UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS …...6G em um espectrômetro de massas Orbitrap com HCD (higher-energy collisional dissociation), para melhor entendimento de suas fragmentações

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

PEDRO HENRIQUE VENDRAMINI

EXPLORANDO AS APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS: MONITORAMENTO DE REAÇÕES ORGÂNICAS, MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO E IMAGEAMENTO COM NOVAS TÉCNICAS DE

IONIZAÇÃO

CAMPINAS

2016

PEDRO HENRIQUE VENDRAMINI

EXPLORANDO AS APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS: MONITORAMENTO DE REAÇÕES ORGÂNICAS, MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO E IMAGEAMENTO COM NOVAS TÉCNICAS DE

IONIZAÇÃO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto

de Química da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos para

a obtenção do título de Mestre em Química na área

de Química Orgânica

Orientador: Prof. Dr. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELO ALUNO PEDRO HENRIQUE VENDRAMINI, E

ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN.

Ficha catalográfica

CAMPINAS

2016

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin (Orientador)

Prof. Dr. Rodinei Augusti (DQ-UFMG)

Prof. Dr. Igor Dias Jurberg (IQ-UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da

Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno PEDRO

HENRIQUE VENDRAMINI, aprovada pela Comissão

Julgadora em 22 de fevereiro de 2016.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a uma

pessoa muito especial, que é a

responsável por fazer com que

muitas teses e dissertações

sejam realizadas com tanta

qualidade no ThoMSon. Dona

Cida essa é especialmente

dedicada à senhora. Muito

obrigado por tudo!

AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradecer ao meu orientador Prof. Marcos Eberlin

pela oportunidade a mim conferida.

Gostaria também de agradecer a minha tia Landa, por todo o carinho, dedicação

e recepção quando cheguei em Campinas, me acolhendo como um filho.

Agradecer a todos os colegas do laboratório ThoMSon pela companhia durante

esses anos, em especial Bruno Vilachã, Adriana Godoy, Giovana Bataglion, Davila

Zampieri, Nicolas Schwab, Celio Angolini, Eduardo Schmidt, Renan Galaverna,

Marcos Pudenzi, Almas, Bruno de Paula, José Lara, Nubia Miranda e Regina

Sparrapan pelas oportunidades de a cada dia aprender um pouco mais sobre a química e

além dela... sobre a vida!

Agradeço aos docentes que muito me ensinaram, em especial ao prof. Igor Dias,

pelo excelente prof. com o qual aprendi muito. Aos colaboradores da UNICAMP que

prestam um serviço de muita qualidade, especialmente Bel, Janaína, Isabela e Gabi e

muitos outros obrigado pelo carinho e por fazer muito mais do que o vosso dever para

nos ajudar.

Agradeço a todos os meus amigos e familiares que sempre me deram âmino e

motivação para continuar caminhando, mesmo esse caminho me levando e mantendo

cada dia mais longe deles, mas saibam que sempre penso em vocês.

Não poderia deixar de citar algumas pessoas muito queridas que sempre me

deram suporte, que sempre me escutaram, me aconcelharam, me criticaram, me deram

força acima de tudo: Giuliana, Natalia Bressan, Natalia Petean, Ana Lucia, Raduan,

Carlos, Aline, Gisele, Juliana, Péricles, Breno... vocês realmente são pessoas que

aprendi a adimirar respeitar muito. Bruno Corte, Egon, Milena, Juliana, Sarah,

Tathiane, Ariane, Rafaella, Fernanda, André, Bruno Saravali, Eduardo, Fraciele,

Vivian, Debora, Yuri, Ana Leticia, Tatiane... vocês me mostraram que podemos

aprender, crescer, melhorar como profissional e pessoalmente sem competir e passar

por cima de ninguém, e que ajudar o próximo pode ser mais importante que fazer por si

mesmo, vocês são minha inspiração, para a cada dia melhorar e querer ser melhor. Ana

Lucia, Janaína, Thiago e Maurício... vocês são responsáveis diretamente por essa

conquista.

Acima de tudo gostaria de agradecer a minha mãe Osdelha, que se dedicou

muito para que os meus primeiros passos fossem dados. Poucas pessoas podem

imaginar o quanto a senhora fez. Muito obrigado mesmo!

Agradeço à ANP pelo apoio financeiro concedido através da empresa Petrobras

e da rede Geoquímica.

CITAÇÃO

“Todo homem toma os limites do próprio campo de visão como os limites do mundo.”

(Arthur Schopenhauer)

“ A glória é tanto mais tardia quanto mais duradoura há de ser, porque todo o fruto delicioso amadurece lentamente.”

(Arthur Schopenhauer)

“O tempo muda, e com ele mudam as exigências: antes era fundamental saber muito de pouco, hoje

saber muito de pouco e um pouco de tudo, amanhã...”

Anônimo

RESUMO

Aplicações da espectrometria de massas (mass spectrometry - MS) como

ferramenta no monitoramento de reações orgânicas, mecanismos de

fragmentação e na utilização de uma nova fonte de ionização desenvolvida no

laboratório ThoMSon - easy ambient sonic/spray ionization (EASI) em

comparação à técnica clássica desorption electrospray ionization (DESI) são

demonstradas.

Foram realizados dois estudos de mecanismos de reações orgânicas de

compostos heterocíclicos aromáticos por ESI-MS: a reação de N-metilação e

N-metoxicarboxilação do indol com carbonato de dimetila (DMC) utilizando

dois catalisadores (DABCO e DBU), e a dessulfurização oxidativa do tiofeno

com peróxido de hidrogênio catalisada por metil trióxido de rênio (MTO). No

primeiro estudo foi possível avaliar a diferença entre os dois catalisadores, o

DABCO realiza a transferência de metila após reagir com o DMC por uma

única via, enquanto que o DBU realiza tanto a N-metilação quanto a N-

metoxicaboxilação por duas vias. Os resultados são evidências contrárias ao

atual mecanismo proposto na literatura, portanto, novos mecanismos foram

propostos.

No segundo estudo, foi realizado o monitoramento de dessulfurização do

tiofeno com H2O2, catalisado por MTO, com o tiofeno marcado com etiqueta de

carga a fim de facilitar a detecção dos intermediários da reação. Foi possível

então verificar que a polimerização via Diels-Alder ocorre tanto com o sulfóxido

quanto com a sulfona, além de demonstrar o papel do catalisador.

No estudo de fragmentação, foram investigadas as Rodaminas catiônicas B e

6G em um espectrômetro de massas Orbitrap com HCD (higher-energy

collisional dissociation), para melhor entendimento de suas fragmentações

isobáricas (perdas distintas com a mesma massa nominal). O uso de altíssima

resolução e exatidão possibilitou definir os mecanismos envolvidos, incluindo

fragmentações que não seguem a regra do elétron par (regra fundamental de

fragmentação de compostos em espectrometria de massas).

Para a otimização dos procedimentos de imageamento por MS ambiente,

foram feitos estudos de ionização de moléculas biológicas (ácidos graxos,

triglicerídeos e fosfolipídeos) pelas técnicas de DESI e EASI. Comparou-se a

eficiência de ionização e avaliou-se a supressão iônica em dois tipos de

suporte (vidro e papel), para se medir o efeito da dispersão dos analitos.

Ambas as técnicas foram aplicadas para o imageamento em cortes de tecido

cerebral de rato, sendo demostrado que a fonte EASI apresenta desempenho

equivalente a técnica clássica de DESI.

ABSTRACT

New applications of mass spectrometry (MS) as a tool for organic reactions

monitoring, fragmentation mechanisms and the use of a new source of

ionization developed in ThoMSon laboratory - easy ambient sonic / ionization

spray (EASI) compared to classic desorption electrospray ionization (DESI)

technique are demonstrated.

Two studies on organic reactions mechanisms of heterocyclic aromatic

compounds ESI-MS were performed: N-methylation reaction, N-

metoxicarboxilação indole with dimethyl carbonate (DMC) using two catalysts

(DABCO and DBU), and oxidative desulfurization thiophene with hydrogen

peroxide catalyzed by methyl rhenium trioxide (MTO).

In the first study was possible to elucidate the reaction pathways by

which DABCO and DBU catalyze indole N-methylation. Whereas DABCO

performs the methyl transfer after reacting with the DMC by one route, on the

oder hand, DBU performs N-methylation via two different reaction pathways in

addition to performed N-metoxycarboxylation. Both disagree with the current

proposed mechanism. Therefore, new mechanisms have been proposed.

In the second study, charge-tagged thiophene was employed in order to

facilitate detection of the reaction intermediates. It was then possible to verify

that dimerization occurs via Diels-Alder reaction between thiophene-derived

sulfoxide and sulfones, and that SO or SO2 extrusion leads to the desulfurated

product.

On the fragmentation study, cationic Rhodamines B and 6G were investigated

in a Orbitrap mass spectrometry equipped with HCD (higher-energy collisional

dissociation), to better understand their isobaric fragmentation (distinct losses

with the same nominal mass) the use of high resolution and accuracy possible

define the mechanisms involved, including fragmentation that does not follow

the even electron rule.

For the optimization of the environment by MS imaging procedures, ionization

studies were made from biological molecules (fatty acids, triglycerides and

phospholipids) by EASI and DESI techniques. The ionization efficiency was

compared and ion suppression was evaluated in two types of support (glass

and paper) to measure the effect of dispersion of analytes. Both techniques

were applied for imaging in rat brain tissue sections, and demonstrated that the

EASI source has performance equivalent to the DESI conventional technique.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Componentes básicos de um espectrômetro de massas com

exemplos para cada componente. ........................................................................ 21

Figura 2. Gráfico de massa molecular versus polaridade dos compostos

ionizáveis por algumas técnicas de ionização em espectrometria de massas. ..... 22

Figura 3. O sistema ESI (processo de dessolvatação e transporte dos íons

para fase gasosa), onde A- capilar da fonte, B- tubo de transferência, 1-

diferença de potencial entre A e B, 2- cone de Taylor, 3- evaporação do

solvente, 4- explosão Coulombica, 5- ejeção dos íos. .......................................... 24

Figura 4. Esquema de um sistema DESI, a) componentes da fonte DESI (A-

plataforma, B- capilar de transferência, C- plataforma, I- ângulo entre A e C, II-

distância entre A e C, III- distância entre A e B, IV- distância entre B e C, 1-

protrusão do capilar, 2- gás de nebulizador. Em b) e c) podemos ainda ver

ampliações do sistema de ionização, com destaque para insidência de

solvente e a formação da micropelícula de dessorção respectivamente. ............. 25

Figura 5. Esquema de um sistema EASI, mostrando a formação dos íons e

posterior entrada no espectrômetro de massas. ................................................... 26

Figura 6. Espectrômetro de massas híbrido com analisador Q-TOF. ................... 27

Figura 7. Funcionamento do detector MCP, com detalhamento para a

ampliação de sinal via cascata. ............................................................................. 28

Figura 8. Esquema de um espectrômetro de massas híbrido com analisador

Orbitrap. ................................................................................................................ 29

Figura 9. Frequências dos íons quando entram no OT, onde U é o potencial

aplicado pelos eletrodos externo e central, k é a curvatura do campo, são as

frequências e r são os raios, R são características do raio e m/z é a razão

massa sobre carga do íon. .................................................................................... 30

Figura 10. Moléculas com atividade biológica que apresentam como principal

subunidade iodol N-metilado. ................................................................................ 34

Figura 11. ESI(+)-MS da solução reacional com DABCO: (a) t = 0 h; (b) t = 7 h... 38

Figura 12. ESI(+)-MS da solução reacional com DBU: (a) t = 0 h; (b) t = 1 h; (c)

t = 7 h. ................................................................................................................... 41

Figura 13. ESI(+)-MS do produto da reação de formação do indol marcado. ....... 43

Figura 14. Compostos sulfurados encontrados em combustíveis fósseis.36.......... 45

Figura 15. Métodos de dessulfurização. ................................................................ 45

Figura 16. ESI(+)-MS do produto da reação de acoplamento entre o imidazol e

o tiofeno................................................................................................................. 50

Figura 17. ESI(+)-MS da solução reacional em: t = 10 min. .................................. 51

Figura 18. ESI(+)-MS da solução reacional em: (a) t = 60 e (b) t = 180 min. ........ 52

Figura 19. ESI(+)-MS da solução reacional: (A) t = 0 min; (B) t = 60 min. ............. 54

Figura 20. Ampliação do íon m/z 179, espectro experimental, e das massas

teóricas do reagente monocarregado e do produto dessulfurizado dicarregado

em A, B e C respectivamente. ............................................................................... 55

Figura 21. Cinética da reação de dessulfurização do tiofeno com peróxido de

hidrogênio (H2O2), catalisado por metil trióxido de rênio (MTO). ........................... 55

Figura 22. Efeito de Cieplak. ................................................................................. 57

Figura 23. Estrutura da Rodamina B e 6G. ........................................................... 59

Figura 24. Espectro de ESI-MS(MS)n da RB. ...................................................... 61

Figura 25. Ampliação do íons, a) m/z 371 e b) m/z 355 da RB. ............................ 61

Figura 26. Espectro de ESI-MS(MS)n da R6G. ..................................................... 63

Figura 27. Ampliação do íon m/z 371 da R6G. ...................................................... 64

Figura 28. Fragmentações radicalares, A) RB e B) R6G....................................... 66

Figura 29. Perda Neutra para a RB em A) e B), e para a R6G em A) e C). ......... 67

Figura 30. Número de publicações em MSI. (Web of Science: 28/01/2016_

mass spectrometry e imaging). ............................................................................. 68

Figura 31. Padrão estrutural de A) triglicerídeos, B) ácidos graxos e C)

fosfolipídeos.42....................................................................................................... 69

Figura 32. MSI dos padrões de AGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d)

EASI, sendo à direita o mix dos padrões............................................................... 72

Figura 33. MSI dos padrões de FLs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d)


Figura 34. MSI dos padrões de TAGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d)


Figura 35. Espectros de ESI(-) – MS dos padrões de ácidos graxos em

misturas equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D)

EASI-papel. ........................................................................................................... 74

Figura 36. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de fosfolipídeos em


EASI-papel. ........................................................................................................... 75

Figura 37. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de triglicerídeos em


EASI-papel. ........................................................................................................... 76

Figura 38. MSI de cérebro de rato: a) e b) m/z 782.540, e) e f) m/z 683,504, c),

d), g) e h) m/z 303,208. ........................................................................................ 78

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Tabela dos elementos mais comuns na composição de moléculas

orgânicas e seus isótopos mais abundantes, com suas respectivas massas

nominais e exatas. ................................................................................................ 31

Tabela 2. Principais métodos de ativação na fragmentação, e suas energias

associadas a cada analisador. .............................................................................. 31

Tabela 3. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a RB. .................. 62

Tabela 4. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a R6G. ................ 64

Tabela 5. Condições padrões utilizadas na aquisição dos espectros de massas

para as fontes DESI e EASI .................................................................................. 71

Tabela 6. Espécies detectadas em cada espectro, íons base e médias das

intensidades absolutas dos íons base de cada espectro, das diferentes

misturas de padrões em seus respectivos suportes. ............................................. 77

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Formação de carbonato de dimetila (DMC)....................................... 34

Esquema 2. Mecanismo proposto por Shieh para a N-metilação do indol. ........... 35

Esquema 3. Nova proposta mecanística para a N-metilação do indol com

DMC quando DABCO é utilizado como catalisador. ............................................. 39

Esquema 4. Mecanismo detalhado para a transferência de metila para o indol. .. 40

Esquema 5. Equilíbrio químico ácido-base entre o indol e o metanol. .................. 40

Esquema 6. Nova proposta mecanística para a N-metilação e N-

metoxicarboxilação do indol com DMC catalisado por DBU.................................. 42

Esquema 7. Rota sintética para a formação do indol com etiqueta de carga. ....... 43

Esquema 8. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno e polimerização

das sulfonas. ......................................................................................................... 46

Esquema 9. Etapas para a síntese do tiofeno marcado com etiqueta de carga

utilizando PF6-como contra íon. . ........................................................................... 52

Esquema 10. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno, polimerização

dos produtos de oxidação com subsequente eliminação de enxofre. ................... 56

Esquema 11. Possíveis vias para a perda de propano, A) via passo concertado

e B) via radicalar. .................................................................................................. 60

LISTA DE ABREVIATURAS

MS – Mass Spectrometry

MSI – Mass Spectrometry Imaging

NRM – Nuclear Magnetic Ressonance

GC – Gas Chromatography

LC – Liquid Chromatography

CE – Capillary Electrophoreses

EI – Electron Ionization

CI – Chemical Ionization

SIMS – Secondary Ion Mass Spectrometry

MALDI – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

APPI – Atmospheric Pressure Photoionization

APCI - Atmospheric Pressure Chemical Ionization

ESI – Electrospray Ionization

DESI – Desorption Electrospray Ionization

EASI – Easy Ambient Sonic-Spray Ionization

B – Magnetic Sector

Q - Quadrupole

TOF – Time of Flight

IT – Ion Trap

ICR – Ion Ciclotron Ressonance

OT – Orbitrap

EM – Electron Multiplier

MCP – Microchannel Plate

FT – Fourier Transform

CID – Collision-Induced Dissociation

SID – Source-Induced Dissociation

ETD – Electron-Transfer Dissociation

ECD – Electron Capture Dissociation

HCD – Higher-Energy Collisional Dissociation

m/z – razão massa sobre carga

DMC – Carbonato de dimetila

DABCO – 1,4-diazabiciclo[2,2,2]octano

DBU – 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno

DMAP – 4-Dimetilaminopiridina

MTO – Metil Trióxido de Rênio

T – Tiofeno

BT – Benzotiofeno

DBT – Dibenzotiofeno

BNT – Benzonaftotiofenos

RB – Rodamina B

R6G – Rodamina 6G

ATM - Automatedteller Machine

AG – Ácidos Graxos

TAG – Triglicerídeos

FL - Fosfolipídeos

Sumário

1. Capítulo 1- Introdução Geral ...................................................................21

1.1. Espectrometria de Massas ...............................................................21

1.2. Fontes de Ionização ..........................................................................23

1.2.1. Electrospray Ionization (ESI) .....................................................23

1.2.2. Desorption Electrospray Ionization (DESI) ...............................24

1.2.3. Easy Ambient Sonic-Spray Ionization (EASI) ...........................25

1.3. Analisadores de Massas ...................................................................26

1.3.1. Time of Flight (TOF) ....................................................................26

1.3.2. Orbitrap........................................................................................29

1.4. Aplicações da Espectrometria de Massas ......................................30

1.5. Objetivos ............................................................................................32

2. Capítulo 2- Estudos Mecanísticos ..........................................................32

2.1. Monitoramento de Reações Orgânicas ...........................................32

2.2. Estudo da N-metilação e N-metoxicarboxilação do Indol ..............34

2.2.1. Introdução ...................................................................................34

2.2.2. Parte Experimental .....................................................................35

2.2.3. Resultados e Discussão.............................................................36

2.2.4. Conclusão ...................................................................................43

2.3. Estudo da Dessulfurização Oxidativa do Tiofeno ..........................44

2.3.1. Introdução ...................................................................................44

2.3.2. Parte Experimental .....................................................................46


2.3.4. Conclusão ...................................................................................58

2.4. Estudo da Fragmentação das Rodaminas ......................................58

2.4.1. Introdução ...................................................................................58

2.4.2. Experimental ...............................................................................60


2.4.4. Conclusão ...................................................................................67

3. Imageamento com Novas Técnicas de Ionização .................................68

3.1. Introdução ..........................................................................................68

3.2. Parte Experimental ............................................................................70

3.3. Resultados e Discussão ...................................................................71

3.4. Conclusão ..........................................................................................78

4. Conclusões Gerais ..................................................................................79

5. Referências ..............................................................................................80

6. Informação Suplementar – Espectros de RMN e MS............................83

21

1. Capítulo 1- Introdução Geral

1.1. Espectrometria de Massas

A espectrometria de massas (mass spectrometry - MS), é uma técnica que analisa

a razão massa carga (m/z) de um íon. Os primeiros experimentos empregando esta

tecnologia foram realizados no início do século XX por J. J. Thomson.1 A partir do

aprimoramento da tecnologia, novos e melhores espectrômetros de massas foram

desenvolvidos, sempre buscando aprimorar a performace geral dessa importante

ferramenta analítica. A Figura 1 mostra os componentes básicos de um espectrômetro de

massas.2

Figura 1. Componentes básicos de um espectrômetro de massas com exemplos para cada componente.

O sistema de inserção de amostras pode ser feito de modo direto, ou seja, sem

utilização de técnicas de separação hifenadas ao espectrômetro de massas (sistemas

cromatográficos): GC, LC e CE. Quando realizado a inserção direta alguns inconvenientes

podem ocorrer, como o efeito de supressão iônica, que consiste na supressão do sinal de

compostos de menor eficiência de ionização frente a um composto mais ionizável. Esse

efeito é mais acentuado devido ao não fracionamento de amostras complexas (diversas

classes de compostos), em contrapartida temos uma análise mais rápida.3

22

O segundo componente do espectrômetro de massas é a fonte de ionização, essa

pode ser dividida em três grupos: fontes de ionização sob vácuo como: EI, CI e MALDI , a

pressão atmosférica como: APPI, APCI e ESI e ambiente (com pouco ou nenhum preparo

de amostra) como: DESI e EASI.4

A fonte de ionização está diretamente relacionada ao tipo de molécula que se

deseja analisar, pois, cada uma delas apresenta um mecanismo próprio, que promove a

ionização de moléculas de acordo com sua composição estrutural como, por exemplo,

grupos funcionais e insaturações além da massa molecular (Figura 2). Outros dois fatores

importantes da fonte de ionização são: energia transferida durante a ionização, que pode

ser branda, assim proporcionando a formação do íons sem fragmentação, ou altamente

energética o que causa a fragmentação dos íons precursores e o número de cargas que o

íon pode ter: mono, di, tri, tetra ou policarregados, com uma, duas, três, quatro ou mais

cargas, respectivamente.

Figura 2. Gráfico de massa molecular versus polaridade dos compostos ionizáveis por

algumas técnicas de ionização em espectrometria de massas.

23

O terceiro componente é o analisador, onde apesar de todos os tipos analisarem a

m/z de um íon, cada analisador apresenta características próprias, como velocidade de

varredura, resolução (depende apenas do sinal de um íon : R = m / ∆m(½ H)), poder de

resolução (capacidade de resolver dois íons de massa muito próxima, está relacionado

com a resolução mínima para resolver dois íons : Rmin = (m1 + m2) / ∆m) e exatidão

(expresso em um erro da massa experimental frente a massa teórica do composto em

ppm – (mT - mE) / mT). Essas características fazem com que uma escolha adequada deva

ser feita quando se deseja ultilizar um espectrômetro de massas. Além dessas

características alguns analisadores apresentam propriedades que fazem deles

apropriados para determinados tipos de estudo. Tendo em vista essas características de

cada analisador, existem analisadores híbridos – dois tipos de analisadores em um

mesmo espetrômetro de massas, aproveitando o melhor de cada analisador, como os Q-

TOFs e Q-Ts, que são a combinações de analisadores do tipo Q com TOF ou IT,

respctivamente.5

O quarto e último componente é o detector.Ele é responsável pela detecção o íon

seja por impacto como a EM ou a MCP, ou por placas de indução. Este último tipo utiliza

FT (transformada de Fourier), para converter o sinal adquirido no domínio do tempo no

domínio de frequência.6

Para a realização desse trabalho, a introdução da amostra foi direta, três tipos de

fonte de ionização (ESI, DESI e EASI) e dois analisadores híbridos (Q-TOF e Q-OT)

foram utilizados, cada qual com seu detector.

1.2. Fontes de Ionização

1.2.1. Electrospray Ionization (ESI)

O ESI foi um das maiores revoluções em MS, proporcionando um grande avanço

quanto à faixa de massa e à polaridade de moléculas ionizadas, uma vez que antes dela,

apenas moléculas com baixa polaridade (apolar) e com massa molecular baixa eram

analizadas por MS.7

24

A ionização por eletrospray se baseia no desbalanceamento de carga e na

dessorção das gotículas carregadas. Inicialmente aplica-se uma voltagem no capilar pelo

qual flui o solvente com os analitos, atraindo e neutralizando as cargas de sinal oposto à

voltagem aplicada, causando um excesso de carga de mesmo sinal nas gotículas

formadas pela nebulização da amostra. Essas gotículas formadas vão diminuindo de

tamanho pela evaporação do solvente, aumentando a densidade de carga por gotícula,

então, podendo ocorrer dois fenômenos: 1-) o cisalhamento das gotículas (explosão

Coulômbica) em gotículas menores até todo solvente evaporar, liberando os analitos para

a fase gasosa, ou 2-) ejeção dos analitos das gotas para a fase gasosa devido à alta

repulsão iônica (Figura 3).8

Figura 3. O sistema ESI (processo de dessolvatação e transporte dos íons para fase gasosa), onde A- capilar da fonte, B- tubo de transferência, 1- diferença de potencial entre A e B, 2- cone de Taylor, 3- evaporação do solvente, 4- explosão Coulombica, 5- ejeção dos íos.

1.2.2. Desorption Electrospray Ionization (DESI)

A fonte DESI, consiste em aplicar um fluxo de solvente por um capilar, que é

submetido a uma diferença de potencial semelhante ao ESI. Formam-se gotículas que

entram em contato com uma superfície, criando uma micropelícula de solvente que

dessorve os analitos. Gotículas secundárias com analitos são formadas pelo impacto das

gotículas primárias, e direcionadas ao espectrômetro de massas. A Figura 4 ilustra a

fonte de DESI e o processo de ionização ambiente por dessorção, com as variáveis

experimentais que podem ser ajustadas.9

25

Figura 4. Esquema de um sistema DESI, a) componentes da fonte DESI (A- plataforma,

B- capilar de transferência, C- plataforma, I- ângulo entre A e C, II- distância entre A e C, III- distância entre A e B, IV- distância entre B e C, 1- protrusão do capilar, 2- gás de nebulizador. Em b) e c) podemos ainda ver ampliações do sistema de ionização, com destaque para insidência de solvente e a formação da micropelícula de dessorção respectivamente.

1.2.3. Easy Ambient Sonic-Spray Ionization (EASI)

A fonte de ionização EASI se assemelha com a DESI quanto ao mecanismo de

dessorção, mas se diferencia por não ter voltagem aplicada no capilar de formação do

spray, que aumenta a relação sinal/ruído e pelos capilares utilizados em sua construção

serem de diâmetros diferentes, proporcionando uma maior vazão do gás em pressões

menores que as utilizadas pelo DESI. O mecanismo de formação dos íons não são muito

bem estabelecidas, até o momento, a teoria mais aceita é de que a alta vazão do gás

causa um cisalhamento das gotículas muito rápido, de modo que não ocorra a distribuição

adequada de cargas dentro das novas gotículas formadas, causando um

desbalanceamento de carga. A Figura 5 ilustra a fonte de EASI.10

26

Figura 5. Esquema de um sistema EASI, mostrando a formação dos íons e posterior

entrada no espectrômetro de massas.

1.3. Analisadores de Massas

1.3.1. Time of Flight (TOF)

Em um espectrômetro de massas com analisador híbrido do tipo Q-TOF (Figura 6),

o quadrupolo é utilizado para varredura e/ou seleção de íons, enquanto que o TOF é o

analisador.

27

Figura 6. Espectrômetro de massas híbrido com analisador Q-TOF.

Os íons são inseridos no TOF de forma laminar, sofrendo um pulso eletrostático

ortogonalmente à direção de entrada, o que corrige dispersões de energias cinéticas dos

íons existentes na direção do movimento original. Quanto maior a m/z menor será a sua

velocidade (Equação 1), logo maior o tempo do voo do íon em um tubo (Equação 2).

28

A inserção dos íons no analisador TOF de forma laminar é extremamente

importante, pois quanto mais fino for essa lâmina de íons, melhor será a aplicação de um

pulso eletrostático uniforme, ou seja, menor a variação de energia cinética entre as

moléculas, proporcionando maior resolução e poder de resolução dos íons.

A resolução de um TOF pode ser melhorada com a utilização de um ou mais

refletores eletrostáticos que corrigem possíveis diferenças de energia cinética de íons

com mesma m/z, aumentando consequentemente o poder de resolução dos íons. Esse

poder de resolução também pode ser maior com o aumento do tubo de voo.11

O detector utilizado foi o MCP (microchannel plate), que é bem adequado para

analisadores do tipo TOF, que precisam de tempos de chegada precisos e larguras de

pulso estreitas. Além disso, a grande área de detecção da placa de microcanais permite a

detecção de grandes feixes de íons do analisador sem focalização adicional (Figura 7).12

Figura 7. Funcionamento do detector MCP, com detalhamento para a ampliação de sinal

via cascata.

A amplificação do sinal é duas ordens de grandeza acima (102), podendo ainda ser

colocados em série dois ou três detectores, ampliando ainda mais o sinal recebido,

chegando a oito ordens de grandeza (108). No entanto, os detectores de placa de

microcanais têm algumas desvantagens, eles são frágeis, sensíveis ao ar e as suas

grandes placas de microcanais são caras.11

29

1.3.2. Orbitrap

Um espectrômetro de massas com analisador Orbitrap (OT) (Figura 8), funciona

como uma armadilha de íons. Os íons entram rapidamente no analisador através do C-

trap, em forma de funil (squeeze) que concentra os íons antes de transferí-los para o OT.

Os íons, então, orbitam ao redor de um eletrodo central, e oscilam axialmente ao longo

desse eletrodo. Todos os íons entram com a mesma energia, portanto, os íons com

menor m/z fazem maior número de oscilações harmônicas devido à maior velocidade.

Figura 8. Esquema de um espectrômetro de massas híbrido com analisador Orbitrap.

Quando inseridos no OT, os íons apresentam três diferentes tipos de frequências:

rotacional, oscilções radiais e axiais. Essas frequências são determinadas por meio de

transformadas de Fourier (Figura 9), aplicadas após os sensores detectarem as

oscilações dos íons no domínio tempo.

30

Figura 9. Frequências dos íons quando entram no OT, onde U é o potencial aplicado

pelos eletrodos externo e central, k é a curvatura do campo, são as frequências e r são

os raios, R são características do raio e m/z é a razão massa sobre carga do íon.

Após a determinação das frequências, através da frequência axial de cada íon é

construído o espectro de massas. Quanto maior o número de oscilações maior resolução,

assim a resolução cai com o aumento da massa do íons.13

1.4. Aplicações da Espectrometria de Massas

A espectrometria de massas pode ser aplicada nos mais diversos campos da

ciência, como petroquímica,14 alimentos,15 forense,16 polímeros,17 médica,18 ambiental,19

microbiológica,20 etc. Suas aplicações se baseiam na identificação e na caracterização

molecular.21

A exatidão de massa está diretamente correlacionada com a alta resolução do íon,

uma vez que, quanto maior for a resolução mais fino será o espectro contínuo, tornando

mais preciso e com menor erro o centro de massa do espectro contínuo. Com uma

exatidão de massa muito precisa é possível calcular a composição elementar da

molécula, devido ao defeito de massa característico de cada átomo (Tabela 1), sendo que

suas combinações apresentam massas exatas únicas.22

31

Tabela 1. Tabela dos elementos mais comuns na composição de moléculas orgânicas e

seus isótopos mais abundantes, com suas respectivas massas nominais e exatas.

Átomo Massa nominal (u) Massa Exata (u) 1H 1 1,00782 2H 2 2,01410 12C 12 12,00000 12C 13 13,00335 14N 14 14,00307 15N 15 15,00010 16O 16 15,99491 18O 18 17,99916

Entretanto, não é possível saber como esses átomos estão ligados entre si,

impossibilitando a diferenciação de moléculas isobárias (mesma massa molecular), sendo

a fragmentação muito importante para auxiliar nesse tipo de caracterização molecular.

Existem diversos métodos de ativação para dissociar um íon, cada método apresenta

energias diferentes entre si e também entre analisadores, para um mesmo método de

ativação (Tabela 2).4 Um dos métodos de fragmentação mais utilizados é o collision-

induced dissociation (CID).

Tabela 2. Principais métodos de ativação na fragmentação, e suas energias associadas a

cada analisador.

Métodos de Ativação Energia Analisador

CID Baixa

Alta

QqQ, IT, Q-TOF, Q-IT e ICR

TOF e B

SID Baixa

Alta

QqQ, IT, ICR e B-Q

TOF

ECD Baixa ICR

ETD Baixa IT

HCD Alta OB

Existem cinco principais mecanismos de fragmentação em MS: clivagens σ, α e i,

fragmentações subsequentes a transferência 1,2 ou 1,4 de H e rearranjo de Mc Lafferty.

Esses mecanismos explicam tanto fragmentações provenientes de sítio de carga quanto

fragmentações radicalares.23

32

1.5. Objetivos

Esse trabalho envolve duas aplicações da MS, utilizando a alta resolução e a

exatidão para caracterizar e identificar os íons.

I. Elucidação de mecanismo de reação e fragmentação.

a. Elucidar o mecanismo da reação de N-metilação e N-metoxicarboxilação do

indol com carbonato de dimetila (DMC) utilizando 1,4-

diazabiciclo[2,2,2]octano (DABCO) e 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBU)

como catalisador.

b. Elucidar o mecanismo de dessulfurização oxidativa do tiofeno com peróxido

de hidrogênio e metil trióxido de rênio (MTO), utilizando etiqueta de carga

para melhor acompanhamento da reação.

c. Investigar o mecanismo de fragmentação dos isômeros de rodamina – 6G e

B, a fim de detalhar os mecanismos de fragmentação, confirmar quais as

reais fragmentações que formam os íons m/z 399 e 355, e avaliar se

rearranjos1,3-H são possíveis apenas via anel aromático ou pode ocorrer

com outros sistemas.

II. Imageamento por espectrometria de massas.

a. Avaliar a ionização da técnica EASI para as principais classes de compostos

analisadas em imageamento por espectrometria de massas (Mass

Spectrometry Imaging - MSI) ambiente, para determinar a supressão iônica

dentro de uma mesma classe, o perfil de ionização: desprotonação,

protonação, formação de espécies amoniadas, sodiadas e potassiadas, e a

viabilidade de empregar o EASI no MSI.

2. Capítulo 2- Estudos Mecanísticos

2.1. Monitoramento de Reações Orgânicas

O entendimento dos eventos/reações que ocorrem a nível molecular durante uma

reação, são extremamente importante para o seu melhor controle e aprimoramento.

Normalmente os mecanismos são propostos de acordo com a reatividade dos reagentes e

catalisadores empregados. Entretanto, nem sempre é simples e fácil inferir um

33

mecanismo, fazendo-se necessário a utilização de técnicas seletivas de monitoramento

para auxiliar na proposta mecanística como, por exemplo, ressonância magnética nuclear

(Nuclear Magnetic Ressonance - NMR) e MS, assim como também estudos de cálculos

teóricos.24

Estudos por ESI-MS depende muito das características das moléculas

empregadas, bem como dos intermediários formados no meio reacional, uma vez que a

ionização por esta técnica depende da acidez e basicidade dessas moléculas, para que

sejam desprotonadas ou protonadas, respectivamente. Entretanto essa problemática

pode ser solucionada com o uso de etiquetas de carga (líquidos iônicos), que torna a

ionização independente do pH reacional ou mesmo do uso de aditivos para forçar a

ionização.25

O monitoramento de reações pode ser realizado por dois métodos, on-line e off-

line. O monitoramento on-line consiste em acoplar um analisador ao sistema reacional e

assim detectar moléculas com tempo de meia-vida muito pequeno (milesegundos). Já o

monitoramento off-line se baseia em coletas de alíquotas do meio reacional em tempos

pré definidos, diluir essa alíquota afim de estagnar a reação e analisar. Essa metodologia

posssibilita a análise de intermedirários mais estáveis e foi a utilizada nos estudos

abordados nesse trabalho.26

Diversas reações já foram elucidadas por espectrometria de massas mostrando a

importância desses estudos. Alguns exemplos são: reações substituição nucleofílica e

reação eletrofílica aromática além das named reactions – reação de Ugi25(a), Dakin-

West,27 Stille,28 Heck,29 Petasis Borono-Mannich,30 Morita-Baylis-Hillman25(b), Negishi,26(a)

e muitas outras reações.31

Neste trabalho foram estudadas três reações orgânicas clássicas, que não tiveram,

seus mecanismos elucidados quando empregados tais reagentes e catalisadores. Essas

reações se destacam quanto a utilização de reagente mais brandos (menos tóxicos,

corrosivos, etc.) e que atende aos princípios da química verde – N-metilação e N-

metoxicarboxilação, e dessulfurização oxidativa respectivamente.

34

2.2. Estudo da N-metilação e N-metoxicarboxilação do Indol

2.2.1. Introdução

A reação de N-metilação do indol é muito importante na síntese orgânica, uma vez

que esses núcleos indólicos metilados, são relevantes em diversos compostos bioativos

(Figura 7). 32

Figura 10. Moléculas com atividade biológica que apresentam como principal subunidade

iodol N-metilado.

Dentre os agentes alquilantes empregados, o carbonato de dimetila (DMC) se

destaca por atender aos princípios da química verde.33 A síntese do DMC também é

realizada por meio de um processo ecologicamente correto (Esquema 1), utilizando

monóxido de carbono, metanol e oxigênio na presença de sais de cobre.8a

Esquema 1. Formação de carbonato de dimetila (DMC).

O Esquema 2 descreve o ciclo catalítico para a N-metilação do indol proposto por

Shieh e colaboradores. Foram previstas duas etapas principais: primeiro, a

metoxicarboxilação do DABCO (3) pelo DMC (2) e a segunda seria a abstração do H

ácido do indol pelo metóxi, fomando 6. Finalmente, indol N-metilado 7 seria formado pela

abstração da metila por um ataque nucleofílico, regenerarando o catalisador DABCO (3)

35

e liberando CO2.34 Esse mecanismo apresenta o intermediário m/z 171 facilmente

detectado por MS, uma vez que é uma molécula carregada.

Esquema 2. Mecanismo proposto por Shieh para a N-metilação do indol.

2.2.2. Parte Experimental

Síntese do 5-dimetilamino indol (1)

Foram adicionados a um balão de 100 mL: 5-amino indol (216 mg), NaCNBH3 (88

mg) e AcOH glacial (200 µL) em MeOH (11 mL), em seguida foi gotejada por 17 min uma

36

solução de CH2O:H2O:MeOH (0,52:0,86:15,0 mL), o produto foi isolado via extração

líquido/líquido.

Síntese do 5-trimetilamino indol (2)

Foi adicionado CH3I (3,6 mL) e Et2O anidro (17 mL) à solução 2 e deixado sob

agitação por 2 h. O produto foi isolado por extração líquido/líquido e analisado por MS.

Condições Experimentais

No monitoramento da reação foram adicionados a um balão de 15 mL: indol (500

mg), DABCO ou DBU (0.1 eq.), DMF (0.5 mL) e DMC (5.0 mL). A mistura foi mantida sob

agitação e aquecimento (95 °C) durante 8 h.

Monitoramento da Reação

Foi coletada de hora em hora alíquotas de 1 µL da reação diluídas em acetonitrila

(1 mL) e analisadas por ESI (+) – MS. O espectrômetro de massas utilizado foi o

Micromass (Manchester, Reino Unido) QTof instrumento de configuração ESI-QTof com

resolução de massa 5000@400. Foram utilizadas as seguintes condições normais de

funcionamento: voltagem do capilar 3 kV, 8 V do cone e temperatura do gás de

dessolvatação a 100 ºC. ESI-MS/MS foi realizado sob energia de 4-32 kV (CID).

2.2.3. Resultados e Discussão

Primeiramente foi realizado o estudo com o DABCO. A Figura 11 mostra dois

espectros de massas referente ao monitoramento t = 0 e 7 h. No t = 0 h, foram detectadas

moléculas protonadas do solvente [DMF + H] + de m/z 74 e do catalisador [DABCO + H] +

de m/z 113, bem como os seus dímeros e trímeros. Por outro lado, temos no t = 7 h,

novos íons interceptados, que possivelmente são intermediários-chave de reação: N-

37

metilado DABCO 8 de m/z 127, 9 de m/z 244, que é [8 + 1]+ e 11 de m/z 370, que é [8 + 8

+ 6]+ foram claramente detectados como íons muito intensos. Outros adutos, tais como [8

+ 8 + HCO2H] + de m/z 299, [8 + 1 + DMF] + de m/z 317, também foram detectadas.

Um ponto importante foi a ausência do intermediário 5 m/z 171 proposto por Shieh

no (Esquema 2), apesar de sua natureza catiônica e facilidade de detecção por MS,

mostrando que o mecanismo não procede via N-metoxicarboxilação do DABCO. Todos o

íons interceptados foram caracterizados por dissociação induzida por colisão (CID),

utilizando MS tandem.

38

m/z60 100 140 180 220 260 300 340 380

%

0

100186

147113

74

271225

261 320

m/z60 100 140 180 220 260 300 340 380

%

0

100127

370

147299244

169 258 317

m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380

%

0

100 147

127

91

74

97 169 299 203 247 320

Figura 11. ESI(+)-MS da solução reacional com DABCO: (a) t = 0 h; (b) t = 7 h.

De acordo com os íons interceptados m/z 127, 244 e 370 e a não detecção do

intermediário proposto por Shieh, uma nova proposta mecanística foi feita (Esquema 3).

39

Esquema 3. Nova proposta mecanística para a N-metilação do indol com DMC quando

DABCO é utilizado como catalisador.

A proposta mecanística primeiramente envolve o DABCO (nucleófilo mole) (3)

atacando o grupo metila do DMC (2) para formar o primeiro intermediário, o N-metilado

DABCO (8). Em seguida, ocorre a coordenação do indol (1) com 8 para formar 9 (m/z

244). Somente após a formação desse complexo o metóxi (4), abstrai o próton indólico

NH, formando 10 (Esquema 4), que é neutro, mas é detectado por ESI (+) como 11 (m/z

370), ou seja, um aduto entre a espécie neutra e uma molécula de N-metil DABCO [10 +

8]+.

A formação do produto 7, pode ocorrer por duas vias, uma por transferência de

metila “intramolecular” do par iônico 10, regenerando o catalisador para o cíclo catalítico,

ou por fragmentação do aduto 11, liberando uma molécula do intermediário N-metilado

DABCO, o catalisador e o produto 7 (Esquema 4).

40

Esquema 4. Mecanismo detalhado para a transferência de metila para o indol.

O pKa do metanol é inferior ao do indol,35 o que leva a um equilíbrio desfavorável

para o passo de desprotonação no mecanismo de Shieh’s (Esquema 5). Portanto a

formação de 9, seria uma importante etapa para aumentar a acidez do indol, favorecendo

a NH abstração pelo ânion metóxi (Esquema 4).

Esquema 5. Equilíbrio químico ácido-base entre o indol e o metanol.

Shieh15 fez o uso de outras bases DMAP, tribultilamina e DBU como catalisador na

N-metilação do indol. Diante disso, utilizamos outra base DBU, que além da N-metilação

também forma como produto o indol acilado, na tentativa de identificar o catalisador

acilado e comprovar o caráter dualístico do DMC.

41

A Figura 12 mostra três espectros ESI (+) - MS da solução reacional nos tempos t

= 0, 1 e 7 h, usando DBU como catalisador. No espectro de t = 0 h, as moléculas

protonadas de solvente [DMF + H] + de m/z 74, o catalisador [DBU + H] + de m/z 153, e a

reagentes, indol e carbonato de dimetila, foram detectados . Entretanto, mesmo em t = 0

h, também foi detectado o intermediário-chave do ciclo catalítico proposto por Shieh e

colaboradores, ou seja, o carbamato 14 de m/z 211.

m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380

%

0

100 147

74

132

225

213

176

m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380

%

0

100 153

74 147 91

118

305

211

m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380

%

0

100 91

74

147

123 97

153

167

185

Figura 12. ESI(+)-MS da solução reacional com DBU: (a) t = 0 h; (b) t = 1 h; (c) t = 7 h.

42

O íon de m/z 167 correspondendo ao DBU metilado foi observado somente em t =

1 h. No instante t = 7 h dois íons de m/z 132 e 176 foram interceptados, os quais

correspondem aos produtos N-metil indol e ao N-metoxicarboxilado indol,

respectivamente. Nessa mesma alíquota também foi interceptado o íon m/z 225,

caracterizado por CID como sendo o produto de acilação e metilação do catalisador

(Figura 8c).

O Esquema 6 mostra um novo mecanismo proposto para o N-metilação do indol

catalisado pelo DBU. A formação de m/z 225 pode ser racionalizada pela abstração de H-

alfa à ligação C=N pelo metóxi, a partir do DBU N-metoxicarboxilado, seguido de um

ataque nucleofílico a outra molécula de DMC, levando à formação do intermediário 16.

Esquema 6. Nova proposta mecanística para a N-metilação e N-metoxicarboxilação do

indol com DMC catalisado por DBU.

43

Nos estudos com DBU, foi possível interceptar tanto reagente 1 quanto os produtos

7 e 15, porém em baixa intensidade. Para melhor acompanhamento da reação foi

proposto a síntese do indol marcado (LI – sal de amônio quaternário) (Esquema 7), para

acompanhar o consumo do reagente e formação do produto sem a necessidade de

dependência direta com a acidez e basicidade das moléculas empregadas no estudo.

Esquema 7. Rota sintética para a formação do indol com etiqueta de carga.

O produto final da reação foi analisado por ESI(+) – MS, sendo que, pode-se

observar uma mistura de aminas secundárias, terciárias e sais de amônio quaternário

(Figura 13).

Figura 13. ESI(+)-MS do produto da reação de formação do indol marcado.

Portanto, a reação com etiqueta de carga não foi possível ser monitorada, uma vez

que a formação do produto não ocorreu como esperado.

2.2.4. Conclusão

44

Uma nova proposta mecanística para a reação de N-metilação do indol com DMC

catalisada por DABCO foi elaborada, uma vez que o intermediário até então proposto não

foi interceptado, em contrapartida outros intermediários 8 e 11, corroboram a nova

proposta. Outra proposta foi feita quando DBU foi empregado como catalisador, esta pode

formar os produtos indol N-metilado ou N-metoxicaboxilado por dois intermediários cada

(7 via 13 ou 16 e 13 via 14 ou 16). Os intermediários interceptados neste trabalho

representam de modo mais fidedigno os produtos formados, uma vez que o intermediário

N-metoxicarboxilado é interceptado apenas quando DBU é empregado e o produto N-

metoxicarboxilado também é apenas encontrado quando esse catalisador é empregado.

O acompanhamento do consumo de reagente e formação do produto não foi

realizado, visto que a reação de formação do indol com etiqueta de carga não foi

realizada como o esperado, ocorrendo a formação de uma mistura de material de partida

com aminas, secundária e terciária e o produto.

Estudos de cálculos teóricos também estão sendo realizados para melhor suportar

a nova proposta mecanística apresentada nesse trabalho.

2.3. Estudo da Dessulfurização Oxidativa do Tiofeno

2.3.1. Introdução

Para os estudos de dessulfurização foi escolhido o tiofeno, que compõe uma das

classes de compostos orgânicos heterocíclicos mais numerosas presentes no petróleo, a

dos compostos aromáticos sulfurados, que inclui os T e seus alquil substituintes, BT

(enzotiofenos), DBT (dibenzotiofenos), BNT (benzonaftotiofenos), e compostos S-

heterocíclicos similares (Figura 14). Outros tipos de compostos sulfurados que também

podem ser encontrados são: mercaptanas, sulfetos de alquila, sulfeto de hidrogênio e

enxofre elementar.36

45

Figura 14. Compostos sulfurados encontrados em combustíveis fósseis.36

A problemática envolvendo os compostos sulfurados vai desde o envenenamento

dos catalisadores (perda da atividade catalítica) utilizados nos motores automotivos para

a combustão até questões ambientais (poluição). Devido a esses fatores e a legislação

rigorosa, as quantidades desses compostos estão cada vez mais restringidas e, se faz

necessário métodos mais eficientes para o processo de ultra-dessulfurização. São sete os

métodos de dessulfurização conhecidos para combustíveis líquidos, sendo a hidro-

dessufurização o método empregado mais clássico (Figura 15). Entretanto, este método

tem como produto da degradação o ácido sulfídrico (H2S), altamente tóxico, corrosivo e

prejudicial ao meio ambiente. Além de ser necessária a realização do processo sob alta

pressão (50 atm) e temperatura (350 ºC).36

Figura 15. Métodos de dessulfurização.

Outra opção para a dessulfurização é a oxidação que pode ser realizada à baixa

pressão e temperatura, como a dessulfurização oxidativa em sistemas bifásicos, com

peróxido de hidrogênio (H2O2) catalisado por metais de trasição (MT) suportados como:

vanádio (V),37 rênio (Re),38 tungstênio (W)39 e molibdenio (Mo)40.

Mingdon e colaboradores38 recentemente mostraram que a dessulfurização do

tiofeno com metil-trióxido de rênio (MTO), pode gerar dímeros e trímeros do produto de

degradação (Esquema 8). Apesar dos processos de dessulfurização serem muito

estudados, o mecanismo para a sua elucidação ainda é pouco detalhado, uma vez que, a

literatura não reporta como se desdobram esses processos no meio reacional.

46

Esquema 8. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno e polimerização das sulfonas.

2.3.2. Parte Experimental

Síntese do 2-hidróxido metiltiofeno (1)

Uma solução de NaBH4 (370 mg, 10 mmol) em etanol (100 mL) foi adicionado à solução

de 2-formil tiofeno (935 L, 10 mmol) à 0 °C. A mistura foi agitada por 1 hora, em seguida,

10% de HCl foi adicionada lentamente a mistura até cessar a evolução de gás. O produto

foi extraído com diclorometano, a fase orgânica foi seca com Na2SO4 e o solvente foi

removido sob vácuo. O produto foi purificado por cromatografia em coluna (hexano /

AcOEt, 100: 0-90: 10). Produto 1 foi obtido com um rendimento de 68% (753,2 mg) como

um óleo incolor. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) 2.05 (s, 1H), 4.81 (s, 2H), 6.97 (dd, 1H, J =

3.50, 5.00 Hz), 7.00-7.02 (m, 1H), 7.27 (dd, 1H, J = 1.00, 5.00 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125

MHz) 60.0, 125.5, 125.6, 126.9, 144.0.

Síntese do 2-bromo metiltiofeno (2)

47

Foi dissolvido o produto 1 em tolueno, em seguida adicionado HBr em excesso e

aquecido até atingir refluxo em um Dean-Stark. Após 3 h foi realizada a evaporação do

solvente sob vácuo e o produto foi utilizado diretamente na próxima etapa da síntese.

Síntese do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium brometo (3)

1-Metill imidazol (87,7 L, 1,1 mmol) foi adicionado à 2 (177,1 mg, 1 mmol) em acetona (1

mL). A mistura foi agitada por 24 horas, em seguida, a acetona foi separada do óleo

produzido. O resíduo foi lavado três vezes com acetona, e posteriormente secou-se sob

vácuo.

Síntese do 2-cloro metiltiofeno (4)

Foi feito uma solução de SOCl2 (545 L, 7,5 mmol) e NEt3 (1.045 mL, 7,5 mmol) em

diclorometano (50 mL), e adicionado lentamente à solução 1 (570 mg, 5 mmol) à 0 °C. A

mistura foi agitada a 0 ° C durante 30 minutos, em seguida, foi adicionada água ao frasco.

A fase orgânica foi separada, lavada com água, salmoura, e depois secou-se com

Na2SO4. O produto foi purificado por cromatografia em coluna (hexano / AcOEt, 100: 0-95:

5). Produto 4 foi obtido com um rendimento de 74% (492,2 mg) como um óleo incolor. 1H

NMR (CDCl3, 500 MHz) 4.81 (s, 2H), 6.95 (dd, 1H, J = 3.50, 5.00 Hz), 7.07-7.10 (m, 1H),

7.31 (dd, 1H, J = 0.50, 5.00 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) 40.4, 126.9, 126.9, 127.7,

140.1.

48

Síntese do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium cloreto (5)

1-Metill imidazol (87,7 L, 1.1 mmol) foi adicionado à 4 (132,6 mg, 1 mmol) em acetona (1

mL). A mistura foi agitada por 24 horas, em seguida, a acetona foi separada do óleo

produzido. O resíduo foi lavado três vezes com acetona, e posteriormente secou-se sob

vácuo. Produto 5 foi utilizado no passo seguinte sem purificação adicional.

Síntese do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (6)

Uma solução aquosa de KPF6 (176 mg, 1,5 mmol) foi adicionada à 5 (1 mL em solução

aquosa) e mantido sob agitação por 5 horas. O produto foi extraído em dicloro metano, a

fase orgânica foi seca com Na2SO4 e o solvente foi removido para dar 6 em 52% de

rendimento (169,1 mg) como um sólido incolor. m.p. 88.1-89.3 °C; 1H NMR (CD2Cl2, 500

MHz) 3.90 (s, 3H), 5.50 (s, 2H), 7.08 (dd, 1H, J = 3.50, 5.00 Hz), 7.26-7.29 (m, 3H), 7.45

(dd, 1H, J = 1.00, 5.00 Hz), 8.51 (s, 1H); 13C NMR (CD2Cl2, 125 MHz) 36.9, 48.2, 122.3,

124.2, 128.4, 129.0, 130.8, 133.7, 136.0.

Condições Experimentais

No monitoramento da reação foram adicionados a um balão de 5 mL: 2- metil-1-(2’-

tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (20 mg), MTO (0,03 eq.) e solução aquosa de

49

H2O2 30% (0,6 mL). A mistura foi mantida sob agitação e aquecimento (60 °C) durante 3

h.

Monitoramento da Reação

Foram coletadas de 30 em 30 minutos alíquotas de 1 µL da reação diluídas em

metanol (1 mL) e analisadas por ESI (+) – MS. O espectrômetro de massas utilizado foi o

Q-Exactive – Thermo Scientific™, espectrômetro híbrido QOB de configuração ESI-QOB

com resolução de massa 140000@400. Foram utilizadas as seguintes condições normais

de funcionamento: voltagem do capilar 5 kV, fluxo de 5 µL.min-1 e tandem ESI-MS/MS foi

realizado sob energia de 10-40 kV (HCD).


Foram realizados dois estudos de dessulfurização, ambos com etiqueta de carga,

um utilizando como contra íon o Br- e o outro PF6

-. Essa mudança de contra íon foi

importante para evitar reações paralelas envolvendo o Br2 no meio e melhor entendimento

do mecanismo completo de dessulfurização.

Para o primeiro estudo de dessulfurização, a síntese do tiofeno marcado foi

realizada em três etapas (Esquema 8). O material de partida foi o 2-formil tiofeno, que foi

reduzido a 2-hidroximetiltiofeno. Em seguida, foi realizada uma reação de halogenação,

substituindo a hidroxila pelo bromo. A última etapa envolveu uma substituição nucleofílica

do bromo pelo metil imidazol, formando o tiofeno marcado.

Esquema 8. Etapas para a síntese do tiofeno marcado com etiqueta de carga utilizando

Br- como contra íon.

50

O produto da reação foi analisado por ESI-(+) – MS, e foi possível observar que

houve a formação do produto desejado m/z 179,1. Porém, também houve a polimerização

do tiofeno, com formação de dímeros e trímeros m/z 275,1 e 371,1 respectivamente

(Figura 16). Essa polimerização se deve ao fato da posição 2 do tiofeno ser nucleofílica,

competindo com o imidazol pelo ataque nucleofílico.

Figura 16. ESI(+)-MS do produto da reação de acoplamento entre o imidazol e o tiofeno.

Apesar do produto final da reação não ser exatamente o esperado, o íon base do

espectro de massas é o produto desejado e os dímeros e trímeros de tiofeno, não

causariam interferência na reação de oxidação do enxofre. Portanto, foi realizado o

estudo mecanístico com as misturas de mono, di e trímeros de tiofeno marcado.

Logo no início da reação (t = 10 min), foi possível visualizar a formação de

sulfóxido, para todos os tiofenos, mediante ampliação em regiões específicas do espectro

de massas (Figura 17).

51

Figura 17. ESI(+)-MS da solução reacional em: t = 10 min.

Para os polímeros, não é possível saber qual tiofeno é oxidado e se temos apenas

sulfóxidos ou misturas de tiofeno e sulfona para o dímero e tiofeno, sulfóxido e sulfona

para o trímero.

Quando novas alíquotas foram analisadas, não foi observada a formação da

sulfona nem dos produtos de adição [2+4] Diels-Alder. Em contrapartida, foi interceptado

o produto de partida bromado, como reportado na Figura 18.

52

Figura 18. ESI(+)-MS da solução reacional em: (a) t = 60 e (b) t = 180 min.

A formação desse produto se deve provavelmente à oxidação do contra-íon do LI,

gerando espécies de bromo molecular. Esse bromo sofre ataque nucleofílico do tiofeno,

formando o produto e liberando HBr no meio reacional. Após três horas de estudo, o LI

começa a se degradar liberando metil imidazol.

Para o segundo estudo, a síntese do tiofeno marcado foi realizada em quatro

etapas (Esquema 9). O material de partida foi o 2-formil tiofeno, que foi reduzido a 2-

hidroximetiltiofeno. Em seguida, foi realizada uma reação de substituição, que trocou a

hidroxila pelo cloro. Posteriormente foi realizada a substituição nucleofílica do cloro pelo

metil imidazol, e a última etapa envolveu a troca do contra íon Cl- por PF6

-, formando o

substrato de partida para o estudo.

Esquema 9. Etapas para a síntese do tiofeno marcado com etiqueta de carga utilizando

PF6-como contra íon. .

A troca de contra íon por PF6-, foi realizada para evitar reações paralelas ao

mecanismo que desejamos monitorar, como oxidações e reações de substituição

eletrofílica do bromo. Outra alteração nessa reação foi a halogenação que diferentemente

da reação anterior não foi utilizado o Br e sim o Cl, para tentar evitar a polimerização do 1-

metil tiofeno.

Primeiramente foi realizado o monitoramento da reação sem o catalisador (MTO),

para avaliar a oxidação não catalítica do tiofeno, uma vez que é reportado que ocorre

lentamente a reação e utilizamos um substrato (tiofeno marcado) não convencional.

53

Durante o monitoramento da reação não foi observado nenhuma alteração no espectro,

mostrando que mesmo com o tiofeno marcado a reação não ocorre durante as primeiras

horas.

Em seguida foi realizada então a reação com o catalisador. A Figura 19 mostra os

espectros de massas nos t = 0 mim e t = 60 min, no t = 0 min é possível observar apenas

um íon majoritário que é o tiofeno marcado com etiqueta de carga, já no t = 60 min temos

os principais intermediários da reação interceptados m/z 195,1, 211,1 e 203,1 que são

respectivamente o sulfóxido, a sulfona e o produto da adição (2+4) Diels-Alder da sulfona

com o sulfóxido (heterodímero).

54

Figura 19. ESI(+)-MS da solução reacional: (A) t = 0 min; (B) t = 60 min.

Os íons de m/z 195,1 e 211,1 são provenientes de dois intermediários cada, o

monômero e o dímero respectivamente. Uma vez que os intermediários da adição [2+4]

Diels-Alder de dois sulfóxidos ou duas sulfonas (homodímeros), apesentam a mesma m/z

que o intermediário precursor à adição m/z 195,1 e 211,1 respectivamente, entretanto

estes puderam ser diferenciados pelo seu padrão isotópico do 13C, que apresenta 0,5 Da

a mais por ser uma molécula dicarregada, enquanto que o precursor tem 1,0 Da a mais

por ser monocarregado.

O produto da reação apresenta m/z muito semelhante ao material de partida da

reação, uma vez que a diferença entre as duas moléculas são: a substituição de um S do

reagente por O2 no produto, que apresentam mesma massa nominal de 32 Da. Entretanto

a massa exata é diferente 31,972 Da e 31,990 Da, respectivamente, gerando uma

diferença de massa entre as duas moléculas, que pode ser então diferenciadas em um

espectro de massas com analisadores de altíssima resolução (Figura 20).

55

Figura 20. Ampliação do íon m/z 179, espectro experimental, e das massas teóricas do

reagente monocarregado e do produto dessulfurizado dicarregado em A, B e C

respectivamente.

De acordo com os principais intermediários interceptados e suas respectivas

intensidades, foi feito um gráfico de conversão de tiofeno ao produto da adição (2+4)

Diels-Alder dessulfurizado (Figura 21).Apesar de não ser uma análise quantitativa, a

ionização não dependente do pKa, uma vez que todas já apresentam carga. Esses

valores representam de modo muito próximo a quantidade de cada molécula no meio

reacional, visto que a ionização é muito semelhante.

Figura 21. Cinética da reação de dessulfurização do tiofeno com peróxido de hidrogênio

(H2O2), catalisado por metil trióxido de rênio (MTO).

É possivel observar no gráfico que os primeiros intermediádios da reação, o

sulfóxido e a sulfona se mantêm constantes e em baixa porcentagem durante todo o

monitoramento. Isso sugere uma alta taxa de conversão desses intermediários a

homodímeros de mesma m/z e heterodímeros com m/z 203,1. Presumidamente, este fato

56

se deve pelo tiofeno oxidado possuir menor, uma vez que a molécula não é mais

aromática.

Com base nos intermediários interceptados um novo mecanismo para a

dessulfurização do tiofeno com peróxido de hidrogênio catalisado por MTO foi proposto

(Esquema 10).

Esquema 10. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno, polimerização dos

produtos de oxidação com subsequente eliminação de enxofre.

57

O mecanismo de dessulfurização do tiofeno (1) proposto apresenta três diferentes

rotas para a formação do produto, sendo a formação de sulfóxido (2) comum a todos. Em

seguida, pode ocorrer a formação da sulfona (3), ou a homodimerização de 2 formando

7.41

A partir da formação da sulfona (3) dois caminhos podem levar à formação do

produto. Uma possibilidade é a homodimerização (4), rota 1. Outra alternativa é a

heterodimerização (6) – rota 2. Para ambos os produtos formados, 4 e 6, apenas mais

uma etapa leva a formação do produto 5, que é a retroadição [4+1], eliminando SO242 ou

SO respectivamente.

O homodímero 7 sofre uma retroadição [4+1], levando ao intermediário m/z 171 (8),

que foi interceptado a partir de t = 60 min – rota 3. A oxidação do homodímero 7, levando

a formação de 6 não ocorre, portanto a conversão apenas pode ocorrer via oxidação de 8

sengundo Tashiro e colaboradores.43

Para a formação de 6 temos, uma reação térmica de cicloadição com 6 elétrons ,

portanto uma reação anti-periplanar com formação do produto endo exclusivamente

devido ao efeito de Cieplak,43 ou seja, a estabilização do orbital antiligante do dieno pelo

par de elétrons não ligante do S (Figura 22).

Figura 22. Efeito de Cieplak.

A formação de trímeros reportado por Mingdon e colaboradores38 não foi

observada nesses estudos, um dos motivos para a não formação pode ser as interações

repulsivas do sítios de carga, inviabilizando uma molécula pequena com três cargas

positivas.

58

2.3.4. Conclusão

A partir dos intermediários interceptados no monitoramento primeiro por ESI-

MS/MS, foi possível interceptar a formação de sulfóxido, para o tiofeno marcado assim

como oxidação dos dímeros e trímeros. Mas ocorreram reações paralelas desde a síntese

do tiofeno marcado.

Duas alterações foram necessárias para poder realizar o estudo completo da

dessulfurização, a primeira foi alterar o haleto (Br– por Cl–) empregado na síntese, para

evitar a dimerização do tiofeno, e a segunda foi a troca do contra íon (Cl– por BF6–), para

evitar oxidação do haleto e incorporação do mesmo ao tiofeno.

A partir do espectros de ESI-MS/MS, foi possível determinar três rotas para a

dessulfurização do tiofeno. Essas rotas estão relacionadas com os três diferentes dímeros

possíveis de ser formado, dois homodímeros (4 e 7) a partir do sulfóxido (2) e da sulfona

(3) respectivamente e os isômeros constitucional (heterodímeros 6 ou 8), formados a

partir da oxidação de 7 ou dimerização entre 2 e 3 apenas para 6.

Já a formação de trímeros não foi observada, provavelmente pela repulsão das

etiquetas de cargas dos tiofenos.

2.4. Estudo da Fragmentação das Rodaminas

2.4.1. Introdução

A Rodamina B (RB) está entre os corantes sintéticos mais antigos e mais

comumente usados. Foi amplamente utilizada como corante em produtos têxteis e

indústrias de plástico, e também é um corante fluorescente aplicado na indústria química

orgânica e em estudos biológicos. A Rodamina 6G (R6G), também conhecida por

Rodamina 590, é amplamente utilizado como marcador de fluorescência e como um meio

de emissão de laser.44

Na ciência forense, estes tipos de rodaminas disponíveis comercialmente são usados por

alguns bancos como um recurso de segurança em caixas automáticas (Anti- theft Device

for Machine - ATM).45 Há casos em que estes corantes foram encontrados utilizados

ilegalmente pelos mercados de doces ou padeiros para colorir os diferentes produtos de

confeitaria.46

59

A Rodamina possui uma estrutura complexa e estável. Identificar o mecanismo de

fragmentação de um íon nem sempre é trivial, principalmente quando a sua estrutura é

estável, devido aos tipos de átomos e ligações presentes que requerem altas energias de

fragmentação. Isso leva a diversos fragmentos e esses nem sempre advêm de perdas

óbvias.

Portanto, decidimos estudar isômeros RB e R6G, que apresentam estrutura

policíclica aromática, polifuncionalizada e com pequenas ramificações alquílicas (Figura

23).

Figura 23. Estrutura da Rodamina B e 6G.

A Caracterização da RB apresenta muitas discussões na literatura quando utilizado

MS. Trabalhos envolvendo analisadores de baixa resolução atribuem a perda de 44 Da a

uma molécula de CO2 (que seria uma perda lógica, para moléculas catiônicas), em

contrapartida, trabalhos com analisadores de alta resolução atribuem a perda à liberação

de C3H8. Para a perda de propano, duas propostas são descritas, via anel de 4 membros

ou via radicalar como apresentado no Esquema 11.47

60

Esquema 11. Possíveis vias para a perda de propano, A) via passo concertado e B) via

radicalar.

2.4.2. Experimental

Foram preparadas soluções de RB e R6G em metanol grau HPLC-Sigma-Aldrich,

Brazil Ltda, de pureza 95%, e injetados diretamente no espectrômetro de massas

OrbitrapTM através da fonte ESI, com vazão de 3.0 µL.min-1. A energia de colisão aplicada

na fragmentação variou de 45.00-55.00.


Primeiramente foi analisada a RB, que apresentou como íon mais intenso o de m/z

399, e outros com baixa intensidade. Esses íons menos intensos são muito relevantes

quando se pretende fazer um estudo do mecanismo de fragmentação (Figura 24), uma

vez que estes nos auxiliam na interpretação da fragmentação.

61

300 340 380 420 460 500 m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lati

ve

Ab

un

da

nce

399.17

443.23

413.18 385.15 355.11

371.14 427.20

415.20

Figura 24. Espectro de ESI-MS(MS)n da RB.

Analisar essas massas sem um olhar mais minuncioso, pode levar a equívocos

quanto às reais fragmentações, ou mesmo a desprezar mecanismos paralelos com

perdas “isobáricas”, ou seja, de mesma massa nominal. Portanto foi feito uma ampliação

de 0.3 Da de todos os íons significativos, e desses, apenas 2 espectros apresentaram

duas fragmentações que podem ser confundidas em analisadores de baixa resolução,

que não resolveriam massas tão próximas (Figura 25).

a) b)

Figura 25. Ampliação do íons, a) m/z 371 e b) m/z 355 da RB.

Na Figura 25 a), temos dois íons com defeito de massa muito próximos, que se

referem à perda radicalar de CH2N (m/z 371.15054) e a outra à perda neutra de C2H4 (m/z

62

371.13821). Para o fragmento de m/z 355, foram detectadas tanto a perda de CO2 quanto

de C3H8. Para resolver essas massas temos que ter uma resolução mínima de 60.000, de

acordo com a fórmula Rmin= (2m /∆ m).

A Tabela 3 reporta detalhadamente como foram feitas as atribuições das

fragmentações de acordo com as diferenças de massas e seus defeitos de massas para

perdas “isobáricas”, obtidos pelo espectro de MS/MS de alta resolução.

Tabela 3. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a RB.

Íon Precursor Íon Produto Intensidade Diferença

de Massa

Perda Mecanismo de

Fragmentação

Massa

Teórica

Erro (Da)

443,23190 442.22420 2.00e3 1.00770 H Radicalar 1.00783 0.00013

443,23190 428.20842 4.16e3 15.02333 CH3 Radicalar 15.02348 0.00015

443,23190 427,20050 7.54e5 16,03140 CH4 Radicalar 16,03121 -0,00019

443,23190 415,20038 7.73e5 28,03152 C2H4 Perda Neutra 28,03130 -0,00022

443,23190 414.19299 2.54e3 29.03891 C2H5 Radicalar 29.03913 0,00022

443,23190 413,18478 4.72e6 30,04712 C2H6 Radicalar 30,04695 -0,00017

443,23190 399,16940 4.78e7 44,06250 C3H8 Radicalar 44,06260 0,00010

413,18478 385,15344 2.58e6 28,03134 C2H4 Perda Neutra 28,03130 -0,00004

399,16919 371,15054 2.78e5 28,01865 CH2N Radicalar 28,01872 0,00007

399,16940 371,13821 5.97e5 28,03119 C2H4 Perda Neutra 28,03130 0,00011

399,16940 355,17929 1.33e5 43,99011 CO2 Perda Neutra 43,98983 -0,00028

399,16940 355,10684 1.87e6 44,06256 C3H8 Radicalar 44,06260 0,00004

Foram detectadas fragmentações radicalares, tipo de fragmentação comum em

moléculas ionizadas por electron ionization (EI), pois, formam íons com camada aberta

(íons positivo-radicalares). Quando a ionização forma íons catiônicos, como neste caso da

RB, normalmente ocorre a fragmentação com perdas neutras, mantendo a camada

fechada (regra do elétron par). Esse mecanismo de fragmentação radicalar se deve à alta

estabilidade da carga, pela ressonância entre os anéis, levando a perdas não óbvias na

63

fragmentação dessa estrutura, formando de íons distônicos, ou seja, espécies em que a

carga e o radical estão em átomos diferentes. Portanto, ocorre a formação do m/z 399 por

vias radicalares, devido à perda sequencial de radicais etila e metila .

Por outro lado, a formação do íon m/z 399 pode ocorrer por uma via mista, iniciado

por um passo concertado com eliminação de C2H4, seguido por uma etapa radicalar com

eliminação de H e CH3. O passo concertado pode ocorrer por meio de um estado de

transição altamente energético (4 membros), e neste caso especial, ocorre prototropismo

auxiliado por sistema , similar ao descrito por Schroder e colaboradores.48

Esses dois mecanismos explicam a formação de todos os fragmentos da RB.

Sendo pela via de prototropismo, as perdas neutras de CO2 e C2H4, e os demais por via

radicalar, com formação de íons distônicos.

Em seguida foi estudada a fragmentação da R6G, um isômero da RB, que leva à

formação de alguns íons produtos diferentes, mas que deve seguir os mesmos princípios

mecanísticos (Figura 26).

300 340 380 420 460 500 m/z

0

20

40

60

80

100

Rela

tive

Ab

un

da

nce

415.20

443.23

341.16

386.16

312.13 357.12 327.15 399.17 371.14

Figura 26. Espectro de ESI-MS(MS)n da R6G.

64

Para essa molécula temos m/z 415,20 como íon base do espectro, diferentemente

da RB, o que era esperado uma vez que a perda de C3H8 é dificultada por não possuir 2

radicais etila no mesmo nitrogênio. A formação do íon base é facilmente explicada pela

transferência de H do radical etil da função éster para a carbonila via anel de seis

membros tipo McLafferty.

O mesmo procedimento anteriormente descrito foi feito, e apenas um espectro foi

adquirido, que apresentou 3 diferentes íons detectados, m/z 371,13880, m/z 371,15080 e

m/z 371,21131 (Figura 27).

a)

Figura 27. Ampliação do íon m/z 371 da R6G.

A formação desses íons ocorre por diferentes íons precursores, com perdas de

C2H5, CH2N e CO2 respectivamente. Assim como para a RB, a Tabela 4 mostra

resumidamente para a R6G todos os íons de m/z detectados, as atribuições a cada

fragmentação assim como suas vias de formação.

Tabela 4. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a R6G.

Íon Precursor Íon Produto Intensidade Diferença

de Massa

Perda Mecanismo de

Fragmentação

Massa

Teórica

Erro (Da)

443,23223 415,20109 7.96e8 28,03114 C2H4 Perda Neutra 28,03130 0,00016

415,20109 400.17779 9.69e6 15.02330 CH3 Radicalar 15,02348 0.00018

415,20109 399,16980 1.53e7 16,03129 CH4 Radicalar 16,03121 -0,00008

415,20109 386,16200 8.31e7 29,03909 C2H5 Radicalar 29,03913 0,00004

415,20109 385,15423 7.58e6 30,04686 C2H6 Radicalar 30,04695 0,00009

65

415,20109 371,21131 2.09e6 43,98978 CO2 Perda Neutra 43,98983 0,00005

399,16980 371,15080 5.61e6 28,01900 CH2N Radicalar 28,01872 -0,00028

386,16200 371,13880 1.17e7 15,02320 CH3 Radicalar 15,02348 0,00028

385,15423 357,12295 4.05e7 28,03128 C2H4 Perda Neutra 28,03130 0,00002

385,15423 341,16454 1.30e8 43,98969 CO2 Perda Neutra 43,98983 0,00014

371,13880 327,14885 2.44e7 43,98995 CO2 Perda Neutra 43,98983 -0,00012

341,16454 312,12558 4.55e7 29,03896 C2H5 Radicalar 29,03913 0,00017

De acordo com os íons detectados, mecanismos de fragmentação foram propostos,

para os dois isômeros: RB e R6G, sendo a Figura 28 correspondente às fragmentações

radicalares e a Figura 29 às perdas neutras.

66

Figura 28. Fragmentações radicalares, A) RB e B) R6G.

67

Figura 29. Perda Neutra para a RB em A) e B), e para a R6G em A) e C).

2.4.4. Conclusão

Foi possível determinar as vias mecanísticas para a formação dos principais

fragmentos detectados no espectro de MS/MS por CID dos isômeros RB e R6G. As

fragmentações radicalares são predominantes, mesmo sendo uma molécula de camada

fechada, indo contra a regra do octeto. Apesar das fragmentações radicalares serem

predominantes, temos também transposições 1,3–H via anel de 4 membros, auxiliadas

pelo sistema π, e transposições 1,5–H para a R6G em específico.

Constatou-se também que há perdas de CO2 para ambos isômeros, e uma nova

fragmentação radicalar com perda de CH2N, que podem ser confundidas juntamente com

a perda de C3H8 em analisadores com resolução insuficiente.

68

3. Imageamento com Novas Técnicas de Ionização

3.1. Introdução

O imageamento por espectrometria de massas (mass spectrometry imaging – MSI),

consiste na combinação entre a informação molecular com a distribuição espacial,

proporcionando diferenciar estruturas (tecidos) de acordo com suas diferentes

composições moleculares.49 A importância do MSI pode ser dimensionada pela Figura

30 que mostra sua crescente aplicação com o decorrer dos anos.

Figura 30. Número de publicações em MSI. (Web of Science: 28/01/2016_ mass

spectrometry e imaging).

Suas primeiras aplicações foram na década de 70 com a fonte de ionização SIMS

(secondary ion mass spectrometry), uma técnica que permite análises tridimencionais e

com alta resolução espacial. Porém, apresenta algumas desvantagens como a faixa de

massa ionizável (ioniza moléculas de baixa massa molecular) e a alta fragmentação

dificultando a identificação das moléculas precurssoras.50

69

Essa limitações foram sanadas com a fonte de MALDI, que permite a ionização

sem fragmentação e uma alta faixa de massa, permitindo a análise desde lipídeos até

proteínas. Seus principais inconvenientes são espectros com muito ruído abaixo de 600

Da, o que dificulta a análise de lipídeos de baixa massa molecular. A escolha da matriz

também é um importante fator a ser considerado, pois, pode influenciar nas classes de

moléculas ionizadas.51

Entretanto ambas as técnicas, SIMS e MALDI, necesssitam de um sistema de

ionização sob vácuo, e dessa forma aparatos elaborados e sofisticados são necessários.

Uma alternativa para essas técnicas veio com o surgimento de novas técnicas de

ionização ambiente como a fonte DESI, que também possibilita a realização de uma

análise mais rápida.52

Apesar de não ter o poder de resolução espacial que a fonte SIMS possui e a

capacidade de ionizar moléculas de alta massa molecular que a fonte de MALDI tem,

DESI apresenta uma vantagem muito significante que é a análise em tempo real, devido

ao pouco preparo requerido para análise, característica que proporcionou a aplicação

desta técnica em diagnósticos na área clínica de oncologia simultaneamente à

intervenção cirúrgica.53

Nos estudos de MSI com fontes de ionização ambiente em tecido animal, algumas

classes de compostos se destacam, como ácidos graxos (AGs), triglicerídeos (TAGs) e

fosfolipídeos (FLs), principalmente pela importância metabólica dessas moléculas (Figura

31).54

Figura 31. Padrão estrutural de A) triglicerídeos, B) ácidos graxos e C) fosfolipídeos.42

70

Impulsionado pelo alto desempenho e praticidade, recentemente diversas fontes de

ionização ambiente vêm sendo desenvolvidas, sempre buscando a ionização de novas

classes de compostos, maior poder de resolução espacial, e outros fatores que possam

aumentar a eficiência e o campo de atuação dessas fontes de ionização ambiente. Dentre

essas a fonte de EASI tem se mostrado eficiente para moléculas que não dependem

diretamente da acidez ou basicidade, ou seja, moléculas que já apresentam carga

(cátions e ânions) são favorecidas por essa técnica em comparação à fonte de DESI.55

Janfelt e Nørgaard 55 reportaram um estudo comparativo entre DESI e EASI. A

fonte EASI empregada nesse estudo foi uma adaptação da fonte DESI, mesma fonte,

porém, sem voltagem aplicada ao capilar de formação do eletrospray. Para todas as

amostras analisadas em seus estudos a EASI apresenta resultados inferiores aos da

DESI quanto ao número de íons detectados, e com intensidade muito inferior com

exceção dos corantes Azul Básico 7 e Rodamina B. Os autores concluem que a fonte

EASI teria menor eficiência de ionização que a fonte DESI. Esse trabalho almeja

comparar DESI e EASI, sendo utilizada a fonte de EASI propriamente e não a fonte de

DESI adaptada.

3.2. Parte Experimental

Preparo dos Padrões

Foram preparadas soluções equimolares dos padrões dos AGs (oleico, linoleico e

linolénico), TAGs (trioleína, tripalmitina, triestearina e trilinoleína), e FLs (fosfatidilcolina -

ovo, esfingomielina - porco, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-3-fosfocolina e 1,2-dipalmitoil-sn-

glicero-3-fosfocolina) e feitos spots de 2 µL nas superfícies (vidro e papel).

Preparo do Corte Histológico

Para as análises de tecido cerebral, o tecido foi previamente congelado e em

seguida feito cortes histológicos de 14 µm com o criostato LEICA CM1900, também foram

utilizados vidro e papel como suportes para a análise.

Parâmetros das Fontes DESI e EASI

71

Tabela 5. Condições padrões utilizadas na aquisição dos espectros de massas para as

fontes DESI e EASI

Parâmetro DESI EASI

Capilar Interno* diâmetro interno (µm) 50 100

Capilar Interno* diâmetro externo (µm) 150 200

Capilar Externo* diâmetro interno (µm) 250 373

Capilar Externo* diâmetro externo (µm) 350 565

Vazão do Gás volume (L.min-1) 0,65 2,5

Vazão do Gás pressão (psi) 160 110

Vazão do Gás área (mm2) 0,0314 0,0776

Gás de Nebulização velocidade (m.s-1) 350 536

Voltagem do Spray (kV) modo negativo

modo positivo

-3,2

+5,0

0

0

Vazão do Solvente (µL.min-

1)

papel

vidro

20

3

20

3

*Silica fundida

3.3. Resultados e Discussão

Primeiramente realizamos análises dos padrões de Ags, TAGs e FLs

separadamente e suas respectivas misturas por MSI, nas melhores condições de vazão

do solvente em cada um dos dois suportes: papel e vidro, em ambas as fontes: DESI e

EASI (Figuras 32, 33 e 34), a fim de avaliar a fonte de ionização. Para esse estudo spots

de cada padrão e seu respectivo mix foram aplicados no suporte e feito a análise.

72

Figura 32. MSI dos padrões de AGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI,

sendo à direita o mix dos padrões.

Figura 33. MSI dos padrões de FLs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI,


73

Figura 34. MSI dos padrões de TAGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI,


É possível observar que ocorre supressão iônica similar, tanto com DESI quanto

com EASI, e a intensidade relativa dos compostos é muito semelhante. Para os AGs e os

TAGs, o EASI apresenta maior arraste (dispersão lateral), principalmente quando utilizado

o vidro como suporte, devido às características dos analitos, em contrapartida para os FLs

tanto DESI quanto EASI fornecem excelentes resultados (alta resolução lateral).

Em seguida comparamos os perfis das misturas equimolares de AGs (Figura 35),

FLs (Figura 36) e TAGs (Figura 37).

74

Figura 35. Espectros de ESI(-) – MS dos padrões de ácidos graxos em misturas

equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D) EASI-papel.

É possível observar o alto grau de similaridade entre os espectros da Figura 35 A)

e B), tanto pelos íons produzidos quanto pela intensidade relativa dos mesmos. Quanto a

27 C) e D), temos uma pequena inversão entre os íons base, m/z 293.0 e 281.1

respectivamente, porém o perfil dos íons é o mesmo e com intensidades relativa

semelhantes.

75

Figura 36. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de fosfolipídeos em misturas


Na Figura 36, podemos observar que também existe um alto grau de similaridade

quando utilizado o vidro como suporte, como mostrado em A) e B), com predominância

dos adutos de Na+ sobre as espécies protonadas, sendo que utilizando DESI, as

intensidades realtivas das espécies protonadas é ligeiramente maior.

Quando foi utilizado o suporte papel Figura 36 C) e D), foi observada uma maior

divergência em relação às intensidades relativas do íons, enquanto a fonte DESI 28 C)

apresentou predominância de espécies protonadas a fonte EASI D) apresentou um

espectro com intensidades mais equilibradas de espécies protonadas e sodiadas, porém,

com leve preferência por adutos de Na+. Algumas espécies potassiadas também foram

detectadas.

76

Figura 37. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de triglicerídeos em misturas


Podemos observar na Figura 37 alta similaridade dos perfis. A exemplo dos

demais padrões, para ambos os suportes (vidro e papel), foram identificadas apenas

espécies amoniadas ou sodiadas. Adutos de Na+ são os íons base em 29 A) e B), m/z

901.7 em ambos espectros, e observou-se alta similaridade entre as intensidades

relativas dos íons. Por outro lado 29 C) e D) apresentam predominância de espécies

amoniadas, com inversão de íon base do espectro, m/z 896.8 e 902.8 respectivamente.

A intensidade absoluta dos íons foi calculada para analisar a eficiência de

ionização em ambas as técnicas (DESI e EASI) (Tabela 5). Para a comparação de

77

intensidade absoluta de cada espectro foi selecionada a corrente total iônica (TIC) de três

corridas da análise de MSI, a corrida central de cada análise, 1 mm acima e 1 mm abaixo

da mesma. Foi selecionado para esse estudo o íon base.

Tabela 6. Espécies detectadas em cada espectro, íons base e médias das intensidades

absolutas dos íons base de cada espectro, das diferentes misturas de padrões em seus

respectivos suportes.

Padrão Suporte Técnica

Espécies

identificadas Íons mais intenso

1 mm antes do

centro Centro

1 mm depois do

centro Média

AGs (-)

Vidro

DESI - H+ 281.1 (M-H)

+ 1,96E+06 1,48E+06 1,26E+06 1,57E+06

EASI - H+ 281.1 (M-H)

+ 1,61E+07 1,33E+07 1,35E+07 1,43E+07

Papel

DESI - H+ 293.0 (M-H)

+ 1,23E+05 1,50E+05 1,19E+05 1,31E+05

EASI - H+ 281.1 (M-H)

+ 5,28E+06 5,86E+06 7,37E+06 6,17E+06

FLs (+)

Vidro

DESI H+ ,Na

+ 782.6 (M+Na)

+ 6,28E+05 5,84E+05 5,81E+05 5,98E+05

EASI H+ ,Na

+ 782.6 (M+Na)

+ 5,01E+05 1,79E+06 2,55E+05 8,49E+05

Papel

DESI H+ ,Na

+ ,K

+ 760.6 (M+H)

+ 4,15E+05 3,41E+05 5,56E+05 4,37E+05

EASI H+ ,Na

+ ,K

+ 782.6 (M+Na)

+ 3,17E+05 3,79E+05 3,67E+05 3,54E+05

TAGs (+)

Vidro

DESI NH4+ ,Na

+ 901.7 (M+Na)

+ 6,45E+06 6,69E+06 7,09E+06 6,74E+06

EASI NH4+ ,Na

+ 901.7 (M+Na)

+ 3,32E+06 3,66E+06 3,94E+06 3,64E+06

Papel

DESI NH4+ ,Na

+ 896.8 (M+NH4)

+ 4,77E+05 3,29E+05 3,78E+05 3,95E+05

EASI NH4+ ,Na

+ 902.8 (M+NH4)

+ 2,52E+06 2,50E+06 2,49E+06 2,50E+06

De acordo com a Tabela 6 podemos observar que as intensidades absoluta das

triplicatas não apresentam uma variação grande para a maioria das corridas (apenas a

fonte EASI nas análises de AGs no suporte vidro apresentou uma variação de 10x entre

as intensidades). Os AGs tem intensidades superiores em 10 e 50 vezes para os suportes

vidro e papel respectivamente, quando utilizada a fonte EASI. Para FLs, DESI e EASI

apresentam valores muito semelhantes. Para os TAGs, houve uma discrepância entre os

suportes, no vidro a DESI apresentou intensidade ligeiramente maior (2 vezes), já para o

papel a EASI obteve intensidade 6 vezes maior.

78

Pôde-se observar uma predominância de adutos de Na+ nos TAGs no vidro, em

relação às preferência por espécies amoniadas no papel. Quanto aos PFs, prevalecem

íons Na+, o que pode se dar pela melhor coordenação entre as carbonilas e o cátion,

devido a seu raio atômico. A formação de espécies amoniadas poderia ocorrer com a

mesma estabilidade que nos TGs, porém nesse caso temos uma interação íon-molécula e

não mais iônica.

A Figura 38 mostra um estudo de caso, no qual dois cortes histológicos de cérebro

de rato foram submetidos às análises de DESI e EASI nos modos positivo e negativo.

Figura 38. MSI de cérebro de rato: a) e b) m/z 782.540, e) e f) m/z 683,504, c), d), g) e h)

m/z 303,208.

Nos estudos de caso, é possível visualizar algumas falhas durante as corridas,

porém a resolução espacial em ambos suportes com ambas as fontes de ionização foram

bons, além de que a ionização do EASI sob baixa vazão no suporte vidro não afetou seu

desempenho, assim como a alta vazão no suporte papel não diminuiu a resolução

espacial.

3.4. Conclusão

Nesse estudo comparativo entre as fontes de ionização DESI e EASI, foi possível

definir que a configuração da fonte de ionização foi o fator determinante para a ionização.

79

A fonte EASI foi tão eficiente quanto ou melhor que a fonte DESI, em realação às

intensidades absolutas, o grau de supressão iônica e o perfil de ionização relativa.

O estudo de caso comprova que o EASI pode ser empregado no MSI, sem perda

da qualidade de informação, com resolução espacial mesmo sob alta vazão de solvente,

uma vez que a dessolvatação é alta o suficiente para evitar a formação de um spot

grande.

4. Conclusões Gerais

A utilização de espectrometria de massas de alta e altíssima resolução juntamente

com a exatidão de massa permite estudos em diferentes áreas da ciência, como mostrado

nesse trabalho, que foi abordado desde estudos mecanísticos de reações orgânicas e

mecanismo de fragmentação até estudos com aplicações biológicas, como o de

ionização, realizado por duas diferentes fontes de ionização ambiente.

Para o estudo de mecanismo de reação de N-metilação e N-metoxicarboxilação

apenas a alta resolução foi suficiente para identificar os intermediários e com o MS

tandem caracterizar todos os intermediários.

Por outro lado foi necessário a altíssima resolução para diferenciar reagente e

produto da reação de dessulfurização do tiofeno, uma vez que a diferença da razão

massa/carga das duas molélucas <0,01 Da. Também foi necessário a análise dos

isotopólogos para determinar a formação de homodímeros, uma vez que esses

apresentam mesma m/z que os seus respectivos monômeros. Todos os intermediários

foram devidamente caracterizados por MS tandem.

Para os estudos de fragmentações das Rodaminas, o uso da altíssima resolução

foi suficiente para determinar a diversidade de rotas para a fragmentação e seus diversos

íons produto. Fragmentações radicalares também podem ocorrer em moléculas com sítio

de carga quando essas são muito estáveis, contrariando a regra do octeto. Essas perdas

podem inclusive convergir em estruturas “isobáricas”, que apresentam mesma massa

80

nominal, porém, são provenientes de diferentes tipos de fragmentação com diferentes

perdas.

O último estudo mostra que os avanços da MS, nem sempre se dá no campo do

analisador e sim também no sistema de inserção de amostras e suas aplicações, como é

o caso da aplicação de uma fonte de ionização EASI (homemade), que é muito mais

simples, devido a não aplicação de voltage e trabalha com pressões mais brandas de gás,

em imageamento com o mesmo potencial que a fonte comercial DESI.

5. Referências

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83

48 Schr der, . Mud ínsk , M. oithová, J. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 15897.

49 (a) McDonnell, L. A.; Rompp, A.; Balluff, B.; Heeren, R. M. A.; Albar, J. P.; Andren, P. E.; Corthals, G. L.; Walch, A.; Stoeckli, M., Anal. Bioanal. Chem. 2015, 407, 2035. (b) Barcelo-Coblijn, G.; Fernandez, J. A., Front. Physiol. 2015, 6.

50 Boxer, S. G.; Kraft, M. L.; Weber, P. K., Annu. Rev. Biophys. 2009, 38, 53. 51 Yalcin, E. B.; de la Monte, S. M., J. Histochem. Cytochem. 2015, 63, 762 52 Wu, C. P.; Dill, A. L.; Eberlin, L. S.; Cooks, R. G.; Ifa, D. R., Mass. Spectrom. Rev. 2013, 32, 218.

53 (a) Eberlin, L. S.; Norton, I.; Dill, A. L.; Golby, A. J.; Ligon, K. L.; Santagata, S.; Cooks, R. G.; Agar, N. Y. R., Cancer Res. 2012, 72, 645. (b) Eberlin, L. S.; Tibshirani, R. J.; Zhang, J. L.; Longacre, T. A.; Berry, G. J.; Bingham, D. B.; Norton, J. A.; Zare, R. N.; Poultsides, G. A., P. Natl. Acad. Sci. USA 2014, 111, 2436. (c) Santagata, S.; Eberlin, L. S.; Norton, I.; Calligaris, D.; Feldman, D. R.; Ide, J. L.; Liu, X. H.; Wiley, J. S.; Vestal, M. L.; Ramkissoon, S. H.; Orringer, D. A.; Gill, K. K.; Dunn, I. F.; Dias-Santagata, D.; Ligon, K. L.; Jolesz, F. A.; Golby, A. J.; Cooks, R. G.; Agar, N. Y. R., P. Natl. Acad. Sci. USA 2014,

111, 11121. 54 Weston, D. J., Analyst 2010, 135, 661

55 Janfelt, C. and Jørgaard, A. W. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23, 1670.

6. Informação Suplementar – Espectros de RMN e MS

1. N-metilação do indol com DABCO

ESI(+)-MS do indol.

84

ESI(+)-MS da reação t = 1 h.



85




86


ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 127.


87



88



89



5.1. N-metilação e N-metoxicarboxilação do indol com DBU

90



91



92

Figure 23. ESI(+)-MS of the reaction at 5h.


.

93



94



95



96



5.2. Dessulfurização oxidativa do tiofeno com MTO

97

RMN 1H do 2- hidroximetiltiofeno.

RMN 13C do 2-hidroximetiltiofeno

98

RMN H1 do 2-cloro metiltiofeno.

RMN 13C do 2-cloro metiltiofeno.

99

RMN 1H do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (4).

RMN 13C do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (4).

100

ESI(+)-MS da reação t = 120 min.

ESI(+)-MS da reação t = 180 min.

100 160 220 280 340 400 m/z

0

20

40

60

80

100

Rela

tive

Ab

un

da

nce

179.07

203.06

141.07

100 160 220 280 340 400 m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

179.07

203.06

141.07

101

50 90 130 170 210 250 m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

97.01

179.06

ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 179 no t = 0 min.

60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

97.01

83.06

121.08 179.06

275.09 193.03

ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 179 no t = 120 min.

102

60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

83.06

96.07 195.57

172.57 121.08 148.58 216.12 244.12

ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 195,5.

60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

186.05

125.01

203.05 109.01 97.01


103

60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z

0

20

40

60

80

100

Rela

tive

Ab

un

da

nce

83.06

195.57 96.07 181.57

211.58 121.08 134.08 173.11 301.09 319.09

ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 211,5

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS …...6G em um espectrômetro de massas Orbitrap com HCD (higher-energy collisional dissociation), para melhor entendimento de suas fragmentações