Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA
DE Matayba elaeagnoides RADLK.
MICHEL THOMAZ DE SOUZA
Itajaí - 2006
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
MICHEL THOMAZ DE SOUZA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA
DE
Matayba elaeagnoides RADLK.
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero
Itajaí, Novembro de 2006.
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA
DE Matayba elaeagnoides RADLK.
Michel Thomaz de Souza
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Rivaldo Niero, Doutor
Orientador
__________________________________________________________
Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
_____________________________________________________
Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI)
Presidente
_____________________
Dr. Brás Heleno de Oliveira (UFPR)
Membro
______________________________________
Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI)
Membro
Itajaí (SC), 13, novembro de 2006
Dedicatória
Aos meus pais, que sempre me apoiaram em todos os momentos que precisei e
continuam me apoiando até hoje
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Rivaldo Niero, pela orientação, amizade, confiança e estímulo para prosseguir sempre Aos colegas e amigos, Sarai, Lisi, Marina, Cláudia, Micheli, Jordana, Bruna, Viviane, André, Marcelo, pela parceria e momentos de descontração Ao Prof. Dr. Franco Delle Monache e a Profa. Dra. Cleusa Conceição da Silva pela grande colaboração e pela obtenção dos espectros de RMN de 1H e 13C Aos professores deste curso de Pós-Graduação pelos ensinamentos passados À Roselia pela ajuda prestada quando solicitada À Universidade do Contestado Campus Caçador pelo apoio financeiro Ao botânico Prof. Dr. Ademir Reis pela identificação da espécie em estudo Ao Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz e ao laboratório de microbiologia da UNIVALI pelos ensaios e atividades microbiológicos realizados A Profa. Iriane Eger pelos testes antiparasitários realizados As equipes da Profa. Fátima de Campos Buzzi, da Profa. Dra. Márcia Maria de Souza do laboratório de Farmacologia do curso de Farmácia da UNIVALI, pelos ensaios realizados À Profa. Dra. Susana Zacchino e o laboratório de microbiologia da faculdade de Ciências Bioquímicas e Farmacêuticas da Universidade Nacional de Rosário (Rosário, Argentina) pelos ensaios de atividade antifúngica realizados Aos meus irmãos Nelvio Junior e Darlan pela grande e eterna amizade A minha namorada e futura esposa Gabi, pelo incentivo, companheirismo, amizade, carinho, amor e por tudo A Dona Aurora, Dona Geni, Luci e Madureira pelo grande apoio e incentivo Aos grandes amigos Luiz Armando e Luciana que sempre me apoiaram e deram força para chegar até aqui Aos familiares, Vô Dico, Vó Irene, Vô João, Padrinho Zini, Madrinha Mara, Tio Darlan e Tia Rose pelo incentivo sempre prestado durante todos estes anos Aos meus pais, pela vida, dedicação, amor, apoio e incentivo prestado durante todos estes anos e por ser meu admirável exemplo a seguir.
EPÍGRAFE
Contrariando o ditado popular que nada se cria tudo se copia, posso dizer, que
a natureza cria e dela se copia.
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Matayba elaeagnoides RADLK.
Michel Thomaz de Souza
Novembro/2006 Orientador: Rivaldo Niero, Doutor. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas. Número de Páginas: 85. O presente trabalho mostra o estudo fitoquímico das cascas de Matayba elaeagnoides Radlk (Sapindaceae), bem como a avaliação do potencial biológico dos extratos, frações e de uma substância isolada desta espécie. Da fração de hexano foram isolados, por métodos cromatográficos, uma mistura de triterpenos composta de lupeol, α-amirina, β-amirina e β-sitosterol. Além disso, da fração clorofórmica foram isoladas as substâncias escopoletina, umbeliferona, 3β-O-D-glicopiranosil-sitosterol e betulina. As estruturas foram identificadas com o uso de técnicas espectroscópicas de IV, RMN 1H e 13C, além de determinações do ponto de fusão e comparações com dados da literatura. Estas substâncias foram relatadas pela primeira vez na espécie estudada. Os extratos hidroalcóolico e metanólico, assim como suas frações e a betulina, foram submetidos a testes biológicos preliminares com a finalidade de avaliar o seu efeito antibacteriano e antinociceptivo em diferentes modelos experimentais. Quando analisado frente a microorganismos patogênicos, todos os extratos e frações apresentaram atividade contra a bactéria Gram positiva S. aureus. Por outro lado, apenas a fração de clorofórmio foi ativa para o fungo M. gypseum na concentração de 125 µg/mL. Os extratos e frações também mostraram promissor potencial antinociceptivo bem como uma substância isolada, identificada como betulina. Este composto foi cerca de sete vezes mais potente do que algumas substâncias utilizadas terapeuticamente, aspirina e paracetamol. Quando analisado frente ao teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (3-10 mg/Kg, i.p.), a betulina apresentou um efeito dose-dependente com um valor calculado de DI50 de 7,74 (6,53 – 9,17) mg/Kg ou DI50 de 17,5 (14,7-20,5) µmol/Kg, e uma inibição máxima (IM) de 58,33% em relação ao grupo controle. Da mesma forma, quando no teste da formalina (3-10 mg/Kg, i.p.), este composto foi capaz de inibir de forma parcial a nocicepção de origem neurogênica, com inibição de 40,8%. Por outro lado, foi mais eficaz em reduzir a nocicepção inflamatória com valores calculados de DI50 e inibição máxima de 8,32 (7,83 – 8,84) mg/Kg ou DI50 de 18,79 (17,7-19,9) µmol/Kg e 64,39%, respectivamente. Resultados estes, que mostram a atividade antinociceptiva da betulina e antimicrobiana dos extratos e frações da planta estudada. Palavras-chave: Matayba elaeagnoides, Efeito Antinociceptivo, triterpenos, efeito antimicrobiano
PHYTOCHEMICAL STUDY AND EVALUATION OF THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF Matayba elaeagnoides RADLK.
Michel Thomaz de Souza
November/2006 Supervisor: Rivaldo Niero, Doctor. Area of Specialization: Natural Products and Bioactive Substances. Number of pages: 85. This work shows the phytochemical study of Matayba elaeagnoides Radlk (Sapindaceae) barks, and the evaluation of the biological potential of the extracts and fractions, as well as a compound isolated from this species. Using chromatographic methods, a mixture of triterpenes known as lupeol, α-amirin, β-amirin, and β-sitosterol, was isolated from the hexane fraction. Scopoletin, umbelifferone, 3β-O-D-glicopiranosyl-sitosterol and betulin were also isolated from the chloroform fraction. The structures were identified using the spectroscopic techniques of IV, RMN 1H and 13C, and the melting point was determined, plus the use of comparison with data in the literature. These substances are reported for the first time in the species studied. The hydroalcoholic and methanolic extracts, as well as their fractions, and betulin, were submitted to preliminary biological tests, in order to evaluate their antibacterial and antinociceptive effects in different experimental models. When analyzed against pathogenic microorganisms, all the extracts and fractions showed activity against the Gran positive bacteria S. aureus. On the other hand, only the chloroform fraction was active against the M. gypseun fungi at a concentration of 125 µg/mL. The extracts and fractions also showed promising antinociceptive effects, as did an isolated substance, identified as betulin. This compound was about 7-fold more active than two clinically used drugs: aspirin and paracetamol. When analyzed in the writhing test (3-10 mg/Kg, i.p.), betulin showed a dose-dependent effect, with a calculated ID50 value of 7.74 (6.53 – 9.17) mg/kg or DI50 of 17,5 (14,7-20,5) µmol/Kg, and a maximal inhibition (MI) of 58.33% in relation to the control group. Likewise, when analyzed in the formalin test (3-10 mg/kg, i.p.), this compound partially inhibited nociception of neurogenic origin, with 40.8 % inhibition. On the other hand, it was more effective in reducing inflammatory nociception, with calculated ID50 values and maximal inhibition of 8.32 (7.83 – 8.84) mg/Kg or ID50 of 18,79 (17,7-19,9) µmol/Kg and 64.39%, respectively. These results show that the extract, fractions and betulin exhibit important antibacterial and antinociceptive activity. Key words: Matayba elaeagnoides, Antinociception, triterpenes, Antimicrobial activity
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Partes aéreas de Matayba elaeagnoides Radlk................................. 33 Figura 2 Operações realizadas no processo de fracionamento e purificação
dos compostos....................................................................................
37 Figura 3 Espectro de RMN1H da mistura de Lupeol, α-amiria e β-amirina
(CDCl3, 400MHz)................................................................................
47 Figura 4 Espectro de RMN1H (400 MHz; Acetona D6) da
Escopoletina.......................................................................................
52 Figura 5 Espectro de RMN13C (100 MHz; Piridina D5) da substância
Escopoletina.......................................................................................
53 Figura 6 Espectro RMN-1H (400Mhz; Acetona-D6) da Umbeliferona............... 55 Figura 7 Espectro de RMN1H de 3-O-β-glicopiranosil-sitosterol...................... 57 Figura 8 Espectro de RMN-13C (C5D5N, 100 MHz), de 3-O-β-glicopiranosil-
sitosterol (ME-7)..................................................................................
59 Figura 9 Espectro de IV da substância ME-8 (Betulina)................................... 60 Figura 10 Espectro de RMN1H (400 MHz, CDCl3), de ME-8 na região de 2 a 5
ppm.....................................................................................................
65 Figura 11 Espectro de RMN1H (400 MHz, CDCl3), de ME-8 na região de 0 a
2,5 ppm...............................................................................................
66 Figura 12 Espectro de RMN13C (100 Mhz, CDCl3) de ME-8.............................. 67 Figura 13 Placas do teste Bioautográfico........................................................... 68 Figura 14 Efeitos da betulina (3mg/Kg – 10mg/Kg) no teste de contorções
induzidas por ácido acético i.p............................................................
73 Figura 15 Efeito antinociceptivo da Betulina (3-10 mg/Kg) teste da formalina
pela administração i.p. A: primeira fase (0-5 min.) e B: segunda fase (20-30 min.)…………………………………………………………..
75 Figura 16 Efeito da atividade antiinflamatória da Betulina na formação de
edema no teste da formalina pela administração i.p..........................
75
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Rendimento das frações obtidas no particionamento do Extrato metanólico em relação a planta seca...................................................
45
Tabela 2 Dados espectrais em RMN-1H e RMN-13C, do 3β-O-D-glicopiranosil-sitosterol na literatura (C5D5N, 200 MHz) e dos valores encontrados para substância ME-7 ..........................................................................
58 Tabela 3 Dados espectrais em RMN-1H e RMN-13C, da betulina na literatura
em comparação aos valores encontrados para substância ME-8........
62 Tabela 4 Análise da atividade antimicrobiana dos extratos e frações de M.
elaeagnoides.........................................................................................
70 Tabela 5 Análise da atividade antifúngica dos extratos e das frações de M.
elaeagnoides......................................................................................... 71
Tabela 6 Atividade antinociceptiva comparativa entre extratos brutos e frações das cascas de M. elaeagnoides com medicamentos utilizados na clínica, no modelo das contorções abdominais induzidas por acido acético (0,6%) (10 mg/kg, i. p.).............................................................
72 Tabela 7 Efeito antinociceptivo entre a betulina, aspirina e paracetamol no
modelo da formalina, i.p........................................................................
74 Tabela 8 Triagem inicial de frações e extratos com atividade leishmanicida e
tripanocida in vitro. Os produtos que causaram percentuais de inibição acima de 40% na concentração de 0,1mg/ml foram considerados ativos..............................................................................
76
LISTA DE ABREVIATURAS
AE – Acetato de Etila
ATCC – American Type Culture Collection
CC – Cromatografia em Coluna
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CEME – Central de Medicamentos
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Co-CCD – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
DI50 – Dose Inibitória 50
DMSO – Dimetilsulfóxido
EH – Extrato Hidroalcoólico
EM – Espectrometria de Massa
i.p. – Intra-peritonial
IV – Infra-Vermelho
CIM – Concentração Inibitória Mínima
NO – Oxído Nítrico
OMS – Organização Mundial da Saúde
P&D – Pesquisa e Desenvolvimento
P.F. – Ponto de Fusão
PGE2 – Prostaglandina E2
PPPM – Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais
Rf – Fator de Retenção
RMN-13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
RMN-1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
SC – Santa Catarina
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral α
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina
UNIVALI – Universidade do Vale do Itajaí
UV – Ultra-Violeta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................13
2 OBJETIVOS.........................................................................................16
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................16
2.2 Objetivos Específicos....................................................................................16
3 EMBASAMENTO TEÓRICO..........................................................................17
3.1 Cronologia de investigação fitoquímica....................................................28
3.2 Família SAPINDACEAE .................................................................................29
3.3 Matayba elaeagnoides Radlk .......................................................................31
4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................34
4.1 Análise fitoquímica ........................................................................................34
4.1.1 Material vegetal................................................................................................34
4.1.2 Preparação do extrato metanólico bruto e hidroalcoólico..........................34
4.1.3 Preparação das frações..................................................................................34
4.1.4 Análise cromatográfica..................................................................................35
4.1.5 Separação e purificação dos compostos......................................................35
4.1.6 Identificação e elucidação estrutural dos compostos isolados.................36
4.2 Análise Biológica...............................................................................................38
4.2.1 Atividade antimicrobiana...............................................................................38
4.2.1.1 Material microbiológico...............................................................................38
4.2.1.2 Método Bioautográfico................................................................................38
4.2.1.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima....................................39
4.2.1.4 Preparo e ajuste da densidade dos inóculo..............................................39
4.2.1.5 Atividade Antifúngica...................................................................................40
4.2.2 Atividade antinociceptiva...............................................................................40
4.2.2.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético............41
4.2.2.2 Modelo da dor induzida por formalina.......................................................41
4.2.3 Atividade antiparasitária in vitro....................................................................42
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................44
5.1 Resultados fitoquímicos ...............................................................................44
5.1.1 Obtenção das frações.....................................................................................44
5.1.2 Fração Hexano................................................................................................45
5.1.3 Fração Clorofórmio .........................................................................................46
5.1.3.1 Reavaliação cromatográfica da fração clorofórmio .................................59
5.1.5 Fração Acetato de Etila (AE) .........................................................................64
5.1.4 Fração Butanólica...........................................................................................64
5.2 Resultados Biológicos.......................................................................................68
5.2.1 Atividade Antimicrobiana ..............................................................................68
5.2.1.2 Teste Bioautográfico....................................................................................68
5.2.1.3 Resultados da Concentração Inibitória Mínima........................................69
5.2.1.4 Resultados da atividade antifúngica .........................................................70
5.3 Atividade antinociceptiva: Método do ácido acético..............................71
5.4 Modelo de dor induzida pela formalina .....................................................73
5.5 Atividade antiparasitaria in vitro .................................................................75
6. CONCLUSÕES...................................................................................77
REFERÊNCIAS.....................................................................................................78
13
1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas com fins medicinais, no tratamento, cura e prevenção
de doenças, é uma das mais antigas formas de pratica medicinal da humanidade.
Mantém-se até os dias de hoje, sendo utilizadas com um significativo papel para
medicina, tanto mantendo a saúde como melhorando a qualidade de vida dos
homens (LEE, 2004; BALUNAS, 2005; LEITE, 2005; TRIPATHI et al., 2005; VEIGA
JUNIOR, 2005).
A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas talvez
tenham sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais
(BARREIRO, 2006). Atualmente tem havido um forte resgate histórico do
conhecimento das civilizações, presente nos diversos setores da sociedade, seja
próximo à população promovendo a saúde e resgatando as bases folclóricas ou
ainda no meio científico sendo utilizada como ponto de partida para o
desenvolvimento e obtenção de novos fármacos (FAROMBI, 2003; LEE, 2004;
SIMÕES et al., 2004; VUORELLA et al., 2004; NAIR et al., 2005).
O grande consumo de plantas medicinais ou de produtos fitoterápicos, se
deve em parte, aos pacientes que querem se automedicar com a finalidade de curar
suas doenças, com a ingênua visão de que o que é natural só faz bem para a saúde
e com a noção equivocada de que os medicamentos fitoterápicos, são
completamente inofensivos, sem reconhecer o real valor da medicina tradicional, que
acaba sendo utilizada de maneira distorcida (BORELLI, 2006).
A fitoterapia constitui outra forma de terapia medicinal que vem crescendo
notadamente nestes últimos anos, ao ponto do mercado mundial gira, em torno de
22 bilhões de dólares ao ano, atingindo US$ 8,5 bilhões na Europa, US$ 6,6 bilhões
nos Estados Unidos e R$ 400 milhões no Brasil. Estima-se que a taxa de
crescimento é da ordem de 15% contra 4% dos medicamentos sintéticos, tendendo
a aumentar, nos próximos 5 anos (YUNES et al, 2001; PINTO et al., 2002; ASSAD &
FERRO, 2005; RODRIGUES, 2005; SIANI & MICHILES, 2005; BORELLI, 2006).
Estudos químicos e farmacológicos envolvendo plantas medicinais visam obter
novas substâncias com propriedades terapêuticas, assim, em pesquisas recentes de
companhias farmacêuticas para algumas doenças complexas, os produtos naturais
14
mostram ser de extremo valor na busca de novos produtos químicos (CECHINEL
FILHO; YUNES, 1998; CALIXTO, 2005).
O interesse pelos medicamentos de origem vegetal, motivou a indústria
farmacêutica, em parte, pela descoberta de quimioterápicos eficazes como
vimblastina, vincristina, podofilotoxina, etoposídeo, teniposídeo, taxol, camptotecina
e derivados. Outro fator é a busca de substâncias com estruturas moleculares
complexas, praticamente impossíveis de serem obtidas por um processo sintético de
custo acessível. Isto acabou estimulando a pesquisa pré-clinica e clínica das nossas
plantas medicinais, fortalecendo a confiabilidade na eficácia e segurança de uso
destes produtos (MONTANARI, 2001; PINTO et al., 2002; LEE, 2004; BRANDÃO,
2005). Atualmente, cerca de, 25-30% de todos os princípios ativos utilizados na
terapêutica são extraídos de produtos naturais, na maioria das vezes oriundos de
plantas superiores, destes 18% de fungos, 5% de bactérias e 3% de origem animal
(vertebrados). Contudo, temos que considerar a grande importância dos produtos
naturais de origem marinha e de microorganismos. Além disto, grande parte dos
medicamentos mais prescritos até hoje são baseadas em produtos naturais de
plantas (PINTO et al., 2002; VUORELLA et al., 2004; ASSAD, 2005; CALIXTO,
2005; BARREIRO, 2006).
Depois da descoberta de alguns medicamentos, que geram bilhões de
dólares, é possível entender à corrida entre algumas indústrias transnacionais pela
busca de novas substâncias bioativas. Esta busca foi intensificada nos anos 90,
especialmente nas florestas tropicais onde se concentra grande parte da
biodiversidade e especialmente no Brasil, onde a grande maioria das espécies
continua sem qualquer estudo químico ou biológico (PINTO et al., 2002).
Segundo Truiti e cols. (2005), aproximadamente apenas 20% das plantas de
todo o mundo tiveram seus extratos submetidos a testes farmacológicos ou
biológicos. E para piorar a situação, o fantasma da extinção das espécies torna-se
cada vez mais presente e ameaçador, estimando-se que mil espécies sejam extintas
por ano no planeta. Muitas destas espécies ainda nem foram descritas, catalogadas
e estudadas. Impacto maior é visto nas florestas tropicais, que cobrem cerca de 7%
da superfície terrestre do planeta e abriga cerca de 50% de todas as espécies
existentes (MEDEIROS, 2003).
De acordo com Assad e Ferro (2005), é estimado que no mundo, pelo menos
35 mil espécies de plantas possuem propriedades medicinais, mas apenas 5.000
15
foram estudadas até agora, a fim se detalhar as suas aplicações medicinais. Sendo
que no Brasil, pelo menos 300 plantas medicinais fazem parte do arsenal terapêutico
da população.
Devido a tais constatações, os produtos naturais e derivados foram e
continuam sendo notoriamente de importância crucial em determinados setores da
sociedade moderna, mesmo considerando-se o grande número de produtos
produzidos por síntese (MONTANARI, 2001). Segundo a Organização Mundial de
Saúde (OMS) 65-80% da população dos países em desenvolvimento, e entre estes
o Brasil, dependem das plantas medicinais como única forma de acesso aos
cuidados básicos de saúde (PINTO et al., 2002; ASSAD, 2005; BUENO et al, 2005;
CALIXTO, 2005; TRIPATHI et al., 2005; VEIGA JUNIOR et al., 2005). Além disso,
vê-se um interesse crescente na utilização e pesquisa de plantas medicinais,
objetivando-se fins terapêuticos, aliadas à boa aceitabilidade destes produtos no
mercado farmacêutico e as altas cifras que circundam a utilização de
fitomedicamentos, observada na última década (NOLDIN, 2006).
Neste contexto, podemos destacar que são várias as espécies com utilização
popular para fins farmacológicos. Dentre estas espécies é destacada a Matayba
elaeagnoides Radlk, uma planta encontrada no Brasil e conhecida popularmente
como camboatá, camboatã, cragoatã-branco, cuvantã, craguatã, pau-de-pombo,
camboatá-branco, pau-crioulo e pau-de-espeto. Esta planta é utilizada popularmente
como antiinflamatória, analgésica e no combate ao câncer de fígado (LORENZI,
2000; GUARIM NETO, 2000; RIBEIRO, 2004). No entanto, até o momento, ainda
não eram descritos estudos experimentais no intuito de confirmar os seus
constituintes químicos e relaciona-los com as suas possíveis atividades
farmacológicas e biológicas.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Isolar e identificar os constituintes químicos presentes nas cascas de M.
elaeagnoides Radlk, bem como analisar suas possíveis atividades antinociceptiva e
antimicrobiana em distintos modelos experimentais.
2.2 Objetivos Específicos:
- Isolar através de métodos cromatográficos convencionais, os constituintes
químicos majoritários presentes a partir das frações semipurificados.
- Identificar por métodos espectroscópicos usuais (IV, RMN-1H, RMN-13C), os
constituintes químicos isolados, com auxílio da determinação do ponto de fusão e
comparação dos dados encontrados com a literatura.
- Avaliar as possíveis atividades biológicas (analgésica, antibacteriana e
antifúngica) dos extratos, frações e substâncias isoladas, em diferentes modelos
experimentais.
- Comparar os efeitos biológicos encontrados com fármacos utilizados clinicamente.
17
3 EMBASAMENTO TEÓRICO
As plantas são utilizadas desde os primórdios da civilização para tratamento e
cura de enfermidades, o que propiciou uma das bases mais importantes para o
nascimento da medicina (NOLDIN, 2006). Esta medicina tradicional, que é praticada
por centenas de anos por uma grande parcela da população do Brasil e de todo o
mundo, inicialmente, era baseada na utilização de plantas cruas ou na forma de
tinturas, extratos, chás, pós, na alimentação sólida ou com outras formas de uso.
Mais recentemente na história, o uso de plantas medicinais tem envolvido o
isolamento de compostos ativos responsáveis pelas atividades farmacológicas
baseando-se no conhecimento adquirido através de diversas culturas, como por
exemplo, a indígena (BALUNAS, 2005; BUENO et al., 2005; LEITE, 2005; LIMA et
al., 2005; BORELLI, 2006).
A natureza, de forma geral, tem produzido e continuamente providenciado
para o homem uma ampla variedade de substâncias orgânicas, estas conhecidas e
consideradas farmacologicamente ativas, já foram e continuam sendo valiosos
componentes da alimentação, da mesma maneira como cosméticos, corantes e na
medicina. Tornaram-se, nos dias de hoje indispensáveis para a cura de diversas
doenças tanto para a descoberta de novas substâncias úteis na área farmacêutica.
Desta forma, o Reino Vegetal se mostra responsável pela maior parcela da
diversidade química conhecida e registrada na literatura, tendo contribuído de forma
bastante significativa na pesquisa e no descobrimento de novas drogas de origem
natural, e no fornecimento substancias de grande utilidade ao tratamento de
doenças que acometem aos seres vivos. Entretanto, também se deve destacar, os
produtos químicos naturais de origem marinha, que tem sido o foco do
descobrimento de novos produtos de interesse farmacológicos e químicos
(MONTANARI, 2001; PROKSCH et al., 2003; NAIR et al., 2005; TRIPATHI et al.,
2005; BARREIRO, 2006).
Entre as substâncias interessantes isoladas estão algumas de grupos
bastante diversificados como os alcalóides da papoula (Papaver somniferum), as
cumarinas extraídas da angélica (Angelica archangelica), a salicilina extraída de
Salix Alba, a quinina extraída das cascas secas de espécies de Chinchona, os
alcalóides isolados de Catharantus roseus e de Camptotheca acuminata, o taxol
isolado de Taxus brevifolia, a escopolamina de Datura fastuosa, e a capsaicina de
18
Capsicum frutescens. De fontes naturais também são retiradas substâncias básicas
que podem ser ligeiramente modificados para tornarem-se mais eficazes ou menos
tóxicos, exemplo disso são as numerosas variações da molécula da morfina. Além
disto, outro papel desempenhado pelos produtos naturais é a sua utilidade como
protótipos ou modelos para medicamentos sintéticos, onde a natureza fornece
muitos modelos moleculares que fundamentam estudos de relação estrutura-
atividade e inspiram o desenvolvimento da síntese orgânica clássica (ROBBERS,
1997; LEE, 2004; VEIGA JUNIOR et al., 2005; BARREIRO, 2006; BORELLI, 2006).
O uso dos recursos vegetais está fortemente presente na cultura popular que
é transmitida de pais para filhos no decorrer da existência humana. Este
conhecimento é encontrado junto a populações tradicionais e/ou contemporâneas, e
pelo que se tem observado, tende à redução ou mesmo ao desaparecimento,
quando sofre a ação inexorável da modernidade. Neste sentido, são necessários
esforços individuais e governamentais para preservar esse conhecimento,
especialmente aqueles derivados da medicina tradicional e do conhecimento
indígena que está desaparecendo (DIEGUES, 1996; CALIXTO, 2005).
As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais
contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos
vegetais, prescritos, pelos efeitos medicinais que produzem, apesar de não terem
seus constituintes químicos conhecidos (MACIEL et al., 2002). Entretanto, devemos
lembrar, que as plantas medicinais podem ter variabilidade química devido à
influência da região onde esta planta é encontrada, sofrendo alterações
influenciadas pela temperatura, pela umidade relativa, tempo de exposição ao sol,
regime de ventos e tipo de solo, e que ainda, diferentes órgãos de uma mesma
planta podem apresentar diferentes constituintes químicos (YARIWAKE, et al., 2005;
ROSSATO et al., 2006). Além de todos estes fatores, deve-se levar em
consideração a variabilidade genética das plantas, que é expressa através dos
chamados quimiotipos (QT). Segundo alguns autores, QT é o termo aplicado a
plantas do mesmo gênero e espécie, com a mesma aparência externa, mas que
diferem, às vezes consideravelmente, em sua composição química. Esses QT
usualmente ocorrem naturalmente em plantas silvestres e podem resultar
parcialmente de polinização cruzada (ROSSATO et al., 2006).
Está comprovado hoje, que grande parte da população mundial,
principalmente aquelas de paises em desenvolvimento usam como medicamentos
19
extratos ou porções oriundas de plantas (MONTANARI, 2001; FAROMBI, 2003). Em
muitos casos, o conhecimento sobre plantas medicinais simboliza diversas vezes o
único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. Várias plantas
medicinais são comumente utilizadas para o tratamento de diversas doenças na
Índia, como relata Muthu (2005), e são consideradas muitas vantagens neste
tratamento em relação ao uso de substâncias convencionais conhecidas, como por
exemplo, a menor causa de efeitos adversos. Esta menor incidência de efeitos
adversos, com a utilização de preparações com plantas, comparada com a medicina
farmacêutica moderna, aliada aos custos mais baixos, tem encorajado cada vez
mais o consumo destas preparações para melhoria da saúde da população, e
diversas instituições estão considerando as plantas medicinais, como uma
alternativa ao uso das substâncias sintéticas (NAIR et al., 2005). Isto também
acontece no continente africano, que possui uma das maiores biodiversidades de
todo o mundo, onde diversas espécies de plantas são utilizadas na medicina
tradicional na profilaxia e na cura de diversas doenças (FAROMBI, 2003).
Nas grandes cidades brasileiras, as plantas medicinais são comercializadas
em feiras livres, mercados populares e ainda encontradas em quintais residenciais, e
continuam sendo utilizadas com finalidade terapêutica. Dessa forma, usuários de
plantas medicinais de todo o mundo, mantém em voga a prática do consumo de
fitoterápicos, tornando válidas informações terapêuticas que foram sendo
acumuladas durante séculos (MACIEL et al., 2002).
Segundo Jacomassi (1994), e Barreiro (2006), é admirável a perpetuação do
conjunto de conhecimentos acumulados que englobam a domesticação e a cultura
das plantas, salientando que no Brasil os povos indígenas, antes mesmo do
descobrimento, utilizavam espécies medicinais na cura de doenças. Este profundo
conhecimento do arsenal químico da natureza, pelos povos primitivos e pelos
indígenas pode ser considerado fator fundamental para descobrimento de
substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo. Um exemplo disto, é a
pesquisa desenvolvida por Mendonça et al., (2005), onde a partir da biodiversidade
e do conhecimento popular, verificou que de óleos essenciais de diversas plantas
medicinais são utilizados para repelir mosquitos, na tentativa de encontrar um
produto com atividade larvicida contra o mosquito Aedes aegypti.
A cultura popular desperta o interesse de pesquisadores em estudos
envolvendo áreas multidisciplinares, assim como da indústria farmacêutica que
20
motivada em parte, pela descoberta de quimioterápicos eficazes, reativou o
interesse pelos medicamentos de origem vegetal, principalmente pela busca de
substâncias com estruturas moleculares complexas, que são formadas pelas plantas
através de um mecanismo evolutivo que levou um período de milhões de anos, e
que são praticamente impossíveis de serem obtidas por um processo sintético de
custo racional (MONTANARI, 2001; MACIEL et al., 2002; CALIXTO, 2005; NOLDIN,
2006).
A variedade e a complexidade das micromoléculas que constituem os
metabólitos secundários de plantas e organismos marinhos ainda é inalcançável por
métodos laboratoriais, e isto seria a conseqüência direta destes milhões de anos de
evolução, atingindo um refinamento elevado de formas de proteção contra a
resistência às intempéries do clima, poluição e predadores (BARREIRO, 2006).
Além do fator econômico e do avanço tecnológico que as plantas com
potencial terapêutico possibilitam, há que se destacar a importância para segurança
nacional e preservação dos ecossistemas onde existam tais espécies (DIAS, 2004).
Agravado pela disseminação, o uso de determinadas plantas consideradas
medicinais tem resultado em intenso e incontrolado extrativismo, e esta exploração,
está colocando em risco de extinção inúmeras espécies nativas de plantas e de
animais, causando distúrbios ecológicos e o desaparecimento de espécies, cujo
potencial farmacológico e químico não pôde sequer ser estudado (SIMÕES et al.,
2004; PINTO et al., 2002; CALIXTO, 2005). A lista oficial da flora brasileira
ameaçada de extinção, editada em 1992 (Portaria IBAMA 037-N), relacionava um
total de 107 espécies. Entretanto, o grau de precisão desta lista é bastante
questionável, principalmente pela falta de atualização, o que ilustra mais uma vez a
carência de conhecimento sobre nossa diversidade (MEDEIROS, 2003).
Segundo Pinto et al. (2002), em levantamento recente foram identificadas
áreas do globo terrestre caracterizadas por excepcional concentração de espécies
endêmicas e elevada degradação de habitat. Essas áreas denominadas de
“hotspots”, estão sendo exploradas de forma irracional pelo homem e necessitam de
ações urgentes a fim de se evitar a extinção em massa das espécies nelas
existentes em um futuro próximo. Dos 25 “hotspots” identificados no mundo, o
Cerrado e a Mata Atlântica foram reconhecidos como áreas de maior risco de
extinção, o que reforça a importância de uma massa crítica consolidada de
pesquisadores que estudem estes ecossistemas, visando não somente sua
21
preservação e o conhecimento do seu perfil químico, mas também a descoberta de
novas substâncias úteis ao homem.
Os países da América Latina possuem uma grande parte da biodiversidade
de todo o mundo, sendo que, podemos considerar ainda que o Brasil é o país que
apresenta a maior diversidade genética vegetal do planeta, distribuída em seis
biomas distintos, com cerca de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado
de 350.000 e 550.000 espécies, possuindo sozinho cerca de 20-22% de todas as
plantas e microorganismos existentes no mundo (SANDES, 2000; PINTO et al.,
2002; ASSAD, 2005; CALIXTO, 2005; RODRIGUES, 2005; NOLDIN, 2006).
Uma grande variedade de plantas continua originando diversos compostos
medicinais e tem um papel importante na manutenção da saúde humana desde a
antiguidade, isto através, do isolamento, da purificação e da caracterização de
compostos farmacologicamente ativos. Com o desenvolvimento de novas técnicas
espectroscópicas os químicos orgânicos têm conseguido elucidar rapidamente
estruturas moleculares complexas de constituintes naturais, até há pouco tempo
difíceis de serem identificados, e tem utilizado estas estruturas para dar origem a
novas moléculas. Sendo que a cada momento são relatadas na literatura novas
moléculas, algumas de relevante ação farmacológica (CECHINEL FILHO; YUNES,
1998; FAROMBI, 2003; MACKOWIAK, 2003; BALUNAS, 2005).
Segundo Siani e Michiles (2005), acima de 25% dos fármacos hoje prescritos
são derivados ou foram inspirados em substâncias derivadas de plantas superiores,
e cerca de 11% dos 252 fármacos considerados essenciais pela OMS originaram
exclusivamente destas plantas. Os maiores impactos no setor de “fitofármacos” são
confirmados nas drogas antitumorais, onde recente prospecção revelou que 61%
das 877 pequenas moléculas introduzidas como fármacos foram derivadas ou
inspiradas em produtos naturais. Em certas áreas terapêuticas, estes valores sobem
para 78% (antibacterianos) e 74% (anticâncer).
Dentre os estudos de desenvolvimento da química de produtos naturais, a
quimiotaxonomia é uma importante ferramenta, apontando as espécies em que há
maior probabilidade de encontrar determinados compostos. Esse conhecimento,
somado a etnofarmacologia, tem permitido a descoberta de novos fármacos de
origem natural, que têm sido utilizados sem alterações estruturais ou como modelo
para síntese a partir da molécula protótipo, ou através de isolamento, algumas vezes
biomonitorado (SIMÕES et al., 2004; NOLDIN, 2006). A etnofarmacologia, que
22
consiste na exploração científica interdisciplinar de agentes biologicamente ativos,
tradicionalmente empregados por determinado agrupamento humano, trabalha em
estreita cumplicidade com a etnobotânica aplicada ao estudo de plantas medicinais
(MACIEL et al., 2002).
A etnobotânica é citada na literatura como sendo um dos caminhos
alternativos que mais evoluiu nos últimos anos para a descoberta de produtos
naturais bioativos. Entre as estratégias utilizadas para a seleção de plantas a serem
investigadas em estudos farmacológicos e fitoquímicos, visando o desenvolvimento
de novos fitoterápicos, a etnofarmacologia é aquela que apresenta maiores chances
de acerto. Esta área de pesquisa enfoca dois fatores fundamentais: coleta e
utilização medicinal da planta. O primeiro fator implica na região, na época e no
estágio de desenvolvimento, preferida para coleta, envolve também, procedimentos
especiais como preparação de excicatas. O depósito da excicata em herbário
credenciado é muito útil para evitar enganos com a espécie que está sendo
estudada (MACIEL et al., 2002; RODRIGUES, 2005).
Os produtos naturais também são de importante representação no papel do
descobrimento de princípios ativos e como ponto de partida para fabricação de
novos medicamentos (VUORELLA et al., 2004; BUTLER, 2005). Além disto, algumas
das grandes companhias farmacêuticas mundiais contêm programas, que
possibilitam projetar a descoberta de promissoras moléculas a partir produtos
naturais, e ainda abrem espaço para a síntese de diversos análogos destas
moléculas (SHANG & TAN, 2005).
Atualmente, a pesquisa por novas entidades químicas bioativas pelos
laboratórios de pesquisa industriais observaram a adoção de novas técnicas, como o
uso da química combinatória, para se obter o maior número de substâncias. De
modo geral, por esta tecnologia, as reações são feitas em várias etapas, ocorrendo
em paralelo ou em misturas, a partir de poucos reagentes (BARREIRO, 2006).
Segundo Lee (2004), são três os principais métodos para que as pesquisas
estão direcionadas: a) bioatividade ou mecanismos de isolamento e caracterização
de substâncias ativas com ação direcionada; b) substâncias projetadas com
modificações baseadas em modelos de estrutura e síntese de análogos; c) estudos
dos mecanismos de ação. Sendo o descobrimento de substâncias um processo de
interação baseada na descoberta (isolamento de compostos bioativos a partir de
recursos naturais) junto ao melhoramento (estruturas racionais e síntese de novos
23
análogos para aperfeiçoar o perfil farmacológico), e teste da atividade biológica
destas.
Recentemente, face aos impressionantes avanços científico-técnológicos
observados em diversas áreas como a biologia estrutural, molecular e a química
computacional, por exemplo, o planejamento racional de novos fármacos tornou-se
uma realidade, envolvendo vários bilhões de dólares e ocupando milhares de
pesquisadores titulados, de diferentes áreas, em diversos laboratórios de pesquisa,
tanto industriais como acadêmicos (BARREIRO, 2002). Desta forma, ainda 80% dos
laboratórios obtêm as suas informações sobre as plantas, baseados na literatura e
em bancos de dados (RODRIGUES, 2005).
Neste sentido, esperar-se-ia que o Brasil fosse um país privilegiado,
considerando sua extensa e a diversificada flora. No entanto, nosso país não tem
uma atuação destacada no mercado mundial de fitoterápicos, ficando inclusive atrás
de países menos desenvolvidos tecnologicamente (YUNES et al., 2001).
No Brasil, as plantas medicinais da flora nativa são consumidas com pouca ou
nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas, principalmente pelos
habitantes do interior do país, estas plantas são propagadas por usuários ou
comerciantes. Desta forma, o conjunto de conhecimentos populares do folclore
brasileiro é muito largo, entretanto essas informações contidas neste conhecimento
popular ainda não foram verificadas por estudos científicos rigorosos. Além disso, as
pesquisas realizadas para a avaliação do uso seguro de plantas medicinais e
fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes, assim como o controle da
comercialização pelos órgãos oficiais em feiras livres, mercados públicos ou lojas de
produtos naturais (LIMA, 2005; VEIGA JUNIOR et al., 2005).
Nota-se que embora haja investimentos por parte das empresas que
produzem fitoterápicos no Brasil, que estes investimentos são insuficientes. Num
primeiro lugar porque são poucas aquelas que de fato investem, e além disso, uma
grande parte delas é de pequeno e médio porte. Outro fator de dificuldade é a
relação entre o número de grupos de estudos presentes ao longo do território
brasileiro (195) e o número de empresas que investem neste setor (por volta de 12),
sendo que assim, nem todos os grupos de pesquisa são contemplados. Desta forma,
o movimento de aproximação entre a universidade e a indústria no Brasil, é ainda
bastante discreto, ocorrendo de forma espontânea e individual, já que não há
incentivo governamental suficiente para tais parcerias (RODRIGUES, 2005).
24
O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da
maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua
vocação para os produtos naturais (PINTO et al., 2002). Assim, uma das ações
destinadas a agregar a competência científica tecnológica, para produção de drogas
terapêuticas, a partir de plantas medicinais oriundas de nossa biodiversidade, foi a
implementada pela Central de Medicamentos – (CEME) – por intermédio do
Programa de Pesquisa de Plantas Naturais – PPPM, nos anos 80. Embora anterior à
discussão atual e ao crescente interesse pelos produtos fitoterápicos, e a toda a
discussão acerca do uso sustentável da biodiversidade para a produção de
fitomedicamentos, a ação da CEME possui importância histórica no esforço
governamental em Produção e Desenvolvimento para obtenção e geração de
fitomedicamentos para consumo da população (SANT`ANA, 2004).
A CEME atuou, durante toda sua existência, em torno da questão da
produção e distribuição de medicamentos para consumo da população de baixa
renda. O Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais da CEME teve um papel
importante no conhecimento e possível aplicabilidade de plantas brasileiras com uso
medicinal. A CEME não logrou colocar no mercado nacional um medicamento
fitoterápico totalmente brasileiro, principalmente, pela descontinuidade do apoio
governamental a partir de 1990, e pela extinção da CEME em 1997, não sendo
substituída por nenhuma outra medida de continuidade às atividades de prospecção
biológica de plantas nativas.
Apesar desta interrupção ocorrida com a extinção da CEME, esforços
pessoais foram realizados para que todo o material gerado não se perdesse. O
apoio localizado às pesquisas em fitomedicamentos continuou por meio de ações
desarticuladas dos órgãos de fomento, sem a implementação da estratégia
desenhada pela CEME, a exemplo do CNPq, por meio do Programa de
Biotecnologia e Recursos Genéticos. Os grupos de pesquisas continuaram o
desenvolvimento dos estudos científicos e tecnológicos com plantas nativas de
potencial farmacológico (SANT`ANA, 2004).
Logo, a indústria farmacêutica brasileira precisa ser viabilizada através de
grandes investimentos de pesquisa básica e desenvolvimento. Na situação atual,
cerca de 85% das industrias transnacionais sediadas no Brasil praticam toda
pesquisa de descoberta e desenvolvimento em seus paises de origem. A
universidade brasileira tem competência instalada na área de produtos naturais,
25
síntese química e química medicinal associada às diversas interfaces mencionadas
(MONTANARI, 2001). Assim, nos últimos anos, a integração entre a universidade e
a empresa não tem sido apenas desejável, mas sim necessária. É uma questão de
sobrevivência na área de produção de fitoterápicos, tanto para uma, quanto para a
outra, uma vez que cada qual tem seu papel: uma pesquisa, a outra produz
(RODRIGUES, 2005).
Quando observamos os grupos de pesquisa no Brasil, vemos que entre os
15.158 grupos de pesquisa em C&T, incluídos na versão 5.0 do Diretório
CNPq/Versão 2002, 195 desenvolvem pesquisas na área de produtos naturais e
plantas medicinais, perfazendo 1,28% do total. Pode-se verificar ainda que a Região
Sudeste é a que mais concentra esses grupos, enquanto a Região Norte, apesar da
grandeza da sua biodiversidade e a amplitude das possibilidades de pesquisa que o
manancial biológico local oferece, apresenta ainda uma discreta área de
investigação. Também, percebe-se que nos últimos sete anos houve um grande
aumento do número de grupos de estudo em plantas medicinais, de 70 em 1998
para 195 em 2002. Além disso, no final da década de 90 não se percebia a
participação da universidade privada neste tipo de pesquisa o que se observa na
atualidade (RODRIGUES, 2005).
É importante salientar que vários grupos de pesquisa, vêm alterando o seu
enfoque da fitoquímica tradicional privilegiando trabalhos que envolvem a atividade
biológica, ecologia química e a biossíntese de micromoléculas de plantas,
microorganismos, organismos marinhos, entre outros, assim como novas
metodologias analíticas de trabalho com produtos naturais (PINTO et al., 2002).
Segundo Calixto (2005), entre os países com maior destaque na América
Latina no período de 1984-2004, dentre todos os países que publicaram artigos em
revistas internacionais de renome, o Brasil foi o país que mais se destacou, com
41,6% das publicações, sendo que estas publicações foram principalmente nas
revistas “Phytochemistry”, “Journal of Ethnopharmacology” e “Planta Médica”,
totalizando nestes anos 3.722 publicações. Destas publicações, 1.431 foram entre
os anos de 2000 e 2004, enquanto neste mesmo período o México e a Argentina
produziram 607 e 603 artigos respectivamente. Os dados levam a acreditar que a
pesquisa em nosso país está crescendo apesar de todas as dificuldades que
encontra e que o Brasil já apresenta massa crítica para trabalhar na nova realidade
de pesquisa com enfoque biológico (PINTO et al., 2002; RODRIGUES, 2005).
26
Quando se faz uma análise dos resumos apresentados nas Reuniões Anuais
da SBQ, ainda se nota a dificuldade que persiste em se realizar trabalhos
multidisciplinares envolvendo fitoquímica e atividade biológica. Apesar dos
pesquisadores se proporem a realizar esse tipo de estudo, isto pode ser observado
nos dados de que 51% dos trabalhos, envolvem principalmente isolamento e
identificação estrutural e 16% desenvolvimento e aplicação de metodologias
analíticas, enquanto trabalhos sobre atividade biológica representam cerca de 20%
(PINTO et al., 2002).
Estudos apontam que no desenvolvimento de novos medicamentos, de
22.900 substâncias sintetizadas apenas uma alcançará a aprovação dos órgãos
reguladores internacionais de medicamento; apesar dos investimentos necessários
em tempo (cerca de 12 anos), recursos humanos e tecnologias avançadas, que vão
de US$ 250 milhões a 880 milhões e já chegaram a ultrapassar US$ 2,3 bilhões. Na
área de medicamentos o ciclo de P&D é longo e extremamente caro, chegando a
níveis estratosféricos de dezenas ou centenas de milhões de dólares e crescendo
progressivamente ano a ano. Essas condições têm desestimulado os investimentos
em pesquisa para o lançamento de novas drogas sintéticas. Já um medicamento de
origem vegetal, com base em informações tradicionais, apresenta relação maior de
aprovação (4:1) com o tempo de investimento entre 5 e 7 anos, e um custo estimado
em U$ 3 a 8 milhões. Estes dados justificam a atenção dos diversos setores que se
ocupam do estudo de plantas medicinais (MARQUES, 2005; SIANI e MICHILES,
2005; RODRIGUES, 2005).
Convém afirmar que a indústria nacional já possui tecnologias para a
pesquisa dirigida, a validação e o registro de produtos, somadas às tecnologias de
produção com Boas Práticas de Fabricação e de Controle de Qualidade, sendo que
o investimento de novos fitoterápicos atualmente, representa sem dúvida um fator de
competitividade para as indústrias farmacêuticas, onde os fitoterápicos apontam
novas potencialidades para a inovação e ampliação de mercados (SIANI &
MICHILES, 2005). Desta forma, a pesquisa e o desenvolvimento de
fitomedicamentos é uma das áreas onde o Brasil pode ser muito competitivo
(ASSAD & FERRO, 2005).
Recentemente uma planta nativa da Mata Atlântica, a Cordia verbenácea,
conhecida pelo nome de erva-baleeira ou maria-milagrosa, foi utilizada como base
de um antiinflamatório que já recebeu o aval da Agência Nacional de Vigilância
27
Sanitária (Anvisa) e já está sendo vendido nas farmácias brasileiras na forma
farmacêutica de creme com o nome de Acheflan�, desenvolvido pelo Laboratório
Ache. Sendo o primeiro antiinflamatório tópico feito a partir de extrato de uma planta
brasileira, é o primeiro fitoterápico novo, totalmente nacional. O produto é
considerado um fitomedicamento, pois têm em sua composição apenas substâncias
ativas extraídas da planta, com comprovação de eficácia e segurança. O projeto de
desenvolvimento do produto iniciou-se antes de 1998 e se estendeu até 2004, e
contou com a participação de agrônomos, bioquímicos, farmacêuticos, médicos e
outros profissionais, que envolvidos somaram mais de uma centena de pessoas.
Foram realizados todos os testes necessários, desde pré-clinicos até clínicos de fase
1, fase 2 e fase 3, sendo que o investimento foi maior que R$ 15 milhões em
pesquisa e desenvolvimento para obtenção do medicamento, e contou com
parcerias com quatro importantes universidades nacionais (ASSAD & FERRO, 2005;
CALIXTO, 2005; ERENO, 2005; SIANI e MICHILES, 2005; RODRIGUES, 2005).
Nos países em desenvolvimento, bem como nos mais desenvolvidos, os
apelos da mídia para o consumo de produtos à base de fontes naturais aumentam a
cada dia. Nos Estados Unidos e na Europa há mais controle no registro e na
comercialização de produtos obtidos de plantas. Nesses países, as normas para a
certificação e para o controle de qualidade de preparações vegetais são mais
rígidas, entretanto, na Alemanha, onde se consome metade dos extratos
comercializados em toda Europa, cerca de 3,5 bilhões de dólares, plantas medicinais
são utilizadas pela população para os mais diversos tratamentos, geralmente através
da automedicação com preparações à base de plantas medicinais, mesmo sabendo-
se que 70% dos clínicos-gerais alemães prescrevem as centenas de ervas
licenciadas neste país (VEIGA JUNIOR et al., 2005). No Brasil, desde o ano de
2000, cerca de 650 registros de medicamentos fitoterápicos (130-150/ano) foram
obtidos, estes produtos partiram principalmente de plantas exóticas que representam
89% destes produtos (SIANI e MICHILES, 2005).
Segundo Marques (2005), muito se tem comentado sobre a importância das
atividades de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos no Brasil, como única
forma razoável de geração de inovação nesse importante segmento econômico. Na
área de produtos oriundos da biodiversidade, essa valorização aumenta em função
principalmente da tendência crescente da preferência dos consumidores e também
pela conhecida riqueza da nossa flora. Portanto, numa avaliação global desta ultima
28
década em que iniciamos e praticamos concretamente iniciativas de pesquisa e
desenvolvimento em fitoterápicos, pode-se admitir que evoluímos de forma
marcante. O mercado brasileiro melhorou muito. Neste aspecto, já conhecemos
muito mais as espécies nativas, temos algumas patentes depositadas, efetivamos
alguns produtos na obtenção de registro e comercialização e já apontamos á
possibilidade de exportação.
3.1 Cronologia de investigação fitoquímica
Em geral a escolha de uma determinada planta medicinal é feita através da
abordagem etnofarmacológica. Uma vez definida a espécie vegetal a ser estudada,
define-se também o local e o modo como é feita a coleta. Após a coleta a planta
escolhida deve ser seguramente identificada por um botânico ou técnico
especializado, sendo então a planta catalogada corretamente. Na etapa que
determina o estudo fitoquímico, escolhe-se à parte da planta que será investigada
(raiz, cascas do caule, caule, galhos, folhas, flores, frutos) e a quantidade de
material que será coletado. Num projeto que interligue a fitoquímica com a
farmacologia deve-se escolher para a coleta a parte da planta que é utilizada na
medicina popular. A secagem pode ser realizada ao sol, à sombra ou em estufa,
sempre com circulação de ar. A armazenagem deve ser feita em sacos plásticos,
acondicionados em caixas de papelão guardadas em local seguro, com baixa
umidade e temperatura. A moagem só deverá ser efetuada na ocasião da
preparação dos extratos. A preparação de extratos é feita geralmente por percolação
(método de extração a frio), Soxhlet (método de extração a quente) ou ácido-base
(MACIEL, et al., 2002).
O processo realizado desde a coleta da amostra, até a preparação dos
extratos, define um conjunto de informações sobre a qual, ajudará na
homogeneidade do processo e na obtenção do princípio ativo desejado, evitando
reações secundárias com as substâncias presentes na amostra obtida (LEITE,
2005).
A preparação dos extratos brutos das plantas é o ponto de partida, da etapa
do isolamento e purificação dos constituintes químicos fixos das plantas. Deve-se
escolher o solvente para extração tendo em vista os objetivos do estudo e os
resultados da abordagem. A investigação preliminar de constituintes químicos
29
representa muitas vezes, um estímulo motivador da curiosidade, já que possibilita o
conhecimento prévio dos extratos e indica a natureza das substâncias presentes
facilitando a escolha de técnicas de fracionamento cromatográfico. Em seguida
esses extratos podem ser submetidos ao fracionamento cromatográfico, utilizando a
técnica baseada nas propriedades separativas mais adequadas. As separações
cromatográficas são realizadas em coluna de gel de sílica e as frações obtidas são
monitoradas em cromatografia em camada fina utilizando-se variados tipos de
reagentes reveladores específicos. Em seguida, a determinação da estrutura
molecular dos compostos isolados é feita principalmente pela interpretação de vários
espectros obtidos em espectrômetros de absorção das radiações ultravioleta (UV) -
o espectro UV define a presença de compostos que possuem ligações insaturadas
em conjugação; espectroscopia na região do infravermelho (IV) – o espectro de IV é
interpretado em termos de presença ou ausência de grupos funcionais;
espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) e de
carbono-13 (RMN de 13C) – determina a natureza e o ambiente químico de
hidrogênios e carbonos, respectivamente; e espectrometria de massas (EM) –
fornece dados sobre o peso e a fórmula molecular e possibilita ainda, a identificação
de fragmentos característicos da molécula (MATOS, 1997; MACIEL et al., 2002).
Nesse contexto, vale salientar que o potencial econômico da flora nacional é
altamente significativo, particularizando, na família Sapindaceae, este potencial é
muito extenso, principalmente analisando as espécies que a compõem e as suas
diferentes formas de utilização pela população (GUARIM NETO et al., 2000).
Apesar dos estudos já realizados com a família Sapindaceae, a sua
importância etnobotânica ainda não foi devidamente salientada, especialmente por
ser família de ampla distribuição e ter espécies com usos diferenciados (GUARIM
NETO, et al., 2000).
3.2 Família SAPINDACEAE
Esta família pertence à ordem Sapindales que possui vinte diferentes famílias
botânicas, algumas com grande ocorrência no Brasil e na região amazônica,
destacando-se nesta ordem além da família Sapindaceae às famílias, Burseraceae,
Anacardiaceae, Simaroubaceae, Meliaceae, Rutaceae, Oxalidaceae e
30
Balsaminaceae. Esta ordem, reúne inúmeras plantas de grande valor medicinal e
econômico (DI STASI, 2002).
A família Sapindaceae abrange cerca de 14 tribos, 140 gêneros e 2000
espécies, e a ocorrência e a distribuição das espécies são amplas, atingindo áreas
distintas no mundo, nas mais diferenciadas regiões biogeográficas, principalmente
nas regiões tropicais e subtropicais (FERRUCCI, 2000; GUARIM NETO et al., 2000).
Destacam-se dentro desta família os gêneros Paullinia, Cupania e Serjania, todos
com importantes espécies conhecidas popularmente como Timbó, muitas das quais
utilizadas para a pesca por serem consideradas narcóticas para os peixes. Possuem
também significativos efeitos farmacológicos, especialmente no Sistema Nervoso
Central (DI STASI, 2002). Além destas, podemos destacar também a presença nesta
família de diversas espécies do gênero Matayba, espécies estas ainda muito pouco
estudadas.
As diversas espécies de plantas da família Sapindaceae são conhecidas
pelos seus usos na medicina tradicional como diuréticas, estimulantes,
expectorantes, sedativas, vermífugas, para dores de estômago e dermatites, em
várias partes do mundo. Em investigações químicas desta família, já foram isoladas
saponinas, diterpenos, flavonóides, além de diversos outros metabólitos secundários
que tem sido isolado das mais diversas espécies da família Sapindaceae
(CAVALCANTI, 2001).
Nesta família se incluem plantas de uso alimentar para o homem, entre estas
a Paullinia cupana que fornece um dos produtos importantes para o comércio do
Brasil, o “guaraná”. A Paullinia cupana, é a mais representativa espécie das plantas
desta família, sendo que esta planta é conhecida pelas propriedades estimulantes
de bebidas preparadas com suas frutas. Além desta espécie, também são
encontradas outras espécies, algumas do gênero Talisia que contém frutos
comestíveis que são usados nas regiões amazônica e nordestina (CAVALCANTI,
2001; DI STASI, 2002). Dentre as plantas deste gênero são citadas algumas
espécies arbóreas: Allophylus (com quatro espécies: A. edulis (A.St.-Hil., A. Juss. &
Cambess.) Radlk., A. guaraniticus (A. St.-Hil.) Radlk., A. semidentatus (Miq.) Radlk.,
A. petiolulatus Radlk.), Cupania (C. vernalis Cambess.), Diatenopteryx (D. sorbifolia
Radlk.), e Matayba (M. elaeagnoides Radlk.) (ESTEVAN, et. al, 2000).
Algumas espécies da família Sapindaceae presentes na flora nacional já
foram estudadas, como a Magonia pubescens St. Hil. que está presente no cerrado
31
brasileiro e tem a presença de taninos com atividade larvicida. Em um estudo com
os extratos do tronco de Serjania lethalis e das folhas de Cupania vernalis, foi
verificada uma significante redução na produção de oxido nítrico (NO), um
importante mediador inflamatório. Os extratos etanólico dos troncos de Serjania
lethalis e das folhas de Cupania vernalis, mostraram completa inibição na produção
de NO por macrófagos. Sugerindo que extratos destas plantas têm grande potencial
na busca por substâncias ativas que podem ser utilizadas como agentes
antiinflamatórios (MINEO et al., 2004; NAPOLITANO et al., 2005). Também já foram
estudados os extratos das folhas de Sapindus emarginatus que, mostraram uma
considerável atividade antibacteriana frente à diversas cepas de bactérias (NAIR et
al., 2005).
A Matayba guianensis Aublet, já foi estudada e seus extratos mostraram uma
diminuição nos danos causados nos tecidos pela produção excessiva de oxido
nítrico durante o processo de inflamação (SILVA, 2004; MINEO, 2004). Esta mesma
espécie, também foi estudada por Mesquita et al. (2005), e demonstrou que o extrato
hexânico apresenta in vitro uma significante atividade antiplasmodial contra cepas
de Plasmodium falciparum, resistentes a cloroquina. Além disto, foram isolados
quatro compostos desta planta que mostraram uma moderada atividade in vitro,
contra a mesma cepa de P. falciparum, sendo estes compostos denominados de
Matayosideos A-D.
Neste mesmo gênero, foram estudados também os troncos e galhos de
Matayba arborescens, que levaram a identificação dos compostos Cleomiscosina A
e Escopoletina (MESQUITA et al., 2005).
3.3 Matayba elaeagnoides Radlk
A M. elaeagnoides Radlk é uma árvore mediana, com 6 a 14 metros de altura,
tem o tronco curto e tortuoso, de 30-50 cm de diâmetro. Folhas compostas pinadas
de 10-20 cm de comprimento; folíolos em número de 4-13, coriáceos, glabros, de 7-
11 cm de comprimento por 2-3 cm de largura (LORENZI, 2000). Casca áspera,
cinzento-clara ou escura, acompanhada de leve escamamento, e poucas fissuras
irregulares. Inflorescências em panículas axilares, menores que as folhas, brancas.
Seu fruto é cápsulas globosas, rugosas, por dentro bem peludas, por fora quase
sem pêlos (LOPEZ et al., 1987). Floresce durante os meses de setembro a
32
novembro e os frutos amadurecem entre os meses de dezembro à janeiro. Ocorre
de Minas Gerais e São Paulo até o Rio Grande do sul, principalmente na floresta
semidecídua de altitude e mata de pinhais. É uma planta semidecídua, mesófila e
seletiva higrófita, muito freqüente nas submatas de pinhais e matas semidecíduas de
altitude situadas em solos úmidos e, menos freqüente na floresta latifoliada
semidecídua da bacia do Paraná. É encontrada tanto no interior da mata como nos
estágios mais adiantados da sucessão secundária. Produz anualmente moderada
quantidade de sementes viáveis, as quais são amplamente disseminadas pela
avifauna que consome o arilo que as envolve parcialmente, sendo que as sementes
podem ser utilizadas para produção de mudas. Sua madeira é moderadamente
pesada, dura, medianamente resistente, de boa durabilidade quando protegida das
intempéries. A madeira é empregada para construção civil, como caibros, vigas,
ripas, tabuado em geral, para obras internas, e para lenha e carvão. Os frutos são
avidamente consumidos por várias espécies de pássaros. A árvore possui
qualidades paisagísticas que a recomendam para a arborização urbana em geral. É
indicada para a composição de reflorestamentos mistos destinados ao
repovoamento de áreas degradadas de preservação permanente. Produz
anualmente moderada quantidade de sementes viáveis, que são amplamente
disseminadas pela avifauna que consome o arilo que as envolve (LORENZI, 2000).
A M. elaeagnoides Radlk (Figura 1) que é conhecida popularmente por
camboatá, camboatã, cragoatã-branco, cuvantã, craguatã, pau-de-pombo, pau-
crioulo e camboatá-branco, é utilizada popularmente com atividade antiinflamatória,
analgésica e no combate ao câncer de fígado. No entanto, não apresenta ainda
estudos que comprovem estas atividades destacadas na medicina popular
(LORENZI, 2000; RIBEIRO, 2004).
Quanto aos seus constituintes químicos, foi reportado na literatura apenas um
estudo, com as sementes de M. elaeagnoides, mostrando que foram encontrados
ácidos graxos em sua composição (MESQUITA et al., 2005).
33
Figura 1: M. elaeagnoides Radlk (BACKES & IRGANG, 2002)
34
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Análise fitoquímica
4.1.1 Material vegetal
As cascas de M. elaeagnoides Radlk (Família Sapindaceae) foram coletadas
em maio de 2004, no município de Caçador-SC e identificadas pelo Prof. Dr. Ademir
Reis do Departamento de Botânica da UFSC. Uma exsicata foi depositada no
Herbário Barbosa Rodrigues no município de Itajaí-SC, sob número MTS 001.
4.1.2 Preparação do extrato metanólico bruto e hidroalcoólico
As cascas de M. elaeagnoides (2,6 Kg) foram trituradas e secas a
temperatura de 40°C durante 7 dias, os pedaços das cascas foram submetidos à
maceração com metanol por 14 dias em um percolador, e posteriormente extraído
até exaustão com o mesmo solvente. Após este período, o macerado foi filtrado,
recolhido e concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida, obtendo-se
o extrato metanólico bruto (EMB) 221,74g. Paralelamente, uma massa de 1,5 Kg do
mesmo material foi submetida à maceração com água e álcool etílico (1:1) durante
um período de 14 dias. Após este período, o macerado passou por um processo de
concentração no evaporador rotatório sob pressão reduzida, obtendo-se um extrato
denominado de extrato hidroalcoólico (EH).
4.1.3 Preparação das frações
O extrato obtido inicialmente, EMB (221,74g), foi redissolvido numa solução
de Água:Metanol (1:9) e submetido a uma partição liquido-líquido, com diferentes
solventes em ordem de polaridade crescente: Hexano, Clorofórmio, Acetato de Etila
(AE) e Butanol, visando a semipurificação dos compostos conforme suas
polaridades (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).
Para cada extração, foram utilizados 200 ml do líquido extrator, repetindo-se
as operações cinco vezes. Posteriormente, os solventes foram evaporados através
do evaporador rotatório sob pressão reduzida até secura, obtendo-se as respectivas
frações semipurificadas de Hexano, Clorofórmio, Acetato de Etila e Butanol.
35
4.1.4 Análise cromatográfica
Os extratos e as frações obtidas, foram, submetidos à Cromatografia em
Camada Delgada (CCD), visando uma análise fitoquímica preliminar. Para estes
procedimentos foram utilizadas placas de sílica Gel 60 F254 (Merck) como fase
estacionária, e como eluentes misturas de diferentes proporções com os solventes:
hexano, clorofórmio, acetona, acetato de etila, metanol, água.
Para revelar as classes dos compostos foram utilizados reveladores
específicos como: anisaldeído sulfúrico para terpenóides e esteróides, Dragendorff
para alcalóides e cloreto férrico (3%) para flavonóides e compostos fenólicos. O
método físico da luz Ultra-Violeta foi utilizado no intuito de se detectar ligações
duplas conjugadas (UGAZ, 1994).
4.1.5 Separação e purificação dos compostos
As frações obtidas no particionamento do extrato metanólico foram
submetidas ao procedimento de cromatografia em coluna (CC), utilizando-se sílica
Gel 60 (70-230 mesh) como fase estacionária e diferentes eluentes como fase móvel
(hexano, clorofórmio, acetona, acetato de etila, metanol, água), variando-se o tipo e
a proporção conforme a fração, ou a sub-fração utilizada.
O eluente mais o produto carreado nas CC foram recolhidos por gotejamento
em frascos de aproximadamente 10 ml e numerados seqüencialmente.
Posteriormente os compostos presentes em cada um destes frascos foram
analisados por CCD. As sub-frações que eram semelhantes foram reunidas, dando
assim, origem a outras sub-frações. Quando necessário estas sub-frações foram
submetidas a uma nova CC, repetindo-se o processo até a obtenção de compostos
puros. Os procedimentos utilizados encontram-se no fluxograma da figura 2.
A fração Hexânica (6,85g), foi empacotada com hexano 100% e sílica Gel
como fase estacionária. A eluição da coluna ocorreu em polaridade crescente da
fase móvel Hexano:Acetona. Desta forma, foram coletadas 178 frações (10 ml
aproximadamente cada) as quais foram monitoradas através de CCD e as frações
similares foram unidas obtendo assim novas sub-frações ou substâncias puras.
36
O processo anterior foi repetido para fração Clorofórmica (1,25g) com uma
massa de sílica de 33,42g na fase estacionária, entretanto, esta coluna foi
empacotada com Clorofórmio e foi utilizada como fase móvel a mistura de
Clorofórmio:Metanol em polaridade crescente.
Da mesma forma para a fração de Acetato de Etila (3,61g) e fração butanólica
(4,5g) os processos cromatográficos foram repetidos conforme citados acima,
usando uma massa de sílica como fase estacionária de 43,00g e 21,00g
respectivamente. No entanto a fase móvel para a fração de Acetato de Etila foi
Clorofórmio:Metanol em polaridade crescente. Para fração butanólica foi utilizado
polaridade crescente da mistura de solventes Acetato de Etila:Metanol.
4.1.6 Identificação e elucidação estrutural dos compostos isolados
As substâncias puras foram identificadas por métodos espectroscópicos
usuais. Foram utilizadas técnicas de Ressonância Magnética de Hidrogênio (RMN-1H) e Carbono (RMN-13C), realizados em colaboração com o professor Dr. Franco
Delle Monache (CNR/Roma), e com a professora Dra. Cleusa Conceição da Silva
(UEM). Além disso, algumas substâncias foram identificadas com auxílio da técnica
de IV ou pela técnica de CCD e Co-CCD em comparação com padrões autênticos. O
ponto de fusão das substâncias foi determinado e comparado com dados
disponíveis na literatura.
37
Figura 2: Operações realizadas no processo de fracionamento e purificação dos
compostos.
38
4.2 Análise Biológica
4.2.1 Atividade Antibacteriana
A ação antimicrobiana dos extratos, frações e substâncias puras isoladas de
M. elaeagnoides Radlk, foram investigadas pela equipe do Prof. Dr. Alexandre Bella
Cruz, no laboratório de Microbiologia do curso de Farmácia da UNIVALI. A atividade
foi analisada pelo método de diluição em Agar segundo Pelczar et al. (1996).
4.2.1.1 Material microbiológico
Para determinar a atividade antimicrobiana, foram utilizados os
microrganismos da Americam Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA),
obtidos da Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia André Tosello de Campina-
SP. Foram testados os microorganismos Staphylococcus aureus (ATCC 6538P),
Escherichia coli (ATCC 11775), Candida albicans (ATCC 10231).
Os microorganismos foram mantidos em tubos contendo agar nutritivo e
conservados sob refrigeração (4oC), sendo replicados em intervalos de 20 dias para
manter as colônias vivas.
4.2.1.2 Método Bioautográfico
As amostras testes (extratos brutos e frações) foram dissolvidas em acetona e
aplicadas em placas de cromatografia em camada delgada (CCD) (Sílica Gel 60
F254) (Merck) e em seguida, foram submetidas a eluição em sistemas de solventes
escolhidos previamente para cada extrato conforme a sua polaridade, sendo eles:
Hexano:Acetona (70:30), Clorofórmio:Metanol (70:30) e AE:Acetona:Água:Metanol
(28:8:1:5). As placas foram feitas em duplicata, uma delas sendo usada como
cromatograma referência e a outra para bioautografia. Após a eluição e evaporação
do sistema de solventes por corrente de ar, as manchas foram visualizadas sob luz
Ultravioleta entre 254 e 366nm. Sobre a superfície de uma das placas, foi distribuída
uma fina camada de meio de cultura (10mL) contendo inoculo de Staphylococcus
aureus na concentração de 106 UFC/mL. Após a solidificação do meio, foi incubada
por 18 horas a 35oC em ambiente com umidade controlada. Após o período de
39
incubação, os bioautogramas foram homogeneamente, borrifados com uma solução
aquosa de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (TTC) (20mg/mL) (Merck), e incubados
por 4 horas a 37 oC. Para a interpretação dos resultados foi considerado como
critério o aparecimento de zonas claras coincidindo com a das substâncias,
indicando a presença de atividade antimicrobiana.
4.2.1.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima
Os valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram determinados
através da técnica da macrodiluição em Agar. Nesta técnica, foi utilizado frascos de
vidro de 5 mL, onde os extratos são dissolvidos em solução à 5% de DMSO:água
(1:1), e adicionados em séries de frascos com concentrações que variam de
(1µg/mL à 1000µg/mL). Para as leveduras, a cada frasco foi adicionado 1 mL do
meio agar Sabouraud dextrosado e para as bactérias foi adicionado 1 mL do meio
de cultura agar Mueller-Hinton. Após homogeneização da mistura e solidificação dos
meios de cultura, os microorganismos previamente ativados foram inoculados nas
séries correspondentes, sendo então, incubados a 37oC por 24 a 48 horas para os
fungos leveduriformes e por 18 a 24 horas à 37oC para as bactérias. Após o período
foram realizadas leituras da concentração inibitória mínima através da verificação do
crescimento microbiano (NCCLS, 1993).
Durante os testes foram realizados controles com o solvente utilizado nas
solubilizações dos extratos e frações, a fim de se verificar seu efeito sobre os
microorganismos testados, estes não devem interferir na análise microbiológica. A
concentração final de DMSO nos ensaios não excedeu 2%. Foram utilizados
antibacterianos (Amoxicilina) e antifúngico (Vancomicina) como controle positivo, e
incluídas soluções livres de droga usadas como controle branco. Os ensaios foram
realizados em triplicata.
4.2.1.4 Preparo e ajuste da densidade dos inóculos
As bactérias foram transferidas do meio nutriente para um tubo contendo
caldo de infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion – Merck –10493), sendo
desta maneira, ativadas e mantidas em estufa a 37oC até que adquirissem uma
turbidez satisfatória.
40
A densidade microbiana do inoculo das bactérias foi ajustada através do
comprimento de onda (λ) de 520nm, por comparação com a escala de McFarland,
estabelecendo a concentração final compreendida em 1,5 x 106 UFC/mL.
4.2.1.5 Atividade Antifúngica
A atividade antifúngica foi realizada na Universidade Nacional de Rosário na
Argentina pela equipe da Prof. Dra. Susana Zacchino. Os ensaios foram realizados
conforme descrito por Sartori e cols. (2003). As amostras foram preparadas em
DMSO já que não produz inibição dos cultivos quando utilizado em concentrações
de 2%. No método de diluição em Agar, as amostras foram homogeneizadas em
concentrações conhecidas com o meio de cultivo, no qual se inocularam os
microorganismos. Para cada fungo testado, um tubo contendo somente o meio de
cultura (branco apenas com o solvente como controle positivo) e um tubo contendo
30 mg/ml de cetoconazol (controle negativo). Após solidificação do meio de cultivo,
foram incubados os fungos sobre a superfície do agar. Os tubos foram incubados a
28 °C por 24, 48 e 72 horas. A leitura foi baseada na observação visual do
crescimento ou não dos fungos estudados.
Foram testadas os fungos Candida albicans (ATCC 10231), Candida tropicalis
(C 131 2000), Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763), Cryptococcus neoformans
(ATCC 32264) Aspergillus fumigatus (ATCC 26934), Aspergillus flavus (ATCC 9170),
Aspergillus niger (ATCC 9029), Microsporum gypseum (C 115 2000), Trichophyton
rubrum (C 113 2000) e Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9972).
4.2.2 Atividade Antinociceptiva
A ação antinociceptiva dos extratos, frações e a substância pura obtida de M.
elaeagnoides Radlk, foi investigada pela equipe da Profa. Fátima de Campos Buzzi,
e pela equipe da Profa. Dra. Márcia Maria de Souza no laboratório de Farmacologia
do curso de Farmácia da UNIVALI.
Os resultados foram analisados estatisticamente, em comparação com o
grupo controle, tendo como média ± erro padrão da média, exceto as DI50, que foram
apresentados como médias geométricas acompanhadas de seus respectivos limites
de confiança em nível de 95%. Os valores de DI50 foram determinados pela
41
regressão linear GraphPad. O resultado estatístico entre os grupos foi calculado por
meio da análise da variação seguida por testes múltiplos de comparação por New-
man-Kuels. Valores de p<0,05 foram considerados como indicativos de significância.
4.2.2.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
A resposta nociceptiva foi induzida pela injeção intraperitoneal de acido
acético (0,6%) diluído em solução salina (0,9%). O comportamento que se observou
nos animais foi o número de contorções abdominais, durante um período de 20
minutos. As contrações abdominais consistem basicamente da contração da
musculatura abdominal juntamente com a extensão de uma das patas posteriores.
Após o tratamento com os compostos em estudo, esperou-se 30 minutos e
procedeu-se a injeção de ácido acético. Os animais foram observados em pares,
colocados sob funis de vidro individuais e o número de contorções abdominais foi
quantificado cumulativamente. A atividade analgésica foi determinada, tomando-se
como base à inibição do número das contorções abdominais dos animais pré-
tratados com os extratos brutos, frações e com a substância isolada, estes foram
administrados sistemicamente via intraperitoneal, e os resultados foram em relação
aos grupos controle. No grupo controle positivo foi utilizado um analgésico de uso
terapêutico (COLLIER et al., 1968; BRESCIANI, et al., 2003; SOUZA et al., 1998;
2003).
4.2.2.2 Modelo de dor induzida pela formalina
Neste ensaio, os animais foram tratados com a substância em estudo e após
30 minutos receberam 20 µl de formalina a 2,5% (0,92% de formaldeído) ou salina
na região subplantar das patas posteriores, direita e esquerda, respectivamente.
Após a injeção de formalina, os animais foram colocados, individualmente, sob um
funil de vidro o qual é circundado para facilitar a observação do comportamento
emitido. O tempo em que o animal permaneceu mordendo ou lambendo a pata
injetada com formalina foi cronometrado, sendo este tempo considerado como
indicativo de dor. Foram cronometrados os 5 minutos após a injeção da formalina
(período correspondente a dor neurogênica), após 10 minutos foi recomeçado o
42
período de cronometragem por 15 minutos consecutivos e o tempo de lambidas
correspondeu a dor inflamatória. Sendo o tempo total do testes de 30 minutos.
Ao final do tempo de observação, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical e as patas posteriores foram cortadas na junção tíbio-tarsal e
pesadas em balança analítica para quantificação do edema induzido pela formalina.
A diferença de peso (em mg) entre a pata direita (injetada com formalina) e esquerda
(injetada com salina) foi considerada como índice de edema (HUNSKAAR, et al,
1985; SOUZA et al., 2003).
4.2.3 Atividade antiparasitária in vitro
A atividade antiparasitária foi realizada pela Profa. Iriane Eger do curso de
Medicina da UNIVALI. Neste estudo, foram utilizadas formas de cultura
(epimastigotas) da cepa Y de Trypanosoma cruzi e (promastigotas) da cepa 575 de
Leihsmania amazonensis. Os parasitos foram mantidos a 26ºC, através de repiques
semanais em meio LIT suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) e 10
µg/ml de estreptomicina e 10 UI/ml de ampicilina. Para os ensaios de atividade dos
diferentes extratos, os parasitos foram coletados no quinto dia de crescimento,
lavados 3 vezes em PBS (Tampão Salina Fosfato) pH 7,4 e centrifugados a 1.500
rpm durante 10 minutos. Em seguida, os parasitos foram suspensos em meio de
cultura LIT + 10% SBF e a concentração ajustada para 5,0 x 106 parasitas/ml.
Os diferentes extratos e frações foram solubilizados em DMSO em uma
concentração de 50 mg/mL, mantidos ao abrigo da luz e a 4°C até o seu uso. Para a
triagem, 190µl da suspensão de parasitos (5,0 x 106 parasita/mL) foram cultivados
por 72 horas a 28°C em placas de 96 orifícios com 1,0mg/ml e 0,1mg/ml do extrato e
frações. Como controle, foi utilizado, Dimetilsulfóxido (DMSO), Benzonidazol
(Rochagan) (50 µg/ml) e Anfotericina B (20 ng/mL), utilizados contra T. cruzi e L.
amazonensis, respectivamente.
A atividade antiparasitária foi determinada pela redução da mobilidade e do
crescimento dos parasitos, observados em microscópio óptico. A determinação do
número de parasitos foi realizada através da contagem em câmara de Neubauer.
Os resultados foram analisados estatisticamente, em comparação com o
grupo controle, tendo como média ± erro padrão da média, exceto as CI50, que foram
43
apresentados como médias geométricas acompanhadas de seus respectivos limites
de confiança em nível de 95%. Os dados foram analisados por meio de análise de
variância seguida pelo teste de múltipla comparação, utilizando-se o método de
Dunnett, quando apropriado. Valores de p<0,05 foram considerados como
indicativos de significância.
44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Resultados fitoquímicos
5.1.1 Obtenção das frações
A partir do Extrato Metanólico Bruto (EMB) foi realizado o particionamento
com solventes de polaridade crescente onde foram obtidos as seguintes frações e
seus respectivos rendimentos em relação à massa de planta seca: Fração Hexano;
Fração Clorofórmica; Fração Acetato de Etila (AE); Fração Butanólica (Tabela 1 e
Figura 2). Como pode ser observado, as frações com maiores rendimentos foram a
de Hexano, Acetato de Etila (AE) e Butanólica, com massa iguais a 6,85g; 3,61g e
28,62g, respectivamente.
Na análise fitoquímica preliminar, as frações de Hexano, Clorofórmio, Acetato
de Etila mostraram resultados positivos para terpenos e esteróides quando
revelados com anisaldeído sulfúrico. A fração de Clorofórmio também mostrou
resultados positivos quando submetido à luz UV, mostrando uma possível presença
de cumarinas, assim como nos extratos metanólico, hidroalcoólico. Além disto, os
extratos metanólico, hidroalcoólico e as frações de Acetato de Etila e Butanólica,
deram resultados positivos para substâncias fenólicas quando revelados com cloreto
férrico (FeCl3), mostrando assim, uma eficiência na separação das substâncias
conforme as polaridades. Entretanto, os resultados foram negativos para alcalóides
quando revelado com o reativo de Dragendorff.
Esta análise fitoquímica preliminar, além de revelar parcialmente as classes
das substâncias presentes em cada fração ou sub-fração analisada, permite, ainda,
selecionar os melhores eluentes para a realização das CC e consequentemente
melhorar a resolução cromatográfica para separação das substâncias de interesse.
45
Tabela 1: Rendimentos das frações obtidas no particionamento do Extrato
metanólico em relação à planta seca.
Frações Massa obtida (g) Rendimento (%)
Hexano 6,850 0,260
Clorofórmica 1,250 0,050
Acetato de Etila 3,610 0,140
Butanólica 28,62 1,100
5.1.2 Fração Hexano
O eluente mais o produto carreado na CC da fração de hexano com a
amostra de 6,65g foi recolhido totalizando 178 subfrações. Após análise do perfil
cromatográfico, as frações semelhantes foram reunidas dando origem a outras
subfrações. Entre estas se destacam as subfrações 1-37 e a subfração 38-42.
A subfração 38-42 (45 mg) eluidas com hexano:acetona 98:2, apresentou-se
na forma de cristais incolores e foi denominada de substância ME-1. Através de
análises de CCD e Co-CCD com padrão autêntico, foi identificado como uma
substância esteroidal conhecido na literatura: o β-sitosterol (1). Entretanto não se
descarta a possibilidade de ser uma mistura de esteróides que possuam o mesmo Rf
e também, cujas características frente à técnica de cromatografia em camada
delgada são idênticas o que impossibilita a identificação por esta técnica, sendo
necessário a realização de uma análise de cromatografia gasosa.
HO
CH3
CH3
H3C CH3
CH3
H3C
(1)
46
Esta substância já foi isolada anteriormente de inúmeras outras plantas,
como: Bombacopsis glabra, Calyptranthes pallens, Arrabidaea samydoides, Cacalia
tangutica, na análise de Euterpe precatória, Hyptis fasciculata, Salvia mexicana L.
var. minor (DELIRA et al, 2003; FALCÃO et al, 2003; GARCEZ et al, 2003;
PAULETTI et al, 2003; LIU e TIAN 2004; GALOTTA e BOAVENTURA, 2005; LOBO-
ECHEVERRI et al, 2005; PAULA et al, 2006). Além disto, também foi identificada
nas cascas de Terminalia glabrescens, em Clerodendrum bunguei, em Ricinus
communis, em Psidium guajava (RODRIGUES, et al., 2002; GAO et al., 2003;
SANCHES et al, 2005). Albuquerque et al. (2006), isolaram uma mistura com β-
sitosterol e estigmasterol em flores de Eupatorium betonicaeforme, assim como,
Cavalcanti et al. (2001), que isolaram estas mesmas substâncias de uma espécie da
família Sapindaceae conhecida como Cupania vernalis Camb. Segundo Delira et al.
(2003), a substância β-sitosterol já tem comprovada a sua atividade antiinflamatória.
A subfração 1-37 foi recromatografada, obtendo-se duas novas subfrações. A
subfração 13-14 (19 mg) eluída com 98:2 (Hexano:Acetona) foi denominada de (A),
esta substância não foi até o momento identificada, entretanto pode ser uma
substância terpênica ou esteróide, devido as suas características frente ao revelador
de anisaldeído sulfúrico quando borrifado em CCD. A subfração 20-24 (123 mg) na
proporção 96:4 denominada de (B) foi submetida a técnica de RMN-1H e através das
comparações com dados da literatura mostrou ser uma mistura das substâncias
lupeol, α-amirina e β-amirina. Esta mistura de substâncias também foi isolada da
fração de clorofórmio, onde a elucidação foi detalhada. A razão da presença destas
substâncias em ambas as frações, pode estar relacionada, a polaridade
intermediária destas substâncias nos solventes hexano e clorofórmio, fazendo que
nem toda as substâncias que estavam presentes no extrato bruto fossem separadas
no mesmo solvente durante o particionamento.
5.1.3 Fração Clorofórmio
Do fracionamento da fração de clorofórmio, através de CC e eluída com uma
mistura de Hexano:Acetona, em diferentes proporções de polaridades crescentes,
foram obtidas 140 subfrações. A subfração 28-32 (15 mg), coletada no sistema de
47
eluentes Hexano:Acetona 98:2, apresentou-se na forma de um sólido branco
amorfo, denominado de substância B.
Através da análise de RMN-1H (Figura 3) da substância B, pode-se observar
alguns sinais característicos de triterpenos como lupeol (2), α-amirina (3) e β-amirina
(4). Entre eles podemos citar os sinais na região de δ 0,6 a 1,3 ppm relativos aos
grupamentos metilas. Um singleto em 1,65 ppm relacionado a uma metila do alceno
terminal característico do composto lupeol. Além disso, outros sinais atribuídos ao
lupeol são os dois singletos largos em 4,65 e 4,63 ppm relativos aos hidrogênios
olefínicos H-29a e H-29b. Estes valores de sinais são característicos desta
substância conforme descreve Jacomé (2004). Na região de δ 3,18 ppm, observa-se
um multiplete característico de H-3 em triterpenóides do tipo 3-β-OH relativo a
mistura de três compostos. Da mesma forma, pode-se observar dois tripletes δ 5,15
e 5,10 ppm, correspondentes ao H-12 olefínico típico da β-amirina e α-amirina
respectivamente.
Segundo El Deeb et al., 2003, o espectro de RMN de H1 da β-amirina
apresenta sinais de oito grupamentos metila em δH 0,98, 0,78, 0,92, 0,96, 1,12, 0,82,
0,86, 0,82, e apresenta sinais em 1,60 e 1,95 ppm, correspondentes a H-26 e H-28 e
ainda apresenta um sinal em (δH 5,17) indicando uma dupla ligação entre os
carbonos do H-12 e H-13, que também podem ser observados no espectro abaixo.
Figura 3: Espectro de RMN-1H da mistura de Lupeol, α-amirina e β-amirina (CDCl3).
48
( 2 ) H O
1 3
2 3 2 4
2 5 2 6
2 7
2 8
2 9
3 0
1 9 2 0
2 1 2 2
( 3 )
1
3
23 24
25 26
27
28
2 9
30
1920 21
22
2
4 67
8
11
12
13
15
16
1718
HO
9
( 4 )
1
3
2 3 2 4
25 2 6
2 7
28
2 9 30
1 9 20 2 1
2 2
2
4 67
8
1112
13
15
1 6
171 8
HO
9
Os dados obtidos para a substância B em comparação com os reportados na
literatura permitiram identificar o sólido amorfo, como uma mistura dos triterpenóides
lupeol (ME-2) α-amirina (ME-3) e β-amirina (ME-4) (CARVALHO et al., 1998;
JUNIOR et al., 2005; PUAPAIROJ, 2005). Estas substâncias também foram isoladas
na fração de hexano, como foi descrito anteriormente.
Esta mistura de triterpenos já foi isolada em outras plantas, como foi
demonstrado por Araújo e Chaves (2005), em folhas de Terminalia brasiliensis, por
Galotta e Boaventura (2005), que isolaram as substâncias na espécie Euterpe
precatória, e por Nogueira et al. (2004), que isolaram a mistura em frutos de
Hancornia speciosa. Também já foi citada por Souza et al. (2001), em espécies de
Gustavia longifólia e G. augusta, e ainda por Albuquerque et al. (2006), que isolaram
estas substâncias em flores de Eupatorium betonicaeforme. Da mesma forma,
Sanches et al. (2005), em Psidium guajava e Lima et al. (2005), em cascas de
Protium kleinii.
O lupeol é uma substância que se apresenta em cristais incolores e tem como
ponto de fusão 215-216 °C (MARQUES et al., 1998). Esta substância também já se
mostrou presente em Bombacopsis glabra, em espécies de Maytenus, nas cascas
de Phyllanthus flexuosus, em Arrabidaea samydoides, nas cascas de Terminalia
glabrescens, em cascas de Aspisdosdera parvifolium (PAULA et al., 2006; REYES et
al., 2006; TANAKA et al., 2004; PAULETTI et al., 2003; JACOMÉ et al., 2004). Além
disto, já foi encontrado em Zanthoxylum syncarpum, Z. rugosum e Z. ekmanii, como
é discutido por Facundo et al. (2005), que cita a ação inibitória in vitro da substância
contra o protozoário Plasmodium falciparum e ainda é citada por Pato�ka (2003),
que discute a presença do lupeol em diversas outras plantas.
Os triterpenos da série dos lupanos, são substâncias pentacíclicas com 30
átomos de carbonos, são biossinteticamente derivados a partir da ciclização do
49
esqualeno, e esta vasta classe de produtos naturais tem uma diversidade estrutural
que inclui uma ampla lista de grupos funcionais. As substâncias desta classe, tem
demonstrado bioatividade e citotoxicidade, além de promover atividades
antitumorais, antivirais e antiinflamatórias (REYES et al., 2006).
Estudos realizados demonstram que quando o lupeol administrado oralmente
na dose de 2 g/kg não produz efeitos adversos em ratos e camundongos, após 96
horas de observação. Outro estudo mostra também que quando o lupeol é
administrado oralmente ou via intra-peritonial na dose de 25-200 mg/kg apresenta
ação antiinflamatória em inflamações agudas e crônicas em ratos e camundongos. A
melhor atividade foi observada no edema induzido por carragenina. A marcante ação
antiinflamatória foi também demonstrada em modelos de artrite crônica e o efeito
observado é comparado ao do ácido acetil salicílico na dose de 100 mg/kg. Em
camundongos. Foi verificado que o lupeol tem a mesma atividade com uma dose
comparável de ácido acetil salicílico, da mesma forma, quando testado na artrite
induzida por formaldeído em ratos. Similarmente a outros agentes antiinflamatórios,
o lupeol reduz significantemente o volume de exudato e o valor total de leucócitos. A
redução do exudato (de 32%) após uma dose de lupeol de (200 mg/kg) foi
observada no teste de indução por ácido acético na permeabilidade vascular em
camundongos. Além disso o lupeol também se mostra um inibidor competitivo da
tripsina e da quimiotripsina (Ki no valor de 22 e 8 µM respectivamente) (PATO�KA,
2003). Por outro lado, o lupeol não produziu efeitos analgésicos e antipiréticos, mas
também, não induziu ulcera gástrica. Estas observações sugerem que o lupeol age
por um mecanismo de ação diferente do ácido acetil salicílico, e assim ele não inibe
a atividade da ciclooxigenase e a síntese de prostaglandinas. Umas das hipóteses é
que a atividade do triterpeno pentacíclico pode ser de ação imunossupressora, e
também faz a inibição de células de migração da inflamação, posicionando-se assim
na redução dos fatores quimiostáticos da pró-inflamação (PATO�KA, 2003).
Também, um outro estudo verificou a sua atividade inibitória na produção de
NO e PGE2 em macrófagos de ratos, sendo este considerado, um ensaio preliminar
na busca de novas substâncias antiinflamatórias. Desta forma, o lupeol mostrou-se
efetivo na produção de PGE2, entretanto os mesmos resultados não foram
demonstrados para NO (REYES et al., 2006). Ainda neste mesmo estudo, foi
demonstrado que uma alteração estrutural na substância, substituindo a metila em
C-28 por um grupo hidroximetil, aumenta significativamente os resultados na
50
produção de NO. Desta forma, podemos verificar que alterações estruturais nesta
estrutura conhecida, podem levar a obtenção de novas substâncias com diferentes
atividades farmacológicas, ou diferentes intensidades de ação, o que possibilita
novos estudos com esta substância.
Os triterpenos α-amirina e β-amirina têm demonstrado diferentes ações
farmacológicas podendo ser destacado a importante atividade analgésica e a
propriedade inibitória da enzima GAPHD de T. cruzi (OTUKI et al., 2005; NOGUEIRA
et al., 2004).
Em um estudo realizado por Lima-Júnior e cols. (2006), a mistura de α-
amirina e β-amirina isolada da resina de Protium heptaphyllum, foi avaliada no
modelo de nocicepção visceral estabelecidos em ratos. Os ratos foram tratados
oralmente com α-amirina e β-amirina ou veículo, e a resposta ao comportamento da
dor induzida indicou que o potencial antinociceptivo possivelmente envolve
mecanismos receptores opióide e vanilóide. Além disto, sugerem que eles podem
ser usados no tratamento de dores viscerais e intestinais de origem pélvica.
Em relação às subfrações 114-120 e 131-133, que também foram obtidas no
sistema de solventes Hexano:Acetona 8:2 e 75:25 respectivamente, apresentaram-
se puras, na forma de um pó branco. Quando submetidas à técnica de CCD com
posterior observação na luz UV, mostraram características fluorescentes indicando
serem possíveis cumarinas, que foram denominadas de ME-5 e ME-6.
Neste aspecto, o ME-5 (8mg) quando analisado através de RMN-1H (Figura
4), mostrou sinais característicos de cumarinas, quando comparados com a
literatura. Através destes dados, esta substância foi identificada como a 7-hidroxi-6-
metoxi-cumarina, conhecida por escopoletina (5).
O O
C H 3 O
H O
ME -5
1 2 3
4 5
8
Como pode ser observado, o dubleto em 7,84 ppm (J=9,4 Hz), foi atribuído ao
H-4. Além disso, pode-se observar dois singletes, um em 7,20 e outro em 6,80 ppm
correspondentes ao H-5 ao H-8, respectivamente. Na região de 6,17 ppm (J = 9,4
Hz) também se observa um dublete referente ao H-3. Já o singleto em 3,90 ppm,
51
está relacionado aos hidrogênios do grupo metóxi e o singleto em 8,77 ppm
representa o hidrogênio ligado ao C-7.
No espectro de RMN-13C (Figura 5), pode-se observar um sinal em 161,3
ppm correspondente ao C-2, assim como outros sinais em 153; 151,6; 146,2 e 143,9
ppm que foram atribuídos aos carbonos C-9; C-7; C-6 e C-4, respectivamente. Da
mesma forma, também se observam quatro sinais em 112,4; 111,1; 109,6 e 104,1
ppm os quais foram atribuídos aos carbonos C-10; C-3; C-5 e C-8 respectivamente.
Além disso, um sinal em 56,2 ppm característico de carbono oxigenado foi atribuído
ao grupo metóxi ligado à C-6 na estrutura.
O O
H O
ME -6
1 2 3
4 5
8
Por outro lado, ME-6 (6mg) através de análise do espectro de RMN de H1
(Figura 6), mostra sinais muito semelhantes à substância anterior. Assim, pode-se
observar quatro dupletes em 7,86 ppm (J = 9,1 Hz), 6,75 ppm (J = 2,3 Hz), 6,86 ppm
(J = 2,3) e 6,17 ppm (J = 9,1 Hz) atribuídos aos hidrogênios H-4, H-8; H-6 e H-3,
respectivamente. Também observa-se um dubleto de dubleto em 7,51 ppm (J = 8,5
Hz; 2,3 Hz), referente ao H-5, e um sinal em 9,4 ppm referente ao grupo OH. Através
destes dados, e em comparação com os reportados por Liu e Tian (2004), esta
substância foi identificada como 7-hidroxicumarina conhecida como umbeliferona (6).
As cumarinas são produtos que estão amplamente distribuídos na natureza, e
que exibem um grande perfil farmacológico. Desta forma, já foram citadas atividades
citotóxicas, antiaminésica, antitumoral, antinociceptiva, antivirais, anti-bacterianas,
antiagregadora de plaquetas, neuprotetivas e como ativadora de proteína quinase C,
para estas substâncias, além disto, foi feita a descrição de substâncias desta classe
com grande potencial anti-HIV (KANG et al., 2005; MELLIOU, 2005).
52
Figura 4: Espectro de RMN1H (400 MHz; Acetona-D6) da Escopoletina (ME-5)
53
Figura 5: Espectro RMN13C (100MHz; Piridina D5) da substância Escopoletina.
54
Muitas cumarinas simples possuem odor característico, amplamente utilizado
como aromatizante em alimentos industrializados, e atualmente continua sendo
utilizada nas indústrias de produtos de limpeza e cosméticos. A procura por
medicamentos de origem vegetal tem conduzido a um renovado interesse
farmacêutico em cumarinas, pelo fato destas substâncias mostrarem atividades
farmacológicas potentes e relevantes e serem de baixa toxicidade para mamíferos
(SIMÕES et al., 2004). A atividade antiespasmódica de alguns extratos vegetais de
espécies de Viburnum (Caprifoliaceae) tem sido atribuída ao teor de escopoletina e
outras cumarinas (ROBBERS et al., 1997).
A escopoletina já havia sido isolada anteriormente de outras espécies, como a
Casimiroa edulis, por Garcia-Argaéz et al. (2003), especialmente, isolada dos
troncos e galhos de Matayba arborescens, como descrito por Mesquita et al. (2005).
Segundo Oliveira et al. (2001), esta mesma cumarina, foi isolada nas raízes de
Brunfelsia hopeana Benth, e demonstrou a inibição das contrações de forma
aproximadamente igual quando comparada com a serotonina e PGF(2)(α). Neste
estudo, também foi demonstrado que a escopoletina não interfere com o suprimento
de noradrenalina intracelular e com armazenamento de cálcio. Sugerindo que a ação
espasmolítica não específica exercida pela escopoletina é atribuída, em menor
parcela, pela sua habilidade de inibição na mobilização do cálcio intracelular devido
ao armazenamento de noradrenalina.
Em estudos realizados por Cavalcanti et al. (2001), com extratos da espécie
de Cupania vernalis Camb. (Sapindaceae), a escopoletina que mostrou ser a
responsável pela moderada atividade antifúngica destes extratos contra
Saccharomyces cerevisiae. A escopoletina isolada de Artemísia feddei, favoreceu a
inibição na síntese de oxido nítrico em macrófagos (KANG et al., 1999).
Um estudo realizado por Godoy e cols. (2005), mostrou que a umbeliferona,
apresentou atividade antifúngica contra um fungo denominado de Atta sexdens,
fungo este que é um simbionte das formigas cortadeiras, que são consideradas
pragas na agricultura. Podendo assim, estas substâncias serem utilizadas em
métodos alternativos para o controle destes insetos, através da produção de
produtos com atividade antifúngica de origem natural.
55
Figura 6: Espectro RMN-1H (400MHz; Acetona-D6) da Umbeliferona (ME-6)
56
Ainda na coluna de clorofórmio, a subfração 184-187 (23mg), que foi coletada
durante a limpeza da coluna com acetona pura, apresentou uma substância amorfa,
de coloração branca, que foi denominada de ME-7. Após realizadas análises de
CCD, técnicas de RNM-1H e RMN-13C, determinação de seu ponto de fusão e
comparados com resultados obtidos por Carvalho et al., (2001), Matida et al. (1996)
e Malheiros (1995), o composto (ME-7), foi identificado como sendo o 3β-O-D-
glicopiranosil-sitosterol (7).
Neste aspecto, o espectro de RMN-1H (Figura 7), mostra que a substância
tem sinais de hidrogênios de grupos metila e metilenos em δ 0,6-2,8 ppm. Além
disto, os dubletes de δ 5,17 e 5,06 ppm correspondem ao H-6 indicando a dupla
ligação da estrutura. O sinal de δ 5,06 ppm, é típico do hidrogênio anomérico H-1’
da unidade glicosídica, e o sinal do dublete em 5,06 ppm (J=7,6 Hz), é relativo à
relação trans diaxial entre H-1’ e H-2’ e confirma a β configuração da glucose. Estes
dados podem ser observados na Tabela 2.
Já no espectro de RMN-13C (Figura 8), pode ser observado um sinal em
102,4 ppm referente ao C1’ de carbono anomérico da glucose. Também se observam
alguns sinais em 75,2; 77,9; 71,6 e 78,3 ppm correspondentes aos carbonos da
unidade glicosídica C-2’; C-3’; C-4’ e C-5’ e um sinal em 62,7 ppm, característico de
C-6’. Da mesma forma, podemos observar um sinal em 78,3 ppm, correspondendo
ao C-3 da aglicona. Além destes, podemos também verificar os sinais em δ 140,8 e
121,7 correspondentes aos carbonos da dupla ligação da estrutura. A posição da
dupla ligação entre C-5 e C-6, é confirmada pelo sinal em δ 140,6 e 121,6 ppm.
57
A substância 3β-O-D-glicopiranosil-sitosterol, já havia sido isolada
anteriormente nas partes aéreas de Galianthe brasiliensis e em Zanthoxylum
syncarpum e Z. rugosum (MOURA et al., 2006; FACUNDO et al., 2005). Também foi
isolada em Cupani vernalis, nas partes aéreas de Eriope blanchetti, nas folhas de
Terminalia glabrescens e em Calyptranthes pallens (CAVALCANTI et al., 2001;
DAVID et al., 2001; COSTA e CARVALHO, 2003; GARCEZ, et al., 2003; LOBO-
ECHEVERRI et al., 2005) Além disto, Galotta e Boaventura (2005), mostram que a
substância apresentou forte atividade citotóxica (DL50 = 67 µg/mL), quando testado
frente a Artemia salina. Este resultado se mostra promissor, pois substâncias cuja
DL50 estiverem na faixa de 80-250 µg/mL podem apresentar atividade tripanomicida.
Por outro lado, substâncias com DL de toxicidade menor que 145 µg/mL podem
apresentar atividade anti-tumoral (DOLABELA, 1997).
Figura 7: Espectro de RMN-1H (C5D5N, 400 MHz), de 3-O-β-glicopiranosyl-sitosterol.
58
Tabela 2: Dados espectrais comparativos, do 3β-O-D-glicopiranosil-sitosterol na
literatura e dos valores encontrados para substância ME-7.
Posição
δδδδ 13C –3ββββ-O-D-
glicopiranosil-
sitosterol
δδδδ 13C - ME-7
δδδδ 1H –3ββββ-O-D-
glicopiranosil-
sitosterol
δδδδ 1H - ME-7
1 37,2 37,3
2 29,9 30,1
3 78,2 78,3
4 39,0 39,2
5 140,6 140,8
6 121,6 121,7 5,35 dd 5,17 dd
7 31,9 31,9
8 31,8 30,3
9 50,0 50,2
10 36,6 36,3
11 21,0 21,1
12 39,6 39,8
13 42,2 42,3
14 56,5 56,7
15 24,2 24,1
16 28,2 28,3
17 55,9 56,1
18 11,7 11,8 0,66 s 0,77 s
19 19,1 19,2 0,93 m 0,97 m
20 36,1 34,1
21 18,9 19,0
23 26,1 26,2
24 45,7 45,9
25 29,2 29,3
26 18,7 18,8
27 19,7 19,8
28 23,1 23,2
29 11,9 11,9
59
Figura 8: Espectro de RMN-13C (C5D5N, 100 MHz), de 3-O-β-glicopiranosyl-
sitosterol (ME-7).
5.1.3.1 Reavaliação cromatográfica da fração clorofórmio
Na tentativa de isolar outras substâncias da fração de clorofórmio uma nova
cromatografia em CC foi realizada. Neste sentido, foi eluída com uma fase móvel
Clorofórmio:Metanol em diferentes proporções possibilitando obter 280 subfrações.
A subfração 215-245 (90mg), apresentou-se como um sólido amorfo, com ponto de
fusão 258-260 0C e foi denominada de ME-8. A substância foi submetida a análises
de CCD e posteriormente às técnicas de IV e RMN-1H e RMN-13C para sua
identificação.
No espectro de IV podem-se observar absorções características de
estiramento do grupo hidroxila em 3380 cm-1 e oleifínicos pelo sinal em 1646 cm-1,
além disto, vemos outros sinais em 2940 cm-1 de estiramento CH e em 1027 um
sinal característico de C-O (Figura 9).
60
Figura 9: Espectro de IV da substância ME-8 (Betulina).
O espectro de RMN-1H (Figuras 10 E 11), permite sugerir que se trata de um
triterpeno da série dos lupanos com uma função diol. Isto se dá pela presença de
sinais na forma de dois singletos em 4,68 e 4,57 ppm atribuídos aos H-29a e H-29b
presentes nesta série, respectivamente. Dois dupletos em 3,82 e 3,30 ppm foram
atribuídos aos hidrogênios H-28a e H-28b. Além disso, a presença de um duplo
dubleto em 3,16 e um singleto em 1,68 ppm foram relacionados aos H-3 e H-30,
respectivamente.
HO
OH
1
3
23 24
25 26
27
28
29
30
19
2021
22
( ME-8 )
O espectro de RMN1H mostra na forma de singletos, seis grupos metilas em
0,96, 0,76, 0,81, 1,07, 0,98 e 1,68 ppm correspondendo aos C-23, C-25, C-26, C-24,
C-27, C-30 respectivamente; os dados de RMN1H ainda mostram um hidroximetileno
61
em 3,22, 3,78 ppm, correspondendo ao C-28 ppm, um metino hidroxilado em 3,13
ppm, correspondendo ao C-3, dois hidrogênios oleifínicos em 4,66, 4,65 ppm
correspondentes ao C-29. Além disso, podemos comparar os dados encontrados em
estudos de Falcão et al. (2003), Lavoite (2001) e Alberton (2001), o que possibilita
concluir que ME-8 é um triterpeno denominado Betulina (8) (Tabela 3).
A substância betulina também foi isolada das folhas e das cascas de
Terminalia brasiliensi (ARAÚJO e CHAVES, 2005; GARCEZ et al., 2003). Ainda foi
isolada de cascas de Phyllanthus flexuosus, em Salvia mexicana L. var. minor, de
espécies de Maytenus e das cascas de Melaleuca alternifólia, além de outras plantas
(TANAKA et al., 2004; DELIRA et al., 2003; REYES et al., 2006; VIEIRA et al., 2004).
Os triterpenos pentacíclicos em geral representam uma classe muito grande
de metabólitos secundários, e tem demonstrado exibir uma grande variedade de
atividades biológicas. Já foram relatados efeitos biológicos dos triterpenos incluindo
citotoxicidade, efeitos anti-tumoral e atividades antivirais, bactericida, fungicida,
espermicida, cardiovasculares, analgésicas entre outras, como a atividade
antiinflamatória destas substâncias que está relacionada com as diversas proteínas
celulares e extracelulares (PATO�KA, 2003; ZDZISI�SKA et al., 2003).
Dentre essa classe de substâncias, a betulina é um dos precursores na
biossíntese de uma das mais potentes substâncias encontrada neste grupo, o ácido
betulínico. A betulina foi um dos primeiros produtos naturais isolados de plantas
como substância quimicamente pura. Ela foi isolada por Lowitz em 1788 por
sublimação de raízes de bétula. A estrutura química da betulina foi completamente
elucidada em 1952. Alguns anos mais tarde esta substância foi encontrada em
outras espécies de plantas da família Betulaceae (PATO�KA, 2003).
A betulina é um valioso componente de produtos cosméticos. A substância
pura e o extrato de raízes de bétula são utilizados em condicionadores de cabelo e
como aditivos na produção de xampu. Na Finlândia, aonde consideráveis amostras
de raízes de bétula são descartadas na indústria de madeira (200.000 ton/ano), são
obtidas 2500 toneladas de substância, onde 95% são de betulina, foram feitas
intensivas pesquisas conduzindo a utilização da betulina como um precursor na
manufatura de vernizes, para proteção e resistência de tintas contra água, agentes
químicos e biológicos (PATO�KA, 2003).
62
Tabela 3: Dados espectrais em RMN1H RMN13C, da betulina na literatura em
comparação aos valores encontrados para substância ME-8.
Posição δδδδ 13C – Betulinaa δδδδ 13C – ME-8 δδδδ 1H – Betulinaa δδδδ 1H – ME-8
1 38,9 38,76
2 27,1 26,96
3 78,9 78,78 3,19 dd 3,16 dd
4 38,9 38,83
5 54,6 55,33
6 18,0 18,30
7 34,0 34,22
8 40,3 40,91
9 52,0 50,40
10 37,6 37,12
11 20,5 20,84
12 25,1 25,24
13 36,6 37,30
14 42,5 42,69
15 30,1 29,70
16 31,7 33,95
17 48,1 47,82
18 47,7 47,72
19 48,5 48,42 2,39 td 2,38 td
20 150,5 150,66
21 29,1 29,15
23 28,0 27,87 0,66 s 0,66 s
24 15,5 15,36
25 15,8 15,88 0,77 s 0,76 s
26 15,9 16,06 0,81 s 0,83 s
27 14,8 14,70 0,96 s 0,95 s
28 60,3 59,86 3,82 / 3,33 d 3,82 / 3,30 d
29 109,6 109,57 4,68 / 4,58 s 4,68 / 4,57 s
30 19,1 19,03 1,62 s 1,68 s aFalcão et al., (2003); Lavoite (2001); Alberton (2001).
63
A betulina possui atividade antiinflamatória descrita na literatura, mostrando
ser um potente inibidor da fosfolipase A2. Estudos mostram a sua habilidade em
induzir e modular a produção de citocina humana em culturas de células do sangue,
indicando que a betulina é um indutor moderado de TNF-α e também um excelente
indutor mitogênico na produção de TNF-α (ZDZISI�SKA et al., 2003). Um outro
estudo, verificou a sua atividade inibitória na produção de NO e PGE2 em
macrófagos de ratos, sendo este um ensaio preliminar na busca de novas
substâncias antiinflamatórias. Desta forma, a betulina mostrou-se efetiva na
produção de NO e PGE2 (REYES et al., 2006).
Estudos revelaram a marcante inibição da indução por carragenina e por
serotonina no edema de pata de rato, e esta ação foi comparada a agentes
antiinflamatórios padrões como fenilbutazona e dexametasona. Sendo que foi
concluído que os derivados do lupano (triterpenos esteroidais), tem afinidade por
receptores glicocorticóidais. O mecanismo de ação foi confirmado com o triterpeno
mostrando atividade antiinflamatória nos testes com modelos de indução de edema
de pata com serotonina e carragenina; e edema de olho induzido por TPA e por
EPP. A administração de progesterona, actinomicina D e ciclohexamida, ajudaram a
esclarecer o mecanismo de ação glicocorticoidal do composto (RECIO et al., 1995;
PATO�KA, 2003).
Além disto, outro estudo com a substância, realizado por Wang e Polya
(1996), mostrou a capacidade de a betulina fazer a inibição seletiva do AMP cíclico
dependente da proteína quinase (cAK), em fígados de ratos.
Reyes e cols. (2006) prepararam derivados da betulina através de reações de
acetilação e confirmaram que a reatividade da hidroxila do grupo ligado ao C-28 é
muito maior em relação a C-3, e que o C-28 acetoxi pode ser obtido em grande
concentração (77,5%).
Desta forma, podemos comparar a betulina com uma substância que difere
apenas com uma substituição na carboxila em C-28, e chamada de ácido betulínico,
onde demonstrou atividade contra a replicação do HIV. O ácido betulínico quando
sofre alterações estruturais (estereficações na hidroxila de C-3), mostra um
grandioso aumento no seu potencial anti-HIV. A betulina é menos potente que o
ácido betulínico, entretanto adicionando-se ésteres 3’,3’-dimetilglutaril em C-3 e C-28
nos grupos hidroxila esta substância ganha um aumento de potência. Tendo valores
tão bons quanto àqueles do ácido betulínico e seus análogos estereficados. Sendo a
64
betulina diestereficada mais ativa que o ácido betulínico esterificado em C-3 e que a
betulina monoesterificada em C-28 (LEE, 1999; LEE, 2004). Isto comprova que as
alterações estruturais podem levar a obtenção de substâncias com grande
bioatividade, a partir de substâncias bastante conhecidas e de fácil obtenção.
5.1.4 Fração Acetato de Etila (AE)
Após CC foram obtidas 11 subfrações. A subfração 148-177 (15 mg) foi
denominada de (E). Após analises de CCD e Co-CCD esta substância foi submetida
às técnicas de RMN-1H e RMN-13C para identificação, entretanto os resultados ainda
não estão disponíveis.
Por outro lado, a subfração 107-132 (585mg) foi submetida a uma nova CC
obtendo-se novas subfrações. Da subfração 22-42 (200mg), foi possível isolar duas
substâncias que foram denominados de (F) e (G), entretanto, ainda estão em
processo de identificação. Estas substâncias quando revelados com cloreto férrico a
3% em técnicas de CCD, mostram coloração característica de substâncias fenólicas.
5.1.5 Fração Butanólica
O eluente mais o produto carreado na CC da fração de butanol foi recolhido
totalizando 23 subfrações. Após análise do perfil cromatográfico, as frações
semelhantes foram reunidas dando origem a outras subfrações.
Dentre estas subfrações, a subfração 6-7 (119mg) obtida no sistema de
solvente 95:5 (Clorofórmio:Metanol), foi denominada de (D). Através de CCD
utilizando o revelador cloreto férrico a 3%, sugere-se que a substância seja da
classe dos flavonóides, por apresentar coloração característica. Entretanto, esta
substância está sendo submetida à análise através de técnicas de RMN para sua
elucidação.
65
Figura 10: Espectro RMN-1H (400 MHz, CDCl3),de ME-8 na região de 2 a 5 ppm.
66
Figura 11: Espectro RMN-1H (400 MHz, CDCl3), de ME-8 na região de 0 a 2,5 ppm.
67
Figura 12: Espectro de RMN13C (100 MHz, CDCl3) de ME-8
68
5.2 Resultados Biológicos
5.2.1 Atividade antimicrobiana
5.2.1.2 Teste Bioautográfico
Na pesquisa e localização de componentes com potencial antimicrobiano, a
bioautografia (HAMBURGER & CORDEL, 1987; RAHALISON et al., 1994). É uma
importante ferramenta de ajuda para o isolamento direcionado de compostos ativos
presentes em misturas complexas (SOUZA, et al, 2003). Neste aspecto, as frações
de Hexano, Clorofórmio, Acetato de Etila, Butanol e os extratos metanólico e
hidroalcoólico foram submetidos a esta técnica. Como pode ser observado na
Figura 13, as frações de Hexano, Clorofórmio e Butanol mostraram efeito
antimicrobiano, com halos de inibições em diferentes valores de Rf (fator de
retenção), sugerindo diferentes substâncias bioativas. Por outro lado, os extratos
metanólico e hidroalcoólico e a fração de acetato de etila não apresentaram halos de
inibição consideráveis, talvez pela baixa concentração das substâncias ali presentes.
Estes resultados redirecionaram os estudos fitoquímicos para as frações
efetivas na tentativa de isolar os princípios ativos responsáveis pela atividade
antimicrobiana.
Figura 13: Placas do teste bioautográfico dos extratos e frações de M.elaeagnoides.
69
5.2.1.3 Concentração Inibitória Mínima
Um método clássico utilizado em testes in vitro, é a diluição em meio, que
produz resultados da quantidade mínima de agente antimicrobiano necessária para
inibir o crescimento de um microorganismo específico. O método da macrodiluição
consiste em se preparar diluições sucessivas do antimicrobiano a ser testado, em
meios de cultura sólidos ou líquidos, semear a bactéria ou fungo em estudo e após
incubação verificar a menor concentração (maior diluição) que inibiu o crescimento
do microrganismo.
Como pode-se observar na Tabela 4, os extratos e as frações apresentaram
atividade contra a bactéria Gram positiva Staphylococcus aureus. Por se tratar do
extrato bruto e suas frações, os resultados podem ser considerados promissores, no
sentido de que alguns componentes foram isolados destas frações, podendo estes,
agirem individualmente ou de forma sinérgica nesta atividade.
Comparando os resultados observados para as frações de Hexano e de
Clorofórmio com dados da literatura, podemos dizer que parte desta atividade pode
ser atribuída as substâncias β-sitosterol, (isolada na fração de Hexano) e α-amirina e
β-amirina (isolados na fração de clorofórmio). Segundo Sanches et al. (2005), estas
substâncias mostraram atividade contra S. aureus com Concentração Inibitória
Mínima de 100 µg/ml, valor este considerado pouco ativo, para substâncias puras.
Entretanto, estas substâncias podem ter ação sinérgica com outras substâncias
presentes nestas frações. Por outro lado, quando comparamos o Rf dos halos de
inibição na bioautografia, com o Rf de cada uma das substâncias isoladas, notamos
que os valores são diferentes, o que descarta esta hipótese.
Também foi realizado o teste da Concentração Inibitória Mínima para a
substância betulina, entretanto os resultados não foram satisfatórios, e mostraram-se
acima de 1000 µg/ml, o que descaracteriza esta atividade antimicrobiana para S.
auresu, E. coli e C. albicans.
70
Tabela 4: Análise da atividade antimicrobiana dos extratos e frações de M.
elaeagnoides
Material testado MIC (µµµµg/mL)
S.aureus E. coli
EMB 800 > 1000 Fr. Hexano 200 > 1000 Fr. CHCl3 500 > 1000 Fr. AcOEt 300 > 1000 Fr. BuOH 600 > 1000
EH 500 > 1000 Betulina > 1000 > 1000
S. aureus (Staphylococcus aureus); E. coli (Escherichia coli); EMB (extrato metanólico bruto); Fr. Hexano (fração hexano); Fr. CHCl3 (fração clorofórmio); Fr. AcOEt (fração acetato de etila); Fr. BuOH (fração butanol); EH (extrato hidroalcoólico).
5.2.1.4 Atividade Antifúngica
Os extratos e as frações obtidos também foram testados frente a 10 tipos
diferentes de fungos. Como pode ser observado na Tabela 5, um resultado bastante
promissor foi encontrado para o fungo Microsporum gypseum (C 115 2000). Para os
outros fungos, o resultado foi negativo, o que não descarta a possibilidade de uma
possível atividade das substâncias isoladas.
Por outro lado, já era de se esperar um resultado positivo para a fração de
clorofórmio contra o fungo Microsporum gypseum maior do que o encontrado de 125
µg/ml, que estaria relacionada à presença do composto umbeliferona nesta fração.
Como já foi destacado em estudos realizados por Vajs e cols. (2004), este composto
apresenta atividade contra diversos tipos de fungos como: Aspergillus niger, A.
ochraceus, A. versicolor, A. flavus, A. terreus, P. ochrochloron, P. funiculosum, T.
viride, C. cladosporioides e A. alternata. Entretanto, esta comparação com o fungo
com maior inibição não pode ser feita, pois ele não foi testado no estudo comentado.
71
Tabela 5: Análise da atividade antifúngica dos extratos e frações de Matayba
elaeagnoides (µg/mL).
Material
testado
Ca
Ct
Sc
Cn
Afu
Afl
An
Mg
Tr
Tm
Fr. Hexano >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
Fr. CHCl3 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 125 >250 >250
Fr. BuOH >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
Fr. AcOEt >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
EMB >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
EHA >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
Ca (Candida albicans), Ct (Candida tropicalis), Sc (Saccharomyces cerevisiae), Cn (Cryptococcus neoformans), Afu (Aspergillus fumigatus), Afl (Aspergillus flavus), An (Aspergillus niger), Mg (Microsporum gypseum), Tr (Trichophyton rubrum), Tm (Trichophyton mentagrophytes); EMB (extrato metanólico bruto); Fr. Hexano (fração hexano); Fr. CHCl3 (fração clorofórmio); Fr. AcOEt (fração acetato de etila); Fr. BuOH (fração butanol); EHA (extrato hidro-alcoólico).
5.3 Atividade antinociceptiva: Método do ácido acético
Na tentativa de verificar uma possível ação antinociceptiva dos extratos e
frações, o método de dor induzida pelo ácido acético 0,6% em camundongos foi
utilizado. Este modelo foi desenvolvido por Collier et al. (1968), e ligeiramente
modificado por vários pesquisadores ao longo dos anos. Embora este seja um
modelo de nocicepção simples e pouco específico, ele permite avaliar em um
primeiro momento a atividade analgésica de várias substâncias que atuam tanto ao
nível central quanto periférico (BAGGIO, et al., 2002; MIRANDA et al., 2002;
ANTONIOLLI, 2003).
Como pode ser observado na Tabela 6, entre as amostras analisadas, a
fração de acetato de etila e o extrato hidroalcoólico mostraram os resultados mais
significativos, apresentando porcentagens de inibição das contorções abdominais de
66,0 e 71,1%, respectivamente. Entretanto, nenhum dos resultados pode ser
descartado, pois os valores encontrados para os extratos brutos e suas respectivas
frações, mostram uma ação superior quando comparada com medicamentos de
referência utilizados na clínica como a aspirina e o paracetamol, que causaram
inibições de 35 e 38%, respectivamente.
72
Tabela 6: Atividade antinociceptiva de extratos brutos e frações das cascas de M.
elaeagnoides em comparação com medicamentos utilizados na clínica, no modelo
das contorções abdominais induzidas por acido acético (0,6%) (10 mg/kg, i. p.).
Material testado Inibição (%)
EMB 54,6 + 2,8 EHA 71,1 + 1,9
Fr. Hexano 46,4 + 1,5 Fr. AcOEt 66,0 + 0,6 Fr.CHCl3 46,4 + 0,4 Fr. BuOH 25,7 + 2,4
aParacetamol 38,0 + 1,0 aÁcido Acetil Salicílico 35,0 + 2,0
aDados de Bresciani et al. (2003).
Quando se analisou o efeito antinociceptivo da substância betulina (3-10
mg/kg, i.p.) no teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, os
resultados mostraram-se bastante promissores, com um valor calculado de DI50 de
17,5 (14,7-20,5) µmol/Kg, e uma inibição máxima (IM) de 58,33% em relação ao
grupo controle (Figura 14). Quando estes dados são comparados com os dados
fornecidos por Niero (2000) e Bresciane et al. (2003), com resultados de dois
medicamentos utilizados terapeuticamente, como a Aspirina DI50 de 133,0 (73,0-
243,0) µmol/Kg e IM de 35,0%, e com o Paracetamol DI50 125,0 (104,0-250,0)
µmol/Kg e IM de 38%, verifica-se que a betulina apresenta valores sete vezes
superiores aos encontrados para estes medicamentos.
Os analgésicos pertencem a uma das classes de fármacos mais vendidas no
mundo, responsável por cifras da ordem de centenas de bilhões de dólares
(HONÓRIO et al., 2006). Desta forma, a substância mostra possuir um potencial
analgésico, passível de estudos mais aprofundados no intuito de incluí-la nesta
classe de analgésicos que é de suma importância para a indústria farmacêutica e
saúde da população. Neste sentido, são necessários outros testes mais específicos
com esta substância para que comprovem a atividade antinociceptiva, bem como
outros estudos que comprovem a sua segurança para utilização.
73
Figura 14: Efeitos da betulina (3-10 mg/Kg) no tese de contorções induzidas pelo
ácido acético i.p. Cada grupo representa a media de 6 animais e as linhas verticais
os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle, **p<0.01., *p<0.05.
5.4 Modelo de dor induzida pela formalina
O teste da formalina é um dos modelos mais utilizados para explicar os
mecanismos de dor, com melhores resultados do que os testes que utilizam
estímulos mecânicos ou térmicos. O modelo avalia duas fases distintas. A primeira
fase representa o efeito irritante da formalina nas fibras-C sensoriais. A segunda é
uma resposta de dor inflamatória. Analgésicos de ação central inibem as duas fases
do teste. No entanto, substancias de ação periférica, como os antiinflamatórios não
esteroidais e corticosteróides, inibem somente a segunda fase (BAGGIO et al., 2002;
MIRANDA et al., 2002; ANTONIOLLI, 2003).
Neste teste, os resultados mostraram valores significativos entre os
tratamentos com diferentes doses e o grupo controle tanto na primeira quanto na
segunda fase. Como pode ser observado, na Figura 15, a betulina (3-10 mg/Kg),
administrado por via i.p., foi capaz de inibir de forma parcial a nocicepção de origem
neurogênica, com DI50 de >10mg/Kg e IM de 40,8% (Figura 15 A). Por outro lado, foi
mais eficaz em reduzir a nocicepção inflamatória com valores calculados de DI50
18,79 (17,7-19,9) µmol/Kg e IM de 64,39%, respectivamente (Figura 15 B). Quando
comparamos estes resultados com dados da literatura fornecidos por Niero (2000),
que mostram que a aspirina e o paracetamol são inativos na primeira fase do teste
74
da formalina e que os dados para a segunda fase do teste da formalina são para
aspirina de 123,0 (77,0-209,0) µmol/Kg e IM 88,0% e para o paracetamol 120,0
(90,0-161,0) µmol/Kg e IM de 85,0%, verificamos que os dados encontrados para a
betulina são melhores que estes medicamentos nas duas fases do teste. Na primeira
fase a betulina se mostrou ativa enquanto os 2 medicamentos utilizados na clínica
foram inativos indicando que esta substância pode atuar na dor neurogênica, e na
segunda fase do teste de formalina os dados obtidos na DI50 da betulina são 6 vezes
superiores aos encontrados para os medicamentos aspirina e paracetamol como
podemos observar na tabela 7.
Tabela 7: Efeito antinociceptivo entre a betulina, aspirina e paracetamol no modelo
da formalina, i.p.
Tratamento
DI50
(mg/Kg, i.p.)
DI50
(µmol/Kg, i.p.)
IM (%)a
Betulina >10,001
8,32 (7,83-8,84)2
NC1
18,79 (17,7-19,9)2
40,81
64,391
Aspirina* Inativa1
22,1 (13,9-37,6)2
NC1
123,0 (77,0-209,0)2
NC1
88,02
Paracetamol* Inativa1
18,1 (13,6-24,3)2
NC1
120,0 (90,0-161,0)2
NC1
85,02
1: 1a fase 2: 2a fase a Inibição Máxima
NC = Não Calculada
* Dados de Niero (2000).
É importante notar que a substância analisada também foi efetiva em inibir o
edema de pata induzido pela injeção intraplantar de formalina (Figura 16). O que
mostra o possível efeito antiinflamatório da betulina.
75
Figura 15: Efeito antinociceptivo da Betulina (3-10 mg/Kg) teste da formalina pela
administração i.p. A: primeira fase (0-5 min.) e B: segunda fase (15-30 min.) Cada
grupo representa a media de 6 animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere
significativamente do grupo controle, **p<00,1., *p<0.05.
Figura 16: Efeito da atividade antiinflamatória da Betulina na formação de edema no
teste da formalina pela administração i.p. Cada grupo representa a media de 6
animais e as linhas verticais os E.P.M. Difere significativamente do grupo controle,
**p<00,1., *p<0.05.
5.5 Atividade antiparasitária in vitro
Recentemente um estudo realizado por Mesquita e cols. (2005) mostrou
atividade antimalárica in vitro de alguns compostos purificados da fração hexânica
de Matayba guianensis, cujas CI50 variaram de 2,5 a 8,9 µg/ml contra a cepa FcB1
76
de Plasmodium falciparum resistente a cloroquina. Entretanto, em nosso estudo, nas
três frações e no extrato avaliado, observam-se significativas taxas de inibição in
vitro contra T. cruzi ou L. amazonensis principalmente na fração de Hexano (Tabela
7). Resultados estes que pode estar relacionados às substâncias isoladas desta
fração, o que abre caminho para estudos posteriores.
Tabela 8. Triagem inicial do extrato e frações da atividade leishmanicida e
tripanocida in vitro. Percentuais de inibição acima de 40% na concentração de 0,1-
1,0 mg/ml, foram considerados ativos.
% de inibição (parasitos x 106/ml)
Trypanossoma cruzi Leischmania amazonensis
Extrato e Frações
Analisados 1 mg/ml 0,1 mg/ml 1 mg/ml 0,1 mg/ml
EMB 15,5%(19,1) 0% (231,4) 80,7% (8,3) 24,2%(38,5)
Fr. Hexano 75,7% (5,5) 0% (29,7) 100% (0,0) 33,5%(33,2)
Fr. AcOEt 17,1%(18,8) 0% (33,0) 47,0%(37,9) 25,4%(26,9)
Fr. BuOH 15,9%(19,5) 0% (24,2) 78,0%(11,1) 26,4%(37,4)
77
6. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que:
- As cascas de Matayba elaeagnoides apresentam vários constituintes químicos,
identificados através de técnicas de RMN-1H, RMN-13C, como: α-amirina, β-amirina,
lupeol, 3β-O-D-glicopiranosil-sitosterol, β-sitosterol, escopoletina, umbeliferona e
betulina.
- Todos os extratos e frações apresentaram atividade antimicrobiana contra a
bactéria S. aureus.
- Apenas a fração de clorofórmio apresentou atividade antifúngica contra o M.
gypseum.
- A fração de hexano apresentou uma importante ação antiparasitária.
- Tanto os extratos como as frações apresentaram ação antinociceptiva e ambos os
modelos de dor estudados.
- Os resultados mais promissores em relação à atividade analgésica, diz respeito ao
Extrato hidroalcoólico e as frações de CHCl3 e Acetato de Etila.
- A substância isolada betulina mostrou-se 7 vezes mais potente do que dois
medicamentos utilizados na clínica: aspirina e paracetamol, nos testes da dor
induzidos pelo ácido acético e pela formalina.
- Sugere-se a continuidade dos estudos no intuito de isolar outras substâncias
presentes nas frações ativas.
,
78
REFERÊNCIAS
ALBERTON, M. D. Investigação fitoquímica de Zollernia ilicifolia (Brongniart) Vogel (Fabaceae): Contribuição ao controle de qualidade de espinheira-santa (Maytenus spp.). Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Farmácia como requisito à obtenção do grau de Mestre em Farmácia da Universidade Federal de Santa Catarina, 99 p., 2001. ALBUQUERQUE, M.R.J.R.; PIRES, A.M.L.; PESSOA, O.D.L.; SILVEIRA, E.R. Terpenoids, flavonoids and other constituints of Eupatorium betonicaeforme (Asteraceae). J. Braz. Chem. Soc. v. 17, n. 1, p. 68-72, 2006. ANTONIOLLI, A.R.; VILLAR, J.C. Atividade antinociceptiva e toxicidade aguda do extrato aquoso de Vitex gnus-castus L. An. Sem. Pesq. FAP-SE, 2003 ARAÚJO, D.S.; CHAVES, M.H. Triterpenóides pentacíclicos das folhas de Terminalia brasiliensis. Quim. Nova. v. 28, n. 6, p. 996-999, 2005. ASSAD, A.L.D.; FERRO, A.F.P. Biodiversidade e sua utilização na geração de fitoterápicos. Fármacos e Medicamentos. n. 37, ano VI, p. 14-18, 2005. BACKES, P.; IRGANG, B. Árvores do sul: As principais espécies nativas sul-brasileiras. Instituto Souza Cruz. 2002. BAGGIO, M.M.; LIMA, M.E.L.; VEASEY, E.A.; HARAGUCHI, M.; Atividades farmacológicas das folhas da Sesbania virgata (Cav.) Pers. Arq. Inst. Biol. v. 69, n. 4, p. 49-53, 2002. BALUNAS, M. J.; KINGHORN, A. D. Drug discovery from medicinal plants. Life Sciences., 78, p.431-441, 2005. BARREIRO, E. J. Estratégia de simplificação molecular no planejamento racional de fármacos: A descoberta de novo agente cardioativo. Quim. Nova. v. 25, n. 6B, p.1172-1180, 2002. BARREIRO, E. J.; VIEGAS JR, C.; BOLZANI, V. S., Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Quim. Nova. v. 29, n. 2, p.1-12, 2006. BORELLI, F.; CAPASSO, R.; CAPASSO, F. Herbal remedies: promises with risk. Nat. Prod. Comm. v. 1, n. 1, p. 77-79, 2006. BRANDÃO, D. C. O registro de fitoterápicos no Brasil. Fármacos e Medicamentos. n. 37, ano VI, p. 14-18, 2005. BRESCIANI, L.F.V.; PRIEBE, J.P.; YUNES, R.A.; DAL MAGRO, J.; DELLE MONACHE, F.; DE CAMPOS, F., DESOUZA, M.M., CECHINEL FILHO, V. Pharmacological and phytochemical evaluation of Adiantum cuneatum growing in Brazil. Z. Naturforsch., v.58c, p.191-194, 2003.
79
BUENO, N.R.; CASTILHO, R.O.; COSTA, R.B.; POTT, A.; POTT, V.J.; SCHEIDT, G.N.; BATISTA, M.S. Medicinal plants used by the Kaiowá and Guarani indigenous populations in the Caarapó Reserve, Mato Grosso do Sul, Brazil. Acta Bot. Bras. v. 19, n.1, p.39-44, 2005. BUTLER, M. S., Natural products to drugs: natural product derived compounds in clinical trials. Nat. Prod. Rep., v. 22, p. 162-195, 2005. CALIXTO, J. B. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin América: A personal view. J. Ethnopharmacol. v. 100, p. 131-134, 2005. CARVALHO, M.G.; VELANDIA, J.R.; OLIVEIRA, L.F.; BEZERRA, F.B. Triterpenos isolados de Eschweilera longipes Miers (Lecythidaceae). Quim. Nova. v.21., n.6, 1998. CARVALHO, M. G.; VEJA, M.R.G.; VELANDIA, J.R.; BRAZ FILHO, R. Chemical constituints from Piper fulvescens – complete H1 and C13 NMR assigments of neolignans and 3β-O-β-D-glucopyranosil-5,6-epoxy-β-sitosterol. Rev. Latinoamer. Quim. Rio de Janeiro, v. 29, n. 2, p. 63-71, 2001. CAVALCANTI, S.B.T; TELES, H.L.; SILVA, D.H.S; FURLAN, M.; YOUNG, M.C.M.; BOLZANI, F.S. New Tetra-acetylated oligosaccharide Diterpene from Cupania vernalis. J. Braz. Chem. Soc. v. 12, n. 3, p. 413-416, 2001. CECHINEL FILHO, V.; YUNES R.A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Quim. Nova, v. 21, n. 1, p. 99-105, 1998. COLLIER, H. D. J.; DINNEEN, L.C.; JOHNSON, C.A.; SCHENEIDER, C. The abdominal response and its suppression by analgesic drugs in the mouse. Br. J. Pharmacol, v. 32, p. 295-310, 1968. COSTA, P.M.; CARVALHO, M.G. New triterpene isolated from Eschweilera longipes (Lecythidaceae). An. Acad. Bras. Cienc. v. 75, n. 1, p. 21-25, 2003. DAVID, J.P.; SILVA, E.F.; MOURA, D.L.; GUEDES, M.L.S.; ASSUNÇÃO, R.J.; DAVID, J.M. Lignanas e triterpenos do extrato citotóxico de Eriope blanchetti. Quim. Nova. v. 24, n. 6., p. 730-733, 2001. DELIRA, R.A.; PARRA-DELGADO, H.; APAN, M.T.R.; CAMACHO, A.N.; MARTINEZ-VÁSQUEZ, M. Isolation and chemical transformations of some anti-inflammatory triterpenes from Salvia mexicana L. var. minor Benth. Rev. Soc. Quim. Mex. v. 47, n. 2, p. 167-172, 2003. DIAS, B.F.S. A implementação da convenção sobre diversidade biológica no Brasil: desafios e oportunidades, Campinas, Disponíveis em: <http://www.bdf.fat.org.br/publicacoes/padct/bio/cap1/res.html>. Acesso em: 4 de agosto de 2004.
80
DI STASI, L. C.; HIRUMA-LIMA, C. A.; Plantas medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica. 2. ed. São Paulo: Ed. UNESP, 2002. DIEGUES, A. C. O mito moderno da natureza intocada. HUCITEC, São Paulo, 1996. DOLABELA, M. F.; Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil, 1997. EL DEEB, K. S., AL-HAIDARI R. A., MOSSA, J. S., ATEYA, A.; Phytochemical and pharmacological studies of Maytenus forsskaoliana. Saudi Pharm. J., v. 11, n. 4, oct. 2003. ERENO, D. Da natureza para a farmácia. Pesquisa FAPESP. v. 110. p. 78-81., 2005. ESTEVAN, D. A.; VIEIRA, A.O.S.; FERRUCCI, M.S. Sapindaceae na flora arbórea da bacia do rio Tibagi (Paraná). Departamento de Biologia Animal e Vegetal, Universidade Estadual de Londrina, Instituto de Botânica Del Nordeste-Universidad Nacional Del Nordeste, Corrientes, Argentina, 2000. FACUNDO, V.A.; SILVEIRA, A.S.P.; FILHO, R.B.; PINTO, A.C.; REZENDE, C.M. Constituintes químicos de Zanthoxylum ekmanii (URB.) ALAIN. Quim. Nova. v. 28, n. 2, p. 224-225, 2005. FALCÃO, D.Q.; FERNANDES, S.B.O.; MENEZES, F.S. Triterpenos de Hyptis fasciculata Benth. Rev. Bras. Farmacogn. v. 13, supl., p. 81-83, 2003. FAROMBI, E.O. African indigenous plants with chemotherapeutic potencials and biotechnological approach to the production of bioactive prophylatic agents. Afric. J. Biotechnol. v. 2 (12), p. 662-671, 2003. FERRUCCI, M.S.Cytotaxonomy of Sapindaceae with special reference of the tribe Paullinieae. Gen. and Mol. Biol. 23, 4, p. 941-946, 2000. GALOTTA, A.L.Q.A.; BOAVENTURA, M.A.D. Constituintes químicos da raiz e do talo da folha do Açaí (Euterpe precatoria, Mart., Arecaceae), Quim. Nova. v. 28, n. 4, p.610-613, 2005. GAO, L.M.; WEI, X.M.; HE, Y.Q. Studies on chemical constituints in of Clerodendrum bunguei. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 28 (11), p. 1042-1044, 2003. GARCEZ, F.R.; GARCEZ, W.S.; MIGUEL, D.L.S.; SEREA, A.A.T.; PRADO, F.C. Chemical Constituints from Terminalia glabrescens. J. Braz. Chem. Soc. v. 14, n. 3, p. 461-465, 2003. GARCIA-ARGAÉZ, A.N.; MARQUÉZ, C.; GONZÁLES-LUGO, N.M.; MARTING-VÁZQUEZ, M.; Cumarinas presentes en especies del género Casimiroa. Rev. Soc. Quim. Mex. v. 47, n. 2, p. 151-154, 2003.
81
GODOY, M.F.P.; VICTOR, S.R; BELLINI, A.M.; GUERREIRO, G.; ROCHA, W.C.; BUENO, O.C.; HEBLING, M.J.A.; BACCI JUNIOR, M.; SILVA, M.F.G.F.; VIEIRA, P.C.; FERNANDES, J.B.; PAGNOCCA, F.C. Inhibition of the Symbiotic Fungus of Leaf-Cutting Ants by Coumarins. J. Braz. Chem. Soc. v. 16, n. 3B, p. 669-672, 2005. GUARIM NETO, G., SANTANA S. R., SILVA J. V. B., Notas Etnobotânicas de espécies de Sapindaceae Jussieu. Acta. Bot. Bras. 14(3): 327-334. 2000. HAMBURGER, M. O., CORDELL, G. A., A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. v. 50, p. 1345–1346, 1987. HONÓRIO K. M.; ARROIO A.; SILVA A. B. F. Aspectos terapêuticos de compostos da planta Cannabis sativa. Quim. Nova. v. 29, n. 2, p. 318-325, 2006. HUNSKAAR, S; FASMER, O.B.; HOLE, K. Formalin test in mice, a useful technique for evaluating mild anlagesics. J. Neurosci. Methods, v. 14, p. 69-76, 1985. JACOMASSI, E. & PIEDADE, L. H. A importância das plantas com finalidades terapêuticas e suas aplicações na cidade de Goioerê - PR. Rev. UNIMAR v. 16, n. 2, p.335-353, 1994. JACOMÉ, R L.R.P.; OLIVEIRA, A.B.; RASLAN, D.S.; WAGNER, H., Estudo químico e perfil cromatográfico das cascas de Aspisdosperma parvifolium A. DC. (‘PAU PEREIRA”). Quim. Nova. v. 27, n. 6, p. 897-900, 2004. JUNIOR, G.M.V.; SOUZA, C.M.L.; CHAVES, M.H. Resina de Protium heptaphyllum: isolamento, caracterização estrutural e avaliação das propriedades térmicas. Quim. Nova. v. 28, n.2, 2005. KANG, T.H.; PAE, H.O.; JEONG, S.J.; YOO, J.C.; CHOI, B.M.; JUN, C.D.; CHUNG, H.T.; MIYAMOTO, T.; HIGUCHI, R.; KIM, Y.C. Scopoletin: an inducible nitric oxide synthesis inhibitory active constituent from Artemisia feddei. Planta Med. v. 65, n. 5, p. 400-403, 1999. KANG, S.Y.; LEE, K.Y.; SUNG, S.H.; KIM, Y.C. Four new neuroprotective Dihydropyranocoumarins from Angelica gigas. J. Nat. Prod. v. 68, p. 56-59, 2005. LAVOITE, S. Contribution à lá synthése de derives de L’Acide betulinique à partir du bétulinol extrait de L’écorre du bouleau Blanc (Betula papyrifera). Mémore presente à L’Université du Québec à Chicoutimi comme exigence partulle de la maîtrise em Ressources renouvelables. 2001. LEE, K.; MORRIS-NATSCHKE, S.L. Recent advances in the Discovery and development of plant-derived natural products and their analogs as anti-HIV agents. Pure Appl. Chem. v. 71, n. 6, p. 1045-1051, 1999. LEE, K. Current Developments in the Discovery and Design of New Drug-Candidates from Plant Natural Product Leads. J. Nat. Prod. v. 67, p. 273-283, 2004.
82
LEITE, F. Controle de Qualidade de Fitoterápicos. Fármacos e Medicamentos. n. 37, ano VI, p. 14-18, 2005. LIMA, F.V.; MALHEIROS, A.; OKUTI, M.F.; CALIXTO, J.B.; YUNES, R.A.; CECHINEL FILHO, V.; MONACHE F.D. Three New Triterpenes from the Resinous Bark of Protium kleinii and their Abtinociceptive Activity. J. Braz. Chem. Soc. v. 16, n. 3B, p. 578-582, 2005. LIMA, M. R. F.; LUNA, J. S.; SANTOS, A. F.; ANDRADE, M. C. C.; SANT’ANA, A. E. G.; GENET, J.; MARQUEZ, B.; NEUVILLE, L.; MOREAU, N., Anti-bacterial activity of some Brazilian medicinal plants. J. Ethnopharmacol. v. 105, p. 137-147, 2006. LIMA-JÚNIOR, R.C.P.; OLIVEIRA, F.A.; GURGEL, L.A.; CAVALCANTE, I.J.M.; SANTOS, K.A.; CAMPOS, D.A.; VALE, C.A.L.; SILVA, R.M.; CHAVES, M.H.; RAO, V.S.N.; SANTOS, F.A. Attenuation of Visceral Nociception by α- and β- Amyrin, a Triterpenoid Mixture Isolated from the Resin of Protium heptaphyllum, in Mice. Planta Med. v. 72, p.34-39, 2006. LIU Z.; TIAN X., The components of Cacalia tangutica. Bull. Korean Chem. Soc. v. 25, n. 7, p. 1078-1080, 2004. LOBO-ECHEVERRI, T.; RIVERO-CRUZ, J.F.; SU, B.; CHAI, H.; CORDELL, A.; PEZZUTO, J.M.; SWANSON, S.M.; SOEJARTO, D.D.; KINGHORN, A.D. Constituints of leaves and twigs of Calyptranthes pallens Collected from an Experimental Plot in Southern Florida. J. Nat. Prod. v. 68, p.577-580, 2005. LOPEZ, J.A; LITTLE, E; RITZ, G; ROMBOLD, J; HAHN, W., Arboles comunes del Paraguay. Paraguay, Cuerpo de Paz, 425 pág., 1987. LORENZI, H., Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. v. 1. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarium. 3. ed., 2000. MACIEL, M. A. M.; PINTO, A. C.; VEIGA, V. F., Plantas medicinais: A necessidade de estudos multidisciplinares. Quim. Nova, v. 25, n. 3, p. 429-438, 2002. MACKOWIAK, E.D. Natural products education. Am. J. Pharmac. Educ. 67 (1), Article 6, 2003. MALHEIROS, A. Estudo químico e avaliação antibacteriana da Allamanda cathartica L. (APOCYNACEAE). Maringá, 1995. Dissertação (Mestrado em Química). Centro de Ciências Exatas, Universidade Estadual de Maringá. MARQUES, L. C. O Brasil e a pesquisa & desenvolvimento de produtos fitoterápicos. Fármacos e Medicamentos. n. 37, ano VI, p. 14-18, 2005. MARQUES, D.D.; MACHADO, M.I.L.; CARVALHO, M.G.; MELEIRA, A.C.; BRAZ-FILHO, R. Isoflavonoids and terpenoids isolated from Pterodon polygalaeflorus. J. Braz. Chem. Soc. v. 9, n. 3, p. 295-301, 1998.
83
MATIDA, A.K.; ROSSI, M.H.; BLUMENTHAL, E.E.A.; SCHUQUEL, I.T.A.; MALHEROS, A. VIDOTTI, G.J. 3-β-O-β-D-glucopyranosylsitosterol in species of labiatae, verbenaceae and apocynaceae. An. Assoc. Bras. Quim. v. 45, n. 3, p. 147-151, 1996. MATOS, F.J.A. Introdução à fitoquímica experimental. 2. ed., Fortaleza: UFC, 1997. MEDEIROS, J. D. A biotecnologia e a extinção de espécies, Crise da Modernidade. Rev. Biotec. Ciência e Desenv. 30. ed., 2003. MELLIOU, E.; MAGIATIS, P.; MITAKU, S.; SKALTSOUNIS, A.; CHINOU E.; CHINOU, I. Natural and synthetic 2,2-Dimethylpyranocoumarins with antibacterial activity. J. Nat. Prod. v. 68, p. 78-82, 2005. MENDONÇA, F. A. C.; SILVA, K. F. S.; SANTOS, K. K.; RIBEIRO JÚNIOR, K. A. L.; SANT’ANA, A. E. G. Activities of some Brasilian plants against larvae of the mosquito Aedes aegypty. Fitoterapia. v. 76, p. 629-636. 2005. MESQUITA, M.L.; GRELLIER, P.; BLOND, A.; BROUARD, J.; PAULA, J.E.; ESPINDOLA, L.S.; MAMBU, L. New ether diglycosides from Matayba guianensis with antiplasmodial activity. Bioorg. Med. Chem. v. 13, p. 4499-4506, 2005. MINEO, J.R.; ESPINDOLA, L.S; SOUZA, M.A.; PAULA, J.E.; ESPINDOLA, F.S.; NAPOLITANO, D.I. Down-modulation of nitric oxide production in murine macrophages treated with crude plant extracts from Brazilian cerrado. International Symposium on Nitric Oxide, Cytokines, and Inflammation. Rio de Janeiro, 2004. MIRANDA, F.G.G.; ALVES, I.A.N.; VILAR, J.C.; BATISTA, J.S.; ANTONIOLLI, A.R. Toxicidade aguda e atividade antiedematogênica e antinociceptiva do extrato aquoso da entrecasca de Tabebuia avellanedae Lor. Ex. Griseb. Rev. Bras. Farmacogn., v. 12, p. 91-94, 2002. MONTANARI, C. A.; BOLZANI, V.S. Planejamento racional de fármacos baseados em produtos naturais. Quim. Nova, v. 24, n. 1, p. 105-111, 2001. MOURA, V. M.; SANTOS, D. P.; SANTIN, S. M. O.; CARVALHO, J. E.; FOGLIO, M. A. Constituintes químicos de Galianthe brasiliensis (RUBIACEAE). Quim. Nova. v. 29, n. 3, p. 452-255, 2006. MUTHU, S.E.; NANDAKUMAR, S.; RAO, U.A. The effect of methanolic extract of Tamarindus indica Linn. on the growth of clinical of Burkholderia pseudomallei. Indian J. Med. Res. v. 122, p. 525-528, 2005. NAIR, R.; KALARIYA, T.; CHANDA, S. Antibacterial activity of some selected Indian medicinal flora. Turk J. Biol. v. 29, p. 41-47, 2005.
84
NAPOLITANO, D.R.; MINEO, J.R.; SOUZA, M.A.; PAULA, J.F.; ESPINDOLA, L.S.; ESPINDOLA, F.S. Down-modulation of nitric oxide production in murine macrophages treated with crude plant extracts from Brazilian cerrado. J. Ethnopharmacol. v. 99, n. 1, p.37-41, 2005. NATIONAL COMMITEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS) Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically. M7-A3. NCCLS, Villanova, PA, 1993. NIERO, R. Obtenção de novas moléculas com atividade analgésica e antiinflamatória a partir de plantas medicinais brasileiras. Florianópolis, 2000. Tese (Doutorado). Departamento de Química. Universidade Federal de Santa Catarina. NOGUEIRA, P.C.; ANDRADE, M.S.; SAMPAIO, T.S.; RIBEIRO, A.S.; MORAES, V.R.S.; MACHADO, S.M.F.; ALVES, P.B.; OLIVA, G.; THIEMANN, O.H. Estudo fitoquímico e avaliação farmacológica de plantas da família Apocynaceae e Guttiferae do estado de Sergipe. II Seminário de Pesquisa FAP-SE. Aracajú, 2004. NOLDIN, V. F.; ISAIAS, D. B.; CECHINEL FILHO, V. Gênero Calophyllum: Importância Química e Farmacológica. Quim. Nova. v. 29, n. 3, p. 549-554, 2006. OLIVEIRA, E.J.; ROMERO, M.A.; SILVA, M.S.; SILVA, B.A.; MEDEIROS, I.A. Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolyti action of scopoletin. Planta Med. v. 67, n. 7, p. 605-608, 2001. ORABI, K.Y.; AL-QASOUMI, S.I.; EL-OLEMY, M.M.; MOSSA, J.S.; MUHAMMAD, I. Dihydroagarofuran alkaloid and triterpenes from Maytenus heterophylla and Maytenus arbutifolia. Phytochemistry. v. 58, n. 3, p. 475-480, 2001. OTUKI, M.F.; VIEIRA-LIMA, F.; MALHEIROS, A.; YUNES, R.ª; CALIXTO, J.B. Topical antiinflammatory effects of the ether extract from Protium kleinii and alpha amyrin pentacyclic triterpene. Eur. J. Pharmacol., n.4, p.345-347, 2003. PATO�KA J. Biologically active pentacyclic triterpenes and their current medicine signification. J. App. Biomed. v. 1, p. 7-12, 2003. PAULA V. F.; CRUZ M. P.; BARBOSA L. C. A. Constituintes químicos de Bombacopsis glabra (BOMBACACEAE). Quim. Nova. v. 29, n. 2, p. 213-215, 2006. PAULETTI P. M.; BOLZANI V. S.; YOUNG M. C. M.; Constituíntes químicos de Arrabidaea samydoides (BIGNONIACEAE). Quim. Nova. v. 26. n. 5, p. 641-643, 2003. PELCZAR JÚNIOR, M.J.; YAMADA, S. F. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2. ed. São Paulo: Makron Books, 1996. PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S.; LOPES, N.P.; EPIFANIO, R.A. Produtos naturais: Atualidade, desafios e perspectivas. Quim. Nova. v. 25, Supl. 1, p. 45-61, 2002.
85
PROKSCH, P.; EBEL, R.; EDRADA, R.A.; SCHUPP, P.; LIN, W.H.; SUDARSONO; WRAY, V.; STEUBE, K. Detection of phaarmacologically active natural products using ecology. Selected exemples from Indopacific marine invertebrates and sponge-derived fungi. Pure Appl. Chem. v. 75, n. 2-3, 343-352, 2003. PUAPAIROJ, P.; NAENGCHOMNONG, W.; KIJJOA, A; PINTO, M.M.; PEDRO, M.; NASCIMENTO, M.S.J.; SILVA, A.M.S.; HERZ, W. Cytotoxic activity of lupane-type triterpenes from Glochidion sphaerogynum and Glochidion eriocarpum two of which Induce Apoptosis. Planta Med. v.71, p.208-213., 2005. RAHALISON, L., HAMBURGER, M.; HOSTETTMAN, K.; MONOD, M.; FRENK, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal, v. 2, p.199-203., 1991. RECIO, M.C.; GINER, R.M.; MANEZ, S.; GUEHO, J.; JULIEN, H.R.; HOSSTETTMANN, K.; RIOS, J.L. Investigations on the steroidal ati-inflammatory activity of trterpenoids from Diospyros leucomelas. Planta Med. v. 61, n. 1, p. 9-12, 1995. REYES, C.P; NÚÑEZ, M.J.; JIMÉNEZ, I.A.; BUSSEROLLES, J.; ALCARAZ, M.J.; BAZZOCCHI, I.L. ACTIVITY OF LUPANE TRITERPENOIDS FROM Maytenus species as inhibitors of nitric oxide and prostaglandin E2. Bioorg. Med. Chem. v. 14, p. 1573-1579, 2006. RIBEIRO, A., Identificadas 124 plantas medicinais somente na região da Floresta Nacional. Informe Empresarial. Caçador, 12 de abr. 2004. Geral, p.6 ROBBERS, J. E.; TYLER, V. E., SPEEDIE, M. K., Pharmacognosy & Pharmacobiotechnology. New York: William & Wilkim, 1997. RODRIGUES, E. A parceria Universidade-Empresa privada na produção de Fitoterápicos no Brasil. Fármacos e Medicamentos. n. 37, ano VI, p. 14-18, 2005. RODRIGUES, R. F. O.; OLIVEIRA, F.; FONSECA, A. M., As folhas de Palma Chisti – Ricinus communis L. Euphorbiaceae Jussieu. Revisão de Conhecimentos. Rev. Lecta. v. 20, n. 2, p. 183-194, 2002. ROSSATO, M.; SANTOS, A. C. A.; SERAFINI, L. A.; AGOSTINI, F.; PANSERA, M. R.; WASUM, R.; BARBIERI, R. L. Avaliação do óleo essencial de Aloysia sellowii (Briquet) Moldenke (Verbenaceae) do sul do Brasil. Quim. Nova. v. 29, n. 2, p. 200-202, 2006. SANCHES, N.R.; CORTEZ, D.A.G.; SCHIAVINI, M.S.; NAKAMURA, C.V.; FILHO, B.P.D. An evolution of antibacterianal activities of Psilium guajava (L.). Braz. Arch. Biol. Technol. v. 48, n. 3, p. 429-436, 2005. SANDES, A.R.R.; DI BLASI, G. Biodiversidade e Diversidade Química e Genética. Biotecnologia. n.13. p. 28-32. 2000.
86
SANT`ANA, Paulo J. P., ASSAD, Ana L. D. Programa de Pesquisa em Produtos Naturais: A experiência da CEME. Quim. Nova, v. 27, n. 3, p. 508-512, 2004. SARTORI, M.R.K., PRETTO, J.B., BELLA CRUZ, A., BRESCIANI, L.F.V., YUNES, R.A., SORTINO, M., ZACCHINO, S.A., CECHINEL FILHO, V. Antifungal activity of fractions and two purê compounds of flowers from Wedelia paludosa (Acmela brasiliensis) (Asteraceae). Pharmazie. v. 58, p. 567-569, 2003. SHANG, S.; TAN, D.S. Advancing chemistry and biology through diversity-oriented synthesis of natural product-like libraries. Curr. Opin. Chem. Biol. v. 9, p. 248-258, 2005. SIANI A. C.; MICHILES E. Medicamentos de Origem Vegetal: Cenário atual de desenvolvimento, produção e mercado. Fármacos e Medicamentos. n. 37, ano VI, p. 14-18, 2005. SILVA, H. H.G.; SILVA, I. G.; SANTOS, R. M. G. et al. Larvicidal activity of tannins isolated of Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) against Aedes aegypti (Diptera, Culicidae). Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 37, n. 5, p. 396-399, 2004. SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5. ed. Porto Alegre/ Florianópolis: UFRGS/UFSC, 2004. SOUZA, M.M.; DE JESUS, R.A.P.; CECHINEL FILHO, V.; SCHLEMPER, V. Analgesic profile of hidroalcoholic extract obtained from Marrubium vulgare. Phytomedicine. v. 5, n.2, p.111-115, 1998. SOUZA, M.M.; CRUZ, A.B.; SCHUHMACHER, M.B.; KREUGER, M.R.O.; FREITAS, R.A.; CRUZ, R.C.B. Ciências Farmacêuticas: Contribuição ao desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. Métodos de Avaliação de atividades biológica de produtos naturais e sintéticos. Itajaí: UNIVALI, 2003. SOUZA, A.D.L; ROCHA, A.F.I.; PINHEIRO, M.L.B.; ANDRADE, C.H.S.; GALOTTA, A.L.A.Q.; SANTOS, M.P.S.S. Constituintes químicos de Gustavia augusta L. (LECYTHIDACEAE). Quim. Nova. v. 24, n. 4, p. 439-442, 2001. TANAKA, R.; KINOUCHI, Y.; WADA, S.; TOKUDA, H. Potential anti-tumor promoting activity of lupane-type triterpenoids from the stem bark of Glochidion zeylanicum and Phyllanthus flexuosus. Planta Med. v. 70, n. 12, p. 1234-1236, 2004. TRIPATHI, R.; MOHAN, H.; KAMAT, J.P. Modulation of oxidative damage by natural products. Food Chem., 2005. TRUITI, M.C.T.; FERREIRA, I.C.P.; ZAMUNER, M.L.M.; NAKAMURA, C.V.; SARRAGIOTTO, M.H.; SOUZA, M.C. Antiprotozoal and molluscicidal activies of five Brasilian plants. Braz. J. Med. Biol. Res. v. 38, n. 12, p. 1873-1878, 2005. UGAZ, O. L., Investigación Fitoquímica, Métodos en el estudio de productos naturales. 2. ed. Lima, Peru: Fondo Editorial de la Pontificia Universidad, 1994.
87
VAJS, V.; TRIFUNOVIC, S.; JANA�KOVÍ�, P.; SOKOVI�, M.; MILOSAVLJEVI�, S.; TEŠEVI�, V. Antifungal activity of davanone-type sesquiterpenes from Artemisia lobelli var. Conescens. J. Serb. Chem. Soc. 69 (11), p. 969-972, 2004. VEIGA JUNIOR, V. F., PINTO, A. C., MACIEL, M. A. M., Plantas Medicinais: Cura Segura? Quim. Nova. v. 28, n. 3, p. 519-528, 2005. VIEIRA T. R.; BARBOSA L. C. A.; MALTHA C. R. A.; PAULA V. F.; NASCIMENTO E. A. Constituintes químicos de Melaleuca alternifólia (MIRTACEAE). Quim. Nova. v. 27, n. 4, p. 536-539, 2004. VUORELLA, P.; LEINONENB, M.; SAIKKUC, P.; TAMMELAA, P.; RAUHAD, J.P.; WENNBERGE, T.; VUORELA, H. Natural products in the process of finding new drug candidates. Curr. Med. Chem. v. 11, n. 11, p. 1375-1389, 2004. ZDZISI�SKA, B.; RZESKI, W.; PADUCH, R.; SZUSTER-CIESIELSKA, A.; KACZOR, J.; WEJKSZA, K.; KANDEFER-SZERSZE�, M. Differential effect of betulin and betulinic acid on cytokine production in human whole blood cell cultures. Polish J. Pharmacol. n. 55, p. 235-238, 2003. WANG, B.H.; POLYA, G.M. Selective inhibition of cyclic AMP-dependent protein kinase by amphiphilic triterpenoids and related compounds. Phytochemistry. v. 41, n. 1, p.55-63, 1996. YARIWAKE, J.H.; LANÇAS, F.M.; CAPPELARO, E.A.; VASCONCELOS, E.C.; TIBERTI, L.A.; PEREIRA, A.M.S.; FRANCA, S.C. Variabilidade sazonal de constituintes químicos (triterpenos, flavonóides e polifenóis) das folhas de Maytenus aquifolium Mart. (Celastraceae). Rev. Bras. Farmacogn. v. 15, n. 2, p. 162-168, 2005. YUNES, R. A.; PEDROSA, R.C.; CECHINEL FILHO,V. Fármacos e fitoterápicos: A necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Quim. Nova. v. 24, n. 1, p. 147-152, 2001.
