UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE … · 2020-01-23 · coturno, cintos de bala, cabelão e cheio de tatuagens...pois é, não tenho um pai “tradicional” rs... O

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

LUCIENE SILVA DOS SANTOS

INFECÇÃO POR Bartonella spp. EM PACIENTES QUE APRESENTAM REAÇÕES

HANSÊNICAS SUBENTRANTES

CAMPINAS

2018


INFECÇÃO POR Bartonella spp. EM PACIENTES QUE APRESENTAM REAÇÕES

HANSÊNICAS SUBENTRANTES

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na

área de concentração Clínica Médica.

ORIENTADOR: Elemir Macedo de Souza

COORIENTADOR: Paulo Eduardo Neves Ferreira Velho

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA

PELA ALUNA LUCIENE SILVA DOS SANTOS E ORIENTADA PELO PROF. DR. ELEMIR

MACEDO DE SOUZA.

CAMPINAS

2018

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO


ORIENTADOR: ELEMIR MACEDO DE SOUZA

COORIENTADOR: PAULO EDUARDO NEVES FERREIRA VELHO

MEMBROS:

1. PROF. DR. ELEMIR MACEDO DE SOUZA

2. PROF. DRA. ALEXSANDRA RODRIGUES DE MENDONÇA FAVACHO

3. PROF. DRA. RENATA FERREIRA MAGALHÃES

Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas

da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 22/08/2018

Dedico este trabalho a todos os profissionais que se

empenham no ensino e na pesquisa de doenças

negligenciadas. Infelizmente a esperança de muitos

está nas mãos de poucos.

Agradecimentos

Primeiramente tenho muito a agradecer aos alunos do Instituto Tecnológico

de Aeronáutica (ITA) que refletiram sobre a dificuldade que eles tiveram para passar

no vestibular daquela Instituição, considerado uma das provas de seleção mais

difíceis da América Latina.

A grande maioria deles tinha apoio familiar, ensino de qualidade do berçário

ao médio e condições financeiras satisfatórias, ou seja, tudo que a grande maioria

dos alunos de escolas públicas não têm ou tiveram. Tendo em vista isso, um grupo

de alunos idealizaram um cursinho pré-vestibular exclusivo para os alunos

provenientes de escola pública e de baixa renda. Assim foi criado o Curso Alberto

Santos Dumont (Casd, também conhecido por CasdVest). Inicialmente suas

atividades começaram no porão de um cursinho comercial da região, sobre o qual

há relatos de que quando chovia os alunos ficavam com água na altura das canelas.

Eles eram muito bons em exatas, mas não tinham nenhuma formação

pedagógica, entretanto eles tinham tudo o que precisávamos: conhecimento,

vontade de ensinar e, o principal, acreditavam de fato em nós.

Hoje o CasdVest é um dos cursinhos que mais têm aprovações de alunos

em universidades públicas, eles aprovam mais do que muitos cursinhos particulares.

Posso dizer, com propriedade, que esses alunos do ITA conseguiram mudar

o “Mundo”, o mundo de muitos alunos como eu... Sem dúvidas é o maior

transformador de realidades que eu conheci! O importante é que isso não acaba na

aprovação, somos uma família. O crescimento pessoal não é nada se não

crescermos socialmente. Essa eterna gratidão é uma corrente que não se quebra e

ela é transmitida por nós todos os dias em nossas atitudes, pois também sabemos

que podemos mudar o mundo de alguém.

Hoje temos em quem nos espelhar. Nenhum de nós tinha alguém na família

com ensino superior e hoje somos uma multidão de formados e formandos em

várias áreas. Temos a consciência de que juntos somos mais fortes e o amor, a

dedicação e a confiança são incentivos essenciais para a realização de sonhos e

como dizia Mandela: “A educação é a arma mais poderosa que você pode usar para

mudar o mundo”.

Aqui na Unicamp eu tenho muito a agradecer aos meus professores do

Instituto de Biologia. Esse curso sempre foi um dos meus maiores sonhos. A grande

maioria das disciplinas nunca deixaram a desejar. O bom de ter uma origem humilde

é que apreciamos tudo com empolgação, afinal “nem era para eu estar ali”.

In memoriam agradeço ao Prof. José Roberto Trigo, o grande “Trigão”, por

ter me ensinado uma das matérias mais fantásticas e complexas da biologia:

Ecologia.

Agradeço a Marina Drummond. Não me vejo hoje sem toda a ajuda e

suporte que dela recebi. Há 4 anos quando entrei para equipe eu não tinha noção do

que era trabalhar em laboratório, ao menos sabia quais eram as ponteiras certas

para cada pipeta. Graças à didática, carinho e paciência para responder as minhas

perguntas, que não foram poucas, hoje sou capaz de realizar todos os

procedimentos e treinar os novos estagiários da equipe. Posso dizer com

propriedade que eu descobri o real significado da frase “inspirar-se em alguém”. Ela

não foi apenas uma grande tutora, mas também se tornou uma grande amiga!

Daquelas que temos a certeza que é para a vida toda. Sou muito grata e sortuda,

pois sei que esse nível de afinidade, respeito e companheirismo é raríssimo.

Agradeço muito o meu coorientador Prof. Dr. Paulo Velho, quem o conhece

sabe o quanto ele é um verdadeiro “gentleman”. Nunca vi pessoa tão gentil, polida,

educada... Confesso que até bons modos com ele apreendi. Infelizmente não tive a

oportunidade de tê-lo como professor na graduação, pois admiro o quanto ele se

preocupa com a qualidade do ensino. Não poderia deixar de agradecê-lo por todas

as correções, sempre criterioso e detalhista. Com toda certeza aprendi mais

português com ele do que nos meus 11 anos de ensino fundamental e médio.

Agradeço e peço perdão por dar trabalho na correção. Bom, dizem que os

orientandos acabam adquirindo as manias dos orientadores, eu gostaria de ter essa

capacidade de fazer tanta coisa e ser boa em todas elas.

Ao Prof. Dr. Elemir, sou grata por me ensinar sobre hierarquia, experiência

de vida e construção de legados. Afinal, ele é o professor do meu professor! Tenho

muito respeito por toda sabedoria e conhecimento por ele transmitido.

Agradeço imensamente o meu pai Douglas por ter me ensinado a ser forte,

otimista e persistente. Ele é o meu super-herói sem capa, porém com braceletes,

coturno, cintos de bala, cabelão e cheio de tatuagens...pois é, não tenho um pai

“tradicional” rs... O apetrecho que eu mais amo nele, e ele sabe usar muito bem, é o

seu enorme coração. Meu pai é aquela pessoa rara que todos gostariam de ter

como amigo, é aquele que marca a vida e que todos lembram com carinho. Ele é

“culpado” por boa parte do que eu sou hoje, sem isso tudo seria muito mais

complicado e penoso.

Agradeço minha vó Maria por ter sido a mãe que eu nunca tive, que cuidou

de mim da melhor forma que ela podia. É tão estranho ficar doente e não tê-la por

perto, confesso que sinto saudades até das “pajelanças”: se eu estou com tosse e

catarro, lá vem a Dona Maria trazendo o café com banha de galinha. Se tomei uma

picada de inseto, a Dona Maria surge de prontidão com um frasquinho de spray

contendo um composto com várias ervas em álcool e assim vai... Como o meu pai,

ela sempre me apoiou a continuar os estudos. Graças a eles hoje sou bióloga

formada pela Unicamp, embora o sonho dela fosse que eu estudasse farmácia, por

que será? rs...

Agradeço ao Marcelo, o Amor da minha vida, que há 6 anos me deixa feliz

só por lembrar que ele existe. Quando um experimento não funcionava, ou um

equipamento quebrava e atrasava todo o meu cronograma, era ele que aguentava

as minhas angústias de perto. Quando as coisas fluíam e eu aprendia algo novo e

empolgante, era que aguentava eu repetir mil vezes a mesma história, rs... Muito

obrigada pelos risos espontâneos em todos os momentos, especialmente nos

naqueles difíceis.

Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo auxílio financeiro, o qual sem ele este trabalho não seria possível.

Por fim, e não menos importante, agradeço a todos da equipe do laboratório,

pelo suporte nos experimentos, aprendizado e boas risadas. Agradeço a todos os

meus professores (sem exceção) pela construção do meu conhecimento e,

principalmente, pelas dúvidas plantadas. Aos meus amigos, em particular aos que

não vejo há muito tempo, e jamais estão ausentes... sempre oferecendo uma boa

conversa online, nos momentos de estresse.

RESUMO

Dados da Organização Mundial da Saúde mostram que no Brasil a hanseníase

ainda é um preocupante desafio a ser resolvido. Embora seja uma doença que

apresenta baixa taxa de letalidade, a hanseníase é uma das que mais causa

incapacidades físicas, sendo que a maioria dessas têm a sua origem nos episódios

inflamatórios agudos próprios das reações hansênicas. Os pacientes que

apresentam essas reações são, muitas vezes, medicados com corticoides em doses

imunossupressoras. A longo prazo, esse tipo de terapia, além de outros problemas,

torna os pacientes susceptíveis a infecções por outros patógenos. Essas

coinfecções, mesmo que subclínicas, podem desencadear novas reações

hansênicas, dificultando o tratamento e aumentando os riscos de lesões

incapacitantes. As bartonelas são patógenos negligenciados de distribuição mundial,

que causam bacteremia cíclica, potencialmente assintomática, podendo evoluir para

manifestações graves. O objetivo deste trabalho foi avaliar a prevalência da infecção

por Bartonella spp. em pacientes que apresentavam reações hansênicas

subentrantes de difícil controle há pelo menos seis meses. Para isso foram

analisadas as amostras de sangue de pacientes usando a combinação de vários

métodos microbiológicos (cultura líquida e subcultura sólida) e moleculares (PCR

convencional, PCR de dupla amplificação e PCR em tempo real). Também foram

avaliados, por meio dos métodos moleculares citados, fragmentos cutâneos

parafinados dos pacientes que porventura haviam sido biopsiados durante o

tratamento e tinham tecido disponível para o estudo. Dos 20 pacientes analisados,

nove (45%) apresentaram positividade para infecção por Bartonella spp. e em quatro

deles foi possível isolar Bartonella henselae. Quatro entre os 12 pacientes, que

tinham tecido parafinado disponível, apresentaram PCR positiva nesse tipo de

amostra. Assim, foi possível avaliar que o uso de tecido parafinado pode ser uma

alternativa para o diagnóstico retroativo da infecção por esses agentes. Os

resultados obtidos neste trabalho sugerem que infecções por Bartonella spp. devem

ser incluídas na lista de infecções que potencialmente contribuem para o

desencadeamento de reações hansênicas subentrantes de difícil controle.

Palavras-chave: Bartonella; Hanseníase Multibacilar; Prevalência; Doenças

Negligenciadas.

ABSTRACT

Data from the World Health Organization show that leprosy in Brazil is still a troubling

challenge to be solved. Although it is a disease that presents a low lethality rate,

leprosy is one of the main causes of physical disabilities, most of which have their

origin in the acute inflammatory episodes characteristic of leprosy reactions. Patients

who have these reactions are often given corticosteroids in immunosuppressive

doses. In addition to other health problems, corticosteroids long-term therapy makes

patients susceptible to infections by other pathogens. These coinfections, even if

subclinical, can trigger new leprosy reactions, making treatment difficult and

increasing the risk of disabling injuries. Bartonella spp. are neglected pathogens of

worldwide distribution. They cause cyclical and potentially asymptomatic bacteremia

that can evolve to severe manifestations. The main objective of this work was to

evaluate the prevalence of Bartonella spp. in patients with chronic type 2 leprosy

reactions for at least six months. For this purpose, blood samples from 20 of these

patients were analyzed using a combination of several microbiological methods

(liquid culture and solid subculture) and molecular methods (conventional PCR,

nested PCR and real-time PCR). The paraffin-embedded cutaneous fragments of the

patients who had been biopsied in the hospital and had tissue available for the study

were also evaluated using molecular methods. Of the 20 patients analyzed, nine

(45%) presented positivity for infection by Bartonella spp. and four of them had a

Bartonella henselae isolate. Twelve patients had paraffin-embedded tissue available

for analysis and four were B. henselae positive. The results obtained in this work

suggest that infections by Bartonella spp. should be included in the list of infections

that potentially contribute to the onset of leprosy chronic reactions and that paraffin-

embedded tissue may be an alternative way to the retroactive diagnosis of infection

by these agents.

Keywords: Bartonella; Multibacillary Leprosy; Prevalence; Neglected Diseases.

Sumário 1. Introdução ......................................................................................................... 13

1.1. Hanseníase ................................................................................................. 13

1.1.1. Epidemiologia ....................................................................................... 14

1.1.2. Diagnóstico e classificação ................................................................... 16

1.1.3. Tratamento ........................................................................................... 17

1.2. Reações hansênicas ................................................................................... 19

1.2.1. Epidemiologia das reações hansênicas ................................................ 21

1.2.2. Gatilhos imunológicos reacionais.......................................................... 21

1.2.3. Tratamento das reações hansênicas .................................................... 22

1.2.4. Reações hansênicas subentrantes ....................................................... 22

1.2.5. Complicações relacionadas ao uso de corticoides ................................ 24

1.3. Infecção por bartonelas ............................................................................... 24

1.3.1. Bartonella spp. ...................................................................................... 25

1.3.2. Manifestações clínicas .......................................................................... 27

1.3.3. Desafios diagnósticos ........................................................................... 31

1.3.4. Risco potencial de bartonelose durante terapias imunossupressoras ... 32

1.3.5. Tratamento para bartoneloses .............................................................. 32

1.3.6. Caso índice .......................................................................................... 33

1.4. Justificativa ................................................................................................. 38

2. Objetivos ........................................................................................................... 38

2.1. Geral .............................................................................................................. 38

2.2. Específicos .................................................................................................... 38

3. Metodologia ....................................................................................................... 39

3.1. População do estudo .................................................................................. 39

3.2. Local ........................................................................................................... 39

3.3. Fatores de risco para infecção por bartonelas (questionário) ...................... 40

3.4. Métodos ...................................................................................................... 40

3.5. Aspectos éticos ........................................................................................... 45

4. Resultados ........................................................................................................ 45

5. Discussão .......................................................................................................... 49

6. Conclusão ......................................................................................................... 57

7. Referências ....................................................................................................... 59

8. Apêndices .......................................................................................................... 69

Apêndice 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido .................................... 69

Apêndice 2 - Questionário: Fatores de risco para infecção por Bartonella spp. .... 72

9. Anexos .............................................................................................................. 76

Anexo 1 – Parecer Consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp

............................................................................................................................. 76

Anexo 2 – Artigo submetido e aceito para publicação na JDDG: Journal der

Deutschen Dermatologischen Gesellschaft ........................................................... 81

Anexo 3 – Trabalho submetido para o 54ª Congresso da Sociedade Brasileira de

Medicina Tropical- Medtrop 2018 .......................................................................... 84

13

1. Introdução

1.1. Hanseníase

A hanseníase é uma doença crônica infectocontagiosa de evolução lenta

causada pelo Mycobacterium leprae e também pelo Mycobacterium lepromatosis,

ambos similares. O último só foi descoberto em 2008 no México, após análise

genética dos bacilos presentes em pacientes virchowianos (1-3). Esses agentes são

responsáveis pelo comprometimento, primeiramente, de nervos periféricos e

secundariamente da pele, olhos e, nos pacientes virchowianos polares, de qualquer

órgão do organismo (3). A infecção pode provocar incapacidades físicas e evoluir

com significativas deformidades (1). Embora seja conhecida desde os primórdios da

civilização, a hanseníase, especialmente no Brasil, ainda é um grande problema de

saúde pública a ser resolvido. Fruto da combinação de vários fatores genéticos,

ambientais e sociais, a antiga “lepra”, foi erradicada em países desenvolvidos,

mesmo antes de uma antibioterapia efetiva, evidenciando que sua eliminação não se

trata apenas de um problema biológico (4). Apesar da potencial cura, e a quebra do

ciclo de transmissão por meio do esquema terapêutico padronizado, conhecido

como multidrogaterapia (MDT), a doença ainda está longe de ser eliminada do

território brasileiro.

Muito importante para história da medicina, o agente M. leprae foi a

primeira bactéria a ser associada a uma doença humana (5). São patógenos

intracelulares obrigatórios que têm predileção por macrófagos da pele e as células

de Schwann do sistema nervoso periférico (3). Os bacilos são morfologicamente

retos ou ligeiramente encurvados de 1,5 a 8 mícron de comprimento por 0,2 a 0,5

mícron de largura. Pertencentes ao mesmo gênero do agente da tuberculose,

Mycobacterium tuberculosis, esses patógenos têm algumas características em

comum: são bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) e possuem crescimento lento

(3).

O M. leprae são bactérias intracelulares obrigatórias e um dos maiores

desafios, que dificultam os estudos destes microrganismos, é a impossibilidade de

14

isolar suas colônias in vitro. Ainda não foi possível criar um meio e condições que

atendam todas as exigências desses bacilos, além disso, o seu crescimento

bastante lento (11 a 16 dias) é outro entrave para o avanço das pesquisas (6, 7).

Por exigir temperaturas variando de 30 a 35°C para o seu crescimento, o

M. leprae tem predileção por regiões mais frias do corpo como nariz, orelha e dedos

(3). Nos organismos altamente infectados os bacilos viáveis formam aglomerados,

conhecidos como globias (6).

O agente é transmitido preferencialmente pelas vias aéreas,

principalmente no convívio prolongado com portadores multibacilares sem

tratamento (3). Embora muitos bacilos sejam eliminados pelo portador

potencialmente transmissor, nem todos do convívio com os doentes desenvolvem a

doença. Estima-se que mais de 95% dos indivíduos apresentam imunidade natural

capaz de impedir o desenvolvimento da infecção (3, 8, 9).

O Brasil é um país que tem uma trágica história em relação às políticas de

isolamento compulsório que perdurou até os meados dos anos 80, mesmo já tendo

conhecimento de que pacientes em tratamento não eram fontes de transmissão da

doença. Essa postura reforçou o preconceito para com os portadores da doença,

além de separar famílias inteiras e causar todo o sofrimento psicológico por conta

deste tipo de medida (10).

O estigma era tão grande no país em torno do nome “lepra” que em 1995

uma das medidas tomadas pelo governo foi proibir o uso da palavra em todos os

documentos oficiais, substituindo-a por “mal de Hansen”, ou simplesmente

hanseníase. Hoje o Brasil é o único país que eliminou o termo e não alcançou a

meta de eliminação da doença (11).

1.1.1. Epidemiologia

Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2015, mostram que

94% dos doentes se encontram em 13 países: Etiópia, Bangladesh, Brasil, Filipinas,

Índia, Indonésia, Madagascar, Mianmar, Nepal, Nigéria, República Democrática do

Congo, República Unida da Tanzânia e Sri Lanka. (12).

15

O Brasil, a Índia e a Indonésia apresentam juntos 81% de todos os casos

novos notificados da doença. O Brasil encontra-se no segundo lugar no ranking dos

países endêmicos da hanseníase, perdendo apenas para a Índia em números

absolutos de casos e sendo o único país que não atingiu a meta de prevalência

estipulada pela Organização das Nações Unidas (ONU), que era alcançar menos de

um caso para cada 10 mil habitantes em 2015 (12).

Embora haja vários esforços para alcançar a meta de eliminação da

hanseníase, ela se mantém em lugar de destaque em meio a outras doenças

negligenciadas. Em 2016, no Brasil, foram notificados 25.218 novos casos da

doença. A maior parte dos casos se concentram nos estados mais pobres do Brasil

como pode-se observar no Gráfico 1.

Gráfico 1. Taxa de detecção de hanseníase nos estados brasileiros por cada

100.000 habitantes.

Nesse gráfico destaca-se que os estados com condições mais favoráveis

de qualidade de vida, infraestrutura pública de saúde e educação são os que têm os

menores índices da doença. A hanseníase é uma doença conhecida por atingir

principalmente a população de baixa renda. A sua distribuição está associada a

estados com índice elevados de municípios com baixos indicadores

16

socioeconômicos como: expectativa de vida, oferta de serviços públicos à

população, urbanização, renda, etc. Segundo dados socioeconômicos, o Centro-

Oeste, Norte e Nordeste são as regiões mais carentes e apresentam altas taxas da

doença (2). Segundo a ONU, além de ser uma doença prevalente em grupos menos

favorecidos, as pessoas do sexo masculino são as mais acometidas (3).

1.1.2. Diagnóstico e classificação

O aparecimento de lesões cutâneas, queda de pelos, diminuição da

sudorese, alteração de sensibilidade (térmica, dolorosa e tátil) e problemas

oftalmológicos, são algumas manifestações apresentadas pelos pacientes

hansenianos. Entretanto, a hanseníase é uma doença de caráter espectral, ou seja,

possui uma ampla variedade de manifestações clínicas entre os polos da doença,

descritos a seguir. O desenvolvimento dessas apresentações clínicas é dependente

das condições genéticas, imunológicas e ambientais do indivíduo (4). Para facilitar a

padronização, em meio a essas múltiplas formas, a OMS implementou uma

classificação para fins operacionais do tratamento com MDT que compreende duas

formas: a paucibacilar (PB) e a multibacilar (MB). As formas PB são caracterizadas

por baciloscopia negativa, presença de até cinco lesões cutâneas e no máximo um

único tronco nervoso comprometido. Já as formas MB caracterizam-se por

apresentarem baciloscopia positiva, lesões disseminadas pelo corpo e pelo menos

dois troncos nervosos acometidos (5).

O tipo de resposta imunológica desenvolvida pelo hospedeiro é

determinante para que haja esta variação nas características histológicas e

bacteriológicas das lesões, essas características determinam a classificação clínica

conforme mostrado no Quadro 1 (1, 8). A hanseníase apresenta dois polos estáveis:

o polo tuberculoide, que é o polo de alta resistência ao bacilo, onde os portadores

apresentam uma boa resposta imunológica celular (resposta Th1), e o polo

virchowiano, que é o polo de susceptibilidade, no qual os portadores apresentam

uma resposta imunológica celular ineficiente para impedir a multiplicação bacilar

(resposta Th2). Entre esses dois polos extremos, existem as formas dimorfas que

são formas instáveis que podem apresentar características próprias, como é o caso

17

da forma dimorfa-dimorfa (DD) e características mistas entre os polos estáveis,

como é o caso das formas dimorfa- tuberculoide (DT) e dimorfa-virchowiana (DV) (5,

6). Os indivíduos que apresentam hanseníase tuberculoide (HT), possuem

manifestações que estão relacionadas a forte intensidade de sua resposta

imunológica celular que leva à destruição dos bacilos, limitando a área das lesões.

Já os indivíduos com hanseníase virchowiana (HV) apresentam uma grande

deficiência na resposta imune celular, mas apresentam uma maciça resposta imune

humoral. Entretanto, a produção de anticorpos e imunocomplexos não impedem a

disseminação dos bacilos para várias partes do corpo (7).

Quadro 1. Classificação da hanseníase

Classificação da hanseníase

Ridley & Jopling Resposta imunológica celular Resposta imunológica

humoral

Formas clínicas Indeterminada, Tuberculoide,

Dimorfa-tuberculoide Dimofa-dimorfa, Dimorfa-virchowiana, Virchowiana

Classificação operacional (OMS)

Nº de lesões: até 5 Até um tronco nervoso acometido

Índice baciloscópico: negativo

Nº de lesões: > 5 Mais que um tronco nervoso

acometido Índice baciloscópico: positivo

Formas operacionais Paucibacilar Multibacilar

Fonte: Ridley & Jopling (1966) e da Organização Mundial da Saúde (1982).

1.1.3. Tratamento

O tratamento, além de evitar a evolução e os agravos da doença, é a

única forma de quebrar o ciclo de transmissão. Durante muito tempo ele foi feito com

monoterapia de dapsona. Esse tipo de tratamento poderia durar mais do que 10

anos, além disso, havia uma significativa taxa de resistência bacilar ao medicamento

(8).

18

Apenas no início da década de oitenta (1982) a OMS implementou e

padronizou o uso da MDT, que consiste na combinação de dapsona com clofazimina

e rifampicina que até hoje é a primeira linha de tratamento. Além de diminuir a taxa

de recidivas, esta associação também foi capaz de padronizar e reduzir

significativamente o tempo do tratamento. Nessa combinação medicamentosa, a

dapsona e a clofazimina são drogas bacteriostáticas e a rifampicina é bactericida. O

esquema terapêutico varia de acordo com a classificação operacional: Quadro 2 e 3

(9, 10).

O fim da transmissão é alcançado já nas primeiras doses do tratamento,

mas a potencial cura sem sequela pela MDT depende da detecção precoce da

doença. Só assim, os pacientes têm, de fato, grandes chances de não desenvolver

nenhuma sequela.

Quadro 2. Esquema terapêutico recomendado pela Organização Mundial

da Saúde para pacientes paucibacilares

Esquema terapêutico para pacientes paucibacilares

Doses mensais

supervisionadas

Rifampicina (RFM): 600mg

Dapsona (DDS): 100mg

Doses diárias

auto administradas


Tempo de Tratamento 6 meses

Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde (2010).

19

Quadro 3. Esquema terapêutico recomendado pela Organização Mundial

da Saúde para pacientes multibacilares

Esquema terapêutico para pacientes multibacilares

Doses mensais

supervisionadas

Rifampicina (RFM): 600mg


Clofazimina (CFZ): 300mg

Doses diárias

auto administradas


Clofazimina (CFZ): 50mg

Tempo de tratamento 12 meses

Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde (2010).

1.2. Reações hansênicas

Embora a cura da infecção do M. leprae seja possível há mais de três

décadas, com a implementação do tratamento pela MDT os males da doença podem

não terminar com a morte dos bacilos. Muitos pacientes acabam apresentando

episódios inflamatórias agudos e subagudos contra os fragmentos dos bacilos vivos

ou mortos, respostas denominadas de reações hansênicas ou estados reacionais

(11, 12). Durante esses eventos ocorre a piora do estado clínico do paciente, as

reações hansênicas não dependem da infecção ativa do M. leprae e podem ocorrer

tanto nos casos multibacilares quanto paucibacilares (13).

As reações hansênicas são consideradas uma urgência clínica que requer

tratamento imediato com imunossupressores, pois são elas as principais causadoras

de incapacidades físicas nesses pacientes. Portanto, controlar a inflamação é

imprescindível para prevenir esses danos (10, 14).

Assim como as várias formas de apresentações clínicas da hanseníase, o

tipo de reação desenvolvida pelo paciente também está relacionado ao modo como

ele responde imunologicamente aos antígenos do M. leprae. E isso, também está

20

relacionado a fatores genéticos e ambientais, juntamente com o tipo clínico de

hanseníase que este paciente tem ou tinha no início do tratamento (7, 15).

As reações hansênicas são divididas em dois principais tipos:

Reações hansênicas do tipo I também conhecida como reação

reversa (RR): é causada pelo desencadeamento da resposta imunológica celular

(Th1). Acontece em pacientes com imunidade celular competente e específica

contra o M. leprae. Neste tipo de reação as lesões cutâneas pré-existentes ficam

mais edemaciadas e evidentes e pode haver surgimento de novas lesões. Em casos

mais graves, podem surgir reação aos antígenos dos bacilos localizados em troncos

nervosos. Entretanto, não há comprometimento sistêmico e geralmente ocorrem em

pacientes com as formas HT, DT, DD e raramente nos DV (14).

Reações hansênicas do tipo 2: são, erroneamente, conhecidas como

sinônimo de eritema nodoso hansênico (ENH), porém nem todo paciente com

reação do tipo 2 desenvolve nódulos eritematosos. Ela é causada pelo

desencadeamento da resposta imunológica humoral (Th2). Esse tipo de reação

geralmente ocorre em pacientes que não apresentaram uma resposta Th1 efetiva e

que, devido a isso, há um grande acúmulo de bacilos e deposição de

imunocomplexos na evolução da hanseníase. Geralmente ela ocorre durante ou

depois do tratamento com a MDT, mas pode preceder o diagnóstico da doença.

Com a destruição bacilar promovida principalmente pela MDT, esses pacientes

começam a apresentar reações hipersensibilidade humoral com formação de

imunocomplexos formados pela resposta Th2 (7, 14).

As reações do tipo 2 têm efeitos sistêmicos podendo comprometer

diversos órgãos como olhos, rins, baço e fígado, além da pele e nervos. Portanto,

são potencialmente mais graves que as reações do tipo 1. Suas manifestações

caracterizam-se por apresentar nódulos, pápulas e placas dolorosas. Geralmente

são acompanhadas de febre, mal-estar generalizado, neurite com ou sem

espessamento e dor de nervos periféricos e dores nas articulações ou mesmo

artrites (16). São autolimitadas e duram em torno de duas semanas. Ao contrário da

reação do tipo 1, é comum o surgimento de novas lesões e as pré-existentes podem

permanecer inalteradas. Ocorrem em pacientes com as formas DV e V (11, 14, 17).

21

1.2.1. Epidemiologia das reações hansênicas

Assim como há predisposição genética para o desenvolvimento da

hanseníase e de suas formas clínicas, estudos mostram que o aparecimento das

reações também tem relação com alguns marcadores genéticos (18, 19).

As reações hansênicas são um dos principais motivos que levam os

pacientes a abandonar o tratamento, pois eles acreditam que os medicamentos são

os responsáveis pela piora do quadro clínico (7).

De acordo com a literatura, a frequência e o tempo de duração das

reações hansênicas são bastante variáveis, mas há uma relação muito forte entre os

pacientes que apresentam reações durante o tratamento são mais propensos a

desenvolver reações após o término da terapia específica (20).

A OMS mostra que, assim como a hanseníase, há uma maior frequência

no número de ocorrência de reações hansênicas em homens. A predominância dos

estados reacionais está potencialmente relacionada com a tendência na demora da

procura por ajuda médica por este gênero (3, 21).

Estima-se que em média 30 a 35% dos pacientes desenvolvem reações

hansênicas e essas são mais comuns e frequentes em pacientes multibacilares

chegando a 50% entre esse grupo (14, 22-24).

1.2.2. Gatilhos imunológicos reacionais

Não é possível prever a ocorrência das reações hansênicas, mas existem

alguns marcadores genéticos, fatores fisiológicos e ambientais que predispõem as

reações nos indivíduos (25). Fatores que podem precipitar as reações hansênicas

são observados, particularmente, nas reações do tipo 2. O seguimento desses

fatores é essencial para a prevenção e o controle desses episódios. Em geral,

perturbações imunológicas como gravidez, parto, estresse, alcoolismo, infecções ou

infestações concomitantes, inclusive subclínicas, são os principais precipitantes (7,

14, 23).

22

Um estudo observou que pacientes que fizeram tratamento para

infecções orais tiveram significativa melhora nas reações inflamatórias da

hanseníase em comparação ao grupo controle. Isso sugere que um foco infeccioso,

mesmo que subclínico, poderia estimular o gatilho imunológico das reações. As

periodontites são causas comumente associadas as reações hansênicas (26).

1.2.3. Tratamento das reações hansênicas

Até o momento não há nenhum tratamento capaz de impedir que as

reações hansênicas ocorram, mas elas podem ser tratadas (27). Apesar de

caracterizar um estado de urgência, o tratamento reacional geralmente é

ambulatorial e o paciente deve ser acompanhado de perto. Não há um esquema

terapêutico único para o tratamento das reações. A dose, o tempo de tratamento e o

esquema terapêutico variam de acordo com a resposta do paciente aos fármacos, a

gravidade das lesões e a sua evolução (10, 27, 28).

No caso de reações do tipo 1 mais leves, ou seja, apenas cutânea, sem o

comprometimento neural, é recomendado analgésicos e anti-inflamatórios não

esteroidais. Caso haja comprometimento neural, o tratamento com corticoides é

necessário para a prevenção dos danos (14, 27). Para os pacientes com reações do

tipo 2, a droga de escolha é a talidomida e sua dose irá variar de acordo com a

gravidade do caso. Entretanto, este medicamento não é indicado para mulheres no

período fértil, devido aos seus efeitos teratogênicos, ou para pacientes com

comprometimento extracutâneo como neurites, uveítes, etc. Nesses casos é

necessário o tratamento com corticoides (29).

1.2.4. Reações hansênicas subentrantes

Normalmente as reações do tipo 2 duram em torno de uma ou duas

semanas e, quando se faz necessário, respondem bem ao tratamento (30). Embora

a reação hansênica do tipo 2 possa ocorrer em um único episódio, cerca de 33% a

64% dos pacientes que apresentam esse tipo de reação pode manifestá-la mais de

23

uma vez, com média de 2,6 episódios (13, 31). Entre esses pacientes 31% podem

manifestar cinco ou mais episódios durante um período de mais de dois anos, o que

eleva muito as chances de adquirirem alguma incapacidade física em decorrência

dessas reações (31). Portanto, o tempo reacional, o número das recorrências e o

intervalo entre elas são fatores importantes para que providências sejam tomadas

como a busca mais cuidadosa dos possíveis gatilhos reacionais e uma melhor

adequação terapêutica.

Embora haja várias contradições conceituais e terminológicas de como

classificar corretamente a temporalidade das reações hansênicas, este estudo,

assim como o estudo de Kumar et al., 2004, considerou a reação hansênica do tipo

2 como crônica aquela que o paciente se encontra em tratamento reacional

continuamente por um período de seis meses ou mais (31). Neste trabalho, foi

denominado como reações subentrantes aquelas que se apresentam de forma

subsequentes, sem intervalos entre elas. Ou seja, antes do término de um episódio

reacional, um outro ressurge em seguida de forma aguda e de difícil controle.

Todos os casos de reações de difícil tratamento, principalmente as que

possuem estados contínuos, ou recorrentes, devem ser investigados com mais

acuidade os fatores precipitantes de reações (parasitoses, infecções, situações

estressantes, etc.) (32).

Por tratar-se de um estado reacional prolongado e subsequente é comum

o comprometimento neural durante as reações subentrantes, por isso se faz

necessário o uso de corticoides, associados ou não à talidomida, frequentemente

em altas doses (27, 32). A clofazimina é recomendada como droga poupadora de

corticoide nessas situações. Em casos em que a talidomida é contraindicada como

tratamento isolado (no eritema nodoso com comprometimento neural, irite,

iridociclite, orquite, edemas de mãos e pés, entre outros), faz-se necessário o uso de

prednisona na dose de 40mg ou mais por dia, com redução gradual das doses

conforme a melhora clínica (27).

Entre os esquemas terapêuticos alternativos para essas reações está o

uso e/ou associação de pentoxifilina, metotrexato, azatioprina, etarnecept, infliximab

entre outros (27, 32-35).

24

1.2.5. Complicações relacionadas ao uso de corticoides

Pacientes que apresentam reações subentrantes por longos períodos,

acabam fazendo o uso crônico de altas doses de corticoides e outros

imunossupressores. Essa dependência terapêutica potencializa comorbidades como

a diabetes, osteoporose, problemas cardiovasculares e hepáticos, catarata entre

outros males (36-38).

Antes de iniciar um tratamento imunossupressor prolongado é necessário

fazer uma investigação de comorbidades que podem ser agravadas com o uso

desses medicamentos. É recomendado fazer tratamentos profiláticos para

infestações intestinais, reposição de cálcio, além do controle periódico das

condições dos pacientes, como taxa glicêmica, peso e pressão arterial (39).

A imunossupressão induzida por esses medicamentos aumenta as

chances do paciente adquirir infecções e infestações oportunistas e/ou atípicas, uma

vez que comprometem a capacidade de resposta imunológica eficaz. Essas

infecções, mesmo que subclínicas, podem estar relacionadas ao gatilho imunológico

associado à origem ou a manutenção dessas reações, dificultando o tratamento e

potencializando os riscos ao paciente (32, 40-43). Entre os agentes que causam

infecção subclínica estão as bartonelas.

1.3. Infecção por bartonelas

As bartonelas são bactérias do gênero Bartonella que ao infectar

indivíduos imunocompetentes, podem causar infecção assintomática. Um estudo

avaliou a prevalência da bacteremia por esses agentes no sangue de 500

hemodoadores do Hemocentro da Unicamp. A análise foi realizada pela técnica de

reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional específica para o gênero

Bartonella, que amplifica a região ITS a partir de DNA extraído de cultura líquida

usando o BAPGM® (Bartonella Alpha-Proteobacteria Growth Liquid Medium) e de

subcultura em meio sólido. Dezesseis doadores de sangue (3,2%) foram positivos

na pesquisa molecular e foram obtidos seis (1,2%) isolados (44). Recentemente

essas mesmas amostras foram reanalisadas usando diversos métodos moleculares

25

(PCR convencional, PCR de dupla amplificação e PCR em tempo real) para a

detecção de Bartonella spp. também nas amostras de sangue total. Nesta

reavaliação foram positivos 102 doadores (20,4%). Somando todos os positivos

obtidos nos dois projetos, 115 doadores tiveram o DNA de Bartonella sp. detectado

o que corresponde a 23% de prevalência nestes doadores (45). Esse estudo é um

importante alerta que mostra que esse tipo de infecção é comum, embora não se

saiba até quando esse tipo de infecção se apresenta de forma assintomática. Além

disso, foi evidenciada a necessidade de um diagnóstico rápido e preciso para

Bartonella spp., uma vez que esse sangue infectado pode ser transfundido em

pessoas que estão potencialmente imunodeficientes.

Embora a infecção possa ser assintomática em imunocompetentes, esses

agentes podem causar uma linfadenopatia granulomatosa acompanhada, ou não, de

febre. Geralmente nesses indivíduos o quadro é autolimitado, sem necessidade de

uso de fármacos para a melhora, comumente é o que acontece na doença da

arranhadura do gato (DAG) (46, 47).

Nos pacientes imunodeficientes, sejam por problemas de saúde ou por

uso contínuo de imunossupressores, a infecção por bartonelas pode ser mais grave

ou mesmo fatal, uma vez que nesses casos a doença tem maiores chances de se

apresentar de forma sistêmica. Pacientes com aids, quando são infectados por

bartonelas, apresentam altas taxas bacterêmicas e desenvolvem com mais

frequência, se comparado com imunocompetentes, angiomatose bacilar, peliose

hepática ou esplênica, entre outras manifestações (48-50). Da mesma forma, várias

complicações são relatadas em pacientes que fizeram transplantes de órgãos

sólidos, principalmente rins e fígado (51, 52). Também é apontado o aumento

dessas infecções em pacientes que fazem uso de imunossupressores para

tratamento de doenças como lúpus e artrite reumatoide (53-55).

1.3.1. Bartonella spp.

O gênero Bartonella compreende pelo menos 45 espécies, sendo 16

(Quadro 4) conhecidas como patógenas ao homem (56, 57). São bactérias

pertencentes a classe das alfa-proteobactérias, gram-negativas, cocobacilares,

26

fastidiosas, intracelulares facultativas podendo infectar macrófagos, eritrócitos,

células dendríticas e endoteliais. A existência de uma fase intraeritrocítica dificulta a

ação das defesas do sistema imunológico (58-60). Desta forma, esse gênero de

bactéria alcançou um grande sucesso ecológico e hoje compreendem numerosas

espécies e subespécies. Embora algumas espécies sejam endêmicas, há várias que

estão distribuídas por todo o mundo. Esses microrganismos são especializados em

infectar mamíferos, mas algumas espécies já foram encontradas em aves

migratórias e tartarugas (61-63).

Provocar uma bacteremia cíclica em seus hospedeiros é uma

característica adaptativa que favorece a transmissão dessas bactérias por

artrópodes hematófagos. A maioria das bartonelas possuem um vetor preferencial,

por exemplo a Bartonella quintana que é transmitida por piolho do corpo (Pediculus

humanus corporis), mas também pode ser transmitida por percevejo de cama (Cimex

pilosellus) (64).

Entre as espécies de Bartonella patogênicas ao ser humano, pode-se

destacar três como sendo as principais causadoras de manifestações clínicas:

Bartonella bacilliformis, B. quintana e Bartonella henselae (65).

27

Quadro 4. Espécies de Bartonella patogênicas ao homem e suas manifestações

1.3.2. Manifestações clínicas

A primeira espécie de Bartonella descrita foi a B. bacilliformis identificada

em 1905 pelo microbiologista argentino Alberto Barton. O nome do gênero é uma

homenagem a esse pesquisador. Ele estudava uma doença endêmica no Peru e

restrita à região dos Andes (Peru, Equador e Colômbia), transmitida por um

mosquito flebotomíneo (Lutzomyia verrucarum) comum nessas regiões.

A doença estudada por Barton possui duas fases distintas: uma aguda,

conhecida como febre de Oroya, que é caracterizada por uma bacteremia

intraeritrocitária que frequentemente resulta em uma anemia hemolítica fatal (de 40

a 90% dos casos na era pré-antibiótica) e outra crônica, conhecida por verruga

peruana que consiste no aparecimento de vários tumores vasculares que se

originam de células endoteliais colonizadas por essas bactérias.

28

Essa doença bifásica é conhecida por doença de Carrión, em

homenagem ao estudante de medicina peruano Daniel Carrión, que atingiu seu

objetivo comprovando que as duas doenças (febre de Oroya e verruga peruana)

eram fases de uma mesma enfermidade. Em 1885, Carrión inoculou em si mesmo

sangue proveniente de uma lesão cutânea de verruga peruana, contraiu a febre de

Oroya e faleceu durante a fase aguda da infecção (66, 67). Embora a maioria das

outras bartonelas tenha como reservatórios outros animais a B. bacilliformis tem

como hospedeiro reservatório os humanos (67).

Outra exceção em que os humanos também são considerados

reservatórios primários é a espécie B. quintana. Esse agente é transmitido

principalmente pelo piolho de corpo humano (Pediculus humanus corporis).

Entretanto, outros artrópodes hematófagos como carrapatos já mostraram ser

potenciais vetores desse agente aumentando as possibilidades de transmissão (64,

68, 69). Essa espécie foi identificada como o agente da febre quintana, também

conhecida como febre das trincheiras, pelo microbiologista brasileiro Enrique da

Rocha Lima quando investigava o tifo para o governo alemão durante a Primeira

Guerra Mundial (70). O agente causou grandes epidemias infectando mais de um

milhão de soldados durante a Primeira Guerra Mundial (71). A doença reemergiu na

Segunda Guerra Mundial e, no final do século passado, foi descrita em moradores

de rua e em alcoólatras crônicos. É caracterizada pelo aparecimento de uma febre

súbita, acompanhada por uma bacteremia intraeritrocitária. Tipicamente, tem cinco

dias de duração (por isso do nome quintana). Esse quadro, quando não tratado, é

cíclico e pode ter recorrência de 3 a 5 vezes por ano, sempre intercalando com

períodos assintomáticos (72).

A B. quintana também pode causar angiomatose bacilar: lesões

angioproliferativas nas formas papulosas, tumorais ou nodulares, podendo ser

únicas ou múltiplas, localizadas ou difusas. Essas bactérias são encontradas em

estreita associação com a proliferação de células endoteliais, sendo mais comum

em imunodeficientes, como já citado, mas atingindo também indivíduos

imunocompetentes (73, 74). Esses microrganismos também podem causar

bacteremia crônica, além de ser mais comumente associada à endocardite cultura

negativa, que se caracteriza pela inflamação do endocárdio sem etiologia definida e

29

em que não há identificação do agente mesmo após a inoculação de pelo menos

três amostras de sangue independentes em hemocultura com incubação de cinco

dias além de subcultura (56, 70, 75, 76).

A B. henselae foi assim denominada em homenagem à microbiologista

Diane Hensel que contribuiu para o seu isolamento. Primeiramente, o agente foi

nomeado como Rochalimaea henselae, após análises de sequenciamento genético

foi classificada no gênero Bartonella (77).

Os gatos são o reservatório primário sendo considerados os principais

responsáveis pela transmissão aos humanos (78). Essa espécie é o agente

causador da DAG, cuja transmissão é associada a arranhaduras de gatos

infectados. As pulgas (Ctenocephalides felis) de gatos infectados possuem em suas

fezes uma alta carga bacteriana. Possivelmente ao se coçarem os gatos transferem

essas fezes com bartonelas para as garras, e no momento da arranhadura essas

bactérias são inoculadas e podem entrar acidentalmente na corrente sanguínea do

indivíduo. Dependendo da bacteremia, da profundidade da arranhadura e da

condição imunológica, o indivíduo pode, ou não, desenvolver a doença (79). Porém,

entre os gatos, esse microrganismo é transmitido por pulgas e sua ocorrência não se

dá sem a presença dos ectoparasitas, mesmo que se arranhem. Os cães, embora

em menores taxas, também podem ser reservatórios do patógeno (72).

A B. henselae é a espécie mais frequentemente associada a doenças

humanas e está presente em todo mundo (65, 72, 74). Geralmente, após três

semanas da infecção, há o aparecimento de linfonodomegalia unilateral no linfonodo

mais próximo da região do arranhão. Essa doença é uma causa comum de

linfonodomegalia em crianças, que também pode apresentar dor de cabeça, febre ou

esplenomegalia. A DAG é uma doença autolimitada, portanto o tratamento com

antibióticos é questionável (80). Em alguns casos, pode ocorrer manifestações

oculares como uveítes, síndrome de Parinaud, neurorretinite, iridociclite, entre outas,

e também manifestações como osteomielite, glomerulonefrite e encefalopatia (81).

A B. henselae também pode provocar outras manifestações sendo as

mais descritas: a angiomatose bacilar; a peliose bacilar, que é caracterizada também

por lesões angioproliferativas associadas à formação de cistos no fígado, no baço ou

na medula óssea (74, 82, 83); e a febre de origem indeterminada (FOI), que se

30

caracteriza por febre recorrente de pelo menos 38,3°C persistente por mais de três

semanas (47, 84).

Outra manifestação potencialmente fatal causada pelas bartonelas,

especialmente pela B. henselae e a B. quintana, são as endocardites que

apresentam cultura negativa. Essas bactérias são responsáveis por

aproximadamente 30% dos casos (85).

Além das manifestações clássicas já citadas, essas bactérias podem

provocar várias manifestações clínicas, desde uma bacteremia assintomática,

passando por sintomas comuns como: febre, dores de cabeça e mal-estar. Na sua

forma crônica pode apresentar manifestações cutâneas como eritema nodoso,

exantema maculopapular, entre outros tipos (86, 87).

As bartonelas são conhecidas por causar proliferação endotelial e por ser

capazes de induzir sinalizações vaso proliferativas de maneira análoga à

angiogêneses de tumores malignos (88). Esses agentes regulam os genes

mitogênicos, pró-inflamatórios e suprimem a apoptose das células endoteliais

originando várias manifestações cutâneas e extracutâneas (83, 89).

A Figura 1 mostra diversas manifestações cutâneas provocadas, ou

agravadas, pela infecção por Bartonella sp.. Esse espectro de sintomas torna a

suspeita da infecção algo desafiador.

Figura 1. Dermatoses relacionadas à infecção por Bartonella spp..

Imagens: arquivos da Dermatologia da Unicamp

31

1.3.3. Desafios diagnósticos

O diagnóstico de Bartonella spp. é um desafio a ser superado.

Dificilmente essas bactérias crescem nas culturas bacteriológicas das rotinas

hospitalares. As bartonelas são bactérias fastidiosas, elas podem demorar até 42

dias para apresentar crescimento. Além disso, elas requerem condições nutricionais

com enriquecimento de sangue, condições específicas como saturação de gás

carbônico e sua temperatura ótima de crescimento é 35ºC para maioria de suas

espécies. Mesmo oferecendo todas essas condições específicas, ainda sim, o seu

isolamento e cultivo são raros. Isso dificulta sua “visibilidade”, o que também

influencia na negligência da doença (78, 90, 91).

O uso de testes sorológicos para diagnóstico de Bartonella spp. é

comumente feito. Há kits comerciais para Imunofluorescência Indireta (IFI) e Elisa

(enzyme linked immunosorbent assay) (66, 67, 92). Entretanto, esses métodos

imunológicos apresentam várias limitações como a reação cruzada entre as

espécies de bartonelas e diversos outros patógenos, elevando assim, o número de

falsos-positivos.

Já os resultados falsos-negativos também são frequentes, uma vez que

os antígenos de kits comerciais são restritos a poucas espécies e, muitas vezes, são

sensíveis apenas às cepas regionais. Portanto, o uso de testes sorológicos não é

um bom método diagnóstico para ser utilizado isoladamente (48, 49).

A histologia é um método de diagnóstico mais tardio que só é usado

quando a infecção já comprometeu o tecido como acontece na DAG, angiomatose

bacilar, verruga peruana e peliose hepática. Embora seja um método de diagnóstico

limitado à área da lesão, é bom para diferenciar as lesões teciduais de outras

doenças (93-96).

A melhor técnica, até o momento, que evita reações cruzadas com outros

patógenos, é rápido e traz a possibilidade de identificação de espécies é a análise

molecular pela PCR, embora haja algumas limitações no uso dessa técnica. Por se

tratar de um gênero de bactéria que causa bacteremia cíclica, pode ocorrer que no

momento da coleta de sangue, não haja uma quantidade mínima de DNA detectável

pela PCR. Devido a isso, é recomendável que também seja realizada culturas de

32

enriquecimento a partir de sangue para que haja a multiplicação desses patógenos e

assim uma maior chance de obtenção da quantidade suficiente de DNA para a

detecção (97, 98).

Até então não há um consenso científico de quais primers e quais

condições são melhores para alcançar maior sensibilidade da técnica. A PCR nested

(PCR de dupla amplificação) e a PCR em tempo real (PCR Real Time) são técnicas

mais sensíveis e capazes de aumentar a detecção do agente (66, 90, 99, 100). A

desvantagem dos métodos moleculares é que a detecção do DNA do agente não

determina que haja uma infecção ativa. Além disso, a característica cíclica e o baixo

nível bacteriêmico faz com que o número de falsos-negativos seja significativo e,

portanto, o uso combinado de várias técnicas moleculares se faz necessário (101,

102).

1.3.4. Risco potencial de bartonelose durante terapias

imunossupressoras

A gravidade da infecção por Bartonella sp. correlaciona-se com o estado

imunológico do paciente. Além dos pacientes soropositivos para HIV, já mencionado

por apresentarem com maior frequência as manifestações clínicas por esses

agentes, vários relatos reportam a incidência de Bartonella spp. em pacientes que

fazem uso de terapias imunossupressoras como os transplantados, aqueles em

tratamento de doenças autoimunes e pacientes oncológicos (54, 103-107). Esses

relatos mostram a importância do diagnóstico e do tratamento em pacientes que

fazem uso de imunobiológicos. A infecção por esses agentes pode estar sendo

subdiagnosticada na maioria dos casos (108).

1.3.5. Tratamento para bartoneloses

A infecção por Bartonella sp. em indivíduos imunocompetentes é, em

grande maioria, benigna e autolimitada. Devido a isso, o uso de terapia antibiótica é

33

questionável uma vez que não traz benefícios significativos no tempo de cura em

comparação aos pacientes que não fazem a terapia (109).

Já os pacientes que apresentam a forma sistêmica, como a endocardite,

devem ser tratados com gentamicina e doxiciclina, mas o cloranfenicol tem sido

proposto para o tratamento no caso de bacteremia causada por B. bacilliformis

(doença de Carrión). Já para a febre das trincheiras a combinação de gentamicina

com doxiciclina é sugerida como melhor escolha terapêutica (109). O uso da

rifampicina ou da estreptomicina possuem bons resultados para tratar a verruga

peruana (109). A eritromicina é o antibiótico de escolha nos casos de angiomatose

bacilar e de peliose hepática e deve ser administrado por no mínimo dois meses

(85).

Embora estes sejam os tratamentos mais utilizados, até o momento não

há estudos sistemáticos que avaliem de forma sólida quais são as melhores terapias

para cada caso de bartonelose. O que se encontra na literatura são relatos de casos

e estudos baseados em pequenos grupos de pacientes. Além disso, não há estudos

que provem que essas terapias garantem a eliminação total dessas bactérias do

organismo (80).

1.3.6. Caso índice

Homem branco, 49 anos, peão de rodeio, natural e procedente de

Piracicaba (22° 43′ 30″ S, 47° 38′ 56″ W), foi internado em agosto de 2010 no

Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (HC-Unicamp)

apresentando lesões cutâneas pápulo-nodulares pelo corpo e edema dos membros

inferiores, acompanhados de linfonodomegalias cervicais, axilares e inguinais havia

seis meses.

Referia sudorese noturna, sem febre aferida. Havia sido encaminhado ao

ambulatório de Hepatites Virais da Infectologia do HC-Unicamp com PCR positiva

para o vírus B com 298.917 UI/mL de DNA (5,48 log). Apresentava sorologias não

reagentes para anti HBc e HBe. Trazia exame anátomo-patológico hepático com

discreto infiltrado linfocitário portal com ausência de hepatite lobular. Havia tomado

lamivudina por 14 meses interrompendo o tratamento por conta própria dois anos

antes. Evoluiu com oscilação de transaminases, plaquetopenia, esplenomegalia e

edema de membros inferiores.

34

Além da hepatite B crônica, o paciente referia etilismo anterior ao

diagnóstico da hepatite e negava outras doenças ou uso de medicamentos.

No exame físico o fígado foi palpável a 3 cm e o baço percutível e

palpável a 2 cm do rebordo costal. Apresentava linfonodos de 1-2 cm de diâmetro

nas cadeias mencionadas e nas cadeias submandibular e mentoniana, não

coalescidos. No exame dermatológico foram observadas lesões eritêmato-

nodulares, algumas hipercrômicas, outras com ulceração central, nos glúteos e face

posterior das coxas. Além disso, apresentava manchas hipercrômicas residuais pelo

corpo, madarose e infiltração de lóbulos das orelhas. Os nervos cubitais e poplíteos

estavam espessados e havia hipoestesia térmica e tátil em botas e luvas.

Apresentava edema dos membros inferiores +/4+ e, na face plantar da base do

hálux esquerdo, hiperqueratose com ulceração central de 0,5 cm de diâmetro.

O diagnóstico de hanseníase virchowiana foi confirmado por baciloscopia

de linfa e exame anátomo-patológico de fragmento cutâneo, o qual evidenciou a

presença de dermo-hipodermite crônica, rica em macrófagos espumosos e contendo

numerosos bacilos álcool-ácidos resistentes (BAAR) à coloração de Ziehl-Neelsen,

com acometimento de feixes nervosos.

A linfonodomegalia febril foi considerada manifestação de reação

hansênica subentrante acompanhada de eritema nodoso necrotizante. Com 4.085

UI/mL de DNA do vírus B, optou-se por conduta expectante para a hepatite B,

esquema multibacilar para tratar a hanseníase e o uso de prednisona 30mg/d e

albendazol profilático para a reação tipo 2, além de vitamina D, carbonato de cálcio e

omeprazol.

Para a triagem de possíveis desencadeadores reacionais e da

linfonodomegalia febril crônica foram solicitadas avaliação odontológica, sorologias

para paracoccidioidomicose, brucelose, sífilis, toxoplasmose, mononucleose, aids e

hepatite C, teste tuberculínico e RX do hálux esquerdo. Não havia atividade de

nenhuma destas doenças, pois, embora a sorologia para hepatite C tenha sido

positiva, a pesquisa do RNA viral por PCR foi negativa. O teste tuberculínico

também foi negativo. Dos demais exames o paciente apresentava plaquetopenia de

cerca de 100.000 células/mm3 de sangue que se manteve no seguimento.

35

Houve piora do quadro reacional e da ulceração do pé esquerdo. A

prednisona foi aumentada para 80mg/d e prescrita talidomida 100mg/d. O paciente

teve piora intensa do edema de membros inferiores e a talidomida foi suspensa e

contraindicada por considerar-se a hipótese de farmacodermia. Foi prescrito

difosfato de cloroquina 250mg/d na tentativa de controlar as reações, sem sucesso,

e houve instalação de lesão plantar direita simétrica. Foram indicadas órteses

plantares.

Como houve elevação para 9.270 UI/mL de DNA do vírus, foi iniciado o

uso de tenofovir 300mg/d. Foi iniciada também amitriptilina 25mg/d e a prednisona

aumentada para 100mg/d. O paciente passou a apresentar artrite de cotovelo e

joelho direitos. Foi internado para realização de exames e reintrodução de talidomida

que o paciente tolerou com melhora clínica, sendo possível reduzir a prednisona

para 60mg/d. A hemoglobina que era 13 no início do tratamento havia reduzido

lentamente para 10g/dL e a dapsona foi trocada por ofloxacina 400mg/d com

melhora da anemia.

No ecocardiograma apresentou derrame laminar e não foram vistas

vegetações.

Chegou a tomar 20mg/d de prednisona e 200mg/d de talidomida, mas

manteve edema de membros inferiores e o mal perfurante plantar esquerdo.

Um exame anátomo-patológico cutâneo feito após um ano de tratamento

multibacilar apresentava agregados de macrófagos xantomatosos na derme

superficial e profunda. Não foram observados esboços de granulomas ou vasculite.

A pesquisa de bacilos ácido-álcool resistentes (BAAR) foi negativa. Mesmo assim o

tratamento com rifampicina, clofazimina e ofloxacina foi mantido. O paciente, por

vezes, apresentava agudização da parestesia dos membros inferiores ou

agravamento do edema de mãos e pés. Também, o controle com monofilamentos

para avaliação da sensibilidade mostrava oscilação, motivando a elevação da

prednisona em várias ocasiões.

Com 22 doses da multidrogaterapia, o paciente fez novo exame anátomo-

patológico que mostrou dermo-hipodermite crônica, perivascular e perineural, com

macrófagos espumosos, plasmócitos, comprometimento de filetes nervosos, com

pesquisa de BAAR negativa à coloração de Ziehl-Neelsen modificada.

36

O paciente completou 24 doses do tratamento para hanseníase. Sete

meses depois, com PCR para hepatite B inferior a 20 UI/mL, foi submetido a

colicistectomia e o fígado foi então biopsiado. O exame anátomo-patológico da

vesícula biliar evidenciou macrófagos xantomatosos subepiteliais e o exame do

fígado apresentou cirrose com formação de pseudonódulos regenerativos com

moderado infiltrado linfocitário septal. Como na endoscopia digestiva alta

apresentava varizes esofágicas de fino calibre o paciente foi classificado como Child

A.

Um ano após o término do tratamento da hanseníase o paciente

apresentou hematúria (16 hemácias por campo) com dismorfismo eritrocitário. O

tratamento para hepatite B foi substituído por entecavir 1mg/d que foi reduzido

posteriormente para 0,5mg/d. A hematúria foi transitória e não houve alteração da

função renal.

Durante todo tempo, foi necessário manter o uso de drogas para reações

subentrantes: prednisona que ao final do tratamento da hanseníase estava em dose

baixa (5mg/d) e foi suspensa, mantendo apenas talidomida. As lesões de mal

perfurante plantar também foram constantes, porém oscilavam de localização na

dependência da órtese fornecida e do seu uso, sempre irregular. Os tornozelos

foram se deformando ao longo dos meses e se instalaram pés de Charcot. Apesar

do uso da talidomida, em muitos retornos referia ter apresentado ou apresentava ao

exame físico nódulos eritematosos pelo corpo.

A queixa de parestesia em botas e luvas oscilava a despeito do aumento

do corticoide ou uso de amitriptilina ou carbamazepina.

Trinta e três meses após o término do tratamento para hanseníase o

paciente apresentou lesões bolhosas sobre base eritematosa, sem nodulação

clínica, nos membros inferiores. Uma das lesões foi submetida a biópsia e o exame

histopatológico evidenciou dermo-hipodermite crônica inespecífica perivascular, com

edema da derme alta, bolha subepidérmica ulcerada e em reepitelização, com

pústula, depósito intersticial de fibrina e numerosas células xantomatosas. Foram

observados, às colorações especiais pelo método de Ziehl-Neelsen, numerosos

BAAR íntegros, distribuídos irregularmente, por vezes formando globias, inclusive na

parede de vasos, além de bacilos fragmentados no interior de macrófagos (poeira de

37

Marchoux). No retorno o paciente referia cerca de dois episódios mensais de lesões

bolhosas semelhantes à biopsiada, com duração de dois a três dias e melhora

espontânea. Com a hipótese clínica de resistência do Mycobacterium leprae, dado o

pequeno intervalo para recorrência da doença denunciada pela presença das

globias, nova biopsia foi feita do lóbulo da orelha para envio de fragmento para

pesquisa de genes de resistência. O tratamento foi reiniciado com rifampicina,

clofazimina e ofloxacina. No exame anátomo-patológico do fragmento cutâneo

biopsiado não foram observados bacilos íntegros e apenas achados compatíveis

com poeira de Marchoux. Não foi possível encaminhar o material coletado para

pesquisa de resistência na instituição de referência que se localizava em outra

cidade e o fragmento cutâneo foi submetido à pesquisa de bartonela, uma vez que

estes agentes podem causar infecção assintomática, o paciente referia contato

frequente com animais e carrapatos e por manter reação hansênica do tipo 2

subentrante. O DNA foi extraído da amostra cutânea com kit da Qiagen A pesquisa

de DNA para Bartonella spp. da cultura líquida de enriquecimento foi positiva na

PCR convencional para a região ITS e para o gene ssrA. Houve homologia de 100%

com a espécie Bartonella henselae (acesso ao GenBank BX 897699.1) dos dois

amplificados. Foi solicitada a pesquisa molecular de bartonela no sangue do

paciente já em tratamento para a hanseníase que foi negativa. Foi prescrita

doxiciclina 200mg/d por via oral, mas o paciente não fez uso por apresentar diarreia.

Seis meses depois do reinício do tratamento para a hanseníase, o paciente foi

internado para antibioterapia intravenosa com gentamicina 80mg a cada 8h e

amoxacilina+clavulanato 1g a cada 8h por 15 dias. Durante a internação foram

realizadas tomografias de tórax e abdômen que não evidenciaram

linfonodomegalias. Na alta foi prescrita azitromicina 250mg/d que o paciente usou

até completar seis semanas. Já no primeiro retorno referia ter deixado de apresentar

lesões cutâneas eritêmato-edematosas. A talidomida foi diminuída para 100 mg em

dias alternados e posteriormente suspensa. Nesta época houve melhora do edema

dos membros inferiores e cicatrização das úlceras plantares.

Completados seis semanas do tratamento para bartonelose, o paciente

interrompeu o uso de azitromicina por intolerância gástrica.

Nova biópsia do lóbulo de orelha foi feita com dez meses do novo

tratamento para hanseníase e foram observados vários agregados de células

38

xantomatosas na derme, porém não foram encontrados BAAR nem poeira bacilar

(Fite Faraco). A PCR para vírus B não detectou DNA viral. O tratamento multibacilar

foi concluído.

Trinta e seis meses depois de terminado o tratamento o paciente

apresenta-se sem reações hansênicas e sem sinais de recidivas. O paciente

mantem-se apenas com medicações para parestesia sequelar e a droga antiviral

para a hepatite.

1.4. Justificativa

Entre os principais fatores capazes de ativar as reações hansênicas em

pacientes multibacilares estão as coinfecções. Nada se sabe a respeito da

prevalência de Bartonella spp. em pacientes que apresentam reações hansênicas

subentrantes de difícil controle. Considerando-se que esses agentes também podem

causar infecções assintomáticas e que essa condição poderia estar associada ao

gatilho imunológico que propicia essas reações hansênicas, como sugere o caso

relatado. Este estudo potencialmente contribuirá para o desenvolvimento de ações

que possam auxiliar na diminuição das reações, minimizando as chances de

ocorrência de incapacidades físicas, caso haja alta prevalência de infecção por

Bartonella spp. nesses pacientes.

2. Objetivos

2.1. Geral

Avaliar a prevalência de infecção por Bartonella spp. por meio de métodos

microbiológicos e moleculares, em pacientes que têm ou tiveram hanseníase

multibacilar que estejam fazendo tratamento por apresentarem reações hansênicas

subentrantes de difícil controle a mais de seis meses.

2.2. Específicos

39

1. Avaliar a prevalência de infecção por Bartonella spp. a partir de amostras

sanguíneas por meio da combinação de métodos microbiológicos e moleculares.

2. Avaliar a presença de DNA de Bartonella spp. em fragmentos cutâneos

parafinados de biópsias, do grupo de pacientes em estudo, que tenham sido

feitas no Hospital de Clínicas da Unicamp.

3. Comparar a relação dos resultados obtidos das análises microbiológicas e

moleculares com as respostas dadas no questionário de fatores de risco para

bartoneloses.

3. Metodologia

3.1. População do estudo

Foram estudados 20 pacientes maiores que 18 anos, de ambos os sexos,

que apresentavam reações hansênicas subentrantes do tipo 2, de difícil tratamento,

há mais de seis meses e que aceitaram participar voluntariamente do estudo.

3.2. Local

Todos os pacientes do estudo faziam tratamento no Ambulatório de

Dermatologia do Hospital de Clínicas da Unicamp, na cidade de Campinas-SP. No

protocolo deste serviço, todos os pacientes que apresentam reações subentrantes

têm os fatores desencadeantes investigados. Entre eles estão: gestação, estresse

físico ou mental, drogas (anticoncepcionais, iodeto de potássico, anticonvulsivantes),

infestações e coinfecções. Além disso, todos os pacientes sob essas condições são

requeridos: avaliação odontológica, investigação de sinusite crônica, teste

tuberculínico (PPD) se ainda não tiver feito, exames protoparasitológicos, sorologias

para hepatites e HIV e uranálise, no caso de mulheres assintomáticas.

40

3.3. Fatores de risco para infecção por bartonelas (questionário)

Todos os pacientes do estudo responderam um questionário para a

triagem de fatores de risco para infecção por Bartonella spp. O questionário fornece

informações sobre fatores demográficos (faixa etária, estado civil, local de habitação

etc), contato com animais domésticos, de criação e silvestres, além de acidentes

como mordida e arranhaduras por estes animais e a exposição à artrópodes

hematófagos (Apêndice 2).

3.4. Métodos

Coleta do sangue

A triagem dos pacientes e a coleta do sangue foi feita durante o

acompanhamento médico de rotina no Ambulatório de Dermatologia do Hospital de

Clínicas da Unicamp no período entre 2015 a 2017. De cada participante foi coletado

de forma asséptica um volume de cerca de 8mL de sangue em tubo seco e um

volume de cerca de 8mL de sangue em um tubo contendo EDTA.

Tecido parafinado

Foram levantados blocos de biópsias cutâneas dos pacientes, que

tivessem sido realizadas no serviço para diagnóstico da doença ou durante o seu

seguimento.

Processamento do sangue

O tubo contendo sangue com o EDTA foi congelado a -20°C para a lise

das hemácias. O conteúdo do tubo seco foi centrifugado a 3500 rpm por 15 minutos

para a separação do soro e do pellet, após este processo estas amostras também

foram armazenadas a -20°C.

Cultura líquida

Para o crescimento das bartonelas em cultura líquida foi confeccionado

um novo meio líquido específico modificado a partir do meio descrito por Maggi et al.

41

(97). O meio líquido modificado utilizado foi composto por: 900ml do meio IPL-41

(insect medium), 0,1mg de NAD (nicotinamida adenina dinucleótido), 1,25mg de

NADP (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato), 2mg de ATP (adenosina

trifosfato) e 2mg de piruvato, todos da marca da marca Sigma-Aldrich e 2g extrato

de levedura da marca Fluka®.

Após o período de congelamento, 2mL do sangue total (coletado em

tubo seco) foi inoculado em 8mL de meio líquido modificado. As culturas foram

mantidas em agitação constante em estufa a 35°C com 5% de CO2 por 14 dias.

Cultura sólida

Após os 14 dias de incubação da cultura líquida, 1mL da suspensão desta

cultura foi semeada em meio sólido preparado da seguinte forma: 6g de BDTM

Bordet Gengou Agar em 117mL de água destilada e 1.167mL de glicerol. Após

autoclavagem e resfriamento até 50ºC, foram adicionados 50 mL de sangue de

carneiro e aliquotado em frascos para cultura celular com tampa com filtro (110). Os

tubos de cultura foram mantidos a 35°C com 5% de CO2, em atmosfera saturada de

água, por até 42 dias. As avaliações para a verificação do crescimento foram

realizadas semanalmente. Ao observar crescimento característico da bactéria

estudada, colônias foram coletadas e analisadas pela coloração de Gram. Quando a

morfologia era sugestiva do gênero (bactérias gram-negativas pequenas e

delicadas), o material foi coletado para posterior análise molecular.

Controle das culturas

Como medida de garantia da esterilidade dos meios de cultura e dos

ambientes aos quais as culturas foram submetidas, foram acrescentados controles

negativos. Estes controles foram mantidos por todo o processo (incubação, extração

e análises moleculares) junto com as demais amostras e consistiam de meios de

cultura sem inóculo.

Todo esse processo de cultivo de Bartonella spp. foi realizado em cabine

de biossegurança de classe B2, afim de prevenir a possibilidade de contaminações e

propiciar a proteção a executor e aos demais profissionais do laboratório.

42

Extração do DNA

A extração de DNA foi realizada com o kit comercial QIAamp DNA Mini Kit

(Qiagen®), de acordo com as recomendações do fabricante. Foram extraídas a

amostra de sangue total, cultura líquida (do sangue total e do pellet), colônias

sugestivas da cultura sólida (subcultura da cultura líquida de enriquecimento) e

tecido desparafinado.

Os fragmentos de pele biopsiados foram desparafinados de acordo com o

protocolo “Agilent Oligonucleotide Array-Based CGH for Genomic DNA Analysis (for

FFPE Samples)” (111).

Amplificação do DNA

Todas as amostras extraídas foram testadas com PCR para amplificação

de um gene constitutivo. A região gênica escolhida foi um fragmento da GAPDH

(gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), uma enzima relacionada com a glicólise e

expressa por todas as células de mamíferos. Esta reação tem como objetivo a

verificação da qualidade do DNA extraído, além da certificação da inexistência de

inibidores de amplificação (112).

O DNA extraído a partir do sangue total, da cultura líquida do sangue, da

cultura líquida do pellet, dos isolados em cultura sólida e dos tecidos parafinados foi

testado por PCR para a presença de DNA de Bartonella spp.. Foram utilizados três

tipos de PCR: a PCR convencional, a PCR de dupla amplificação (nested) e a PCR

em tempo real.

Em todas as reações foram adicionados dois controles: o branco (apenas

os reagentes de cada reação; ao invés do DNA, foi colocada o mesmo volume de

água utilizada na preparação da reação) e um controle positivo (DNA extraído de

cepa de B. henselae). Além destes controles, a cada reação foram testadas para

diferentes concentrações de B. henselae, de modo a determinar a sensibilidade e o

limite de detecção de cada reação.

43

Para a PCR convencional, foram utilizados primers para o gênero

Bartonella direcionados para a região espaçadora intergênica (ITS) 16S-23S do

rRNA (113).

Para a PCR nested foram utilizados primers para a região alvo que

codifica a proteína FtsZ envolvida na divisão celular da bactéria. Estes primers são

espécie-específicos para B. henselae (114).

Para a PCR em tempo real foram utilizados primers para amplificação da

região que codifica a proteína citrato sintase (gltA) no sistema SYBR® Green

específico para B. henselae. A amplificação foi detectada por fluorescência do SYBR

Green I com emissão a 522 nm (115).

Todos os produtos das PCR foram analisados por eletroforese em gel de

agarose a 2% corado com GelRed® e visualizado sob luz ultravioleta. Os amplicons

obtidos foram sequenciados para identificação as espécies. A Figura 2 ajuda na

visualização dos procedimentos realizados.

44

Figura 2. Fluxograma dos procedimentos para a detecção de Bartonella sp.

Sequenciamento

Os produtos amplificados de boa qualidade foram enviados para o

sequenciamento no laboratório comercial Helixxa Bases for Life em Paulínia-SP. Os

resultados do sequenciamento foram analisados com auxílio do software Chromas

versão 2.6.4 e comparados com banco de dados do GenBank® utilizando a

ferramenta BLAST do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Para a

45

comparação foram excluídos a sequência dos primers e a região inicial da leitura a

qual possui muitos ruídos.

Análise do questionário de fatores de risco para bartoneloses

Foi realizada análise exploratória de dados por meio de medidas resumo

(média, desvio padrão, mínimo, mediana, máximo, frequência e porcentagem). A

comparação da idade entre os grupos positivo e negativo foi realizada pelo teste de

Mann-Whitney. A associação entre as variáveis foi avaliada através do teste exato

de Fisher. O nível de significância adotado foi de 5%.

3.5. Aspectos éticos

Trata-se de uma pesquisa em que foi necessária a coleta de sangue de

pacientes voluntários. Todos os participantes foram informados sobre as fases da

pesquisa e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (Apêndice 1.),

com a garantia de que suas identidades foram mantidas em sigilo. O projeto foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp (CAAE:

44670015.4.0000.5404) (Anexo 1.).

4. Resultados

As sensibilidades obtidas pelas diversas PCR realizadas foram de: 50

cópias de DNA para a PCR convencional, 10 cópias de DNA na PCR de dupla

amplificação (nested) e 10 cópias de DNA na PCR em tempo real conforme mostra o

Quadro 5.

46

Quadro 5. Resultados da sensibilidade de detecção de cada PCR realizada

PCR Região Sensibilidade

PCR controle de qualidade GAPDH Não se aplica

PCR convencional ITS do gene 16S-23S rRNA

gênero Bartonella 50 cópias

PCR nested

FtsZ envolvida na divisão

celular

de B. henselae

10 cópias

PCR em tempo real (SYBR ®Green)

Gene citrato sintase (gltA)

de B. henselae 10 cópias

Dos 20 pacientes analisados que tinham ou haviam tido hanseníase

multibacilar e apresentam reações hansênicas subentrantes de difícil controle oito

eram mulheres (40%) e doze homens (60%). Deste grupo, três mulheres

apresentaram positividade para B. henselae (37,5% das mulheres analisadas),

enquanto que seis homens apresentaram o mesmo (50% dos homens analisados).

Assim, não houve diferenças significativas entre as proporções de positividade por

gênero. A faixa etária dos pacientes analisados variou de 18 anos a 62 anos, com a

mediana de 37,5 anos e média de 39,1 anos. Entre os nove pacientes positivos,

cinco pacientes apresentavam a forma clínica DV e quatro eram V.

Dos 20 pacientes analisados, 12 tinham amostras de tecido parafinado

disponíveis para análise. Quatro pacientes (33,3%) apresentaram positividade neste

tipo de amostra, e destes, três pacientes também apresentaram PCR positiva em

amostras de sangue. Um paciente apresentou positividade apenas na amostra de

tecido parafinado usando a técnica de PCR em tempo real, conforme mostrado na

Quadro 6.

47

Quadro 6. Resultados da positividade de infecção por Bartonella sp. em amostras

de tecido parafinado

Paciente

positivo

Início do

tratamento

por MDT

Tecido

parafinado

(mg)

Tecido

parafinado

(mg)

Tecido

parafinado

(mg)

Tecido

parafinado

(mg)

Positividade em

tecido parafinado

Resultado

final da

positividade

2 Agosto 2012

Bloco A.1 (25,1 mg) Coletado

em agosto de 2012

Bloco A.2 (24 mg)

Coletado em

agosto de 2012


em agosto de

2012

-

Nested positivo no Bloco A.2

Tecido parafinado

e sangue

3 Julho 2010

Bloco A (25,1 mg) Coletado

em abril de 2012

Bloco B (15,7 mg) Coletado em 2013

Bloco C (19,7mg) Coletado em 2014

-

Nested positivo no

Bloco A

Tecido parafinado e sangue

11 Dezembro

2012


em dezembro de 2012


em dezembro

2012

-

-

PCR em tempo real positivo no Bloco A.1

Só tecido parafinado

12 Janeiro 2005

Bloco A (22,1 mg) Coletado

em 2010

Bloco B (24,4mg) Coletado em 2012

Bloco C (25,3 mg) Coletado em 2015

Bloco D

(25,2 mg) Coletado

em 2016

Nested positivo no

Bloco B

Tecido parafinado e sangue

ABCD: diferentes amostras de tecido; 123: diferentes fragmentos de um mesmo tecido

Dezesseis amostras foram positivas, das quais 12 foram sequenciadas.

Dos nove pacientes positivos, apenas um deles não foi possível sequenciar. Os

demais apresentaram similaridade de 99% a 100% para B. henselae. O número de

acesso correspondente ao GenBank® encontrado para a região gltA foi KT945243.1

(Houston- EUA) e para a região ftsZ foi HG965802.1 (Genótipo Marseille, França).

Não houve similaridade para outra espécie de Bartonella.

Nove dos 20 pacientes analisados (45%) tiveram DNA de B. henselae

detectado. Destes, 6 pacientes (67%) foram positivos em mais de um tipo de

amostra. Apenas um paciente apresentou positividade em sangue total, como pode-

se observar no Quadro 7.

De acordo com as respostas dadas no questionário de risco para

infecções por Bartonella spp., não houve nenhuma diferença significativa entre os

48

pacientes positivos e negativos para bartonelas. Os principais fatores de risco

podem ser observados nas tabelas 1, 2 e 3.

Quadro 7. Resultados das amostras positivas dos pacientes

NT= Não testado, RT= Real Time PCR, CL= Cultura líquida e CS= Cultura sólida

Tabela 1. Contato com animais

Resposta Pacientes negativos

Pacientes positivos

Sim 8 5

Não 3 4

p-valor= 0.6424

49

Tabela 2. Mordidas/arranhões no passado


Pacientes positivos

Sim 6 3

Não 5 6

p-valor = 0.4059

Tabela 3. Picada de artrópodes no passado


Pacientes positivos

Sim 7 3

Não 4 6

p-valor = 0.3698

5. Discussão

As reações hansênicas são as principais responsáveis pelas

incapacidades físicas e deformidades que há tantos milênios estigmatizam os

pacientes com hanseníase (24). O reconhecimento dessas reações, o tratamento de

forma adequada e precoce, juntamente com o conhecimento de seus principais

desencadeadores, são essenciais para a prevenção desses quadros clínicos.

Estas reações, por não serem fenômenos infecciosos-contagiosos, não

são notificadas. Devido a isso, a epidemiologia e os dados, assim como a

temporalidade destas reações, estão limitados aos estudos científicos que muitas

vezes têm caráter regional. Por esse motivo, o estudo das reações hansênicas

subentrante ainda é muito incipiente.

50

Na literatura é notável que a classificação temporal dos surtos das

reações do tipo 2 é rara e muitas vezes não há uma homogeneidade nos termos

usados entre os trabalhos. Em inglês o termo recurrent é bastante usado, mas não

deixa implícito o intervalo de tempo entre as recorrências reacionais, uma vez que

as reações podem ser recorrentes e não necessariamente subsequentes. O termo

mais correto para descrever os casos de reações de difícil controle na língua inglesa

é chronic. Esta falta de padronização faz com que os dados epidemiológicos desse

tipo de reação sejam difíceis de estimar (31, 32).

Há um consenso que em toda reação hansênica de difícil tratamento e

naquelas que apresentam recorrência, deve-se investigar a coexistência de fatores

desencadeantes como as infecções, inclusive subclínicas (infecções orais comuns

como a cárie) (41).

Embora ainda muito negligenciadas dentre as doenças infecciosas

humanas (as bartoneloses não estão na lista de doenças negligenciadas da OMS),

as pesquisas sobre as bartonelas vêm mostrando sua importância na clínica médica

e veterinária (57, 116).

A bartonelose, assim como a hanseníase, é uma doença que tende a

atingir com maior frequência a população com baixo poder econômico, uma vez que

este grupo está mais sujeito ao contato com ectoparasitas e reservatórios altamente

bacterêmicos como cães e gatos abandonados -ou que vivem soltos-, sobretudo

filhotes, os quais são, muitas vezes, os responsáveis pela transmissão da DAG

(117).

Este é o primeiro estudo investigativo que utiliza diferentes métodos

moleculares e microbiológicos para detectar infecção por Bartonella sp. em

pacientes que apresentam reações hansênicas. As bartonelas têm capacidade de

causar infecção crônica subclínica. A característica fastidiosa das bartonelas não

permite que elas cresçam em meios de cultura usados na rotina dos hospitais, além

disso, a falta de conhecimento de muitos profissionais da saúde sobre esses

agentes também contribui para ausência de suspeição.

A falta de um teste diagnóstico padrão ouro é um limitante para o

diagnóstico desses agentes. A baixa bacteremia tem sua consequência nas análises

moleculares, pois a baixa quantidade de DNA das amostras culmina num processo

51

estocástico durante a aplicação destas no mix da PCR conforme mostra a Figura 3

(44). Esse é um dos motivos que falsos-negativos são frequentes para esses

microrganismos, por isso se faz necessário a combinação de várias técnicas

moleculares e microbiológicas. Observa-se a baixa prevalência nos trabalhos que

usam apenas amostras de sangue total para a análise por PCR (Quadro 8).

Figura 3. Representação gráfica da variação da quantidade de DNA em múltiplas

aplicações de amostras de DNA nas reações de PCR. Fonte: Drummond (2018)

O uso de amostras de biópsias parafinadas para análises moleculares é

discutido na literatura (118). O processamento de parafinização e desparafinação

dessas amostras podem resultar na degradação do DNA aumentando as chances

de um resultado falso-negativo. Os falsos-positivos também são possíveis, uma vez

que há o aumento de número de etapas de processamento para a extração do DNA

neste tipo tecido. Além disso, a própria obtenção da amostra que inclui a incisão do

tecido, inclusão desse no bloco de parafina e seus cortes requerem várias etapas.

Portanto, boas práticas de laboratório e o uso de controles são essenciais para

garantir a confiabilidade dos resultados (118). Apesar deste dilema envolvendo o

uso de biópsias parafinada para análises moleculares, esta técnica mostrou ser uma

alternativa para o diagnóstico da infecção por bartonelas. O caráter fastidioso e a

baixa concentração destes agentes em amostras de sangue limitam a taxa de

detecção (como o observado no Quadro 8), já o uso de tecido fresco aumenta a

quantidade de DNA desses patógenos o que reflete na maior taxa de detecção por

técnicas moleculares.

52

Quadro 8. Levantamento nas bases de dados do Scholar Google,

Pubmed e Scopus dos artigos publicados nos últimos 10 anos, com “PCR” e

“Bartonella” no título e resumo

País

Nº de

pacientes/

População

estudada

PCR positiva

(amostra)

Manifestações

clínicas Referência

EUA

192

Pacientes com

exposição a

animais

46 (23,9%) Bartonella spp.

(sangue, soro e cultura líquida)

Fadiga, insônia,

dor nas

articulações e

dor muscular

Maggi et al.

2011 (114)

EUA

296

Pacientes

reumatológicos

40 (13,5%) B. henselae

54 (18,2%) B. koehlerae

10 (3,4%) B. vinsonii subsp. berkhoffii

(sangue, soro e cultura líquida)

Artralgia/artrite,

Fadiga crônica e

fibromialgia

Maggi et al.

2012 (115)

Brasil

56

Voluntários

sadios


(sangue) Assintomático

Corrêa et al.

2012 (116)

França

106

Pacientes com

endocardite

48/52 (92,0%) Bartonella spp.

(valvas cardíacas)


(sangue)


(soro)

Endocardite Edouard et al.

2014 (117)

Brasil

500

Doadores de

sangue

6/500 (1,2%) B. henselae

(cultura sólida)

16/500 (3,2%)B. clarridgeia e B.

henselae

(cultura líquida)

Assintomático Pitassi et al.

2015(44)

Peru

42

Doadores de

sangue

1 (2,4%) B. bacilliformis

(sangue)

Assintomático Pons et al.

2016 (118)

Espanha

89

Veterinários

saudáveis

2 (2,25%) B. henselae

3 (3,37%) B. vinsonii subsp. berkhoffii

2 (2,25%) B. quintana

(sangue e cultura líquida)

Assintomático Oteo et al.

2017 (119)

53

França

83

Pacientes com

DAG


(aspirado de linfonodo) DAG

Hobson et al.

2017 (120)

África do

Sul

74

Pacientes


(sangue) Febre

Simpson et al.

2018 (121)

França 1762

Pacientes

438 (24,8%)

B. henselae

(biópsia linfonodo)

Suspeita de

linfoadenite

infecciosa

Prudent et al.

2018 (122)

Japão 63

Pacientes

5 (7,9%)

B. henselae

(sangue)

DAG Yanagihara et

al. 2018 (123)

Índia 140

Pacientes

3 (2,14%)

Bartonella spp.

(sangue)

Febre e

linfoadenopatia

Chaudhry et

al. 2018 (124)

Neste trabalho quatro pacientes entre os 12 (33,3%) que possuíam tecido

parafinado para análise apresentam positividade para B. henselae. Um dentre estes

pacientes apresentou positividade em apenas este tipo de amostra, revelando um

resultado potencialmente falso-positivo dessa amostra ou falso-negativo dos demais

testes (Quadro 7). A concordância dos outros três casos evidencia que o uso de

tecido, mesmo os parafinados, diminuem as chances de falsos-negativos nas

análises moleculares e que o tecido parafinado pode ser uma ferramenta em

potencial para o diagnóstico de Bartonella sp. mesmo para estudos retroativos.

O presente trabalho mostrou uma alta prevalência de pacientes que

apresentaram isolados de B. henselae nas subculturas sólidas (Tabela 4). Três dos

isolados foram obtidos de culturas de sangue total e um de culturas de pellet de

sangue. Se forem comparados os isolados obtidos no sangue total dos 20 pacientes

com reações com os seis isolados do projeto que analisou a prevalência de

Bartonella spp. em 500 doadores de sangue usando os mesmos métodos

moleculares neste tipo de amostra, encontra-se uma diferença significativa entre as

populações estudadas (p= 0,000003). Esta diferença estatística reforça a hipótese

de que há uma alta prevalência de bacteremia por bartonelas em pacientes que

54

apresentam reações hansênicas de difícil controle, todos em uso crônico de doses

altas de corticoides.

Tabela 4. Comparação dos isolados obtidos no sangue total

Projetos Indivíduos com isolados

% indivíduos isolados

Hemodoadores (n=500) Pitassi et. al 2015(44)

6 1,2 %

Pacientes com Reações subentrantes (n=20)

3 15%

p= 0,000003

Além dos fatores de risco associados à população em questão, o uso de

corticoides e drogas anti-TNF por longo prazo potencializam as chances do risco de

infecções por bartonelas. Esse fato é evidenciado em vários relatos de casos que

associam a infecção por Bartonella sp. com o uso de imunossupressores (53-55).

Como se trata de um tipo específico de reação hansênica, isso faz com

que esse grupo de pacientes seja considerado raro, principalmente localidade do

estudo. Desta forma, o número de pacientes pode ser considerado pequeno, mas é

reflexo da especificidade das condições buscadas uma vez que só foram incluídos

na pesquisa pacientes que sofrem reações do tipo 2 subentrantes de difícil controle

há pelo menos seis meses. Embora exista esse limitante numérico, pode-se sugerir,

frente aos dados da literatura, que há uma prevalência significante de B. henselae

nesses pacientes que apresentam reações hansênicas subentrantes de difícil

controle, uma vez que, além do estudo com os hemodoadores de Campinas,

existem poucos trabalhos que utilizam investigações moleculares em humanos

(Quadro 8). Para a realização do levantamento mostrado neste quadro, buscou-se

nas bases de dados do Scholar Google, Pubmed e Scopus os artigos publicados

nos últimos 10 anos (entre 2008 e julho de 2018) com “PCR” e “Bartonella” no título

e resumo. Foram excluídos os trabalhos que não foram realizados com humanos e

com menos de 30 indivíduos.

55

Os pacientes deste estudo que apresentaram positividade para

Bartonella sp. foram avisados e convidados para receber o tratamento. Dois deles

perderam o seguimento no ambulatório antes do convite. Um paciente não aceitou

receber o tratamento completo para bartonelose, por apresentar efeitos colaterais

gastrointestinais com o início do tratamento via oral. Seis dos nove positivos

aceitaram o tratamento para Bartonella sp.. Entre eles um paciente foi a óbito por

causa desconhecida antes de terminar o tratamento e outro durante o tratamento

mudou-se para outro Estado e também perdeu seguimento. Portanto, foi possível

fazer o acompanhamento de quatro pacientes.

Dos que receberam o tratamento para bartonelose somente um paciente

manteve-se sem alteração do quadro. Entretanto, este paciente negou-se ser

internado para o tratamento com gentamicina via intravenosa (IV) por 14 dias e fez o

tratamento alternativo via oral (VO) com ciprofloxacina e claritromicina (500mg de 12

em 12h) durante seis semanas.

Os três pacientes restantes aceitaram a internação para o tratamento com

gentamicina (IV) por 14 dias e doxiciclina (VO) durante seis semanas. Todos

apresentaram melhora do quadro clínico. Um paciente deixou de ser talidomida

dependente, uma vez que havia apresentava neuropatia pela talidomida, e teve

redução da dosagem de corticoides de cerca de 80 mg/d para 30mg/d e os outros

dois pararam de apresentar reações hansênicas conforme mostrado no Quadro 9.

56

Quadro 9. Dados do tratamento para Bartonella spp. e a evolução clínica dos

pacientes

Pacientes

acompanhados

Tratamento usado para

bartonelose Evolução clínica

2 Gentamicina (IV) por 14 dias +

Doxiciclina (VO) por 6 semanas

Deixou de ser talidomida dependente.

Reduziu o uso de corticosteroide de até 80mg/dia para aproximadamente

30mg

3 Ciprofloxacina+Claritromicina

(VO) por 6 semanas Não houve melhora clínica

12 Gentamicina (IV) por 14 dias+

Doxiciclina (VO) por 6 meses

Parou de apresentar reações

20

Gentamicina (IV) + Azitromicina (VO) por 14 dias

+ Doxiciclina (VO) por 6 semanas

Parou de apresentar reações

IV: Intravenosa; VO: Via oral

Entre os positivos para Bartonella sp. o paciente 2 do Quadro 9 estava em

retratamento para hanseníase durante a realização do projeto.

O número de pacientes acompanhados após o tratamento para

bartonelose é pequeno, mas demostrou melhora do quadro na maioria dos casos.

Tendo em vista isso, a infecção por Bartonella sp. pode ser um dos fatores

desencadeantes da resposta imunológica que ativa as reações. Outras infecções

como a sinusite, infecções urinárias, tuberculose já haviam sido afastadas por

medidas protocolares do serviço que atendem as triagens sugeridas pelo Ministério

da Saúde, acrescida do teste tuberculínico (39).

O monitoramento adequado dos pacientes que sofrem reações

hansênicas é essencial para prevenir as sequelas causadas por esses surtos e

outros agravos decorrentes do uso crônico de imunossupressores como infecções

oportunistas, diabetes, problemas renais, cardíacos entre outros.

Supõe-se que todos os pacientes que fazem uso crônico de

medicamentos imunossupressores deveriam ser questionados sobre a exposição a

gatos, artrópodes hematófagos, especialmente pulgas e carrapatos, e, sempre que

57

possível, deveriam ser aconselhados a evitar brincadeiras agressivas que expõe o

indivíduo a arranhões de gatos, especialmente daqueles que tenham menos de um

ano, já que esses possuem maior carga bacterêmica. Transplantados hepáticos nos

Estados Unidos são desaconselhados a terem gatos (106).

Os resultados das análises do questionário de fatores de risco para

infecção por Bartonella sp. não apresentou nenhuma diferença estatística entre as

respostas dadas pelos pacientes positivos e negativos para essa infecção. Talvez o

número de entrevistados não foi suficiente para observar essa diferença e,

possivelmente, por ser uma doença ligada à pobreza, todos os pacientes tenham

alta exposição a ectoparasitas. Sabe-se que o contato com animais, acidentes como

arranhaduras e mordidas, assim como, picadas por artrópodes são fatores de riscos

para bartoneloses (119).

Deve-se ressaltar que resultados negativos não descartam a possibilidade

de infecção. Por se tratar de um agente fastidioso que causa bacteremia cíclica, às

vezes se faz necessário novas coletas de sangue e combinação de várias técnicas

para o diagnóstico. A real prevalência, portanto, pode ser ainda maior do que aquela

observada neste estudo.

6. Conclusão

Este trabalho mostra uma significativa prevalência de infecção por B.

henselae em pacientes que têm ou tiveram hanseníase multibacilar e apresentam

reações hansênicas do tipo 2 subentrantes de difícil controle.

Documentou-se que é possível usar fragmento de tecido parafinado

guardados há pelo menos cinco anos como alternativa para diagnóstico molecular

de Bartonella spp..

Dados do questionário de fatores de risco para infecção por Bartonella

spp. não apontaram nenhuma diferença significativa entre as respostas dos

pacientes positivos e dos negativos.

58

Sugere-se que as infecções por Bartonella spp. devam ser incluídas na

lista de infecções a serem investigadas em pacientes que apresentam reações

hansênicas, principalmente as subentrantes de difícil controle.

59

7. Referências

1. Han XY, Seo YH, Sizer KC, Schoberle T, May GS, Spencer JS, et al. A new

Mycobacterium species causing diffuse lepromatous leprosy. Am J Clin Pathol. 2008;

130(6): 856-64.

2. Magalhães MdCC, Rojas LI. Diferenciação territorial da hanseníase no Brasil.

Epidemiol Serv Saúde. 2007; 16(2): 75-84.

3. WHO. Global leprosy update. WHO. 2015; 90(36): 461–76.

4. Sindeaux RHM, Mira MT. Genética da suscetibilidade à hanseníase.

Hanseníase. 5º ed. Manaus: Dilivros. 2015; 145-55.

5. Talhari C, Penha GO, Braga B, Talhari ST, Gonçalves HdS. Aspectos gerais

da hanseníase. Hanseníase. 5º ed. Manaus: Dilivros. 2015; 3-5.

6. Ridley DS, Jopling WH. Classification of leprosy according to immunity. A five-

group system. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1966; 34(3): 255-73.

7. Wu J, Boggild AK. Clinical Pearls: Leprosy Reactions. J Cutan Med Surg.

2016; 20(5): 484-5.

8. Pearson JM, Rees RJ, Waters MF. Sulphone resistance in leprosy. A review

of one hundred proven clinical cases. Lancet. 1975; 2(7924): 69-72.

9. Noordeen SK. Leprosy control through multidrug therapy (MDT). Bull World

Health Organ. 1991; 69(3): 263-9.

10. Saúde Md. Diretrizes para Vigilância, Atenção e Controle da Hanseníase.

2010 [Disponível em:

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/gm/2010/prt3125_07_10_2010.html].

11. Cuevas J, Rodríguez-Peralto JL, Carrillo R, Contreras F. Erythema nodosum

leprosum: reactional leprosy. Semin Cutan Med Surg. 2007; 26(2): 126-30.

12. Sehgal VN, Sharma V, Sharma VK. Comprehensive evaluation of complement

components in the course of type I (Lepra) and type II (ENL) reactions. Int J

Dermatol. 1989; 28(1): 32-5.

13. Scollard DM, Smith T, Bhoopat L, Theetranont C, Rangdaeng S, Morens DM.

Epidemiologic characteristics of leprosy reactions. Int J Lepr Other Mycobact Dis.

1994; 62(4): 559-67.

14. Penna GO, Gonçalves HdS, Lástória JC, Machado PRL, Talhari S. Reações

hansênicas. Hanseníase. 5 ed. Manaus: Dilivros. 2015; 45-60.

60

15. Teixeira MA, Silveira VM, França ER. Characteristics of leprosy reactions in

paucibacillary and multibacillary individuals attended at two reference centers in

Recife, Pernambuco. Rev Soc Bras Med Trop. 2010; 43(3): 287-92.

16. Massone C, Belachew WA, Schettini A. Histopathology of the lepromatous

skin biopsy. Clin Dermatol. 2015; 33(1): 38-45.

17. Vázquez-Botet M, Sánchez JL. Erythema nodosum leprosum. Int J Dermatol.

1987; 26(7): 436-7.

18. Alvarado-Arnez LE, Amaral EP, Sales-Marques C, Durães SM, Cardoso CC,

Nunes Sarno E, et al. Association of IL10 Polymorphisms and Leprosy: A Meta-

Analysis. PLoS One. 2015; 10(9): e0136282.

19. Fava V, Orlova M, Cobat A, Alcaïs A, Mira M, Schurr E. Genetics of leprosy

reactions: an overview. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2012; 107 Suppl 1:132-42.

20. Souza LWF. Leprosy reactions in discharged patients following cure by

multidrug therapy. Rev Soc Bras Med Trop. 2010; 43(6): 737-9.

21. Nobre ML, Illarramendi X, Dupnik KM, Hacker MA, Nery JA, Jerônimo SM, et

al. Multibacillary leprosy by population groups in Brazil: Lessons from an

observational study. PLoS Negl Trop Dis. 2017; 11(2): e0005364.

22. Eichelmann K, González González SE, Salas-Alanis JC, Ocampo-Candiani J.

Leprosy. An update: definition, pathogenesis, classification, diagnosis, and treatment.

Actas Dermosifiliogr. 2013; 104(7): 554-63.

23. Motta AC, Pereira KJ, Tarquínio DC, Vieira MB, Miyake K, Foss NT. Leprosy

reactions: coinfections as a possible risk factor. Clinics (Sao Paulo). 2012; 67(10):

1145-8.

24. Lustosa AA, Nogueira LT, Pedrosa JI, Teles JB, Campelo V. The impact of

leprosy on health-related quality of life. Rev Soc Bras Med Trop. 2011; 44(5): 621-6.

25. Zhang G, Yan L, Jiang J, Wei X, Wu Y, Li W, et al. Final report about Stage II

Collaboration Project on Leprosy Rehabilitation. Chin Med Sci J. 2000; 15(3): 187-90.

26. Motta AC, Simão JC, Furini RB, Ferreira MA, Palma PV, Komesu MC, et al.

Oral coinfection can stress peripheral lymphocyte to inflammatory activity in leprosy.

Rev Soc Bras Med Trop. 2013; 46(1): 73-8.

27. Ura S. Tratamento e controle das reações hansênicas. Hansen Int. 2007;

32(1): 67-70.

28. de Souza-Santana F, Marcos E, Nogueira M, Ura S, Tomimori J. Human

leukocyte antigen class I and class II alleles are associated with susceptibility and

61

resistance in borderline leprosy patients from Southeast Brazil. BMC Infect Dis. 2015;

15(1): 22.

29. Penna GO, Universidade de Brasília B, Brasil, Martelli CMT, Universidade

Federal de Goiás G, Brasil, Stefani MMA, Universidade Federal de Goiás G, Brasil,

et al. Talidomida no tratamento do eritema nodoso hansênico: revisão sistemática

dos ensaios clínicos e perspectivas de novas investigações. Anais Brasileiros de

Dermatologia. 2005; 80(5): 511-22.

30. Scollard DM, Adams LB, Gillis TP, Krahenbuhl JL, Truman RW, Williams DL.

The continuing challenges of leprosy. Clin Microbiol Rev. 2006; 19(2): 338-81.

31. Kumar B, Dogra S, Kaur I. Epidemiological characteristics of leprosy

reactions: 15 years experience from north India. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 2004;

72(2): 125-33.

32. Zhu J, Yang D, Shi C, Jing Z. Therapeutic Dilemma of Refractory Erythema

Nodosum Leprosum. Am J Trop Med Hyg. 2017; 96(6): 1362-4.

33. Santos JRS, Vendramini DL, Nery JADC, Avelleira JCR. Etanercept in

erythema nodosum leprosum. An Bras Dermatol. 2017; 92(4): 575-7.

34. Ramien ML, Wong A, Keystone JS. Severe refractory erythema nodosum

leprosum successfully treated with the tumor necrosis factor inhibitor etanercept. Clin

Infect Dis. 2011; 52(5): e133-5.

35. Kahawita IP, Walker SL, Lockwood DNJ. Leprosy type 1 reactions and

erythema nodosum leprosum. An Bras Dermatol. 2008; 83(1): 75-82.

36. Summey BT, Yosipovitch G. Glucocorticoid-induced bone loss in dermatologic

patients: an update. Arch Dermatol. 2006; 142(1): 82-90.

37. Trang G, Steele R, Baron M, Hudson M. Corticosteroids and the risk of

scleroderma renal crisis: a systematic review. Rheumatol Int. 2012; 32(3): 645-53.

38. Poetker DM, Reh DD. A comprehensive review of the adverse effects of

systemic corticosteroids. Otolaryngol Clin North Am. 2010; 43(4): 753-68.

39. Portaria nº 3.125, de 07 de outubro de 2010. Aprova as Diretrizes para

Vigilância, Atenção e Controle da Hanseníase. Sect. 1 (2010).

40. Motta AC, Furini RB, Simão JC, Vieira MB, Ferreira MA, Komesu MC, et al.

Could leprosy reaction episodes be exacerbated by oral infections? Rev Soc Bras

Med Trop. 2011; 44(5): 633-5.

41. Motta AC, Furini RB, Simão JC, Ferreira MA, Komesu MC, Foss NT. The

recurrence of leprosy reactional episodes could be associated with oral chronic

62

infections and expression of serum IL-1, TNF-alpha, IL-6, IFN-gamma and IL-10.

Braz Dent J. 2010; 21(2): 158-64.

42. Singh SK, Sharma T, Rai T, Prabhu A. Type 2 lepra reaction in an

immunocompromised patient precipitated by filariasis. Indian J Sex Transm Dis.

2014; 35(1): 40-2.

43. Arunthathi S, Ebenezer G, Daniel E, Sugumaran ST. Nocardia farcinica

pleuritis in a lepromatous patient with severe necrotizing reaction: an unusual

presentation. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 2001; 69(2): 104-7.

44. Pitassi LH, de Paiva Diniz PP, Scorpio DG, Drummond MR, Lania BG, Barjas-

Castro ML, et al. Bartonella spp. bacteremia in blood donors from Campinas, Brazil.

PLoS Negl Trop Dis. 2015; 9(1): e0003467.

45. Drummond M. Comparison of molecular methods for detection of Bartonella

spp. in blood donors at the Blood Bank of Campinas-SP; Universidade Estadual de

Campinas; 2018.

46. Ventura A, Massei F, Not T, Massimetti M, Bussani R, Maggiore G. Systemic

Bartonella henselae infection with hepatosplenic involvement. J Pediatr

Gastroenterol Nutr. 1999; 29(1): 52-6.

47. Tsukahara M, Tsuneoka H, Iino H, Murano I, Takahashi H, Uchida M.

Bartonella henselae infection as a cause of fever of unknown origin. J Clin Microbiol.

2000; 38(5): 1990-1.

48. Abino JF, Peraldi R, Lepidi H, Luciani M, Girard PM. Bacillary splenitis

(Bartonella henselae) during immune restoration in an HIV-infected patient. AIDS.

2002; 16(10): 1429-30.

49. Mosepele M, Mazo D, Cohn J. Bartonella infection in immunocompromised

hosts: immunology of vascular infection and vasoproliferation. Clin Dev Immunol.

2012; 612-809.

50. Magwai MG, Andronikou S. Isolated splenic peliosis in an

immunocompromised patient. S Afr J Surg. 2012; 50(3): 92.

51. Velho PE. Blood transfusion as an alternative bartonellosis transmission in a

pediatric liver transplant. Transpl Infect Dis. 2009; 11(5): 474.

52. Ishikawa T, Suzuki T, Shinoda M, Takashi H, Yamaguchi H, Miyake N, et al.

[A case of hepatosplenic cat scratch disease]. Nihon Shokakibyo Gakkai Zasshi.

2006; 103(9): 1050-4.

63

53. Vargas-Hitos JA, Sabio JM, Navarrete-Navarrete N, Arenas-Miras MeM,

Zamora-Pasadas M, Jiménez-Alonso J. Cat scratch disease in an

immunosuppressed patient with systemic lupus erythematosus. Lupus. 2016; 25(3):

310-1.

54. Singh N, Sinclair LL, IJdo J. Cat-scratch fever and lymphadenopathy in a

rheumatoid arthritis patient on tocilizumab. J Clin Rheumatol. 2015; 21(1): 40.

55. Orden AO, Nardi NN, Vilaseca AB, Colombini AC, Barrios NG, Vijnovich Barón

A. Cat scratch disease during etanercept therapy in a rheumatoid arthritis patient.

Reumatol Clin. 2017; 14(5):303-306.

56. Okaro U, Addisu A, Casanas B, Anderson B. Bartonella Species, an Emerging

Cause of Blood-Culture-Negative Endocarditis. Clin Microbiol Rev. 2017; 30(3): 709-

46.

57. Breitschwerdt EB. Bartonellosis, One Health and all creatures great and small.

Vet Dermatol. 2017; 28(1): 96-21.

58. Eisenreich W, Heesemann J, Rudel T, Goebel W. Metabolic Adaptations of

Intracellullar Bacterial Pathogens and their Mammalian Host Cells during Infection

("Pathometabolism"). Microbiol Spectr. 2015; 3(3).

59. Rolain JM, Maurin M, Mallet MN, Parzy D, Raoult D. Culture and antibiotic

susceptibility of Bartonella quintana in human erythrocytes. Antimicrob Agents

Chemother. 2003; 47(2): 614-9.

60. Maguiña C, Guerra H, Ventosilla P. Bartonellosis. Clin Dermatol. 2009; 27(3):

271-80.

61. Breitschwerdt EB, Kordick DL. Bartonella infection in animals: carriership,

reservoir potential, pathogenicity, and zoonotic potential for human infection. Clin

Microbiol Rev. 2000; 13(3): 428-38.

62. Valentine KH, Harms CA, Cadenas MB, Birkenheuer AJ, Marr HS, Braun-

McNeill J, et al. Bartonella DNA in loggerhead sea turtles. Emerg Infect Dis. 2007;

13(6): 949-50.

63. Molin Y, Lindeborg M, Nyström F, Madder M, Hjelm E, Olsen B, et al.

Migratory birds, ticks, and Bartonella. Infect Ecol Epidemiol. 2011; 1.

64. Leulmi H, Bitam I, Berenger JM, Lepidi H, Rolain JM, Almeras L, et al.

Competence of Cimex lectularius Bed Bugs for the Transmission of Bartonella

quintana, the Agent of Trench Fever. PLoS Negl Trop Dis. 2015; 9(5): e0003789.

64

65. Anderson BE, Neuman MA. Bartonella spp. as emerging human pathogens.

Clinical microbiology reviews. 1997; 10(2): 203-19.

66. Guptill L. Bartonellosis. Veterinary microbiology. 2010; 140(3-4): 347-59.

67. Breitschwerdt EB, Maggi RG, Chomel BB, Lappin MR. Bartonellosis: an

emerging infectious disease of zoonotic importance to animals and human beings.

Journal of veterinary emergency and critical care. 2010; 20(1): 8-30.

68. Cotté V, Bonnet S, Le Rhun D, Le Naour E, Chauvin A, Boulouis HJ, et al.

Transmission of Bartonella henselae by Ixodes ricinus. Emerg Infect Dis. 2008;

14(7): 1074-80.

69. Kamani J, Baneth G, Mitchell M, Mumcuoglu KY, Gutiérrez R, Harrus S.

Bartonella species in bats (Chiroptera) and bat flies (Nycteribiidae) from Nigeria,

West Africa. Vector Borne Zoonotic Dis. 2014; 14(9): 625-32.

70. Schwartzman W. Bartonella (Rochalimaea) infections: beyond cat scratch.

Annual review of medicine. 1996; 47: 355-64.

71. Breitschwerdt EB. Bartonellosis: one health perspectives for an emerging

infectious disease. Ilar j. 2014; 55(1): 46-58.

72. Kaiser PO, Riess T, O'Rourke F, Linke D, Kempf VA. Bartonella spp.: throwing

light on uncommon human infections. International journal of medical microbiology :

IJMM. 2011; 301(1): 7-15.

73. Velho PENF, Souza EM, Cintra ML, Mariotto A, Moraes AM. Angiomatose

bacilar: revisão da literatura e documentação iconográfica. Anais Brasileiros de

Dermatologia. 2003; 78(5): 601-9.

74. Harms A, Dehio C. Intruders below the radar: molecular pathogenesis of

Bartonella spp. Clin Microbiol Rev. 2012; 25(1): 42-78.

75. Greub G, Raoult D. Bartonella: new explanations for old diseases. Journal of

medical microbiology. 2002; 51(11): 915-23.

76. Raoult D, Casalta JP, Richet H, Khan M, Bernit E, Rovery C, et al.

Contribution of systematic serological testing in diagnosis of infective endocarditis. J

Clin Microbiol. 2005; 43(10): 5238-42.

77. Regnery RL, Anderson BE, Clarridge JE, 3rd, Rodriguez-Barradas MC, Jones

DC, Carr JH. Characterization of a novel Rochalimaea species, R. henselae sp. nov.,

isolated from blood of a febrile, human immunodeficiency virus-positive patient. J Clin

Microbiol. 1992; 30(2): 265-74.

65

78. Boulouis HJ, Chang CC, Henn JB, Kasten RW, Chomel BB. Factors

associated with the rapid emergence of zoonotic Bartonella infections. Veterinary

research. 2005; 36(3): 383-410.

79. Mosbacher ME, Klotz S, Klotz J, Pinnas JL. Bartonella henselae and the

potential for arthropod vector-borne transmission. Vector borne and zoonotic

diseases. 2011; 11(5): 471-7.

80. Rolain JM, Brouqui P, Koehler JE, Maguina C, Dolan MJ, Raoult D.

Recommendations for treatment of human infections caused by Bartonella species.

Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48(6): 1921-33.

81. Kalogeropoulos C, Koumpoulis I, Mentis A, Pappa C, Zafeiropoulos P,

Aspiotis M. Bartonella and intraocular inflammation: a series of cases and review of

literature. Clin Ophthalmol. 2011; 5: 817-29.

82. Velho PENF, Souza EM, Cintra ML, Moraes AM, Uthida-Tanaka AM.

Diagnosis of Bartonella spp. infection: study of a bacillary angiomatosis case. An

Bras Dermatol. 2006; 81(4): 349-53.

83. Dehio C. Bartonella-host-cell interactions and vascular tumour formation. Nat

Rev Microbiol. 2005; 3(8): 621-31.

84. Jacobs RF, Schutze GE. Bartonella henselae as a cause of prolonged fever

and fever of unknown origin in children. Clin Infect Dis. 1998; 26(1): 80-4.

85. Maguina C, Guerra H, Ventosilla P. Bartonellosis. Clin Dermatol. 2009; 27(3):

271-80.

86. Schattner A, Uliel L, Dubin L. The cat did it: erythema nodosum and additional

atypical presentations of Bartonella henselae infection in immunocompetent hosts.

BMJ Case Rep. 2018.

87. Chaudhry AR, Chaudhry MR, Papadimitriou JC, Drachenberg CB. Bartonella

henselae infection-associated vasculitis and crescentic glomerulonephritis leading to

renal allograft loss. Transpl Infect Dis. 2015; 17(3): 411-7.

88. Dehio C. Recent progress in understanding Bartonella-induced vascular

proliferation. Curr Opin Microbiol. 2003; 6(1): 61-5.

89. Maeno N, Oda H, Yoshiie K, Wahid MR, Fujimura T, Matayoshi S. Live

Bartonella henselae enhances endothelial cell proliferation without direct contact.

Microb Pathog. 1999; 27(6): 419-27.

90. Guptill L. Feline bartonellosis. The Veterinary clinics of North America Small

animal practice. 2010; 40(6): 1073-90.

66

91. Duncan AW, Maggi RG, Breitschwerdt EB. A combined approach for the

enhanced detection and isolation of Bartonella species in dog blood samples: pre-

enrichment liquid culture followed by PCR and subculture onto agar plates. Journal of

microbiological methods. 2007; 69(2): 273-81.

92. Vermeulen MJ, Verbakel H, Notermans DW, Reimerink JH, Peeters MF.

Evaluation of sensitivity, specificity and cross-reactivity in Bartonella henselae

serology. Journal of medical microbiology. 2010; 59(Pt 6): 743-5.

93. Hofman P, Raspaldo H, Michiels JF, Garnier G, Santini J. [Bacillary

angiomatosis of the oral cavity in AIDS. A differential diagnosis of mucosal Kaposi's

sarcoma]. Rev Stomatol Chir Maxillofac. 1993; 94(6): 375-8.

94. Forrestel AK, Naujokas A, Martin JN, Maurer TA, McCalmont TH, Laker-

Opwonya MO, et al. Bacillary angiomatosis masquerading as Kaposi's sarcoma in

East Africa. J Int Assoc Provid AIDS Care. 2015; 14(1): 21-5.

95. Perkocha LA, Geaghan SM, Yen TS, Nishimura SL, Chan SP, Garcia-

Kennedy R, et al. Clinical and pathological features of bacillary peliosis hepatis in

association with human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med. 1990;

323(23): 1581-6.

96. Grønlykke L, Tarp B, Dutoit SH, Wilkens R. Peliosis hepatis: a complicating

finding in a case of biliary colic. BMJ Case Rep. 2013;

97. Maggi RG, Duncan AW, Breitschwerdt EB. Novel chemically modified liquid

medium that will support the growth of seven bartonella species. J Clin Microbiol.

2005; 43(6): 2651-5.

98. Tapp RA, Roy AF, Corstvet RE, Wilson VL. Differential detection of Bartonella

species and strains in cat scratch disease diagnostics by polymerase chain reaction

amplification of 16S ribosomal RNA gene. J Vet Diagn Invest. 2001; 13(3): 219-29.

99. Diaz MH, Bai Y, Malania L, Winchell JM, Kosoy MY. Development of a Novel

Genus-specific Real-time PCR Assay for Detection and Differentiation of Bartonella

Species and Genotypes. Journal of clinical microbiology. 2012; 50 (5) 1645-1649.

100. Pennisi MG, La Camera E, Giacobbe L, Orlandella BM, Lentini V, Zummo S,

et al. Molecular detection of Bartonella henselae and Bartonella clarridgeiae in

clinical samples of pet cats from Southern Italy. Research in veterinary science.

2010; 88(3): 379-84.

67

101. Yang S, Rothman RE. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses,

limitations, and future applications in acute-care settings. Lancet Infect Dis. 2004;

4(6): 337-48.

102. Wilson IG. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ

Microbiol. 1997; 63(10): 3741-51.

103. Milin M, Acquitter M, Le Berre R, Sassolas B, Devauchelle-Pensec V, Cornec

D. Bartonella henselae infection during tocilizumab therapy. Joint Bone Spine. 2013;

80(2): 221.

104. Ilyas M, Maganty N, Ginsberg Z, Sharma A. Skin Infections due to Bacteria in

Solid Organ Transplant Recipients: A Review. Dermatology. 2017; 233(5): 358-65.

105. Lee RA, Ray M, Kasuga DT, Kumar V, Witherspoon CD, Baddley JW. Ocular

bartonellosis in transplant recipients: two case reports and review of the literature.

Transpl Infect Dis. 2015; 17(5): 723-7.

106. Psarros G, Riddell J, Gandhi T, Kauffman CA, Cinti SK. Bartonella henselae

infections in solid organ transplant recipients: report of 5 cases and review of the

literature. Medicine (Baltimore). 2012; 91(2): 111-21.

107. Poudel A, Lew J, Slayton W, Dharnidharka VR. Bartonella henselae infection

inducing hemophagocytic lymphohistiocytosis in a kidney transplant recipient. Pediatr

Transplant. 2014; 18(3): E83-7.

108. Rossi C, Nasreddine R, Laurent F, Demeulenaere N, Léon M. Beware the cat:

Bartonella henselae infections and biologic therapies. Joint Bone Spine. 2017;

85(3):381-382.

109. Angelakis E, Raoult D. Pathogenicity and treatment of Bartonella infections.

Int J Antimicrob Agents. 2014; 44(1): 16-25.

110. Drummond MR, Lania BG, de Paiva Diniz PPV, Gilioli R, Demolin DMR,

Scorpio DG, et al. Improvement of Bartonella henselae DNA detection in cat blood

samples by combining molecular and culture methods. J Clin Microbiol. 2018; 56 (5)

e01732-17.

111. Agilent. Agilent Oligonucleotide Array-Based CGH for Genomic DNA Analysis

(Enzymatic Labeling for Blood, Cells, or Tissues). [Disponível em:

https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G4410-

90010_CGH_Enzymatic_7.5.pdf]

68

112. Birkenheuer AJ, Levy MG, Breitschwerdt EB. Development and evaluation of

a seminested PCR for detection and differentiation of Babesia gibsoni (Asian

genotype) and B. canis DNA in canine blood samples. J Clin Microbiol. 2003; 41(9):

4172-7.

113. Diniz PP, Maggi RG, Schwartz DS, Cadenas MB, Bradley JM, Hegarty B, et

al. Canine bartonellosis: serological and molecular prevalence in Brazil and evidence

of co-infection with Bartonella henselae and Bartonella vinsonii subsp. berkhoffii. Vet

Res. 2007; 38(5): 697-710.

114. Kawasato KH, de Oliveira LC, Velho PE, Yamamoto L, Del Negro GM, Okay

TS. Detection of Bartonella henselae DNA in clinical samples including peripheral

blood of immune competent and immune compromised patients by three nested

amplifications. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2013; 55(1): 1-6.

115. Silva MN, Vieira-Damiani G, Ericson ME, Gupta K, Gilioli R, de Almeida AR, et

al. Bartonella henselae transmission by blood transfusion in mice. Transfusion. 2016;

56(6 Pt 2): 1556-9.

116. World Health Organization, WHO. Integrating neglected tropical diseases in

global health and development. WHO: World Health Organization; 2017;

117. Dujardin JC, Herrera S, do Rosario V, Arevalo J, Boelaert M, Carrasco HJ, et

al. Research priorities for neglected infectious diseases in Latin America and the

Caribbean region. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4(10): e780.

118. Sunderkötter C, Becker K, Kutzner H, Meyer T, Blödorn-Schlicht N, Reischl U,

et al. Molecular diagnosis of skin infections using paraffin-embedded tissue - review

and interdisciplinary consensus. J Dtsch Dermatol Ges. 2018; 16(2): 139-47.

119. Diniz PP, Velho PE, Pitassi LH, Drummond MR, Lania BG, Barjas-Castro ML,

et al. Risk Factors for Bartonella species Infection in Blood Donors from Southeast

Brazil. PLoS Negl Trop Dis. 2016; 10(3): e0004509.

69

8. Apêndices

Apêndice 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido

Bacteremia por Bartonella spp. em pacientes que têm, ou tiveram, hanseníase multibacilar e apresentam reações hansênicas subentrantes de difícil controle

Prof. Dr. Paulo Eduardo Neves Ferreira Velho

Você está sendo convidado a participar como voluntário de uma pesquisa. Este documento, chamado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, visa assegurar seus direitos como participante e é elaborado em duas vias, uma que deverá ficar com você e outra com o pesquisador. Por favor, leia com atenção e calma, aproveitando para esclarecer suas dúvidas. Se houver perguntas antes ou mesmo depois de assiná-lo, você poderá esclarecê-las com o pesquisador. Se preferir, pode levar este Termo para casa e consultar seus familiares ou outras pessoas antes de decidir participar. Se você não quiser participar ou retirar sua autorização, a qualquer momento, não haverá nenhum tipo de penalização ou prejuízo. Justificativa e objetivos: O objetivo desta pesquisa é avaliar a presença de bactérias chamadas bartonelas no sangue de pacientes portadores de reações hansênicas de difícil controle. Procedimentos: Participando do estudo você está sendo convidado a:

- Responder a um questionário com duração de aproximadamente 10 minutos.

- Doar aproximadamente 15 mL de sangue (aproximadamente dois tubos de coleta) uma única vez.

Estes procedimentos serão realizados apenas uma vez e no mesmo dia e horário do atendimento ambulatorial previamente agendado. Desconfortos e riscos: Só poderão participar desta pesquisa pacientes com mais de 18 anos, que tenham reações frequentes por causa da hanseníase e não respondam prontamente aos tratamentos usuais.

A participação na pesquisa limita-se a responder a um questionário e a doar um pouco de sangue. Não existe o risco de adquirir a infecção por bartonela com este procedimento. Como em qualquer coleta de sangue para exames, uma veia será puncionada para a coleta, procedimento que oferece riscos muito baixos, como irritação ou inflamação local. Benefícios:

70

Caso a bactéria seja encontrada no seu sangue, você será comunicado e tratado. Isto poderá ajudar no controle das reações. Acompanhamento e assistência: Você receberá resposta para qualquer pergunta ou dúvida relacionadas à pesquisa e poderá deixá-la em qualquer momento, se for da sua vontade, sem que isto interfira no seu atendimento no Hospital das Clínicas da UNICAMP.

Caso a infecção para estas bactérias seja detectada, você será comunicado(a) e poderá, se quiser, ser acompanhado(a) neste serviço. Sigilo e privacidade: Você tem a garantia de que sua identidade será mantida em sigilo e nenhuma informação será dada a outras pessoas que não façam parte da equipe de pesquisadores. Na divulgação dos resultados desse estudo, seu nome não será citado.

O resultado do teste desta pesquisa ficará arquivado e fará parte de seu prontuário médico. Ressarcimento:

Não haverá retribuição financeira por esta participação uma vez que a pesquisa ocorrerá no momento do seu comparecimento ao Ambulatório da Dermatologia. Armazenamento de material:

As amostras poderão ficar armazenadas, por um período de 05 (cinco) anos, podendo ser novamente testadas por outros métodos diagnósticos, para esta mesma bactéria, durante este período. Isso porque ao longo dos anos poderá surgir um método melhor para detectar esta bactéria.

Caso uma nova pesquisa venha a ser realizada com o material armazenado, ela será submetida para aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP).

( ) concordo em participar do presente estudo, porém NÃO AUTORIZO o armazenamento do meu material biológico, devendo o mesmo ser descartado ao final desta pesquisa.

( ) concordo em participar do presente estudo e AUTORIZO o armazenamento do meu material biológico, sendo necessário meu consentimento a cada nova pesquisa, que deverá ser aprovada pelo CEP institucional e, se for o caso, pela CONEP.

( ) concordo em participar do presente estudo e AUTORIZO o armazenamento do meu material biológico, e desde já deixo meu consentimento para pesquisas que atendam ao objetivo acima, que deverá ser aprovada pelo CEP institucional e, se for o caso, pela CONEP.

Em caso de falecimento ou condição incapacitante, os direitos sobre o

material armazenado deverão ser dados a:__________________________________________. Contato:

Em caso de dúvidas sobre o estudo, você poderá entrar em contato com o pesquisador Dr. Paulo Eduardo Neves Ferreira Velho no Ambulatório de Dermatologia, localizado no 3º andar do Hospital das Clínicas da Unicamp (Rua Vital

71

Brasil, 251 - Cidade Universitária "Zeferino Vaz", Campinas – SP, CEP 13083-888), pelo telefone (19) 3521-9132 ou por e-mail [email protected].

Em caso de denúncias ou reclamações sobre sua participação e sobre questões éticas do estudo, você pode entrar em contato com a secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Unicamp das 08:30hs às 13:30hs e das 13:00hs as 17:00hs na Rua: Tessália Vieira de Camargo, 126; CEP 13083-887 Campinas – SP; telefone (19) 3521-8936; fax (19) 3521-7187; e-mail: [email protected]. Consentimento livre e esclarecido:

Após ter recebido esclarecimentos sobre a natureza da pesquisa, seus objetivos, métodos, benefícios previstos, potenciais riscos e o incômodo que esta possa acarretar, aceito participar:

Nome do(a) participante:

___________________________________________________________________

__

RG______________________________, HC____________________________

endereço

___________________________________________________________________

_, número _________, no _______________________, de

_____________________, estado de _____, CEP _______________,

fone ____________________________.

_______________________________________________ Data: ____/_____/______ Assinatura Responsabilidade do Pesquisador:

Asseguro ter cumprido as exigências da resolução 466/2012 CNS/MS e complementares na elaboração do protocolo e na obtenção deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Asseguro, também, ter explicado e fornecido uma via deste documento ao participante. Informo que o estudo foi aprovado pelo CEP perante o qual o projeto foi apresentado. Comprometo-me a utilizar o material e os dados obtidos nesta pesquisa exclusivamente para as finalidades previstas neste documento ou conforme o consentimento dado pelo participante.

_________________________________________ Data: ____/_____/______

Paulo Eduardo Neves Ferreira Velho

mailto:[email protected]

72

Apêndice 2 - Questionário: Fatores de risco para infecção por Bartonella spp.

Data: ___________________ Local da Coleta:___________________

1-Informação demográfica:

Nome:

___________________________________________________________________

___

Idade: ______________ Estado Civil:________________ Sexo: ( )Masculino

( )Feminino

Telefone:____________________________________________________________

__

Ocupação(ões):

___________________________________________________________________

___

2- Fatores associados:

Vive em qual zona? ( ) urbana ( ) rural

Mora onde? ( ) cidade ( ) sitio/chácara?

2.1-Contato com animais:

Você tem tido contato com animais mesmo que ocasional? ( ) Sim ( )

Não

Em caso afirmativo, preencher as tabelas com os códigos abaixo:

Contato: Dir: direto Ind: indireto (convive, mas não toca ou cuida)

Número: Número de animais com os quais tem contato

Frequência:

1 = diariamente

2 = uma vez por semana

3 = uma vez por mês

4 = uma vez por ano

5 = se nunca teve contato

73

Tempo de contato:

A. Menos 1 ano B. De 1 a 5 anos C. De 6 a 10 anos D. Mais 10 anos

2.1.1 Animais de Estimação Número Contato Frequência Tempo

Cachorro (s)

Gato (s)

Pássaro (s)

Rato (s)

Coelho (s)

Outros:

2.1.2 Animais de Criação Número Contato Frequência Tempo

Equinos (Cavalos)

Bovinos

Caprinos (Cabras e Bodes)

Aves (Galinhas, Codorna,

Peru)

Suínos

Ovinos (Carneiros e

Ovelhas)

Outros:

2.1.3 Animais silvestres Número Contato Frequência Tempo

Capivaras

Tatu

Tamanduá

Outros:

74

2.2-Mordedura ou arranhadura de animais:

Você tem sido mordido ou arranhado por animais? ( ) Sim ( ) Não

Em caso afirmativo, preencher a tabela com os códigos já citados acima:

2.2.1 Animais Frequência Tempo

Cachorro (s)

Gato (s)

Pássaro (s)

Cavalo (s)

Rato (s)

Coelho (s)

Animal silvestre

Outros:

2.2.2-Você foi mordido ou arranhado por animal (is) no passado? ( ) Sim

( ) Não


Animal (is) Frequência Tempo Há quanto tempo deixou de ser

mordido/arranhado?

2.3-Exposição a “insetos”:

Você tem sido picado por ”insetos”? ( ) Sim ( ) Não


2.3.1 Exposição a “insetos” Frequência Tempo

Pulgas

Carrapatos

Moscas/ Mosquitos

Piolhos

75

Percevejos

Barbeiro

Outros:

2.3.2- Você foi picado por “insetos” no passado? ( ) Sim ( ) Não


Inseto (s) Frequência Tempo Há quanto tempo deixou de

ser picado?

2.4-Você já recebeu transfusão de sangue? ( ) Sim ( ) Não

Quantas vezes? ____________________ Há quanto

tempo?____________________________________

Qual foi o motivo da(s) transfusão (ões)?___________________________________________________

2.5-Você já fez doação de sangue antes? ( ) Sim ( ) Não

Se sim, quantas vezes? _____ uma vez _____ 2-5 x _____ 6-10x _____ mais de 10x

Qual Hemocentro? _______________________________________

76

9. Anexos

Anexo 1 – Parecer Consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp

77

78

79

80

81

Anexo 2 – Artigo submetido e aceito para publicação na JDDG: Journal der

Deutschen Dermatologischen Gesellschaft

82

83

84

Anexo 3 – Trabalho submetido para o 54ª Congresso da Sociedade Brasileira de

Medicina Tropical- Medtrop 2018

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE … · 2020-01-23 · coturno, cintos de bala, cabelão e cheio de tatuagens...pois é, não tenho um pai “tradicional” rs... O