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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FABIO LUIZ BANDEIRA FERREIRA
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE TROMBOCITOPENIA HEREDITÁRIA E
ADQUIRIDA ATRAVÉS DA FRAÇÃO DE PLAQUETAS IMATURAS (IPF) E DOS
NÍVEIS PLASMÁTICOS DE TROMBOPOIETINA (TPO)
CAMPINAS
2016
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FABIO LUIZ BANDEIRA FERREIRA
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE TROMBOCITOPENIA HEREDITÁRIA E
ADQUIRIDA ATRAVÉS DA FRAÇÃO DE PLAQUETAS IMATURAS (IPF) E DOS
NÍVEIS PLASMÁTICOS DE TROMBOPOIETINA (TPO)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Campinas para obtenção de título de Mestre em Ciências na área de concentração em Clínica Médica.
ORIENTADOR: PROF. DR. ERICH VINÍCIUS DE PAULA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO FABIO LUIZ
BANDEIRA FERREIRA E ORIENTADO
PELO PROF. DR. ERICH VINÍCIUS DE
PAULA.
CAMPINAS
2016
iii
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 2013/09319-0
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos – CRB 8/8402
Ferreira, Fabio Luiz Bandeira, 1979-
F413d Diagnóstico diferencial de trombocitopenia hereditária e adquirida
através da fração de plaquetas imaturas (IPF) e dos níveis plasmáticos de
trombopoietina (TPO) / Fabio Luiz Bandeira Ferreira. – Campinas, SP :
[s.n.],
2016.
Orientador: Erich Vinícius de Paula.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas,
Faculdade de Ciências Médicas.
1. Fração de plaquetas imaturas. 2. Trombocitopenia. 3. Trombopoetina.
I. Paula, Erich Vinicius de,1972-. II. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Differential diagnosis of hereditary and acquired
thrombocytopenia by the immature platelet fraction (IPF) and thrombopoietin plasmatic
levels (TPO)
Palavras-chave em inglês: Immature platelet fraction Thrombocytopenia Thrombopoietin
Área de concentração: Clínica Médica
Titulação: Mestre em Clínica Médica
Banca examinadora:
Erich Vinícius de Paula [Orientador]
Paula Ribeiro Villaça
Helena Zerlotti Wolf Grotto
Data de defesa: 28-11-2016
Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica
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BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
FABIO LUIZ BANDEIRA FERREIRA
ORIENTADOR: ERICH VINÍCIUS DE PAULA
MEMBROS:
1. PROF. DR. ERICH VINÍCIUS DE PAULA
2. PROFA. DRA. PAULA RIBEIRO VILLAÇA
3. PROFA. DRA. HELENA ZERLOTTI WOLF GROTTO
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 28/11/2016
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu pai,
Luiz Alberto Saraiva Ferreira †.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, inteligência suprema, causa primeira de
todas as coisas, que me presenteou com a possibilidade de dedicar-me a pesquisa
laboratorial nas áreas médicas.
Agradeço aos meus pais Luiz e Márcia por tudo o que fizeram por mim para
que eu chegasse nesta fase da vida, obrigado por toda instrução e dedicação que
vocês me concederam e por terem me incentivado a sempre estudar que, ao meu
ver, é uma das melhores formas de mostrar o quanto os pais amam seus filhos.
Agradeço aos meus irmãos Renata e Luiz pelo companheirismo e amizade fraterna.
Gostaria de agradecer a minha esposa Denise por todo incentivo, toda
paciência, todo amor que recebo em todos os momentos da minha vida desde que a
conheci, você é com certeza a minha grande incentivadora na vida acadêmica e na
pesquisa, em você é que me espelho pela ética, dedicação e respeito com que
conduz a sua profissão. Não menos especial, agradeço a minha filha Sophia, razão
do meu viver, pra quem tudo faço e a qual sou inundado diariamente de felicidade e
amor pelo simples fato de ouvi-la chamar-me de Pai.
Quero deixar a minha mais sincera gratidão as todas as pessoas dos
laboratórios e serviços em que passei, em especial a Dra. Fátima Gilberti e toda a
sua equipe do laboratório de Hematologia da divisão de Patologia Clínica do HC-
UNICAMP, ao ambulatório de Hemostasia nas pessoas da Enf. Andréa, Valdirene,
Dr. Samuel, Dra. Ana Carolina e Dra. Margareth e ao laboratório de Hematologia do
Hemocentro-UNICAMP através da Biologista Mônica.
De maneira especial, agradeço por todo apoio e suporte recebido pela
Biologista Liliane e pela Hematologista Dra. Kátia Pagnano do banco de sangue do
Hospital de Paulínia.
Para finalizar, agradeço pela grande parceria da minha equipe de pesquisa.
Obrigado Mairara, Loredana, Yzabella, Sandra e Wil pelo apoio, conselhos e
amizade que foram fundamentais no dia a dia da pesquisa. Agradeço ao meu
7
orientador, o Dr. Erich pela parceria, amizade e dedicação com que ele me orientou.
Espero que consiga ser um dia um exímio professor e pesquisador como você é.
Sua forma de conduzir a vida dos seus alunos na ciência, a sensibilidade com que
você entende os passos e os limites de cada aluno, bem como o seu conhecimento
intelectual e científico servem de inspiração e estímulo para seguirmos na pesquisa,
por maiores que sejam as dificuldades que apareçam nesse grande processo de
construção do saber.
8
RESUMO
Introdução: Nos últimos anos, novas gerações de analisadores de hematologia
expandiram o arsenal de parâmetros hematológicos para a avaliação de pacientes
com trombocitopenia. Entre estes, a determinação da fração de contagem de
plaquetas imaturas (IPF) figura entre os marcadores mais promissores por
relacionar-se com a atividade trombopoiética. De uma forma análoga à contagem de
reticulócitos para série vermelha, a IPF aumenta em condições em que há maior
atividade trombopoiética, constituindo-se em um potencial auxiliar no diagnóstico
diferencial nas diferentes causas de trombocitopenia. Entre estas, o diagnóstico
diferencial entre a plaquetopenia imune (PTI) e as trombocitopenias hereditárias
(TH) pode ser desafiador, particularmente no grupo de pacientes em que a
apresentação clínica não aponte claramente para um destes dois grupos. Além
disso, embora o comportamento da IPF tenha sido demonstrando em diferentes
etiologias de trombocitopenia, a avaliação da reprodutibilidade deste parâmetro,
aspecto essencial para seu uso clínico, é ainda limitada. Metodologia: Neste
estudo, avaliamos o IPF, o VPM (volume médio de plaquetas) e a TPO em um
coorte de pacientes com trombocitopenia pós-quimioterapia (n= 56), insuficiências
medulares (mielodisplasia e anemia aplástica; n = 22), PTI (n = 105) e TH (n = 27). A
determinação da IPF foi realizada no analisador hematológico Sysmex XE5000 e,
em um subgrupo de pacientes com TH, testes de reprodutibilidade intra e inter-
ensaios foram realizados. Para refinamento da análise da atividade trombopoiética
de pacientes com PTI e TH, níveis plasmáticos de trombopoietina (TPO) foram
dosados por ELISA. Resultados e Conclusões: A contagem da IPF mostrou o
comportamento esperado em pacientes com trombocitopenia pós-quimioterapia e
insuficiência medular, com valores significativamente menores do que na PTI. Ao
contrário do esperado, valores significativamente maiores de IPF foram observados
em pacientes com TH, conferindo à IPF uma acurácia diagnóstica significativa para o
diagnóstico diferencial entre PTI e TH. Considerando um valor de corte de 17,45%, a
IPF foi capaz de diferenciar estas duas condições com uma sensibilidade de 77,78%
e uma especificidade de 71,43%. Testes de reprodutibilidade confirmaram que a
9
contagem de IPF é um parâmetro robusto, mesmo no subgrupo com contagens
elevados e diagnóstico de TH. Durante a realização do estudo, resultados de um
outro grupo japonês também observaram valores elevados para IPF em uma coorte
inferior de pacientes com TH. Em conclusão, a IPF é um parâmetro atrativo para
auxiliar no diagnóstico diferencial entre TH e PTI.
Palavras chaves: fração de plaquetas imaturas, Trombopoietina, Trombocitopenia.
10
ABSTRACT
Introduction: In recent years, new generations of hematology analyzers expanded
the arsenal of hematological parameters for the evaluation of patients with
thrombocytopenia. Among these, the determination of the immature platelet fraction
(IPF) count figure among the most promising markers for relate with the
thrombopoietic activity. In an analogous manner to the reticulocyte count for red
series, the IPF increases in conditions where there is greater thrombopoietic activity,
thus becoming a potential aid in the differential diagnosis in different causes of
thrombocytopenia. Among these, the differential diagnosis of immune
thrombocytopenia (ITP) and hereditary thrombocytopenia (HT) can be challenging,
particularly in patients where the clinical presentation does not point clearly to one of
this two groups. Furthermore, although the IPF behavior has been demonstrated in
different etiologies of thrombocytopenia, the evaluation of the reproducibility of this
parameter, essential aspect for it clinical use, is still limited. Methodology: In this
study, we evaluated the IPF, the MPV (mean platelet volume) and TPO in a cohort of
patients with post-chemotherapy thrombocytopenia (n = 56), medullary insufficiencies
(myelodysplasia and aplastic anemia; n = 22), ITP (n = 105) and HT (n = 27). The
IPF determination was realized in Sysmex XE5000 hematology analyzer and a
subgroup of patients with HT, intra- and inter-testing assays were performed. For
refinement analysis of thrombopoietin activity in patients with ITP and HT, plasma
levels of thrombopoietin (TPO) were measured by ELISA. Results and
Conclusions: The IPF count showed a expected behavior in patients with post-
chemotherapy thrombocytopenia and bone marrow failure, with significantly lower
values than ITP. Contrary to expectations, significantly higher IPF values were
observed in patients with HT, giving to IPF a significant diagnostic accuracy for
differential diagnosis between PTI and TH. Considering a cutoff value of 17.45%, the
IPF was able to differentiate these two conditions with a sensitivity of 77.78% and a
specificity of 71.43%. Reproducibility tests confirmed that the IPF count is a robust
parameter even in the subgroup with elevated scores and HT diagnostic. During this
study, results of another Japanese group also noted high IPF values in a smaller
11
cohort of patients with HT. In conclusion, the IPF is an attractive parameter to aid in
the differential diagnosis between TH and PTI.
Key words: immature platelet fraction, thrombopoietin, thrombocytopenia.
12
RÉSUMÉ
Introduction : Au cours de ces dernières années, de nouvelles générations
d’analyseurs hématologiques automatisés ont rendu disponible une panoplie de
paramètres hématologiques pour l’évaluation des patients présentant une
thrombocytopénie. Parmi ceux-ci, la mesure de la fraction de plaquettes immatures
(IPF) est l’un des marqueurs les plus prometteurs du fait de sa corrélation avec
l’activité thrombopoiétique. Par analogie avec la numération de réticulocytes pour la
production des globules rouges, l’IPF augmente en cas d’élévation de l’activité
thrombopoiétique; constituant ainsi un outil potentiel dans le diagnostic différentiel
des causes de thrombopénie. Le diagnostic différentiel entre la thrombocytopénie
immune (PTI) et la thrombocytopenie héréditaire (TH) peut être difficile, surtout chez
les patients dont la présentation clinique ne permet pas de poser un diagnostic clair.
En outre, bien que le profil de l’IPF ait été établi dans différentes étiologies de
thrombocytopénie, l’absence d’évaluation de la reproductibilité de ce paramètre est
toutefois une limitation importante pour son utilisation clinique. Méthodes : Dans la
présente étude, nous avons évalué l’IPF, le MPV (volume moyen des plaquettes) et
la TPO (thrombopoïétine) dans une cohorte de patients présentant une
thrombocytopénie post-chimiothérapie (n = 56), une insuffisance médullaire
(myélodysplasie et anémie aplasique ; n = 22), PTI (n = 105) et TH (n = 27). La
mesure de l’IPF a été faite avec l’analyseur hématologique Sysmex XE5000. Les
tests de reproductibilité intra- et inter-essai ont été réalisés dans un sous-groupe de
patients atteints de TH. Pour affiner l’analyse de l’activité thrombopoiétique chez les
patients atteints de PTI et TH, les niveaux plasmatiques de TPO ont été évalués par
ELISA. Résultats et conclusions : La mesure de l’IPF a montré un profil attendu
chez les patients atteints de thrombopénie post-chimiothérapie et ceux souffrant
d’une insuffisance médullaire, avec des valeurs significativement inférieures à celles
observées chez les patients souffrant de PTI. Contrairement aux valeurs attendues,
un taux significativement plus élevé de l’IPF a été observé chez les patients atteints
de TH, donnant ainsi à l’IPF une précision diagnostique pour le diagnostic différentiel
entre PTI et TH. Considérant la valeur seuil de 17,45%, l’IPF a été capable de
13
différencier ces deux conditions avec une sensibilité de 77,78 % et une spécificité de
71,43 %. Les tests de reproductibilité ont confirmé que l’IPF est un paramètre
robuste, même dans le sous-groupe de patients ayant une numération élevée et
diagnostiqués comme patients souffrant de TH. Au cours de la réalisation de cette
étude, des résultats publiés par un groupe japonais ont aussi montré des valeurs
élevées de l’IPF dans une plus petite cohorte de patients atteints de TH. En
conclusion, l’IPF est un paramètre attrayant qui présente une grande utilité dans le
diagnostic différentiel entre TH et PTI.
Mots clés: fraction de plaquettes immatures, thrombopoïétine, thrombocytopénie.
14
LISTA DE ABREVIATURAS
AA anemia aplásica
ADP difosfato de adenosina
ATP trifosfato de adenosina
AUC área sob a curva
CV% coeficiente de variação
DVW doença de Von Willebrand
EDTA ácido etilenodiaminotretacético
ELISA ensaio imunoenzimático
fL fentolitros
FVW fator de Von Willebrand
GpIb glicoproteína Ib da membrana plaquetaria
HIV Vírus da imunodeficiência humana
IPF fração de plaquetas imaturas (immature platelet fraction)
LES lúpus eritematoso sistêmico
LMA leucemia mielóide aguda
MO medula óssea
15
MPL gene MPL, que codifica o receptor de TPO [Homo sapiens]
MYH9 gene myosin heavy chain 9 [Homo sapiens]
MYHP proteina da cadeia pesada de miosina [Homo sapiens]
PCR proteína C-reativa
PTI plaquetopenia imune
RIPA agregação plaquetária induzida pela ristocetina
RNA ácido riobonucleico
ROC receiver operating characteristic (método estatístico)
RP plaquetas reticuladas (reticulated platelets)
SCA síndrome coronariana aguda
SMD síndrome mielodisplásica
TH trombocitopenia hereditária
THPO gene da TPO [Homo sapiens]
TPO trombopoietina
TPOR receptor de TPO
VPM volume plaquetário médio
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características demográficas dos grupos de pacientes analisados. . 45
Tabela 2. Correlação entre parâmetros plaquetários. ................................................ 51
Tabela 3. Análise de reprodutibilidade da IPF em TH. ............................................... 58
Tabela 4. Precisão intra e inter-ensaio. .......................................................................... 59
Tabela 5. Característica dos pacientes com trombocitopenia hereditária. .......... 82
Tabela 6. Característica dos pacientes com plaquetopenia imune. ....................... 87
17
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Regulação da produção da TPO. .................................................................... 23
Figura 2. Avaliação das IPF pela técnica da citometria de fluxo. ............................ 41
Figura 3. Fração de plaquetas imaturas (IPF). .............................................................. 42
Figura 4. Contagem de plaquetas todos os grupos. ................................................... 46
Figura 5. Volume plaquetário médio todos os grupos. .............................................. 47
Figura 6. Fração de plaquetas imaturas todos os grupos. ....................................... 48
Figura 7. Contagem de plaquetas PTI e TH. .................................................................. 49
Figura 8. Fração de plaquetas imaturas PTI e TH. ....................................................... 50
Figura 9. Correlação entre IPF e contagem de plaquetas na PTI. ........................... 52
Figura 10. Correlação entre IPF e contagem de plaquetas na TH. .......................... 52
Figura 11. Estimativa da acurácia diagnóstica da IPF para diagnóstico
diferencial entre PTI e TH. ................................................................................................. 53
Figura 12. TPO no plasma de pacientes com PTI, TH e sem plaquetopenia. ....... 54
Figura 13. Correlação entre IPF e TPO em pacientes com PTI. ............................... 55
Figura 14. Correlação entre contagem de plaquetas e TPO em pacientes com
PTI ............................................................................................................................................ 56
Figura 15. Estimativa da acurácia diagnóstica TPO para diagnóstico diferencial
entre PTi e TH. ...................................................................................................................... 57
18
SUMÁRIO
1.0- INTRODUÇÃO .................................................................................................. 20
1.1- Plaquetas e Trombocitopoiese ............................................................. 20
1.1.1- Trombopoietina (TPO) ................................................................. 21
1.2- Plaquetopenias: mecanismos, classificação e entidades clínicas ........ 24
1.2.1- Anemia Aplásica (AA) .................................................................... 25
1.2.2- Sindrome Mielodisplasica (SMD) ................................................... 25
1.2.3- Trombocitopenias pós-quimioterapia ............................................. 26
1.2.4- Plaquetopenia Imune (PTI) ............................................................ 27
1.2.5- Trombocitopenias Hereditárias (TH) .............................................. 29
1.3- Fração de plaquetas imaturas (IPF) ..................................................... 31
1.4- Diagnóstico diferencial entre PTI e TH ................................................. 33
2.0- OBJETIVOS ...................................................................................................... 36
2.1- Objetivo geral ....................................................................................... 36
2.2- Objetivos específicos ........................................................................... 36
3.0- MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 37
3.1- Aspectos éticos do estudo ................................................................... 37
3.2- População do estudo ............................................................................ 37
3.3- Diagnóstico de PTI e TH ...................................................................... 39
3.4- Coleta e processamento das amostras de sangue .............................. 39
3.5- Contagem de plaquetas, VPM e IPF .................................................... 40
19
3.6- Dosagem de TPO ................................................................................. 42
3.7- Análise Estatística ................................................................................ 43
4.0- RESULTADOS .................................................................................................. 45
4.1- IPF no diagnóstico diferencial das trombocitopenias ........................... 45
4.2- TPO no diagnóstico diferencial entre PTI e TH .................................... 54
4.3- Reprodutibilidade da IPF em pacientes com TH .................................. 58
5.0- DISCUSSÃO ..................................................................................................... 60
6.0- CONCLUSÃO ................................................................................................... 68
7.0- REFERÊNCIAS................................................................................................. 69
8.0- ANEXOS ........................................................................................................... 81
20
1.0- INTRODUÇÃO
1.1- Plaquetas e Trombocitopoiese
As plaquetas são células anucleadas, discoides com um volume médio de 7 a
11 fL, formadas pela fragmentação da membrana do megacariócito, que é uma
célula diferenciada a partir da célula tronco hematopoiética pluripotente (Gibbins,
2004). A função principal das plaquetas está relacionada à hemostasia, onde atuam
na formação de um tampão hemostático em sítios de lesão endotelial. Dados mais
recentes mostram ainda que essas células são importantes na imunidade inata
(Yeaman, 2014). Do número total de plaquetas presentes no organismo,
aproximadamente 30% estão sequestradas no baço, e 70% na circulação. A
permanência medida das plaquetas na circulação é de aproximadamente 7 a 10 dias
(Schulze e Shivdasani, 2005).
A membrana das plaquetas é rica em glicoproteínas que atuam como
mediadores das reações de adesão e ativação plaquetária (Heemskerk et al., 2005).
Além disso, na zona periférica da membrana encontram-se os fosfolípides que são
de suma importância para o processo de coagulação, pois apresentam sítios de
ligação para outros elementos da hemostasia como os fatores responsáveis pela
geração de trombina (Canobbio et al., 2004). As plaquetas contêm ainda uma série
de grânulos: os grânulos alfa, que contêm o fator de Won Willebrand (FvW),
vitronectina, trombospondina, fator de crescimento derivado de trombócitos, fatores
de coagulação (ex: fator XI), inibidor do ativador plasminogênio e as proteínas de
adesão; os grânulos densos, que contêm trifosfato de adenosina (ATP), serotonina,
difosfato de adenosina (ADP) e cálcio; e os lisossomos (Flaumenhaft, 2003).
Estima-se que um megacariócito maduro dê origem a 1.000 a 3.000
plaquetas, após sua fragmentação e eliminação por fagocitose mediada por
macrófagos de todo seu material nuclear. O processo de produção das plaquetas e
megacariocitopoiese ocorre dentro da medula dos ossos longos, num microambiente
complexo, dentro dos nichos medulares. Durante todo esse processo, quimiocinas,
21
fatores de crescimento, o cálcio, o oxigênio, angiopoietina 1, a trombopoietina (TPO)
entre outros fatores, participam de trombocitopoiese (Deutsch e Tomer, 2013). A
TPO, proteína produzida pelo fígado e rins, é o principal regulador desta produção,
como discutiremos em maior detalhe (Kuter, 2014).
Em relação valores de referência da contagem de plaquetas no sangue, o
mesmo pode variar bastante de população para população, mas varia muito pouco
dentro do mesmo indivíduo (Kuter, 2014). Em geral, indivíduos saudáveis
apresentam contagem plaquetária entre 140 x109/L e 450 x109/L (Sloan, 1951).
1.1.1- Trombopoietina (TPO)
A TPO é uma citocina sintetizada pelo fígado e rins que atua na regulação
primária do desenvolvimento do megacariócito e plaquetas através da ligação ao
receptor de trombopoietina (TPOR) presentes nas células de linhagem
megacariocítica, bem como na célula progenitora hematopoiética, e codificado pelo
gene MPL (Jeong et al., 2015). A TPO é codificada por um único gene humano
(THPO) localizado no cromossomo 3q26.3-3q27 e tem em sua composição 332
aminoácidos. Normalmente, no plasma, os níveis de TPO são de 95,0 ± 6,0 pg/L
(Deutsch e Tomer, 2013).
Mesmo antes de sua descoberta, a existência de um fator de crescimento
hematopoiético responsável pela regulação da trombocitopoise foi prevista por Endre
Keleman, que cunhou o termo “trombopoietina”, com base na descrição da
eritropoietina (Rak, 1959; Kelemen et al., 1963). Depois de mais de três décadas de
pesquisa, durante as quais vários outros fatores de crescimento hematopoiético
foram identificados e a “trombopoietina” permanecia apenas como uma hipótese, a
TPO foi finalmente purificada por cinco laboratórios independentes, que
demonstraram que esta proteína era capaz de estimular o crescimento da linhagem
formadora de colônia megacariocítica e aumentar o número e a ploidia dos
megacariócitos. A demonstração definitiva de que a TPO era um importante
regulador da trombocitopoiese foi feita através de estudos em que os genes que
codificam a TPO ou seu receptor MPL foram eliminados em camundongos. Nestes
22
animais, observou-se uma redução da produção de megacariócitos e de plaquetas
para cerca de 15% do seu valor normal (Kuter, 2014).
Em relação à regulação da produção de TPO, é interessante destacar que
esta ocorre por um mecanismo distinto daquele que regula a eritropoietina (baseado
na presença de um sensor de oxigênio nos rins). Na verdade, o organismo não
possui um sensor específico para a contagem de plaquetas, que é regulada
indiretamente pela massa plaquetária circulante. Assim, a produção de TPO não
varia substancialmente, e sua concentração livre é determinada pela ligação ou não
da TPO a receptores presentes nas plaquetas e megacariócitos. Em situações em
que há redução da massa plaquetária, ocorre aumento da TPO livre, que irá resultar
em aumento da trombocitopoiese. O inverso ocorre em situações em que há
aumento da massa plaquetária, que resultará em redução da TPO livre. Com isso, a
contagem plaquetária do indivíduo permanece controlada em uma faixa restrita de
variação (Deutsch e Tomer, 2013). Este mecanismo está ilustrado na figura 1, e
explica os níveis aumentados de TPO em pacientes com anemia aplástica ou
trombocitopenia secundária a mielossupressão (condições em que ocorre redução
da massa de plaquetas e megacariócitos), e reduzidos após transfusão de plaquetas
ou durante a recuperação da hematopoiese (condições associadas a aumento da
massa plaquetária) (Kuter & Rosenberg, 1995; Kaushansky, 1997).
23
Figura 1. Regulação da produção da TPO. A TPO é produzida de forma estável pelo
fígado, e em menor escala pelos rins. Seus níveis circulantes dependem de sua ligação a
receptores para TPO presentes nas plaquetas e megacariócitos. Em condições em que há
aumento da massa plaquetária e hiperplasia de megacariócitos (seta superior), a TPO livre
encontra-se reduzida, levando a uma redução da trombopoiese. O inverso ocorre em
condições em que há redução da massa plaquetária, com hipoplasia de megacarióticos
(seta inferior). Desta forma, a massa plaquetária é mantida estável.
Surpreendentemente, este modelo não se aplica à trombocitopenia imune
(PTI). Nesta condição, as baixas contagens plaquetárias deveriam estar associadas
a níveis elevados de TPO, pelos mecanismos já descritos. No entanto, diversos
estudos realizados há mais de uma década mostraram que nestes pacientes os
níveis circulantes de TPO não são tão aumentados quanto aqueles observados em
outras plaquetopenias (Nichol, 1998).
24
1.2- Plaquetopenias: mecanismos, classificação e entidades clínicas
De uma forma geral, podemos atribuir uma plaquetopenia a uma das
seguintes causas: (i) alteração da produção na medula óssea; (ii) redução da
sobrevida da plaqueta na circulação (por aumento do consumo ou por mecanismos
autoimunes); (iii) aumento do sequestro esplênico; (iv) hemodiluição durante
sangramentos agudos; ou (v) plaquetopenias hereditárias (Wong e Rose, 2012).
Esta abordagem permite o encaminhamento diagnóstico correto de grande parte das
plaquetopenias, ainda que na prática clínica as condições que cursam com
plaquetopenia sejam extremamente heterogêneas, e em muitos casos multifatoriais.
Como exemplo, em pacientes em unidades de terapia intensiva, é comum a
coexistência de fatores como consumo plaquetário decorrente de processo
inflamatório agudo e/ou sangramento, redução da proliferação medular associado a
drogas e sequestro esplênico (Greinacher e Selleng, 2010; Thiele et al., 2013).
Apesar desta heterogeneidade, é didática a classificação das plaquetopenias em
dois grandes grupos, que consistem nas plaquetopenias hipoproliferativas e
plaquetopenias hiperproliferativas. Esta classificação baseia-se na estimativa da
produção de plaquetas pela medula óssea em cada condição. Dentre as
plaquetopenais hipoproliferativas estão incluídas aquelas causadas por doença
medular primária, como as insuficiências medulares como a anemia aplásica (AA) e
síndromes mielodisplásicas (SMD). Dentre as hiperproliferativas, está incluída a PTI
(Latger-Cannard et al., 2005). A seguir, descrevermos brevemente as
plaquetopenias abordadas em nosso estudo.
25
1.2.1- Anemia Aplásica (AA)
A AA é uma causa rara de falência medular, caracterizada por pancitopenia
periférica e medula óssea (MO) hipoplásica. Representa uma causa clássica de
plaquetopenia hipoproliferativa. Na grande maioria dos casos a AA é idiopática,
podendo ocorrer tanto em adultos quanto crianças, com igual frequência em ambos
os gêneros (Dolberg e Levy, 2014). Alguns estudos sugerem que a AA adquirida é
uma doença imuno-mediada, causadas por respostas dos linfócitos T auxiliares e
linfócitos T citotóxicos que, juntamente com alterações funcionais dos linfócitos T
regulatórios, culminam com a destruição autoimune dos progenitores da MO
(Roderick et al., 2013). De fato, linfócitos da medula óssea de pacientes com AA
podem suprimir a medula óssea normal in vitro (Kagan et al., 1976), e a terapia
imunossupressora é frequentemente bem sucedida nesta condição. O diagnóstico é
baseado na suspeita clínica, a partir da exposição a medicamentos, drogas e
produtos químicos, bem como precedentes sintomas infecciosos. Em raros casos, a
história familiar pode apontar para falência medular hereditária. A confirmação
depende da demonstração da hipoplasia ou aplasia medular em amostras de MO
(Hartung et al., 2013). Em pacientes com AA, a frequência e a gravidade das
citopenias é variável, e a plaquetopenia pode variar de níveis muito leves, até
valores extremamente graves.
1.2.2- Sindrome Mielodisplasica (SMD)
As SMD fazem parte de um grupo heterogêneo de distúrbios clonais das
células progenitoras hematopoiéticas, caracterizado por uma citopenia periférica,
displasia e hematopoiese ineficaz (Gao et al., 2015). Juntamente com a AA,
constituem um subgrupo de doenças hematológicas conhecido como falências
medulares. É também uma importante causa de plaquetopenia hipoproliferativa. Do
ponto de vista fisiopatológico, a principal diferença entre a SMD é a AA é o caráter
clonal da primeira, que justifica sua evolução para Leucemia Mielóide Aguda (LMA)
em cerca de 30% dos casos (List et al., 2004). Já do ponto de vista morfológico, a
26
diferença é que na SMD a MO encontra-se em geral hiperplásica, embora a
hematopoiese seja ineficaz. Por este motivo, ela é considerada uma causa de
plaquetopenia hipoproliferativa. Para a classificação das SMD é de suma
importância uma avaliação medular das alterações displásicas, além disso o
reconhecimento e enumeração de blastos, que permite o diagnóstico diferencial
entre SMD e LMA (Mufti, 2004). A plaquetopenia nas SMDs é mais variável que na
AA tanto em termos de frequência quanto em termos de gravidade. Em alguns
casos, ela pode não ocorrer, sendo o quadro hematológico dominado por anemia
e/ou neutropenia. Quando ocorre, tende a ser menos grave que nas AA, embora em
casos raros possa atingir valores inferiores a 10x109/L (Bryan et al., 2010).
1.2.3- Trombocitopenias pós-quimioterapia
Na medida em que a extensa maioria dos agentes usados para tratamento do
câncer atuam por mecanismos que inibem a proliferação celular, as células tronco
hematopoéticas, devido a sua expressiva taxa basal de proliferação, são
invariavelmente afetadas por estes agentes. Não por acaso, as citopenias (anemia,
neutropenia e plaquetopenia) figuram entre as principais complicações da
quimioterapia. De fato, as trombocitopenias pós quimioterapia podem ser
consideradas o exemplo paradigmático de plaquetopenia hipoproliferativa. Por este
motivo, o diagnóstico é feito apenas pelo hemograma, com base na história e no
tempo de exposição a estes agentes. A gravidade depende da intensidade e da
duração da plaquetopenia, sendo frequentes contagens inferiores a 50*109/L (Wong
e Rose, 2012).
27
1.2.4- Plaquetopenia Imune (PTI)
A púrpura trombocitopênica imune ou idiopática, cuja denominação mais
recentemente proposta é de plaquetopenia imune (PTI), é uma doença adquirida e
geralmente benigna, que se caracteriza por trombocitopenia normalmente isolada no
hemograma. O mecanismo da trombocitopenia na PTI está relacionado à produção
de auto-anticorpos dirigidos contra antígenos plaquetários, que levam à redução da
sobrevida média das plaquetas. Os mecanismos imunes que desencadeiam a
produção de auto anticorpos podem estar relacionados à presença de doenças
reumatológicas como Lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide; à presença
de infecções virais como hepatites B, C e HIV, ou à presença de neoplasias. Em
cerca de 50% dos casos no entanto, nenhuma destas condições está presente e a
PTI é dita idiopática (Rodeghiero et al., 2009; Mahévas et al., 2016). Uma vez que a
plaqueta apresenta um anticorpo aderido à sua membrana, esta célula é
reconhecida por macrófagos localizados no baço e em outras áreas de tecido
reticulo endotelial, onde são destruídas, levando a um menor tempo de vida médio
plaquetário e, consequentemente, a menores contagens de plaquetas circulantes
(Cooper e Bussel, 2006).
A PTI é uma das causas mais comuns de plaquetopenia em crianças, com
uma incidência anual em torno de 3-8 casos por 100.000 crianças (Freedman e
Loscalzo, 2003). Em adultos, alguns estudos epidemiológicos estimam uma
incidência de 1,6-2,7 casos por 100.000 pessoas/ano e uma prevalência de 9,5-23,6
casos por 100.000 pessoas, com predominância no sexo feminino (Lopez-Jimenez
et al., 2013). Não há dados oficiais a respeito de sua incidência e prevalência na
população brasileira.
Apesar do fundo autoimune, a demonstração laboratorial destes auto-
anticorpos carece da padronização necessária para uso clínico de rotina. Por isso,
ao contrário do que ocorre na anemia hemolítica autoimune, onde o teste da
antiglobulina direta (Coombs direto) permite o diagnóstico preciso da etiologia da
anemia, o diagnóstico de PTI depende da exclusão de todas as demais causas de
trombocitopenia listados no começo desta seção. Esta exclusão é feita com base
com base na história clínica, no exame físico (com especial atenção à palpação do
28
baço), e na avaliação de hemogramas anteriores. O hemograma completo incluindo
a análise do esfregaço de sangue periférico é também fundamental. Assim, o
diagnóstico da PTI é realizado quando houver:
Presença de trombocitopenia (<100 x109/L) isolada, sem alterações nas
outras séries do hemograma e no esfregaço de sangue periférico;
Ausência de esplenomegalia que justifique as alterações do hemograma;
Ausência de outras condições clínicas que possam explicar a trombocitopenia
tais como infecções agudas, efeito adverso de medicamentos, hemodiliução,
entre outras (Ayesh et al., 2013).
Por estar associada a uma redução da sobrevida das plaquetas na circulação,
a PTI é classicamente considerada uma trombocitopenia hiperproliferativa. De fato,
na maioria dos pacientes, a análise da MO revela um pool normal ou aumentado de
megacariócitos, descartando a hipoproliferação como mecanismo de doença. No
entanto, estudos realizados nos anos 2000 mostraram que o plasma (Chang et al.,
2003) ou autoanticopos purificados (Mcmillan et al., 2004) de pacientes com PTI é
capaz de reduzir a produção de megacariócitos na MO. Além disso, estudos com
plaquetas marcadas com isótopos radioativos realizados nos anos 1990 mostraram
que parte dos pacientes com PTI apresenta redução da produção plaquetária
(Nugent et al., 2009). Desta forma, embora a classificação didática coloque a PTI
como uma plaquetopenia hiperproliferativa, estes dados mostram que o mecanismo
fisiopatológico desta condição é bem mais complexo, e também parece envolver
algum grau de supressão da trombocitopoiese pelos autoanticorpos circulantes. A
boa resposta terapêutica de pacientes com PTI a agonistas dos receptores da TPO
ilustra bem a relevância clínica deste mecanismo (Kuter, 2013; Bussel et al., 2014).
29
1.2.5- Trombocitopenias Hereditárias (TH)
As TH constituem um grupo relativamente heterogêneo, no qual a causa da
trombocitopenia está relacionada a diferentes alterações na estrutura das plaquetas,
secundárias às alterações moleculares congênitas. Muitas destas condições são
extremamente raras, e descritas em apenas poucas famílias. Por não possuírem um
mecanismo fisiopatológico comum, o diagnóstico destas diferentes condições
depende de testes específicos, ou da pesquisa molecular das mutações causadoras.
Como em muitos casos nem a mutação causadora, nem a alteração estrutural, são
conhecidas, o diagnóstico baseia-se frequentemente na presença de
trombocitopenia em familiares, e na exclusão da PTI como causa da plaquetopenia
(Drachman, 2004; Wong e Rose, 2012). Entre os subtipos de TH que apresentam
características clínicas e laboratoriais que facilitam seu diagnóstico podemos citar:
Síndrome de Bernard-Soulier: este distúrbio autossômico recessivo é causado
pelas deficiências das glicoproteínas Ib/V/IX da superfície plaquetária, que
parecem interferir no processo de megacariocitopoiese (Balduini et al., 2002).
A trombocitopenia é variável, podendo atingir valores inferiores a 30x109/L. O
diagnóstico é feito por citometria de fluxo, através da demonstração das
deficiências destas proteínas na superfície plaquetária. Além da
plaquetopenia, estes pacientes apresentam caracteristicamente
macroplaquetas na circulação (López et al., 1998).
Doença de Von Willebrand tipo 2b e Doença de Von Willebrand plaquetário: a
doença de Von Willebrand (DVW) é um distúrbio hemorrágico resultante de
defeito quantitativo e/ou qualitativo do fator Von Willebrand (FVW) (Castaman
et al., 2003). A DVW tipo 2B é um subtipo da DVW causada por mutações de
ganho de função, que levam a aumento da afinidade do FVW pela
Glicoproteína Ib (GpIb), seu ligante fisiológico. Evidenciado laboratorialmente
pelo aumento da agregação plaquetária induzida pela ristocentina (RIPA), esta
alteração resulta no consumo e redução dos multímeros de FVW de alto peso
molecular, que são críticos para a hemostasia. Isto leva ao quadro clínico de
30
sangramentos, associado a plaquetopenias (Rinder et al., 1997). A DVW do
tipo plaquetário ou pseudo DVW é uma alteração análoga, de aumento da
afinidade da ligação entre o FVW e as plaquetas, causada por mutações na
própria GpIb. Em ambos os casos, o diagnóstico pode ser feito pelo RIPA e
confirmado por pesquisa das mutações em regiões específicas destes genes
(Favaloro et al., 2014).
Macrotrombocitopenias hereditárias ligadas a mutações no gene MYH9: este
grupo diagnóstico envolve várias formas de TH associadas à presença de
macroplaquetas, como as síndromes de May-Hegglin, de Fechtner, de
Sebastian e de Epstein. Todas estas entidades envolvem mutações no gene
MYH9 e foram recentemente consideradas uma única doença com espectro
clínico heterogêneo, variando de uma leve macrotrombocitopenia e presença
de inclusões em leucócitos até formas severas com perda de audição,
catarata e/ou alterações renais (Balduini et al., 2002). O diagnóstico é feito
mediante a suspeita clínica e citomorfológica, e, na maioria das vezes,
confirmado por citometria de fluxo e/ou biologia molecular (Kunishima et al.,
2015) . Estudos realizados em modelos animais e linhagens celulares
sugerem que a proteína MYH9 participe de etapas críticas do processo de
megacariocitopoiese (Matsushita et al., 2004; Zhang et al., 2012).
31
1.3- Fração de plaquetas imaturas (IPF)
As plaquetas reticuladas (RP) são as plaquetas recém formadas que possuem
na sua constituição uma maior quantidade de grânulos plaquetários e resíduos do m-
RNA do megacariócito (Ibrahim et al., 2016). Sua primeira análise em humanos foi
realizada através da citometria de fluxo por meio da coloração por tiazole orange,
corante amplamente empregado na identificação dos reticulócitos a partir de seu
conteúdo de RNA. A alta sensibilidade e especificidade do teste permitiu a
identificação dessas plaquetas mais ricas em RNA, bem como a distinção das
categorias das plaquetopenias (Kienast e Schmitz, 1990). Através desse e de outros
estudos com as RP, pode-se observar que elas são maiores que as plaquetas
senescentes, e que essa maior quantidade de RNA, as confere uma aparência
reticulada (Buttarello e Plebani, 2008). O número de RP no sangue periférico está
relacionado com a trombopoiese: a trombopoiese está aumentada com a detecção
de um número acentuado de RP ou está diminuída quando o número de RP estiver
em declínio. Conhecendo esta relação, podemos avaliar o grau de produção medular
das plaquetas e, até mesmo, avaliar se a trombocitopenia é causada por falência
medular ou por destruição periférica (Buttarello e Plebani, 2008). Em estudos com
animais, foi observado que as plaquetas reticuladas permanecem na corrente
sanguínea por aproximadamente 24-36h, tempo em que ocorre degradação
progressiva do RNA e diminuição do seu volume. A partir deste ponto, estas
plaquetas passam a ser reconhecidas como plaquetas normais (Jung et al., 2010).
Nas últimas décadas, expressivos avanços tecnológicos ocorreram na
produção de analisadores hematológicos, que permitiram um grande salto de
qualidade na qualidade da análise automatizada do hemograma de uma forma geral,
e da contagem de plaquetas de forma específica (Buttarello e Plebani, 2008).
Através da incorporação da citometria de fluxo e de novos corantes fluorescentes,
alguns destes analisadores tornaram possíveis a contagem automatizada das PR,
que passou a ser conhecida como fração de plaquetas imaturas (IPF). Para a
detecção da IPF, estes analisadores utilizam corantes fluorescentes que penetram
na membrana celular da plaqueta, corando o RNA residual. Através da intensidade
da fluorescência, criam-se gráficos (diagramas de dispersão) com o volume da
32
célula (eixo Y) e a fluorescência (eixo X). O uso de softwares específicos separa a
IPF das demais plaquetas pela intensidade da fluorescência, emitindo o resultado da
porcentagem de IPF (Pons et al., 2010). Estudos realizados nas fases de
implementação desta tecnologia mostraram uma boa correlação entre a contagem
de RP e a IPF, permitindo a incorporação desta tecnologia (Pons et al., 2010;
Hoffmann, 2014; Ibrahim et al., 2016).
De forma análoga ao que ocorre com os reticulócitos na série vermelha, a IPF
está relacionada com a trombopoiese: valores aumentados de IPF em geral sugerem
aumento da atividade trombopoiética. A partir da caracterização desta relação
(Briggs et al., 2004), a IPF passou a ser proposta como método auxiliar para estimar
a produção medular das plaquetas, no auxílio do diagnóstico diferencial entre
plaquetopenias hipo- ou hiper-proliferativas, particularmente naquelas associadas a
consumo ou destruição plaquetária (Buttarello e Plebani, 2008). De fato, estudos
com pacientes com trombocitopenia demonstraram que o aumento da IPF
correlaciona-se com a gravidade da trombocitopenia em pacientes com PTI. Além
disso, uma série de outros estudos mostraram que em pacientes submetidos a
quimioterapia ou transplante de células tronco hematopoiéticas, o aumento da IPF
precede em poucos dias a recuperação da contagem plaquetária, o que também
indica a relação entre IPF e atividade trombopoiética (Briggs et al., 2004).
Além de seu papel na estimativa da atividade trombopoiética, estudos mais
recentes sugerem uma relação da IPF com processos inflamatórios agudos. Tal
associação já foi demonstrada no contexto da das síndromes coronarianas agudas
(SCA), em um estudo em que a IPF correlacionou-se com a gravidade da evolução
clínica nestes pacientes. Especula-se que estas plaquetas seriam hemostaticamente
mais ativas por apresentarem mais receptores para glicoproteína Ib e IIb/IIIa, motivo
pelo qual o aumento dessa fração nas primeiras 24h das SCA estaria correlacionado
com pior prognóstico (López-Jiménez et al., 2013). Achados semelhantes indicando
uma correlação da IPF com atividade inflamatória ou com gravidade de condições
associadas a plaquetopenia também foram descritas em UTIs neonatais, em um
estudo em que a IPF foi utilizada no diagnóstico de trombocitopenias no primeiro dia
de vida (Cremer et al., 2009), e na sepse em adultos, em um estudo realizado por
nosso grupo, que mostrou uma correlação da IPF com a gravidade da sepse (Enz
33
Hubert et al., 2015). Embora atrativa, o uso da IPF como biomarcador de inflamação
ainda depende de estudos confirmatórios em grupos específicos de pacientes, além
de validação em populações independentes. Como exemplo da complexidade desta
questão, um estudo recente realizado na FCM Unicamp não encontrou correlação
entre a IPF e a atividade da doença em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico
(comunicação oral por Erich V de Paula).
Em relação a seu uso como ferramenta auxiliar no diagnóstico das
trombocitopenias, as limitações para o uso mais amplo da IPF são de outra
natureza, de ordem operacional e científica. No primeiro grupo, podemos citar a
indisponibilidade de analisadores que realizam esta contagem em muitos centros, a
heterogeneidade de tecnologias usada para cálculo da IPF, e o baixo conhecimento
das equipes de saúde sobre este parâmetro. No segundo grupo, que decorre
indiretamente das causas do primeiro grupo, podemos citar a padronização ainda
limitada de valores de corte associados a diagnósticos específicos, e do número
ainda reduzido de estudos que incorporaram a IPF a algoritmos diagnósticos, e
mostraram benefícios efetivos no diagnóstico diferencial das trombocitopenias.
Neste sentido, estudos sobre a IPF em pacientes com trombocitopenias, cujos
recursos laboratoriais atuais são insuficientes para o diagnóstico diferencial
representam uma excelente oportunidade para avaliação do papel da IPF no
diagnóstico diferencial das trombocitopenias.
1.4- Diagnóstico diferencial entre PTI e TH
O diagnóstico diferencial entre a PTI e a TH na prática clínica diária é
realizado por parâmetros clínicos e laboratoriais. Como já destacado, o diagnóstico
da PTI é feito pela exclusão de outras causas de trombocitopenia (definida como
contagem inferior a 100x109/L), como base na história, exame físico (exclusão de
hiperesplenismo) e avaliação do hemograma (que deve apresentar apenas
plaquetopenia). De fato, em pacientes com plaquetopenia isolada, baço não palpável
e sem outras causas evidentes de plaquetopenia, a avaliação da MO nem é
necessária para o diagnóstico, com exceção de pacientes acima de 60 anos
34
(Rodeghiero et al., 2009; Neunert et al., 2011). No que tange o diagnóstico da TH, a
avaliação é mais complexa. Como já mencionado, as TH representam um grupo de
doenças heterogêneo, cuja apresentação hematológica mais comum é de uma
plaquetopenia isolada no hemograma, muitas vezes indistinguível da PTI do ponto
de vista morfológico. Portanto, dois aspectos clínicos se tornam fundamentais para o
diagnóstico, a saber: (i) a idade de aparecimento dos sintomas, e (ii) a história
familiar. Em relação ao primeiro, a apresentação clássica das TH, como ocorre na
maioria das doenças congênitas, é de surgimento de sintomas de sangramento logo
nos primeiros anos de vida. Isto de fato ocorre nos pacientes com plaquetopenias
mais graves, e direciona o diagnóstico para o grupo de TH na medida em que a PTI
crônica na infância é uma condição bastante rara. No entanto, é importante destacar
que em pacientes com trombocitopenias mais leves (em geral entre 50 e 100*109/L),
que representam grande parte destes indivíduos, os sintomas de sangramento
cutâneo-mucoso podem aparecer tardiamente - como por exemplo após a menarca,
partos, traumas, cirurgias - ou mesmo não ocorrerem. Nestes pacientes
assintomáticos, o diagnóstico só poderá ser feito através da realização de
hemogramas de rotina, cada vez mais frequentes em nosso meio. Nestes casos
oligo- ou assintomáticos o tempo de aparecimento dos sintomas não auxiliará na
caracterização das TH como doenças congênitas, podendo inclusive confundir a
apresentação clínica a favor de uma trombocitopenia adquirida como a PTI. A
disponibilidade de hemogramas antigos do paciente também pode auxiliar na
diferenciação entre causa adquirida (PTI) ou hereditária. Em todos esses casos, o
segundo aspecto fundamental deste diagnóstico familiar é a pesquisa da história
familiar, em geral feita pela busca ativa de hemogramas dos familiares. Quando
positiva, a história familiar reforça a hipótese de TH (Wong e Rose, 2012).
A avaliação do tamanho das plaquetas é outro fator que pode auxiliar para a
suspeita das TH, já que subgrupos importantes destes pacientes (síndrome de
Bernard Soulier e trombocitopenia relacionada ao gene MYH9) apresentam
megaplaquetas no sangue periférico. No entanto, este achado não é específico,
podendo também ser encontrado em pacientes com PTI. Outras etiologias mais
raras, mas que apresentam achados específicos que podem auxiliar no seu
diagnóstico incluem as trombocitopenias ligadas ao cromossomo X e a síndrome de
35
Wiskott-Aldrich, caracterizadas pela presença de microplaquetas; trombocitopenia
amegacariocítica congênita, às vezes associadas a alterações ósseas; e distúrbios
plaquetários de origem familiar com predisposição para leucemia mielóide aguda,
em que a história de recorrência familiar de leucemias costuma ser bastante
evidente (Balduini et al., 2002; Balduini et al., 2013; Noris et al., 2014).
Embora as TH sejam raras, o diagnóstico diferencial com a PTI tem muita
importância já que os tratamentos para estas duas condições são diferentes. Desta
forma, é interessante a identificação de métodos que possam auxiliar nesta
avaliação. Infelizmente, não há para a PTI um teste análogo ao teste direto da
antiglobulina (Coombs direto) no caso das anemias hemolíticas hereditárias. Embora
existam testes para detecção de autoanticorpos ligados a plaquetas, estes ensaios
não foram validados clinicamente (Neunert et al., 2011). Neste contexto, outros
métodos laboratoriais vêm sendo estudados nos últimos anos.
Um parâmetro do hemograma já avaliado neste tipo de diagnóstico foi o
volume plaquetário médio (VPM). Noris e colaboradores avaliaram o VPM em 35
pacientes com TH e 56 pacientes com PTI, encontrando diferenças significativas nos
valores entre estas duas populações, com valores mais elevados nos pacientes com
TH. Um valor de VPM acima de 12,4 fL apresentou uma sensibilidade de 83% e uma
especificidade de 89% para o diagnóstico de TH (Noris et al., 2009). Este achado foi
validado em um estudo com 113 pacientes com TH e 130 com PTI em que o VPM foi
medido em 6 centros independentes, usando equipamentos distintos. A boa
sensibilidade do VPM para este diagnóstico (91% para o mesmo cutt-off) foi
confirmada (Noris et al., 2014).
Um outro parâmetro já explorado neste diagnóstico diferencial foi a
determinação das PR (Fabris et al., 2000). Em um estudo envolvendo 29 pacientes
com TH e 23 com PTI, os autores, utilizaram a citometria de fluxo para determinação
das RP, encontrando uma diferença significativa neste parâmetro entre os dois
grupos, com valores inferiores de RP nos pacientes com TH em comparação ao
grupo com PTI. Como destaco, este estudo utilizou a metodologia de citometria de
fluxo convencional, e não a tecnologia da IPF e outros parâmetros plaquetários
acoplados ao hemograma completo.
36
2.0- OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
Avaliar o uso da contagem automatizada da fração de plaquetas imaturas
(IPF) para o diagnóstico diferencial das trombocitopenias.
2.2- Objetivos específicos
Determinar a contagem de plaquetas, IPF e VPM em pacientes com
trombocitopenias de diferentes etiologias.
Determinar os níveis de TPO em pacientes com PTI e TH.
Determinar a acurácia diagnostica da IPF, VPM e TPO para o diagnóstico em
pacientes com PTI e TH.
37
3.0- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Aspectos éticos do estudo
Este estudo foi submetido e aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da
FCM-UNICAMP, com o parecer sob o número 411.620/2013. Todos os pacientes ou
responsáveis legais forneceram consentimento informado por escrito, após a leitura
do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TCLE (anexo 1) aprovado pelo
comitê de ética em pesquisa, exceto os pacientes internados no HC-UNICAMP em
que os dados do hemograma foram verificados diretamente no sistema do
laboratório de hematologia da divisão de Patologia Clínica do HC pois para estes
pacientes são realizadas análises diárias, evitando assim uma segunda punção.
Para estes casos, a coletada de dados foi aprovada pelo comitê de ética e pesquisa
sob o número 20625913.3.0000.5404 com dispensa do TCLE. Nenhuma atividade
relacionada ao estudo foi iniciada antes da assinatura deste termo. Do ponto de vista
de riscos, o estudo foi associado a riscos mínimos, na medida em que utilizamos
amostras de sangue obtidas durante a punção venosa utilizada na consulta
ambulatorial de rotina. No caso dos pacientes internados na enfermaria, para os
quais o hemograma completo com IPF já estava disponível, foi obtida dispensa para
obtenção do TCLE.
3.2- População do estudo
O estudo foi realizado em pacientes (adultos e crianças) portadores de
trombocitopenia, definida como contagem de plaquetas inferior a 150x109/L,
confirmada em duas amostras independentes e na análise microscópica, em
acompanhamento clínico regular nos ambulatórios do Hemocentro da UNICAMP, ou
em tratamento na enfermaria de Hematologia do HC-UNICAMP. Os seguintes
critérios de inclusão foram observados:
38
Diagnóstico confirmado de PTI, TH, AA ou SMD, e registrado no
prontuário médico dos ambulatórios do Hemocentro;
Pacientes em quimioterapia recente (até 14 dias) para tratamento de
neoplasias hematológicas na enfermaria de Hematologia do HC-
Unicamp;
Idade superior a 2 anos;
Concordância em participar do estudo.
Como critério de exclusão, foi observado o seguinte item:
Presença de outras condições potencialmente relacionadas a
plaquetopenia de causa multifatorial tais como esplenomegalia e
doenças infecciosas agudas.
Cabe destacar que as amostras foram obtidas durante diferentes fases do
acompanhamento dos pacientes. Desta forma, no grupo de pacientes com PTI foram
incluídos indivíduos nas fases iniciais do tratamento (ao diagnóstico), em tratamento
crônico ou fora de tratamento (em remissão parcial ou completa). No caso de
pacientes em remissão completa (definida com contagem superior a 100x109/L),
apenas indivíduos com contagem entre 100 e 150x109/L foram incluídos, conforme
critério de inclusão no estudo.
39
3.3- Diagnóstico de PTI e TH
O Hemocentro da UNICAMP possui em seus ambulatórios de hemostasia
dois coortes acompanhados de forma sistemática com o diagnóstico confirmado
de PTI ou de TH. O diagnóstico de PTI é baseado nos critérios anteriormente
descritos (Rodeghiero et al., 2009; Neunert et al., 2011). O diagnóstico de TH é
baseado na história familiar, anamnese, exame físico e avaliação do hemograma
cuidadosos, realizados por equipe especializada no diagnóstico de TH, testes
específicos para algumas formas características de TH (ex. citometria de fluxo
para Síndrome de Bernard Soulier; RIPA para DVW tipo 2b), e em muitos destes
casos, caracterização molecular. Nos casos sem caracterização molecular e sem
testes específicos positivos, apenas aqueles com clara recorrência familiar,
plaquetopenia confirmada em todos os hemogramas disponíveis para avaliação, e
megaplaquetas na circulação periférica recebem o diagnóstico confirmado de TH.
Desta forma, podemos considerar que esta coorte apresenta uma caracterização
diagnóstica de TH compatível com os melhores padrões internacionais, limitada
apenas pela dificuldade universal de confirmação molecular em 100% dos casos
(Balduini et al., 2002; Balduini et al., 2013).
3.4- Coleta e processamento das amostras de sangue
As coletas de sangue foram realizadas através de punção venosa periférica
de veia superficial de membros superiores realizada pela equipe de enfermagem no
Hemocentro-UNICAMP e da enfermaria de hematologia do HC-UNICAMP. O sangue
foi colhido pelo sistema BD Vacutainer® em tudo com o anticoagulante EDTA K2.
Não houve necessidade de jejum antes da coleta. Para a dosagem de TPO, após a
análise da IPF, os tubos foram centrifugados por 10 min a 5.000 rpm a 22o C, e o
plasma foi retirado, acondicionado em tubos Eppendorf®, e congelado a -80°C para
análise posterior. Esta etapa de separação do plasma foi realizada apenas nos
casos com diagnóstico de PTI ou TH.
40
Para a dosagem de trombopoietina, as amostras de plasma que foram
previamente retiradas do tubo de EDTA K2 (aproximadamente 1 mL de amostra de
plasma) após análise pelo Sysmex XE 5000 e congeladas a -80°C, foram
descongeladas uma única vez para a análise e logo após descartadas.
3.5- Contagem de plaquetas, VPM e IPF
Para a análise da IPF, VPM e contagem de plaquetas, as amostras de sangue
total foram analisadas no analisador hematológico Sysmex XE 5000 (Syxmex
Corporation, Kobe, Japão), do Laboratório de Hematologia da Divisão de Patologia
Clínica do HC-UNICAMP. Após a coleta, as amostras foram imediatamente
transportadas para o laboratório de análise em caixas mantidas a 22o C, e todas as
amostras foram analisadas em até no máximo 4h após a coleta. As amostras de
sangue total foram analisadas durante a rotina deste laboratório, que realiza revisão
microscópica (contagem, morfologia e achados celulares) de todos os pacientes com
plaquetopenia. Além disso, o laboratório utiliza controles de qualidade interno e
externo para os principais parâmetros do hemograma.
Para os valores de VPM cuja leitura no equipamento da Sysmex não foi
possível, foram observados os hemogramas através do prontuário eletrônico dos
pacientes os quais as amostras de sangue foram analisadas no mesmo dia da
pesquisa junto ao Laboratório de Rotinas Hematológicas do Hemocentro da
Unicamp, que utiliza o equipamento ADVIA 2120i (Siemens, Erlangen, Alemanha).
Este procedimento baseou-se em um estudo que mostra que a acurácia clínica do
VPM no diagnóstico das THs foi mantida, mesmo quando os resultados foram
obtidos de diferentes equipamentos (Noris et al., 2013).
No analisador utilizado no estudo (Sysmex), os parâmetros plaquetários foram
analisados pelo método de impedância e citometria de fluxo. No canal de leitura para
reticulócitos (canal RET), esse sistema lança mão do emprego de corantes
fluorescentes contendo polimetina e oxazina, que penetram na membrana celular
corando o RNA residual das hemácias (reticulócitos) e das plaquetas (IPF). As
células coradas passam pelo sistema semicondutor de laser diodo (633 nm). A luz
41
emitida por dispersão é captada por canais frontais (usada para cálculo do volume
celular) e laterais (intensidade de fluorescência do RNA residual) (Figura 2). Um
algoritmo computacional discrimina as plaquetas maduras e a IPF pela intensidade
da fluorescência do RNA residual (Figura 3). Toda a análise da IPF é realizada
através de um software especial: o XE IPF MASTER (Syxmex Corporation, Kobe,
Japão). A IPF é expressa como um valor proporcional (IPF%) do total de plaquetas,
podendo ainda ser convertida em valores absolutos.
A faixa de normalidade do VPM e da IPF utilizada neste estudo foi
estabelecida localmente no laboratório de Hematologia da Divisão de Patologia
Clínica da UNICAMP em amostras de 178 doadores de sangue, durante o ano de
2013, em equipamento Sysmex XE2100 (Syxmex Corporation, Kobe, Japão).
Figura 2. Avaliação das IPF pela técnica da citometria de fluxo. As celulas coradas por
corantes fluorescentes específicos para RNA, passam pelo canal de laser diodo de 633nm.
A luz emitida no canal de dispersão lateral (side scattered light) indica a estrutura celular
interna, e é usada para cálculo da IPF com base na fluorescência emitida pelo RNA residual.
A luz emitida no canal frontal (forward scattered light) indica o tamanho da célula, e é usada
para cálculo do volume celular, e para separação de plaquetas e hemácias. Imagem
disponível em: <https://www.sysmex.com/ca/en/Products/Hematology/XESeries/Pages/XE-
5000-Hematology-Analyzer.aspx> Acesso em out. 2016.
42
Figura 3. Fração de plaquetas imaturas (IPF). No diagrama podemos observar as leituras
de luz dispersa nos canais de volume celular (forward scatter) e de fluorescência do RNA
residual (fluorescence). A IPF corresponde às plaquetas com maior intensidade de
fluorescência, marcadas em verde. Na parte superior do diagrama, hemácias e reticulócitos,
de maior volume que as plaquetas, também são separadas pelo mesmo critério. Fonte da
figura: Catálogo Syxmex XE 5000TM.
3.6- Dosagem de TPO
A análise da TPO foi realizada em amostras de plasma EDTA com o Kit
comercial “Human Thrombopoietin Immunoassay” da R&D Systems (Minneapolis,
EUA). Este ensaio emprega a técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA) sanduíche
quantitativo, em que um anticorpo monoclonal específico para TPO humana foi
previamente revestido sobre uma microplaca. O reagente padrão e as amostras são
pipetadas para os poços da microplaca de ELISA e a TPO presente é ligada ao
anticorpo específico. Após a lavagem para retirar quaisquer substâncias não ligadas,
um anticorpo policlonal ligado a enzima específica para TPO humano é adicionado
aos poços. Seguindo uma lavagem para remover qualquer reagente ou anticorpo
43
não ligado a enzima, uma solução de substrato é adicionada aos poços e a cor
desenvolve-se em proporção à quantidade da TPO ligada no passo inicial. O
desenvolvimento da cor é interrompido e a intensidade da cor é medido através de
um leitor de microplacas de ELISA. Os valores das absorbâncias foram anotados e
calculados e os resultados da análise foram expressos em pg/mL. Os procedimentos
foram realizados de acordo com as orientações do fabricante. Uma amostra de 08
pacientes do ambulatório de PTI com contagem plaquetária superior a 150 x109/L há
pelo menos 1 ano, livre de tratamento, foi avaliada separadamente como população
controle neste ensaio.
3.7- Análise Estatística
Os pacientes foram divididos em grupos, conforme o diagnóstico. A análise e
a comunicação dos resultados foram feitas de acordo com as diretrizes do manifesto
STARD (Standards for the Reporting of Diagnostic accuracy studies), metodologia
padrão exigida pela maioria dos periódicos internacionais para publicação de
estudos de acurácia diagnóstica (Bossuyt et al., 2003). Os dados clínicos e
laboratoriais foram inseridos em planilhas, e apresentados de forma descritiva, como
mediana (salvo se destacado o contrário), desvio-padrão (DP), valores mínimos e
máximos. As diferenças entre as médias do IPF e da dosagem de TPO, bem como
de outras variáveis clínicas contínuas, foram comparadas pelo teste t de Student ou
teste Mann-Whitney. Para variáveis clínicas categóricas, utilizamos o teste de Fisher.
Análises de correlação foram feitas através do coeficiente de correlação de Pearson
ou Spearman, conforme a distribuição dos dados. A acurácia do IPF para
segregação dos pacientes por diagnóstico foi estimada através da metodologia de
ROC (Receiver operating characteristics), que permite a análise concomitante da
sensibilidade e especificidade de cada teste em relação aos desfechos clínicos
selecionados. Os resultados foram expressos juntamente com os intervalos de
confiança e nível de significância. O nível de significância para todas as análises
será de P< 0,05. As análises foram feitas no software Graphpad Prism v5.0
(Califórnia, EUA).
44
No caso de pacientes com TH, nosso alvo de recrutamento foi 100% dos
pacientes atendidos no Hemocentro durante o período do estudo. Para as demais
condições, foram estabelecidos alvos de recrutamento de 50 pacientes com
trombocitopenia pós-quimioterapia, 30 pacientes com insuficiências medulares AA
ou SMD), e 100 pacientes com PTI. Estes alvos foram calculados para
demonstração de diferenças da ordem de pelo menos um desvio padrão com poder
estatístico de 0,8 e nível de significância de 0,05 para cada um dos parâmetros
(contagem plaquetária, VPM, IPF e TPO.
45
4.0- RESULTADOS
4.1- IPF no diagnóstico diferencial das trombocitopenias
O recrutamento do estudo foi realizado entre 07/2013 e 02/2015. No total,
participaram do estudo 210 pacientes com trombocitopenia, sendo 56 com
trombocitopenia pós quimioterapia (Pós Qtx), 22 com insuficiência medular (Ins.
Medular), 105 com PTI e 27 com TH. As características clínicas e demográficas
destes pacientes estão demonstradas na tabela 1. As características individuais dos
pacientes com TH são mostradas no anexo 2. Alguns pacientes com PTI
apresentam contagem superiores a 100x109/L por estarem sob tratamento. É
importante destacar que os valores de contagem plaquetária não foram diferentes
entre os grupos com trombocitopenia (tabela 1 e figura 4).
Tabela 1. Características demográficas dos grupos de pacientes analisados. *Mediana
(mín-máx); ** razão masculino:feminino; *** média ± desvio-padrão; PLAQUETA: contagem
de plaquetas (x109/L); VPM: volume médio plaquetário (fL). Pós QTX: trombocitopenia pós
quimioterapia; Ins. Medular: insuficiências medulares; PTI: plaquetopenia imune; TH:
trombocitopenia hereditária.
Pós QTX (n=56)
Ins. Medular (n=22)
PTI (n=105)
TH (n=27)
IDADE* 51 (24-75) 64 (22-90) 55 (16-87) 29 (04-55)
SEXO** 1,24 2,66 0,46 0,37
PLAQUETA* 31 (5-146) 27 (4-146) 52 (3-150) 52 (6-128)
VPM*** 10,5 (±1,06) 9,2 (±2,15) 11,3 (±2,59) 13,0 (±3,99)
46
Figura 4. Contagem de plaquetas. Análise estatística entre os grupos realizada através do
teste de Kruskal Wallis. Pós QTX: trombocitopenia pós quimioterapia; Ins. Medular:
insuficiência medular; PTI: plaquetopenia imune; TH: trombocitopenia hereditária. As barras
indicam média e desvio-padrão.
Ao analisarmos os valores de VPM, observamos que pacientes com TH
apresentam um VPM mais elevado que pacientes dos demais grupos (teste de
Kruskal Wallis, P=0,0005) (Figura 5). No entanto, esta diferença só foi
estatisticamente significativa na comparação de TH com o grupo pós Qtx (P=0,05) e
com o grupo insuficiências medulares (P=0,01) (pós teste de Dunn). Importante, o
VPM não foi capaz de separar pacientes com TH de pacientes com PTI. As médias
dos grupos foram: Pós QTX 10,50 fL; Ins. Medular 9,67 fL; PTI 11,27 fL; TH 13,03 fL.
47
Figura 5. Volume plaquetário médio. Análise estatística entre os grupos realizada através
do teste de Kruskal Wallis, com pós teste de Dunn. Houve diferença entre pacientes do
grupo TH quando comparados com Pós Qtx e com Ins. Medulares, mas não com o grupo
PTI. Pós QTX: trombocitopenia pós quimioterapia; Ins. Medular: insuficiência medular; PTI:
plaquetopenia imune; TH: trombocitopenia hereditária. As barras indicam média e desvio-
padrão. OBS: 20 amostras de TH e 15 de PTI tiveram os valores de VPM obtidos pelo
equipamento ADVIA 2120i.
A faixa de normalidade para a IPF em nossa população foi de 2,90 ± 1,64 %.
No que tange a análise em grupo da IPF, observamos um valor significativamente
mais elevado no grupo TH, com média de 34,71%. Este valor foi superior a todos os
demais (Pós QTX, Insuficiência Medular e PTI com IPF média de 6,96%, 9,01% e
16,06% respectivamente). Os resultados são demonstrados na figura 6.
48
Figura 6. Fração de plaquetas imaturas. Análise estatística entre os grupos realizada
através do teste de Kruskal Wallis, com pós teste de Dunn. Pós QTX: trombocitopenia pós
quimioterapia; Ins. Medular: insuficiência medular; PTI: plaquetopenia imune; TH:
trombocitopenia hereditária. As barras indicam média e desvio-padrão. (*P <0,0001; **P=
0,005).
Considerando a relevância clínica do diagnóstico diferencial entre PTI e TH,
todas as análises subsequentes foram realizadas nestes dois grupos, de modo que
os demais grupos foram considerados mais como uma validação de nossos
resultados (o perfil de IPF nesta população é bem conhecido). Inicialmente
realizamos uma análise incluindo apenas estes dois grupos de pacientes. Mais uma
vez, não observamos diferenças significativas na contagem plaquetária (teste de
Mann Whitney; P=0,59) (Figura 7).
49
Figura 7. Contagem de plaquetas. Análise estatística entre os grupos realizada através do
teste de Mann Whitney. PTI: plaquetopenia imune; TH: trombocitopenia hereditária. As
barras indicam média e desvio-padrão.
Ao analisarmos a IPF separadamente dos grupos PTI e TH, observamos um
grande aumento dos níveis da IPF em pacientes com TH em relação aos pacientes
com PTI, com médias 35% e 16% respectivamente (teste de Mann Whitney;
P<0,0001). Esta diferença ocorre apesar dos valores de IPF serem aumentados no
grupo de pacientes com PTI (Figura 8).
50
Figura 8. Fração de plaquetas imaturas. Análise estatística entre os grupos realizada
através do teste de Mann Whitney. PTI: plaquetopenia imune; TH: trombocitopenia
hereditária. As barras indicam média e desvio-padrão.
Os valores das correlações de Spearman (Rs) entre as IPFs, os valores de
VPM e contagem plaquetárias dos grupos dos pacientes analisados foram obtidos e
são demonstrados na tabela 2. A IPF se correlacionou negativamente e com forte
intensidade, com a contagem plaquetária em todos os grupos, com exceção de
pacientes Pós Qtx. Correlações moderadas entre VPM e contagem de plaquetas
foram observadas apenas nos pacientes com PTI e Ins. Medular. Por fim, apenas no
grupo Pós Qtx pudemos observar uma correlação entre VPM e IPF.
Nas figuras 9 e 10 são demonstradas graficamente as correlações entre a IPF
e a contagem plaquetária nos pacientes com PTI e TH respectivamente.
51
VPM x IPF
VPM x Plaqueta
Plaqueta x IPF
Pós QTX
0,5758; P<0,0001
----
----
Ins. Medular
----
0,4307; P=0,04
-0,7020; P=0,0004
PTI
----
0,4203; P<0,0001
-0,7065; P<0,0001
TH
----
----
-0,7789; P<0,0001
Tabela 2. Correlação entre parâmetros plaquetários. Coeficiente de correlação de
Spearman (Rs) entre os diferentes parâmetros plaquetários, com valor de P correspondente
a cada análise de correlação. Apenas os coeficientes estatisticamente significativos são
mostrados. Plaqueta: contagem de plaquetas (x109/L); VPM: volume médio plaquetário (fL);
IPF: fração de plaquetas imaturas (IPF). Pós QTX: trombocitopenia pós quimioterapia; Ins.
Medular: insuficiências medulares; PTI: plaquetopenia imune; TH: trombocitopenia
hereditária.
52
Figura 9. Correlação entre IPF e contagem de plaquetas na PTI. Gráfico de dispersão
mostrando a correlação inversa entre contagem de plaquetas e IPF em pacientes com PTI.
Rs corresponde ao coeficiente de correlação de Spearman. IPF: fração de plaquetas
imaturas; PTI: plaquetopenia imune.
Figura 10. Correlação entre IPF e contagem de plaquetas na TH. Gráfico de dispersão
mostrando a correlação inversa entre contagem de plaquetas e IPF em pacientes com TH.
Rs corresponde ao coeficiente de correlação de Spearman. IPF: fração de plaquetas
imaturas; TH: trombocitopenia hereditária.
53
Em seguida, estimamos a acurácia diagnóstica da IPF para diagnóstico
diferencial entre PTI e TH, e obtivemos uma área sob a curva ROC de 0,79 (IC95%
0,69-0,89; P<0,0001), que ilustra o potencial informativo deste parâmetro para o
diagnóstico diferencial entre estas duas condições. Como ilustração, utilizando-se
um valor de corte de IPF acima de 17,45%, o diagnóstico de TH pode ser definido
com sensibilidade e especificidades de 77,78 % e 71,43 % respectivamente.
Figura 11. Estimativa da acurácia diagnóstica. Curva ROC ilustrando a sensibilidade (eixo
y) e especificidade (eixo x) da IPF no diagnóstico diferencial entre plaquetopenias imunes e
trombocitopenias hereditárias. AUC: área sob a curva; CI95%: intervalo de confiança 95%.
A acurácia diagnóstica medida pela curva ROC para o diagnóstico diferencial
entre TH e todas as demais plaquetopenias foi de 0,88 (CI95% 0,8 – 0,96)
P<0,0001. Além disso, estimamos a acurácia diagnóstica do VPM para o diagnóstico
de PTI e TH e o valor encontrado foi 0,64 (CL95% 0,50 – 0,79) P=0,022.
54
4.2- TPO no diagnóstico diferencial entre PTI e TH
Também avaliamos o papel da TPO no diagnóstico da PTI e TH. Conforme
demonstrado na figura 12, níveis aumentados de TPO foram observados nos
pacientes com TH em comparação a pacientes com PTI, com mediana de 59,56
pg/mL e 32,97 pg/mL. Em uma população restrita de indivíduos com contagem de
plaquetas normal (PTI em remissão completa com contagem plaquetária superior a
150x109/L, e fora de tratamento há pelo menos 1 ano), valores semelhantes de TPO
foram observados em relação aos pacientes com TH.
Figura 12. TPO no plasma de pacientes com PTI, TH e sem plaquetopenia.
Concentrações plasmáticas de trombopoietina (TPO) no plasma de pacientes com
plaquetopenia imune (PTI) ou trombocitopenia hereditária (TH). Teste estatístico de Mann-
55
Whitney mostrando diferenças entre pacientes com PTI e TH* (P= 0,01) e entre PTI e uma
população controle (Controle) com contagem de plaquetas normais ** (P= 0,04).
Ao analisarmos as correlações entre os níveis plasmáticos de TPO com a
contagem de plaquetas ou a IPF nestes dois grupos, apenas em pacientes com PTI
foram observadas correlações estatisticamente significativas, conforme demonstrado
nas figuras 13 e 14. Em pacientes com TH, não houve correlação entre a TPO com a
contagem plaquetária ou com a IPF.
Figura 13. Correlação entre IPF e TPO em pacientes com PTI. Gráfico de dispersão
mostrando a correlação positiva entre a IPF e a TPO em pacientes com PTI. Rs corresponde
ao coeficiente de correlação de Spearman. IPF: fração de plaquetas imaturas; TPO:
trombopoietina; PTI: plaquetopenia imune.
56
Figura 14. Correlação entre contagem de plaquetas e TPO em pacientes com PTI.
Gráfico de dispersão mostrando a correlação inversa entre a contagem de plaquetas e a
TPO em pacientes com PTI. Rs corresponde ao coeficiente de correlação de Spearman.
TPO: trombopoietina; PTI: plaquetopenia imune.
Estimamos a acurácia diagnóstica da TPO para o diagnóstico diferencial de
TH e PTI para posterior comparação com a a acurácia diagnóstica da IPF. O
resultado obtido foi de 0,66 (CL95% 0,56 - 0,76, P=0,011).
57
Figura 15. Estimativa da acurácia diagnóstica TPO. Curva ROC ilustrando a sensibilidade
(eixo y) e especificidade (eixo x) da TPO no diagnóstico diferencial entre plaquetopenias
imunes e trombocitopenias hereditárias. AUC: área sob a curva; CI95%: intervalo de
confiança 95%.
58
4.3- Reprodutibilidade da IPF em pacientes com TH
Devido aos valores surpreendentemente elevados de IPF nos pacientes com
TH, nós avaliamos a reprodutibilidade destes resultados. Esta análise foi feita
através da comparação entre as contagens plaquetárias e a IPF de duas coletas
seriadas em 6 pacientes com TH (tabela 3). Estas coletas foram feitas em consultas
regulares, com intervalo aproximado de 1 ano. As amostras da 2a coleta foram
analisadas três vezes no mesmo equipamento (Sysmex XE5000), nas mesmas
condições da primeira análise. Utilizando-se os resultados destas 3 repetições, o
coeficiente de variação (CV%) intra-ensaio foi calculado. Em seguida, utilizando-se o
resultado da 1a coleta, e a média da 2a coleta, o CV% inter-ensaio foi calculado. Os
resultados da análise de precisão intra e inter-ensaio são mostrados na tabela 4.
1a coleta 2a coleta
UPN Data Plaqueta IPF Data Plaqueta* IPF *
1 13/04/2015 21 62,7 11/04/2016 7 65,63
2 13/04/2015 96 37,2 11/04/2016 105 42,13
3 13/04/2015 6 59,6 11/04/2016 16 65,83
4 06/10/2014 76 24,6 03/10/2016 69 29,37
5 24/11/2014 49 56,4 10/10/2016 41 65,83
6 03/11/2014 12 62,7 24/10/2016 86 65,63
Tabela 3. Análise de reprodutibilidade da IPF em TH. Resultados de coletas seriadas de
pacientes com TH. Os resultados da 2a coleta correspondem à média de 3 repetições com a
mesma amostra. Plaqueta: contagem de plaquetas (x109/L); IPF: fração de plaquetas
imaturas (%). TH: trombocitopenia hereditária. UPN: número individual de paciente.
59
Intra-ensaio Inter-ensaio
UPN IPF * CV% Plaq* CV% IPF ** CV% Plaq** CV%
1 65,63 8 7 16 64,17 3 14 68
2 42,13 2 105 1 39,67 9 100 6
3 65,83 7 16 15 62,72 7 111 65
4 29,37 6 69 5 26,98 12 72 6
5 65,83 1 41 2 61,12 11 45 13
6 65,63 8 86 7 64,17 3 10 23
Total *** 55,74 ± 16,00
5 ± 3
54 ± 39
8 ± 6
53,14 ± 16,00
8 ± 4 59 ± 43
30 ± 29
Tabela 4. Precisão intra e inter-ensaio. A reprodutibilidade intra-ensaio foi calculada
através do CV% de partir de 3 repetições com a mesma amostra para os parâmetros IPF e
Plaq (* indica a média destas 3 repetições). A reprodutibilidade inter-ensaio foi calculada
através do CV% de duas repetições com intervalo de 1 ano do mesmo paciente (** indica a
média destas duas repetições). O total (***) representa a média ± desvio-padrão dos valores
dos 6 pacientes, para cada um dos parâmetros analisados. Plaq: contagem de plaquetas
(x109/L); IPF: fração de plaquetas imaturas (%). TH: trombocitopenia hereditária. UPN:
número individual do paciente.
60
5.0- DISCUSSÃO
A investigação diagnóstica das trombocitopenias é um assunto de grande
interesse para a prática clínica e laboratorial devido à ampla gama de doenças que
cursam com redução na contagem de plaquetas. Avanços tecnológicos na área
laboratorial permitiram que nos últimos anos, novas estratégias diagnósticas fossem
incorporadas ao arsenal de ensaios disponíveis para clínicos e laboratoristas,
facilitando muito tanto a abordagem diagnóstica de pacientes com trombocitopenia,
quanto a compreensão dos mecanismos que regulam a trombocitopoiese. Não
obstante, grandes desafios ainda persistem, particularmente naquelas condições em
que a trombocitopenia é multifatorial, bem como no diagnóstico diferencial de
plaquetopenias isoladas oligo- ou assintomáticas.
No contexto desta última situação, destaca-se o diagnóstico diferencial entre a
PTI e TH, um problema clínico significativo pela frequente semelhança entre estas
duas condições clínicas. De uma forma geral, dois dos mais importantes fatores que
apontam para o diagnóstico de uma doença congênita, em oposição a uma doença
adquirida são a recorrência familiar, e o início precoce dos sintomas. No caso da TH,
estas informações nem sempre estão claras. Isto ocorre porque muitas destas
condições apresentam herança recessiva ou penetrância incompleta, o que faz com
que a recorrência familiar não seja uma regra. Além disso, o fato de as
trombocitopenias só cursarem com sintomas quando a contagem encontra-se
bastante reduzida (em geral abaixo de 30x109/L), faz com que muitos casos de TH
apresentem curso clínico oligo ou assintomático, sendo detectados incidentalmente
no momento da realização de algum hemograma de rotina. Como agravante,
informações obtidas de hematologistas envolvidos no tratamento destes pacientes
indicam que contagens plaquetárias alteradas são muitas vezes ignoradas por
outros clínicos, atrasando ainda mais o diagnóstico das TH. No caso da PTI, a
apresentação clínica clássica de sangramentos cutâneos mucosos agudos ou
subagudos também encontra-se frequentemente ausente, de modo que não é raro
que esta doença também seja detectada incidentalmente em um hemograma de
rotina. Desta forma, diante de um paciente oligo- ou assintomático, apresentando
61
plaquetopenia isolada no hemograma, o diagnóstico diferencial entre PTI e TH é
menos trivial do que a leitura de diretrizes diagnósticas possa sugerir. O fato de o
tratamento e as orientações para estas duas condições serem muito distintas
(Drachman, 2004; Neunert et al., 2011) torna fundamental a busca de métodos que
refinem a avaliação diagnóstica destas duas condições.
O advento de novas gerações de analisadores hematológicos, permitiu a
incorporação de vários novos parâmetros plaquetários com potencial de auxiliar no
diagnóstico diferencial das trombocitopenias. Entre estes parâmetros, destacam-se o
VPM e a IPF. O melhor exemplo da factibilidade e da utilidade destes parâmetros
para o diagnóstico diferencial da TH e da PTI é o uso do VPM neste contexto,
demonstrados a partir de um estudo que caracterizou as TH como um grupo de
doenças com aumento do VPM em relação à PTI (Noris et al., 2009). A fim de validar
este achado e testar sua robustez, o mesmo grupo liderou um estudo multicêntrico
em que diferentes analisadores hematológicos foram usados para medir esse
parâmetro, o que permitiu sua incorporação bastante consolidada em algoritmos
diagnóstico de TH (Noris et al., 2013; Noris et al., 2014). De fato, o VPM e o
diâmetro plaquetário foram recentemente utilizados como base para uma nova
classificação das TH (Noris et al., 2014). Com base nesta experiência, o objetivo
principal deste projeto foi avaliar a factibilidade da IPF no mesmo contexto clínico e
laboratorial.
A relação entre o conteúdo de RNA das plaquetas circulantes e a atividade
trombopoiética foi inicialmente descrita em 1990, em um estudo que mostrou que
pacientes com aumento de megacariócitos na MO, tais como PTI, apresentam
aumento do RNA residual detectado por citometria de fluxo em relação a outros
pacientes. Neste estudo, os autores já propuseram que este parâmetro poderia ser
usado como ferramenta diagnóstica (Kienast e Schmitz, 1990). O termo plaquetas
reticuladas é anterior a esta demonstração, e foi originalmente usado em 1969, em
um modelo de sangramento agudo em cães, que identificou as chamadas “plaquetas
reticuladas” na circulação, e especulou que estas seriam plaquetas mais jovens
(Ingram e Coopersmith, 1969). Pouco tempo depois da demonstração de Kienast e
Schmitz, Ault e colaboradores publicaram a primeira grande demonstração da
factibilidade da contagem de PR como marcador da atividade trombopoiética (Ault et
62
al., 1992). Em 2004, Briggs e colaboradores publicaram um estudo mostrando a
factibilidade do uso de um analisador hematológico para cálculo deste parâmetro,
então chamado de IPF (Briggs et al., 2004). Neste estudo, os autores demonstram
que pacientes com PTI e outras condições associadas a destruição plaquetária
apresentam níveis elevados de IPF, além de confirmarem a estabilidade deste
parâmetro.
Após esta demonstração, vários grupos passaram a explorar aplicações
clínicas da IPF, em áreas como: (i) o diagnóstico diferencial das trombocitopenias;
(ii) a caracterização do papel da IPF na avaliação da cinética de recuperação
medular em diferentes condições; e (iii) na avaliação da IPF como biomarcador
inflamatório.
No primeiro item, os estudos ficaram mais restritos à reprodução dos
resultados de que pacientes com as chamadas trombocitopenias hiperproliferativas
(um conceito de difícil tradução à luz do conhecimento atual sobre a fisiopatologia da
PTI), apresentam IPF mais elevados que pacientes com trombocitopenias
hipoproliferativas. Um exemplo é um trabalho publicado por um grupo da Coreia do
Sul em 2007 que avaliou 90 pacientes trombocitopênicos, e confirmou a factibilidade
da contagem da IPF para o diagnóstico diferencial de etiologias hipo- ou hiper-
proliferativas (Cho et al., 2007). Outros grupos chegaram a resultados semelhantes
com diferentes desenhos experimentais (Cannavo et al., 2010; Strauss et al., 2011).
O uso da IPF no estudo da cinética de recuperação plaquetária foi talvez a
área em que mais dados foram gerados. A IPF mostrou-se capaz de predizer a
recuperação medular em pacientes submetidos a diferentes esquemas de
quimioterapia ou transplante de células tronco hematopoiéticas (Briggs et al., 2006;
Zucker et al., 2006; Yamaoka et al., 2010; Morkis et al., 2015). Do ponto de vista
clínico, isto é interessante pois pode facilitar decisões relativas a indicação de
transfusões. Ainda nesta área, e também com implicações clínicas potencialmente
interessante, destaca-se um estudo publicado em 2014 por pesquisadores indianos
mostrando correlações da IPF com a cinética de recuperação plaquetária na dengue
(Dadu et al., 2014).
Uma outra área de investigação mais recente é o uso da IPF como marcador
inflamatório. Desde o relato de 1969 sobre as plaquetas reticuladas, especula-se
63
que plaquetas jovens seriam funcionalmente mais ativas que o restante das
plaquetas circulantes, motivando estudos sobre a associação entre a IPF e doenças
inflamatórias agudas. De fato, associações entre este parâmetro de doenças
inflamatórias foram demonstradas em contextos como a SCA (López-Jiménez et al.,
2013), anemia falciforme (Noronha et al., 2007) trombocitopenia neonatal (Cremer et
al., 2009), sepse (Enz Hubert et al., 2015), entre outros. Como já destacado na
introdução, esta associação não deve ser considerada universal, e depende da
condição estudada, como bem ilustrado por recentes resultados negativos em um
estudo que procurou correlacionar a IPF com a atividade da doença em Lúpus
eritematoso sistêmico (comunicação pessoal de De Paula EV e Appenzeller S).
Um outro aspecto importante do uso da IPF é o estudo de sua correlação com
a citometria de fluxo. Curiosamente, apenas dois estudos na literatura inglesa
fizeram esta avaliação (Pons et al., 2010) (Ibrahim et al., 2016). No primeiro estudo,
um coeficiente linear de correlação de 0,65 foi encontrado entre os métodos (Pons et
al., 2010). No entanto, apenas em pacientes com trombocitopenia associada a
destruição periférica esta correlação foi satisfatória. Nos subgrupos de pacientes
com hipoplasia medular, ou nos controles, correlações fracas ou ausentes foram
observadas. No segundo estudo, a correlação entre os métodos foi fraca, com
exceção do subgrupo de pacientes com IPF aumentada (Ibrahim et al., 2016). Isto
sugere que a correlação entre os dois métodos não seja perfeita. Cabe destacar no
entanto, que não há dados que coloquem a citometria de fluxo como padrão-ouro.
De fato, a variabilidade de padronização deste método sugere que sua performance
possa ser mais limitada que a de um método automatizado como a IPF. Além disso,
a partir da descrição de Briggs e colaboradores em 2004, praticamente todas as
associações clínicas publicadas referem-se ao IPF automatizado, usado em nosso
estudo.
Nosso principal resultado foi que em nossa coorte, de 210 pacientes incluindo
um grupo de 27 indivíduos com TH bem caracterizados clinicamente e
laboratorialmente, os valores da IPF foram significativamente maiores (quase três
vezes maior) no grupo TH em comparação com outras causas de trombocitopenias
hipoproliferativas como insuficiência medular e pós-QTX. Mais importante ainda, os
valores IPF foram quase duas vezes maiores em pacientes com TH do que em
pacientes com PTI, apesar de estes grupos apresentarem contagens de plaquetas
64
semelhantes. A análise ROC confirmou a acurácia do da contagem da IPF no
diagnóstico diferencial entre PTI e TH. Este achado pode ser inicialmente
considerado surpreendente, particularmente devido a uma descrição publicada no
ano 2000 com 29 pacientes com TH 23 pacientes com PTI, no qual as PR, medidas
por citometria de fluxo, encontravam-se reduzidas no grupo TH (Fabris et al., 2000).
De fato, com base na premissa de que pacientes com TH apresentam algum
grau de hipoproliferação megacariocítica, ao passo que pacientes com PTI
apresentariam hiperproliferação de megacariócitos, esta era nossa hipótese ao início
do projeto. No entanto, uma análise mais cuidadosa dos mecanismos da
trombocitopenia na PTI e na TH mostra que esta divisão simples entre hipo e
hiperplasia da MO não reflete a complexidade da fisiopatologia destas duas
condições. Como já destacado na introdução, há evidências importantes de que a
PTI está associada a algum grau de redução da produção de megacariócitos, como
ilustrado pelos estudos que utilizaram soro ou anticorpos de pacientes com PTI
sobre culturas destes precursores (Chang et al., 2003; Mcmillan et al., 2004). Por
outro lado, estudos sobre o mecanismo de redução da contagem plaquetária em
doenças como a Síndrome de Bernard Soulier ou na trombocitopenia relacionada ao
gene MYH9 não indicam que o defeito seja redução da proliferação de
megacariócitos, mas sim alterações em sua estrutura e na formação de pró-
plaquetas (López et al., 1998; Pecci et al., 2009). Considerando a complexidade da
fisiopatologia da trombocitopenia na TH, envolvendo mecanismos moleculares e
celulares ainda incertos, acreditamos não ser possível conclusões simplistas
associando o aumento da IPF em pacientes com TH com aumento da atividade
trombopoiética. Tal como acontece na SMD, em que o aumento da celularidade da
MO coexiste com citopenias, é possível apenas especular que o aumento da IPF nas
TH seja reflexo das alterações celulares e moleculares inerentes a estas condições.
Durante a fase final da realização deste estudo, um artigo científico
abordando a mesma questão foi publicado. Nele, Miyazaki e colaboradores
avaliaram o papel da IPF no diagnóstico diferencial da PTI e TH em 15 pacientes
com macrotrombocitopenia congênita, utilizando o mesmo método empregado no
nosso estudo. De forma similar ao que reportamos, níveis mais elevados da IPF
foram observados na TH em comparação à PTI (Miyazaki et al., 2015). Neste
65
estudo, um valor de corte da IPF acima de 15,2% apresentou uma sensibilidade e
especificidade estimada de 0,93% e 0,93% respectivamente, o que se compara aos
resultados obtidos em nosso estudo. Os autores também mostraram a influência do
tamanho das plaquetas na IPF. Neste contexto, nossos resultados também
funcionam como uma validação, em um centro independente, dos resultados
apresentados por Miyazaki e colaboradores. Esta validação reforça a o potencial da
IPF como ferramenta para o diagnóstico diferencial entre PTI e TH.
De fato, validar um teste é extremamente importante na pesquisa de acurácia
diagnóstica, por ser uma etapa fundamental para a definição da precisão e exatidão
de um teste nos variados ambientes clínicos em que eles serão usados (Sackett et
al., 1996). É comum, e até certo ponto desejável, que demonstrações iniciais sobre a
aplicabilidade de um biomarcador sejam realizadas em ambientes altamente
controlados, tanto no que diz respeito à exclusão de pacientes com características
que possam comprometer a acurácia do teste, quanto aos protocolos de coleta,
processamento e análise das amostras mais controlados que os usados na prática
clínica. Desta forma, a reprodução de um resultado positivo sobre um biomarcador
em um centro e em uma população independente é uma etapa crítica de seu
desenvolvimento e implementação. Nosso estudo envolveu 100% dos pacientes com
TH de nosso centro, e foi realizado no mesmo ambiente laboratorial da rotina. Estes
aspectos reforçam ainda mais a aplicabilidade deste parâmetro.
No tocante às limitações de nosso estudo, a não utilização de citometria de
fluxo poderia ser citada como um aspecto relevante. No entanto, já discutimos aqui
que não há na literatura um entendimento que a citometria de fluxo seria o padrão-
ouro para contagem da IPF. Ao mesmo tempo, são os analisadores automatizados,
e não os citômetros de fluxo, os equipamentos mais acessíveis para obtenção deste
parâmetro na prática clínica. Assim, entendemos que os resultados obtidos com este
sistema (analisador automatizado + IPF) são de interesse clínico e laboratorial,
independentes dos resultados que poderiam ser obtidos com a citometria. Isto não
invalida o interesse em estudos que possam compreender melhor o que
representam estas plaquetas imaturas em nossos pacientes. Uma outra limitação de
nosso estudo foi a obtenção do VPM em um equipamento diferente daquele utilizado
para a quantificação da IPF. Isto ocorre por questões técnicas relacionadas ao
método de análise utilizado pelo equipamento XE5000. De fato, o VPM não foi
66
liberado em 20/27 pacientes com TH e em 15/105 pacientes com PTI. No entanto, a
validade do VPM obtido de diferentes equipamentos foi indiretamente confirmada em
um estudo que mostrou a acurácia deste parâmetro em uma pesquisa multicêntrica
utilizando diferentes equipamentos (Noris et al., 2013). Por fim, a análise de
reprodutibilidade incluiu algumas amostras cujos resultados de contagem de
plaqueta variaram muito entre as duas coletas anuais. O significado desta variação é
incerto, e o seguimento deste parâmetro em um maior número de pacientes nos
auxiliará nesta interpretação.
Em relação aos pontos fortes de nossa nossa pesquisa, destacamos a
inclusão de uma amostra relativamente grande e representativa de TH, e o protocolo
de análise muito próximo da “vida real” de um laboratório de análises clínicas. Além
disso, nosso estudo trouxe novas informações sobre a aplicabilidade da IPF em
relação ao trabalho de Miyazaki e colaboradores, ao realizar uma avaliação formal
da reprodutibilidade intra e inter ensaio nos pacientes com IPF bastante aumentada.
O baixo CV% observado nestes pacientes revela que a IPF aumentada é um
parâmetro estável ao longo do curso clínico, fortalecendo sua aplicabilidade na
prática clínica.
Em fim, também realizamos uma avaliação dos níveis plasmáticos de TPO em
pacientes com PTI e TH, tanto para avaliar se esta dosagem poderia contribuir neste
diagnóstico diferencial, quanto fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes à
variação dos valores da IPF observadas nesses pacientes. Apesar de verificarmos
que os pacientes com TH apresentaram valores mais altos de TPO em relação aos
pacientes com PTI, a magnitude desta diferença foi inferior quando comparada à
diferença observada nos valores da IPF. Além disso, embora a acurácia diagnóstica
da TPO na diferenciação de PTI e TH (AUC= 0,66; CL 95% 0,56-0,76; P<0,007)
tenha sido significativa, a dosagem deste parâmetro é muito mais complexa, onerosa
e demorada do que a avaliação da IPF, conferindo a análise da IPF maior
praticidade e viabilidade para realizar esse diagnóstico diferencial.
No grupo de pacientes com PTI encontramos resultados interessantes em
relação à TPO. Em primeiro lugar, os níveis de TPO foram inferiores aos observados
em controles sem plaquetopenia, ao contrário do que seria esperado em uma
plaquetopenia hipoproliferativa. Este resultado confirma as descrições clássicas da
PTI como uma condição caracterizada por uma resposta subótima da TPO (Nichol,
67
1998), que mais tarde subsidiaram o uso de análogos do receptor de TPO como
tratamento desta condição. No entanto, apesar desta resposta limitada, pudemos
observar correlações significativas entre a TPO tanto com a contagem plaquetária
(correlação inversa), quanto com a IPF (correlação positiva). Isto sugere que, ainda
que limitados a uma faixa de flutuação mais restrita, os mecanismos clássicos de
regulação da TPO, baseados na massa de receptores MPL em plaquetas e
megacariócitos, estão operantes na PTI.
Considerando a acurácia diagnóstica da determinação da IPF no diagnóstico
diferencial entre PTI e TH, observada tanto em nosso estudo quanto em uma
população independente no Japão; e considerando a facilidade relativa da obtenção
deste parâmetro por analisadores automatizados, acreditamos que estudos
multicêntricos de acurácia diagnóstica em ambientes clínicos, e com maior número
de pacientes sejam importantes e altamente desejáveis para subsidiar a
incorporação deste parâmetro a algoritmos diagnósticos de TH.
68
6.0- CONCLUSÃO
A IPF encontra-se significativamente aumentada em pacientes com TH, em
comparação a pacientes com PTI, trombocitopenia pós quimioterapia ou
insuficiências medulares. Este aumento confere à quantificação da IPF, uma
acurácia diagnóstica satisfatória para o diagnóstico diferencial entre PTI e TH, com
sensibilidade e especificidade estimada de 77,78 % e 71,43 % respectivamente, para
um valor de corte de 17,45%, de IPF. A acurácia diagnóstica da IPF foi superior à do
VPM, um parâmetro já validado para o diagnóstico diferencial entre PTI e TH.
As análises de reprodutibilidade mostram que a precisão intra- e inter-ensaios
da IPF são satisfatórias para seu uso clínico. Achados semelhantes em outro estudo
independente sugerem que a IPF seja um parâmetro útil no diagnóstico diferencial
entre PTI e TH.
A dosagem de TPO contribui para o diagnóstico diferencial entre TH e PTI,
com acurácia diagnóstica satisfatória embora seja uma análise mais complexa,
onerosa e mais lenta comparada com a avaliação da IPF. A correlação entre TPO e
contagem plaquetária ou IPF em pacientes com PTI mostra que apesar do
incremento sub-ótimo da TPO nestes pacientes, a relação entre os níveis de TPO e
a atividade trombopoiética está mantida na PTI. Por outro lado, a ausência de
correlação entre TPO com a IPF ou com a contagem plaquetária em pacientes com
TH sugere que mecanismos alternativos de regulação da trombocitopoiese estejam
operando nestes pacientes.
69
7.0- REFERÊNCIAS
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81
8.0- ANEXOS
Anexo I. Características dos pacientes com trombocitopenia hereditária.
UPN Idade/Sexo Diagnóstico Plaquetas (x109/L) MPV (fL) IPF (%)
1 33/M MYH9 21 7.7 62.7
2 10/F MYH9 6 7.8 59.8
3 24/F MYH9 49 19.9 56.4
4 15/M MYH9 52 15.1 25.5
5 17/F MYH9 69 14.8 24.7
6 17/F MYH9 20 14.7 43.2
7 12/F MYH9 59 16.5 22.4
8 55/M MYH9 12 21.4 62.7
9 42/F MYH9 74 16.6 38.8
10 37/F BSS 19 16.3 38.3
11 28/F BSS 60 8.1 28.3
12 33/M BSS 96 7.4 37.2
13 4/F BSS 22 8.7 57.2
14 27/M BSS 41 18.1 31.1
15 16/F BSS 14 7.3 61.4
16 37/F BSS 9 17.0 65.9
17 48/F HMT 65 11.8 29.8
18 23/M HMT 128 14.5 10.9
19 13/F HMT 17 14.1 45.9
20 16/F HMT 59 12.3 14.9
21 33/M HMT 56 12.3 14.7
22 32/F HMT 82 14.6 27.8
82
23 53/F HMT 76 14.1 24.6
24 54/F HMT 93 10.2 5.0
25 36/F HMT 41 9.3 4.6
26 33/F HMT 89 12.3 17.5
27 40/M HMT 7 9.0 51.7
Tabela 5. Característica dos pacientes com trombocitopenia hereditária. UPN: número
individual de paciente; MYH9: MYH9-relacionado a distúrbios plaquetários; BSS: Síndrome
de Bernard Soulier ; HMT: Macrotrombocitopenia hereditária não especificada; MPV: volume
plaquetário médio; IPF: fração de plaquetas imaturas.
83
Anexo II. Características dos pacientes com Plaquetopenia Imune.
UPN Sexo Diagnóstico Plaquetas (x109/L) MPV (fL) IPF (%)
1 F PTI 3 8,6 51,3
2 F PTI 4 8,2 43,6
3 F PTI 6 8,6 31,6
4 F PTI 6 8,2 33,3
5 F PTI 7 10 28,9
6 F PTI 8 6 33,0
7 M PTI 8 8,2 24,8
8 F PTI 9 11,3 30,7
9 F PTI 12 7,5 17,0
10 M PTI 18 9,8 14,5
11 F PTI 18 9,7 21,1
12 F PTI 19 7,6 26,0
13 F PTI 20 11,9 24,1
14 F PTI 20 11,6 30,8
15 M PTI 21 13,4 15,5
16 F PTI 21 10 17,7
17 F PTI 23 7,5 24,3
18 F PTI 23 11,9 17,4
19 F PTI 24 10 15,4
20 F PTI 25 10,4 15,5
21 F PTI 28 12,7 12,7
22 M PTI 28 6,4 22,1
23 M PTI 29 9,3 15,1
84
24 F PTI 31 7,5 12,3
25 M PTI 32 9,3 13,0
26 M PTI 32 8,4 12,3
27 M PTI 32 11,2 18,1
28 F PTI 32 10,5 20,9
29 F PTI 33 11,1 21,0
30 M PTI 34 8,2 29,0
31 F PTI 36 19,9 64,2
32 F PTI 36 19,8 65,6
33 F PTI 40 7,2 9,5
34 F PTI 40 7,2 13,0
35 M PTI 41 14,3 37,0
36 M PTI 42 11,8 10,4
37 F PTI 42 8,3 10,5
38 F PTI 44 14 8,5
39 M PTI 45 11,6 16,2
40 F PTI 45 13 26,2
41 M PTI 45 9,3 11,5
42 M PTI 46 14,2 9,2
43 F PTI 46 8,2 23,9
44 F PTI 46 12,4 12,8
45 F PTI 46 12,3 11,4
46 F PTI 46 12,4 15,8
47 M PTI 47 12,5 11,6
48 F PTI 47 19,8 56,6
49 M PTI 47 10,4 5,2
85
50 F PTI 48 10 7,9
51 M PTI 49 9,9 22,9
52 M PTI 51 8,8 9,3
53 M PTI 52 13,5 9,2
54 M PTI 52 12,1 8,9
55 F PTI 52 11,7 10,3
56 F PTI 54 11,7 5,2
57 M PTI 54 11,5 13,1
58 M PTI 54 7,1 7,0
59 M PTI 55 12,1 5,3
60 F PTI 56 15 35,6
61 F PTI 56 12,7 8,5
62 F PTI 56 12,2 7,3
63 F PTI 56 18 50,7
64 F PTI 57 9,2 11,1
65 M PTI 57 9,2 12,9
66 F PTI 57 11 15,1
67 M PTI 58 7,4 13,0
68 F PTI 59 10,9 4,0
69 F PTI 60 10,7 30,3
70 M PTI 60 13,4 5,3
71 M PTI 61 12,7 11,3
72 F PTI 63 11,6 6,2
73 M PTI 64 10,9 6,3
74 F PTI 67 13,5 29,7
75 F PTI 68 13,5 10,5
86
76 F PTI 68 10 16,3
77 F PTI 70 12,3 5,6
78 F PTI 71 12,3 8,9
79 F PTI 72 11,2 6,0
80 F PTI 74 13,4 3,6
81 F PTI 74 12,9 8,8
82 F PTI 76 9,5 11,5
83 F PTI 77 12,8 5,8
84 F PTI 79 11,9 6,4
85 F PTI 79 11,6 4,6
86 F PTI 81 12,4 5,9
87 F PTI 82 12 6,2
88 F PTI 83 10,3 3,4
89 F PTI 84 14 14,0
90 F PTI 86 11,7 16,1
91 M PTI 88 11,4 4,6
92 M PTI 89 12,4 9,4
93 F PTI 92 12,7 6,9
94 F PTI 92 10,6 3,6
95 F PTI 97 11,4 8,1
96 F PTI 97 12,2 4,0
97 M PTI 107 13,5 9,2
98 F PTI 120 14,4 14,2
99 F PTI 121 12,5 7,3
100 F PTI 123 14,3 7,0
101 M PTI 126 10,5 2,4
87
102 M PTI 135 10,8 4,3
103 F PTI 139 10,8 2,8
104 F PTI 147 11,9 3,3
105 F PTI 150 12,1 6,6
Tabela 6. Característica dos pacientes com plaquetopenia imune. UPN: número
individual de paciente; PTI: Plaquetopenia Imune; MPV: volume plaquetário médio; IPF:
fração de plaquetas imaturas.
88
Anexo III. Aprovação pelo comitê de ética em pesquisa da FCM-UNICAMP
Emenda 1
