação da MPO no cólon, e esse aumento foi significativamente revertido
pelo tratamento com o extrato. Estes resultados reforçam o estudo de Barioni et al
(2013), que descreve que o extrato de A. satureioides reduz o influxo de neutrófilos
in vivo em exsudato coletado no modelo de bolsa de ar e no número de leucócitos
em rolamento e aderidos no mesentério estimulado pelo LPS. Por outro lado, os
autores confirmaram que o tratamento in vivo com o extrato de A. satureioides
modifica as propriedades aderentes dos neutrófilos no endotélio, o que prejudica sua
migração para o tecido. Assim, o EHAS reduziu a infiltração leucocitária no tecido
64
lesionado, podendo-se confirmar, que os efeitos observados por Barioni et al. (2013)
também estão envolvidos nas ações anti-inflamatórias ocasionadas pelo EHAS.
Os parâmetros de estresse oxidativo no fígado foram similares aos observados
na mucosa intestinal. Conforme descrito por Toblli et al. (2015), indicativos de dano
oxidativo também podem ser encontrado no tecido hepático de animais submetidos
ao modelo de colite induzida por DSS. Corroborando esse achado, neste estudo foi
constatado um aumento nos níveis hepáticos de LOOH e uma diminuição nos níveis
de GSH no fígado de animais do grupo colítico tratado com veículo. Como
observado no cólon, o tratamento oral com EHAS reverteu o aumento nos níveis da
LOOH, porém não evitou a depleção do antioxidante GSH no fígado. Diferentemente
do cólon, a administração de DSS não promoveu alterações na atividade da SOD no
tecido hepático. Entretanto, o EHAS aumentou significativamente os níveis da
atividade da SOD no fígado e promoveu efeitos benéficos nos hepatócitos dos
animais pertencentes ao grupo colítico, o que foi confirmado pela normalização dos
níveis plasmáticos de TGO.
No que se refere à experiência de motilidade intestinal, administração do EHAS
na mesma dose que reduziu a inflamação induzida pelo DSS, que é de 100 mg/kg,
não demonstrou alteração na taxa de trânsito intestinal. Este resultado torna-se
peculiar, pois indica que os efeitos ocasionados pelo tratamento com EHAS, por
exemplo, a redução de diarreia, não está relacionada com uma redução da
motilidade intestinal.
O tratamento com EHAS demonstrou atividade anti-inflamatória intestinal no
modelo de colite induzida por DSS, através da redução da migração de neutrófilos e,
consequentemente, do dano oxidativo. Juntos, estes resultados colocam Achyrocline
satureioides como uma promissora fonte de metabolitos que podem ser utilizados no
tratamento das doenças inflamatórias intestinais.
65
7 CONCLUSÃO
Conforme anteriormente descrito nos resultados obtidos, para avaliar o efeito
anti-inflamatório intestinal do EHAS, foi utilizado o modelo de Colite Ulcerativa
induzida por DSS conforme descrito por Utrilla (2015), que mimetiza a fase
aguda desta doença em humanos.
Com base neste modelo, diversos sinais clínicos foram analisados e, em
conjunto, quantificados conforme o sistema de escore denominado Índice de
Atividade da Doença (IAD), com o índice 6 (correspondente à diarreia grave com
intenso sangramento anal) e 6,3% de perda de peso em relação ao primeiro dia
do experimento. Paralelamente, os animais tratados com 100 mg/kg de EHAS,
uma vez ao dia, durante sete dias, demonstraram escore de IAD
significativamente menor do que o classificado no grupo colítico tratado com
veículo, alcançando um valor aproximado de 3 ± 0,9 e 1,4% de perda de peso
em relação ao primeiro dia experimental.
Assim, pode-se afirmar que o EHAS apresentou atividade anti-inflamatória no
modelo de colite ulcerativa induzida por DSS em camundongos na dose de
100mg/kg. Além disso, conforme observado, a A. satureioides reduziu
significativamente os efeitos causados pelo DSS, tais como, perda de peso, fezes
diarreicas e o encurtamento de cólon, além de ter demonstrado melhora nos índices
de avaliação de doença. Os parâmetros histopatológicos observados na Colite
Ulcerativa também demostraram melhora no grupo tratado com o EHAS. As
atividades antioxidantes do extrato em conjunto com a ação anti-inflamatória, em
especial na redução da migração leucocitária, estão envolvidas nos efeitos
observados.
Em conjunto, os dados demonstrados no presente trabalho, sem a pretensão
de esgotar as pesquisas sobre o tema, respondem aos objetivos gerais propostos
inicialmente, sugerindo que a Achyrocline satureioides é uma promissora fonte de
fitocompostos que podem ser utilizados no tratamento de doenças inflamatórias
intestinais.
66
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