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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
FRANCISCO DAS CHAGAS MARTINS DE SOUSA
RESÍDUOS DE FÁRMACOS VETERINÁRIOS EM ALIMENTOS:
QUINOLONAS EM SALMÃO E AVERMECTINAS EM CARNE BOVINA
CAMPINAS
2017
FRANCISCO DAS CHAGAS MARTINS DE SOUSA
RESÍDUOS DE FÁRMACOS VETERINÁRIOS EM ALIMENTOS:
QUINOLONAS EM SALMÃO E AVERMECTINAS EM CARNE BOVINA
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do título de Doutor em Ciências
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE
DEFENDIDA PELO ALUNO FRANCISCO DAS CHAGAS MARTINS DE
SOUSA, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH
CAMPINAS
2017
FICHA CATALOGRÁFICA
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Raimundo Feijó de Sousa e Maria Martins
de Sousa.
Aos meus irmãos Jânio Mário, Márcia Martins e Feijó Filho.
“Não querer nada de outro modo, nem para diante, nem para trás, nem em toda eternidade.
Não meramente suportar o necessário, e menos ainda dissimulá-lo - todo o idealismo é
mendacidade diante do necessário -, mas amá-lo...”
Friedrich Nietzsche
AGRADECIMENTOS
A Deus, inteligência suprema, causa primeira de todas as coisas;
Aos meus pais Raimundo Feijó de Sousa e Maria Martins de Sousa, que sempre prezaram pela formação moral e intelectual de seus filhos, sendo verdadeiros exemplos de trabalho, abnegação e devotamento.
À Professora Dra. Susanne Rath, por toda paciência e compreensão na orientação desse trabalho; por toda sua dedicação, amizade e imensa afetuosidade. Faltam palavras para exprimir minha admiração e eterna gratidão.
Aos Professores do IQ-Unicamp que contribuíram diretamente na minha formação, tenha sido através de disciplinas ou compondo as devidas bancas para exames e defesa.
Ao Professor Ronaldo Ferreira do Nascimento (UFC), por ter me despertado o interesse e admiração em conhecer um pouco mais da Química Analítica.
Ao Governo do Estado do Ceará e à Secretaria de Educação, pela concessão do afastamento para fins de estudo de Pós-Graduação.
À UNICAMP, ao Instituto de Química e seu corpo técnico, à coordenação e à secretaria dos cursos de pós-graduação, por toda infraestrutura e equipes que tão bem desempenham suas atividades.
A todos os amigos, conterrâneos cearenses ou da querida nação nordestina, contemporâneos de Pós-Graduação do IQ/Unicamp – um agradecimento especial ao Sávio Moita Pinheiro, a Lívia Paulia e ao Rômulo Batista Vieira.
A todos os amigos do Laboratório Paracelsus que tive a grata satisfação de conhecer e trabalhar. Todos vocês fazem parte de um capítulo de minha história de vida.
À minha amiga e técnica mais querida Andreza Camilotti, pela amizade, companheirismo, e toda sua imparcialidade profissional – você foi fundamental.
Às técnicas do Laboratório Multiusuário de Espectrometria de Massas, Priscila, Fernanda e Rita Zacardi, essa última em especial, por todo o apoio técnico, simpatia e incansável disponibilidade em ajudar, imprescindíveis no desenvolvimento desse trabalho.
A todos os amigos do Grupo Espírita Casa do Caminho (Campinas). Ao Aécio Pereira Chagas, professor aposentado do IQ-Unicamp, pelo acolhimento inicial na casa. Um agradecimento especial à equipe que tive a honra e felicidade de trabalhar– Tony, Fernando, Sheila, Gisele, Madalena, Manoel Carlos e Elaine. A convivência ao lado de vocês foi imprescindível na execução desse trabalho.
À escola de mergulho Captain Dive, em especial ao Rafael Esteves e Gabriel Paschoal, pela amizade estabelecida, pelos cursos, descontrações e valiosos mergulhos juntos.
Aos médicos oftalmologistas Evandro Pinheiro Marques e Jorge Eldo (Fortaleza) e Armando Signorelli Júnior (Campinas) por todo acompanhamento e tratamentos realizados.
E todas as pessoas que de forma direta ou indireta, colaborando ou me fortalecendo, contribuíram para que esse sonho fosse realizado.
Muito obrigado!!!
RESUMO
No decorrer dos últimos anos, a segurança alimentar tem assumido papel de
preocupação e destaque em toda a sociedade mundial. Na prática da criação de animais
para consumo humano, fármacos veterinários são amplamente empregados em extensa
escala de administração para diversas finalidades. O presente trabalho teve como objetivo
abordar a questão referente a presença de resíduos de fármacos veterinários (RFV) em
alimentos de origem animal (AOA), assim como, o desenvolvimento e validação de métodos
para determinar resíduos de antimicrobianos da família das quinolonas (marbofloxacina,
ciprofloxacina, danofloxacina, enrofloxacina, sarafloxacina, ácido oxolínico e flumequina) em
salmão e antiparasitários da família das avermectinas (abamectina, doramectina e
ivermectina) e milbemicinas (moxidectina) em carne bovina.
No desenvolvimento do método para determinar resíduos de quinolonas em salmão
empregando a cromatografia líquida de ultra alta eficiência associada a espectrometria de
massas sequencial (UHPLC-MS/MS) foram avaliados diferentes preparos de amostras
baseados na extração sólido-líquido e no procedimento QuEChERS.
Para a determinação de resíduos de antiparasitários da classe das avermectinas e
milbemicinas em músculo bovino foi desenvolvido um método empregando a cromatografia
líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência (HPLC-FLD). No preparo de
amostras foi otimizado um procedimento com emprego da extração com líquido
pressurizado.
Ambos os métodos foram validados com base em protocolos internacionais e
aplicados na análise de amostras de salmão (25) e músculo bovino (23), adquiridas no
comércio da cidade de Campinas, SP. Enquanto as amostras de salmão não apresentaram
resultados positivos para a presença de resíduos de quinolonas, seis amostras de carne
bovina apresentaram resíduos de avermectinas, mas todas com valores abaixo do limite
máximo de resíduo adotados no Brasil.
ABSTRACT
During the last years, food security has assumed a role of concern and prominence in
the whole world society. In the practice of raising animals for human consumption, veterinary
drugs are widely employed in a wide range of administration for a variety of purposes. The
objective of this study was to discuss the presence of veterinary drug residues (RFV) in foods
of animal origin, as well as the development and validation of methods to determine
antimicrobial residues of the quinolone family (marbofloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin,
enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid and flumequine) in salmon and antiparasitics of the
avermectin family (abamectin, doramectin and ivermectin) and milbemycins (moxidectin) in
cattle.
In the development of the method for the determination of residues of quinolones in
salmon using ultra-high performance liquid chromatography associated with tandem mass
spectrometry (UHPLC-MS/MS) different sample preparation procedures based on solid-liquid
extraction and the QuEChERS approach were evaluated.
A method using high performance liquid chromatography with fluorescence detection
(HPLC-FLD) was developed for the determination of antiparasitic residues of the class of
avermectins and milbemycins in bovine muscle. A procedure using pressurized liquid
extraction was optimized for sample preparation.
Both methods were validated based on international protocols and applied in the
analysis of samples of salmon (25) and bovine muscle (23), commercially purchased in the
city of Campinas, SP. While salmon samples did not show positive results for the presence
of quinolone residues, six beef samples showed avermectins residues, but all with values
below the maximum residue limit adopted in Brazil.
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 01
Figura 1.1: Estrutura dos anfenicóis......................................................................................31
Figura 1.2: Estruturas das tetraciclinas.................................................................................31
Figura 1.3: Estruturas de alguns aminoglicosídeos...............................................................32
Figura 1.4: Estruturas de alguns nitrofuranos.......................................................................32
Figura 1.5: Estruturas de alguns compostos β-Lactâmicos...................................................33
Figura 1.6: Estruturas de algumas sulfonamidas representativas.........................................34
Figura 1.7: Alguns representantes dos nitroimidazóis...........................................................34
Figura 1.8a: Quinolonas da 1ª geração.................................................................................35
Figura 1.8b: Quinolonas de 2ª geração (Fluoroquinolonas)..................................................35
Figura 1.8c: Quinolonas tricíclicas........................................................................................36
Figura 1.9: Estruturas de alguns macrolídeo.........................................................................36
Figura 1.10: Diagrama esquemático, proposto pelo JECFA, para estabelecimento de valores
de LMR..................................................................................................................................50
Figura 1.11: Evolução das técnicas utilizadas na determinação de RFV-AOA......................64
Capítulo 03
Figura 3.1: Estrutura básica e exemplos representativos de três gerações de
quinolonas.............................................................................................................................95
Figura 3.2: Resumo esquemático da avaliação do processo de extração...........................120
Figura 3.3: Resumo esquemático de E4 (extração baseada no método QuEChERS
original)...............................................................................................................................120
Figura 3.4: Resumo esquemático da avaliação do processo de clean up...........................121
Figura 3.5a: Cromatograma de íons extraídos obtido por UHPLC-MS/MS (ESI+) no modo
SRM para separação de quinolonas fortificadas em amostra branco de salmão...............127
Figura 3.5b: Cromatograma de íons totais (TIC) de uma amostra branco fortificada a
1x LMR................................................................................................................................127
Figura 3.6: Eficiências de extração dos ensaios E1, E2 e E3............................................................129
Figura 3.7: Cromatogramas típicos obtidos empregando uma amostra branco de
salmão.................................................................................................................................131
Figura 3.8: Curvas analíticas das quinolonas na matriz e respectivos gráficos de resíduos
............................................................................................................................................132
Capítulo 04
Figura 4.1: Estruturas das principais avermectinas estudadas...........................................141
Figura 4.2: Mecanismo da reação de derivatização das avermectinas utilizando ATFA e MI........................................................................................................................................145 Figura 4.3: Dados de eficiência de extração para as avermectinas e milbemicina utilizando-
se diferentes parâmetros de extração no método MSPD/S-PLE........................................176
Figura 4.4: Eficiência de extração para as avermectinas e milbemicina utilizando-se diferentes parâmetros de extração no método MSPD-PLE.................................................178 Figura 4.5: Cromatograma (HPLC-FLD) comparativo de uma amostra branco com uma branco fortificada com as avermectinas e milbemicina estudadas (10 ng g-1)......................181 Figura 4.6: Curvas analíticas na matriz e seus respectivos gráficos de resíduos................184
LISTA DE TABELAS
Capítulo 01
Tabela 1.1: Classificação das substâncias nos grupos A e B de acordo com a Diretiva
96/23/EC...............................................................................................................................28
Tabela 1.2: Valores de algumas propriedades físico-químicas de algumas classes de
fármacos veterinários............................................................................................................30
Tabela 1.3: Procedimentos de extração de RFV-AOA com enfoque nas técnicas
manuais.................................................................................................................................71
Tabela 1.4: Procedimentos de extração de RFV-AOA com enfoque nas técnicas
instrumentais.........................................................................................................................74
Tabela 1.5: Procedimentos de extração de RFV-AOA com enfoque na etapa de clean
up..........................................................................................................................................77
Capítulo 03
Tabela 3.1: Métodos representativos na determinação de quinolonas em AOA..................106
Tabela 3.2: Métodos representativos na determinação de RFV em peixes.........................109
Tabela 3.3: Aplicações representativas do método QuEChERS na determinação de RFV-
AOA.....................................................................................................................................111
Tabela 3.4: Programa do gradiente utilizado na corridacromatográfica.............................116
Tabela 3.5: Intervalo do tempo de retenção (ItR) e parâmetros MS/MS para a detecção das
quinolonas...........................................................................................................................116
Tabela 3.6: Concentrações dos analitos para a construção da curva analítica na matriz branco de
salmão..............................................................................................................................................123
Tabela 3.7: Intervalos de tempo de retenção, razão entre os íons, curvas analíticas,
coeficientes de correlação linear e efeitos matriz.................................................................134
Tabela 3.8: LMR das quinolonas em salmão e resultados da exatidão, precisão
(repetibilidade e precisão intermediária), CCα e CCβ..........................................................136
Capítulo 04
Tabela 4.1: Métodos representativos na determinação de resíduos de avermectinas em
AOA.....................................................................................................................................146
Tabela 4.2: Aplicação de métodos PLE na determinação de RFV-AOA..............................157
Tabela 4.3: Programação do gradiente utilizado na corrida cromatográfica......................164
Tabela 4.4: Otimização e avaliação da etapa de clean up (in situ)....................................167
Tabela 4.5: Parâmetros avaliados para a otimização do método PLE...............................167
Tabela 4.6: Condições e parâmetros utilizados no método PLE........................................168
Tabela 4.7: Concentrações dos analitos para construção da curva na matriz...................170
Tabela 4.8: Tempos de retenção, curvas analíticas na matriz e coeficientes de correlação
linear...................................................................................................................................182
Tabela 4.9: Limites máximos de resíduos das avermectinas e milbemicina em músculo
bovino e resultados de exatidão, precisão (repetibilidade e precisão intermediária), CCα e
CCβ.....................................................................................................................................183
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ABA - Abamectina
ACN – Acetonitrila
AcOEt – acetato de etila
AOXO – Ácido oxolínico
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOA – Alimentos de origem animal
APCI – Ionização química à pressão atmosférica (do inglês Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
API – Ionização à pressão atmosférica (do inglês Atmospheric Pressure Ionization)
APPI – Fotoionização à pressão atmosférica (do inglês, Atmospheric Pressure Photoionization)
ATCA – Ácido tricloroacético
ATFA – Anidrido trifluoracético
C18 – Sílica modificada com hidrocarboneto linear octadecil
CCα – Limite de Decisão
CCβ – Capacidade de Detecção
CE – Eletroforese capilar (do inglês, Capillary Electrophoresis)
CE-LIF – Eletroforese capilar com detecção por fluorescência induzida a laser (do inglês, Capillary Electrophoresis with Laser Induced Fuorescence Detection)
CID – Dissociação induzida por colisão (do inglês, Collision-Induced Dissociation)
CIPRO - Ciprofloxacina
CRM – Material de referência certificado (do inglês, Certified Material
C.U. – Clean up
CV – Coeficiente de variação
DAD – Detecção por arranjo de diodos (do ingles, Diode Array Detection)
DANO - Danofloxacina
d.i. – Diâmetro interno
DORA - Doramectina
EC – Comunidade Europeia (do inglês, European Communities)
EDTA – Ácido etileno diamino tetracético
ELISA - Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay
EMA - Emamectina
ENRO - Enrofloxacina
ESI – Ionização por eletrospray (do inglês, Electrospray Ionization)
ESI (+) – Ionização por eletrospray no modo positivo (do inglês, Electrospray Ionization Positive Mode)
E.M. – Efeito Matriz
FAO – Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (do inglês, Food and Agriculture Organization of the United Nations)
FDA – Administração de Drogas e Alimentos (do inglês, Food and Drug Administration)
FWHM - Resolução definida quando a largura total do pico é medida na metade de sua altura máxima (do inglês, full width of the peak at half its maximum height)
FLD – Detecção por fluorescência (do inglês, Fluorescence Detection)
FLUM - Flumequina
GC – Cromatografia gasosa (do ingles, Gas Chromatography)
GC-ECD – Cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (do inglês, Gas Chromatography with Electron Capture Detection)
GC-MS – Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (do inglês, Gas Chromatography Coupled Mass Spectrometry)
GC-MS/MS – Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas sequencial (do inglês, Gas Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry)
GC-MS-NCI - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas com ionização química de íons negativos (do inglês, Gas Chromatography Coupled Mass Spectrometry - negative chemical ionisation)
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês, High Performance Liquid Chromatography)
HPLC-DAD – Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de diodos (do inglês, High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection)
HPLC-FLD – Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência (do inglês, High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection)
HRMS – Espectrometria de massas de alta resolução (do inglês, High Resolution Mass Spectrometry)
IDA – Ingestão diária aceitável
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
IT – Analisador do tipo armadilha de íons (do inglês, Ion-Trap)
IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada (do inglês, International Union of Pure and Applied Chemistry)
IVER - Ivermectina
JECFA – Comitê de peritos de aditivos alimentares (do inglês, Joint Expert Committee on Food Additives)
Jei – Método dos resíduos padronizados de Jacknife
LC – Cromatografia líquida (do inglês, Liquid Chromatography)
LC-MS – Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (do inglês, Liquid Chromatography coupled Mass Spectrometry)
LC-MS/MS ou LC-MSn – Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (do inglês, Liquid Chromatography coupled Tandem Mass Spectrometry)
LIT – Analisador do tipo armadilha de íons linear (do inglês, Linear Íon Trap)
LM – Lactonas macrocíclicas
LMPR – Limite mínimo de desempenho requerido
LMR – Limite máximo de resíduos
LOD – Limite de detecção
LOQ – Limite de quantificação
MAE – Extração assistida por micro-ondas (do inglês, Microwave Assisted Extraction)
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MARBO - Marbofloxacina
MeOH – Metanol
MI – 1-metil-imidazol
MIP – Polímero de impressão molecular (do inglês, Molecularly-Imprinted Polymer)
MISPE – Extração em fase sólida molecularmente impressa (do inglês, Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction)
MMQO - Método dos Mínimos Quadrados Ordinários
MOXI - Moxidectina
MRM – Monitoramento de reações múltiplas (do inglês, Multiple Reaction Monitoring)
MS – Espectrometria de massas (do inglês, Mass Spectrometry)
MS/MS ou MSn – Espectrometria de massas sequencial (Tandem Mass Spectrometry)
MSPD – Dispersão da matriz em fase sólida (do inglês, Matrix Solid-Phase Dispersion)
n – Número de replicatas
NIP – Polímero não impresso (do inglês, Non-Imprinted Polymer)
NISPE – Extração em fase sólida com polímero não impresso (do inglês, Non-Imprinted Solid-Phase Extraction)
NIST – National Institute of Standards and Technology
NOR – Norfloxacina
OFLO – Ofloxacina
P.I. – Padrão interno
PLE – Extração com líquido pressurizado (do inglês, Pressurized Liquid Extraction)
ppb – partes por bilhão
PSA – Sorvente amina primária-secundária (do inglês, Primary Secundary Amine)
QIT – Analisador do tipo armadilha de íons quadrupolar (do inglês, Quadrupole Íon Trap)
QqQ – Analisador do tipo Triploquadrupolo
QqLIT – Analisador híbrido do tipo quadrupolo associado a um por captura de íons linear (do inglês, Quadrupole-Linear Ion Trap)
QqToF – Analisador híbrido do tipo quadrupolo associado a um por tempo de voo (do inglês, Quadrupole-Time-of-Flight)
QuEChERS – Método de preparo de amostra rápido, fácil, econômico, robusto e seguro (acrônimo do inglês, Quick, Easy, Cheap, Rugged and Safe)
r – Coeficiente de correlação linear
Rec - Recuperação
RFV – Resíduos de fármacos veterinários
RFV-AOA – Resíduos de fármacos veterinários em alimentos de origem animal
RSD – Estimativa do desvio padrão relativo (do inglês, Relative Standard Deviation)
s – Estimativa do desvio padrão absoluto
Sara - Sarafloxacina
SFE – Extração com fluído supercrítico (do inglês, Supercritical Fluid Extraction)
SIM – Monitoramento de íon selecionado (do inglês, Selected Íon Monitoring)
SLE – Extração sólido-liquido (do inglês, Solid-Liquid Extraction)
SPE – Extração em fase sólida (do ingles, Solid Phase Extraction)
S-PLE – Extração seletiva com líquido pressurizado
SRM – Monitoramento de reação selecionada (do inglês, Selected Reaction Monitoring)
TIC – Cromatograma de íons totais (do inglês, Total Ion Chromatogram)
TLC – Cromatografia em camada delgada (do inglês, Thyn-Layer Chromatography)
ToF – Analisador do tipo tempo de vôo (do inglês, Time of Flight)
tR – tempo de retenção
t-SIM-dd – Monitoramento seletivo de íons alvo dependente de dados (do inglês, Target Selected Íon Monitoring Data Dependent)
UHPLC – Cromatografia líquida de ultra alta eficiência (do inglês, Ultra High Performance Liquid Chromatography)
UHPLC-MS/MS – Cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (do inglês, Ultra High Performance Liquid Chromatography coupled Tandem Mass Spectrometry)
UHPLC-ToF - Cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada a um analisador de massas do tipo tempo de vôo (do inglês, Ultra High Performance Liquid Chromatography coupled Time of Flight)
UV – Ultravioleta
v/v – volume/volume
WHO – Organização Mundial de Saúde (do inglês, World Health Organization)
exc. – Comprimento de onda de excitação
emis – Comprimento de onda de emissão
SUMÁRIO
Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES INTRODUTÓRIAS.............................................24
1.1 – Considerações gerais sobre segurança alimentar....................................25
1.2 – Fármacos veterinários na produção animal...............................................26
1.2.1 – Fármacos veterinários: antibióticos e antimicrobianos...........................29
1.2.2 – Fármacos veterinários: características físico-químicas e impacto
ambiental.............................................................................................................................29
1.2.3 – Principais classes dos antimicrobianos....................................................31
i. Anfenicóis.......................................................................................................31
ii. Tetraciclinas....................................................................................................31
iii. Aminoglicosídeos............................................................................................32
iv. Nitrofuranos....................................................................................................32
v. β-Lactâmicos..................................................................................................33
vi. Sulfonamidas..................................................................................................34
vii. Nitroimidazóis.................................................................................................34
viii. Quinolonas.....................................................................................................35
ix. Macrolídeos....................................................................................................36
1.2.4 - Uso, Administração e Mercado de Fármacos Veterinários.........................37
1.2.4.1 – Situação no Brasil..............................................................................38
1.3 – Programas de regulamentação......................................................................39
1.3.1 – Aspectos Regulatórios no Brasil – Programas Nacional de Monitoramento de
Resíduos de Fármacos Veterinários...........................................................................43
1.4 – Aspectos Toxicológicos..................................................................................45
1.4.1 – Ingestão Diária Aceitável (IDA)........................................................................45
1.4.2 – Cálculo do Limite Máximo de Resíduo (LMR)..................................................48
1.4.3 – Período de Carência........................................................................................51
1.5 – Métodos Analíticos para a Determinação de Resíduos de Fármacos
Veterinários.............................................................................................................51
1.5.1 – Preparo de amostra para extração de RFV-AOA.............................................52
1.5.2 – O analito..........................................................................................................52
1.5.3 – Seleção e estocagem da amostra...................................................................53
1.5.4 – Extração do analito da amostra.......................................................................53
1.5.4.1 – Técnicas manuais..................................................................................54
i) QuEChERS...................................................................................................55
ii) Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD)...............................................56
1.5.4.2 – Técnicas instrumentais de extração.......................................................57
i) Extração líquido pressurizado (PLE).............................................................57
ii) Extração assistida por micro-ondas (MAE)...................................................58
iii) Extração com fluído supercrítico (SFE)........................................................59
1.5.5 – Limpeza (clean up) da amostra.......................................................................60
i) Extração em fase sólida (SPE)......................................................................60
ii) Extração em fase sólida dispersiva (d-SPE).................................................61
iii) Polímeros de impressão molecular (MIP)....................................................62
iv) Material de acesso restrito (RAM)................................................................62
1.6 – Separação e Determinação de RFV-AOA....................................................63
1.6.1 – Técnicas de triagem (screening)................................................................65
1.6.1.1 – Métodos baseados em imunoensaios.................................................65
1.6.2 – Métodos confirmatórios..............................................................................66
1.6.2.1 – Técnicas de separação......................................................................67
1.6.2.2 – Técnicas de detecção.........................................................................68
1.7 – Validação de Métodos Analíticos...................................................................80
1.7.1 – Seletividade....................................................................................................80
1.7.2 – Faixa linear da curva analítica e linearidade....................................................81
1.7.3 – Precisão (repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade)..............83
1.7.4 – Exatidão..........................................................................................................84
1.7.5 – Limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ) .............................85
1.7.6 – Efeito matriz....................................................................................................86
1.8 – Considerações introdutórias finais................................................................87
Capítulo 2 – OBJETIVO.................................................................................................88
Capítulo 3 – DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA
DETERMINAÇÃO DE QUINOLONAS EM SALMÃO POR UHPLC-
MS/MS................................................................................................................................90
3.1 – Introdução.............................................................................................................91
3.1.1 – Aquicultura......................................................................................................91
3.1.2 – A produção de salmão, uso de antimicrobianos e seu consumo no Brasil.......92
3.1.3 – Uso de quinolonas na produção animal e na aquicultura.................................94
3.1.4 – Considerações particulares sobre a etapa do preparo de amostra..................97
3.1.4.1 – A análise de resíduos de quinolonas em AOA......................................97
3.1.4.2 – A análise de RFV em peixes................................................................98
3.1.4.3 – O método QuEChERS na determinação de RFV-AOA........................99
3.1.5 – Considerações particulares sobre a etapa de determinação de RFV utilizando
a LC-MS/MS........................................................................................................................101
3.1.5.1 – Métodos de ionização na análise de RFV pela LC-MS/MS................102
3.1.5.2 – Principais analisadores de massas na determinação de RFV............103
3.1.5.2.1 – Espectrometria de massas sequencial (MS/MS)......................104
3.2 - Objetivos .............................................................................................................113
3.3 – Materiais, instrumentos e métodos...................................................................113
3.3.1 – Reagentes, solventes e materiais..................................................................113
3.3.2 – Instrumentação.............................................................................................113
3.3.3 – Amostras selecionadas para o desenvolvimento do método.........................114
3.3.4 – Quinolonas selecionadas..............................................................................114
3.3.5 – Preparo das soluções analíticas....................................................................115
3.3.6 – Otimização das condições no UHPLC-MS/MS..............................................115
3.3.6.1 – Escolha da fase móvel.....................................................................115
3.3.6.2 – Condições de detecção no sistema MS/MS.....................................116
3.3.7 – Avaliação de ensaios de preparo de amostra, baseados no método
QuEChERS, para determinação de quinolonas em amostras de salmão por UHPLC-
MS/MS......................................................................................................................117
3.3.7.1 – Avaliação da presença de sais na etapa de extração.......................117
3.3.7.2 – Avaliação da etapa de clean up.......................................................118
3.3.8 – Validação do método analítico para determinação de quinolonas em
salmão......................................................................................................................122
3.3.8.1 – Seletividade.....................................................................................122
3.3.8.2 – Curva analítica e Linearidade..........................................................122
3.3.8.3 – Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediária) ........................123
3.3.8.4 – Exatidão..........................................................................................124
3.3.8.5 – Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ)............124
3.3.8.6 – Efeito Matriz.....................................................................................125
3.4 – Resultados e discussão.................................................................................125
3.4.1 – Avaliação inicial das etapas do desenvolvimento de método analítico para a
determinação de quinolonas em amostras de salmão.............................................125
3.4.1.1 – Condições iniciais de estudo...........................................................125
3.4.1.2 – Condições cromatográficas.............................................................126
3.4.2 – Avaliação de ensaios de técnicas de preparo de amostra baseadas no método
QuEChERS.............................................................................................................128
3.4.3 – Validação do método analítico para determinação de quinolonas em
salmão......................................................................................................................130
3.4.3.1 – Seletividade...........................................................................................130
3.4.3.2 – Curva analítica, Linearidade e Efeito Matriz...........................................131
3.4.3.3 – Exatidão e Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediária)..............135
3.4.3.4 – Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ)..................135
3.5 - Análise de amostras de salmão.........................................................................137
3.6 – Conclusões parciais.......................................................................................137
Capítulo 4 – DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA
DETERMINAÇÃO DE AVERMECTINAS E MILBEMICINA EM CARNE BOVINA PELA
EXTRAÇÃO LÍQUIDO PRESSURIZADO E QUANTIFICAÇÃO POR HPLC-
FLD.....................................................................................................................................138
4.1 – Introdução........................................................................................................139
4.1.1 – A criação de gado no Brasil e o uso de avermectinas em sua produção….139
4.1.2 – Características gerais, modo de ação e atividades biológicas e toxicológicas
das avermectinas.....................................................................................................140
4.1.3 – Determinação de resíduos de avermectinas em AOA.................................143
4.1.3.1 – A derivatização das avermectinas para análise por HPLC-FLD...........144
4.1.4 – A extração líquido pressurizado (PLE) no preparo de amostras..................151
4.1.4.1 – Considerações iniciais..........................................................................151
4.1.4.2 – Fatores a serem considerados no desempenho de um método PLE...152
a) Estratégias de desenvolvimento e a escolha do solvente de extração.......152
b) Tratamento prévio da amostra.....................................................................153
c) Aspectos e parâmetros da técnica PLE.......................................................154
4.1.4.3 – Métodos utilizando PLE na determinação de resíduos de fármacos
veterinários em alimentos.....................................................................................156
4.2 – Objetivos...........................................................................................................162
4.3 – Materiais, instrumentos e métodos.............................................................162
4.3.1 – Reagentes, Solventes e Materiais Utilizados.................................................162
4.3.2 – Instrumentação.............................................................................................162
4.3.3 – Amostra selecionada para o teste inicial do desenvolvimento do
método......................................................................................................................163
4.3.4 – Avermectinas e milbemicina selecionadas....................................................163
4.3.5 – Preparo das soluções estoque......................................................................163
4.3.6 – Reação de derivatização...............................................................................164
4.3.7 – Método cromatográfico HPLC-FLD...............................................................164
4.3.8 – Preparo de amostra.......................................................................................165
4.3.8.1 – Avaliação e otimização do método PLE para determinação de
avermectinas e milbemicina em carne bovina................................................165
4.3.8.2 – Testes exploratórios para a seleção inicial das condições de operação
do PLE...........................................................................................................165
4.3.8.3 - Otimização do método PLE selecionado com propósito de
validação........................................................................................................167
4.3.8.4 – Procedimento final selecionado para a extração no PLE.................168
4.3.9 – Validação do método analítico.......................................................................169
4.3.9.1 – Seletividade.....................................................................................169
4.3.9.2 – Curva analítica e linearidade............................................................169
4.3.9.3 – Precisão (repetibilidade e precisão intermediária)...........................170
4.3.9.4 – Exatidão..........................................................................................171
4.3.9.5 – Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ)..........171
4.4 – Resultados e discussão.................................................................................172
4.4.1 – Desenvolvimento do método cromatográfico................................................172
4.4.2 – Procedimento de derivatização.....................................................................173
4.4.3 – Preparo de amostra e otimização do procedimento PLE...............................174
4.4.4 – Validação do método analítico.......................................................................180
4.4.4.1 – Seletividade.....................................................................................180
4.4.4.2 – Curva analítica e linearidade............................................................181
4.4.4.3 – Exatidão e precisão (repetibilidade e reprodutibilidade)...................182
4.4.4.4 – Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ). ..........182
4.4.5 – Análise de amostras de carne bovina............................................................185
4.5 – Conclusão.........................................................................................................185
Capítulo 5 – CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................187
Capítulo 6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................191
24
CAPÍTULO 01
Considerações Introdutórias
25
1.1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE SEGURANÇA ALIMENTAR
No decorrer dos últimos anos, assuntos relacionados diretamente a questões que
envolvam segurança alimentar têm assumido papel de destaque em toda a sociedade
mundial, principalmente depois de alarmantes incidentes, bastante noticiados pela mídia em
geral, de episódios como o do escândalo das dioxinas, da encefalopatia espongiforme bovina
(“mal da vaca louca”) e também da gripe aviária. Tais incidentes, juntamente com o
controverso e polêmico assunto sobre produção e consumo de organismos geneticamente
modificados, têm contribuído para que a população mundial se torne cada vez mais
desconfiada e alarmada sobre o tipo de consumo realizado dos mais variados tipos de
gêneros alimentícios (Bizec et al., 2009; Malik et al., 2010).
Em todos os países, sendo os mesmos desenvolvidos ou em desenvolvimento, a
segurança alimentar é tratada como um problema de saúde pública. Alguns exemplos podem
ser citados como preocupantes, como os riscos decorrentes de contaminação
microbiológica, da prática de uso de fertilizantes e promotores de crescimento, da
contaminação por micotoxinas e outros tóxicos alimentares de ocorrência natural, e também
pela presença de resíduos de fármacos veterinários e pesticidas em alimentos (FAO/WHO,
2005).
A contaminação dos alimentos por substâncias químicas potencialmente tóxicas, além
de ser um assunto preocupante de saúde pública, é um grave problema ao comércio
internacional. A contaminação poderá ocorrer através da poluição ambiental do ar, da água
e do solo (ex.: contaminação de alimentos por metais pesados, bifenilas policloradas,
dioxinas) ou mediante uso intencional de algumas substâncias químicas, como pesticidas,
medicamentos de uso veterinário e outros agroquímicos. Outra forma de contaminação pode
ser decorrente do uso de aditivos alimentares, que são substâncias adicionadas
intencionalmente aos alimentos e tem uma função tecnológica. Também é possível que o
alimento sofra contaminação durante a produção, como fabricação, processamento,
transporte e/ou armazenagem (Farré & Barceló, 2013).
Para que haja a proteção da saúde dos consumidores dos riscos associados ao
consumo de contaminantes, muitos países e diversos organismos internacionais têm
elaborado e adotado legislações específicas. Sabe-se que, embora sejam empregadas
milhares de substâncias químicas de uso comum, apenas poucas passaram por uma
avaliação toxicológica, ou seja, muitas permanecem com seus efeitos toxicológicos
desconhecidos (Hird et al., 2014).
26
O presente trabalho irá focar questões referentes ao escopo da segurança alimentar,
onde, de forma mais específica, abordará o tema que versa sobre a presença de resíduos
de fármacos veterinários (RFV) em alimentos de origem animal (AOA).
Embora os microorganismos constituam a principal fonte ameaçadora da segurança
alimentar, de forma relativa, pouco se conhece quando o assunto diz respeito à segurança
relacionada a presença de RFV. Enquanto o processo de pasteurização e outras formas de
tratamentos térmicos podem eliminar microorganismos, esses possuem efeito limitado sobre
a presença dos RFV. O desrespeito das boas práticas veterinárias, como: doses acima das
recomendadas, uso de medicamentos não registrados para a espécie animal em questão,
abate antes do período de carência, e até mesmo a falta de conhecimento sobre o processo
de administração dos mesmos, podem contribuir para a presença de resíduos de fármacos
nos produtos de origem animal acima do valor considerado seguro. Como consequência,
entre outras, podem levar a hipersensibilidade, distúrbios gastrointestinais e desordens
neurológicas do consumidor (Donkor et al., 2011).
Uma importante atribuição da química analítica moderna diz respeito ao provimento
de métodos confiáveis para serem empregados na análise de alimentos para o controle da
qualidade e segurança dos mesmos. Esses métodos devem permitir a identificação, o
monitoramento e a quantificação de seus componentes, bem como de possíveis
contaminantes alimentares, sejam os mesmos de natureza conhecida ou mesmo compostos
recém-descobertos (Wang et al., 2013).
1.2 - Fármacos veterinários na produção animal
Nos alimentos podem estar presentes diversos tipos de contaminantes orgânicos,
podendo sua origem ser de caráter natural ou antropogênica, e os mesmos sendo divididos
em quatro diferentes categorias: pesticidas, contaminantes ambientais persistentes, toxinas
de origem natural e os fármacos veterinários (Marazula & Bogialli, 2009).
No Brasil, produtos da indústria veterinária são definidos pelo Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA), segundo o artigo 2º do Decreto 1.662/95, como:
Entende-se por produto veterinário toda substância química, biológica,
biotecnológica ou preparação manufaturada, cuja administração seja
aplicada de forma individual ou coletiva, direta ou misturada com os
alimentos, destinada à prevenção, ao diagnóstico, à cura ou ao tratamento
das doenças dos animais, incluindo os aditivos, suplementos,
27
melhoradores de produção animal, antissépticos, desinfetantes de uso
ambiental ou equipamentos, pesticidas e todos produtos que, utilizados nos
animais e/ou no seu habitat, protejam, restaurem ou modifiquem suas
funções orgânicas e fisiológicas. Compreendem-se ainda, nesta definição,
os produtos destinados à higiene e ao embelezamento dos animais (MAPA,
1995).
Na prática da criação de animais para consumo humano, fármacos são amplamente
empregados para as mais diversas finalidades, sendo utilizados em extensa escala de
administração. Sua utilização pode se dar como aditivos, tanto na ração como na água de
beber, e também visando o combate, bem como a prevenção de doenças. Seu uso extensivo
e continuado na produção animal, bem como sua administração inadequada, poderá vir
acarretar o risco da presença de resíduos nos alimentos de origem animal, podendo assim
ocasionar efeitos adversos à saúde de seus consumidores. Outro agravante em particular,
decorrente do emprego de antimicrobianos, está relacionado com o desenvolvimento de
cepas bacterianas resistentes, que poderá comprometer a eficácia dos medicamentos
administrados, sabendo-se também do risco em potencial da transferência das referidas
cepas para o homem (Stolker et al., 2007; Freitas et al. 2014).
Resíduo pode ser definido como uma quantidade, a nível de traço, presente em uma
determinada matriz (ex: carne, leite, urina) após algum processo de administração no animal.
Seu nível de concentração poderá situar-se na ordem de ppb (µg kg-1 ou ng g-1) e até mesmo
atingir níveis abaixo desse, podendo chegar a ppt (ng kg-1). Tais resíduos poderão incluir a
presença do fármaco em sua forma original, ou seja, sua forma não metabolizada, bem como
seus metabólitos e/ou conjugados proteicos, podendo ter assim um efeito tóxico direto ou
indireto na saúde dos consumidores (Brabander et al., 2009; Peters et al., 2010).
De acordo com órgãos regulamentadores da União Europeia, as substâncias
envolvidas na determinação de resíduos podem ser divididas em duas principais classes,
sendo elas denominadas de GRUPO A e GRUPO B (Tabela 1.1, pg 28). A classe das
substâncias do GRUPO A diz respeito às substâncias que não possuem limite máximo de
resíduo (LMR) estabelecidos, sendo estas as que possuem efeitos anabólicos e substâncias
não autorizadas ou proibidas. A classe do GRUPO B compreende a das substâncias que
possuem uso autorizado e, dessa forma, possuem LMR estabelecido (Stolker et al., 2007; Reig
& Toldrá, 2008).
28
TABELA 1.1: Classificação das substâncias nos Grupos A e B de acordo com a Diretiva 96/23/EC
(Stolker et al., 2007; Reig & Toldrá, 2008).
Grupo A: Substâncias com efeitos anabólicos e substâncias proibidas
Estilbenos
Agentes antitireoidianos
Esteroides
Lactonas do ácido resorcílico
β-agonistas
Nitrofuranos
Grupo B: Medicamentos veterinários e contaminantes
Substâncias antimicrobianas
- Sulfonamidas
- Quinolonas
Outros medicamentos veterinários
- Anti-helmínticos
- Anticoccidianos
- Carbamatos e piretróides
- Sedativos
- Antiinflamatórios não-esteroidais
- Outras substâncias farmacologicamente ativas
Contaminantes ambientais e outras substâncias
- Compostos organoclorados e organofosforados
- Elementos Químicos
- Micotoxinas
- Agentes secantes
- outros
A ocorrência de RFV em alimentos poderá se dar tanto por seu uso indevido, no caso
de fármacos que não possuam prescrição autorizada, como também por uso impróprio,
situação que se dá por conta da utilização de fármacos com prescrição para outras espécies
animais. Outra forma relaciona-se com a administração de uma excessiva dose e por não se
respeitar o período de carência (Gentili et al., 2005). Uma descrição mais pormenorizada de
tais ocorrências é descrita no item 1.4, no qual é feita a abordagem dos aspectos
toxicológicos relacionados a presença de RFV em alimentos.
29
1.2.1 - Fármacos veterinários: antibióticos e antimicrobianos
Das diversas categorias de FV administrados, a classe dos antimicrobianos tem
preocupado a comunidade científica pela possibilidade da resistência bacteriana. Esses
fármacos têm sido empregados largamente para fins terapêuticos, profiláticos e metafiláticos
e, em alguns países, como promotores de crescimento, muito embora a legislação da União
Europeia (EU) tenha proibido sua utilização para esta prática desde 2006 (Carretero et al.,
2008; Pericás et al., 2010).
Os antibióticos são compostos de origem natural, sendo substâncias de baixa massa
molar produzidos por fungos e bactérias. Esses compostos inibem o crescimento de outros
microorganismos e compreendem cinco classes principais: beta-lactâmicos, tetraciclinas,
macrolídeos, aminoglicosídeos e anfenicóis. No entanto, o termo antibiótico é muitas vezes
utilizado como sinônimo de antimicrobiano, sendo que essa última terminologia
compreenderá as classes dos compostos que possuem tanto a origem de forma natural como
a de origem sintética. As substâncias de origem sintética incluem: sulfonamidas, quinolonas,
nitrofuranos e nitroimidazóis (Gentili et al., 2005).
O uso de antimicrobianos na prática veterinária iniciou-se na década de 1950 com a
administração da oxitetraciclina e da clortetraciclina, como aditivo na ração alimentar. Sabe-
se que nos dias atuais muitos antimicrobianos e diversas classes dos mesmos são
amplamente empregados no combate e na prevenção de enfermidades, sejam de origem
infecciosa ou não-infecciosa (Corcia & Nazzari, 2002).
1.2.2 - Fármacos veterinários: características físico-químicas e impacto
ambiental
Outro assunto um tanto importante, porém, não abordado de forma aprofundada
nesse trabalho, também relacionado como questão de saúde pública, diz respeito à
disseminação de fármacos veterinários no meio ambiente, podendo os mesmos vir
contaminar água, ar e solo, bem como organismos terrestres e aquáticos. Uma vez presente
no ambiente, diversos tipos de processos físicos, químicos e biológicos irão regular o
comportamento e o destino dos fármacos veterinários, sendo estes processos regidos pelas
propriedades físico-químicas do fármaco (estrutura molecular, tamanho, solubilidade, por
exemplo) e do solo. Os fármacos veterinários caracterizam-se por serem moléculas
anfóteras, possuírem vários grupos funcionais ionizáveis (diferentes valores de pKa), ampla
faixa de valores de massas molares, baixos potenciais de volatização (constante de Henry <
30
4,1 x 10-8 Pa m3 mol-1; pressão de vapor < 1,1 x 10-11 mmHg). Quando comparados aos
pesticidas, classe mais estudada em relação ao comportamento ambiental, os fármacos
veterinários possuem maiores valores de solubilidade em água e menores valores de
coeficiente de partição octanol-água (log Kow) (Regitano & Leal, 2010; Pereira et al., 2012).
Tabela 1.2: Valores de algumas propriedades físico-químicas de algumas classes de
fármacos veterinários (Baseado em Regitano & Leal, 2010)
Classe Massa molar (g mol-1)
Solubilidade em água (mg L-1)
log Kow pKa (a 25 ºC)
Constante de Henry (Pa m3 mol-1)
Pressão de vapor
(mm Hg)
Tetraciclinas 444,5 a 527,6
230 a 52000 -1,3 a 0,05 3,3/7,7/9,3 1,7 x 10-23 a 4,8 x 10-22
1,6 x 10-28 a 6,3 x 10-30
Sulfonamidas 172,2 a 300,3
7,5 a 1500 -0,1 a 1,7 2 a 3 /
4,5 a 10,6 1,3 x 10-12 a
1,8 x 10-8 1,1 x 10-11 a 3,6 x 10-11
Aminoglicosídeos 332,4 a 615,6
10 a 500 -8,1 a -0,8 6,9 a 8,5 8,5 x 10-12 a
4,1 x 10-8 1,6 x 10-28
β-Lactâmicos 334,4 a 470,3
22 a 10100 0,9 a 2,9 2,7 2,5 x 10-19 a 1,2 x 10-12
1,7 x 10-18 a 1,2 x 10-19
Macrolídeos 687,9 a 916,1
0,45 a 15 1,6 a 3,1 7,7 a 8,9 7,8 x 10-36 a 2,0 x 10-26
n.i.
Fluoroquinolonas 229,5 a 417,6
3,2 a 17790 -1,0 a 1,6 8,6 5,2 x 10-17 a
3,2 x 10-8 2,1 x 10-13 a 8,4 x 10-14
n.i.: não informado.
Embora a análise de RFV-AOA tenha se mantido em foco, por programas de
monitoramento de agências de diversos países que praticam a importação e a exportação
de alimentos, sabe-se ter ocorrido um aumento no interesse pela investigação dos impactos
ambientais exercidos pela presença destes resíduos. Uma vez administrado aos animais,
sabe-se que muitos dos fármacos não são completamente absorvidos pelo organismo,
podendo os mesmos serem excretados, em sua forma original ou como metabólitos, na urina
ou pelas fezes. Dessa forma, boa parte da dose administrada do fármaco poderá ser
excretada no meio ambiente, sendo que a taxa de excreção irá depender, dentre vários
fatores, das propriedades físico-químicas do fármaco utilizado. Consequentemente, grandes
quantidades das referidas substâncias passam a ser inseridas no ambiente, fazendo com
que sua dispersão seja alcançada por várias vias de entrada no mesmo (Doretto, 2012).
31
1.2.3 – Principais classes dos antimicrobianos
i) ANFENICÓIS - O cloranfenicol, um composto que possui um grupo nitro-benzeno em sua
estrutura (Figura 1.1), é uma substância altamente eficaz atingindo um abrangente espectro
antimicrobiano. O mesmo teve seu uso proibido como fármaco veterinário em animais que
seriam destinados ao consumo humano depois que estudos demonstraram reações
adversas e efeitos colaterais em seres humanos. Dessa forma, foram desenvolvidos o
tianfenicol e o florfenicol (Figura 1.1), dois compostos de estruturas bastante similares, onde
se substituiu o grupo nitro, presente no anel aromático do cloranfenicol, pelo grupo metil-
sulfona, sendo que essa mudança estrutural tanto levou a um aumento de eficácia dos
compostos quanto a uma diminuição em suas toxicidades (Corcia & Nazzari, 2002; Gentili et
al., 2005).
Figura 1.1: Estrutura dos anfenicóis.
ii) TETRACICLINAS - Classe de antimicrobianos com amplo espectro de atuação contra
bactérias gram-positivas e gram-negativas, possuindo como característica seu baixo custo,
tornando-a assim bastante empregada tanto na prevenção como no tratamento de diversos
tipos de enfermidades. As estruturas das tetraciclinas (Figura 1.2) diferem entre si
basicamente pelo padrão de substituição em R1, R2, R3 e R4. Das oito tetraciclinas
disponíveis comercialmente, as quatro apresentadas na Figura 1.2 são as mais empregadas
em animais que serão destinados ao consumo humano.
OH O OHOH
O
NH2
OH
O
NCH3CH3
H
R4R3
R2R1
Tetraciclina Clortetraciclina Doxiciclina Oxitetraciclina
R1 = -H
R2 = -CH3
R3 = -OH
R4 = -H
R1 = -Cl
R2 = -CH3
R3 = -OH
R4 = -H
R1 = -H
R2 = -H
R3 = -CH3
R4 = -OH
R1 = -H
R2 = -CH3
R3 = -OH
R4 = -OH
Figura 1.2: Estruturas das tetraciclinas (Corcia & Nazzari, 2002).
O
N+
O
O-
NH
Cl
OHOH
Cl
O
NH
S
OO
CH3
OH
F
Cl
Cl
S
OO
CH3
OH
OH
O
NH
Cl
Cl
TianfenicolFlorfenicolCloranfenicol
32
iii) AMINOGLICOSÍDEOS - Classe de antimicrobianos que apresenta dois ou três amino-
açúcares unidos por uma ligação glicosídica (Figura 1.3). Possuem natureza básica devido
aos grupos amino e uma alta solubilidade em água por conta dos grupos hidroxila. São ativos
contra uma ampla faixa de bactérias gram-positivas e gram-negativas (Corcia & Nazzari,
2002; Gentili et al., 2005; Pereira et al., 2012).
Figura 1.3: Estruturas de alguns aminoglicosídeos (Corcia & Nazzari, 2002; Gentili et al., 2005;
Pereira et al., 2012).
iv) NITROFURANOS – São antimicrobianos que possuem em sua estrutura um grupo nitro
ligado a um furano (Figura 1.4) e que tiveram seu uso proibido em decorrência dos efeitos
mutagênico e carcinogênico. Não obstante, alguns países asiáticos ainda fazem uso dos
mesmos, uma vez que foram constatados resíduos destes antimicrobianos em produtos
oriundos da atividade aquícola e em alguns tipos de carnes (Corcia & Nazzari, 2002; Gentili
et al., 2005).
Figura 1.4: Estruturas de alguns nitrofuranos.
CH3
O
CH3O
H
OH
OO
OH
OH
OH
NH
O
OH
OH
N
NH2
NH2
OH
N
NH2
NH2
Espreptomicina
O
OOH
OH
NH
CH3
CH3 NH2NH2
OH
O
O
O
NH2
NH2
CH3
Gentamicina
OOH
OH
O
OHO
OH
O
ONH2
OH
OH
NH2
O
NH2
NH2
OH
NH2
R2
R1
N
NH2NH2
OH
N
NH2
NH2
OH OH
O
O
CH3
OH
OH
O
O
OH
OH
OHNH
CH3
Dihidro-Espreptomicina
R1 R2
Neomicina B -CH2NH2 -H
Neomicina C -H -CH2NH2
Neomicina
ON
+-O
O
N
N
OOfuralizodona
ON
+-O
O
N
N
NH
O
O
ON
+-O
O
N
NH
NH2Onitrofurantoína nitrofurazona
33
S
N R3
O R2
O
H H
NHR1
OCefalosporina
v) β-LACTÂMICOS - Conjunto de antimicrobianos que compreende diversos compostos,
sendo os mais representativos a família da penicilina e a da cefalosporina (Figura 1.5). A
ocorrência de um anel de quatro membros em suas estruturas confere aos mesmos certa
instabilidade, tanto frente a temperatura como na presença de solventes orgânicos, como
álcoois. Ainda, podem sofrer isomerização em meio ácido. Diante destas características, se
faz necessário a tomada de certas precauções na hora de se realizar a análise destes
compostos a nível de resíduos. Os antimicrobianos β-lactâmicos são amplamente utilizados
no combate às infecções bacterianas causadas tanto por organismos gram-positivos como
por organismos gram-negativos (Corcia & Nazzari, 2002; Gentili et al., 2005; Niessen, 1998;
Pereira et al., 2012).
Figura 1.5: Estruturas de alguns compostos β-lactâmicos.
R1 R2
Amoxicilicina OH CH
NH2 -OH
Cloxacilicina
Cl
O
NCH3
-OH
Penicilina G CH2
-OH
Ampicilina CH
NH2 -OH
R1 R2 R3
Cefalexina CH
NH2 -OH -H
Cefazolina
N
N
N
N
CH2
-OH
S
N N
CH3S
Ceftiofur
N
S
NH2N O
CH3
-OH
O
S
O
Cefapirina N S CH2
-OH
CH3
O
O
N
SCH3
CH3
HO
R1O
HH
NH
O
R1
Penicilina
34
vi) SULFONAMIDAS - Classe de antimicrobianos compreendida por um grande número de
compostos de origem sintética. Consistem de um anel benzeno, um grupo amina e um grupo
sulfonamida (Figura 1.6). Tem sido amplamente administrados na prática veterinária,
principalmente por seu baixo custo e amplo espectro de ação bacteriana (Gentili et al., 2005;
Niessen, 1998).
Figura 1.6: Estruturas de algumas sulfonamidas representativas.
vii) NITROIMIDAZÓIS – Compostos heterocíclicos derivados do imidazol por possuírem um
grupo nitro ligado ao mesmo, são antimicrobianos ativos contra a maioria das bactérias
anaeróbicas gram-negativas e muitas gram-positivas, porém possuem limitada atividade
contra bactérias aeróbias. Os nitroimidazóis possuem propriedades tóxicas, mutagênicas e
carcinogênicas, fazendo com que vários deles tenham seu uso proibido na produção animal
(Corcia & Nazzari, 2002; Gentili et al., 2005).
Figura 1.7: Alguns representantes dos nitroimidazóis.
COMPOSTO -R COMPOSTO -R
Sulfadiazina N
N
Sulfamonometoxina
N
N
OCH3
Sulfapiridina N
Sulfametoxazol N
O
CH3
Sulfamerazina
N
N
CH3
Sulfaquinoxalina
N
N
Sulfametazina N
N
CH3
CH3
Sulfadimetoxina N
N
OCH3
OCH3
Sulfamoxol
N
O
CH3
CH3 Sulfacetamida
CH3
O
N
N
O2N
CH3
CH3 N
N
NO2CH3
OH
NN
O2N
CH3
SCH3
OO
dimetridazol metronidazol tinidazol
NH2 S NH R
O
O
35
viii) QUINOLONAS - Antimicrobianos que possuem atividade contra bactérias gram-
positivas e gram-negativas, atuando na inibição da enzima DNA-girase, fundamental na
replicação do DNA. Seu amplo uso no sistema de produção animal tornou-se bastante
preocupante devido evidência de que os mesmos promoveriam o aumento da resistência
bacteriana (Corcia & Nazzari, 2002; Gentili et al., 2005). Uma descrição mais detalhada,
incluindo características de estrutura e atividade das quinolonas, encontra-se realizada no
Capítulo 03.
Figura 1.8a: Quinolonas da 1ª geração.
Figura 1.8b: Quinolonas de 2ª geração (fluoroquinolonas).
Fluoroquinolonas
Compostos R1 G R2
Norfloxacina CH2 CH3 CH NHN
Enoxacina CH2 CH3 N NHN
Danofloxacina F
CH NN CH3
Enrofloxacina
CH NN CH3
Ciprofloxacina
CH NHN
Difloxacina F
CH NN CH3
Sarafloxacina F
CH NHN
N N
O
OH
O
ácido nalidíxico
N N
O
OH
O
O
O
ácido oxolínico
N
N
N
O
OH
O
O
O
cinoxacina
G N
O
R2
R1
OH
O
F
36
Figura 1.8c: Quinolonas tricíclicas.
ix) MACROLÍDEOS - Os macrolídeos constituem uma classe de lactonas
macrocíclicas isoladas de microorganismos Streptomyces spp. Seus compostos
macrocíclicos são constituídos por anéis de 12, 14 e 16 membros, sendo que unidades
glicosídicas são encontradas nos mesmos podendo as mesmas serem constituídas por
amino-açúcares. São amplamente utilizados na medicina veterinária para o tratamento de
enfermidades respiratórias e no tratamento a outros tipos de infecções em bovinos, ovinos e
suínos (Corcia & Nazzari, 2002; Gentili et al., 2005; Pereira et al., 2012).
Figura 1.9: Estruturas de alguns macrolídeos.
Quinolonas Tricíclicas
N
YG
OH
OO
F
R1
CH3
Compostos G Y R1
Flumequina CH2 CH H
Marbofloxacina O N
NN CH3
Ofloxacina O CH NN CH3
O
OCH3
O
OH
H3CO
O
O
OH
N
CH3 CH3
CH3
O
CH3
OH
OH
CH3
OH
CH3
O
CH3
N
CH3
CH3
Espiramicina
O
CH3
O
OH
CH3
O
O
CH3
OH
OH
CH3
CH3
O
CH3
O
CH3
CH3
O
OH
CH3
OH
CH3
N
CH3CH3
Eritromicina
O
O
O
O
CH3 OH
CH3
O
O
OCH3
OCH3
O
H
OH
CH3H
CH3
OCH3
OCH3
CH3
N
CH3
CH3OH
Josamicina
O
NHN
SCH3
OH
OH
OH
H
CH3OH
HOCH3
CH3
Lincomicina
37
1.2.4 – Uso, administração e mercado de fármacos veterinários
A indústria de saúde animal responsabiliza-se pela manutenção e produtividade dos
diversos tipos de rebanhos à nível mundial, assegurando também a sanidade e a abundância
dos alimentos produzidos. Não obstante, a mesma também é responsável pelo provimento
da saúde e do bem-estar de animais domésticos - segmento pet (Capanema et al., 2007).
O mercado mundial de produtos veterinários vem notabilizando-se por apresentar um
grande desenvolvimento, acarretado pelo expressivo crescimento na demanda por
medicamentos especializados, tendo atingido a marca dos US$ 22,5 bilhões em 2012, e
assinalando um crescimento médio de 8% ao ano (IPD-Farma, 2014).
Os produtos farmacêuticos de uso veterinário poderão ser agrupados de acordo com
sua classe farmacêutica em biológicos, fármacos e suplementos nutricionais, onde poderão
ser direcionados tanto aos grandes animais (ruminantes, equídeos, suínos e aves de
produção) como aos pequenos animais (caninos, felinos, aves ornamentais e roedores)
(Capanema et al., 2007).
A indústria mundial de saúde animal constitui um organismo em contínuo
aprimoramento e possui como característica a necessidade de adaptação junto ao meio em
que se encontra inserida. Ela deverá, ainda, estar em conformidade com alguns requisitos,
como, por exemplo, necessidades do consumidor, capacidade de se adequar às rápidas
exigências industriais, ser facilmente acessível e possuir alta qualidade e, também, prestar
a devida atenção às necessidades locais específicas. Preocupações relacionadas com a
segurança alimentar têm pressionado os fabricantes de medicamentos veterinários para que
cumpram as normas de qualidade cada vez mais exigentes. Uma atenção vem sendo dada
semelhante ao que foi visto no desenvolvimento da indústria farmacêutica destinada a
produção de fármacos de uso humano, sendo que este fato veio acarretar mudanças nos
aspectos regulatórios tanto dos países desenvolvidos quanto dos países com economias
emergentes (Mukherjee, 2015).
Dois modelos de empresas caracterizam a indústria de medicamentos veterinários –
as grandes químico-farmacêuticas internacionais, que atuam a nível mundial e que
interagem com empresas regionais de pequeno porte, estas tornando-se seguidoras das
primeiras que se caracterizam pelos processos de inovação. As interações de abertura para
com as pequenas empresas nacionais se dão por conta da diferença entre o padrão de
distribuição de espécies animais e a ocorrência de problemas sanitários e nutricionais
38
inerentes a cada país. Tal modelo de interação se dá sem que ocorram conflitos de interesse
com as grandes companhias internacionais (Capanema et al., 2007).
Quando se fala em evolução de produtos deve-se levar em consideração suas
realidades a nível regional, pois a devida evolução a ocorrer na indústria veterinária deverá
ser avaliada pelas demandas locais. Isso por conta de existirem diversas variações das
legislações, situações relacionadas com os aspectos geográficos do meio, requisitos
específicos para certas espécies, presença de patentes e genéricos, bem como o poder de
compra e a economia que estabelecerão a utilização de eventuais produtos numa dada
região (Mukherjee, 2015).
Entre as classes terapêuticas, o grupo dos agentes biológicos (produtos terapêuticos
obtidos com base em organismos vivos: soros, vacinas, antígenos) constitui a classe de
produtos que mais cresce a nível mundial, o que é decorrente da maior conscientização e
preferência de uso das vacinas em relação aos antimicrobianos. Em seguida, surgem os
aditivos para alimentação animal (vitaminas, aminoácidos, enzimas, etc.). Os
antimicrobianos têm sido comumente utilizados em todo o mundo, porém sua procura tem
diminuído em países desenvolvidos devido a pressões regulatórias. Não obstante, se sabe
que países em desenvolvimento ainda fazem bastante uso, devido tanto ao aumento no
número de animais em suas produções como também devido aos deficientes aspectos em
suas regulamentações e fiscalizações. A classe dos antiparasitários é, principalmente,
consumida por economias produtoras de gados e suínos, como a América Latina e China,
porém sua procura sempre depende das condições climáticas ou dos surtos de doenças
(Mukherjee, 2015).
1.2.4.1 – Situação no Brasil
Em termos mundiais, o Brasil constitui um dos cinco maiores mercados veterinários,
onde o crescimento se dá principalmente devido ao aumento de exportações de produtos
veterinários e de alimentos de origem animal, uma fiscalização sanitária mais criteriosa e
exigente frente o comércio a nível interno ou externo, e uma melhor tomada de consciência
de criadores para que seus rebanhos sejam mantidos saudáveis. Detentor do maior rebanho
bovino mundial e principal exportador de carne dessa categoria, preocupações e interesses
existem, por parte de produtores, para que haja o aumento de sua produtividade, no qual
fatores, como aceleração do ganho de peso e menor tempo para que ocorra o processo de
abate do animal, tornam-se de suma importância. No contexto dos medicamentos
39
veterinários, os produtos biológicos ou vacinas têm papel de destaque (30% do mercado
veterinário), entre essas as destinadas para combate da febre aftosa (Capanema et al.,
2007).
Em levantamento realizado por Rath e colaboradores, em junho de 2014, segundo o
Compêndio de Produtos Veterinários, publicado pelo Sindicato Nacional da Indústria de
Produtos para Saúde Animal (SINDAN), existem 108 diferentes empresas detendo um
número de 2.696 produtos veterinários com licença vigente, no qual se observa o expressivo
número de indústrias instaladas no país, concentradas principalmente no estado de São
Paulo (Rath et al., 2015).
No Brasil, algumas das grandes indústrias farmacêuticas vêm ampliando sua atuação
passando a atingir o segmento de saúde animal, uma vez que a cadeia produtiva da indústria
veterinária é bastante semelhante à humana frente à incorporação de novas tecnologias,
principalmente em fase de pesquisa e desenvolvimento (P&D). O aprimoramento de novos
medicamentos e formulações relacionam-se intimamente com a fabricação de produtos
biotecnológicos, com ênfase aos medicamentos antiparasitários, biológicos e hormonais,
devido principalmente à pouca renovação no setor, havendo a necessidade de inovações
em veículos, combinações ativas, fármacos recombinantes, etc. (IPD-Farma, 2014).
1.3 – PROGRAMAS DE REGULAMENTAÇÃO
Quadros que regulamentam a presença de resíduos de antimicrobianos em alimentos
que serão destinados ao consumo humano, compreendem um conjunto de componentes
que tendem a atuar de forma integral em programas de segurança alimentar a serem
adotados em todo o mundo. Métodos analíticos utilizados no monitoramento de insumos
farmacêuticos são de fundamental importância na proteção da saúde humana e animal, no
monitoramento dos níveis de exposição dos consumidores, na minimização de impactos
ambientais e, também, no apoio e na execução de leis e regulamentações que facilitem o
comércio internacional (Bizec et al., 2009).
O desenvolvimento e validação de um método analítico, visando assegurar testes que
permitam a determinação de resíduos e contaminantes em alimentos, para que seja
implementado de forma confiável, deverá se apoiar em um quadro legislativo que considere
os diversos tipos de exigências da área. Tal quadro deverá levar em conta:
i) Planos de monitoramento e amostragem;
40
ii) Definição de valores dos limites máximos de resíduos (LMR), para as substâncias
que possuam uso regulamentado, e dos limites mínimos de desempenho requeridos
(LMPR), para os procedimentos testes visando a detecção de compostos de uso
proibido; e
iii) Características de desempenho do método analítico (Malik et al., 2010).
O quadro panorâmico que versa sobre a legislação em segurança alimentar não se
mostra em integral harmonia no cenário mundial, existindo assim, organismos internacionais
que se responsabilizam pela elaboração e o estabelecimento de normas que visam a
proteção da saúde humana, em decorrência dos riscos associados à presença de
contaminantes alimentares. Das organizações internacionais existentes, o Codex
Alimentarius é o que possui maior representatividade no contexto legislativo mundial, sendo
o mesmo um Programa Conjunto da Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a
Alimentação (FAO, do inglês Food and Agriculture Organization of the United Nations) e da
Organização Mundial de Saúde (WHO, do inglês World Health Organization). O Codex
Alimentarius constitui um instrumental de referência para produtores, consumidores e
indústrias alimentícias, servindo, ainda, de ponto articulador para que as devidas agências
nacionais elaborem seus programas legislativos, bem como também como documento
mediador no comércio internacional de alimentos (Malik et al., 2010; Paschoal et al., 2008;
Marazuela & Bogialli, 2009).
A Comunidade Europeia (CE), por ser um dos maiores importadores de alimentos do
mundo e por tratar o assunto da segurança alimentar como uma questão de prioridade
nacional, exerce papel decisivo nos tipos de testes executados e, também, na elaboração de
quadros legislativos que dizem respeito ao referido assunto. Também possui função
determinante na implementação de normas cada vez mais rigorosas em se tratando da
importação de alimentos produzidos em outros países. De forma bastante estabelecida, a
CE exerce o controle do uso de fármacos veterinários mediante a publicação de diferentes
documentos regulamentadores (Malik et al., 2010).
Na CE, fármacos veterinários são regulamentados de acordo com a Diretiva
2001/82/EC, sendo que cada novo fármaco veterinário deverá ser avaliado por sua
qualidade, segurança e eficácia antes de sua devida aprovação pela autoridade competente.
Cada substância farmacologicamente ativa deverá ser avaliada toxicologicamente antes que
seja registrada para uso em animais produtores de alimentos, sendo seu processo de
avaliação estabelecido pelo Regulamento 2377/90/EC. Neste documento são descritos
41
procedimentos para o estabelecimento de valores de LMR abrangendo quatro anexos, aos
quais contemplam:
Anexo I - substâncias que possuem valores de LMR estabelecidos;
Anexo II - substâncias as quais não se considera necessário o
estabelecimento do LMR;
Anexo III - substâncias com valores de LMR provisórios; e
Anexo IV - substâncias nas quais valores de LMR não foram possíveis
de se estabelecer, possuindo uso proibido (Sanders, 2007).
A Diretiva 96/23/EC permite avaliar regularmente o controle de resíduos de acordo
com as boas práticas de uso veterinário e visa também que sejam detectados e
regulamentados possíveis desvios de uso de fármacos veterinários. Essa diretiva
regulamenta o controle de resíduos de substâncias farmacologicamente ativas como
contaminantes ambientais, corantes, elementos químicos, etc., em animais vivos e produtos
de origem animal. Este documento divide todos os resíduos em compostos do Grupo A,
compreendendo as substâncias de uso proibido, e compostos do Grupo B, classe onde estão
incluídos todos os fármacos veterinários registrados de acordo com os anexos I e III (Tabela
1.1, pg 28). O mesmo documento também estabelece programas nacionais para o
monitoramento de resíduos (Sanders, 2007).
Duas diretivas do Conselho da Comunidade Europeia - 96/22/EC e 96/23/EC - fazem
a previsão do uso proibido dos agentes promotores de crescimento (Bizec et al., 2009).
Os LMR de fármacos veterinários são referenciados pela Comissão do Codex
Alimentarius, segundo recomendações do Comitê de Peritos em Aditivos Alimentares
(JECFA, do inglês Joint Expert Committee on Food Additives) da FAO/OMS (WHO, 2006).
Uma descrição mais detalhada sobre o processo de estabelecimentos de valores de LMR é
descrita no item 1.4, que faz a abordagem dos aspectos toxicológicos de RFV em alimentos
de origem animal.
A CE, mediante a Diretiva 2002/657/EC, possui um dos principais documentos para
consulta do quadro legislativo que versa sobre a determinação de RFV em alimentos de
origem animal. Estas consultas são de fundamental importância por parte de laboratórios
encarregados de executarem as análises. A referida diretiva estabelece critérios de
desempenho e outras exigências referentes às técnicas de separação e detecção, seja para
métodos de triagem ou para métodos confirmatórios. Tal protocolo recomenda o uso de
Material Certificado de Referência (CRM), sempre que disponível, para propósitos de
42
validação e garantia da qualidade do método analítico. A mesma diretiva ainda estabelece a
inadequação de um método fazendo uso somente da análise cromatográfica, sem a detecção
pela espectrometria de massas (MS), para fins de confirmação de identidade (Gentili et al.,
2005; Zeleny et al., 2006).
Seguindo os critérios definidos pela CE, (Diretiva 2002/657/EC), todos os métodos
analíticos para o controle de resíduos de fármacos veterinários em alimentos de origem
animal, devem ser validados em termos de seletividade, linearidade, exatidão, precisão e
reprodutibilidade. No entanto, os conceitos dos limites analíticos convencionalmente
conhecidos – limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) - são agora
substituídos pelos termos Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ). Um
novo conceito é ainda introduzido, denominado Limite Mínimo de Desempenho Requerido
(LMPR), ao qual se refere a menor quantidade do analito numa amostra que poderá ser
detectado e confirmado (Marazuela & Bogialli, 2009). Uma melhor descrição destas figuras
de mérito é realizada no item 1.7, que trata dos aspectos relacionados à validação do método
analítico.
O mesmo quadro legislativo (Diretiva 2002/657/EC) ainda introduz, como exigências
adicionais para que se obtenha métodos confirmatórios e identificações inequívocas, o
conceito de Pontos de Identificação (IP, do inglês, Identification Points), sendo que no
decorrer de uma análise confirmatória um número mínimo e específico de IP deve ser
adquirido. Para a confirmação de identidade de um analito listado no Grupo B, grupo ao qual
os antimicrobianos são pertencentes, é necessário um mínimo de três IP, e para substâncias
listadas no Grupo A, grupo ao qual pertencem as substâncias banidas, se faz necessário um
mínimo de quatro IP. O número de IP que deverá ser obtido durante uma análise química
dependerá do tipo de técnica a ser utilizada, sendo que em um espectrômetro de massas
com um analisador de baixa resolução (ex: Triplo Quadrupolo ou Ion Trap) será fornecido
1,0 IP para o íon percursor e 1,5 IP para o íon fragmento, sendo que duas transições no
modo MRM (do inglês, Monitoring Multiple of Reactions) fornecerão quatro IP. Em se tratando
de um analisador de massas de alta resolução (ex.: ToF, Orbitrap), no qual é capaz de
fornecer uma alta exatidão de massas, devem ser obtidos 2 IP para o íon percursor e 2,5 IPs
para o íon fragmento (Gentili et al., 2005).
Uma das vantagens em seguir o referido quadro regulamentador (Diretiva
2002/657/EC) é que, contrastando com outras áreas de controle e fiscalização de alimentos,
não existe uma obrigatoriedade em se utilizar um método oficial para o controle de
remanescentes residuais em alimentos de origem animal. Dessa forma, são aplicados
43
critérios de aproximação aos quais são definidas características de desempenho e limites
que deverão ser obtidos pelo método utilizado, tendo essa aproximação a alta flexibilidade
como principal vantagem, permitindo que métodos analíticos se ajustem rapidamente a
novos desenvolvimentos técnicos, oferecendo a chance do mesmo se adequar rapidamente
a um possível problema emergente - ex.: análise da combinação matriz/analito que ainda
não tenha sido considerada (Stolker & Brinkman, 2005).
1.3.1 – Aspectos Regulatórios no Brasil – Programa Nacional de
Monitoramento de Resíduos de Fármacos Veterinários
No Brasil, no que diz respeito à área de análise de resíduos e contaminantes em
alimentos, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por intermédio da
Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) e da Coordenação Geral de Apoio Laboratorial
(CGAL), tendo em vista a necessidade de possuir um documento contendo orientações
cientificamente consolidadas e harmonizadas, tanto para atender os aspectos regulatórios
nacionais, bem como às crescentes requisições por parte de importadores de nossos
alimentos pela qualidade de resultados analíticos, elaborou e publicou o Manual de Garantia
da Qualidade Analítica. Tal documento visa fornecer um referencial conceitual de critérios
analíticos que sejam observados pelos laboratórios da Rede Nacional de Laboratórios
Agropecuários que proporcionem serviços ao Plano Nacional de Controle de Resíduos e
Contaminantes (PNCRC) em produtos de origem animal e vegetal. O mesmo documento não
se restringe somente aos laboratórios que prestem os citados serviços, mas se estende
também a diversas áreas de atividades laboratoriais analíticas (MAPA, 2011).
A nível nacional, tratando-se de programas responsáveis pelo monitoramento da
presença de RFV em alimentos de origem animal, pode-se falar que no Brasil existem dois
tipos - o primeiro, diz respeito ao Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes
(PNCRC), coordenado pelo MAPA; e o segundo referindo-se ao Programa de Análise de
Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos (PAMVet), coordenado pela ANVISA
(ANVISA, 2005; MAPA, 2016b).
PNCRC/MAPA – o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes em
Produtos de Origem Animal foi instituído pela Portaria nº 51, de 06/05/1986, sendo
sua adequação realizada pela Portaria nº 527, de 15/08/1995. O programa visa
garantir a saúde do consumidor por meio do monitoramento da presença de resíduos
44
de medicamentos veterinários e contaminantes ambientais em produtos de origem
animal (carne, leite, pescado e mel). Um de seus principais objetivos é integrar o
esforço destinado à melhoria da produção animal e da qualidade dos alimentos
provenientes dos mesmos e dispostos ao consumo da população brasileira. De forma
secundária, visa proporcionar ao país condições de adequações sanitárias, tendo em
vista atender as regras do comércio internacional de alimentos, preconizados pela
Organização Mundial do Comércio (OMC) e órgãos como a FAO e a OMS. Suas
principais metas refletem a verificação do uso correto e seguro dos fármacos
veterinários, em acordo com as boas práticas de uso recomendadas e das tecnologias
empregadas nos processos de incremento da produtividade pecuária. Suas ações
baseiam-se no sentido de se reconhecer e evitar violações nos níveis de segurança
ou dos LMR de substâncias com uso autorizado, ou da ocorrência de algum nível de
resíduos de compostos de uso proibido no país. As amostras sob monitoramento do
programa são coletadas de acordo com o plano de amostragem recomendado pelo
comitê Codex Alimentarius, sendo publicado pelo MAPA, de forma anual no Diário
Oficial da União, o número de amostras previstas para serem analisadas pelo
programa. As mesmas passam a ser coletadas por fiscais agropecuários federais sob
o Serviço de Inspeção Federal e levadas para análise em laboratórios oficiais
credenciados pelo MAPA e acreditados pelo INMETRO (Pacheco-Silva et al., 2014;
Prestes et al., 2013; Friggi, 2012).
PAMVet/ANVISA – o Programa de Análise de Resíduos de Medicamentos
Veterinários em Alimentos de Origem Animal, sob a coordenação geral da ANVISA,
foi iniciado em 2002, tendo sido fruto de recomendações originárias de um fórum de
discussão promovido por esse órgão em 2000 e 2001. Sua criação oficial se deu
mediante a publicação da RDC nº 253, de 16/09/2003. Seu início teve como visão
duas linhas de monitoramento – uma com ênfase à presença de resíduos e a outra
com enfoque na questão da resistência bacteriana. Tal programa trata-se de uma
ação que visa complementar as ações de controle já exercidas pelo MAPA, porém
preocupando-se em avaliar o alimento no momento do consumo, tal como é
apresentado ao consumidor, não obstante, se conhecer a origem de tal problema
encontrando-se ainda no campo, devido a não observância das Boas Práticas de Uso
Veterinário. O mesmo programa possui como meta global avaliar, de forma gradativa,
resíduos de fármacos veterinários em leite bovino, carne (frango, bovina, suína),
45
pescado, ovos e mel, tendo como base, monitorar alimentos que possuam um maior
impacto no consumo da população, levando-se em consideração dados estatísticos
sobre a dieta alimentar do brasileiro (ANVISA, 2005).
Um artigo de revisão, publicado por Caldas e colaboradores (Pacheco-Silva et
al., 2014), com enfoque em leite e ovos, mostra dados do programa PNCRC/MAPA
no período 2006-2012, com o número de análises realizadas para cada analito e o
número de amostras não conforme. Também apresenta resultados do programa
PAMVet/ANVISA, referentes aos períodos 2006/2007 e 2009/2010, onde se evidencia
um percentual maior de amostras positivas para leite em pó, uma vez que os resíduos
neste produto se encontram mais concentrados, sendo os fármacos da família das
avermectinas os mais detectados nas amostras de leite.
Cabe destacar, que embora esses dois programas estejam bem estabelecidos,
o Regulamento Técnico Mercosul - Metodologias Analíticas, Ingestão Diária
Admissível e Limites Máximos de Resíduos para Medicamentos Veterinários em
Alimentos de Origem Animal (Mercosul/GMC/Res. N0 54/00) está desatualizado
quanto aos métodos analíticos e LMR e está em revisão pela ANVISA assessorado
por um Grupo Técnico designado para essa finalidade, desde 2016. Esse regulamento
técnico é importante porque define os LMR de fármacos veterinários adotados no
Brasil e para produtos comercializados no Mercosul.
1.4 – ASPECTOS TOXICOLÓGICOS
1.4.1 - Ingestão Diária Aceitável (IDA)
A metodologia utilizada para a avaliação de risco, relacionada à área de segurança
alimentar no que diz respeito à presença de RFV em alimentos de origem animal, baseia-se
na avaliação toxicológica do fármaco e/ou metabólitos e no estabelecimento de valores de
Ingestão Diária Aceitável (IDA), no qual os valores de Limite Máximo de Resíduo (LMR) são,
subsequentemente, derivados. A IDA é definida como uma estimativa da quantidade de uma
substância, presente no alimento ou na água de beber, que pode ser ingerida diariamente,
ao longo de toda a vida, sem risco apreciável à saúde humana (expressa em mg/kg massa
corpórea).
Valores de IDA podem ser estabelecidos baseados em dados de estudos
farmacológicos, toxicológicos e/ou microbiológicos. Os dados a serem tomados deverão ser
aqueles que apresentarem os menores níveis de efeito observável, no que diz respeito aos
46
menores valores críticos identificados, nos testes realizados com as mais sensíveis das
espécies. Uma das formas de se estabelecer a IDA é a partir do valor de NOAEL e o uso de
um fator de segurança ou incerteza, a fim de se realizar a identificação e caracterização do
risco.
𝑰𝑫𝑨 = 𝑵𝑶𝑨𝑬𝑳 ( 𝒎𝒈 𝒌𝒈−𝟏, 𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 𝒄𝒐𝒓𝒑ó𝒓𝒆𝒂)
𝒇𝒂𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒔𝒆𝒈𝒖𝒓𝒂𝒏ç𝒂
Dessa forma, o valor da IDA é calculado dividindo-se o NOAEL pelo fator de
segurança convencional de 100, visando proporcionar uma margem conservadora de
segurança por conta de incertezas associadas à extrapolação dos dados experimentais de
toxicidade animal para humanos, onde um fator de 10 é utilizado para explicar as diferenças
de testes entre animais e humanos e outro fator de 10 serve para justificar possíveis
diferenças de sensibilidade entre humanos. É válido ressaltar que diferentes fatores de
segurança, podendo ser mais baixos ou mais altos, poderão ser empregados, o que irá
depender, como por exemplo, do conjunto de dados disponível e da natureza da substância
avaliada. Outra característica, é que quando os resultados de dois ou mais estudos em
animais estiverem disponíveis, o cálculo da IDA deverá ser baseado na espécie animal que
apresentar maior sensibilidade, ou seja, aqueles animais que apresentarem maior resposta
do efeito adverso no menor nível de dose estabelecida na curva dose-resposta (WHO, 1987,
Riehl, 2009; Anadón et al., 2012).
No processo de avaliação de risco associado aos efeitos exercidos pela presença de
RFV, uma atenção diferenciada tem sido dada na avaliação de antimicrobianos, uma vez
que existe inerente um risco microbiológico, além do possível risco toxicológico. Para a
maioria das substâncias que apresentam atividade antimicrobiana, valores de IDA são
tomados com base em testes microbiológicos realizados com microorganismos da flora
intestinal humana, onde outros fatores de segurança são levados em conta na proposição
da fórmula para que se obtenha o valor da IDA, estimado com base em estudos in vitro. É
válido salientar, todavia, que não são levados em consideração os efeitos potencialmente
danosos à saúde humana associados à ingestão de alimentos de origem animal contendo
bactérias resistentes, em virtude do tratamento prévio animal com antimicrobianos. O
particular interesse é dado, frente a ingestão de resíduos de antimicrobianos na alimentação,
em vista de seu potencial perigo à saúde humana. A presença pode exercer uma pressão
47
seletiva na flora intestinal, resultando num ambiente favorável ao crescimento de
microorganismos de resistência natural ou adquirida, e, sabendo-se ainda, que a flora vem
a exercer um importante efeito de barreira, possuindo a tendência de evitar a entrada de
microorganismos estranhos (FAO/WHO, 2000; EMEA, 2001).
A avaliação dos efeitos exercidos pela presença de resíduos de antimicrobianos na
flora intestinal humana, deverá conter dados que contemplem:
i) a identificação das bactérias constituintes da microflora intestinal humana;
ii) os dados representativos da constituição de toda flora; e
iii) os dados obtidos mediante estudo in vivo, que venha a levar em conta os efeitos
de barreira (FAO/WHO, 2000).
Os procedimentos a serem adotados no estabelecimento dos valores de IDA à partir
de dados microbiológicos deverão consistir, primeiramente, no conhecimento das doses do
antimicrobiano que não exerça efeito sobre a flora intestinal de voluntários humanos, onde,
juntamente com fatores adequados de segurança, poderão ser utilizados no cálculo da IDA.
Em segundo plano, caso não existam dados com seres humanos, níveis de doses sem efeito,
obtidos mediante estudos especificamente delineados, utilizando-se a flora intestinal humana
empregando um modelo animal, poderá servir como base para o cálculo da IDA. Em terceiro
plano, na ausência de dados utilizando-se estudo in vivo, resultados obtidos mediante estudo
in vitro, empregando a microflora intestinal humana na identificação da Concentração
Inibitória Mínima (MIC, do inglês minimum inhibitory concentration) também poderão ser
utilizados no estabelecimento de uma IDA temporária. No entanto, a definição de uma IDA
definitiva, partindo de uma IDA temporária, só será possível mediante dados de estudo in
vivo (FAO/WHO, 2000).
IDA=MIC50 x massa do conteúdo do cólon (g)
fração da dose biodisponível x fator de segurança x massa corpórea (kg)
IDA temporária
Um valor de IDA temporária poderá ser estabelecido quando não estiverem
disponíveis dados toxicológicos suficientes da substância no momento da avaliação. Porém,
o julgamento científico deverá ser suficientemente confiante de que o consumo de RFV não
apresentem riscos de toxicidade ao longo de um curto período de tempo, intervalo esse
48
necessário para que sejam gerados e avaliados mais dados toxicológicos. Sempre que for
estabelecido um valor de IDA temporária, deve-se especificar as informações necessárias
para que sejam resolvidas as devidas pendências e se estabelece uma data em que tais
dados deverão ser apresentados para uma nova avaliação por parte do comitê julgador
(FAO/WHO, 2000).
1.4.2 – Cálculo do Limite Máximo de Resíduo (LMR)
Antes que um novo medicamento veterinário seja licenciado para uso em animais
produtores de alimentos destinados a consumo humano, faz-se necessário o
estabelecimento do Limite Máximo de Resíduo (LMR) das substâncias farmacologicamente
ativas que serão empregadas na formulação do mesmo. A avaliação de riscos deverá
considerar o metabolismo, bem como o processo de depleção das substâncias em evidência
na espécie animal em estudo. Também irá considerar a quantidade e o tipo de resíduo que
poderá ser ingerido pelos seres humanos, por toda a vida sem risco apreciável à saúde, isso
expresso em termos da IDA. A avaliação de risco também deverá se preocupar com: i) o tipo
e a quantidade de resíduo considerando-se que o mesmo não venha apresentar risco à
saúde humana; ii) os riscos associados aos efeitos toxicológicos, farmacológicos e/ou
microbiológicos em seres humanos; e iii) os resíduos que ocorram nos alimentos de origem
animal que sejam de origem vegetal ou provenientes do meio ambiente. Os resíduos dos
fármacos veterinários deverão incluir tanto os provenientes do fármaco original, bem como
seus metabólitos, devendo os metabólitos ser levados em conta caso possuam relevância
toxicológica, ou seja, apresentando-se em considerável quantidade ou possuindo potencial
farmacológico ou toxicológico. O LMR será expresso então em termos dos níveis do fármaco
de origem ou em relação ao metabólito marcador, caso a formação deste possua uma
porcentagem conhecida a partir do fármaco original (Anadón et al., 2012; Leeuwen, 1997).
Se dados referentes ao metabolismo e ao processo de depleção da substância não
puderem ser estabelecidos, a avaliação de risco poderá levar em consideração dados de
monitoramento e de exposição. A metodologia padrão para que se estabeleça a avaliação
de segurança referente à presença de RFV em alimentos de origem animal é baseada na
determinação de valores da IDA, onde valores de LMR são subsequentemente obtidos. O
processo de estabelecimento de valores de LMR para um dado fármaco veterinário exigirá o
fornecimento dos seguintes dados:
Conhecimento do esquema de dosagem e via de administração (quantidade, intervalo
entre doses e duração do tratamento);
49
Dados de metabolismo e farmacocinética com estudo em animais de laboratório;
Dados de distribuição e de depleção residual para os principais tipos de tecidos
comestíveis (músculo, gordura, fígado e rim) para cada espécie alvo, devendo ser
utilizadas moléculas radiomarcadas;
Métodos analíticos validados para a detecção e quantificação dos resíduos; e
Dados referentes a permanência dos resíduos nos alimentos levando-se em conta o
processamento dos mesmos (Anadón et al., 2012).
Outros fatores que influenciarão no estabelecimento de valores de LMR relacionam-
se com a identificação do tecido alvo animal, com os intervalos de segurança para que haja
a garantia da devida depleção residual e de métodos analíticos práticos para a determinação
dos resíduos. No entanto, a principal consideração para a recomendação de um LMR
relaciona-se com o estabelecimento do valor da IDA, seja com base em dados de estudos
toxicológicos ou mesmo microbiológicos. Recomendações de valores de LMR não serão
estabelecidos caso a ingestão diária máxima teórica de resíduos exceda de forma
significativa o valor da IDA, devendo-se reconhecer que o consumo de resíduos, tomando-
se como base a IDA e fatores alimentícios teóricos, constitui o limite superior na consideração
dos valores de LMR. É válido salientar que valores de LMR não serão derivados diretamente
da IDA, todavia, valores de LMR são obtidos de acordo com a IDA. Valores recomendados
de LMR poderão ser modificados caso sejam necessárias medidas de maior confiabilidade
relacionadas ao emprego de um dado método analítico, porém sempre considerando-se a
premissa de que a ingestão máxima teórica de resíduos não exceda a ingestão teórica na
qual se baseia a IDA. Outra consideração de significativa importância no estabelecimento de
um LMR diz respeito à quantidade de alimentos consumidos por uma população para o
cálculo destas estimativas. Porém, tal abordagem é um assunto complexo, uma vez que a
obtenção de dados de consumo alimentar precisos são difíceis de serem harmonizados
internacionalmente, principalmente considerando que os hábitos alimentares são
profundamente influenciados por questões de origens étnicas, religiosas, climáticas, dentre
outros. Outra dificuldade existente está associada ao número limitado de publicações que
abordam o “destino” dos RFV após o processamento dos alimentos, seja através do preparo
doméstico, por fermentação, ou mesmo outros processos. Diante do exposto e visando a
proteção de todas as camadas sociais, considera-se razoável a utilização de dados de
consumo individualizado de produtos alimentares de origem animal. Portanto, é consenso a
utilização de uma abordagem conservadora onde se estima a ingestão diária de 300 g de
músculo, 100 g de fígado, 50 g de rim, 50 g de gordura, 100 g de ovos e 1,5 L de leite. Na
50
recomendação do valor de um LMR é tomada a decisão de que pelo menos dois tipos de
tecidos comestíveis sejam identificados, sendo um o músculo ou gordura, e o outro sendo o
fígado ou o rim. Tal seleção visa permitir a regulamentação do LMR no âmbito do comércio
internacional, bem como em programas nacionais de controle de remanescentes residuais.
A identificação de um resíduo isotopicamente marcado também se mostra como um assunto
de extrema importância, uma vez que sua utilização permite a determinação de limites
máximos de resíduos por parte de programas do governo nacional ou da indústria para fins
de controle (FAO/WHO, 2000).
Figura 1.10: Diagrama esquemático, proposto pelo JECFA, para estabelecimento de valores
de LMR (Adaptado de FAO/WHO, 2000).
Valores de LMR temporários também são passiveis de serem recomendados, da
mesma forma que podem ser estabelecidos valores de IDA temporários. Tal medida visa
garantir o tempo necessário para que a empresa responsável pelo fármaco possa gerar
dados adicionais sobre a natureza do resíduo e sobre seu processo de quantificação. Dessa
forma, são especificadas pelas agências regulamentadoras as informações necessárias para
a resolução de possíveis pendências e a data para que as mesmas sejam apresentadas.
Ensaios de campo e verificação das Boas Práticas de Uso Veterinário
Estudos de distribuição e metabolismo Resíduo marcador Resíduo Total
Curva de Depleção e Intervalo de Confiança LMR
1. Estimativa Resíduo Médio
Avaliação de Consumo (Modelo da Cesta Básica) IDA
Ingestão > IDA
LMR aceito ;
Opções para ajuste do LMR
Ajuste no LMR ou LMR não recomendado
𝑰𝒏𝒈𝒆𝒔𝒕ã𝒐 ≤ 𝑰𝑫𝑨
2. Estimativa
51
Os tipos de informações temporárias poderão incluir, por exemplo, dados de
farmacocinética e dos tipos de resíduos isotopicamente marcados, melhores caracterizações
estruturais dos resíduos e seus metabólitos, ou de um método analítico adequado para a
quantificação dos mesmos. É válido ressaltar que, quando houver a existência de uma
grande quantidade de dados com alta confiabilidade, existirá a possibilidade de que seja
aplicada uma análise estatística no estabelecimento do valor de um LMR (FAO/WHO, 2000).
1.4.3 – Período de Carência
Outra preocupação em relação ao consumo seguro de produtos alimentares de
origem animal diz respeito ao cumprimento do período de carência, também conhecido como
período de retirada. Tal período está relacionado com o intervalo de tempo no qual é
realizada a última administração do medicamento veterinário e o subsequente abate do
animal ao qual foi submetido a tratamento, ou para que se consumam produtos como leite e
ovos. Acatar esse período de tempo visa garantir a ausência dos RFV em níveis acima dos
aceitos pelos seus respectivos LMR. O não cumprimento do período de carência antes do
abate do animal, bem como a não execução das chamadas Boas Práticas de Uso de
Produtos Veterinários, constitui uma das principais causas da presença de RFV em alimentos
de origem animal acima dos limites considerados seguros. Estudos de metabolismo e
farmacocinéticos são necessários para que seja determinado o período de carência de um
novo fármaco, sendo que, dependendo do tipo do mesmo, da forma de dosagem e da rota
de administração, o período de carência poderá variar desde algumas horas até mesmo
alguns dias ou semanas (MAPA, 2015).
O modelo matemático para o cálculo estatístico na determinação do período de
carência baseia-se em princípios aceitos pela farmacocinética, considerando-se as fases de
absorção, distribuição e eliminação.
1.5 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE
FÁRMACOS VETERINÁRIOS
A determinação de resíduos de fármacos veterinários em matrizes de alimentos pode
ser dividida basicamente em cinco etapas: amostragem, preparo de amostras, o qual tem
como objetivo principal a eliminação de concomitantes e/ou intereferentes da matriz, a
quantificação por uma técnica analítica confiável e a validação do método.
52
1.5.1– PREPARO DE AMOSTRA PARA EXTRAÇÃO DE RFV-AOA
O preparo de amostra é a etapa na qual se realiza a extração dos analitos de interesse
de uma determinada matriz, preferencialmente, evitando-se que interferentes sejam co-
extraídos, fazendo-se necessário, em boa parte das vezes, a realização de procedimentos
para a remoção dos interferentes mediante procedimentos de purificação ou limpeza (clean
up). No campo referente à análise de RFV-AOA, a etapa de preparo de amostra passa a ser
bastante crítica e de suma importância, uma vez que características de desempenho do
método analítico deverão ser alcançados e tais critérios de desempenho estão inteiramente
relacionados com a composição final do extrato. Não obstante, outras características ainda
deverão ser levadas em conta, como tempo de manuseio despendido, compromisso com um
menor custo de análise, bem como com uma menor quantidade de resíduos gerados
(Berendsen et al., 2012; Kinsella et al., 2009; Marazuela & Bogialli, 2009).
O preparo de amostra deverá sempre estar em consonância com o tipo de análise a
ser realizada, devendo ainda levar em consideração a instrumentação a ser empregada e
também o nível de exatidão exigido. Para fins quantitativos, algumas considerações não
devem ser negligenciadas, como a construção da curva analítica na matriz e a utilização de
um padrão interno adequado, assunto abordado de forma mais detalhada no item 1.7
(Validação de Métodos Analíticos). Outro fator a ser considerado, com o intuito de diminuir
as incertezas estatísticas associadas ao processo de preparo de amostra, relaciona-se com
a necessidade de redução do número de etapas envolvidas nessa fase, uma vez que tais
incertezas relacionam-se com o número de etapas envolvidas durante o desenvolvimento do
método analítico (Ridgway et al., 2007).
1.5.2 – O ANALITO
Frente ao planejamento do procedimento de extração para o desenvolvimento do
método analítico, a análise de resíduos de substâncias alvos em matrizes complexas como
alimentos, deverá primeiramente levar em consideração as propriedades físico-químicas dos
analitos e a natureza na qual a matriz se apresenta. A realização de uma extração seletiva
dos analitos poderá ser baseada na diferenciação de tais propriedades, haja visto que a
obtenção de uma adequada extração poderá está associada com características como
massa molar dos analitos envolvidos, a presença ou não de cargas nos mesmos, bem como
fatores como polaridade e solubilidade (Ridgway et al., 2007; Boyd et al., 2008).
53
1.5.3 – SELEÇÃO E ESTOCAGEM DA AMOSTRA
Referente aos animais criados em fazenda cujo destino será o consumo humano,
existem diferentes tipos de tecidos que poderão ser selecionados de acordo com a
característica das substâncias a serem investigadas. A escolha da amostra frequentemente
considera o fato pelo qual ocorre a deposição normal dos resíduos em determinado tipo de
matriz. A preferência pelo músculo para a análise de RFV é muitas vezes feita pelo fato de
ser um dos principais tecidos consumidos pela população, muito embora em algumas
situações possa ser questionável se esse tecido representa o sítio de injeção. Para o
monitoramento de substâncias autorizadas, ou seja, as que possuem LMR, as matrizes
normalmente utilizadas são músculo, fígado, rim, gordura e leite. Um segundo grupo de
matrizes de interesse irá compreender ovos, peixe e mel, haja visto o aumento no consumo
dos mesmos pela população. Para a verificação de substâncias de uso proibido, a escolha
de matrizes como pelos e retinas apresentam um interesse especial, por conferirem a
possibilidade de determinação de fármacos utilizados como promotores de crescimento,
mesmo meses após suas administrações (Stolker et al., 2007; Kinsella et al., 2009).
Um fator importante a ser considerado é o processo de estocagem da amostra entre
o período de coleta e a posterior análise, uma vez que tanto fatores físico-químicos (ex.:
oxidação, proteólise, precipitação) como biológicos (ex.: atividades microbiológicas, reações
enzimáticas) podem influenciar no resultado final. Recomendações de agências
regulamentadoras estabelecem critérios para a realização de estudos de estabilidade
durante o processo de desenvolvimento do método analítico. Um fator comumente ignorado
é a possibilidade de variação na forma como os RFV se acumulam em um dado organismo
ou em um certo tipo de órgão ou tecido, sendo importante considerar a obtenção de uma
alíquota representativa e uma posterior homogeneização da amostra a ser analisada
(Kinsella et al., 2009).
1.5.4 – EXTRAÇÃO DO ANALITO DA AMOSTRA
Alimentos de origem animal constituem um conjunto de matrizes de natureza
complexa, apresentando em sua composição uma abrangente faixa de substâncias
químicas. Após o processo de amostragem, tanto a extração como a determinação dos
analitos de interesse poderão se tornar um trabalho dificultoso de ser executado. Uma
adequada etapa de extração constitui um componente chave no processo de preparo de
amostra. Os procedimentos de extração adotados na maioria dos métodos analíticos
54
referentes a esta área baseiam-se numa extração com solvente, podendo ser seguida de
uma etapa de clean up. Embora tais procedimentos sejam considerados clássicos, algumas
modificações têm ocorrido com os mesmos ao longo do tempo, de modo que eles passaram
a contemplar exigências como: uso de uma menor quantidade de amostra; redução e/ou
eliminação de solventes orgânicos; procedimentos abrangendo o maior número de analitos,
bem como de classes dos mesmos; possibilidade de automação e de rápido processamento
das amostras e redução do número de etapas envolvidas nesse estágio (Buldini et al., 2002;
Blasco et al., 2007; Marazuela & Bogialli, 2009).
Nesta seção, serão apresentados os procedimentos de preparo de amostra para a
análise de RFV-AOA, englobando desde abordagens clássicas no processo de extração e
clean up, até outros mais recentes e genéricos. Também se mostra um pouco da tendência
em se utilizar métodos instrumentais de preparo de amostra.
1.5.4.1 – TÉCNICAS MANUAIS
A primeira etapa no processo de preparo de amostra para a análise de RFV-AOA pode
ser frequentemente composta por duas fases, uma em que envolve a homogeneização da
amostra com algum agente de precipitação proteica e outra envolvendo a técnica de extração
dos analitos (Paschoal, 2007).
A precipitação de proteínas trata-se de uma fase comumente empregada durante o
processo de preparo de amostra, sendo frequentemente utilizada quando se faz necessária
a remoção de interferentes, permitindo também que se atinja adequada eficiência de
extração dos analitos (McGlinchey, 2010). Para a precipitação de proteínas tem sido
empregado frequentemente o ácido tricloroacético (ATCA). No entanto, deve-se atentar que
alguns fármacos podem ser degradados neste meio, como por exemplo compostos da família
dos β-lactâmicos e alguns macrolideos (Stolker et al., 2007; Kinsella et al., 2009; Berendsen
et al., 2013).
A extração com solvente pode ser empregada em determinações multiclasse de
analitos. Em matrizes líquidas (ex.: leite), tal extração será do tipo líquido-líquido (ELL), já no
caso de tecidos homogeneizados (ex.: músculo, fígado) a mesma poderá ser denominada
de extração sólido-líquido (SLE). Para essa finalidade, têm sido empregados o metanol
(MeOH), a acetonitrila (ACN), o acetato de etila (AcOEt) e a acetona (ACE). A ACN tem sido
o solvente mais comumente reportado, uma vez que permite a extração de uma ampla gama
de analitos e, também, por desnaturar proteínas, as quais necessitam ser removidas anterior
55
a etapa de quantificação. Soluções tampão também têm sido empregados na etapa de
extração de resíduos, apresentando vantagens para analitos com carga. Fatores como a
natureza da amostra (ex.: se a mesma é de origem sólida ou líquida) e as características
físico-químicas dos analitos (ex.: polaridade, pKa) poderão implicar na técnica de extração a
ser adotada (Kinsella et al., 2009).
Uma vez que os solventes de extração não são seletivos, etapas adicionais de clean-
up se fazem necessárias (item 1.5.4).
i) QuEChERS
Anastassíades et al. desenvolveram um procedimento genérico, que é uma
modificação de uma extração simples com solvente, a qual sofreu a denominação de
QuEChERS - acrônimo de “Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe” (rápido, fácil,
barato, eficiente, robusto e seguro). Esse procedimento tem sido aplicado com sucesso em
análises multiresíduo de pesticidas em frutas e vegetais. O método QuEChERS consiste
numa técnica de preparo de amostra em que se emprega como solvente extrator a ACN, o
AcOEt ou outro solvente orgânico, o qual sofrerá posterior partição com sulfato de magnésio,
empregado sozinho ou combinado com outros sais, visando tanto a melhor separação de
fases entre o solvente orgânico e a fase aquosa, quanto melhor efeito salting out. Em
seguida, faz-se uma etapa de limpeza onde se utiliza a extração em fase sólida dispersiva
(d-SPE), adicionando-se pequena quantidade de um sorvente ao extrato, sendo o mais
utilizado a amina primária-secundária (PSA, do inglês primary secondary amine). Após a
etapa de limpeza, o extrato é centrifugado e o sobrenadante pode ser então concentrado ou
diretamente injetado no sistema cromatográfico. Esse procedimento mostra-se bem flexível
e desde sua proposição inicial tem sofrido algumas modificações, que poderão depender da
natureza dos resíduos, da matriz, da instrumentação e da preferência do analista. Ainda,
apresenta como vantagem requerer o uso de pouco material de laboratório e gerar uma
menor quantidade de resíduos. O mesmo é capaz de fornecer elevadas recuperações e
adequada repetibilidade, bem como custos inferiores a muitos outros tipos de procedimentos
de preparo de amostra (Kinsella et al., 2009; Núñez et al., 2012).
Uma abordagem mais detalhada é dada no Capítulo 2, que trata da avaliação do
desenvolvimento de um método analítico, para determinação de quinolonas em salmão,
empregando o QuEChERS na etapa de preparo de amostra.
56
ii) Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD)
Outra abordagem genérica para a extração de resíduos consiste na dispersão da
matriz em fase sólida (MSPD, do inglês Matrix Solid-Phase Dispersion). Esse procedimento
possibilita a execução do preparo, extração e fracionamento de amostras sólidas e semi-
sólidas, sendo a amostra misturada e dispersada em um suporte sólido (sorvente) utilizando-
se gral e pistilo. O dispersante, que poderá ser C8, C18, sílica, alumina, areia, florisil, entre
outros, atuará como material abrasivo quebrando a estrutura da amostra. A amostra
dispersada já seca é então usada para rechear uma coluna ou um dispositivo do tipo seringa,
para ser fracionada com solventes, o qual promoverá o isolamento e/ou limpeza dos analitos
de interesse. Este procedimento pode possibilitar a eliminação de etapas complicadas de
extrações e/ou SPE, sendo útil no isolamento de ampla variedade de compostos como
fármacos, pesticidas, compostos de origem natural e outros componentes de matrizes
biológicas complexas. Aplicações adequadas da MSPD estão diretamente relacionadas com
a escolha do solvente de lavagem e eluição. Enquanto que interferentes lipofílicos da matriz
poderão ser removidos mediante uso de solventes de baixa polaridade (ex.: hexano),
fármacos veterinários irão exigir o uso de solventes mais polares (ex.: diclorometano, álcoois
e até água aquecida). As principais vantagens dessa técnica consistem na possibilidade de
aplicação em ampla faixa de resíduos, na eliminação da etapa de precipitação proteica e na
possibilidade de eluição dos analitos de forma sequencial, mediante uso do aumento ou
diminuição da polaridade do solvente de eluição. Não obstante, a MSPD ainda exige
melhorias, como possibilidade de miniaturização e acoplamento com outras técnicas. A
mesma não tem encontrado vastas aplicações em métodos de rotinas analíticas, pois exige
um intenso e trabalhoso processo manual (Stolker et al., 2007; Chen et al., 2008; Kinsella et
al., 2009; Prestes et al., 2013).
A Tabela 1.3 (pg 71) exemplifica alguns trabalhos enfocando tanto as técnicas
manuais bem como os procedimentos genéricos de extração (QuEChERS e MSPD).
57
1.5.4.2 – TÉCNICAS INSTRUMENTAIS DE EXTRAÇÃO
Como já mencionado, embora métodos clássicos e usuais de extração sejam
empregados com frequência na análise de RFV, existe a tendência de que sejam
incorporadas novas abordagens de extração visando a automação e o rápido processamento
de amostras. Dessa forma, a utilização de técnicas instrumentais de extração, além de
poderem colaborar para que as características citadas sejam alcançadas, também poderá
levar à redução de incertezas e aumento da precisão quando comparadas as técnicas
manuais, podendo levar também à uma redução no tempo de processamento, redução esta
que poderá constituir em uma forte vantagem na aplicação de um método rotineiro de análise
(Marazuela & Bogialli, 2009).
Dessa forma, algumas técnicas instrumentais de extração têm sido desenvolvidas,
podendo se destacar a extração líquido pressurizado (PLE), a extração assistida por micro-
ondas (MAE) e a extração com fluído supercrítico (SFE). Outras vantagens no uso destas
técnicas, além do potencial de automação, consistem na obtenção de um processo de maior
seletividade no isolamento dos analitos, mediante ajustes nos parâmetros do instrumento, e
também na possibilidade de se obter um processo de clean up online das amostras (Kinsella
et al., 2009).
Embora as técnicas instrumentais de preparo de amostra possam apresentar as
características de desempenho anteriormente citadas, há de se considerar também as
desvantagens apresentadas pelas mesmas, como o limitado número de equipamentos
comercialmente disponíveis no mercado e o maior custo relacionado ao processo de
aquisição de equipamentos e de material consumível de laboratório, bem como a
necessidade de analistas bem treinados. Deve-se considerar também que essas técnicas
geralmente apresentam aplicações limitadas a determinados tipos de compostos, aos quais
só poderão ser extraídos sob determinadas condições, o que as deixa longe de serem
consideradas como técnicas ideais para métodos multiresíduo de RFV-AOA (Kinsella et al.,
2009; Prestes et al., 2013).
i) Extração Líquido Pressurizado (PLE)
A extração líquido pressurizado (PLE, do inglês Pressurized Liquid Extraction),
conhecida com nomes diversos, como extração acelerada por solvente, extração por fluído
pressurizado e extração por solvente subcrítico, consiste num processo de extração onde se
utiliza um solvente acima do seu ponto de ebulição e altas pressões, a fim de manter o
58
solvente em sua fase líquida, podendo ser obtido assim um rápido e eficiente processo de
extração dos analitos. Essa técnica baseia-se no processo de decréscimo da viscosidade do
solvente à alta temperatura, sendo que a mesma irá favorecer a quebra das interações
matriz-analito, o que possibilitará tanto a difusão dos analitos da matriz para o solvente, como
a maior solubilidade dos mesmos, uma vez que nessas condições o solvente possui um
maior poder de solvatação e uma maior eficiência de extração. Extrações prévias poderão
ser realizadas com solventes apolares (ex.: hexano), podendo apresentar a vantagem da
eliminação de compostos hidrofóbicos da amostra, antes que os analitos de interesse,
possuindo uma maior polaridade, sejam extraídos. Podem ser citadas como vantagens, a
possibilidade em se obter tempos curtos de extração, consumo de menor volume de
solventes e a possibilidade de uso da água como solvente extrator, uma vez que a mesma é
bem mais barata e ecologicamente correta. Não obstante, o processo de manuseio e
montagem das celas de extração consomem um certo tempo, podendo constituir em uma
entediante e laboriosa atividade (Kinsella et al., 2009; Ridgway et al., 2009).
Uma abordagem mais detalhada sobre a técnica de PLE é dada no Capítulo 4, que
trata do desenvolvimento de um método analítico para determinação de avermectinas em
músculo bovino, mediante processo de extração empregando o referido procedimento de
preparo da amostra.
ii) Extração Assistida por Micro-ondas (MAE)
A extração assistida por micro-ondas (MAE, do inglês Microwave Assisted Extraction),
consiste num processo em que se utiliza a energia micro-ondas, a qual irá promover o
movimento molecular e rotacional do líquido que possua dipolo permanente, acarretando o
rápido aquecimento do solvente que estará em contato com a amostra, de forma que sejam
particionados os analitos da matriz para o solvente. Sua principal aplicação se dá como uma
técnica alternativa comparada aos métodos Soxhlet, devido a melhor eficiência de extração,
a utilização de uma quantidade menor de solvente (10-30 mL) e um curto tempo de extração.
Esta técnica pode ser realizada em sistemas abertos ou fechados, possuindo também a
vantagem de processamento simultâneo de várias amostras, porém devendo ser
considerado que existe o fator limitante relacionado com a escolha do solvente, uma vez que
solventes apolares não absorvem esse tipo de energia. Geralmente é necessária uma etapa
de clean up do extrato obtido antes da análise posterior e essa técnica só deve ser aplicada
a compostos termicamente estáveis, devido ao aumento de temperatura durante a extração.
59
Em análises ambientais, a técnica MAE encontra-se bem estabelecida como método de
rotina, no entanto, no escopo da análise de alimentos para a determinação de RFV, a mesma
tem sido pouco relatada na literatura (Ridgway et al., 2007; Marazuela & Bogialli, 2009;
Prestes et al., 2013).
iii) Extração com Fluído Supercrítico (SFE)
A extração com fluído supercrítico (SFE, do inglês Supercritical Fluid Extraction)
consiste num processo de extração que faz uso de um fluído em seu estado supercrítico.
Define-se um fluído supercrítico como uma substância que se encontra acima de sua pressão
e temperatura crítica, sendo que suas propriedades físicas se situam de forma intermediária
entre as fases líquida e gasosa; seu poder de solvatação mostra-se similar ao de um líquido,
e suas difusividade e viscosidade similares a de um gás. Essas propriedades possibilitam
tornar o processo de extração facilitado, e que também as propriedades de um fluído, em
situações que se aproximam às condições críticas, tornam-se bastante sensíveis a pequenas
variações de temperatura, pressão e densidade. Seu poder de solvatação pode ser
manipulado por mudanças na pressão e/ou temperatura e pela adição de outros solventes.
Uma de suas vantagens é que o solvente de extração (fluído supercrítico) passa a ser
facilmente removido da amostra mediante a redução de pressão (Filippis, 2001; Ridgway et
al., 2007; Kinsella et al., 2009).
O dióxido de carbono (CO2) é o solvente mais utilizado nesta técnica de extração por
causa de algumas características particulares, como ser inerte, possuir baixo custo, baixa
toxicidade e baixos parâmetros críticos (CO2: Tc = 31.3 °C, Pc = 72,9 atm). O mesmo gás,
em sua forma supercrítica, torna-se comumente empregado devido ser capaz de atingir
elevada eficiência de extração, desde compostos apolares até os de baixa polaridade. O uso
de cossolventes em pequenas quantidades (≤ 15%) combinados com o CO2 podem atuar
como modificadores estendendo a aplicação do mesmo a uma maior faixa de polaridade dos
analitos. Uma das principais desvantagens de uso do CO2 supercrítico é sua relativa baixa
polaridade, sendo a mesma ideal para hidrocarbonetos poliaromáticos, pesticidas
halogenados e lípídeos ou gorduras, porém inadequados para a maior parte dos fármacos
(Smith, 2003; Chen et al., 2008).
De forma geral, um dos principais problemas da SFE, diz respeito a robustez do
método quando comparada com a precisão de outras técnicas e condições mais
estabelecidas de extrações. Outra desvantagem é que a numerosa possibilidade de ajustes
60
nos parâmetros anteriormente citados, não apenas torna tal técnica flexível, mas lhe confere
também uma tarefa de maior dificuldade de uso e otimização (Ridgway et al., 2007; Chen et
al., 2008).
A Tabela 1.4 (pg 74) ilustra alguns trabalhos em que os autores fazem uso de técnicas
instrumentais de extração.
1.5.5 – LIMPEZA (CLEAN UP) DO EXTRATO
A etapa de clean up, a ser executada na fase obtida após o processo de extração,
apresentará como principal característica o isolamento dos analitos da presença de
interferentes provenientes da matriz. A utilização de uma técnica adequada de clean up,
vindo a reduzir de forma significativa os interferentes, pode também levar a uma melhora na
relação sinal/ruído e, em consequência, diminuir o limite de quantificação do método. Para a
análise de RFV-AOA, frequentemente, é descrito a extração em fase sólida (SPE), e de forma
menos empregada, a extração em fase sólida dispersiva (d-SPE), os polímeros de impressão
molecular (MIP), os materiais de acesso restrito (RAM) e a partição à baixa temperatura
(LTP) (Lanças, 2004; Ridgway et al., 2007).
i) Extração em Fase Sólida (SPE)
A extração em fase sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction), introduzida em
meados da década de 1970, consiste numa técnica de separação líquido-sólido cujos
mecanismos de separação assemelham-se à cromatografia líquida clássica. Sua forma mais
empregada consiste no uso de uma pequena coluna aberta, com o formato de uma seringa
plástica, denominada cartucho de extração. Dentro desta, retido entre dois discos filtrantes
(frits), fica o suporte sólido (sorvente). Embora esse formato seja o mais comumente
empregado, vale ressaltar a existência de outros, como discos, fibras, placas, entre outros.
Os materiais sorventes comumente utilizados na SPE constituem os mesmos empregados
na cromatografia líquida, podendo operar como fases normal, reversa, troca-iônica,
bioafinidade ou exclusão molecular. Os sorventes de natureza polimérica, comumente à
base de poliestireno entrecruzado com divinilbenzeno, embora apresentem um maior custo
quando comparado com os que são à base de sílica quimicamente ligada, apresentam maior
estabilidade em faixas extremas de pH, maior seletividade e a possibilidade de trabalho com
um número maior de analitos, quando estes apresentarem dificuldade de serem purificados
61
em fases convencionais, principalmente com a crescente tendência de desenvolvimento de
métodos multiclasse de resíduos (Lanças, 2004; Kinsella et al., 2009; Orlando, 2011).
O procedimento de SPE possibilita: concentrar os analitos, remover interferentes e
eliminar a matriz.
As etapas comumente envolvidas no desenvolvimento de um método SPE consiste
no condicionamento do cartucho, na adição da amostra, na remoção de interferentes e na
eluição dos analitos, onde se utiliza uma pequena quantidade de solvente (Lanças, 2004).
É válido ressaltar que embora o efeito matriz possa ser reduzido de forma significativa
pelo uso da SPE, sua aplicação para uma ampla faixa de analitos, possuindo os mais
diferentes tipos de propriedades físico-químicas, fazem com que a escolha do mecanismo
de interação possua aplicação limitada. O maior tempo despendido, a complexidade
operacional quando tal técnica é executada manualmente e o custo adicional de cartuchos,
na maioria das vezes utilizados uma única vez, são outras características de desvantagens
da SPE (Orlando & Gil, 2007; Berendsen et al., 2013).
Além das vantagens e limitações já mencionadas, pode ser citado que a SPE
apresenta grande capacidade de automação, bem como a disponibilidade comercial de
sistemas que já incorporam tal tecnologia. Os sistemas automatizados irão conferir uma
maior capacidade e velocidade de processamento das amostras, sendo reduzido o consumo
de solvente e podendo aumentar a precisão do método. Apresentam também como
vantagem, a possibilidade de serem ou não acoplados à técnicas cromatográficas (Técnicas
On/Off-line), ou mesmo outras técnicas analíticas. Embora esses sistemas automatizados
apresentem as vantagens mencionadas, há de se considerar a necessidade de investimento
do equipamento, sua manutenção, bem como a necessidade de analistas mais capacitados.
Outras desvantagens poderão também relacionarem-se com a incompatibilidade de analitos
ou amostras instáveis, havendo também a possibilidade de sobrecargas de amostras ou de
efeito memória da presença de analitos no sistema (Orlando, 2011).
ii) Extração em Fase Sólida Dispersiva (d-SPE)
A extração em fase sólida dispersiva (d-SPE, do inglês Dispersive Solid-Phase
Extraction) consiste numa técnica de clean up, comumente empregada no método
QuEChERS, cujo princípio se baseia na mistura de um sorvente com o extrato bruto,
proveniente de uma amostra previamente extraída, seguido de agitação, centrifugação e
posterior separação do sobrenadante. O sorvente possui a finalidade de adsorver em sua
superfície os coextrativos da matriz, deixando os analitos de interesse presentes no solvente.
62
As propriedades físico-químicas dos analitos e a natureza da matriz implicarão na escolha
do tipo de sorvente a ser empregado, sendo que na determinação de pesticidas, o sorvente
comumente utilizado constitui o PSA, sendo o mesmo eficaz na retenção de ácidos graxos.
Já para a análise de alimentos de origem animal, os quais são ricos em lipídeos, o uso de
C18, sozinho ou combinado com o PSA, mostra-se mais eficiente na remoção de compostos
lipofílicos (Kinsella et al., 2009).
iii) Polímeros de Impressão Molecular (MIP)
Polímeros de impressão molecular (MIP, do inglês Molecularly Imprinted Polymers),
constituem materiais poliméricos sintéticos, com propriedade de elevado reconhecimento
molecular, possuindo uma rede tridimensional gerada artificialmente, capaz de se ligarem ao
analitos alvo ou a uma classe de compostos com estruturas relacionadas. Tais materiais são
obtidos mediante a polimerização funcional de monômeros de ligações cruzadas, em torno
de uma molécula molde, levando à formação de sítios de reconhecimento específicos de
ligação, complementando-se quanto à forma, ao tamanho e aos grupos funcionais de uma
molécula alvo. As interações nos sítios seletivos atuarão de forma semelhante ao sistema
antígeno-anticorpo. O uso de novos sorventes fazendo uso de MIP em procedimentos de
SPE, denominada de extração em fase sólida molecularmente impressa (MISPE, do inglês
Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction) trata-se de uma alternativa que pode ser
promissora, uma vez que uma das desvantagens do uso de sorventes clássicos em SPE diz
respeito à sua falta de seletividade, sendo que o uso de MISPE pode ainda competir com os
fatores de preço e de estabilidade. A extração seletiva de matrizes complexas como
alimentos é delineada avaliando-se a combinação entre as cavidades dentro do MIP com a
devida escolha do solvente de carregamento, lavagem e eluição. O uso destes polímeros
podem apresentar vantagens como facilidade de síntese, baixo custo de reagentes,
estabilidade por longo tempo, resistência à condições drásticas frente à temperaturas e
pressões, e capacidade de ser reutilizado após limpeza (Marazuela & Bogialli, 2009; Barros,
2010; Núñez et al., 2012).
iv) Material de Acesso Restrito (RAM)
Os materiais de acesso restrito (RAM, do inglês Restricted Access Media) são
sorventes constituintes de suportes cromatográficos porosos cujo princípio de separação é
parcialmente baseado no mecanismo de exclusão por tamanho, tendo sido desenvolvido de
63
forma específica para o processo de remoção de proteínas. Dessa forma, as macromoléculas
passam a ser excluídas do suporte sólido (fase estacionária), em virtude de barreiras físicas
(diâmetro dos poros) ou mediante a barreira de difusão química proporcionado pela rede de
proteínas na superfície exterior da partícula, sendo separadas mediante passagem da fase
móvel. As moléculas de pequeno tamanho passam a ficar retidas nos sítios de interação
dentro dos poros, acessíveis somente a tais componentes, através de mecanismos de
retenção convencionais, como interações dos tipos hidrofóbicas ou eletrostáticas. As
aplicações de RAM têm se dado principalmente no campo de análise de amostras
ambientais, sendo que existem poucas descrições de seu emprego em análises de
alimentos. Outra limitação está relacionada com o preço bem superior dos sorventes do tipo
RAM quando comparado com o dos sorventes convencionais utilizados em SPE (Ridgway
et al., 2007; Marazuela & Bogialli, 2009).
A Tabela 1.5 (pg 77) evidencia alguns trabalhos em que os autores enfocam a etapa
de clean up durante o preparo de amostra.
1.6 – SEPARAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE RFV-AOA
A análise de RFV-AOA é um assunto relativamente novo, tendo seu início datado por
volta de 1970, e foi realizada primeiramente nos países Bélgica, Noruega e Luxemburgo,
posteriormente se difundindo em muitos outros países da Europa. No início da década de
1970, a cromatografia em camada delgada (TLC, do inglês Thyn Layer Chromatography) era
o método escolhido para a determinação qualitativa de substâncias do Grupo A (substâncias
banidas ou proibidas), sendo que até aquele momento, o único método que atingia os limites
de detecção aceitos era a cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (GC-
ECD, do inglês Gas Chromatography – Electron Capture Detector). A cromatografia líquida
de alta eficiência fazendo uso da detecção por ultravioleta (HPLC-UV, do inglês High
Performance Liquid Chromatography – Ultraviolet Detection) somente foi introduzida na
metade da referida década, porém os equipamentos ainda possuíam custos elevados e não
apresentavam robustez satisfatória. A detecção por UV não apresentava a seletividade
exigida e nem atingia os limites de detecção necessários para as substâncias proibidas e a
detecção fazendo uso da fluorescência (FLD, do inglês Fluorescence Detection) só veio ser
introduzida posteriormente. É válido ressaltar que para substâncias do grupo B (substâncias
que possuem LMR estabelecidos) a detecção por UV era utilizada para fins de
determinações quantitativas. O aparecimento da cromatografia gasosa acoplada à
64
espectrometria de massas (GC-MS, do inglês Gas Chromatography – Mass Spectrometry)
só se tornou mais acessível durante a década de 1990, com o aparecimento de seus
equipamentos no mercado, ocorrendo a transição dos métodos baseados na TLC e HPLC
para aquelas fazendo uso da GC-MS. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas sequencial (LC-MSn, do inglês Liquid Chromatography - Tandem Mass
Spectrometry) veio a tornar-se obrigatória para a análise de resíduos somente no final da
década de 1990 (Brabander et al., 2009). A Figura 1.11 mostra um panorama resumido da
evolução das técnicas de determinação.
Métodos analíticos para o monitoramento de RFV-AOA podem ser classificados,
geralmente, em dois tipos – métodos de triagem e métodos confirmatórios. Métodos de
triagem, com uma descrição mais detalhada no próximo subitem (item 1.6.1), normalmente
são baseados na realização de imunoensaios, caracterizando-se por apresentarem alta
especificidade, alta sensibilidade, com simplicidade de execução e boa relação custo
benefício, sendo os mesmos baseados numa reação específica entre um antígeno e um
anticorpo, podendo atingir níveis semi-quantitativos. Métodos confirmatórios, com uma
abordagem mais abrangente no item 1.6.2, fornecem informações estruturais
complementares ou totais da substância a ser investigada, possibilitando sua identificação
inequívoca e podendo também quantificar o analito em determinado nível de interesse
(Blasco et al., 2007; Pericás et al., 2010).
Figura 1.11: Evolução das técnicas utilizadas na determinação de RFV-AOA (Adaptado de
Brabander et al., 2009).
< 1970 1980 1990 2000 2010
TLC HPLC GC-MS (SIM)
GC-MS (MSn)
LC-MSn
LC-MS (QqQ)
UHPLC
UHPLC-ToF GC-ECD
65
1.6.1- Técnicas de Triagem (Screening)
Técnicas de triagem, também conhecidas como métodos screening, permitem a
análise de uma grande quantidade de amostras em um curto período de tempo, sendo esses
métodos baseados principalmente nos imunoensaios, envolvendo o uso de anticorpos, que
se caracterizam por possuírem sítios de reconhecimento que possibilitam interações de alta
especificidade com antígenos (Nunes, 2005; Toldrá & Reig, 2006).
1.6.1.1 – Métodos baseados em Imunoensaios
Utilizadas por muitos anos, as reações do tipo antígeno e anticorpo têm sido aplicadas
na determinação de uma grande diversidade de constituintes alimentares como
contaminantes, incluindo os RFV-AOA. Os imunoensaios podem constituir em uma
alternativa vantajosa para laboratórios de controle de resíduos, uma vez que a análise
realizada por um método confirmatório possui custo mais elevado, em termos de
equipamentos e reagentes, sendo ainda mais demorada e necessitando de operadores bem
treinados na sua execução (Toldrá & Reig, 2006).
Existem diferentes técnicas disponíveis para os testes de triagem na análise de RFV,
onde a abordagem mais comumente utilizada consiste no uso do teste ELISA (do inglês
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay), existindo atualmente disponível no comércio
diferentes kits, seja para um dado resíduo específico ou uma classe de compostos
relacionados. Cada kit permite a análise de uma grande quantidade de amostras e não
requer instrumentação sofisticada, com resultados disponibilizados em poucas horas (Reig
& Toldrá, 2008).
Esse tipo de ensaio se mostra bastante útil apenas como triagem (screening), vindo
realizar somente a avaliação inicial da contaminação presente, devido o mesmo apresentar
como característica, a possibilidade de ocorrência de resultados falso positivos, decorrente
de reação cruzada. Num método de triagem são aceitos alguns falsos positivos, devendo as
amostras serem posteriormente analisadas por um método confirmatório. Porém, deve existir
a necessidade do método de triagem fornecer uma quantidade mínima de amostras falsos
negativos, pois estas não serão futuramente analisadas (Nunes, 2005; Toldrá & Reig, 2006).
Dentre as vantagens já citadas para os métodos de triagem, os testes do tipo ELISA
ainda apresentam como características positivas: facilidade de uso, disponibilidade de kits
para compostos específicos ou para uma classe de compostos, tempo reduzido de obtenção
dos resultados (de 2 a 2,5 horas para a maioria dos kits) e cada kit pode analisar em torno
66
de 42 amostras. Porém, como desvantagem, além das já citadas, há de se considerar o
tempo limitado de poucos meses para estocagem sob refrigeração e a ocorrência, desde
2002, de um aumento considerável em seus custos (Toldrá & Reig, 2006).
Outros tipos de imunoensaios existem disponíveis, embora empregados com menor
frequência, como os radioimunoensaios, (RIA, do inglês radioimmunoassay), que se baseiam
na medida de radioatividade do complexo imunológico, usando para isso um contador, porém
possui as desvantagens de custos mais elevado e uma maior preocupação com o descarte
de seus resíduos. Existem também os imunoensaios que são baseados no uso de detectores
de luminescência ou fluorescência, caso os complexos imunológicos sejam
quimiluminescentes ou fluorescentes, respectivamente (Reig & Toldrá, 2008; Pericás et al.,
2010).
Outra grande desvantagem na utilização de métodos de triagem é que em muitos
casos as mesmas passam a exigir uma etapa de preparo de amostra semelhante a de um
método confirmatório que faça uso da LC-MS. A referida etapa torna o processo mais
limitado, dificultando a possibilidade de processamento a nível de alto rendimento, tanto em
velocidade, como em o alto número de amostras. Tal peculiaridade evidencia a não
existência de vantagens tão expressivas deste método em relação a aplicação direta de um
método confirmatório (Blasco et al., 2007).
1.6.2 – MÉTODOS CONFIRMATÓRIOS
Após a realização da triagem, caso este tenha sido inicialmente empregado, a próxima
etapa consiste na realização da análise confirmatória do resíduo no alimento, mediante o uso
de um método que detecte a identidade presumível de um dado composto. Para tal propósito,
existe a disponibilidade de serem empregadas diferentes técnicas. Uma amostra só poderá
ser considerada como inadequada para consumo humano caso a mesma seja julgada como
não-conforme, ou seja, caso o composto alvo seja claramente identificado e quantificado
acima de seu limite mínimo de desempenho requerido (LMPR), no caso de substâncias
proibidas (Grupo A), ou excedendo o limite máximo de resíduo (LMR), para substâncias com
uso regulamentado (Grupo B) (Reig & Toldrá, 2008).
67
1.6.2.1 – TÉCNICAS DE SEPARAÇÃO
Para determinação de RFV-AOA, dos diversos procedimentos de separação
existentes, geralmente se faz uso de abordagens empregando técnicas como a
cromatografia gasosa (GC, do inglês Gas Chromatography), a cromatografia líquida (LC, do
inglês Liquid Chromatography), e a eletroforese capilar (CE, do inglês Capillary
Electrophoresis).
Ao contrário dos métodos baseados em imunoensaios, os métodos de separação,
sendo eles cromatográficos ou eletroforéticos, muitas vezes, mostram um indicativo da
identidade de um composto fazendo uso de seu tempo de retenção, permitindo a separação
de muitos analitos e podendo ser realizado também suas determinações quantitativas em
uma única análise (Gentili et al., 2005).
A maior parte dos fármacos veterinários, bem como de seus produtos de
transformação, possuem como características: alta polaridade, solubilidade em água, não
voláteis e termicamente instáveis. Dessa forma, poucos métodos são descritos na literatura
fazendo uso da GC-MS na análise de RFV, sendo que quando essa técnica é empregada,
torna-se necessária uma etapa adicional de derivatização, por vezes trabalhosa e mais
demorada (Cruz & Barceló, 2007).
O uso da técnica de eletroforese capilar é muitas vezes proposta como uma opção
para ampliar o leque de métodos para a determinação de RFV-AOA. Não obstante, seu
campo de aplicação não se mostra muito bem definido nesta área, sendo que os principais
entraves associados com esta técnica se relacionam com a baixa detectabilidade dos
analitos e a pequena quantidade do volume de injeção da amostra. Embora tais problemas
de detectabilidade tenham sido parcialmente solucionados, os limites de detecção
alcançados pela eletroforese capilar para os RFV, mesmo usando o detector de massas,
ainda permanecem maiores do que aqueles obtidos por métodos baseados no uso da LC-
MS (Blasco et al., 2007).
Dessa forma, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês High
Performance Liquid Chromatography) é a técnica de separação preferencialmente escolhida
na análise de RFV-AOA. No que se refere ao emprego de fases estacionárias, as do tipo
fase reversa têm sido as frequentemente utilizadas na análise de moléculas de interesse
biológico, e também em outras aplicações, como análises de compostos possuindo de baixa
à média polaridade. A escolha do detector passa a ser um assunto de extrema importância
para que sejam atingidos, por exemplo, melhores seletividade e detectabilidade, se fazendo
68
necessário, em algumas situações, de etapas de derivatização para que se promovam
modificações estruturais a fim de que os analitos passem a possuir grupos cromóforos e/ou
fluoróforos (Reig & Toldrá, 2008; Lanças, 2010).
Há de ser considerado, no tocante ao uso de abordagens mais recentes de HPLC, a
possibilidade de serem realizadas análises com um menor tempo de corrida cromatográfica
sem que ocorram perdas em resolução, usando a cromatografia líquida de ultra alta eficiência
(UHPLC, do inglês Ultra High Performance Liquid Chromatography). Essa técnica baseia-se
no uso de fases estacionárias com partículas de diâmetro inferiores a 2 µm, tendo surgido
como uma abordagem de características superiores aos tradicionais métodos utilizando
HPLC. Dessa forma, métodos empregando a UHPLC, quando comparados com métodos
convencionais empregando colunas recheadas com partículas de 5 µm, irão apresentar
como vantagens: maior rapidez, maior economia em relação ao consumo de solvente, melhor
eficiência cromatográfica e melhor detectabilidade (Maldaner & Jardim, 2009; Núñez et al.,
2012).
1.6.2.2 – TÉCNICAS DE DETECÇÃO
Embora a Diretiva 2002/657/EC ainda aceite, como possíveis técnicas confirmatórias,
para determinados antimicrobianos específicos, a utilização dos métodos de detecção
fazendo uso do arranjo de diodos (DAD) ou da fluorescência (FLD), sabe-se que, do ponto
de vista prático, um método só poderá confirmar a presença de um resíduo se o mesmo
fornecer informações sobre a estrutura química do mesmo. Dessa forma, o uso dos
detectores citados acima não atenderão esse requisito e apenas o detector fazendo uso da
espectrometria de massas sequencial permitirá tal confirmação estrutural (Blasco et al.,
2007; Reig & Toldrá, 2008; Marazuela & Bogialli, 2009).
O poder de detecção cromatográfica quando se utiliza um espectrômetro de massas
está relacionado com sua capacidade em oferecer informações estruturais do analito,
através da determinação de sua massa molecular, mediante a formação de seu íon percursor
e obtenção de seus produtos de fragmentação. Assim, mais do que a correta identificação
do composto, a combinação LC-MS/MS também possibilita a quantificação de compostos
que não foram totalmente resolvidos cromatograficamente (Gentili et al., 2005).
No que diz respeito ao modo de interfaceamento LC-MS, quando se objetiva a
determinação de RFV, pode-se afirmar que a maior parte dos métodos utilizam as fontes de
ionização à pressão atmosférica (API, do inglês Atmospheric Pressure Ionization). As duas
69
principais fontes de ionização bastante empregadas na análise de RFV constituem a
ionização por eletronebulização ou eletrospray (ESI, do inglês Electrospray Ionisation) e a
ionização química à pressão atmosférica (APCI, do inglês Atmospheric Pressure Chemical
Ionisation). O modo de ionização por ESI mostra-se adequado para a caracterização de
moléculas que possuem desde o caráter hidrofóbico até o caráter hidrofílico, seja para as
pequenas, ou mesmo as moléculas relativamente grandes. Porém, pode-se inferir que ESI e
APCI se complementam, no que diz respeito a ionização de moléculas quanto a polaridade
e massa molar dos analitos (Gentili et al., 2005; Reig & Toldrá, 2008).
O uso da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-
MS/MS), fazendo uso de analisadores do tipo triplo quadrupolo (QqQ) ou ion-trap (IT),
mostra-se como a principal escolha na determinação da maioria dos RFV-AOA. No entanto,
o uso de um analisador QqQ, no modo de monitoramento seletivo de reações (SRM, do
inglês Selected-Reaction Monitoring), é o que se tem, atualmente, de mais usual em tais
tipos de análise, pois este permite a determinação simultânea de substâncias, suas
identificações inequívocas e suas devidas quantificações, enquanto que o analisador do tipo
IT já mostra-se mais adequado na obtenção de espectros de varredura total, tendo a
capacidade de executar experimentos do tipo MSn, possibilitando a caracterização estrutural
e a confirmação da identidade de metabólitos. Não obstante, embora o uso de um QqQ
possua detectabilidade e seletividade adequada, existe um limite de ordem técnica do
número de compostos alvos a serem monitorados simultaneamente. Dessa forma, para
análises multiresíduo, existe uma tendência crescente no uso de técnicas utilizando a
espectrometria de massas de alta resolução (HRMS, do inglês High Resolution Mass
Spectrometry) (ex.: ToF, Orbitrap), pois estas podem chegar a determinar mais de cem
compostos em uma única análise (Bizec et al., 2009; Brabander et al., 2009; Marazuela &
Bogialli, 2009).
Uma abordagem mais detalhada no uso da espectrometria de massas como técnica
de detecção cromatográfica na análise de RFV-AOA é dada no Capítulo 3, onde se faz uso
da mesma no desenvolvimento do método analítico.
O processo de quantificação dos analitos pode, em algumas situações, tornar-se um
assunto dificultoso por conta de interferentes da matriz poderem constituir um entrave no
desenvolvimento do método, uma vez que algumas dificuldades podem surgir em virtude do
efeito matriz. Os métodos LC-MS, fazendo uso da fonte de ionização por ESI ou APCI,
sempre se mostram passíveis de sofrerem o efeito matriz, uma vez que os extratos obtidos
de amostras alimentícias frequentemente contribuem para esse efeito. O efeito matriz mais
70
comumente observado diz respeito ao ganho ou a supressão do sinal analítico, sendo
induzido pela presença de coextrativos eluídos simultaneamente com os analitos na corrida
cromatográfica. Algumas estratégias passam a ser usadas visando a eliminação e/ou
compensação do efeito matriz, dentre elas podem ser destacadas a construção da curva
analítica na matriz e o uso de padrões internos marcados isotopicamente. No entanto, essas
abordagens podem apresentar desvantagens, como o levantamento da curva analítica na
matriz poder ser um processo trabalhoso e demorado, não existir matriz branca e o uso dos
padrões isotopicamente marcados serem caros e nem sempre disponíveis comercialmente
(Blasco et al., 2007; Marazuela & Bogialli, 2009).
Um levantamento é mostrado a seguir onde se procura apresentar uma visão geral
dos diversos tipos de preparo de amostra, bem como dos diversos tipos de técnicas
analíticas empregados na determinação de RFV-AOA. Na Tabela 1.3 (pg 71) estão
apresentados procedimentos representativos de extração de RFV-AOA, enfocando técnicas
manuais. Na Tabela 1.4 (pg 74) é dada ênfase às técnicas instrumentais de preparo de
amostra e na Tabela 1.5 (pg 77) são apresentados procedimentos visando a etapa de clean
up.
71
TABELA 1.3: PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE RFV-AOA COM ENFOQUE NAS TÉCNICAS MANUAIS
Abreviações: aminoglicosídeos (AG); anfenicóis (AN); avermectinas (AV); β-lactâmicos (βL); benzimidazol (BI); lincosamidas (L); macrolídeos (M); nitrofuranos (NF); nitroimidazóis (NI); penicilinas (P); quinolonas (Q); sulfonamidas (S); tetraciclinas (T); trimetoprima (tri).
Técnicas Manuais - métodos baseados na extração com solvente
Analitos (nº total de compostos)
Matriz Preparo de Amostra
1 – Extração 2 – Etapa de clean up
Determinação Em caso da LC-MSn: 1 – Fonte de ionização 2 – Analisador
Ref.
S, T, pirimetamina (10 compostos)
Leite
1 – Foram adicionados 2 mL de ácido tricloroacético (20%, v/v) a 5 mL da amostra, sendo levada
à agitação em vórtex e posteriormente adicionando-se 20 mL de tampão McIlvaine e novamente agitando-se a mistura. O extrato teve seu pH ajustado a 4,5 com NaOH (1 mol L-1), onde após centrifugação foi submetido a um clean up;
2 – SPE (Oasis HLB)
LC-MS 1 – ESI (+) 2 – Quadrupolo simples
Koesukwiwat et al., 2007
T, Q, P, S, M, tri (38 compostos)
Músculo de frango
1 – 3 g da amostra fortificada foram extraídas com 200 µL de uma solução de EDTA
(0,1 mol L-1) e 10 mL de uma solução MeOH:H2O (70:30, v/v);
2 – Não foi utilizada etapa de clean up.
UHPLC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ
Chico et al., 2008.
βL, T, Q, P, S, M, L, tri
(38 compostos) Leite
1 – 1 mL da amostra foi extraído com 0,5 mL de H2O e 3 mL de ACN. A fase sobrenadante foi
removida e evaporada, sendo o resíduo reconstituído em 3 mL de uma solução fosfato tamponada (0,1 mol L-1; pH = 8,5);
2 – SPE (Oasis HLB) – fase polimérica
UHPLC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ
Han et al., 2015.
S, T, M, Q, P, AN, tri
(41 compostos)
Músculo bovino
1 – Foram tomados 2 g de amostra, sendo realizada a extração com 10 mL de ACN e 1 mL de
EDTA (0,1 mol L-1). Após centrifugação o extrato foi submetido a uma limpeza.
2 – Partição líquido-líquido com hexano.
UHPLC-MS/MS 1 – ESI (+) e ESI (-) 2 –QqQ
Freitas et al.,
2014.
72
S e T (17 sulfonamidas e 5 tetraciclinas)
Peixe
1 – Foram adicionados a 1 g de amostra: 5 mL ACN + 5 mL MeOH + 5 µL HCOOH, seguindo-se com agitação em vórtex (30 s), banho de ultrassom (15 min.) e centrifugação (10 min.). Uma alíquota de 4 mL do sobrenadante foi transferida, evaporada, reconstituída, filtrada e analisada.
2 – Sem etapa de clean up
UHPLC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ
Dasenaki & Thomaidis, 2010.
Técnicas Manuais - Procedimentos Genéricos (QuEChERS; MSPD e outros)
Analitos (nº total de compostos)
Matriz Preparo de Amostra
1 – Extração 2 – Etapa de clean up
Determinação Em caso da LC-MSn: 1 – Fonte de ionização 2 – Analisador
Ref.
Sulfonamidas (S) (13 compostos)
Ovos
1 – Trataram-se 10 g de amostra (clara + gema), previamente homogeneizada, com 900 µL de
ácido acético (10%, v/v) para se ajustar o pH entre 5 e 6, deixando-se em repouso por 15 min. Em seguida adicionaram-se 30 mL de clorofórmio/acetona (1:1 v/v) agitando-se por 10 min, sendo a mistura levada a banho de ultrassom por 20 min. Em seguida foram adicionados 3 g de NaCl e 3 g de Na2SO4 à mistura, sendo agitada vigorosamente e depois centrifugada. Transferiu-se o extrato deixando-o em repouso por 30 min a -70 ºC, para melhor separar as fases orgânica e aquosa. Foram adicionados 10 mL de ácido acético glacial a 25 mL da fase orgânica, sendo em seguida promovida uma etapa de limpeza na mistura.
2 – SPE (cartuchos SCX benzensulfônico)
HPLC-DAD Summa et al.,
2015
Anfenicóis (AN) (4 compostos)
Músculo de Peixe e Camarão
MSPD: 1 – Foram tomados 1 g de amostra juntamente com 2 g de sorvente (C18), sendo os mesmos
cuidadosamente misturados com auxílio de gral e pistilo até que se obtivesse uma mistura homogênea. Levou-se a mistura à uma coluna de vidro (300 mm x 15 mm d.i.), sendo utilizadas, respectivamente, as misturas dos solventes (AcOEt/ACN) e (AcOEt/ACN/NH4OH), ambas em gradiente de eluição. O eluato foi recolhido e levado à secura, auxiliado com fluxo suave de nitrogênio. O resíduo foi reconstituído, filtrado e analisado.
LC-MS/MS
1 – ESI (+) e ESI (-) 2 – QqQ
Tao et al., 2014.
Benzimidazol (BI) (19 analitos)
Leite
QuEChERS:
1 – 10 g de amostra foram extraídas com 10 mL de ACN/NH3 (0,1%, v/v), seguindo-se com a adição de 5 g de MgSO4:NaCl (4:1, m/m), com imediata agitação por 1 min e posterior centrifugação por 5 min.
UHPLC-MS/MS
1 – APCI 2 – QqQ
Villalba et al., 2013.
73
2 – Clean up: transferiu-se 1 mL do sobrenadante para um tubo do tipo Eppendorf (2 mL) contendo MgSO4 (150 mg) + C18 (50 mg) + PSA (50 mg). A mistura foi agitada em vórtex (1 min) e centrifugada (2 min). Uma alíquota de 500 µL do sobrenadante foi evaporada, reconstituída, filtrada e analisada.
Multiclasse BI, L, M, NI,
Q, S, T e outros
(100 analitos)
Músculo, fígado e
rim
1 – Homogeneização de 6 g de amostra + 30 mL de ACN. Em seguida adiciona-se 1 g (NH4)2SO4 + 30 mL de solução extratora (tampão succinato-EDTA), seguido de homogeneização e centrifugação (10 min.) Ambas as fases líquidas foram transferidas, adicionando-se mais 2 g de (NH4)2SO4 e evaporando-se a mistura sob vácuo a 50 ºC. A solução remanescente teve o pH ajustado em 6,5 com NH4OH (12,5%, v/v), prosseguindo-se com centrifugação (5 min). O recipiente foi lavado com 6 mL da mistura tampão succinato/dimetilssulfóxido, sendo o
solvente de lavagem submetido à centrifugação. A fase líquida foi transferida e diluída em 14 mL de H2O para posterior etapa de clean up.
2 – SPE (Oasis HLB) – fase polimérica
UHPLC-MS
1 – ESI 2 – TOF (intervalo m/z: 100-1000)
Kaufmann et al., 2008.
Sulfonamidas (S) (7 analitos)
Fígado (de frango,
suíno e bovino)
MSPD:
1 – 0,5 g de amostra foram dispersados com 1,5 g do sorvente terra diatomácea (sílica, alumina neutra e C18, também foram testados). O material dispersado foi transferido para um dispositivo do tipo seringa (10 mL) passando a ser eluído com 8 mL de acetona. O eluato foi então evaporado até a secura. 500 µL de solução tampão de CH3COONa (0,02 mol L-1, pH 3,5) + 5 µL de solução do reagente derivatizante fluorescamina (10 mg mL-1) foram utilizados para reconstituir o resíduo. 2 – Clean up: 1 mL de hexano foi empregado para extração líquido-líquido da fase obtida em 1. A fase hexânica foi removida e descartada, passando a fase remanescente a ser filtrada e analisada.
HPLC-FLD
(mediante reação de derivatização com
solução de fluorescamina)
Zhang et al.,
2012.
Multiclasse M, Q, S, AV e
outros
(20 compostos)
Músculo de frango
QuEChERS modificado:
1 – Adicionaram-se 5 mL de H2O pura a 5 g de amostra, seguindo-se com a adição de 10 mL de CH3COOH (1%, v/v) em solução de ACN/H2O (80:20, v/v), sendo a mistura agitada por 15 min. Em seguida adicionaram-se 0,5 g de citrato sódico dibásico sesquiidratado + 1 g de citrato sódico diidratado + 4 g de MgSO4 anidro, seguido de agitação (15 min.) e centrifugação (5 min.)
UHPLC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ
Lopes et al., 2012c.
74
TABELA 1.4: PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE RFV-AOA COM ENFOQUE NAS TÉCNICAS INSTRUMENTAIS
2 – Transferiu-se 1 mL de fase orgânica para um Eppendorf contendo 150 mg de PSA, seguindo-se com agitação manual (30 s) e centrifugação (5 min). Tomaram-se 500 µL do sobrenadante filtrado e dilui-se em 500 µL de fase cromatográfica para posterior análise.
TÉCNICAS INSTRUMENTAIS (PLE; MAE; SFE)
Abreviações: aminoglicosídeos (AG); anfenicóis (AN); avermectinas (AV); β-lactâmicos (βL); benzimidazol (BI); lincosamidas (L); macrolídeos (M); nitrofuranos (NF); nitroimidazóis (NI); penicilinas (P); quinolonas (Q); sulfonamidas (S); tetraciclinas (T); trimetoprima (tri).
Analitos (nº total de compostos)
Matriz Preparo de Amostra
1 – Extração 2 – Etapa de clean up
Determinação Em caso da LC-MSn:
1 – Fonte de ionização 2 – Analisador
Ref.
M, AV (18 compostos)
Músculo, fígado e rim (bovino e suíno)
1 - PLE:
Foram misturados 2 g de amostra com 12 g de areia, previamente tratada com EDTA, até a obtenção de um material seco, sendo o mesmo levado à cela de extração (22 mL de capacidade);
Condições otimizadas de extração – temperatura: 60 ºC; pressão: 1500 psi; tempo do ciclo de extração: 10 min.; nº de ciclos de extração: 2; Solvente de extração: H2O/ACN (1:1, v/v).
O extrato obtido foi totalmente evaporado sob destilação à vácuo, o resíduo foi ressuspendido e transferido com 5 mL de MeOH, sendo o mesmo evaporado até a secura com fluxo suave de nitrogênio. O mesmo foi reconstituído em 1 mL de fase móvel, filtrado e injetado no sistema cromatográfico.
LC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ
Tao et al., 2012
75
TABELA 1.4 (Continuação)
TÉCNICAS INSTRUMENTAIS (PLE; MAE; SFE)
Abreviações: aminoglicosídeos (AG); anfenicóis (AN); avermectinas (AV); β-lactâmicos (βL); benzimidazol (BI); lincosamidas (L); macrolídeos (M); nitrofuranos (NF); nitroimidazóis (NI); penicilinas (P); quinolonas (Q); sulfonamidas (S); tetraciclinas (T); trimetoprima (tri).
Analitos (nº total de compostos)
Matriz Preparo de Amostra
1 – Extração 2 – Etapa de clean up
Determinação Em caso da LC-MSn:
1 – Fonte de ionização 2 – Analisador
Ref.
Quinolonas (Q) (15 compostos)
Músculo, fígado e rins (bovino e suíno); Músculo e fígado de frango; Músculo de peixe
1 – PLE:
Misturou-se 5 g de tecido homogeneizado com 1 g de terra diatomácea, sendo a mistura levada à cela de extração (11 mL de capacidade). Condições otimizadas de extração – pressão: 70 bar; temperatura: 65 ºC; tempo de aquecimento da cela: 5 min.; tempo de extração estático: 2 min.; nº de ciclos de extração: 2; solvente de extração: ACN.
O extrato foi evaporado até a secura e ressuspendido em 10 mL de uma solução fosfato para ser submetido a clean up. 2 - SPE: cartuchos Oasis HLB
HPLC-DAD
LC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ
Yu et al.,
2012.
S, P, AN, T, tri
+ 3 metabólitos sulfonamídicos
(16 compostos)
Peixes:
- anchova - pescada - linguado e Mexilhão
1 - Extração enzimática assistida por micro-ondas (MAE-enzimática):
Foram levadas à cela de extração 2 g de amostra liofilizada juntamente com 5 mL de água deionizada e 50 µL de solução de Proteinase-K.
Condições de extração – tempo de extração: 5 min.; potência da radiação: 50 W.
O extrato obtido foi centrifugado e o sobrenadante tratado com 100 µL de ácido fórmico e submetido a clean up.
2 – Particionamento líquido-liquido com 5 mL de diclorometano (2x) com agitação manual. A fase
orgânica obtida foi evaporada com fluxo suave de nitrogênio. O resíduo foi reconstituído em 1 mL de água deionizada, filtrado e injetado no sistema cromatográfico.
LC-MS/MS
1 – ESI (+) e ESI (-) 2 – QqLIT
Torres et al., 2011.
76
Quinolonas (Q) (8 compostos)
Músculo suíno
1 - MAE:
Foram levadas à cela de extração 5 g de amostra juntamente com 25 mL da solução de extração – ácido meta-fosfórico 0,3%/ACN (75:25, v/v). Após o 1º ciclo, repetiu-se novamente a extração, dessa vez utilizando-se 10 mL da fase extratora. Condições de extração – tempo de extração: 4 min.; potência da radiação: 40% (potência máxima de 300 W).
O extrato obtido foi centrifugado, filtrado em membrana de 22 µm e submetido a clean up.
2 – SPE: Ao extrato obtido foram adicionados 75 mL de água com o intuito de se reter os analitos
no cartucho de extração em fase sólida. Após eluição dos analitos do cartucho, a fase obtida foi evaporada e o resíduo reconstituído, sendo posteriormente injetado no sistema cromatográfico.
HPLC-DAD Hermo et al.,
2005.
Anfenicóis (AN) (3 compostos)
Músculo de camarão
1 – SFE:
Levou-se a um almofariz de vidro 500 mg de músculo homogeneizado, juntando-se a este 500 mg de areia e 1 g de Na2SO4 anidro, para a devida desidratação da amostra. Após completa maceração, levou-se a mistura à câmara de extração, sendo ainda adicionados 600 µL de acetato de etila como modificador, para se promover o aumento da solubilidade dos anfenicóis no CO2. Condições otimizadas de extração: pressão: 25 MPa; temperatura: 60 ºC; tempo de extração estático: 5 min.; tempo de extração dinâmico: 10 min. As substâncias extraídas foram coletadas em tubo de vidro para se promover a reação de sililação in situ com o reagente SYLON BFT. O solvente foi evaporado até a secura, auxiliado por fluxo suave de nitrogênio, e o resíduo reconstituído em 200 µL de acetato de etila para posterior análise cromatográfica.
GC-MS-NCI Liu et al.,
2010.
77
TABELA 1.5: PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE RFV-AOA COM ENFOQUE NA ETAPA DE CLEAN UP
Abreviações: aminoglicosídeos (AG); anfenicóis (AN); avermectinas (AV); β-lactâmicos (βL); benzimidazol (BI); lincosamidas (L); macrolídeos (M); nitrofuranos (NF); nitroimidazóis (NI); penicilinas (P); quinolonas (Q); sulfonamidas (S); tetraciclinas (T); trimetoprima (tri).
TÉCNICAS DE CLEAN UP - Metodologias Usuais (SPE; d-SPE; MIP/MISPE)
Analitos Matriz Preparo de Amostra
1 – Técnica de Extração 2 – Etapa de clean up
Determinação Em caso da LC-MSn:
1 – Fonte de ionização 2 – Analisador
Ref.
Sulfonamidas (S) (14 compostos)
7 tipos de
pescado marinho koreano
d-SPE: 1 – Adicionou-se 5 mL de ACN a 1 g de amostra triturada, agitando-se a mistura por 1 min. e levando a
mesma a banho de ultrassom por 10 min., sendo a mesma centrifugada em seguida. Após o sobrenadante ser reservado, repetiu-se a mesma etapa por mais uma vez, sendo no final combinados os dois sobrenadantes; 2 – (Etapa dispersiva): 100 mg do dispersante C18 foram adicionados à fase orgânica; após agitação
por 30 s, seguiu-se com a centrifugação, separação e evaporação do sobrenadante, com auxílio de fluxo suave de N2 (g), até a secura. O resíduo foi ressuspendido em 1 mL de solução 5 mmol L-1 de KH2PO4 e então filtrado para posterior análise cromatográfica.
HPLC-DAD UHPLC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ
Won et al., 2011.
βL, T (11 compostos)
Músculo bovino
d-SPE: 1 – Extraiu-se 2 g de amostra com 10 mL de solução ACN/H2O (80:20, v/v), mediante
homogeneização/agitação em ultra turrax, seguindo-se com uma etapa de centrifugação para posterior clean up.
2 – 1ª parte (partição líquido-líquido com hexano): 5 mL de hexano foram adicionados ao sobrenadante,
obtido anteriormente, para a remoção do excesso de gordura;
2 – 2ª parte (etapa dispersiva): Após remoção da fase hexânica, 500 mg do dispersante C18 foram
adicionados à fase aquosa; após agitação e centrifugação, evaporou-se o sobrenadante, com auxílio de fluxo suave de N2 (g), até um volume aproximado de 1,5 mL, sendo o mesmo avolumado para 2 mL com água e então filtrado para posterior análise cromatográfica.
UHPLC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ
Rezende et al., 2012.
78
Sulfonamidas (S) (6 compostos)
Camarão &
Peixe
MIP – Um polímero de impressão molecular foi sintetizado utilizando o ácido metacrílico como monômero funcional, o etileno glicol dimetacrilato como reagente de ligação cruzada, o 2,2’-azobis (2-isobutironitrila) (AIBN) como iniciador e a sulfadimetoxima como molécula molde, tendo sido também sintetizado o polímero não impresso (NIP). O MIP e o NIP foram empregados como fases estacionárias em SPE (MISPE e NISPE, respectivamente), tendo sido desenvolvido e validado um método para determinação de 6 sulfonamidas em peixe e camarão. Os desempenhos dos dois tipos de polímeros também foram comparadas com um cartucho SPE SCX convencional.
1 – 10 mL de solução H2O/CH3COOH (1%, v/v) foram adicionados a 5 g de amostra, agitados em vórtex e
levados a ultrassom por 5 min. A mistura foi centrifugada e o sobrenadante recolhido para etapa de limpeza do extrato.
2 – Clean up semelhante para MISPE e NISPE:
Condicionamento: 1 mL de MeOH; 1 mL de solução H2O/CH3COOH (1%); Carregamento: Levou-se o sobrenadante, obtido na etapa de extração, aos cartuchos previamente condicionados; Lavagem: 1 mL H2O/ACN/ CH3COOH (94:5:1, v/v/v); Eluição: 3 mL ACN/CH3COOH (95:5, v/v).
HPLC-UV Shi et al.,
2011.
Aminoglicosídeos (AG)
(9 analitos)
Mel
SPE/MISPE
1 – 10 g de amostra são diluídas em 19,5 mL de tampão fosfato (50 mmol L-1, pH 7) e agitado por 5 min. Verifica-se e ajusta, se necessário, o pH a 7 com solução de NaOH (1 mol L-1). O volume final da solução é ajustado a 20 mL com a mesma solução de tampão fosfato. 1 – Clean up: Condicionamento: aplicação sucessiva de 1 mL de MeOH e 1 mL de tampão fosfato (pH 7); Carregamento: alíquota de 3 mL do extrato (obtido em 1) é levada ao cartucho condicionado, sendo eluída a um fluxo de 0,2 mL min-1; Lavagem: 1ª etapa: aplicação sucessiva de 3 mL de H2O e 1 mL de NH4OH (0,1%, v/v); 2ª etapa: aplicação sucessiva de 1 mL ACN/H2O (40:60, v/v) e 1 mL CH2Cl2/MeOH (50:50, v/v); Eluição: 1 mL de HCOOH (1%, v/v) em solução ACN/H2O (20:80, v/v).
O extrato é diluído quatro vezes em água, agitado, filtrado e injetado.
Obs: cartucho disponível comercialmente (SupelMIP AGs SPE Column, 50 mg, 3 mL).
CE-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – IT
Moreno-González
et al., 2015.
79
Quinolonas (Q) (4 compostos)
Leite bovino
& Rim
suíno
MIP/MISPE:
1.1 - Amostra de leite bovino
10 mL de leite foram diluídos com 10 mL de uma solução tampão de acetato de amônio (10 mmol L-1; pH 5,0), agitada e centrifugada. Em seguida tomou-se o sobrenadante ajustando-se seu pH a 7,0 com solução de NH4OH (3%), sendo em seguida adicionado o tampão acetato de amônio até um volume final de 25 mL, seguindo-se a etapa de limpeza; 1.2 – Amostra de rim suíno
2 g da matriz foram triturados e homogeneizados, sendo a esta porção adicionados 30 mL de solução de NaH2PO4 (50 mmol L-1; pH 7,4), seguido de agitação e centrifugação. Filtrou-se uma alíquota de 2 mL do sobrenadante e submeteu-se 1 mL da solução filtrada à etapa de limpeza; 2 - clean up (igual para ambas as amostras): Condicionamento: aplicação sucessiva de 1 mL de MeOH; 2 mL H2O e 0,5 mL de tampão acetato de amônio (10 mmol L-1); Carregamento: 1 mL da solução final do extrato foi levada ao cartucho condicionado, sendo eluída a um
fluxo de 0,2 mL min-1; Lavagem: aplicação sucessiva de 3 mL de H2O e 1 mL de ACN; Eluição: solução MeOH/H2O (1:1, v/v), com NH4OH (3%).
O extrato foi levado à secura, sob fluxo de N2(g), e o resíduo reconstituído em 400 µL (ACN/eletrólito de corrida (25:75, v/v), filtrado e injetado.
Obs: cartucho disponível comercialmente (SupelMIP FQ SPE Column).
CE-LIF Agüí et al.,
2010
80
1.7 – Validação de Métodos Analíticos
A validação de um método analítico é a demonstração por parte do laboratório, através
de meios e critérios objetivos, que um determinado ensaio executado conduza a resultados
confiáveis e adequados à qualidade pretendida (INMETRO, 2003).
O processo de validação é uma ação contínua que se inicia desde o planejamento da
estratégia analítica e prossegue durante todo o seu desenvolvimento. Um procedimento
validado e bem documentado é capaz de fornecer às agências regulamentadoras, informações
de que o método desenvolvido e o sistema analítico empregado se adequam a uma dada
metodologia que venha ser utilizada por tal agência (Ribani et al., 2004).
Os parâmetros comumente utilizados para validação de um método analítico são:
seletividade, faixa linear da curva analítica e linearidade, precisão (repetibilidade e precisão
intermediária), exatidão, limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ), podendo
ser ainda avaliado o efeito matriz. Todos esses parâmetros se baseiam em recomendações e
orientações estabelecidas pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA,
2011) e pela Comunidade Europeia (EC, 2002).
1.7.1 - Seletividade
A seletividade de um método analítico é a capacidade que o mesmo possui de
quantificar de forma inequívoca o analito de interesse na presença de interferentes da amostra.
Tais interferentes poderão ser substâncias de natureza endógena, metabólitos, produtos de
degradação, isômeros, dentre outros. Dessa forma, a seletividade deverá garantir que seja lido
de forma exclusiva o sinal analítico do composto a ser investigado. Para se avaliar a
seletividade leva-se em conta não somente a aplicação do método, mas também o tipo de
técnica instrumental a ser empregada (Paschoal et al., 2008; Cassiano et al., 2009).
A seletividade de um método pode ser avaliada de duas formas, sendo que a primeira
delas consiste em se comparar a matriz isenta dos analitos de interesse (matriz branco) com
a matriz adicionada com as mesmas substâncias (matriz branco fortificada). Procedendo de
tal forma, se avalia se interferentes da matriz coeluíram nos mesmos tempos de retenção dos
analitos de interesse. A segunda maneira é através da utilização de detectores mais seletivos
(arranjo de diodos, espectrômetros de massas) que são capazes de registrar espectros do pico
de interesse durante a etapa cromatográfica e, assim, permitindo a comparação do mesmo
81
com o espectro de um composto puro (padrão), utilizando tal comparação como indicativo da
presença ou não do analito a ser investigado.
1.7.2 - Faixa Linear da Curva Analítica e Linearidade
Linearidade é a capacidade que um método possui de responder de forma diretamente
proporcional à concentração do analito investigado numa amostra, em um dado intervalo de
concentração (INMETRO, 2003).
A linearidade pode ser estimada matematicamente por um artifício denominado de
regressão linear, sendo o mesmo obtido mediante um conjunto de valores adquiridos
experimentalmente. A regressão linear fornece uma equação matemática que é denominada
curva analítica, sendo a mesma expressa por:
y = ax + b
onde:
y - resposta analítica medida (altura/área do pico, valor de absorbância, etc.);
x – concentração do analito medida;
a – coeficiente angular (inclinação da curva, que também serve para se estimar a
sensibilidade do método);
b – coeficiente linear da curva.
Além dos coeficientes de regressão a e b, também é possível se obter o coeficiente de
correlação linear r, parâmetro utilizado para se estimar a qualidade da curva analítica, onde se
seguem determinados critérios de aceitabilidade preconizados por agências regulamentadoras
oficiais, sendo que a ANVISA cita na aceitação de valores iguais ou superiores a 0,98 e a
Comunidade Europeia a 0,99. Durante o processo de avaliação da linearidade, os cálculos de
regressão linear não se tornam suficientes, sendo necessária também a avaliação dos valores
de resíduos da regressão linear, sendo que os mesmos valores de resíduos deverão estar
distribuídos de forma aleatória ao longo da linha de regressão, para então se confirmar a
linearidade (Paschoal et al., 2005; Ribani et al., 2004).
Métodos de Padronização
A construção da curva analítica poderá ser realizada por três diferentes tipos de
critérios, sendo que deverá ser levado em consideração o tipo de análise, bem como o
82
tratamento empregado na etapa do preparo de amostra, uma vez que é desejável elevados
níveis de exatidão e precisão.
Padronização Externa - utilizada para amostras que não exijam elaborados processos de
preparo de amostra, sendo comparada a área do analito a ser quantificado numa amostra
com as áreas do padrão em soluções de concentrações conhecidas. Somente pode ser
empregado na ausência de efeito matriz.
Padronização Interna - método de padronização realizado mediante o preparo de
soluções, de concentrações conhecidas, de um dado padrão. A essas mesmas soluções se
adiciona quantidades de uma outra substância que será chamada padrão interno que por
sua vez deverá possuir concentração constante em todos os níveis de concentração da
curva analítica da substância a ser quantificada. A substância a ser utilizada como padrão
interno preferencialmente deverá possuir propriedades físico-químicas semelhantes ao
analito que se queira estudar e o gráfico da curva analítica deverá ser construído pela
relação entre a razão das áreas (analito/padrão interno) pelas respectivas concentrações
do analito. Este método se mostra de extrema utilidade, uma vez que permite a correção de
pequenas variações em variáveis experimentais, principalmente relacionadas com a etapa
do preparo de amostra (exemplo: extração, evaporação, ressuspensão). Vale lembrar que
a amostra real a ser analisada deverá ser fortificada com a mesma quantidade de padrão
interno.
Curva Analítica na Matriz - como o próprio nome sugere, consiste na construção da curva
analítica na própria matriz branco (matriz isenta do analito a ser analisado), sendo tal artifício
também conhecido como superposição da matriz (matrix matched calibration curve). Esse
procedimento poderá ser empregado tanto na padronização externa quanto na interna. Ele
visa a correção de um possível efeito matriz com a compensação da influência de
coextrativos e interferentes da amostra. Tais influências poderão ser notadas em etapas
como no preparo de amostra (ex.: etapa de pré-concentração), cromatográficas (ex.: perda
de resolução) ou mesmo de detecção (ex.: perda ou acréscimo do sinal analítico).
Adição de Padrão - método de padronização utilizado quando não se dispõe de uma matriz
branco, quando não se possui um padrão interno adequado e ainda, quando a amostra é
muito complexa, exibindo fortes interações matriz/analito. Esse método consiste no
acréscimo de pequenas quantidades do padrão, referente ao analito a ser analisado, à
83
matriz, que por sua vez, já contém determinada quantidade desconhecida do mesmo. A
curva analítica deverá ser construída relacionando-se as áreas dos picos obtidas com as
respectivas quantidades adicionadas. O ponto de intersecção da curva com o eixo das
ordenadas irá informar a área correspondente ao pico do analito presente na amostra a ser
analisada. A extrapolação da curva analítica até o ponto que intercepta o eixo das abcissas
irá informar a concentração do analito na amostra investigada.
1.7.3 - Precisão (Repetibilidade, Precisão Intermediária e
Reprodutibilidade)
De acordo com a IUPAC, a precisão representa o grau de concordância de resultados
de testes independentes obtidos sob condições estabelecidas, sendo expressa pela estimativa
do desvio padrão absoluto (s) ou estimativa do desvio padrão relativo (RSD, do inglês relative
standard deviation), também conhecido como coeficiente de variação (CV).
𝑠 = √∑(𝑥𝑖 − �̅� )2
𝑛−1 ; RSD (%) ou CV (%) =
𝑠
�̅� x 100
�̅� – média das determinações
𝑥𝑖– valor individual de uma medição
n – número de medições
Num processo de validação de método, existem três diferentes modos de se avaliar a
precisão: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. A aceitação dos resultados
depende do nível de concentração e é regido pela Equação de Horwitz.
Repetibilidade (precisão intra-dia) – mostra o quanto o método é capaz de estimar
resultados obtidos sob as mesmas condições de análise (mesmo método, mesmo
instrumento, mesmo analista) em um curto intervalo de tempo. A repetibilidade deve estimar
a concordância de medições de distintos preparo de amostra, não devendo ser confundida
com a precisão instrumental, que avalia a dispersão de resultados de repetidas e sucessivas
injeções de uma única amostra, obtida por um determinado tipo de preparo (Cassiano et al.,
2009; Ribani et al., 2004).
84
Precisão Intermediária (precisão inter-dias) – é um indicativo do quanto o método é
capaz de fornecer os mesmos resultados, porém estes sendo obtidos em diferentes dias
com diferentes analistas, sendo seu objetivo verificar a capacidade de um mesmo
laboratório fornecer os mesmos resultados. Tanto a repetibilidade como a precisão
intermediária podem ser expressas em termos de C.V., sendo aceitos valores de até 20%
para análises a nível de traços (ng/g ou µg/kg) (Cassiano et al., 2009; Ribani et al., 2004).
Reprodutibilidade – é a capacidade de se demonstrar que os mesmos resultados sejam
obtidos por diferentes laboratórios, utilizando-se o mesmo método analítico com as mesmas
amostras. A reprodutibilidade é também conhecida como estudo colaborativo, não sendo
necessária no processo de desenvolvimento e validação de método analítico, a não ser que
se pretenda utilizá-la como método oficial em farmacopeias ou em procedimentos do Codex
Alimentarius. Estudos de colaboração são também de grande importância quando se
pretende avaliar a exatidão de um método analítico (Cassiano et al., 2009; Ribani et al.,
2004).
1.7.4 - Exatidão
Representa a concordância entre os valores determinados experimentalmente e os
valores nominais - valores de referência aceitos como verdadeiros. A exatidão de um método
analítico será a medida dos erros aleatórios e sistemáticos.
𝐸𝑋𝐴𝑇𝐼𝐷Ã𝑂 = (𝑥𝑖
𝑥) 𝑋 100
𝑥𝑖 – concentração experimental
𝑥 – concentração nominal
Para a avaliação da exatidão de um método analítico são geralmente utilizados os
seguintes procedimentos: material de referência certificado, comparação de métodos, ensaios
de recuperação e adição de padrão.
Material de Referência Certificado (CRM) – materiais fornecidos por instituições de
reconhecida confiabilidade, como o NIST (National Institute of Standards and Technology).
85
Na avaliação da exatidão de um método, deverão ser comparados os valores certificados
do material de referência com os valores obtidos pelo laboratório.
Comparação de Métodos – consiste na avaliação da exatidão através da comparação dos
valores de resultados entre o método em desenvolvimento e os resultados obtidos de um
método de referência.
Ensaio de Recuperação (R) – é definido como a quantidade do analito de interesse,
presente ou adicionado à matriz a ser analisada, que será extraído e passível de ser
quantificado. Quando não ocorrer a disponibilidade de um material certificado de referência,
a recuperação poderá ser estimada através de um composto substituto (“surrogate”). O
composto substituto ou surrogate é definido como um padrão analítico, que se deve
adicionar à amostra, o qual possui comportamento físico-químico semelhante à substância
na forma nativa. O mesmo leva tal nome pelo fato da possibilidade desse não entrar no
mesmo estado de equilíbrio da substância na forma nativa, depois do processo de
fortificação da amostra. Tais compostos substitutos poderão ser de alguns tipos:
- Padrão da substância adicionado à matriz branco (fortificação, dopagem,
enriquecimento – do inglês “spiking”);
- Padrão da substância marcado isotopicamente;
- Composto quimicamente diferente da substância de interesse, mas com uma
representatividade do mesmo comportamento físico-químico (muitas vezes chamado de
Padrão Interno).
Uma das desvantagens do procedimento do ensaio de recuperação é o fato da
substância a ser fortificada nem sempre representar o mesmo estado de equilíbrio daquela
que se encontra na forma nativa. Porém, este procedimento torna-se o mais comum de ser
realizado devido a inexistência de materiais certificados.
Adição de Padrão – como descrito no item 1.7.2, utilizado quando existir a dificuldade ou
a inviabilidade de se obter uma matriz branco - matriz isenta dos analitos de interesse
(Cassiano et al., 2009; Ribani et al., 2004).
1.7.5 - Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ)
São parâmetros de desempenho em validação de métodos analíticos, preconizados
pela Comunidade Europeia (EC, 2002), aos quais se aplicam extensivamente na determinação
86
de resíduos de fármacos veterinários em alimentos de origem animal, com o intuito de se
observar a presença ou ausência de substâncias banidas ou regulamentadas (Souza, 2007).
O limite de decisão (CCα) de um método representa o valor limite pelo qual se conclui,
com uma certeza estatística de 1-α, se uma amostra se encontra ou não conforme. Caso a
substância possua um valor estabelecido de LMR, o valor de α será de 5%, e caso a substância
seja classificada como não permitida, o valor de α será de 1%. A capacidade de detecção
(CCβ) de um método representa o valor mais baixo da substância que pode ser detectado,
identificado e/ou quantificado numa amostra com uma probabilidade de erro aceitável (β). Para
todas as substâncias, sendo elas permitidas ou não, o valor do erro será de 5% (Toaldo, 2011;
Paschoal et al.,2008).
1.7.6) Efeito Matriz
Efeito que se observa quando componentes da amostra passam a interferir no
desempenho do sistema de detecção selecionado, sendo o efeito decorrente do processo de
coeluição de substâncias presentes na matriz com os analitos a serem estudados. Consegue-
se diminuir e/ou eliminar o efeito matriz através da redução e/ou eliminação de coextrativos
provenientes da matriz que venham a interferir no processo de detecção dos analitos,
utilizando-se para isso métodos de extração e etapas de clean-up cada vez mais efetivos e
seletivos nas etapas do processo de preparo de amostra (Moreira, 2012 e Friggi, 2012).
Embora o estudo do efeito matriz venha a ser investigado em diferentes métodos
bioanalíticos, tais como: HPLC-DAD, HPLC-FLD e LC-MS/MS, é nesse último que se observa
a necessidade de uma maior atenção, devido ao mesmo estar propenso a uma maior fonte de
erros decorrente da possibilidade do comprometimento da eficiência de ionização pela
presença de substâncias não monitoradas durante a etapa de detecção no espectrômetro de
massas. Muito embora se desconheça o mecanismo exato do efeito matriz quando se utiliza a
LC-MS/MS, estima-se que esse efeito se origine entre a competição do analito e componentes
não voláteis da matriz, durante a etapa de transferência de elétrons do capilar para a solução,
e posterior distribuição de cargas na superfície da gota que irá originar os íons em fase gasosa.
Tal fenômeno poderá causar uma diminuição (supressão) ou aumento da eficiência
(incremento) de formação de íons a serem analisados (Cassiano et al., 2009).
87
1.8 – Considerações introdutórias finais
Nos últimos anos se observa que foram desenvolvidos um número relativamente grande
de métodos analíticos visando a determinação de resíduos de fármacos veterinários em
alimentos, porém à medida que vão surgindo e sendo melhoradas novas tecnologias, seja no
que diz respeito à etapa de separação dos analitos ou mesmo na de detecção, bem como
também no emprego de novas abordagens durante a etapa de preparo de amostras,
necessário se faz que métodos analíticos já desenvolvidos sejam revistos, comparados e
modificados. Tudo isso com o intuito de que características como custo e benefício, dentre
outras, sejam alcançadas, favorecendo a escolha entre o emprego de diversas técnicas.
Diante de características apresentadas pela cromatografia de ultra alta eficiência
associada a espectrometria de massas sequencial, no que diz respeito a versatilidade e
confiabilidade de resultados exigidos, é forçoso afirmar que seu emprego mostra-se bastante
consagrado no campo de análise de resíduos. Porém, tal técnica possui custo relativamente
elevado, seja em se tratando da aquisição de equipamento, sua manutenção ou mesmo com
a necessidade de mão de obra qualificada e bem treinada, o que por final implicará no
encarecimento da análise. Diante do exposto, necessário se faz que outras abordagens
relativamente mais econômicas e simplificadas, com o sistema de detecção atendendo
também tais características, sejam testadas e, caso necessário, implementadas visando
atender as inúmeras necessidades das rotinas laboratoriais de controle e fiscalização
existentes.
Levando-se em conta a necessidade de simplificação dos procedimentos de preparo de
amostras, o método QuEChERS tem se apresentado bastante aceito e difundido. Não
obstante, procedimentos mais simplificados atendendo os critérios de extração dos analitos da
matriz alimentar, devem ser testados e propostos.
Por fim, cabe destacar que o Brasil carece de dados de análise de amostras de
alimentos disponíveis ao consumidor.
88
Capítulo 02
Objetivo
89
O presente trabalho possuiu como objetivo geral o desenvolvimento e a validação de
dois diferentes métodos analíticos para a determinação multiresíduo de fármacos em matrizes
alimentares de origem animal, usando a cromatografia líquida associada a dois diferentes
sistemas de detecção.
Os objetivos específicos compreenderam:
Avaliar diferentes preparos de amostra, baseados no procedimento QuEChERS,
para a determinação de resíduos de quinolonas em amostras de salmão por
UHPLC-MS/MS.
Desenvolver e validar um método para a determinação de resíduos de quinolonas
em amostras de salmão por UHPLC-MS/MS e analisar amostras de salmão do
mercado.
Avaliar a extração de resíduos de avermectinas e milbemicinas em músculo
bovino usando a extração por líquido pressurizado (PLE) e a avaliação de
diferentes técnicas de clean up (in situ).
Desenvolver e validar um método para a determinação de resíduos de
avermectinas e milbemicinas em músculo bovino por HPLC-FLD e analisar
amostras do mercado.
90
Capítulo 03
Desenvolvimento e Validação de Método para Determinação de Quinolonas em Salmão por UHPLC-MS/MS
91
3.1 – INTRODUÇÃO
3.1.1 – Aquicultura
Atualmente a aquicultura é definida pela Organização das Nações Unidas para
Agricultura e Alimentação (FAO, Food and Agricultural Organization of the United Nations)
como o cultivo de organismos aquáticos que incluem peixes, moluscos, crustáceos e plantas
aquáticas. Tal cultivo implica em intervenção no processo de criação, visando um ganho em
sua produção, e abrange um número relativamente alto de espécies, tipos de criação e
técnicas de manejo. Tal atividade, praticada de forma extensiva, se caracteriza pelo cultivo de
espécies em determinado habitat sem o acréscimo de alimentação ou medicamentos, com um
menor impacto sobre o ambiente e, geralmente, beneficiando comunidades locais. Já a
aquicultura realizada de forma intensiva, notabiliza-se pelo seu desenvolvimento em gaiolas e
viveiros, envolvendo o fornecimento de ração e medicamentos, com um consequente impacto
sobre o ambiente (Read & Fernandes, 2003; Kümmerer, 2009).
De forma coincidente, com o aumento da população no século XX, ocorreu também um
aumento na demanda por alimentos de origem aquática, tendo os peixes e crustáceos tomado
papel de destaque, principalmente nos últimos 50 anos. Inicialmente a demanda foi suprida
pela prática pesqueira, mas como a pesca mundial começou a ser explorada de forma
intensiva, ocorreu uma diminuição de organismos antes facilmente disponíveis. Dessa forma,
sistemas de cultivo de peixes tiveram um crescimento sem precedentes, passando a ter uma
contribuição significativa no fornecimento de organismos de origem aquática, oferecendo uma
importante fonte de proteínas de elevado valor nutricional e contribuindo também na
implementação financeira de parcelas da comunidade em todo o mundo. O aumento da
atividade aquícola exigiu assim, a intensificação dos métodos de cultivo, caracterizando-se
pelo aumento no uso de rações formuladas contendo antimicrobianos, antifúngicos e outros
insumos farmacêuticos, bem como na utilização de pesticidas e desinfetantes (Sapkota et al.,
2008).
Em 2008 a grande produção da aquicultura era dominada principalmente por fazendas
localizadas em alguns países asiáticos, perfazendo um total de 94% de toda a produção
mundial, sendo que a China sozinha contabilizava aproximadamente 71% desta produção
(Sapkota et al., 2008). Segundo o novo relatório da FAO, que tem como título - o estado
mundial da pesca e aquicultura 2016 (SOFIA) - a produção aquícola em termos mundiais
92
deverá crescer alcançando 195,9 milhões de toneladas em 2025, significando um aumento de
17% em comparação a produção de 2013 - 2015, que foi de 166.8 milhões, o que representa
um aumento na produção de 29 milhões de toneladas. Desses 29 milhões de toneladas, a
América Latina e o Caribe deverão responder por quase 3 milhões, onde, mesmo ainda
distante da produção asiática, os mesmos deverão se consolidar como uma região exportadora
de produtos aquícolas, mantendo uma das taxas de expansão mais elevada do mundo (FAO,
2016).
Embora os métodos de aquicultura intensiva que são praticados na Ásia e em todo o
mundo possam variar de forma significativa de um determinado local para outro, sabe-se que,
a maior parte dos produtores depende fortemente do uso de rações formuladas e da aplicação
de vários tipos de produtos químicos (ex.: antimicrobianos e outros tipos de insumos), podendo
resultar em diversas formas de contaminação química e biológica. Dados limitados existem
especificando os tipos e as quantidades utilizadas de antimicrobianos nesta atividade, sendo
que os dados existentes são geralmente provenientes de países desenvolvidos, enquanto que
a maior parte da produção encontra-se em países em desenvolvimento, os quais mal dispõem
de uma legislação que regulamente tal prática, e quando dispõem a mesma ainda se mostra
limitada (Sapkota et al., 2008).
3.1.2 – A produção de salmão, uso de antimicrobianos e seu consumo no
Brasil
Na aquicultura o processo de criação do salmão é uma das atividades mais importantes,
com representatividade superior a 73% de toda a produção. De acordo com a FAO, o salmão
é cultivado em 24 países, sendo seus principais produtores a Noruega, o Chile, a Escócia e o
Canadá. Sua rede de criação teve início na década de 1980, sofrendo rápida ascensão e,
atualmente, possui uma produção anual estimada em 1,5 milhões de toneladas, com valor
correspondente a 8 bilhões de dólares. O salmão corresponde a uma das espécies mais bem
sucedidas em termos de produção em cativeiro, sendo a espécie salmão do Atlântico (Salmo
salar) a mais importante na aquicultura, tanto em termos de produção de biomassa como de
valor econômico (Buschmann et al., 2009; Glover et al., 2009; Burridge et al., 2010; Asche et
al., 2013; Pochon et al., 2015).
93
Sua criação pode ser realizada em grandes gaiolas ou cercados flutuantes, em baías
costeiras semi-abrigadas ou em braços de mar. Como em todo sistema de produção animal,
sempre se faz necessário a prevenção e o tratamento de doenças infecciosas e de infestações
parasitárias. Os principais fármacos utilizados no tratamento de infecções bacterianas na
criação de salmão constituem, a amoxicilina (β-lactâmico); florfenicol (anfenicol); associação
de sulfadiazina:trimetropina (5:1); ácido oxolínico e flumequina (quinolonas); oxitetraciclina
(tetraciclina); e eritromicina (macrolídeo). Outros insumos químicos necessários para tal
atividade, além dos fármacos veterinários que podem ser prescritos, poderão incluir compostos
anti-incrustantes, anestésicos e desinfetantes (Burridge et al., 2010).
Embora os maiores mercados dessa espécie sejam o Japão, a União Europeia e a
América do Norte, observa-se que o fornecedor que mais cresce atualmente em sua produção
é o Chile, onde tal tipo de indústria corresponde a quarta de maior contribuição para sua
economia. O Chile se destaca na referida produção por possuir tanto a mão de obra como o
custo de materiais mais baratos, podendo competir de forma efetiva com os tradicionais países
produtores (Buschmann et al., 2009; Herrero et al., 2011).
Dessa forma, o Chile tornou-se o segundo maior produtor de salmão cultivado no
mundo, perdendo apenas para a Noruega e possuindo uma indústria considerada
economicamente estável. No entanto, pode-se destacar que no Chile o uso de antimicrobianos
é muito maior do que em países de clima temperado. Por exemplo, em 2003, enquanto a
Noruega empregou 805 kg de antimicrobianos para produzir 509.594 toneladas de salmão, o
Chile empregou 133.800 kg de antimicrobianos para produzir 280.481 toneladas de salmão.
Um outro dado referente ao emprego de antimicrobianos diz respeito ao uso da flumequina,
uma quinolona utilizada de forma exclusiva na aquicultura, cuja administração sofreu um
aumento aproximado de 30 para 100 toneladas no intervalo de tempo compreendido entre os
anos de 1998 e 2002. Esse aumento coincidiu com o crescimento de produção do salmão, que
foi de 258.000 a 494.000 toneladas no mesmo período de tempo (Fortt et al., 2007; Buschmann
et al., 2009).
Quanto ao uso indiscriminado de antimicrobianos na aquicultura, há de se considerar
também a preocupação ambiental relacionada com a questão da liberação de substâncias
para o ambiente onde ocorre a administração, substâncias essas que não foram ingeridas e/ou
metabolizadas pelos organismos submetidos ao tratamento. Evidências consideráveis existem
94
dando conta de que o uso de antimicrobianos em espécies cultivadas, no caso o salmão,
possibilitam a introdução de concentrações significativas de fármacos em espécies não-alvo
que vivem nos arredores dos criadores, permanecendo esses compostos ativos após serem
liberados no ambiente. Dessa forma, a segurança alimentar poderá ser afetada tanto pelo
consumo de espécies cultivadas, que foram tratadas diretamente com antimicrobianos, como
por outros tipos de peixes selvagens, circundantes à área da atividade aquícola, capturados
para consumo humano (Coyne et al., 1997; Fortt et al., 2007).
Segundo o Ministério da Pesca e Aquicultura do Brasil, os brasileiros estão se tornando
cada vez mais adeptos do consumo de peixes, sendo que o salmão se destaca no mercado
nacional. Segundo a Infotrade, empresa responsável por fornecer informações atualizadas
sobre produtos aquícolas exportados pelo Chile, entre 2000 e 2011 os volumes de exportações
do salmão, tendo o Brasil como mercado de destino, chegaram a crescer 500%. Em 2012, por
exemplo, importou-se do Chile 68 mil toneladas de salmão, fazendo do Brasil um dos principais
consumidores mundiais. Tal crescimento de vendas ao mercado brasileiro pode ser explicado
pela existência de campanhas promocionais para o aumento de consumo do salmão, pela boa
aceitação do produto por parte dos consumidores e por conta da logística de transporte
favorecer a exportação do mercado chileno para o brasileiro (Henríquez, 2012).
3.1.3 – Uso de quinolonas na produção animal e na aquicultura
As quinolonas constituem uma importante família de antimicrobianos sintéticos
utilizados tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária. No campo veterinário,
são utilizadas na profilaxia e no tratamento de vários tipos de infecções da produção animal,
sendo também extensivamente administradas na aquicultura. A persistência de seus resíduos
em alimentos de origem animal pode ocasionar efeito tóxico direto ou ser fonte de
desenvolvimento de patógenos resistentes, constituindo possível risco à saúde humana
(Cañada et al., 2009).
Desde a descoberta do ácido nalidíxico (ver Figura 3.1; pg 95) em 1962, diversas
modificações estruturais foram sendo realizadas, possibilitando a descoberta de novas drogas
com um aumento em suas atividades biológicas e farmacológicas. Tais modificações incluem
a introdução de grupos alquila e arila na posição 1, bem como substituições por grupos fluoro
95
e piperazinil nas posições 6 e 7, respectivamente. Devido aos distintos tipos de substituições,
as quinolonas possuem propriedades físico-químicas diferentes. A presença do grupo ácido
carboxílico na posição 3 faz com que esses fármacos possuam natureza ácida, enquanto que
a presença do grupo piperazinil, possuindo grupos amino, faz com que as mesmas também
possuam natureza básica. Em soluções aquosas, quinolonas do tipo 7-piperazinil podem
possuir, portanto, caráter catiônico, zwiteriônico ou aniônico, enquanto que as outras
quinolonas podem possuir somente caráter aniônico ou neutro (Hernández-Arteseros et al.,
2002; Andreu et al., 2007).
N
O O
OH
12
345
6
78
Estrutura básica das quinolonas
1ª Geração 2ª Geração 3ª Geração
N N
O O
OH
ácido nalidíxico
N
O O
OH
F
N
NH
ciprofloxacina
CH3
N
O O
OH
F
N
N O
CH3
levofloxacina
N
O O
OHO
O
ácido oxolínico
CH3
N
O O
OH
CH3
F
N
N
norfloxacina
N
O O
OH
F
N
NH
CH3
O
CH3
gatifloxacina
Figura 3.1 - Estrutura básica e exemplos representativos de três gerações de quinolonas.
96
Por conta da presença de um átomo de flúor na molécula, alguns desses
antimicrobianos são muitas vezes descritos como fluoroquinolonas. As mesmas podem sofrer
subdivisões, sendo a mais utilizada a que as divide em quinolonas de 1ª, 2ª e 3ª gerações. As
quinolonas de 1ª geração, podendo ser citados como exemplos o ácido nalidíxico e o ácido
oxolínico, referem-se aquelas que não possuem boa atividade contra bactérias gram-positivas,
sendo geralmente utilizadas no tratamento de infecções urinárias. As de 2ª geração, citadas
como exemplos a norfloxacina e a ciprofloxacina, são utilizadas no tratamento de infecções
sistêmicas bem como no trato urinário, possuindo atividades tanto contra bactérias gram-
positivas quanto gram-negativas. Já as de 3ª geração, citadas como exemplos a levofloxacina
e a gatifloxacina, incluem as que possuem um espectro mais amplo de ação (Carlucci, 1998).
O mecanismo de ação das quinolonas como agente antibacteriano envolve a inibição
da enzima DNA girase, resultando num rápido poder bactericida. As quinolonas entram nas
células bacterianas através de difusão passiva, passando a inibir seu crescimento a nível
intracelular mediante interferência com a enzima citada, uma vez que esta se mostra essencial
no processo de enrolamento e desenrolamento do DNA bacteriano (Carlucci, 1998;
Samuelsen, 2006).
De forma geral, não se restringindo somente ao emprego de quinolonas, o modo de
administração dos antimicrobianos em peixes torna-se diferente do modo empregado nas
demais espécies animais, podendo os mesmos serem administrados na forma injetável,
misturados à ração ou mediante banhos de imersão. Enquanto que na teoria boa parte dos
tratamentos possam ser administrados por via injetável, sabe-se que o tratamento
individualizado em peixes torna-se bastante dispendioso, tanto em custo quanto em tempo,
sendo usado somente no tratamento de espécies que possuam um valor individual elevado,
como matrizes reprodutoras ou peixes ornamentais. Tratamento à base de banhos de imersão,
embora sejam fáceis de serem executados, mediante o emprego de substâncias de alta
solubilidade em água, restringe-se a sistemas de recirculação ou a tanques de tamanho
reduzido, sendo principalmente empregados no tratamento de pequenos peixes que estejam
sofrendo de infecções. Dessa forma, a administração oral de antimicrobianos a um grande
número de peixes na fase adulta tanto se torna mais fácil de ser executado quanto possui um
menor custo envolvido, fazendo desse tipo de tratamento a principal rota de administração de
antimicrobianos. Pode-se falar que o tratamento oral no controle de infecções a grupo de
97
animais, ao invés de ser em peixes individualizados, pode ser considerado mais profilático do
que terapêutico, uma vez que muitos peixes irão ingerir o fármaco antes mesmo de encontrar-
se infectado. O agente antimicrobiano a ser administrado passa então a ser incorporado à
ração, podendo ser realizado diretamente pela indústria ou na própria fazenda de criação de
peixes (Samuelsen, 2006; Figueiredo et al., 2008).
3.1.4 – Considerações particulares sobre a etapa do preparo de amostra
No capítulo 01 foi apresentado um apanhado geral sobre os diversos tipos de preparo
de amostra que têm sido empregados na determinação de RFV-AOA nos mais diversificados
tipos de matrizes do referido gênero. Agora, com o intuito de evidenciar diferenças e
similaridades entre os procedimentos empregados na análise dos mesmos, serão mostradas
considerações mais pontuais abrangendo:
i) a parte que refere-se a determinação de resíduos de quinolonas em diversos tipos de
matrizes alimentícias de origem animal;
ii) a parte que diz respeito a determinação dos diversos tipos de remanescentes
residuais de antimicrobianos em peixe; e
iii) aspectos mais abrangentes do emprego do método QuEChERS na determinação de
RFV-AOA.
3.1.4.1 – A análise de resíduos de quinolonas em AOA
Para a análise de resíduos de quinolonas em AOA muitos métodos têm sido reportados
na literatura. Uma abordagem mais abrangente e detalhada poderá ser consultada nos artigos
de revisão organizados por Hernández-Arteseros e colaboradores (Hernández-Arteseros et al.,
2002), que versa sobre a análise de resíduos de quinolonas em AOA, e também no que foi
organizado por Picó e colaboradores (Andreu et al., 2007), este já abordando a determinação
dos referentes resíduos, porém em matrizes alimentícias e ambientais.
Levantamento realizado sobre a etapa de preparo de amostra, na determinação de
resíduos de quinolonas em AOA, evidencia que a extração com solvente, podendo ou não
fazer uso de uma etapa de clean up com SPE, constitui o principal procedimento empregado
na maior parte destes estudos. Porém outros métodos, embora com uma frequência muito
98
menor, empregando PLE, MAE e ultrafiltração, têm sido também descritos (Andreu et al.,
2007).
As quinolonas são solúveis em solventes orgânicos polares e insolúveis em solventes
apolares, também possuem solubilidade em misturas constituídas de água e solvente orgânico
ou em soluções aquosas cujo pH tenha sido ajustado para possuir caráter ácido ou básico.
Dessa forma, diversas abordagens de extração são possíveis de serem empregadas, incluindo
procedimentos utilizando extração com solvente orgânico de média a alta polaridade, partição
entre a fração homogeneizada da amostra numa solução aquosa tamponada com um solvente
orgânico imiscível, ou simplesmente uma extração com uma solução tampão (Hernández-
Arteseros et al., 2002).
Tais métodos incluem a extração com solvente de amostras cujos tecidos foram
homogeneizados - SLE (fígado, rim e músculo, por exemplo), bem como a extração líquido-
líquido - LLE (leite, por exemplo). Em muitos casos, a extração com solvente combinada com
uma etapa de SPE é empregada, sendo que após o processo de isolamento dos analitos da
matriz, os mesmos sofrem uma concentração utilizando-se um tipo adequado de sorvente no
cartucho SPE. Poderão ainda ser utilizados diversos tipos de sorventes poliméricos, o que
poderá tornar o método de extração mais robusto, com uma faixa maior de aplicabilidade,
quando comparados com os tradicionais métodos que empregam sorventes à base de sílica
modificada (Andreu et al., 2007).
A Tabela 3.1 (pg. 106) mostra um apanhado com as principais características dos
métodos mais representativos empregados na análise de resíduos de quinolonas em AOA.
3.1.4.2 – A análise de RFV em peixes
A carne de peixe, embora possua composição variável, é bastante similar a outros tipos
de carnes, como aves, suínos e bovinos, porém apresenta qualidade superior, devido a uma
menor quantidade de tecido conjuntivo, cuja composição é constituída de proteínas de baixa
qualidade. A carne de peixe, de modo geral, apresenta como principais componentes a água
(64% a 90%), proteínas (8% a 23%), gordura (0,5% a 25%), e, de forma minoritária, sais
minerais (1% a 2%) e carboidratos (< 1%) (Food Ingredients Brasil, 2009).
99
Diversos tipos de antimicrobianos encontram aplicações em variados tipos de doenças
dos peixes ocasionadas por infecções bacterianas, sendo as classes das tetraciclinas,
quinolonas, sulfonamidas e anfenicóis, as mais comumente empregadas (Samuelsen, 2006).
Levantamento bibliográfico realizado evidencia que os tipos de preparo de amostra
empregados na análise de RFV em peixes, tratam-se basicamente dos mesmos empregados
em outros tipos de matrizes alimentícias de origem animal. Uma abordagem mais abrangente
e detalhada poderá ser consultada nos artigos de revisão organizados por Samanidou e
Evaggelopoulou (2007) e por Cañada e colaboradores (2009), ambos versando sobre a
determinação de resíduos de antimicrobianos em peixe. A Tabela 3.2 (pg. 109) apresenta
exemplos representativos de métodos empregados na determinação de resíduos das
principais classes de fármacos veterinários em pescado.
3.1.4.3 – O método QuEChERS na determinação de RFV-AOA
Os criteriosos limites analíticos estabelecidos pelos órgãos regulamentadores tornam-
se cada vez menores, tendo em vista a necessidade de melhores parâmetros de qualidade
exigidos por consumidores e agências governamentais. Os métodos de análise devem,
portanto, possuir alta detectabilidade, tanto para atingir os baixos valores de LMR, no
monitoramento de substâncias de uso regulamentado, como os ainda menores valores de
LMPR, no caso da fiscalização de substâncias de uso proibido. Dessa forma, a utilização da
espectrometria de massas como técnica de detecção tem possibilitado que as referidas
concentrações a nível de traços sejam atingidas, concentrações essas situadas na ordem de
ng g-1 ou ng L-1. Assim, o emprego cada vez maior de técnicas MS ou MS/MS, detentoras de
altíssimo poder de seletividade e detectabilidade, acopladas com as bem estabelecidas e
avançadas técnicas cromatográficas, têm garantido o desenvolvimento de métodos analíticos
abrangendo muitos tipos de contaminantes. Não obstante, pode ser afirmado que para garantir
o ideal benefício dos desempenhos de tais técnicas, é necessário que o preparo de amostra
também possua critérios de desempenho melhorados, seja no que diz respeito a sua
velocidade, como também na maior abrangência, tanto no número de analitos como na de
classes diferentes. Esses procedimentos têm sido aplicados com sucesso na determinação de
pesticidas já a algum tempo, porém os mesmos possuindo como característica serem ainda
demorados (Ridgway et al., 2007; Stubbings & Bigwood, 2009).
100
Com o intuito de atingir tais objetivos frente as demandas exigidas pelo processo de
preparo de amostra, Anastassíades et al. desenvolveram um procedimento de preparo de
amostras para a determinação de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais. Esse
procedimento foi então denominado de QuEChERS, um acrônimo para QUick, Easy, CHeap,
Effective, Ruged e Safe - cuja tradução está relacionada com rápido, fácil, econômico,
eficiente, robusto e seguro. Desde sua proposição inicial o método QuEChERS tem sido
aplicado de forma satisfatória na análise multiresíduo de pesticidas, podendo cada análise ser
aplicada a centenas de analitos (Anastasíades et al., 2003; Kinsella et al., 2009).
No método QuEChERS original, os analitos são inicialmente extraídos com solvente
(acetonitrila) e em seguida adiciona-se sais em dada proporção (MgSO4 anidro e NaCl), com
o intuito de promover um melhor particionamento pelo efeito salting out. Logo em seguida,
segue-se com uma agitação e posterior centrifugação. Após esta etapa a fase orgânica é
retirada e submetida a um processo de clean up mediante uma extração em fase sólida
dispersiva (d-SPE) utilizando-se para isso o sorvente PSA (amina primária secundária)
juntamente com MgSO4 anidro. Por fim, a mistura é centrifugada e o sobrenadante separado,
podendo o mesmo ser injetado diretamente no sistema cromatográfico. Trata-se de um
procedimento oficial adotado nos EUA pela Association of Official Analytical Chemists, a ser
empregado na análise de resíduos de pesticidas em alimentos, sendo o referido método
também considerado como oficial pelo European Committee for Standardization (Kinsella et
al., 2009; Rodrigues et al., 2011; Lopes et al., 2012b).
A acetonitrila utilizada como solvente de extração possui a vantagem de proporcionar
uma menor quantidade de coextrativos de natureza lipofílica (ex.: ceras, pigmentos) e ainda
de extrair ampla faixa de pesticidas de diferentes polaridades. A utilização de sais
proporcionando o efeito salting out, visa a obtenção de melhor eficiência de extração dos
analitos polares, considerando-se que os sais promoverão uma diminuição de suas
solubilidades na fase aquosa e também uma menor quantidade de água na fase orgânica. A
escolha do sal secante MgSO4 está relacionada com sua maior capacidade de remoção de
água se comparado com outros tipos de sais. O uso do sorvente PSA visa reter interferentes
da matriz uma vez que sua estrutura bidentada possui elevado poder de quelação (Prestes et
al., 2011).
101
Desde sua proposição inicial, embora o método QuEChERS mostre-se bastante
consolidado em análises atingindo centenas de analitos nos mais variados tipos de gêneros
alimentícios, principalmente no que se refere a determinações de pesticidas em frutas e
vegetais, têm ocorrido subsequentes ajustes em seu desenvolvimento. Tais modificações são
propostas com base em se obterem melhores características de desempenho no que diz
respeito a ocorrência de dificuldades inerentes aos analitos ou às matrizes. A maior parte
destas modificações relacionam-se diretamente com o método QuEChERS proposto
inicialmente, porém variando-se suas diferentes etapas de execução, seja na modificação da
quantidade de amostra, na utilização de outro tipo de fase extratora, no emprego de sais que
desempenhem efeito tamponante (ex.: tampão acetato, citrato), ou mesmo alterando o tipo de
sorvente durante a etapa dispersiva do método (Lopes et al., 2012b; Curbelo et al., 2015).
O método QuEChERS, por suas características de rapidez e economia, logo atraiu a
atenção de laboratórios de controle e fiscalização de resíduos em todo o mundo, onde o
mesmo vem sendo principalmente aplicado na determinação de diferentes tipos de classes de
pesticidas. No entanto, logo começou a ocorrer um aumento na investigação de tal abordagem
na análise de outros tipos de compostos em alimentos, onde por exemplo podem ser citados,
a determinação de acrilamidas, de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e também de
fármacos veterinários. Porém, é válido salientar que não ocorrem tantos trabalhos
descrevendo sua aplicação na análise de RFV-AOA (Aguilera-Luiz et al., 2008; Núñez et al.,
2012; Lopes et al., 2012b). A Tabela 3.3 (pg. 111) apresenta exemplos representativos de
métodos QuEChERS empregados na determinação de RFV-AOA.
3.1.5 – Considerações particulares sobre a etapa de determinação de RFV
utilizando a LC-MS/MS
Diante do contexto já mencionado, a cromatografia líquida associada à espectrometria
de massas sequencial (LC-MS/MS) adquiriu valioso e importante papel na área da segurança
alimentar. Assim, a LC-MS/MS destaca-se cada vez mais como importante técnica analítica,
uma vez que ela é capaz de fornecer valiosas informações no que diz respeito à triagem,
confirmação de identidade e quantificação de compostos em uma única análise. A LC-MS/MS
reúne as vantagens da cromatografia líquida, como eficiência de separação e seletividade,
com os benefícios que a espectrometria de massas oferece, como fornecimento de
102
informações estruturais, ganho de seletividade e uma melhor detectabilidade, parâmetros de
valiosa importância analítica. Permite ainda que se trabalhe com amostras em pequenas
quantidades e/ou baixas concentrações, uma vez que é possível a obtenção de espectros de
massas de compostos a nível de traço (ng g-1) (Vékey, 2001; Malik et al., 2010).
3.1.5.1 – Métodos de ionização na análise de RFV por LC-MS/MS
O desenvolvimento da ionização à pressão atmosférica (API) no interfaceamento LC-
MS, deu início a um novo período na análise de resíduos de fármacos veterinários. Tal
modalidade de ionização é principalmente compreendida pelas técnicas de ionização por
eletrospray (ESI) e pela ionização química à pressão atmosférica (APCI), sendo as mesmas
consideradas técnicas brandas de ionização, onde são negligenciáveis seus produtos de
fragmentações (Balizs & Hewitt, 2003).
Em ambas as técnicas (ESI e APCI) o eluente passa através de um pequeno capilar
onde é formado um fino spray, sendo o solvente posteriormente evaporado e os íons formados
durante esse processo direcionados para o analisador de massas. Não obstante, algumas
limitações mostram-se relacionadas com essa etapa, onde, por exemplo, são citadas as
necessidades de serem evitados tampões não voláteis, bem como a presença de sais no
eluente proveniente da etapa cromatográfica, uma vez que afetam a formação dos íons e
podem obstruir o capilar (Vékey, 2001).
A técnica ESI tem sido adequada para compostos de natureza polar e de alta massa
molar, caracterizando-se como bastante apropriada na determinação de RFV (Balizs & Hewitt,
2003; Núnez et al., 2005).
A fonte de APCI, possui certa similaridade com a ESI, no entanto, se caracteriza por
empregar reações de transferência de carga que ocorrem em fase gasosa, adequada na
ionização de compostos de baixa e média polaridade, bem como de compostos de baixa
massa molar. A mesma mostra-se de natureza mais energética do que a ESI, onde o eluente
é nebulizado por fluxo de nitrogênio passando a ser rapidamente evaporado utilizando-se altas
temperaturas (350 - 500 ºC) (Balizs & Hewitt, 2003; Núnez et al., 2005; Cruz & Barceló, 2007).
Essas fontes podem ser utilizadas tanto no modo positivo como no modo negativo,
sendo que o modo negativo será mais adequado para os compostos negativamente
carregados, compostos de elevada aromaticidade, compostos halogenados e nitro-derivados.
103
Nestas técnicas de ionização não ocorre biblioteca de espectros, indisponibilizando a pesquisa
computacional para a identificação estrutural de compostos. Estima-se que aproximadamente
98% dos métodos LC-MS sejam executados com as referidas fontes de ionização (Vékey,
2001; Corcia & Nazzari, 2002).
Como brevemente já exposto no Capítulo 01 (ítem 1.6.2.2; pg 45), ambas as fontes
(ESI e APCI) se complementam em relação à polaridade e massa molar dos analitos a serem
investigados, mas possuem pouco efeito sobre substâncias de baixa polaridade. Substâncias
apolares, não sendo suscetíveis de protonação ácido-base, possuirão detectabilidade
dificultada nestas fontes; caso ocorra, irão possuir comprometidos limites de detecção (Gentili
et al., 2005).
O mais recente tipo de fonte de ionização desenvolvido no acoplamento LC-MS,
operando à pressão atmosférica e também detentor de uma ionização branda, diz respeito à
fotoionização à pressão atmosférica (APPI). Tal método se assemelha à APCI, porém a corona
de descarga, presente na APCI, passa a ser substituída por uma lâmpada UV que emite fótons
com energia de 10 eV. Embora se descreva que a APPI possa ser empregada na análise de
algumas classes de substâncias antimicrobianas possuidoras de elevada afinidade eletrônica,
como anfenicóis, nitroimidazóis e nitrofuranos, evidencia-se a pouca ocorrência de descrição
na literatura relatando seu uso em tais determinações (Gentili et al., 2005; Marchi et al., 2009).
3.1.5.2 – Principais analisadores de massas na determinação de RFV
O analisador de massas possui papel de destaque diante dos principais componentes
de um espectrômetro de massas, isso pelo fato do mesmo selecionar e/ou separar os íons de
acordo com sua relação massa/carga (m/z). Existem diferentes tipos de analisadores e seus
princípios de construção e operação diferem de um para outro, bem como suas aplicações,
vantagens e limitações. A escolha do tipo de analisador deve ser baseada levando-se em conta
sua aplicação, não existindo, assim, um analisador ideal para todas as necessidades, uma vez
que sempre se deve levar em consideração fatores como a faixa de massas desejada, o tipo
de resolução necessária, o custo envolvido, dentre outros fatores (Lanças, 2013).
No campo de análise da determinação de RFV, os analisadores mais usuais em
análises de rotina dizem respeito aos do tipo quadrupolo (Q), ion trap (IT) e por tempo de voo
(TOF), constituindo na ordem os analisadores mais utilizados na referida área. No entanto, a
104
configuração de uso dos mesmos poderá variar, podendo se apresentar em apenas um único
estágio, combinados sequencialmente ou de forma híbrida (Gentili et al., 2005). Para a
quantificação de RFV em alimentos a espectrometria de massas sequencial tem destaque.
3.1.5.2.1 – Espectrometria de massas sequencial (MS/MS)
A espectrometria de massas sequencial, também conhecida como espectrometria de
massas in tandem, se caracteriza pelo princípio básico de execução de experimentos MS/MS,
que consiste na seleção de um íon percursor, na fragmentação desse mesmo íon ocasionada,
geralmente, por uma dissociação induzida por colisão (CID, do inglês Collision-Induced
Dissociation), e pela análise dos íons produtos originados. Experimentos MS/MS poderão ser
realizados por dois diferentes tipos de abordagens - a sequencial no espaço e a sequencial no
tempo. A espectrometria de massas sequencial no espaço é realizada quando se acopla dois
analisadores distintos fisicamente, ou seja, espacialmente separados, para que determinados
íons previamente especificados, sejam selecionados em um primeiro estágio do equipamento,
dissociados no segundo estágio (cela de colisão), e os íons produtos obtidos transferidos para
o posterior estágio para a devida separação e aquisição espectral. A espectrometria de massas
sequencial no tempo se caracterizará pela execução de uma sequência apropriada de
experimentos de fragmentação (seleção de íons de determinada relação m/z, dissociação e
análise dos íons fragmentos) dentro de um mesmo espaço de confinamento, porém em
diferentes momentos (analisador ion trap, por exemplo) (Hoffmann & Stroobant, 2007;
Vessecchi et al., 2011; Hird et al., 2014).
O surgimento da espectrometria de massas sequencial de certa forma foi alavancada
pela necessidade em se atingir os valores cada vez menores dos limites mínimos de
desempenho requerido (LMPR), introduzidos e exigidos pela Comunidade Europeia (EC,
2003), que fez com que a detectabilidade na espectrometria de massas tivesse de ser cada
vez mais melhorada, tanto a nível de intensidade de sinal como em termos de diminuição do
ruído. Para atender a tais exigências, analisadores de massas de um único estágio (MS)
começaram a ser gradativamente substituídos por analisadores de massas multidimensionais
(MS/MS), conferindo um maior nível de segurança na hora de se identificar e quantificar um
analito. Técnicas baseadas na espectrometria de massas sequencial (MS/MS) apresentam
grandes vantagens no campo da análise de resíduos a nível de traços (ng g-1 ou µg kg-1) em
105
matrizes biológicas complexas como alimentos. A fragmentação de compostos alvos para a
detecção específica de íons produtos, permite um grande aumento na relação sinal/ruído pela
redução considerável de interferentes provenientes de outros compostos presentes no extrato
com a mesma massa molar, ou até mesmo com massas próximas do analito de interesse.
Vários analisadores de massas oferecem a possibilidade da realização de tais experimentos,
sendo os de uso mais frequente o do tipo triplo quadrupolo (QqQ) e o ion trap (IT) (Bizec et al.,
2009).
A LC-MS/MS, utilizando um triplo quadrupolo (QqQ) como analisador de massas, é no
momento o que se tem de mais usual em métodos analíticos para a identificação inequívoca
e quantificação de RFV-AOA. Embora seja uma técnica bastante sensível e seletiva, existem
alguns fatores que a tornam limitada. Algumas dessas limitações estão intimamente
relacionadas com o limite do número de compostos possíveis por análise, a não possibilidade
de uma análise retrospectiva de dados - além daqueles já previamente estabelecidos junto ao
método, na dependência no que diz respeito à disponibilidade de padrões analíticos e na
incapacidade de monitorar a presença de compostos desconhecidos. Tais limitações vêm
motivando cada vez mais a utilização de instrumentos fazendo uso da espectrometria de
massas de alta resolução (Marazuela & Bogialli, 2009; Pérez et al., 2012; Hird et al., 2014),
embora essas sejam de custo bem mais elevado.
106
Tabela 3.1: MÉTODOS REPRESENTATIVOS NA DETERMINAÇÃO DE QUINOLONAS EM AOA
Matriz & Analitos
(nº de compostos)
Preparo de Amostra
1 – Quantidade de amostra 2 – Extração 3 – Etapa de clean up 4 – Recuperação
Etapa Cromatográfica
1 – Coluna 2 – Fase móvel:
FA - fase aquosa FO - fase orgânica
3 – Vazão 4 – Temperatura 5 – Modo de eluição 6 – Volume de injeção 7 – Tempo de corrida
Determinação
Em caso da LC-MSn: 1 – Fonte de ionização 2 – Analisador 3 – Modo de monitoramento
LOD e LOQ e/ou
CCα e CCβ (μg kg-1)
Ref.
LEITE
Quinolonas (22 analitos)
1 – 2 g 2 – 10 mL de tampão McIlvaine – solução de Na2HPO4 (0,2 mol L-1) / ácido cítrico (0,1 mol L-1); pH 4,0. 3 – SPE em cartucho Bond Elut Plexa (fase polimérica) 4 – 63,1% – 94,6%
1 – Acquity Shield RP 18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) 2 – FA: ácido fórmico (0,2%; pH 3,0)
FO: MeOH/ACN (40:60, v/v) 3 – 0,3 mL min-1
4 – 40 ºC 5 – gradiente 6 – 10 µL 7 – 15 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 0,002 – 0,409
LOQ:
0,008 – 0,339
Zh
an
g
et
al.,
200
9.
OVOS
Quinolonas (10 analitos)
1 – 1 g 2 – 2 extrações sucessivas com 4 mL ACN seguido da adição de 250 µL de solução de amônia (25%) 3 – SPE dispersiva com 100 mg de C8 4 – 92% – 99%
1 – Luna C18 (150 mm × 2,0 mm, 3 µm) 2 – FA: ácido heptafluorobutírico (0,025 %, v/v)
FO: ACN 3 – 0,25 mL min-1
4 – 35 ºC 5 – gradiente 6 – 30 µL 7 – 24 min
HPLC-FLD (Para fins de triagem)
LC-MS/MS (Para fins confirmatórios)
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 0,5 - 1 LOQ: 1,5 – 3 CCα: 3 – 7 CCβ: 6 - 11 (Para o método LC-MS/MS)
Ga
jda
et
al.,
201
2.
PEIXE (salmão)
Quinolonas (7 compostos)
1 – 1 g 2 – 1ª extração: 5 mL tampão citrato (pH 4,7) com auxílio de ultrassom; 2ª extração: repetiu-se da mesma forma, porém com 3 mL da fase extratora. 3 – SPE: cartucho OASIS HLB (fase polimérica)
4 – 96,3% – 102,7%
1 – Perfectisil ODS-2 120 (250 mm × 4,0 mm, 5 µm) 2 – FA: ácido trifluoracético (0,1 %, v/v; pH 1,0)
FO: ACN e MeOH (fase ternária) 3 – 1 mL min-1
4 – 25 ºC 5 – gradiente 6 – 20 µL 7 – 24 min
HPLC-DAD
LOD: 1,9 – 11,6 LOQ: 5,7 – 35 CCα: 31,3 – 628,2 CCβ: 32,1 – 605,1
Eva
gge
lop
ou
lou
&
Sa
ma
nid
ou
, 2
01
3.
107
Tabela 3.1: continuação
Músculo (frango e porco)
Quinolonas
(7 compostos)
1 – 2 g 2 – 2 extrações sucessivas com 10 mL tampão fosfato (0,1 mol L-1; pH 7) 3 – SPE: cartucho OASIS HLB (fase polimérica)
4 – 70,4% – 105,8%
1 – Symmetry C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: ácido fórmico (0,02 %, v/v; pH 7,0)
FO: ACN 3 – não informado
4 – 30 ºC 5 – gradiente 6 – 100 µL 7 – 32 min
HPLC-FLD LOD: 0,1 – 0,3 LOQ: 0,3 – 1
Si-
Ju
n e
t al.,
20
07
Músculo de frango e
gema de ovo
Quinolonas (10 compostos)
Músculo frango (sistema 1)
1 – 1 g 2 – 2 extrações sucessivas com 4 mL MeOH (0,1% anidrido trifluoracético, v/v), assistida por ultrassom 3 – SPE: cartucho LiChrolut RP-18 4 – 96,6% – 102,8%
Gema de ovo (sistema 2)
1 – 1 g 2 – 2 extrações sucessivas com 2 mL de solução 0,75 mol L-1 de NaOH em ACN, assistida por ultrassom 3 – SPE: cartucho LiChrolut RP-18 4 – 96,4% – 102,8%
1 – ODS-3 PerfectSil Target (ambos os sistemas) - (250 mm × 4 mm, 5 µm) 2 – FA: ácido trifluoracético (0,1 %, v/v)
FO: ACN e MeOH (fase ternária) 3 – 1,2 mL min-1 (ambos os sistemas) 4 – 25 ºC (ambos os sistemas) 5 – diferentes gradientes nos 2 sistemas 6 – 50 µL (sistema 1) e 20 µL (sistema 2) 7 – 33 min (sistema 1) e 27 min (sistema 2)
HPLC-DAD
Músculo frango
CCα: 15 – 405 CCβ: 15 – 407
Gema de ovo
CCα: 25 – 28,6 CCβ: 26,4 – 31
Chri
sto
do
ulo
u e
t al.,
20
07
.
Fígado suíno Quinolonas
(8 compostos)
1 – 5 g 2 – 2 extrações sequenciais (25 e 10 mL) com ácido metafosfórico 0,35%/ACN (73:27; v/v) auxiliadas com banho de ultrassom. 3 – SPE: cartucho ISOLUTE ENV+ 4 – 54% – 70%
1 – Zorbax Eclipse XDB-C8 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: acetato de amônio (5 mmol L-1, pH 2,5)
FO: ACN 3 – 1 mL min-1
4 – não informado (n.i.)
5 – gradiente 6 – 200 µL 7 – 15 min
LC-ESI-TOF (MS) 1 – ESI (+) 2 – TOF 3 – full scan (intervalo m/z:100-500)
O método é comparado
com outros dois: LC-Q (MS) e LC-QqQ (MS/MS); ambos operando com a fonte turbo ion spray
LOD: 0,5 - 2 LOQ: 1,5 - 6 CCα: 64 – 818 CCβ: 175 – 828
Herm
o e
t a
l.,
200
8
Peixe (tilápia)
Quinolonas (6 analitos)
1 – 2 g 2 – 2 extrações sequenciais (10 e 5 mL) com ácido tricloroacético (10%)/MeOH (8:2; v/v) assistida por ultrassom. 3 – SPE: cartucho OASIS HLB (fase polimérica) 4 – 73% – 110%
Método HPLC-FLD (quantificação)
1 – XTerra (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: ácido oxálico (0,01 mol L-1, pH 4)
FO: ACN 3 – 1 mL min-1 4 – 25 ºC 5 – gradiente 6 – 50 µL 7 – 35 min
HPLC-FLD (quantificação)
LC-MS/MS (confirmação) 1 – ESI (+) 2 – QqTOF 3 – O quadrupolo selecionou íons m/z no intervalo de massas das quinolonas em estudo.
LOD: 2 – 8 LOQ: 5 – 27
Pa
sch
oa
l e
t al.,
20
09
b.
108
Tabela 3.1: continuação
Leite
Multiclasse
(9 quinolonas e outros 97 analitos) BI, M, NI, P, S, T e outros
1 – 5 mL 2 – 10 mL ACN + 5 mL solução de extração (solução de extração: 4,3 g ácido oxálico + 3,7 g EDTA em 0,5 L H2O); 3 – 1 g (NH4)2SO4 4 – 70% - 120% (Para a maioria dos compostos) Segundo os autores, é introduzida uma nova abordagem de extração e clean up, denominada de SOSLE (salting out supported liquid extraction). Para mais descrição, ver artigo na íntegra.
1 – Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm) 2 – FA: H2O contendo ACN (0,05%) e HCOOH (0,03%)
FO: ACN contendo H2O (0,05%) e HCOOH (0,03%) 3 – 0,4 mL min-1 4 – 25 ºC 5 – gradiente 6 – 10 µL 7 – 14,6 min
LC-HRMS 1 – ESI 2 – Q-Orbitrap 3 – full scan (intervalo m/z:140-1000)
LOD: 0,5 - 2 CCα: 0,05 – 202,5 CCβ: 0,06 – 207,7
Ka
ufm
an
n e
t a
l.,
20
14
b.
Alimentos infantis
Multiclasse 9 quinolonas e
outros 324 analitos
(Pesticidas &
Fármacos Veterinários)
1 – 5 g 2 – 10 mL ACN/MeOH (84:16, v/v)/CH3COOH (1%) + 6 g Na2SO4 anidro + 1,45 g CH3COONa anidro (QuEChERS modificado); 3 – não houve clean up 4 – 79,8% – 110,7%
1 – Thermo Accucore C-18 aQ (100 mm × 2,1 mm; 2,6 µm) 2 - FA:HCOONH4 (4 mmol L-1) em H2O/HCOOH (0,1%, v,v) FO: HCOONH4 (4 mmol L-1) em MeOH/HCOOH (0,1%, v,v) 3 – não informado 4 – não informado 5 – gradiente 6 – 10 µL 7 – 15 min
LC-HRMS 1 – ESI (+) e ESI (-) 2 – Q-Orbitrap 3 – full scan
CCα: 0,01 – 5,35
CCβ: 0,01 – 9,27
Jia
et
al.,
20
14
.
109
Tabela 3.2: MÉTODOS REPRESENTATIVOS NA DETERMINAÇÃO DE RFV EM PEIXES
Abreviações: aminoglicosídeos (AG); anfenicóis (AN); avermectinas (AV); benzimidazol (BI); β-agonista (βA); β-lactâmicos (βL); etoxiquina (etox); lincosamidas (L); macrolídeos (M); mebendazol (meb); nitrofuranos (NF); nitroimidazóis (NI); penicilinas (P); quinolonas (Q); sulfonamidas (S); tetraciclinas (T); trimetoprima (tri); verde malaquita (vm); verde leucomalaquita (vlm)
Matriz & Analitos
(nº de compostos)
Preparo de Amostra
1 – Quantidade de amostra 2 – Extração 3 – Etapa de clean up
4 – Recuperação
Etapa Cromatográfica 1 – Coluna 2 – Fase móvel:
FA - fase aquosa FO - fase orgânica
3 – Vazão 4 – Temperatura 5 – Modo de eluição 6 – Volume de injeção 7 – Tempo de corrida
Determinação
Em caso da LC-MSn: 1 – Fonte de ionização 2 – Analisador 3 – Modo de monitoramento
LOD e LOQ ou
CCα e CCβ (μg kg-1)
Ref.
Tilápia
S, tri, Q, AN (4 analitos)
1 – 1 g 2 – 3 extrações sucessivas com: 0,25 mL H2O/HCOOH (1%, v/v) + 0,5 mL ACN + 0,5 mL MeOH; 3 – A fase combinada dos sobrenadantes, após evaporação e reconstituição em 1 mL de fase móvel, é submetida a uma extração líquido-líquido com hexano (2 mL) 4 – 93,8% – 97%
1 – Poroshell 120 EC C18 (50 mm × 3 mm, 2,7 µm) 2 – FA: H2O (contendo 0,1% HCOOH, v/v)
FO: MeOH (contendo 0,1% HCOOH, v/v) 3 – 0,4 mL min-1 4 – 25 ºC 5 – Fase isocrática: FA/FO (20:80, v/v) 6 – 10 µL 7 – inferior a 3 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) e ESI (-) 2 – Q-LIT 3 – MRM
LOQ: 0,5 – 1,0
Rezk e
t al.,
20
15
.
Sparus aurata (dourada)
Quinolonas (7 analitos)
1 – 1 g 2 – 1ª extração: 5 mL de NaOH (0,1 mol L-1) + 0,2 g de NaCl; 2ª ext.: 3 mL de NaOH (0,1 mol L-1) + 0,1 g de NaCl; ambas auxiliadas com banho de ultrassom 3 – SPE: cartucho OASIS HLB (fase polimérica) 4 – 90% – 132%
1 – PerfectSil ODS-2 (250 mm × 4 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O (contendo 0,2% HCOOH, v/v)
FO: ACN e MeOH (fase ternária; ambos os solventes contendo 0,2% HCOOH, v/v) 3 – 1,0 mL min-1 4 – Não informada 5 – Gradiente 6 – 20 µL 7 – 30 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 2 – 2,7 LOQ: 6 – 8
Sa
ma
nid
ou
et a
l.,
20
08
Peixe (diversas
espécies)
Multiclasse
AG, βL, Q, M, S, T, tri
(34 analitos)
1 – 2 g 2.1 – 0,5 mL EDTA (0,1 mol L-1) + 6 mL ác. metafosfórico (3%, pH 5,5) + 2 mL ác. heptafluorobutírico (0,02 mol L-1) + 0,6 mL ác. tricloroacético;
1 – Luna C18(2) 100A (50 mm × 4,6 mm, 3 µm) 2 – FA: H2O / ác. heptafluorobutírico (0,025%)
FO: ACN 3 – 250 µL min-1 4 – 35 ºC 5 – Gradiente 6 – Não informado 7 – 18 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
CCα: 39,6 – 48,3 CCβ: 59,5 - 1141
Gb
ylik
et a
l., 2
013
.
110
2.2 – O resíduo obtido após extração 2.1, foi novamente extraído com 6 mL de ACN; 3 – SPE: Strata X-CW (somente da fase obtida em 2.1); OBS: os resíduos obtidos após evaporação das fases 2.2 e 3, foram combinados para posterior análise; 4 – 96% - 111%
PEIXE (Sparus aurata - dourada)
Multiclasse (32 analitos) S, Q, T, tri e outros
1 – 5 g 2 – 10 mL ACN/MeOH (75:25, v/v) + 4 g MgSO4 anidro + 1 g CH3COONa (QuEChERS modificado);
3 – Tomou-se 4 mL do sobrenadante para evaporação e reconstituição, sem a necessidade de clean up 4 – 69% – 125%
1 – Acquity UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1%; v/v)
FO: ACN/HCOOH (0,1%; v/v) 3 – 0,3 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Gradiente 6 – 5 µL 7 – 8,5 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 3 - 15 LOQ: 10 - 50 CCα: 16,7 – 605,7 CCβ: 23,5 – 611,5
Lo
pes e
t a
l., 2
012
a.
Truta, sea bream (peixes) e 3 outras matrizes
Macrolídeos (7 analitos)
1 – 5 g + 7g Al2O3 (MSPD) 2 – PLE (condições): a) solvente: MeOH; b) pressão: 1500 psi; c) temperatura: 80 ºC; d) tempo extração: 15 min.; e) nº ciclos: 2; f) volume final extrato: 40 mL. 3 – 66% - 91%
1 – Kromasil 100 C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O/CH3COOH (1%, v/v; pH 2,8)
FO: ACN 3 – 1 mL min-1
4 – 35 ºC 5 – Gradiente 6 – 50 µL 7 – 41 min
LC-MS 1 – ESI (+) 2 – Q 3 – SIM e full scan
LOD: 3 – 15
CCα: 6 – 208 CCβ: 15 - 211
Be
rra
da
et
al.,
20
08
.
Salmão, truta, catfish e outros
Multiclasse
AN, BI, M, NI, P, Q, S, T e outros
(107 analitos)
1 – 2 g 2 – 10 mL ACN/H2O (6:4, v/v), seguida por 30 min. de agitação e centrifugação; 3 mL do sobrenadante são diluídos a 60 mL com H2O, para posterior clean up; 3 – SPE: cartucho StrataX (60 mg) 4 – 50% – 118% (para 80% dos compostos)
1 – Acquity UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1%; v/v)
FO: ACN/ 0,1% HCOOH (9:1; v/v) 3 – 0,4 mL min-1
4 – Não informado
5 – Gradiente 6 – 20 µL 7 – 12 min
LC-HRMS LC-ESI-TOF (MS)
1 – ESI (+) 2 – TOF 3 – full scan (intervalo m/z:100-1000)
CCβ: para 90% dos
compostos, o valor situa-se até 2x o nível de fortificação determinado
Pe
ters
et
al.,
20
09
.
111
Tabela 3.3: APLICAÇÕES REPRESENTATIVAS DO MÉTODO QuEChERS NA DETERMINAÇÃO DE RFV-AOA
Abreviações: aminoglicosídeos (AG); anfenicóis (AN); avermectinas (AV); benzimidazol (BI); β-agonista (βA); β-lactâmicos (βL); etoxiquina (etox); lincosamidas (L); macrolídeos (M); mebendazol (meb); nitrofuranos (NF); nitroimidazóis (NI); penicilinas (P); quinolonas (Q); sulfonamidas (S); tetraciclinas (T); trimetoprima (tri); verde malaquita (vm); verde leucomalaquita (vlm)
Matriz & Analitos
(nº de compostos)
Preparo de Amostra 1 – Quantidade de amostra 2 – Solvente de Extração 3 – Sais adicionados (efeito salting out) 4 – Etapa dispersiva (tipo de sorbente + sais) 5 – Recuperação
Etapa Cromatográfica 1 – Coluna 2 – Fase móvel:
FA - fase aquosa FO - fase orgânica
3 – Vazão 4 – Temperatura 5 – Modo de eluição 6 – Volume de injeção 7 – Tempo de corrida
Determinação
Em caso da LC-MSn: 1 – Fonte de ionização 2 – Analisador 3 – Modo de monitoramento
LOD e LOQ ou
CCα e CCβ (μg kg-1)
Ref.
CAMARÃO Multiclasse
(13 analitos)
S, tri, vm, vlm, meb, cloreto de
benzalcônio
1 – 10 g 2 – 10 mL ACN/CH3COOH (1%, v/v) 3 – 4 g MgSO4 anidro + 1,75 g NaCl 4 – 5 mL do sobrenadante é tratado com 250 mg de PSA + 750 mg de MgSO4 anidro 5 – 53% – 118%
1 – Zorbax Eclipse XDB-C18 (50 mm × 4,6 mm, 1,8 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1%; v/v)
FO: ACN 3 – 0,5 mL min-1
4 – Não informado 5 – Gradiente 6 – 20 µL 7 – 16 min
LC-TOF (MS) 1 – ESI (+) 2 – TOF 3 – full scan (intervalo m/z: 50-1000)
LOD: 0,06 – 7
LOQ: não informado
Pu
lido
et
al.,
201
1.
MÚSCULO DE FRANGO
Multiclasse
(41 analitos)
S, Q, NI e outros
1 – 5 g 2 – 10 mL ACN/CH3COOH (1%, v/v) 3 – 5 g Na2SO4 anidro 4 – sorbente 500 mg Bondesil (NH2) 5 – É fornecido diversos níveis de recuperação para os vários ensaios de preparo de amostra testados.
1 – Synergi Fusion-RP column (100 mm × 2 mm, 3 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1%; v/v)
FO: ACN e MeOH 3 – 0,2 – 0,3 mL min-1
4 – 40 ºC 5 – Gradiente 6 – 10 µL 7 – 28 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) e ESI (-) 2 – QqQ 3 – MRM
CCα: 0,27 – 444 CCβ: 0,45 - 487 S
tub
bin
gs &
Big
woo
d, 2
009
.
LEITE Diversas catego-rias: integral, desnatado e semi-desnatado)
Multiclasse (18 analitos)
S, Q, T, M, AV
1 – 10 g 2 – 10 mL ACN/CH3COOH (1%, v/v) + 10 mL de solução de EDTA (0,1 mol L-1) 3 – 4 g MgSO4 anidro + 1 g CH3COONa 4 – sem clean up 5 – 71% – 109,3%
1 – Acquity UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,01%; v/v)
FO: MeOH 3 – 0,3 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Gradiente 6 – 5 µL 7 – 9,5 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 1 – 4 LOQ: 3 – 10
Ag
uile
ra-L
uiz
et
al.,
20
08
.
112
Tabela 3.3: continuação
FÍGADO e LEITE BOVINO
(Multiclasse) avermectinas, benzimidazóis, fluquicidas e
outros anti-helmínticos
(38 analitos)
1 – 10 g 2 – 10 mL ACN 3 – 5 g MgSO4:NaCl (4:1, m/m) 4 – Adicionou-se 50 mg de C18 + 150 mg de MgSO4 a 1 mL do sobrenadante 5 – Fígado: 51% – 128%
Leite: 61% – 115%
1 – Prodigy C18 (150 mm × 3 mm, 5 µm) 2 – FA: 25 mmol L-1 de HCOONH4 (pH 4)
FO: 12,5 mmol L-1 de HCOONH4 em ACN:MeOH (1:1, v/v) 3 – 0,3 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Gradiente 6 – 10 µL 7 – 15,5 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) e ESI (-) 2 – QqQ 3 – MRM
FÍGADO: CCα: 11 – 1721 CCβ: 11 – 1943 LEITE: CCα: 11 – 108 CCβ: 11 – 124 K
insella
et
al.,
20
09.
Músculo bovino
Anti-helmínticos (37 analitos)
1 – 10 g 2 – 12 mL ACN 3 – 4 g MgSO4 anidro + 1 g NaCl 4 – 0,5 g C18 + 1,5 g MgSO4 5 – 70% – 120% (para a maioria dos compostos)
1 – Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) 2 – FA:H2O/ACN (90:10, v/v) - 0,01% CH3COOH FO: MeOH/ACN (75:25) - HCOONH4 (5 mmol L-1) 3 – 0,3 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Gradiente 6 – 5 µL 7 – 9,5 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) e ESI (-) 2 – QqQ 3 – MRM
CCα: 0,15 – 10,21 CCβ: 0,25 – 17,23
Coo
pe
r et
al.,
201
2.
Músculo (porco, carneiro, galinha)
Sulfonamidas e
seus metabólitos (22 analitos)
1 – 5 g 2 – 10 mL ACN/CH3COOH (1%, v/v) 3 – 0,5 g hidrogenocitrato dissódico sesquihidratado + 1 g citrato de sódio + 4 g MgSO4 anidro + 1 g NaCl; 4 – 6 mL do sobrenadante é tratado com 150 mg de PSA + 900 mg de MgSO4 anidro 5 – 88% – 112%
1 – Zorbax Eclipse XDB-C8 (100 mm × 2,1 mm, 3,5 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,01%; v/v)
FO: MeOH/HCOOH (0,01%; v/v) 3 – 0,2 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Gradiente 6 – 5 µL 7 – 30 min
LC-HRMS
1 – ESI 2 – LIT-Orbitrap 3 – full scan ou MSn
LOD: 3 - 26 LOQ: 11 - 88 CCα: 101 – 111 CCβ: 102 – 122
Ab
da
llaa
h e
t al., 2
01
4.
Músculo (bovino, ovino e suíno)
Multiclasse
BI, Q, S, M, βA (55 analitos)
1 – 4 g 2 – 16 mL ACN/CH3COOH (5%, v/v) 3 – 4 g Na2SO4 anidro + 2 g NaCl (2:1, m/m) 4 – 400 mg C18 5 – 70% - 120%
1 – Zorbax SB-C18 (100 mm × 2,1 mm, 3,5 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1%; v/v)
FO: ACN 3 – 0,3 mL min-1
4 – 40 ºC 5 – Gradiente 6 – 10 µL 7 – 36 min
LC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: não informado LOQ: 0,1 - 20
Ka
ng
et a
l.,
201
4.
113
3.2 – OBJETIVOS
O trabalho descrito no presente capítulo possuiu como objetivo principal avaliar
diferentes preparos de amostra, baseados no procedimento QuEChERS, para
determinação de quinolonas em amostras de salmão por UHPLC-MS/MS. Os objetivos
específicos compreenderam validar o método proposto e aplicar o mesmo na análise de
amostras de salmão comercializadas nos supermercados da cidade de Campinas/SP.
3.3 - MATERIAIS, INSTRUMENTOS E MÉTODOS
3.3.1 – Reagentes, solventes e materiais
- Acetonitrila e metanol grau HPLC (J. T. Baker, EUA);
- Ácido acético glacial e ácido fórmico, grau analítico (Synth, Brasil);
- Hexano (J. T. Baker, EUA);
- Sorvente PSA, 40 μm (Varian, EUA);
- Sorvente C18, 40 μm (Varian, EUA);
- Água deionizada e posteriormente purificada em sistema Milli-Q, modelo Academic
(Millipore, EUA);
- Sulfato de magnésio anidro p.a. (Synth, Brasil);
- Cloreto de sódio p.a. (Synth, Brasil);
- Acetato de sódio anidro p.a. (Synth, Brasil);
- Nitrogênio gasoso (White Martins, Brasil);
-Tubos de polipropileno com tampas rosqueáveis do tipo Falcon (capacidade de 50 mL);
- Seringas (capacidade de 3 mL);
- Filtros de membrana de 0,22 μm de PVDE (Millex, EUA);
- Frascos de vidro (vials), capacidade de 2 mL (Waters, EUA);
- Coluna cromatográfica AcquityTM UPLC BEH C18 (50 x 2,1 mm d.i., 1,7 μm de diâmetro
de partícula), dotada com coluna de guarda Van GuardTM BEH C18 (5 mm × 2,1 mm d.i.,
1,7 µm diâmetro de partícula), do mesmo fabricante (Waters, EUA);
3.3.2 – Instrumentação
- Balança Sartorius modelo CPA 225D, com precisão de ±0,01 mg;
- Bomba de vácuo (Fanem, Brasil);
114
- Banho de ultrassom modelo USC 700 (Unique Thorton Brazil);
- Ultra-Turrax® modelo T18 basic (IKA, Brasil);
- Agitador do tipo Vórtex;
- Centrífuga modelo Excelsius II (Fanem, Brasil);
- Sistema UHPLC-MS/MS: cromatógrafo Acquity UPLC system (Waters, EUA) acoplado a
um espectrômetro de massas do tipo triploquadrupolo Quattro Premier da Micromass
(Waters, EUA) usando uma fonte de ionização por eletrospray; A aquisição e tratamento de
dados foi realizado pelo software Mass Lynx versão.4.1.
3.3.3 – Amostras selecionadas para o desenvolvimento do método
As amostras utilizadas durante os testes iniciais para o desenvolvimento do método
foram adquiridas no comércio local da cidade de Campinas/SP em março de 2011, tendo
sido adquiridas na forma de filé de salmão congelado, com massa aproximada de 1 kg.
Tendo ocorrido o processo de degelo à temperatura ambiente, realizou-se o processo de
retirada da pele do filé do peixe, deixando somente o músculo como material de estudo.
Em seguida cortou-se manualmente em pequenos pedaços todo o material que seria
investigado durante futuros experimentos, sendo que o mesmo foi devidamente
acondicionado em sacos plásticos em pequenas porções, cada qual pesando
aproximadamente 20 g, garantindo-se dessa forma que a amostra não ficasse sendo
submetida a ciclos de congelamento/descongelamento, minimizando as chances da
mesma sofrer deterioração. Após as porções serem devidamente acondicionadas, as
mesmas foram mantidas à temperatura inferior a -18 °C. Estas amostras para serem
consideradas como “branco”, deveriam ser isentas dos analitos de interesse.
3.3.4 – Quinolonas selecionadas
Os padrões analíticos utilizados foram: norfloxacina (NOR: 99,9 %, Kyorin
Pharmac., Japão); hidrocloridrato de sarafloxacina (SARA: 99,7%, Riedel-de-Haën–Sigma-
Aldrich, China); marbofloxacina e danofloxacina (MARBO e DANO: 98%, Pfizer, Brasil);
ciprofloxacina e enrofloxacina (CIPRO e ENRO: 98%, Fluka Biochemica – Sigma-
Aldrich, China), ofloxacina, ácido oxolínico e flumequina (OFLO, AOXOx e FLUM: 98%,
Sigma, Alemanha).
115
3.3.5 – Preparo das soluções analíticas
Preparo das soluções estoque
Para o preparo das soluções estoque da NOR, CIPRO, DANO e ENRO, foram
pesados 10 mg de cada padrão analítico. Os compostos foram solubilizados com uma
pequena quantidade de metanol, adicionados de 500 µL de ácido acético glacial e
transferidos para balão volumétrico de 10 mL, o qual foi avolumado com metanol. As
soluções foram armazenadas em frasco âmbar e mantida sob refrigeração a -18 ºC por até
6 meses. Para o preparo das soluções estoque da SARA, AOXO, FLUM e MARBO, o
mesmo procedimento de preparo foi adotado, com exceção do ácido acético glacial que foi
substituído por hidróxido de amônio.
Preparo das Soluções de trabalho
Para o preparo das soluções de trabalho, as soluções estoque foram diluídas em
fase móvel (água:metanol-0,1% HCOOH) obtendo-se soluções diluídas nas concentrações
de 1 a 20 μg mL-1. Todas as soluções de trabalho foram mantidas em frasco âmbar e
conservadas sob refrigeração a -18 ºC, por um período máximo de uma semana.
3.3.6 – Otimização das condições no UHPLC-MS/MS
Na realização dessa etapa do trabalho, os experimentos foram realizados
utilizando-se a cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de
massas sequencial (UHPLC-MS/MS), sendo utilizado o eletrospray (ESI), como fonte de
ionização, e um analisador de massas do tipo triploquadrupolo (QqQ), operando no modo
de monitoramento de reações selecionadas (SRM, do ínglês Selective Reaction
Monitoring).
São descritos a seguir os principais parâmetros que foram otimizados durante o
desenvolvimento desse trabalho.
3.3.6.1 – Escolha da fase móvel
A escolha da fase móvel foi baseada nas descritas na literatura para a
determinação de quinolonas e com as de uso frequente no laboratório onde esse trabalho
foi desenvolvido. Ela consistiu no uso de um gradiente de eluição (Tabela 3.4; pg 116)
utilizando-se uma mistura de água (solvente A) e metanol (solvente B), tendo sido
adicionado 0,1% (v/v) de ácido fórmico em ambos os solventes. A vazão utilizada foi de
0,35 mL min-1, o volume de injeção foi de 10 µL e o tempo total de corrida cromatográfica,
incluindo o tempo de reequilíbrio da coluna, antes da posterior injeção, foi de 11 min.
116
Tabela 3.4: Programa do gradiente utilizado na corrida cromatográfica
Tempo (min) % A % B
0,0 95 5
2,0 95 5
6,0 70 30
8,0 40 60
8,5 95 5
11,0 95 5
3.3.6.2 – Condições de detecção no sistema MS/MS:
Os parâmetros no espectrômetro de massas, o qual foi operado no modo de aquisição
SRM e com a fonte de ionização por eletrospray no modo positivo (ESI+), foram ajustados da
seguinte forma:
* Voltagem do capilar: 0,8 kV;
* Temperatura da fonte de ionização: 150 ºC;
* Temperatura de dessolvatação: 300 ºC;
* Vazão do gás de dessolvatação: 800 L/h;
* Intervalo do tempo de varredura (“dwell time”) – 0,1 s.
A dissociação induzida por colisão (CID) foi executada utilizando-se gás argônio à pressão
de 3 x 10-3 mbar na célula de colisão.
Os parâmetros específicos dos experimentos MS/MS (Tabela 3.5), como voltagem do
cone, energia de colisão e as transições selecionadas de cada composto para se trabalhar no modo
SRM, foram otimizados mediante a realização de infusão direta no espectrômetro de massas, de
soluções a 1 µg mL-1 de cada padrão analítico em solução aquosa de 0,1% HCOOH:MeOH
(adicionado de 0,1% HCOOH) na proporção 75:25 v/v.
TABELA 3.5: Intervalo do tempo de retenção (ItR) e parâmetros MS/MS para a detecção
das quinolonas.
ANALITO ItR (min.) Voltagem
Cone (V)
Transição de
Quantificação (a)
Transição de
Confirmação (a)
MARBO 3,00 – 5,15 25 363,3 > 72,0 (20) 363,3 > 345,0 (20)
OFLO 4,95 – 5,50 30 362,0 > 318,0 (20) 362,0 > 261,0 (20)
NOR 5,10 – 5,50 20 320,2 > 302,0 (20) 320,2 > 276,0 (20)
CIPRO 5,30 – 5,65 25 332,3 > 314,0 (20) 332,3 > 231,0 (20)
DANO 5,45 – 5,90 25 358,2 > 340,0 (30) 358,2 > 82,0 (30)
ENRO 5,45 – 5,90 25 360,2 > 342,0 (20) 360,2 > 316,0 (20)
SARA 5,90 – 6,70 25 386,3 > 368,0 (20) 386,3 > 343,0 (20)
AOXO 6,70 – 7,60 25 262,2 > 244,0 (25) 262,2 > 216,0 (25)
FLUM 7,70 – 8,50 25 262,2 > 244,0 (20) 262,2 > 202,0 (20)
(a) – Energia de colisão (eV) dada entre parênteses.
117
3.3.7) Avaliação de ensaios de preparo de amostra, baseados no método
QuEChERS, para determinação de quinolonas em amostras de salmão
por UHPLC-MS/MS
A avaliação do preparo de amostra, baseado no método QuEChERS, foi realizada
em duas etapas. Na primeira etapa se estudou o efeito da presença de sais na melhoria da
eficiência de extração das quinolonas e na segunda etapa avaliou o uso de sorventes PSA
ou C18 no processo de clean up do extrato contendo as quinolonas. O clean up também foi
avaliado utilizando-se uma etapa adicional de partição líquido-líquido com hexano. A fase
extratora utilizada para extração das quinolonas foi ACN:CH3COOH (1%, v/v), baseada no
estudo realizado por Stubbings e Bigwood (2009). A eficiência de extração foi avaliada
mediante uso de curva de padronização externa.
3.3.7.1 - Avaliação da presença de sais na etapa de extração
E1 - Extração líquido-sólido sem adição de sais (SLE)
Para se avaliar a eficiência de extração do método E1, foram pesados 2 g de
amostra, previamente triturada em ultra-turrax, diretamente em tubos do tipo Falcon (50
mL). Em seguida foi realizada a fortificação (n=2) ao nível de 500 ng g-1 com a solução
contendo todas as quinolonas na mesma concentração. Aguardou-se por um período de
repouso de aproximadamente 30 min, de forma que fosse garantida uma melhor
incorporação dos analitos na matriz. Após esse período, foram adicionados 15 mL da
solução extratora (ACN:CH3COOH 1%, v/v), sendo realizada em seguida a agitação em
vórtex por 1 minuto. Após essa etapa efetuou-se a centrifugação à 2355 g por 5 min, sendo
em seguida separado o sobrenadante que foi submetido à processo de evaporação até a
secura, com um fluxo brando de nitrogênio auxiliado com temperatura (60 ºC). O material
residual obtido após a evaporação foi ressuspendido em 1 mL de H2O:MeOH (75:25, v/v),
agitado por 1 minuto em vórtex e filtrado em filtros de seringas (0,22 µm) antes da análise
cromatográfica.
E2 - Extração líquido-sólido com adição de sais (SLE-sais)
O procedimento de avaliação da eficiência de extração do método E2 foi
semelhante ao E1, diferenciando na etapa de extração onde se fez a adição de sais. Após
a adição 15 mL da fase extratora (ACN:CH3COOH 1%, v/v), agitou-se a mistura com auxílio
118
de vórtex por 1 minuto, em seguida foram adicionados 400 mg da mistura de sais MgSO4
(anidro) : NaCl (3:1, m/m) e logo após repetiu-se a agitação em vórtex por mais 1 minuto.
Procedeu-se com o restante do procedimento (centrifugação / evaporação / ressuspensão)
da mesma forma que em E1.
E3 - Extração líquido-sólido com adição de sais tamponantes (SLE-sais tamp.)
O procedimento do método E3 foi semelhante ao E2, diferenciando o tipo de
mistura de sais. Dessa vez, foram adicionados à fase extratora 300 mg de MgSO4 (anidro)
e 1 g de acetato de sódio.
E4- Extração baseada no método QuEChERS-original
A avaliação da eficiência de extração das quinolonas baseando-se no método
QuEChERS-original, consistiu em se utilizar quantidades de amostra e de sais em
proporções recomendadas no método original. Para isso, pesaram-se 10 g de amostra,
previamente processada no ultra-turrax, diretamente em tubos do tipo Falcon (50 mL). Em
seguida foi realizada a fortificação (n=2) ao nível de 500 ng g-1. Aguardou-se por um período
de repouso de aproximadamente 30 min e após esse, foram adicionados 10 mL da solução
extratora (ACN/CH3COOH 1%, v/v), sendo realizada em seguida a agitação em vórtex por
1 minuto. Em seguida foram adicionados 4 g da mistura de sais MgSO4 (anidro):NaCl (3:1,
m/m) e, logo após, repetiu-se a agitação em vórtex por mais 1 minuto. Após essa etapa
efetuou-se a centrifugação à 2355 g por 5 min, sendo em seguida separado o sobrenadante
e retirando-se uma alíquota de 500 µL do mesmo para análise por UHPLC-MS/MS.
3.3.7.2 - Avaliação da etapa de Clean Up
As avaliações da etapa de clean up foram realizadas diretamente nos
sobrenadantes obtidos mediante processo de extração descrito em E1 (ítem 3.3.7.1).
C.U.1 - Clean up utilizando PSA (CU-PSA)
Ao sobrenadante obtido, conforme descrito em E1, foram adicionados 100 µg do
sorvente PSA. Agitou-se a mistura por aproximadamente 1 minuto e em seguida
centrifugou-se a mesma à 6000 rpm por 5 min. O novo sobrenadante obtido foi separado e
submetido à evaporação com um fluxo brando de nitrogênio auxiliado com temperatura (60
ºC). O material residual obtido após a evaporação foi ressuspendido em 1 mL de
119
H2O:MeOH (75:25, v/v), agitado por 1 minuto em vórtex e filtrado em filtros de seringa (0,22
µm) antes da injeção cromatográfica.
C.U.2 - Clean up utilizando C18 (CU- C18)
A verificação da etapa de clean up com o emprego de C18 foi realizada da mesma
forma que em C.U.1, substituindo-se o PSA por igual quantidade de C18.
C.U.3 - Partição líquido-líquido com hexano (CU-H)
Ao sobrenadante obtido, conforme descrito em E1, foram adicionados 10 mL de
hexano. A mistura foi agitada em vórtex por aproximadamente 1 minuto e a fase hexânica
foi removida com auxílio de uma pipeta de Pasteur e desconsiderada. A nova fase obtida
foi submetida a processo de evaporação com um fluxo brando de nitrogênio auxiliado com
temperatura (60 ºC). O material residual obtido após a evaporação foi ressuspendido em 1
mL de H2O:MeOH (75:25, v/v), agitado por 1 minuto em vórtex e filtrado em filtros de seringa
(0,22 µm) antes da análise cromatográfica.
120
Figura 3.2: Resumo esquemático da avaliação do processo de extração
Figura 3.3: Resumo esquemático de E4 (extração baseada no método QuEChERS original)
E2 Adição de Sais
400 mg – MgSO4/NaCl (3:1; m/m)
15 mL – ACN/Ác. Acético (1%, v/v)
Amostra (2g)
1. Fortificação (n = 2); 2. Repouso (30 min.);
EXTRAÇÃO
E1 (Sem Adição de sais)
E3 Adição de Sais Tamponantes 300 mg MgSO4 + 1 g AcONa
1. vórtex (1 min.) 2. centrifugação
sobrenadante
1. Evaporação 2. Ressuspensão 3. Filtração (0,22 µm)
Análise cromatográfica
1. vórtex (1 min.) 2. centrifugação
sobrenadante
1. Evaporação 2. Ressuspensão 3. Filtração (0,22 µm)
Análise
cromatográfica
1. vórtex (1 min.) 2. centrifugação
sobrenadante
1. Evaporação 2. Ressuspensão 3. Filtração (0,22 µm)
Análise
cromatográfica
Adição de Sais (4 g) MgSO4 : NaCl (3:1, m/m)
1. 10 mL – ACN/Ác. Acético (1%, v/v)) 2. vórtex (1 min.)
Amostra (10 g)
1. Fortificação (n = 2) 2. Repouso (30 min.)
EXTRAÇÃO
1. vórtex (1 min.) 2. centrifugação
sobrenadante
1. Alíquota (500 µL) 2. Filtração (0,22 µm)
Análise cromatográfica
121
Figura 3.4: Resumo esquemático da avaliação do processo de clean up.
1. 15 mL – ACN/Ác. Acético (1%, v/v) 2. vórtex (1 minuto) 3. centrifugação
1. Fortificação (n = 2); 2. Repouso (30 min.);
Amostra (2g)
EXTRAÇÃO
C.U.1 (100 µg de PSA)
C.U.3 Partição líquido-líquido
(10 mL de Hexano)
1. vórtex (1 min.) 2. centrifugação
sobrenadante
1. Evaporação 2. Ressuspensão: 3. Filtração (0,22 µm)
Análise
cromatográfica
1. vórtex (1 min.) 2. centrifugação
sobrenadante
1. Evaporação 2. Ressuspensão: 3. Filtração (0,22 µm)
Análise
cromatográfica
1. vórtex (1 min.) 2. centrifugação
sobrenadante
1. Evaporação 2. Ressuspensão: 3. Filtração (0,22 µm)
Análise
cromatográfica
Sobrenadante
C.U.2 (100 µg de C18)
122
3.3.8 - Validação do método analítico para determinação de quinolonas
em salmão
A validação do método analítico, para a determinação de quinolonas em amostras
de salmão por UHPLC-MS/MS, foi feita baseando-se nos seguintes parâmetros:
seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de decisão (CCα), capacidade de
detecção (CCβ) e efeito matriz, tendo sido baseadas em recomendações do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2011) e da Comunidade Europeia (EC,
2002).
O número de experimentos, durante todo o processo de validação, bem como o de
amostras analisadas, foi otimizado de modo a se realizar um menor número de ensaios.
3.3.8.1 – Seletividade
A seletividade do método foi avaliada comparando-se os cromatogramas da
amostra branco, submetida ao mesmo tipo de preparo de amostra selecionado para o
método, com o da amostra branco fortificada, ao nível de fortificação de 1,0 x LMR (ng g-1)
para cada quinolona em estudo. Na avaliação dos cromatogramas observou-se a presença
de interferentes na mesma janela de retenção dos íons de quantificação e de confirmação.
3.3.8.2 – Curva analítica e linearidade
A construção das curvas analíticas para a quantificação das quinolonas foi
realizada mediante o método de padronização interna da curva analítica na matriz branca.
Foi utilizada a norfloxacina como surrogate e a plotagem da curva foi realizada pela razão
área do pico do analito/área do pico do surrogate em função da concentração. A
norfloxacina foi utilizada como surrogate devido ao fato dela não ser autorizada como
medicamento veterinário. Utilizou-se a ofloxacina como padrão interno de referência,
visando a identificação de possíveis flutuações nas respostas analíticas durante a etapa de
detecção no sistema MS/MS, flutuações essas que independem da etapa de preparo de
amostra. O P.I. de referência foi preparado na concentração de 100 ng mL-1 na solução final
de ressuspensão dos analitos (H2O:MeOH 75:25, v/v - 0,1% HCOOH, v/v), etapa que
antecede a injeção das amostras no sistema cromatográfico. As amostras branco de
salmão foram fortificadas em cinco níveis de concentração (n1, n2, n3, n4 e n5) os quais
corresponderam a 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 vezes o LMR, respectivamente. O Guia do MAPA
(MAPA, 2011) recomenda que cada nível de concentração seja analisado em triplicata de
amostra e que se faça uma duplicata de injeção para cada uma delas, devendo assim a
curva analítica ser levantada com trinta pontos. Visando um menor número de ensaios
123
durante o processo de validação, otimizou-se a redução do número de experimentos
durante seu desenvolvimento. Dessa forma, os níveis n1, n2 e n3 foram realizados em
sextuplicata de análise, de forma a se garantir a obtenção direta de outros ensaios, como
exatidão e precisão, aos quais serão descritos posteriormente. Quanto ao número de
ensaios correspondente aos níveis n4 e n5 realizou-se como é recomendado por essa
normativa – em triplicata de amostra e em duplicata de injeção.
O procedimento de fortificação consistiu na utilização de 1 g de amostra branco de
salmão, com adição de 500 µL da solução de fortificação, contendo a mistura de todas as
quinolonas, excetuando o P.I. ofloxacina, preparadas em solução de H2O:MeOH (75:25,
v/v), de modo que se obtivesse as concentrações descritas na Tabela 3.6.
A linearidade do método foi avaliada mediante cálculo de regressão linear aplicado
ao conjunto de dados obtidos à partir da curva analítica matrizada, tendo sido obtidos os
coeficientes de regressão a e b, e ainda o coeficiente de regressão linear r. Foi obtido
também o gráfico de resíduos para se verificar a linearidade, tendo sido aplicado o Teste
de Jacknife (Método dos Resíduos Padronizados – Jei) para avaliar a presença de possíveis
outliers.
Tabela 3.6: Concentrações dos analitos para a construção da curva analítica na matriz branco de
salmão.
Nível de
Fortificação
Concentração – ng g-1
Nor1 Oflo2 Marbo3 Cipro Dano Enro Sara AcOx Flum
n1 (0,5 LMR) 250 100 25 50 50 50 15 50 75
n2 (1,0 LMR) 250 100 50 100 100 100 30 100 150
n3 (1,5 LMR) 250 100 75 150 150 150 45 150 225
n4 (2,0 LMR) 250 100 100 200 200 200 60 200 300
n5 (2,5 LMR) 250 100 125 250 250 250 75 250 375
1 – “surrogate” – concentração constante;
2 – Padrão Interno de Referência; concentração de 100 ng mL-1; preparado na etapa de resuspensão da
amostra que antecede a injeção no sistema cromatográfico.
3 – sem LMR estabelecido legalmente; valor estipulado.
3.3.8.3 – Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediária)
A precisão do método analítico, em termos de repetibilidade, foi obtida mediante a
realização de sextuplicata de análise por nível de fortificação, tendo sido realizada em 3
níveis: 0,5, 1,0 e 1,5 x LMR.
A precisão intermediária do método, também conhecida como reprodutibilidade
intralaboratorial, foi obtida da mesma forma que a repetibilidade, porém em mais dois dias
124
diferentes, perfazendo um total de 18 ensaios por nível de fortificação e sendo obtida nos
mesmos 3 níveis (0,5 LMR, 1,0 LMR e 1,5 LMR).
Como critério de aceitação, considera-se que a nível de resíduo, o coeficiente de
variação do método não deve exceder a 20% (MAPA, 2011).
3.3.8.4 – Exatidão
Devido à indisponibilidade de material certificado de referência, a exatidão do
método foi avaliada mediante ensaio de recuperação. Dessa forma, se procedeu realizando
fortificações de amostras branco (n = 18) em três níveis de concentração – 0,5 LMR, 1,0
LMR e 1,5 LMR, tendo sido realizados procedimentos de extração de amostras branco de
salmão fortificadas em sextuplicata para cada nível de fortificação.
A exatidão do método analítico, expressa como porcentagem de recuperação, foi
calculada conforme a equação (3.1).
𝑅𝑒𝑐 (%) =𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝐷𝑒𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑥 100 Eq. 3.1
No caso de se trabalhar com concentrações a nível de resíduos, os valores de
recuperações aceitos se situam na faixa de 80% a 110% (MAPA, 2011).
3.3.8.5 – Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ)
O limite de decisão (CCα) e a capacidade de detecção (CCβ) do método analítico
foram calculados utilizando-se dados dos pontos da curva analítica construída na matriz,
fortificados na concentração do LMR para cada substância.
Para as substâncias que possuem um LMR, ou seja, substâncias que não são
consideradas banidas, as equações (3.2 e 3.3) foram empregadas para o cálculo de CCα
e de CCβ.
CCα = LMR + 1,64σ (Eq. 3.2)
CCβ = CCα + 1,64σ (Eq. 3.3)
Onde σ corresponde ao desvio padrão da reprodutibilidade intralaboratorial, que
por sua vez também corresponde à precisão intermediária.
Para substâncias com valores de LMR estabelecidos, os valores de CCα e CCβ
deverão ser sempre maiores que LMR, no entanto, deverão ser o mais próximo possível do
mesmo (MAPA, 2011).
125
3.3.8.6 – Efeito Matriz
A avaliação do efeito matriz foi realizada calculando-se a razão entre as inclinações
das equações das retas obtidas entre soluções padrão preparadas no solvente puro
(H2O:MeOH-75:25 v/v - 0,1% HCOOH, v/v) com aquelas preparadas no extrato da matriz
branco fortificadas. As concentrações utilizadas para as construções das curvas, tanto no
solvente quanto no extrato da matriz branco, a título de cálculo do efeito matriz, foram de
0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 vezes o LMR, tendo sido realizadas em triplicatas de análise.
O cálculo do efeito matriz foi baseado na equação 3.4.
E. M. (%) =Inclinação da Reta do Extrato da Matriz
Inclinação da Reta do Solvente 𝑥 100 Eq. 3.4
3.4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.4.1 - AVALIAÇÃO INICIAL DAS ETAPAS DO DESENVOLVIMENTO DE
MÉTODO ANALÍTICO PARA A DETERMINAÇÃO DE QUINOLONAS EM
AMOSTRAS DE SALMÃO
3.4.1.1 - CONDIÇÕES INICIAIS DE ESTUDO
Mediante a realização de infusão direta de cada quinolona no espectrômetro de
massas, foi possível estabelecer as condições iniciais de trabalho de cada composto para
posterior quantificação dos analitos por MS/MS. Cada analito foi inicialmente introduzido
diretamente, via seringa de infusão, na concentração de 1 µg mL-1 em solução de
H2O:MeOH (75:25, v/v) acrescida de 0,1% de ácido fórmico (v/v). Dessa forma foram
determinados quais seriam as melhores condições de fragmentação na câmara de colisão
para a obtenção dos íons a serem detectados no modo SRM, operando a fonte de ESI no
modo positivo. As condições adequadas de trabalho utilizadas na fonte de ionização
encontram-se descritas no item 3.3.6.2.
Para cada composto foram selecionadas as duas transições mais intensas, sendo
que o pico de maior intensidade foi escolhido como transição de quantificação e o de
segunda maior intensidade como transição de confirmação, como já apresentado na Tabela
3.5 (pg 116).
126
Para as quinolonas, os íons mais intensos observados são aqueles que
correspondem aos íons produtos [MH – H2O]+ e [MH – CO2]+.
3.4.1.2 - CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
A adição de ácido fórmico (HCOOH - 0,1%, v/v), tanto nas soluções de infusão
direta como na fase móvel, tem como finalidade facilitar o processo de ionização das
quinolonas como espécies carregadas positivamente, ou seja, formar espécies [M+H]+.
Otimizado os parâmetros de detecção no sistema MS/MS, realizou-se o acoplamento entre
o sistema cromatográfico e o espectrômetro de massas.
A separação cromatográfica foi realizada utilizando-se uma coluna de fase reversa
C18 (50 x 2,1 mm,1,7 μm) e uma fase móvel composta de uma mistura H2O:MeOH em
eluição por gradiente e vazão de 0,35 mL min-1 (Tabela 3.4; pg 116). Com o intuito de se
minimizar o tempo de análise, optou-se pela não separação dos analitos na coluna
cromatográfica. Isso é viável, uma vez que os íons precursores e produtos monitorados tem
m/z diferentes.
Empregando as condições selecionadas, utilizou-se um total de 9 canais de
aquisição, sendo que um deles monitorou um máximo de 4 transições (2 compostos),
referentes a DANO e a ENRO, que eluíram praticamente no mesmo tempo de retenção.
Uma das principais vantagens na utilização de um sistema UHPLC em relação aos
métodos LC convencionais diz respeito à redução no tempo de análise. No
desenvolvimento desse método, um tempo de corrida de 11 min foi obtido, isso já levando
em conta o tempo gasto para a coluna ficar novamente reequilibrada com as condições
iniciais para a próxima injeção.
As Figuras 3.5a e 3.5b (pg 104) apresentam, respectivamente, o cromatograma de
íons extraídos e o cromatograma de íons totais (TIC), referentes às separações
cromatográficas das quinolonas, fortificadas em amostra branco de salmão a nível de
1xLMR.
127
Figura 3.5a: Cromatograma de íons extraídos obtido por UHPLC-MS/MS (ESI+) no modo SRM para
separação de quinolonas fortificadas em amostra branco de salmão (1xLMR; para valores
individuais de LMR, consultar a Tabela 3.6. Condições cromatográficas: volume de injeção 10 µL;
Fase móvel: H2O:MeOH (0,1% HCOOH, v/v); eluição por gradiente (ver Tabela 3.4); vazão: 0,35
mL min-1; coluna cromatográfica e de guarda: Acquity TH BEH C18 (50 x 2,1 mm; 1,7 µm); tempo
total de corrida: 11 min.; surrogate: norfloxacina; padrão interno de referência: ofloxacina.
Figura 3.5b: Cromatograma de íons totais (TIC) de uma amostra branco fortificada a 1 x LMR.
Condições cromatográficas semelhantes às da Figura 3.5a.
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
300812_MRT_B1_1 1: MRM of 2 Channels ES+ 363.3 > 72 (MARBO (QUANTI))
6.66e4
4.77
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
300812_MRT_B1_1 8: MRM of 2 Channels ES+ 262.2 > 244 (FLUM QUANT)
1.44e5
8.00
300812_MRT_B1_1 7: MRM of 2 Channels ES+ 262.2 > 244 (ACOX QUANT)
8.79e4
7.09
300812_MRT_B1_1 6: MRM of 2 Channels ES+ 386.3 > 368 ( SARA (QUANTI))
4.83e3
6.036.07
6.126.36
300812_MRT_B1_1 5: MRM of 4 Channels ES+ 360.2 > 342 (ENRO Quanti)
2.28e4
5.61
5.71
300812_MRT_B1_1 5: MRM of 4 Channels ES+ 358.2 > 340 (DANO Quanti)
2.74e4
5.64
300812_MRT_B1_1 4: MRM of 2 Channels ES+ 332.3 > 314 (CIPRO QUANTI)
1.69e4
5.42
300812_MRT_B1_1 3: MRM of 2 Channels ES+ 320.2 > 302 (NOR (QUANT))
9.49e4
5.23
300812_MRT_B1_1 2: MRM of 2 Channels ES+ 362 > 318 (OFLO (QUANTI))
3.76e4
5.12
300812_MRT_B1_1 1: MRM of 2 Channels ES+ 363.3 > 72 (MARBO (QUANTI))
6.66e4
4.77 Marbo
Nor
Oflo
Cipro
Dano
Enro
Sara
AcOx
Flum
128
3.4.2 - AVALIAÇÃO DE ENSAIOS DE TÉCNICAS DE PREPARO DE
AMOSTRA BASEADAS NO MÉTODO QuEChERS
A etapa de preparo de amostra é sempre um dos pontos críticos durante o
desenvolvimento de um método analítico, dada a complexidade da matriz a ser investigada
e também as diferentes propriedades físico-químicas das substâncias que devem ser
simultaneamente extraídas. Um dos objetivos desse trabalho foi o desenvolvimento e a
validação de um método de análise de resíduos de quinolonas em amostras de salmão por
UHPLC-MS/MS, possuindo uma abordagem simplificada e consistente durante a etapa do
preparo de amostra. Cabe destacar, que no preparo de amostras os analitos devem ser
extraídos com eficiência com o menor teor possível de concomitantes ou interferentes que
podem ocasionar um efeito matriz na quantificação.
Inicialmente foi avaliado a extração por solvente, usando ACN:CH3COOH (1%, v/v),
conforme sugerido na literatura (Stubbings & Bigwood, 2009) – Ensaio E1. A utilização de
acetonitrila acidificada permitiu a extração das quinolonas do filé de salmão com uma
eficiência de extração superior a 65% para todas quinolonas em estudo, com exceção para
a SARA, cujo valor ficou em torno de 50%. Ainda, a mesma permitiu a obtenção de um
precipitado proteico de fácil separação da fase extratora. Outra característica importante é
a de que uma única etapa de extração possibilitou que se atingisse os menores níveis de
concentração exigidos (0,5 LMR) para a construção das curvas analíticas. Referente ao
extrato obtido em E1 observou-se a formação de um resíduo alaranjado (pellet) quando o
mesmo foi evaporado até a secura, o qual é insolúvel na fase móvel (H2O:MeOH-75:25, v/v
– 0,1% HCOOH, v/v) de ressupensão.
Na tentativa de se utilizar um procedimento bastante similar ao método QuEChERS
original, realizou-se um ensaio (E4) onde se fez uso de quantidades de amostras, volume
de extração, quantidade de sais e de sorventes em proporções equivalentes a esse
procedimento. Isso visando a não necessidade da etapa de evaporação do extrato obtido,
o que conferiria ao método um ganho efetivo no tempo gasto durante a etapa de preparo
de amostra. No entanto, com esse procedimento as quinolonas não foram extraídas da
matriz do salmão.
No intuito de obter uma melhora na eficiência de extração usando o procedimento
E1, foram realizados testes de adição de sais (E2- MgSO4 + NaCl e E3 - MgSO4 + acetato
de sódio) ao solvente extrator visando a promoção do efeito salting out. Observou-se que
embora a adição de sais tenha promovido a formação de um precipitado proteico mais
129
consistente, favorecendo a separação da fase extratora, não ocorreu aumento significativo
na eficiência de extração dos analitos que justificasse seu emprego, ocorrendo pelo
contrário, uma diminuição de eficiência para a maior parte das quinolonas, como pode ser
visto na Figura 3.6. Inclusive a substituição do NaCl por acetato de sódio prejudicou a
extração dos analitos. Dessa forma percebe-se que não foi justificado a adição dessa outra
etapa, tendo em vista o aumento no tempo consumido na pesagem dos sais e o custo
relacionado ao consumo de reagentes. Picó e colaboradores (Blasco et al., 2011), num
trabalho que avalia a eficiência de procedimentos de extração de antimicrobianos em
músculo bovino, mais especificamente a extração líquido pressurizada (PLE) e o método
QuEChERS, descrevem que a utilização de grandes quantidades de agentes secantes
forneceram baixas recuperações das quinolonas, argumentando a ocorrência de tal fato
pela possibilidade da adsorção destes compostos aos sais empregados.
Figura 3.6: Eficiências de extração dos ensaios E1, E2 e E3
Uma etapa de clean up do extrato foi avaliada com o intuito de eliminar lipídeos e
outros coextrativos da amostra que viessem, por ventura, prejudicar a ionização dos
analitos na fonte ESI e, em consequência, comprometer o sinal analítico na etapa de
detecção, assim como o tempo de vida útil da coluna cromatográfica. Para tanto, foram
testados 3 procedimentos de clean up (C.U.1 - PSA, C.U.2 – C18 e C.U.3 – hexano). Nos
dois primeiros procedimentos foram utilizados os sorventes PSA ou C18, e no terceiro foi
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Marbo Nor Cipro Dano Enro Sara AcOx Flum
E1 - ELS
E2 - ELS c/ sal
E3 - ELS c/ sal tamp.
130
realizada uma partição líquido-líquido com hexano. Os cromatogramas de íons totais não
revelaram a existência de diferenças significativas dos extratos obtidos em C.U.1, C.U.2 e
E1. Quanto à eficiência de extração das quinolonas houve uma leve perda quando os
sorventes foram empregados, (10-17%) para o PSA e (2-11%) para o C18, se comparado
com a não utilização dos mesmos em E1. No artigo supracitado (Blasco et al., 2011) os
autores também reportam haver similaridade nas recuperações quando se utiliza PSA e
C18 e que suas quantidades empregadas não correspondem a um fator crítico, muito
embora eles citem que a utilização de uma grande quantidade de sorvente origine extratos
turvos. Mediante a utilização da partição líquido-líquido do extrato com hexano, também
não se observou mudanças significativas no TIC após essa etapa de clean up quando
comparado com o obtido em E1, sendo que a adição dessa nova etapa também promoveu
perda de analitos (7–15%).
Diante do mencionado optou-se por realizar o processo de preparo de amostra
baseando-se apenas em uma única e simples extração com solvente, utilizando como fase
extratora ACN:CH3COOH (1%, v/v), sem posterior etapa de clean up. Tal proposição
mostra-se bastante condizente com recentes trabalhos publicados na literatura que
realizam determinações de RFV-AOA baseando-se no procedimento QuEChERS e suas
modificações. Tais trabalhos corroboram mostrando tanto a opção de fazerem uso da ACN
acidificada, na etapa de extração, como também vários deles afirmam ser dispensável a
posterior etapa de clean up do extrato (Frenich et al., 2010; Luiz et al., 2008; Lopes et al.,
2012a; Bjorn et al., 2012).
3.4.3 - VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE
QUINOLONAS EM SALMÃO
3.4.3.1 - SELETIVIDADE
A seletividade do método foi avaliada por meio da análise de amostras branco de
salmão submetidas ao processo de preparo de amostra selecionado (E1). Tal procedimento
demonstrou a ausência de sinais coeluindo nos intervalos dos tempos de retenção dos
compostos em estudo, mostrando a ausência de interferentes na matriz selecionada. O
MAPA preconiza, como critério de aceitabilidade de seletividade, que o sinal do interferente
seja igual ou inferior a 30% do sinal do analito no menor nível de concentração (0,5 LMR)
da curva matrizada (MAPA, 2011). Dessa forma, tal amostra foi utilizada para ensaios de
fortificação e para a construção das curvas analíticas na matriz. Devido à alta seletividade
131
do sistema de detecção, utilizando a espectrometria de massas sequencial (QqQ) operando
no modo SRM, conseguiu-se facilmente distinguir os sinais dos analitos daqueles referentes
às substâncias que coeluíram com os mesmos, isso sendo dado através da diferenciação
de seus íons percursores e produtos, o que evitou sinais de falso positivo. A confirmação
das substâncias em amostras reais se dará por comparação entre a razão das intensidades
dos sinais das duas transições escolhidas (quantificação e confirmação), obtidas utilizando
amostras branco fortificadas como recomendado pela Comunidade Europeia (EC, 2002).
Figura 3.7: Cromatogramas típicos obtidos empregando uma amostra branco de salmão.
Condições cromatográficas semelhantes às da Figura 3.5a.
3.4.3.2 - CURVA ANALÍTICA, LINEARIDADE E EFEITO MATRIZ
A curva analítica foi obtida plotando-se a razão entre as áreas, do sinal analítico de
cada quinolona pelo sinal do surrogate, versus sua concentração. Foram construídas seis
curvas analíticas na matriz branco em cinco níveis de concentração cada uma (0,5; 1,0;
1,5; 2,0 e 2,5 LMR). O estudo da linearidade do método foi realizado através de tratamento
estatístico por ajuste dos dados pelo Método dos Mínimos Quadrados Ordinários (MMQO),
sendo utilizado para isso o programa computacional Excel®. Através do mesmo programa
se obteve o gráfico da curva analítica, o gráfico de resíduos, a equação da reta e os
parâmetros de regressão linear. Pontos referentes a valores dispersos da curva analítica
(outliers) foram identificados e eliminados através do Teste dos Resíduos Padronizados de
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
%
0
100
230812_BRANCO1 8: MRM of 2 Channels ES+ 262.2 > 244 (FLUM QUANT)
124
8.187.877.77 8.35
230812_BRANCO1 7: MRM of 2 Channels ES+ 262.2 > 244 (ACOX QUANT)
593
6.85
6.826.91
7.50 7.57
230812_BRANCO1 6: MRM of 2 Channels ES+ 386.3 > 368 ( SARA (QUANTI))
126
5.995.94
6.43 6.56
230812_BRANCO1 5: MRM of 4 Channels ES+ 360.2 > 342 (ENRO Quanti)
223
5.785.565.51 5.84
230812_BRANCO1 5: MRM of 4 Channels ES+ 358.2 > 340 (DANO Quanti)
48
5.865.785.52
230812_BRANCO1 4: MRM of 2 Channels ES+ 332.3 > 314 (CIPRO QUANTI)
141
5.34
5.31
5.60
230812_BRANCO1 3: MRM of 2 Channels ES+ 320.2 > 302 (NOR (QUANT))
153
5.295.17
5.43
230812_BRANCO1 2: MRM of 2 Channels ES+ 362 > 318 (OFLO (QUANTI))
96
5.124.985.23
230812_BRANCO1 1: MRM of 2 Channels ES+ 363.3 > 72 (MARBO (QUANTI))
463
3.883.04 3.11 3.84
4.03
4.18 4.61 4.944.99
230812_BRANCO1 1: MRM of 2 Channels ES+ TIC513
3.883.04 3.843.11
4.244.99
4.844.67 5.03
132
Jacknife, o mesmo tendo sido aplicado de forma sucessiva até não mais ser obtido outliers,
ou até uma máxima exclusão de 22,2% do número original de resultados.
Na Figura 3.8, são apresentadas as curvas analíticas obtidas pela fortificação de
amostras branco de salmão com todos os analitos.
FIGURA 3.8: Curvas analíticas das quinolonas na matriz e seus respectivos gráficos
de resíduos
y = 0,0027x - 0,0181
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 100 200 300
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica CIPRO
-0,03
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0 100 200 300
Re
síd
uo
s (n
g g-1
)
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos CIPRO
y = 0,0303x - 0,165
0
1
2
3
4
5
0 25 50 75 100 125 150
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica MARBO
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0 25 50 75 100 125 150R
esíd
uo
s (n
g g-1
)
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos MARBO
y = 0,0044x + 0,0031
0
0,5
1
1,5
0 100 200 300Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica DANO
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0 100 200 300
Res
ídu
os
(ng
g-1)
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos DANO
133
FIGURA 3.8: Continuação
y = 0,0042x - 0,0221
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 50 100 150 200 250 300
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica ENRO
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0 100 200 300
Res
ídu
os
(ng
g-1)
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos ENRO
y = 0,0027x - 0,0053
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 20 40 60 80
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica SARA
-0,03
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0 15 30 45 60 75 90R
esíd
uo
s (n
g g-1
)
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos SARA
y = 0,0158x + 0,0388
0
1
2
3
4
5
0 100 200 300
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica AcOx
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0 100 200 300
Res
ídu
os
(ng
g-1)
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos AcOx
y = 0,0152x - 0,0192
0
1
2
3
4
5
6
7
0 75 150 225 300 375
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica FLUM
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0 100 200 300 400
Res
ídu
os
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos FLUM
134
As curvas analíticas construídas na matriz mostraram-se lineares nos intervalos de
trabalho estudados (0,5 - 2,5 LMR), sendo que todas apresentaram coeficiente de
correlação linear (r) superior a 0,99, como recomenda o MAPA (MAPA, 2011) e a
Comunidade Europeia (EC, 2002).
A Tabela 3.7 mostra as equações da reta, valores encontrados para o coeficiente de
correlação linear (r) e o cálculo do efeito matriz.
Tabela 3.7: Intervalos de tempo de retenção, razão entre os íons, curvas analíticas,
coeficientes de correlação linear e efeitos matriz.
Analito ItR (min)
Razão
entre
Íons (%)
Curva Analítica na
Matriz
Coeficiente de
correlação
linear (r)
Efeito
Matriz (%)
MARBO 3,00-5,15 4 y = 0,0303x – 0,165 0,9929 - 15
CIPRO 5,30-5,65 19 y = 0,0027x – 0,0181 0,9976 - 24
DANO 5,45-5,90 84 y = 0,0044x + 0,0031 0,9963 - 15
ENRO 5,45-5,90 81 y = 0,0042x – 0,0221 0,9973 - 4
SARA 5,90-6,70 3 y = 0,0027x – 0,0053 0,9911 - 36
AcOx 6,70-7,60 28 y = 0,0158x + 0,0388 0,9946 - 6
FLUM 7,70-8,50 13 y = 0,0152x – 0,0192 0,9939 - 2
O efeito matriz foi negativo para todos os analitos e manteve-se no intervalo de -2
a -36%, o que significa que a matriz suprime o sinal analítico. Muito embora o efeito matriz
seja investigado em muitos trabalhos descritos na literatura, não existe um consenso de
como o mesmo deva ser avaliado durante a validação do método analítico. De modo geral,
o efeito matriz ocorre na ionização dos analitos, na qual concomitantes extraídos da matriz
afetam esse processo na fonte de ESI. A melhor forma para que se compense o efeito
matriz em métodos que utilizam a espectrometria de massas como técnica de detecção é
através da utilização de padrões internos marcados isotopicamente. No entanto, nem todos
os analitos isotopicamente marcados estão disponíveis no mercado e, quando disponíveis,
tem um custo elevado. Por outro lado, o efeito matriz não afeta o resultado final, quando a
135
curva analítica é obtida pela fortificação da matriz branca e uso concomitante de um
surrogate (Eeckhaut et al., 2009; Cassiano et al., 2009; Pulido et al., 2011; Friggi, 2012).
3.4.3.3 - EXATIDÃO E PRECISÃO
A exatidão e a precisão, ambas com resultados mostrados na Tabela 3.8 (pg 136),
foram avaliadas mediante ensaios de recuperação em três diferentes níveis de fortificação
(0,5; 1,0 e 1,5 x LMR). As exatidões para todos os analitos situaram-se na faixa de 96-
107%, ou seja, dentro do intervalo preconizado pelo MAPA (MAPA, 2011) de 80% a 110%.
Os resultados obtidos para a precisão em termos de repetibilidade (n = 6) e de precisão
intermediária (n = 18), expressos como coeficiente de variação (CV), foram todos inferiores
a 20%. A FLUM apresentou a maior dispersão de resultados para o menor nível de
concentração (20%). Assim, pode-se verificar que foram obtidos resultados satisfatórios em
termos de exatidão e recuperação dentro dos intervalos preconizados.
3.4.3.4 - LIMITE DE DECISÃO (CCα) E CAPACIDADE DE DETECÇÃO (CCβ)
O limite de decisão (CCα) e a capacidade de detecção (CCβ), calculados conforme
descrito no item 3.3.8.5 (pg. 127), foram obtidos utilizando-se dados da curva analítica na
matriz e valores de LMR estabelecidos pela Comunidade Europeia para resíduos de
quinolonas em salmão (Canãda et al., 2009). Os resultados obtidos encontram-se listados
na Tabela 3.8 (pg 136). Todas as substâncias avaliadas, excetuando-se a MARBO, que
por sua vez não sendo uma substância banida teve seu valor de LMR estipulado a 50 ng g-
1, possuem valores estabelecidos de LMR.
Para as substâncias que possuem LMR a nível de 100 ng g-1 (CIPRO, DANO,
ENRO e ACOx) os valores de CCα e CCβ foram inferiores a 115 e 129 ng g-1
respectivamente. A SARA, substância de menor LMR estabelecido, situou seus valores de
CCα e CCβ em 33 e 36 ng g-1, respectivamente. Assim, observa-se que tais valores situam-
se sempre próximos aos seus LMR, como preconizado pelo MAPA (MAPA, 2011).
136
Tabela 3.8: LMR das quinolonas em salmão e resultados da exatidão, precisão
(repetibilidade e precisão intermediária), CCα e CCβ.
ANALITO LMR
(µg kg-1)
Nível de
Fortificação
(LMR)
Exatidão Rec. (%)
(n = 6)
Prec.
Rep.
(n = 6)
Prec.
Intermed. (n = 18)
CCα (µg kg-1)
CCβ (µg kg-1)
MARBO*
0,5 107 8 12
50 1,0 100 7 5 54 59
1,5 96 2 5
CIPRO 100
0,5 100 7 8
1,0 102 3 5 107 115
1,5 98 3 3
DANO
0,5 98 5 10
100 1,0 104 4 5 109 118
1,5 98 1 4
ENRO 100
0,5 101 4 6
1,0 102 4 3 105 111
1,5 97 3 5
SARA
0,5 102 6 16
30 1,0 105 3 6 33 36
1,5 98 6 8
ACOx 100
0,5 96 3 6
1,0 106 3 9 114 129
1,5 98 2 6
FLUM
0,5 101 5 20
150 1,0 106 8 8 169 189
1,5 97 3 8
Prec. Rep.: precisão repetibilidade; Prec. Intermed.: precisão intermediária.
137
3.5 – Análise de amostras de salmão
Objetivando-se mostrar a aplicabilidade do método desenvolvido e validado, como
método que possa ser aplicado em análises de rotina, 25 amostras que seriam destinadas
ao consumo humano foram analisadas quanta à presença de quinolonas. As amostras
foram adquiridas na forma de filé de salmão em diferentes supermercados da cidade de
Campinas/SP. Na análise das amostras comerciais não se evidenciou a presença de
nenhuma das quinolonas monitoradas, tendo todas as amostras dado resultado negativo
em relação à presença das mesmas.
3.6 – CONCLUSÕES PARCIAIS
Um método para determinação multiresíduo de quinolonas em amostra de salmão
foi desenvolvido e validado. O método de extração baseou-se em uma única e simples
etapa de extração líquido-sólido sem a necessidade de posterior etapa de clean up. O
método proposto e validado apresentou como características, ser simples e rápido quando
comparado a métodos convencionais que fazem uso da tradicional etapa de SPE. Tal
procedimento, aliado às particularidades inerentes a um sistema UHPLC-MS/MS, teve
ainda ganhos relacionados às características de desempenho analítico, como
detectabilidade e seletividade. Diante de tais peculiaridades, somadas aos adequados
parâmetros de validação alcançados, é possível dizer que tal método possui atributos que
se adequam aos métodos que possam ser utilizados na rotina de laboratórios de controle
e fiscalização de remanescentes residuais de antimicrobianos em salmão. O referido
método foi aplicado em 25 amostras comerciais de salmão de diferentes supermercados
da cidade de Campinas/SP, não tendo sido encontrada nenhuma amostra com resultado
positivo. Embora surja um novo conceito na análise de RFV, seja no campo da análise de
alimentos ou ambiental, com o emprego da HRMS, no qual se defende a possibilidade de
execução de análise de compostos alvos e não alvos, pode-se afirmar que o emprego de
analisadores do tipo QqQ ainda possui campo de domínio bastante predominante na
quantificação multianalitos, muito embora tais sistemas apresentem limitações inerentes já
discutidas na introdução do capítulo.
138
CAPÍTULO 04
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE
MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE
AVERMECTINAS E MILBEMICINA EM CARNE
BOVINA PELA EXTRAÇÃO LÍQUIDO PRESSURIZADO
E QUANTIFICAÇAO POR HPLC-FLD
4.1 – Introdução
139
4.1.1 – A criação de gado no Brasil e o uso de avermectinas em sua
produção
A produção de carne bovina no Brasil constitui um dos principais negócios no
mercado mundial, uma vez que o país detém o segundo maior rebanho mundial. Esse
desempenho é possível pelo país ter uma extensa área territorial e diversidade em clima.
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) estima que até 2020 a
produção nacional cobrirá 44,5% de todo o mercado internacional, com a expectativa de
que o Brasil atinja a posição de primeiro colocado na exportação mundial (MAPA, 2016a).
Concomitante ao aumento na produção de carnes, o Brasil também tem apresentado
um crescimento de forma acelerada na indústria de produtos farmacêuticos veterinários.
Tal fato pode ser constatado levando-se em conta o grande número de indústrias instaladas
no Brasil. Segundo Rath e colaboradores, considerando o Compêndio de Produtos
Veterinários (CPVS), que é publicado pelo Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para
Saúde Animal (SINDAN), apoiado pela Coordenação de Fiscalização de Produtos
Veterinários (CPV) do MAPA, foram registrados, em dezembro de 2014, 3.005 produtos
veterinários contendo avermectinas como insumo farmacêutico ativo provenientes de 114
empresas diferentes. Outro dado com importância relevante registrado é o que aponta o
faturamento de R$ 3.956 milhões em cima dos produtos farmacêuticos veterinários no
mercado nacional em 2013. Em termos de consumo, 27% estiveram relacionados ao
comércio de vacinas, 25% de antiparasitários e 16% de antimicrobianos, valendo ressaltar
ainda que, dos fármacos veterinários que foram vendidos em 2013, 56,3% foram destinados
ao emprego em ruminantes (Rath et al., 2016).
As avermectinas constituem uma das principais classes de fármacos veterinários
empregadas na bovinocultura. Essa classe chega a perfazer mais de 44% do total de
medicamentos com caráter antiparasitário empregados no Brasil. Sua preferência se dá,
provavelmente, devido à forte atividade endectocida e também pelo fato de possuir lenta
taxa de eliminação do organismo animal. Porém, essa longa persistência no animal pode
ter por consequência o risco associado a presença de resíduos destes fármacos nos
produtos de origem animal. No que diz respeito ao controle de resíduos de avermectinas
em AOA, uma atenção especial começou a ser dada no início de 2010. Na ocasião foram
encontrados níveis de ivermectina acima do máximo permitido em carne enlatada e
congêneres exportadas do Brasil para os EUA e Comunidade Europeia (CE). Cabe
ressaltar que até a referida época, nenhum limite máximo de resíduo (LMR) havia sido
140
estabelecido pela legislação brasileira para o controle de resíduos de avermectinas em
carne bovina. Embora tenha ocorrido a suspensão da exportação de tais produtos, vale
ressaltar ainda que no ano de 2010, a CE registrou mais 19 ocorrências e os EUA outras
22, todas referentes a presença de resíduos de ivermectina em produtos de carne
provenientes do Brasil. Após tais incidentes, uma série de medidas foram tomadas pelo
governo brasileiro visando sanar tais problemas, como a introdução da análise das
avermectinas no Plano Nacional de Controle de Resíduos (PNCR) (Rübensam et al., 2013).
Mesmo o Brasil detendo a posição de um dos maiores exportadores mundiais de
carne bovina, há de se considerar determinadas limitações relacionadas com as
enfermidades que afetam a sua produção e pelas barreiras sanitárias exercidas pelos
maiores mercados consumidores, como os EUA e a CE. Dessa forma o Brasil, mesmo
detendo posição de destaque no comércio internacional, necessita ainda superar entraves
como a existência de políticas protecionistas, bem como se adequar às criteriosas
exigências técnicas e sanitárias dos principais países consumidores. A título de informação,
torna-se importante informar a existência de um sistema de notificação presente entre os
países integrantes da CE, o qual é denominado de RASFF (Rapid Alert System for Food
and Feed). A notificação é realizada sempre que se detecta riscos à saúde humana
relacionados com a cadeia alimentar humana e animal. É forçoso informar ainda o número
significativo de notificações RASFF sofridas pelo Brasil, tendo em vista a presença de
resíduos de ivermectina em carne bovina e seus derivados, onde desde junho de 2010 até
dezembro de 2014, das 56 notificações realizadas, 55 delas estiveram relacionadas com o
Brasil por esse tipo de contaminação. Desse número, 43 notificações foram pertinentes a
rejeições de fronteira, onde os produtos foram destruídos ou reenviados de volta ao Brasil
(Rath et al., 2016).
4.1.2 – Características gerais, modo de ação e atividades biológicas e
toxicológicas das avermectinas
As avermectinas e milbemicinas correspondem à uma família de compostos,
presentes em mistura em diferentes proporções, denominadas de lactonas macrocíclicas
(LM). Suas obtenções se dão como produtos de origem natural pela fermentação produzida
por microrganismos do gênero Streptomyces encontrados em solos. Alguns representantes
do referido gênero são as espécies S. avermetilis, S. cyanogrise e S. hygroscopicus
(Danaher et al., 2006; Giannetti et al., 2011).
141
Figura 4.1: Estruturas das principais avermectinas estudadas - adaptadas de Durden
et al., 2007 e Berendsen et al., 2007.
As LM possuem uma ampla utilização, tanto em caráter profilático como terapêutico,
na prevenção e tratamento de doenças causadas por parasitas. Sua atividade
antiparasitária se mostra altamente eficaz, mesmo quando são administradas em doses
extremamente baixas em bovinos, suínos, equinos e caprinos, combatendo infestações
tanto por endoparasitas (nematódeos intestinais, por exemplo) como por ectoparasitas
(carrapatos e piolhos, por exemplo) (Wang et al., 2009; Danaher, 2012).
O emprego das LM surgiu em 1975 com importante desempenho na parasitologia,
possuindo papel de destaque em artrópodes e nematódeos. Sua farmacocinética depende,
entre outros, da via de administração, formulação, massa corpórea e espécie alvo. O
caráter lipofílico das avermectinas e baixa solubilidade em água faz com que sejam, após
absorção, independente da via de administração, distribuídas em todo o corpo animal e
O
O
OH
CH3
OH
OO
O
CH3
CH3
OOCH3
O
CH3
O
CH3
OH
O
CH3
O
CH3
CH3
CH3
Ivermectina
O
O
OH
CH3
OH
OO
O
CH3
CH3
OOCH3
O
CH3
O
CH3
OH
O
CH3
O
CH3
Doramectina
O
O
OH
CH3
OH
OO
O
CH3
CH3
OOCH3
O
CH3
O
CH3
OH
O
CH3
O
CH3
CH3
CH3
Abamectina
O
O
OH
CH3
OH
OO
O
CH3
CH3
OOCH3
O
CH3
O
CH3
NH
O
CH3
O
CH3
CH3
CH3
CH3
O
Eprinomectina
O
OH
CH3
OH
OO
O
CH3
CH3
O
CH3
N
O
CH3
CH3 CH3
CH3
Moxidectina Benzoato de Emamectina
O
O
OH
CH3
OH
OO
O
CH3
CH3
OOCH3
O
CH3
O
CH3
NH
O
CH3
O
CH3
CH3
CH3
CH3
142
concentradas no tecido adiposo. Esse tecido, por ser pouco vascularizado, irá conferir uma
lenta liberação do fármaco, conferindo um maior tempo de permanência no organismo do
animal (Rodrigues, 2007).
Como vantagens de uso, as avermectinas possuem sobre animais vertebrados alta
potência antiparasitária e baixa toxicidade, possibilitando a morte de parasitas sem que
ocorra prejuízo ao hospedeiro. Seus efeitos tóxicos só aparecerão em doses bastante
superiores às utilizadas para fins terapêuticos, o que as tornam detentoras de uma alta
margem de segurança. A título de informação, seu emprego também se dá no combate a
ectoparasitas de vegetais, como em plantas ornamentais e cítricas, algodão e verduras. Por
possuírem baixa solubilidade em água e apresentarem forte ligação a solos, sua
biodisponibilidade a organismos não alvo e a possibilidade de que atinjam lençóis freáticos
tornam-se limitadas (Gerenutti & Spinosa, 1997).
Apesar da maioria dos trabalhos descritos na literatura se reportarem principalmente
à ivermectina, de forma aparente todas as LM apresentam o mesmo mecanismo de ação.
Suas concentrações mínimas letais mostram-se diferentes para os diversos tipos de
parasitas, podendo variar entre 2 e 200 µg kg-1, tal diferenciação dando-se por conta da
especificidade e da relação parasita/hospedeiro, levando-se em conta as propriedades
químicas relacionadas à absorção, transporte e ação direta. O mecanismo de ação contra
parasitas está relacionado com o estímulo na liberação do neurotransmissor inibidor GABA
(ácido gama-aminobutírico). A GABA trata-se de um neurotransmissor conhecido em
nematódeos e artrópodes, porém também presente no sistema nervoso central (SNC) de
mamíferos. Entretanto, a concentração de avermectinas no SNC de mamíferos, submetidos
a doses terapêuticas normais, apresentam níveis inexpressíveis. Ela irá atuar na fenda
sináptica entre interneurônios do cordão central e neurônios motores. A maior liberação de
GABA tornará difícil a neurotransmissão de estímulos para músculos periféricos, deixando
os vermes paralisados que serão posteriormente expelidos pelo organismo (Pimpão et al.,
2005; Rodrigues, 2007).
4.1.3 – Determinação de resíduos de avermectinas em AOA
143
Na extração de resíduos de avermectinas de matrizes biológicas, os analitos são
geralmente extraídos utilizando um solvente orgânico, sendo a acetonitrila o solvente mais
empregado. Os extratos obtidos podem ser submetidos a um processo de clean up
mediante partição líquido-líquido ou por meio da SPE. Vários tipos de sorventes como C8,
C18 e alumina são relatados quando se faz uso da SPE. Também se relata a possibilidade
de extração mediante o uso da dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) no preparo de
amostras (Danaher et al., 2006).
A determinação de resíduos de avermectinas em AOA poderá se dar por técnicas
imunoquímicas e/ou cromatográficas (Giannetti et al., 2011). Métodos imunoquímicos são
geralmente empregados como métodos de triagem, e embora ofereçam vantagens como
elevada detectabilidade, seletividade, e facilidade de execução na hora da análise de um
grande número de amostras de uma única vez, possuirá como desvantagens a
possibilidade de reações cruzadas, podendo gerar resultados falsos-positivo. Sabe-se,
ainda, que os mesmos são suscetíveis de interferência por conta de efeito matriz e de
condições reacionais como pH, força iônica, temperatura, entre outros. Em caso de
resultados positivos, os métodos de triagem requerem posterior confirmação de identidade
dos analitos por técnicas como a LC-MS/MS (Nunes, 2005).
As avermectinas, frequentemente reportadas na literatura, poderão ser facilmente
separadas em colunas de fase reversa C18, com comprimentos variando de 150 - 250 mm,
diâmetro interno com variações 3 - 4,6 mm e tamanho de partícula variando de 3 - 5 µm
(Danaher et al., 2006).
Não obstante, levantamento bibliográfico mais recente também revela uma
frequência de uso de colunas típicas de UHPLC, com dimensões e tamanho de partícula
inferiores a essas relatadas.
De modo geral, na cromatografia em fase reversa, a fase móvel é constituída em
90%, ou mais, de solvente orgânico, podendo o mesmo ser a acetonitrila, o metanol ou a
mistura de ambos, não se fazendo necessário o uso de agentes tamponantes na fase
móvel.
A nível de resíduos (ng g-1 ou µg kg-1) as principais determinações das avermectinas
são baseadas em métodos por HPLC com detecção por fluorescência (FLD), sendo
necessária uma etapa prévia de derivatização das avermectinas. Tal tipo de detecção tem
tido preferência em relação aos métodos que utilizem radiação UV, por ela oferecer
melhores características de desempenho analítico como detectabilidade e seletividade
(Giannetti et al., 2011; Danaher et al., 2006).
144
Métodos baseados em LC-MS/MS vêm sendo utilizados nessas mesmas
determinações, sabendo-se que os mesmos ainda não substituíram totalmente os que se
baseiam na detecção por FLD, por este último ser de menor custo, oferecer dectabilidade
adequada e ser robusto. Muitos trabalhos desenvolvidos vêm utilizando a LC-MS/MS com
propósito apenas confirmatório, sendo utilizado outro método que faz uso da FLD para fins
quantitativos. Não obstante, se observa que trabalhos vêm sendo desenvolvidos utilizando
a LC-MS/MS para propósitos tanto de confirmação quanto de quantificação. Embora
recentemente essa tendência tenha sido evidenciada, observa-se que métodos utilizando
a detecção por FLD têm apresentado melhores características de desempenho no que diz
respeito a obtenção de valores mais satisfatórios de exatidão, precisão e menor efeito
matriz, bem como na obtenção de menores limites de detecção (LOD) e de quantificação
(LOQ) (Giannetti et al., 2011; Berendsen et al., 2007; Danaher et al., 2006).
4.1.3.1 – A derivatização das avermectinas para análise por HPLC-FLD
As avermectinas não apresentam grupos fluorófos e, portanto, necessitam ser
derivatizadas para que possam ser determinadas por HPLC-FLD. O processo de
derivatização das avermectinas é realizado com reagentes específicos a fim de se produzir
derivados fluorescentes. Baseando-se nesse princípio, vários procedimentos de
derivatização foram propostos nos últimos 25 anos, sendo que as principais preocupações
no desenvolvimento desses procedimentos dizem respeito a utilização de reagentes de
maior reatividade e na diminuição do tempo de reação e da temperatura de derivatização.
Contudo, também se observa uma preocupação na produção de derivados fluorescentes
de maior estabilidade (Danaher et al., 2006). No referido trabalho, que se trata de um artigo
de revisão bibliográfica, os autores apresentam uma discussão de como se deu o
aprimoramento desse tipo de reação, mencionando vários trabalhos e suas respectivas
propostas reacionais.
As avermectinas contém um anel tetraidro-benzofurânico-diidroxilado que sob
condições de derivatização, utilizando anidrido trifluoracético (ATFA) e 1-metil-imidazol
(MI), pode ser convertido em um grupo cromóforo fluorescente. Primeiramente, ocorre a
formação de um reagente de acilação in situ pela reação do ATFA com MI, e em seguida
ocorre a reação com os grupos hidroxílicos das avermectinas. Na presença de uma forte
base nucleofílica (1-metil-imidazol ou trietilamina), ocorrerá uma dupla desacetilação do
anel benzofurânico, resultando assim na formação de um derivado aromático de forte
145
caráter fluorescente. Na Figura 4.2 é apresentado o mecanismo de reação da derivatização
das avermectinas com a utilização de ATFA e MI. Esse mecanismo foi proposto por
Berendsen e colaboradores (Berendsen et al., 2007).
Figura 4.2 – Mecanismo da reação de derivatização das avermectinas utilizando
ATFA e MI - Adaptado de Berendsen et al., 2007.
Na Tabela 4.1 (pg 146) são apresentados métodos reportados na literatura para a
determinação de resíduos de avermectinas e milbemicina em alimentos de origem animal.
F3C O CF3
O O
+
N
N
CH3
N
N+
CH3
CF3
O
+F3C
O
O-
( ATFA ) ( MI ) ( MIAc ) ( TFA )
Etapa 1 - Formação do Reagente Acilante
Etapa 2 - Formação do derivado aromático fluorescente pela dupla desacetilação do anel benzo-furânico
O
COOR
OH
R
H
OH
CH3
2 MIAc
2 MIH+
O
COOR
O
R
H
O
CH3
O
CF3
F3CO
2 MI
2 MIH+ + 2 TFA
O
COORR
CH3
146
Tabela 4.1: MÉTODOS REPRESENTATIVOS NA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE AVERMECTINAS E MILBEMICINA EM
AOA
Abreviações: abamectina (ABA); doramectina (DORA); emamectina (EMA); eprinomectina (EPRI); ivermectina (IVER); moxidectina (MOXI); selamectina (SELA); ácido acético (AA); anidrido trifluoracético (ATFA); 1-metil-imidazol (MI).
Métodos utilizando a detecção por Fluorescência, baseados em reação de derivatização
Matriz & Analitos
(nº de compostos)
Preparo de Amostra & Reação de Derivatização
1 – Condições de Extração 2 – Etapa de clean up 3 – Etapa de derivatização 4 – Recuperação (%)
Etapa Cromatográfica 1 – Coluna 2 – Fase móvel:
FA - fase aquosa FO - fase orgânica
3 – Vazão 4 – Temperatura 5 – Modo de eluição 6 – Volume de injeção 7 – Tempo de corrida
Determinação
HPLC-FLD
λexcitação (nm) λemissão (nm)
Em caso da LC-MSn:
1 – Fonte de ionização 2 – Analisador 3 – Modo de monitoramento
LOD e LOQ ou
CCα e CCβ (μg kg-1)
Ref.
FÍGADO BOVINO, OVINO
E SUÍNO (4 analitos)
ABA, DORA, MOXI e IVER
1 – A 2,5 g de amostra homogeneizada são adicionados 15 mL de H2O/acetona (1:1, v/v), sendo a mistura agitada por 30 s. A amostra é extraída com 15 mL de isooctano, agitada (30 s) e centrifugada (10 min, 2000 rpm). Após separação do sobrenadante a amostra é extraída mais 2 vezes. 2 – Os sobrenadantes combinados (3 x 15 mL) são submetidos a SPE utilizando alumina como sorbente. 3 – O eluato, evaporado até a secura, sob fluxo de N2 (g) a 60 ºC, foi dissolvido em 200 µL MI/ACN (1:1, v/v) e agitado em vórtex (2 min). São adicionados 300 µL ATFA/ACN (1:2, v/v), sendo agitado em vórtex (1 min). A amostra derivatizada foi filtrada e analisada. 4 – 83% - 96%
1 – Novapak C18 (150 mm × 3,9 mm, n.i.) 2 – FA: H2O/H3PO4 (1%, v/v)
FO: MeOH/ACN 3 – 1 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Isocrático (61/30/9, v/v/v) 6 – 100 µL 7 – 30 min
HPLC-FLD
λexcitação: 365 nm λemissão: 470 nm
LOQ: 2
Dan
ah
er
et
al.,
20
00
.
147
Tabela 4.1: continuação
FÍGADO e MÚSCULO
BOVINO (4 analitos)
ABA, DORA, EPRI e IVER
1 – 2,5 g de amostra + 8 mL de ACN (30 s de agitação e 3 min de centrifugação - 1500 rpm), repetindo-se a mesma etapa de extração mais uma vez. 2 – Os sobrenadantes combinados, misturados com 25 mL de H2O e 40 µL de trietilamina, foram submetidos a SPE (cartucho C18). 3 – O eluato, evaporado até a secura, sob fluxo de N2 (g) a 50 ºC, foi dissolvido em 100 µL MI/ACN (1:1, v/v) + 150 µL ATFA/ACN (1:2, v/v) + 50 µL de AA. A mistura, em tubo fechado, foi aquecida a 65 ºC por 30 min. A amostra derivatizada foi diluída a 2,5 mL com H2O, filtrada e analisada. 5 – Fígado: 70,3% – 87,1%
Músculo: 79,6% – 93,7%
1 – Inertsil ODS (250 mm × 4,6 mm; 5 µm) 2 – FA: H2O
FO: ACN/THF 3 – 1 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Isocrático: ACN/H2O/THF (88:4:8; v/v/v) 6 – 20 µL 7 – 20 min
HPLC-FLD
λexcitação: 365 nm λemissão: 465 nm
FÍGADO: LOD: 0,5 – 1,0 LOQ: 1 - 2
Hou
et
al., 2
00
7.
FÍGADO BOVINO (3 analitos)
ABA, DORA,
IVER
1 – 2 g de amostra + 6 mL ACN; extração com agitação mecânica (3 min) e centrifugação (5 min) 2 – SPE: cartucho com Alumina; 3 – O eluato, evaporado até a secura, foi reconstituído com 100 µL MI/ACN (1:1, v/v) + 150 µL ATFA/ACN (1:2, v/v). Foram adicioados em seguida 750 µL de MeOH a todas as amostras. 4 – 70 % – 93 %
1 – Novapak C18 (150 mm × 3,9 mm) 2 – não informado 3 – 1 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – não informado 6 – 50 µL 7 – 20 min
HPLC-FLD
λexcitação: 365 nm λemissão: 475 nm
LOQ: 1
Wa
ng
et
al.,
20
09
.
LEITE (6 analitos)
ABA, DORA, EMA, EPRI, IVER, MOXI
1 – 5 g de amostra + 20 mL ACN; extração com agitação manual auxiliada por ultrassom; 2 – SPE: cartucho C8; 3 – O eluato, evaporado até a secura, foi reconstituído com 100 µL MI/ACN (1:1, v/v) + 150 µL ATFA/ACN (1:2, v/v). Foram adicionados em seguida 630 µL de ACN + 120 µL de AA, a mistura sendo agitada por 1 min. em vórtex e em seguida aquecida a 65 ºC por 50 min. 4 – 78 % – 98 %
1 – Supelcosil LC-8-DB (150 mm × 4,6 mm; 3 µm) 2 – FA: H2O
FO: ACN/MeOH 3 – 1 mL min-1
4 – 27 ºC 5 – Gradiente (mistura ternária) 6 – 20 µL 7 – 27 min
HPLC-FLD
λexcitação: 364 nm λemissão: 470 nm
CCα: 24,8 – 50,6 CCβ: 27,8 – 55,2 (substâncias com LMR)
CCα: 0,1 – 0,2 (substâncias não autorizadas)
Cerk
ven
ik-F
lajs
et
al.,
201
0.
148
Tabela 4.1: continuação
Leite, músculo e ovos
(6 analitos)
IVER, ABA, EMA, EPRI, DORA e
MOXI
1 – 2,5 g de amostra foram extraídos com 5 mL de ACN, sonicada por 10 min, agitada por outros 10 min e centrifugada (3500 rpm; 10 min). O processo foi repetido usando 4 mL de ACN e os sobrenadantes combinados até um volume final de 10 mL. 2 – 2 mL do extrato foram submetidos a ELL com 2 mL de hexano. 3 – Foram tomados 200 µL do extrato em um vial e
evaporado. O extrato seco foi derivatizado com 200 µL MI/ACN (1:1, v/v) + 300 µL ATFA/ACN (1:2, v/v) + 100 µL de AA. A mistura foi aquecida a 70 ºC por 30 min e injetada posteriormente. 5 – Leite: 65,4% – 90%
Músculo: 64,3% – 82,9% Ovos: 63,4% – 84,4%
1 – Hypersil C18 (250 mm × 4 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O
FO: ACN/MeOH 3 – 1 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Isocrático: H2O/ACN/MeOH (5:35:60, v/v/v) 6 – n.i 7 – 18 min
HPLC-FLD
λexcitação: 365 nm λemissão: 470 nm
CCα: 3 – 119 CCβ: 4 – 138
Gia
nn
etti e
t a
l.,
201
1.
Fígado bovino (6 avermectinas) IVER, ABA, EMA,
EPRI, DORA e MOXI
+ 32 analitos
Procedimento QuEChERS Quantidade de amostra: 10 g Solvente de extração: 10 mL de ACN Sais adicionados (efeito salting out):
5 g de MgSO4:NaCl (4:1, m/m); Etapa dispersiva (tipo de sorbente + sais):
MgSO4 (150 mg) e C18 (50 mg) Recuperação: 94% - 119%
1 – Acquity HSS T3 C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm) 2 – FA: CH3COOH (0,01%)/ACN (90:10, v/v)
FO: HCOONH4 (5 mmol L-1) em MeOH/ACN (75:25, v/v) 3 – não informado
4 – 60 ºC 5 – Gradiente 6 – 5 µL 7 – 13 min
LC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – SRM
CCα: 27 – 47 CCβ: 1503 – 1765
Kin
sella
et
al.,
20
10.
Músculo bovino
(6 analitos)
IVER, ABA, EMA, EPRI, DORA e
MOXI
1 - 5 g de amostra são extraídas (2x) com 2,5 mL + (1x) com 5 mL de ACN, auxiliadas por agitação em vórtex (10 s) e em mesa agitadora (20 min). Após a adição de 2 g de NaCl a amostra é centrifugada.
Partição à baixa temperatura (LTP)
2 - A fase superior é transferida e armazenada em temperatura a – 20 ºC por 12 h. Após esse período, o extrato líquido é transferido, evaporado até a secura e reconstituído em 1 mL de ACN para análise. 3 – 500 µL do extrato + 290 µL de ACN foram derivatizados com MI (80 µL) + ATFA (80 µL) + AA
(50 µL) a 64 ºC (20 min) 4 – 90% - 101%
Para o método HPLC-FLD: 1 – Luna C18 (50 mm × 2,1 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O
FO: ACN 3 – 0,4 mL min-1
4 – não informado 5 – gradiente 6 – 5 µL 7 – 30 min
HPLC-FLD
(análise quantitativa)
λexcitação: 365 nm λemissão: 470 nm
LC-MS/MS (análise confirmatória)
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 0,1 – 1,1 LOQ: 0,4 – 3,4 CCβ: 11,1 – 23,9
Rüb
en
sa
m e
t al.,
20
13
149
Manteiga (4 analitos)
IVER, ABA,
DORA e MOXI
1 – 0,5 g de amostra foi aquecida (50 ºC) e extraída com 10 mL ACN/AcOEt/H2O (90:4:6, v/v/v; 50 ºC). A mistura foi agitada em vórtex (30 s), aquecida em banho de água (50 ºC, 2 min) e sonicada (10 min). Após resfriamento, a mesma foi centrifugada (6000 rpm, 10 min) e a fase superior removida e filtrada (0,45 µm), sendo essa evaporada. 2 – não ocorreu 3 – O extrato seco foi derivatizado com 100 µL MI/ACN (1:1, v/v) + 50 µL trietilamina + 150 µL ATFA/ACN (1:2, v/v) + 50 µL de anidrido acético. A mistura foi aquecida (70 ºC, 30 min), esfriada e injetada posteriormente. 4 – 72,4 % – 106,5 %
1 – Sunfire C8 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O
FO: ACN 3 – 1,2 mL min-1
4 – 31 ºC 5 – gradiente 6 – 20 µL 7 – 12,5 min
HPLC-FLD
λexcitação: 365 nm λemissão: 470 nm
CCα: 0,13 – 0,22 CCβ: 0,17 – 0,28 LOD: 0,03 – 0,05 LOQ: 0,09 – 0,16
Ma
ce
do
et
al.,
20
15
.
Carne suína, bovina e outras
(6 analitos)
IVER, ABA, EMA, EPRI, DORA e MOXI
Procedimento QuEChERS
Quantidade de amostra: 3 g Solvente de extração:
10 mL de ACN/NH3 (0,5%, v/v) Sais adicionados (efeito salting out):
2,5 g de MgSO4:NaCl (4:1, m/m); Etapa dispersiva (tipo de sorbente + sais):
C18 (150 mg) e MgSO4 (900 mg) Recuperação: 89% - 115%
Para o método LC-MS/MS
1 – Luna C18 (50 mm x 2.1 mm, 2.6 µm) 2 – FA: trietilamina (10 mmol L-1)
FO: ACN 3 – 0,35 mL min-1
4 – 40 ºC 5 – gradiente 6 – 25 µL 7 – 10 min
LC-MS/MS
1 – ESI (-) 2 – QqQ 3 – MRM
LC-HRMS
(estudo comparativo) 1 – ESI 2 – Q-Orbitrap 3 – t-SIM-dd (MS/MS)
CCα: 0,7 – 47 CCβ: 0,8 – 53 LOQ: 2,5
Rúb
ies
et
al.,2
015
.
Fígado, músculo e leite
(4 avermectinas)
IVER, ABA, SELA e MOXI
+
82 analitos de diversas classes
de contaminantes
Procedimento QuEChERS
Quantidade de amostra: 1 g de fígado; 5 g de músculo; 10 mL de leite. Solvente de extração:
15 mL de ACN/HCOOH (0,1%, v/v) Sais adicionados (efeito salting out):
6 g de MgSO4 + 1,5 g de acetato de sódio Etapa dispersiva (tipo de sorbente + sais):
MgSO4 anidro (900 mg) + 300 mg PSA + 150 mg C18
Recuperação: método exploratório, o mesmo não foi validado; recuperação não informada.
1 – Hypersil Gold AQ (50 mm x 2.1 mm, 1.9 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1 %, v/v)
FO: ACN/HCOOH (0,1 %, v/v) 3 – 0,38 mL min-1
4 – 35 ºC 5 – gradiente 6 – 20 µL 7 – 12 min
LC-HRMS
1 – ESI (+) 2 – Orbitrap 3 – full scan (intervalo m/z:100-1500)
LOD: 1 – 100
Fili
ge
nzi e
t a
l.,
201
1.
150
Tabela 4.1: continuação
Fígado, músculo e gordura bovina
IVER, ABA, EMA, EPRI, DORA e MOXI
1 – Adiciona-se a 5 g de amostra 30 mL de acetona/NH3 aquosa (0,5%) (1:1, v/v) + 5 g NaCl. Essa mistura é extraída com 60 mL de isooctano (2x), agitada em vórtex (5 min.) e centrifugada (2500 rpm, 5 min) A fase orgânica é recolhida e evaporada até a secura. 2 – Ao resíduo obtido são adicionados 20 mL de hexano + 20 mL de ACN, sendo a mistura colocada em funil de separação e a fase inferior (ACN) recolhida, evaporada, reconstituída e analisada. 3 – não ocorreu derivatização 4 – 87,9 % - 99,8 %
1 – TSK-GEL ODS 100V (50 mm x 2.0 mm, 3 µm) 2 – FA: HCOOH (0,1 %, v/v) e HCOONH4 (0,1 mmol L-1) em H2O.
FO: ACN/HCOOH (0,1 %, v/v) 3 – 0,2 mL min-1
4 – não informada 5 – gradiente 6 – 10 µL 7 – 30 min
LC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 0,05 – 2 LOQ: 1 – 10
Ino
ue
e
t a
l., 2
00
9.
Carne bovina
6 avermectinas
IVER, ABA, EMA, EPRI, DORA e
MOXI +
31 analitos
Procedimento QuEChERS
Quantidade de amostra: 10 g Solvente de extração: 12 mL de ACN Sais adicionados (efeito salting out):
5 g de MgSO4 anidro:NaCl (4:1, m/m); Etapa dispersiva (tipo de sorbente + sais):
MgSO4 (1,5 g) + C18 (0,5 mg) Recuperação: 94% - 127%
1 – Acquity HSS T3 C18 (100 mm x 2.1 mm, 1.8 µm) 2 – FA: CH3COOH (0,01 %, v/v) em ACN/H2O (10:90, v/v)
FO: HCOONH4 (5mmol L-1) em MeOH/ACN (75:25, v/v) 3 – 0,6 mL min-1
4 – 60 ºC 5 – gradiente 6 – 4 µL 7 – 11 min
LC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
CCα: 0,7 – 2,6 CCβ: 1,2 – 4,3
Coo
pe
r et
al.,
201
2.
Figado suíno Carne bovina e
peixe
6 avermectinas
ABA, IVER, DORA, EMA. EPRI e MOXI
1 – 2,5 g de amostra homogeneizada são extraídas com 8 mL ACN, sendo agitada e centrifugada. Ao sobrenadante são adicionados 25 mL de H2O e 40 µL de trietilamina. 2 – SPE: cartuchos C18 3 – não ocorreu derivatização 4 – 90% - 103%
1 – Symmetry C18 (150 mm x 2.1 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O/trietilamina (0,05 %, v/v)
FO: ACN/trietilamina (0,05 %, v/v) 3 – 0,3 mL min-1
4 – 10 ºC 5 – gradiente 6 – 30 µL 7 – 35 min
LC-MS/MS
1 – APCI (-) 2 – IT 3 – MS2
CCα: 71 –122 CCβ: 10 – 144
Nop
pe
et
al.,
200
9.
151
4.1.4 – A extração líquido pressurizado (PLE) no preparo de amostras
4.1.4.1 - Considerações iniciais
O preparo de amostra é tido como uma etapa de suma importância no
desenvolvimento de um método analítico, principalmente em se tratando de amostras
sólidas e de matrizes complexas. Técnicas clássicas de preparo de amostra como a
extração com solvente, extração do tipo Soxhlet e outras, têm sido utilizadas. Contudo,
essas técnicas possuem desvantagens de serem demoradas, fornecerem baixa eficiência
de extração, além de consumirem quantidades apreciáveis de solventes orgânicos.
Faceando tais dificuldades, um esforço tem ocorrido no que diz respeito ao
desenvolvimento técnico e simplificação de novas abordagens na etapa de extração. Como
exemplos, podem ser citadas técnicas como a extração com fluído supercrítico (SFE),
extração assistida por micro-ondas (MAE) e a extração líquido pressurizado (PLE) (Teo et
al., 2010).
A PLE é uma técnica de preparo de amostra que utiliza um solvente líquido atuando
a elevadas condições de pressão e temperatura, sendo que quando comparada com as
técnicas de extração que atuam próximas à temperatura ambiente e pressão atmosférica,
apresenta ganhos relacionados ao desempenho. A utilização de um solvente à elevada
temperatura irá conferir uma diminuição em sua viscosidade, ocasionando aumento na
eficiência de interação do mesmo com ligações estabelecidas entre o analito e os sítios da
matriz, e que irá implicar diretamente nas propriedades de transferência de massa, que por
sua vez facilitará a solubilização dos analitos a serem extraídos. Essa mesma técnica
também é conhecida com outras denominações, como extração acelerada com solvente
(ASE), extração com solvente pressurizado (PSE) e extração com solvente subcrítico
(SSE), e, ainda, caso a água seja utilizada como solvente de extração, a mesma poderá
também ser denominada de extração pressurizada com água quente (PHWE) (Martínez et
al., 2005; Mustafa & Turner 2011; Sun et al., 2012).
Assim, a PLE tem se consagrado como uma técnica de preparo de amostra para a
extração de diversificadas classes de compostos nos mais variados tipos de matrizes,
sendo que essa técnica tem encontrado forte aplicação no campo da análise ambiental.
Nesse contexto, métodos analíticos têm sido desenvolvidos para a determinação, por
exemplo, de poluentes orgânicos persistentes (POP), dioxinas, hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (HPA), bifenilas policloradas (PCB), entre outros (Runnqvist et al., 2010).
152
4.1.4.2 - Fatores a serem considerados no desempenho de um método
PLE
a) Estratégias de desenvolvimento e a escolha do solvente de extração
Existem vários fatores que influenciam diretamente as características de
desempenho durante o desenvolvimento de um método PLE. Sua otimização inicia-se com
a escolha adequada do solvente de extração. Geralmente utiliza-se o mesmo tipo de
solvente indicado em extrações convencionais. Assim, a regra “semelhante dissolve
semelhante” continua tendo validade, deixando o indicativo de que solventes polares devem
ser utilizados para a extração de analitos polares e a recíproca também sendo verdadeira,
analitos apolares sendo dissolvidos em solventes apolares. Uma situação favorável que
deve ser encontrada é a de que o solvente de extração, além de extrair de forma satisfatória
os compostos de interesse, deve extrair a menor quantidade possível de coextrativos que
sejam provenientes da matriz. Também é importante ter em mente ao se realizar a escolha
do solvente de extração, o compromisso do mesmo com posteriores etapas de tratamento,
como por exemplo, a necessidade ou não de uma etapa de clean up do extrato obtido, se
tal extrato apresentará fatores que dificultarão o processo de pré-concentração dos analitos,
bem como se a técnica analítica escolhida poderá ser empregada (Martínez et al., 2005;
Mustafa & Turner, 2011).
Diante do exposto e baseando-se em trabalhos e métodos já desenvolvidos, existem
três contextos que podem ajudar no processo de racionalização durante o desenvolvimento
de uma metodologia PLE, são elas:
i) Extração exaustiva – durante o desenvolvimento de um método PLE, uma das
primeiras ideias a ser cogitada é a da utilização de condições tão drásticas quanto possível
para o processo de extração, principalmente no que diz respeito à aplicação de elevadas
temperaturas, com a intenção de se promover a quebra entre as interações dos analitos
com sítios de ligação da matriz. Porém, um fator que não deve ser negligenciado é o fato
dos analitos serem passíveis de degradação térmica. Valendo ainda lembrar que a
utilização de elevadas temperaturas pode favorecer a extração indesejada de componentes
da matriz, podendo chegar a exigir uma etapa de clean up que poderia ser evitada, podendo
também vir a comprometer a etapa de detecção analítica (Runnqvist et al., 2010).
153
ii) Extração seletiva – uma outra abordagem que pode ser testada é a de se
promover uma extração seletiva, ou seja, ajustar as condições de extração de forma que
se obtenha uma melhor extração dos analitos em detrimento dos interferentes da matriz.
Porém, para que isso ocorra, deve haver uma forte diferenciação nas propriedades físico-
químicas dos analitos e dos demais compostos que não se deseja extrair. Medidas
cautelares devem ser tomadas para que se tenha a garantia de que boa parte dos analitos
foi satisfatoriamente removida para o extrato e que os mesmos não ficaram retidos na forma
de compostos não extraídos (Runnqvist et al., 2010).
iii) Clean up in situ - outra estratégia que pode ser avaliada é a da realização de
uma etapa de clean up dentro da própria cela de extração do PLE, sendo que poderá ser
evitado também a extração de compostos indesejados (Runnqvist et al., 2010).
b) Tratamento prévio da amostra
A amostra sempre sofre algum tratamento prévio antes de ser colocada na célula de
extração, sendo que uma trituração e homogeneização da mesma geralmente confere um
melhor ganho no processo de transferência dos analitos presentes na amostra para o
solvente de extração, uma vez que se possui um considerável aumento na eficiência de
extração à medida que se reduz o tamanho de partícula. A utilização de agentes secantes,
como sulfato de sódio anidro ou terra diatomácea, geralmente se torna importante,
principalmente quando se deseja fazer uso de solventes apolares, o que garantirá melhor
eficiência de extração. Em se tratando da utilização de solventes mais polares (metanol,
acetonitrila, acetato de etila) ou misturas envolvendo os mesmos, a extração da amostra
umidificada não se torna tão crítica, sendo possível a não utilização de agentes secantes.
Contudo, é possível que alguma quantidade de água seja encontrada de forma
remanescente, o que, provavelmente, poderá comprometer posteriores etapas como a de
clean up, concentração do extrato da amostra ou mesmo da análise direta. Para se evitar
tal caso de comprometimento, alguns autores sugerem a adição direta de sulfato de sódio
anidro no frasco de coleta do extrato. A diminuição do tamanho de partícula da matriz
também pode ser promovida pela dispersão da mesma em algum tipo de material inerte,
sendo, frequentemente, utilizados agentes dispersantes como terra diatomácea, areia ou
alumina. A utilização de agentes dispersantes também se torna de relevante utilidade para
se evitar maior consumo de solventes de extração, uma vez que eles promoverão a redução
do volume morto dentro da célula de extração (Martínez et al., 2005; Runnqvist et al., 2010).
154
c) Aspectos e parâmetros da técnica PLE
i) Temperatura
Em um método PLE, o fator temperatura é uma das variáveis mais críticas que
afetará diretamente a eficiência de extração. O uso de elevadas temperaturas, além de
proporcionar um aumento na eficiência de extração, vem promover uma melhoria nas
quebras entre interações analito-matriz promovidas por forças do tipo van der Waals,
ligações de hidrogênio e atrações dipolo-dipolo. Um aumento de temperatura promove uma
diminuição da viscosidade do solvente, implicando num maior poder de penetração na
matriz, resultando, de modo geral, numa melhora no processo de extração. Outra vantagem
em se utilizar elevadas temperaturas diz respeito ao aumento da taxa de difusão e de
transferência de massa das moléculas para o solvente, que implicará diretamente na
melhoria da velocidade de extração. No entanto, um compromisso deve existir em não se
utilizar temperaturas em limites bastante superiores que venham a promover um aumento
na extração de substâncias coextrativas vindo a comprometer a seletividade do método ou
mesmo promover a degradação do analito (Runnqvist et al., 2010; Mustafa & Turner, 2011).
ii) Pressão
Durante o procedimento de extração por PLE, o principal motivo da utilização de
pressões elevadas é justamente fazer com que os solventes orgânicos sejam mantidos em
seus estados líquidos quando os mesmos se encontram em temperaturas acima de seus
respectivos pontos de ebulição. A utilização de pressão elevada também faz com que o
solvente difunda através do sistema de extração, fazendo com que o mesmo entre em
contato de uma forma mais efetiva com sítios da matriz, proporcionando um melhor contato
com analitos a serem extraídos. Outra vantagem da utilização de elevada pressão é que
esta também ajuda a evitar problemas relacionados com a presença de bolhas que por
ventura venham a ser encontradas no interior da matriz, podendo vir a impedir o contato
direto do solvente com os analitos. No entanto, o que se observa é que o efeito exercido
pela pressão no aumento da eficiência de extração dos analitos normalmente é tido como
negligenciável. Pelo fato de tal parâmetro não demonstrar ser um fator crítico, pesquisas
vêm sendo realizadas nas quais a otimização do parâmetro pressão não mais se mostra
necessária e são empregadas pressões predefinidas já estabelecidas nos equipamentos
(Runnqvist et al., 2010; Mustafa & Turner, 2011).
155
iii) Tempo e Ciclos
Um método de extração utilizando PLE pode ser executado em dois diferentes
modos, podendo ser classificados como estático e dinâmico. No modo de extração estático,
o solvente, juntamente com a amostra, é mantido em uma determinada temperatura por um
certo período de tempo, sendo que a eficiência de extração será bastante influenciada pelo
equilíbrio de partição e pela solubilidade dos analitos em elevadas temperaturas, existindo
a possibilidade de se obter uma incompleta extração caso a amostra encontre-se altamente
concentrada ou mesmo se os analitos possuírem baixas solubilidades. Nesse referido
modo, um ou mais ciclos de extração podem ser realizados, de forma que a cada novo
ciclo, todo o solvente de extração é trocado por um novo volume. A duração do tempo de
extração estática é um fator importante no processo, uma vez que uma maior duração da
exposição do solvente facilitará um melhor contato com a amostra levando a uma melhora
no intumescimento da mesma, facilitando, assim, a penetração do solvente em seus poros
e cavidades. No modo de extração dinâmico, o solvente é bombeado de forma contínua
para dentro da célula de extração, sendo que à medida que um novo volume de solvente
passa a ser injetado, o equilíbrio de partição entre a amostra e o solvente de extração se
desloca de forma que haja a manutenção do restabelecimento do mesmo, geralmente,
levando a uma melhora na eficiência de extração. Dessa forma, um maior volume de
extração passa a ser obtido no modo dinâmico se comparado ao modo estático. Não
obstante, diversos estudos têm demonstrado que a combinação de ambos os modos de
extração podem resultar na melhoria da eficiência de extração. No entanto, não se deve
esquecer que uma condição otimizada deve possuir o compromisso entre o tempo de
extração estática, o número de ciclos a serem empregados e o tempo de execução total da
extração. Trabalhos reportados na literatura têm evidenciado que os métodos PLE,
normalmente, utilizam tempos de extração variando de 5 a 10 min, sendo que os mesmos,
geralmente, envolvem 2 ou 3 ciclos de extrações (Teo et al., 2010; Runnqvist et al., 2010;
Martínez et al., 2005; Mustafa & Turner, 2011).
156
4.1.4.3 - Métodos utilizando PLE na determinação de resíduos de
fármacos veterinários em alimentos
O emprego da técnica PLE tem sido amplamente utilizada na análise de diversos
tipos de contaminantes, sejam eles provenientes de matrizes alimentícias ou ambientais.
Em se tratando da polaridade dos compostos a serem analisados, os mesmos poderão
possuir desde alta polaridade, como antimicrobianos, até mesmo baixa polaridade, como
pesticidas, hidrocarbonetos poliaromáticos, entre outros. Na determinação de fármacos
veterinários em alimentos, a referida técnica vem ganhando crescente espaço de aplicação,
uma vez que ela agrega características como a de possuir adequado desempenho, ser uma
técnica automatizada e possibilitar a redução de consumo de solventes (Marazuela &
Bogialli, 2009; Roig & Picó, 2015).
A Tabela 4.2 (pg 157) mostra um panorama geral de aplicação da PLE na
determinação de RFV em alimentos de origem animal, fornecendo algumas características
importantes dos métodos analíticos desenvolvidos, sendo dada ênfase nas condições e
parâmetros de extração utilizados nos procedimentos utilizando a PLE.
157
Tabela 4.2 – APLICAÇÃO DE MÉTODOS PLE NA DETERMINAÇÃO DE RFV-AOA
Abreviações: aminoglicosídeos (AG); anfenicóis (AN); avermectinas (AV); benzimidazol (BI); β-agonista (βA); β-lactâmicos (βL); etoxiquina (etox); lincosamidas (L); macrolídeos (M); mebendazol (meb); nitrofuranos (NF); nitroimidazóis (NI); penicilinas (P); quinolonas (Q); sulfonamidas (S); tetraciclinas (T); trimetoprima (tri); verde malaquita (vm); verde leucomalaquita (vlm)
Matriz & Analitos
(nº de compostos)
Preparo de Amostra por PLE 1 – Quantidade de amostra (g) 2 – Sorvente (g) 3 – Solvente de extração 4 – Volume da cela de extração (mL) 5 – Pressão (psi) 6 – Temperatura (ºC) 7 – Tempo do ciclo de extração (min) 8 – nº de ciclos 9 – Clean up 10 – Recuperação
Etapa Cromatográfica 1 – Coluna 2 – Fase móvel:
FA - fase aquosa FO - fase orgânica
3 – Vazão 4 – Temperatura 5 – Modo de eluição 6 – Volume de injeção 7 – Tempo de corrida
Determinação
Em caso da LC-MSn: 1 – Fonte de ionização 2 – Analisador 3 – Modo de monitoramento
LOD e LOQ ou
CCα e CCβ (μg kg-1)
Ref.
Carne,
fígado e rim
(frango, porco e gado)
Sulfonamidas (18 analitos)
1 – 5 g 2 – Não utilizou sorvente 3 – ACN 4 – Cela de 11 mL 5 – 1400 psi 6 – 70 ºC 7 – 2 min 8 – 1 ciclo 9 – SPE – cartucho HLB 10 – 71% – 118%
Para o método confirmatório:
1 – Hypersil Golden (150 mm × 2,1 mm, 3,5 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1%; v/v)
FO: ACN 3 – 0,2 mL min-1
4 – Não informado 5 – Gradiente 6 – 10 µL 7 – 23 min
HPLC-DAD
LC-MS/MS (método confirmatório)
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 5-10 LOQ: 10 CCα: 102 – 107 CCβ: 107 – 113
Yu
et
al.,
201
1a
.
Carne e fígado
(frango, porco e gado)
Tetraciclinas (7 analitos)
1 – 25 g 2 – Areia (5 g) lavada com EDTA 3 – Ác. tricloroacético (1mmol L-1) em ACN (pH 4) 4 – Cela de 22 mL 5 – 65 bar 6 – 60 ºC 7 – 5 min 8 – 2 ciclos 9 – Não utilizou 10 – 75% – 105%
1 – ZORBAX SB-C18 (150 mm x 4.6 mm , 5 µm) 2 – FA: ác. oxálico 0,01 mol L-1 (pH 3)
FO: ACN e MeOH 3 – 1 mL min-1
4 – 35 ºC 5 – Gradiente 6 – 50 µL 7 – 18 min
HPLC-DAD
LOD: 3 LOQ: > 15 CCα: 4.6 – 306,4 CCβ: 6,1 – 314,9
Yu
et
al.,
201
1b
.
158
Tabela 4.2: continuação
Alimentação infantil
Quinolonas (6 analitos)
1 – 1 g 2 – Terra diatomácea (1 g) 3 – Ác. o-fosfórico (50 mmol L-1, pH 3)/ACN (20:80 v/v) 4 – Cela de 5 mL 5 – 2000 psi 6 – 80 ºC 7 – 5 min 8 – 3 ciclos 9 – LTP (partição à baixa temperatura) 10 – 69% – 107%
Para o método confirmatório: 1 – Acquity UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,2%; v/v)
FO: ACN/HCOOH (0,1%; v/v) 3 – 0,3 mL min-1
4 – 40 ºC 5 – Gradiente 6 – Não informado 7 – 12 min
HPLC-FLD
(método quantitativo)
LC-MS/MS (método confirmatório)
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOQ: 12-22 CCα: 10-19 CCβ: 17-32
Rod
rig
ue
z e
t al.,
20
10
.
Carne bovina e suína
Multiclasse
βL, L, M, Q, S, T, NI e tri
(31 analitos)
1 – 1 g 2 – Areia (11 g) tratada com EDTA 3 – H2O 4 – Cela de 22 mL 5 – 1500 psi 6 – 70 ºC 7 – 10 min 8 – 1 ciclo 9 – Não utilizou 10 – 75% – 99%
1 – XTerra MS C18 (100 mm × 2,1 mm, 3,5 µm) 2 – FA: HCOOH em H2O (10 m mol L-1)
FO: HCOOH em MeOH (10 m mol L-1) 3 – 0,2 mL min-1
4 – Não informado 5 – Gradiente 6 – 50 µL 7 – 31 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 3 – 15 LOQ: 0,6 – 1 CCα: 12 – 308 CCβ: 14 – 327 C
arr
ete
ro e
t al.,
20
08
.
Músculos bovino, suíno e de frango
Tetraciclinas (4 analitos)
1 – 1 g 2 – Areia tratada com EDTA (11 g) 3 – H2O 4 – Cela de 22 mL 5 – 1500 psi 6 – 70 ºC 7 – 10 min 8 – 1 ciclo 9 – SPE: cartuchos HLB (Oasis) 10 – 89% – 99%
1 – XTerra C18 (100 mm × 2,1 mm, 3.5 µm) 2 – FA: HCOOH em H2O (10 m mol L-1)
FO: HCOOH em MeOH (10 m mol L-1) 3 – 0,2 mL min-1
4 – Não informado 5 – Gradiente 6 – 20 µL 7 – 18 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 0,1 – 0,3 LOQ: 10 – 50 CCα: 104 – 118 CCβ: 112 – 124
Bla
sco
et a
l.,
200
9.
Fígado e músculo bovino
Avermectinas
(5 analitos)
1 – 2,5 g 2 – Terra diatomácea (2 g) 3 – H2O/ACN (60:40, v/v) 4 – Cela de 11 mL 5 – 1500 psi 6 – 100 ºC 7 – 3 min 8 – 2 ciclos 9 – SPE: cartuchos C18 10 – 84,8% – 101,8%
1 – Symmetry Shield RP C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O
FO: ACN 3 – 1 mL min-1
4 – 30 ºC 5 – Eluição isocrática H2O/ACN (4:96, v/v) 6 – 50 µL 7 – 25 min
HPLC-FLD
(mediante reação de derivatização)
LOD: 0,1 – 0,2 LOQ: 0,5 – 0,6
Xia
et a
l., 2
010
.
159
Tabela 4.2: continuação
Ovos
Quinolonas (3 analitos)
1 – 2 g 2 – Terra diatomácea (2 g) 3 – Fosfato (50 m mol L-1, pH 3)/ACN (1:1, v/v) 4 – Cela de 11 mL 5 – 1500 psi 6 – 70 ºC 7 – 5 min 8 – 3 ciclos 9 – Sem clean up 10 – 67% – 90%
Para o método quantitativo:
1 – Aqua C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: ác. o-fosfórico (25 mmol L-1, pH 3)
FO: ACN 3 – 1 mL min-1
4 – Não informada 5 – Gradiente 6 – 8 µL 7 – 18 min
HPLC-FLD (método quantitativo)
LC-MS
(método confirmatório) 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – SIM
CCα: 17-24 CCβ: 30-41
Herr
an
z e
t al.,
20
07
.
Ovos
Multiclasse
S, Q, T, M, P (41 analitos)
1 – 1 g 2 – Terra diatomácea tratada com EDTA (1,5 g) 3 – Tampão succinato (0,01 mmol L-1, pH 6)/ACN (1:1, v/v) 4 – Cela de 13 mL 5 – 1500 psi 6 – 70 ºC 7 – 3 min 8 – 2 ciclos 9 – Sem clean up 10 – rec. > 50% (para a maioria dos compostos)
1 – Acquity UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) 2 – FA: ác. oxálico (1 mmol L-1)/HCOOH (0,02%, v/v)
FO: ACN/HCOOH (0,1%, v/v) 3 – 0,3 mL min-1
4 – 40 ºC 5 – Gradiente 6 – 10 µL 7 – 13 min
UHPLC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
CCα: 0,3 – 232 CCβ: 3,5 – 265
Jim
én
ez e
t a
l., 2
011
.
Ovos e músculo de peixe e camarão
Tetraciclinas (7 analitos)
1 – 5 g 2 – Areia tratada com EDTA 3 – Ác. tricloroacético (pH 4)/MeOH (1:3, v/v) 4 – Cela de 22 mL 5 – 65 bar 6 – 60 ºC 7 – 3 min 8 – 2 ciclos 9 – Sem clean up 10 – 78,8%-102,9%
1 – Zorbax SB-C18 (150 mm × 4,6 mm; 5 µm) 2 – FA: ác. oxálico (0,01 mol L-1, pH 3)
FO: ACN e MeOH 3 – 1 mL min-1
4 – 35 ºC 5 – Gradiente (mistura ternária) 6 – 50 µL 7 – 18 min
HPLC-UV
LOD: 5 - 10 LOQ: 10 - 15 CCα: 5,3 – 206 CCβ: 7 – 215
Liu
et
al.,
201
3.
Carne e peixe
Macrolídeos
(7 analitos)
1 – 5 g da amostra liofilizada 2 – Alumina (7 g) 3 – MeOH 4 – Cela de 33 mL 5 – 1500 psi 6 – 80 ºC 7 – 15 min.
8 – 2 ciclos 9 – Sem clean up 10 – 78,8%-102,9%
1 – Kromasil 100 C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: H2O/CH3COOH (1%, v/v; pH 2,8)
FO: ACN 3 – 1 mL min-1
4 – 35 ºC
5 – Gradiente 6 – 50 µL 7 – 41 min
LC-MS 1 – ESI 2 – Q 3 – SIM e full scan
LOD: 18-51 LOQ: < LMR CCα: 6 – 208 CCβ: 15 – 211
Be
rra
da
et
al.,
20
08
.
160
Tabela 4.2: continuação
Carne e leite
M e L (7 analitos)
1 – Carne (2,5 g) e leite (2,5 mL) 2 – Areia da praia (15 g) e EDTA (0,5 g) 3 – ACN 4 – Cela de 11 mL 5 – 1500 psi 6 – 40 ºC 7 – 5 min 8 – 1 ciclo 9 – Extração líquido-líquido com éter de petróleo 10 – rec. > 70%
1 – Discovery HS C18 (150 mm × 2,1 mm; 3 µm) 2 – FA: H2O/HCOOH (0,1%, v/v)
FO: ACN/HCOOH (0,1%, v/v) 3 – 0,25 mL min-1
4 – 25 ºC 5 – Gradiente 6 – Não informado 7 – 35 min
LC-MS/MS (método confirmatório)
1 – ESI 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 3 – 10 LOQ: 10 – 20 CCα: 0,8 – 210 CCβ: 0,26 – 205
Ju
an e
t al., 2
01
0.
Carne suína Sulfonamidas (12 analitos)
1 – 10 g 2 – Terra diatomácea (10 g) 3 – H2O 4 – Cela de 22 mL 5 – 1500 psi
6 – 160 ºC 7 – 5 min. 8 – 1 ciclo 9 – SPE (cartucho HLB) 10 – 76% – 98%
Separação por Eletroforese Capilar Eletrólito: acetato de amônio (50 mmol L-1) pH: 4,16 Temperatura: 20 ºC Voltagem: + 23 kV
CE-MS/MS 1 – ESI 2 – IT 3 – MRM
LOD: 12,5 LOQ: 46,5
Fo
nt
et
al.,
200
7.
Músculo, fígado e rim ovino
Fígado de gado
Fígado equino
Músculo de peixe
Sulfonamidas e seus metabólitos
(19 analitos)
1º método: remoção de lipídeos (clean up)
1 – 2,5 g 2 – Terra diatomácea 3 – n-hexano 4 – Não informado 5 – 1500 psi 6 – 60 ºC 7 – 5 min 8 – 2 ciclos 9 – Não se faz necessário 10 – Não ocorreu extração de analitos
2º método: para a extração dos analitos:
1 – 2,5 g (a mesma amostra da cela anterior) 2 – Terra diatomácea 3 – ACN/CH3COOH (0,2%, v/v) 4 – Não informado 5 – 1500 psi 6 – 90 ºC 7 – 7 min 8 – 3 ciclos 9 – Partição à baixa temperatura (LTP) 10 – 80%-120% (para a maioria dos analitos)
1 – Purospher STAR C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm) 2 – FA: HCOOH (10 mmol L-1) em H2O
FO: HCOOH (10 mmol L-1) em ACN 3 – 0,2 mL min-1
4 – Não informado 5 – Gradiente 6 – Não informado 7 – 22 min
LC-MS/MS 1 – ESI (+) 2 – QqLIT 3 – MRM
LOD: 10 LOQ: 25 CCα:111 – 161 CCβ: 122 – 221
Hoff
et
al., 2
01
5.
161
Tabela 4.2: continuação
Músculo, fígado e rim bovino
3
AVERMECTINAS (ABA, DORA, e
IVER)
+
14 macrolídeos
1 – 2,0 g) 2 – Areia (12 g) tratada com EDTA 3 – H2O/ACN (1:1, v/v) 4 – Cela de 22 mL 5 – 1500 psi 6 – 60 ºC 7 – 10 min 8 – 2 ciclos 9 – Não ocorreu 10 – rec. > 75%
1 – Hypersil Gold C18 (100 mm × 2,1 mm, 5 µm) 2 – FA: HCOONH4 em H2O (5 mmol L-1) / HCOOH (0,1 %, v/v)
FO: MeOH 3 – 0,25 – 0,4 mL min-1 4 – 35 ºC 5 – Gradiente 6 – Não informado 7 – 20 min
LC-MS/MS
1 – ESI (+) 2 – QqQ 3 – MRM
LOD: 0,21 – 0,33 LOQ: 5
Ta
o e
t a
l., 2
012
162
4.2 – Objetivos
O trabalho descrito no presente capítulo teve como objetivo o desenvolvimento e
validação de um método multiresíduo para a determinação de antiparasitários da classe
das avermectinas e milbemicina em músculo bovino, utilizando a HPLC-FLD.
Os objetivos específicos compreenderam a avaliação da extração dos analitos pela
extração líquido pressurizado (PLE) e a avaliação de diferentes técnicas de clean up (in
situ), assim como a análise de amostras de músculo bovino comercializados no mercado
da cidade de Campinas/SP.
4.3 – Materiais, instrumentos e métodos
4.3.1 - Reagentes, solventes e materiais utilizados
- Acetonitrila e metanol - grau HPLC (J. T. Baker, EUA);
- Água deionizada e posteriormente purificada em sistema Milli-Q, modelo Academic
(Millipore, EUA);
- Anidrido trifluoracético (Fluka); 1-metil-imidazol (Sigma-Aldrich);
- Alumina neutra (Sigma-Aldrich);
-Tubos de polipropileno com tampas rosqueáveis do tipo Falcon com capacidade
para 50 mL;
- Nitrogênio gasoso (White Martins, Brasil);
- Seringas de polipropileno (capacidade 3 mL);
- Filtros de membrana de 0,22 μm de PVDE (Millex, EUA);
- Frascos de vidro (vials), capacidade de 2 mL (Agilent, EUA);
- Coluna cromatográfica Zorbax Eclipse Plus (Agilent, USA) com fase estacionária
do tipo C18 com dimensões 150 mm x 4,6 mm x 5 µm; protegida por sua respectiva coluna
de guarda (12,5 mm x 4,6 mm x 5 µm).
4.3.2 - Instrumentação
- Balança (Sartorius, Alemanha) modelo CPA 225D, com precisão de ±0,01 mg;
- Bomba de vácuo (Fanem, Brasil);
- Banho de ultrassom modelo USC 700 (Unique Thorton Brasil);
- Ultra-Turrax® - modelo T18 basic (IKA, Brasil);
- Agitador do tipo Vórtex – modelo AP56 (Phoenix Luferco, Brasil);
163
- Centrífuga - modelo Excelsius II (Fanem, Brasil);
- Mesa agitadora – modelo MA 139/CFT (Marconi, Brasil);
- Extrator com líquido pressurizado – modelo ASE350 (Dionex/Thermo Scientific,
EUA);
- Cromatógrafo a líquido – série 1200 (Agilent, EUA), constituído de sistema de
bombeamento quaternário, amostrador automático e sistema de detecção por
fluorescência, operando a 365 nm (excitação) e 465 nm (emissão). O procedimento de
aquisição e processamento de dados foi realizado utilizando-se o software ChemStation
(Agilent, USA).
4.3.3 - Amostra selecionada para o teste inicial do desenvolvimento do
método
As amostras utilizadas para os testes iniciais para o desenvolvimento do método
analítico foram adquiridas no comércio local da cidade de Campinas/SP, tendo sido
adquiridas na forma de músculo bovino moído e semi-congelado, com massa aproximada
de 1 kg. Após ocorrido o processo de degelo à temperatura ambiente, separou-se
manualmente pequenas porções da amostra (20 g) que foram acondicionadas em sacos
plásticos, garantindo-se dessa forma que a amostra não ficasse sendo submetida a ciclos
de congelamento/descongelamento. As amostras foram então mantidas à temperatura
inferior a -10 °C. Estas amostras para serem consideradas como “branco”, deveriam ser
isentas dos analitos de interesse.
4.3.4 - Avermectinas e milbemicina selecionadas
As avermectinas e a milbemicina selecionadas para esse estudo consistiram da
moxidectina (MOXI: Fluka, 97,1%, Alemanha); benzoato de emamectina (EMA: Fluka,
99,4%, Alemanha); abamectina (ABA: Fluka, 98,7%, Alemanha); doramectina (DORA:
Fluka, 94,8%, Alemanha) e ivermectina (IVER: Sigma Aldrich, 90%, China).
4.3.5 - Preparo das soluções estoque
O preparo das soluções estoque foi realizado mediante a pesagem de 10 mg de
MOXI, EMA, ABA, DORA e IVER, sendo solubilizadas em acetonitrila, transferidas para
164
balão volumétrico de 10 mL e avolumados com o mesmo solvente. As soluções foram
armazenadas em frasco âmbar e mantidas em refrigeração a -18 ºC por até 6 meses.
A solução de trabalho foi obtida a partir do preparo de uma mistura da MOXI, ABA,
DORA e IVER, mediante a combinação de alíquotas das respectivas soluções estoque, de
modo a se obter uma solução de concentração intermediária a 200 ng mL-1. Uma solução
intermediária e individualizada de EMA também foi preparada a 500 ng mL-1, tendo a
mesma sido utilizada como surrogate.
4.3.6 - Reação de derivatização
O extrato obtido após extração por PLE foi evaporado com fluxo suave de nitrogênio
auxiliado com banho termostatizado em aproximadamente 55 ºC. Ao resíduo seco obtido
foram adicionados 500 µL de acetonitrila, sendo o mesmo em seguida agitado por 30 s com
auxílio de vórtex. Após a agitação, a solução foi filtrada em filtro de membrana 0,22 µm,
sendo a parte filtrada recolhida diretamente no vial a ser levado ao HPLC-FLD. À solução
filtrada foram adicionados 250 µL de 1-metilimidazol/ACN (1:1, v/v) e mais 250 µL de
ATFA/ACN (1:1, v/v), conforme descrito pelo FDA (FDA, 2011).
4.3.7 - Método cromatográfico HPLC-FLD
O método cromatográfico foi desenvolvido utilizando-se a fluorescência como
método de detecção (exc. = 365 nm; emis. = 465 nm). A separação dos analitos foi realizada
em coluna C18 e fase móvel de uma mistura de água (solvente A) e metanol (solvente B).
A eluição foi realizada por gradiente (Tabela 4.3). A temperatura da coluna foi mantida a 30
ºC, o volume de injeção utilizado foi de 20 µL. O tempo total da corrida cromatográfica,
incluindo o tempo de reequilíbrio da coluna, antes da próxima injeção, foi de 26 min.
Tabela 4.3: Programação do gradiente utilizado na corrida cromatográfica
Tempo (min) % A % B Vazão (mL min-1)
0,0 15 85 1,0
2,0 15 85 1,0
4,0 6 94 1,4
15,0 6 94 1,4
17,0 0 100 1,4
22,0 0 100 1,4
23,0 15 85 1,0
26,0 15 85 1,0
165
4.3.8 - Preparo de amostra
4.3.8.1 - Avaliação e otimização do método PLE para determinação de
avermectinas e milbemicina em carne bovina
O desenvolvimento, otimização e avaliação do método PLE, para a determinação
dos antiparasitários em músculo bovino, foi realizado baseando-se inicialmente no trabalho
desenvolvido por Carretero e colaboradores (Carretero et al., 2008), mas também sendo
comparado com métodos usuais baseados apenas numa extração sólido-líquido, método
de extração bastante relatado na literatura para a extração de avermectinas em diversos
tipos de matrizes alimentícias de origem animal (Hou et al., 2007; FDA, 2011; Giannetti et
al., 2011; Rübensam et al., 2013).
Extração Sólido-Líquido (SLE) – uma quantidade de amostra de aproximadamente
4 g, previamente processada no ultra-turrax, foi colocada em tubo Falcon (50 mL) e
fortificada com os analitos de interesse. A mistura foi agitada em vórtex por 30 s e deixada
em repouso por 30 min para permitir a incorporação dos analitos na matriz da amostra. Em
seguida foram adicionados 20 mL de ACN e a mistura foi novamente agitada em vórtex por
30 s e em mesa agitadora por mais 20 min. Por fim, a mistura foi centrifugada a 2355 g por
5 min. O sobrenadante foi separado e levado à evaporação até a secura com fluxo suave
de nitrogênio auxiliado com banho termostatizado (55 ºC). O resíduo obtido foi processado
segundo o mesmo procedimento (ressuspensão e derivatização) descrito no item 4.3.6 (pg
141).
4.3.8.2 - Testes exploratórios para a seleção inicial das condições de
operação do PLE
- Extração com líquido pressurizado (Método PLE - não dispersivo) - uma
quantidade de amostra de aproximadamente 4 g, previamente processada no ultra-turrax,
foi transferida para um tubo Falcon (50 mL) e fortificada com os analitos de interesse. A
mistura foi agitada em vórtex por 30 s e deixada em repouso por 30 min para permitir a
incorporação dos analitos na matriz da amostra. Após esse tempo, a amostra foi
acondicionada em papel de filtro e colocada na cela de extração do equipamento. As
condições do método PLE foram: acetonitrila como solvente de extração; temperatura: 70
ºC; tempo de aquecimento: 5 min; tempo estático: 10 min; nº de ciclos: 1; volume da cela
166
de extração: 33 mL. A fase extraída obtida foi submetida ao mesmo procedimento de
evaporação, ressuspensão, filtração e derivatização descrito no ítem 4.3.6 (pg 141).
- Dispersão da matriz em fase sólida e extração com líquido pressurizado
(Método MSPD-PLE) – uma quantidade de amostra de aproximadamente 4 g, previamente
processada no ultra-turrax, foi colocada em tubo Falcon (50 mL) e fortificada com os analitos
de interesse. A mistura foi agitada em vórtex por 30 s e deixada em repouso por 30 min
para permitir a incorporação dos analitos na matriz da amostra. Em seguida, a amostra foi
dispersada em aproximadamente 10 g de alumina e transferida para a cela de extração. As
condições do método PLE foram: acetonitrila como solvente de extração; temperatura: 70
ºC; tempo de aquecimento: 5 min; tempo estático: 10 min; nº de ciclos: 1; volume da cela
de extração: 33 mL. A fase extraída obtida foi submetida ao mesmo procedimento de
evaporação, ressuspensão, filtração e derivatização descrito no ítem 4.3.6.
- Dispersão da matriz em fase sólida e extração seletiva com líquido
pressurizado (Método MSPD/S-PLE) - A amostra (3 g), após processada no ultra-turrax,
foi transferida para tubo Falcon (50 mL) e fortificada com os analitos na concentração de
50 ng g-1. A mistura foi agitada em vórtex por 30 s e deixada em repouso por 30 min. Após
a incorporação dos analitos na matriz da amostra, a mesma foi devidamente dispersada
em, aproximadamente, 10 g de alumina e transferida para a cela de extração. Foram
realizadas duas extrações com as mesmas condições do método PLE que foram:
temperatura: 70 ºC; tempo de aquecimento: 5 min; tempo estático: 10 min; nº de ciclos: 1;
volume da cela: 33 mL. No entanto, modificou-se o tipo de solvente utilizado entre as duas
extrações. Na primeira extração utilizou-se H2O:ACN (10:90 v/v), visando uma etapa de
clean up, e na segunda extração foi utilizado ACN (100%) como solvente de extração dos
analitos da matriz. A segunda fase extraída contendo os analitos foi submetida ao mesmo
procedimento de evaporação, ressuspensão, filtração e derivatização descrito no item
4.3.6, enquanto a primeira fase foi descartada.
Esses experimentos de clean up (C.U.) foram avaliados frente a parâmetros como
composição, ou polaridade da fase extratora, empregada durante a 1ª etapa de extração, e
também foi avaliado o tempo estático necessário para se processar a referida 1ª etapa. Um
resumo dos experimentos realizados encontra-se sumarizado na Tabela 4.4 (pg 167).
167
Tabela 4.4: Otimização e avaliação da etapa de clean up (in situ).
Otimização e avaliação da etapa de Clean Up (in situ) do método MSPD/S-PLE
Quanto à polaridade do 1º solvente de extração Parâmetros fixos
Experimentos: Variável: Temperatura: 70 °C
C.U.1 H2O (100%) Tempo estático: 10 min
C.U.2 H2O:ACN (90:10 v/v)
C.U.3 H2O:ACN (70:30 v/v)
Quanto ao tempo estático da 1ª extração (min) Parâmetros fixos
Experimentos: Variável: Temperatura: 70 °C
C.U.4 3 min Composição do solvente:
H2O:ACN (90:10, v/v)
C.U.5 6 min
4.3.8.3 – Otimização do método PLE selecionado com propósito de
validação
Para a otimização do procedimento PLE, foram realizados alguns experimentos com
o intuito de se promover a maior eficiência de extração com a menor co-extração de
compostos indesejados. A Tabela 4.5 descreve, de forma resumida, as variáveis e
parâmetros empregados nestes estudos.
Tabela 4.5: Parâmetros avaliados para a otimização do método PLE
Experimentos Varíável: temperatura (°C) Parâmetros fixos
A 70 Tempo estático: 10 min.
B 80 Solução de extração: ACN (100%)
C 90
Experimentos Varíável: solvente de extração Parâmetros fixos
A ACN (100%) Temperatura: 70 °C
D MeOH (100%) Tempo estático: 10 min.
E ACN/MeOH (1:1)
Experimentos Varíável: Tempo estático (min) Parâmetros fixos
A 10 min Temperatura: 70 °C
F 7 min Solução de extração: ACN (100%)
G 13 min
168
4.3.8.4 - Procedimento final selecionado para a extração por PLE
Uma quantidade de amostra de músculo bovino de aproximadamente 4 g, pesadas
com precisão de ± 0,01 mg, previamente processada em ultra-turrax, foi transferida para
tubo Falcon (50 mL). A amostra foi fortificada com os analitos ao nível da concentração
almejada para fins de validação e também foi adicionado o surrogate. A mesma foi então
agitada em vórtex por 45 s e, em seguida, deixada em repouso por 30 min. Após a espera
da incorporação dos analitos na matriz da amostra, a mesma foi transferida para um gral e
foi devidamente dispersada em aproximadamente 6 g de alumina. A amostra, então
dispersada, foi levada à estufa por 20 min a 70 ºC. Após essa etapa de secagem da amostra
dispersada, a mesma foi colocada em cela de extração, não se fazendo uso do
preenchimento do espaço vazio remanescente na cela. As condições otimizadas do método
PLE desenvolvido encontram-se listadas na Tabela 4.6. A fase extraída obtida foi
submetida ao mesmo procedimento de evaporação, ressuspensão, filtração e derivatização
descritas no item 4.3.6 (pg 141).
Tabela 4.6: Condições e parâmetros utilizados no método PLE
Solvente de extração ACN (100%)
Temperatura (ºC) 70
Pressão (psi) 1700
Tempo de aquecimento da cela (min) 5
Tempo de extração (min) 13
Número de ciclos 1
Tempo de purga (min) 1
Volume da cela de extração (mL) 33
Tempo total de extração* (min) 23
Volume de solvente consumido* (mL) 43
* por amostra
169
4.3.9 - Validação do método analítico
A validação do método analítico para a determinação de avermectinas em amostras
comerciais de músculo bovino, utilizando a extração com líquido pressurizado e análise por
HPLC-FLD, foi feita baseando-se nos seguintes parâmetros: seletividade, linearidade,
precisão, exatidão, limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ), tendo sido
baseadas em recomendações do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA, 2011) e da Comunidade Europeia (EC, 2002).
O número de experimentos, durante todo o processo de validação, bem como o de
amostras analisadas, foram otimizados de modo a se realizar um menor número de
ensaios.
4.3.9.1 – Seletividade
A seletividade do método foi avaliada comparando-se os cromatogramas da amostra
branco, submetida ao mesmo tipo de preparo de amostra selecionado para o método, com
o da amostra branco fortificada, ao nível de fortificação de 1,0 x LMR (µg kg-1) para cada
avermectina ou milbemicina em estudo. Analisando os cromatogramas foi avaliada a
possível presença de interferentes próximos aos tempos de retenção dos analitos em
estudo.
4.3.9.2 – Curva analítica e linearidade
A construção das curvas analíticas para a quantificação das avermectinas foi
realizada usando o método de padronização interna mediante fortificação de matriz branca
de músculo bovino com os analitos alvos. Foi utilizada a EMA como surrogate e a
construção da curva analítica foi realizada pela razão área do pico do analito/área do pico
do surrogate em função da concentração. O composto EMA foi utilizado como surrogate
devido ao fato dele não ser utilizado como fármaco veterinário na pecuária, sua prescrição
se dá somente para uso na aquicultura, portanto, não deve ser encontrado em amostras de
carne. As amostras branco foram fortificadas em cinco níveis de concentração (n1, n2, n3,
n4 e n5) aos quais corresponderam a 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 x LMR, respectivamente. O guia
do MAPA (MAPA, 2011) recomenda que cada nível de concentração seja construído em
triplicata de amostra e que se faça uma duplicata de injeção para cada uma delas, devendo
assim a curva analítica ser levantada com trinta pontos. No entanto, dada a adequada
170
repetibilidade do método por detecção por fluorescência, optou-se pelo levantamento da
curva em sextuplicata de amostra por nível de fortificação.
O procedimento de fortificação consistiu na utilização de 4 g de amostra branco,
com adição de 100, 200, 300, 400 e 500 µL da solução de fortificação, mix de todas as
avermectinas e milbemicina ao nível de 200 ng mL-1. Para o processo de padronização
interna adicionaram-se 160 µL do surrogate EMA, preparada separadamente ao nível de
500 ng mL-1, de modo que se obtivesse as concentrações descritas na Tabela 4.7.
A linearidade do método foi avaliada mediante aplicação do método dos mínimos
quadrados ordinários, após verificação da homocedasticidade dos resíduos pelo teste de
Levene e avaliação de possíveis outliers pelo método dos resíduos padronizados Jacknife.
A curva analítica na matriz foi expressa pelos coeficientes angular e linear, assim como de
seus desvios e o coeficiente de correlação linear.
4.3.9.3 – Precisão (repetibilidade e precisão intermediária)
A precisão do método analítico, em termos de repetibilidade, foi obtida mediante a
realização de sextuplicata de análise de uma mesma amostra branco de músculo bovino
fortificado com os analitos, pelo mesmo analista, no mesmo equipamento e um curto
espaço de tempo (no mesmo dia). Esse ensaio foi realizado em 3 níveis de fortificação: 0,5
1,0 e 1,5 x LMR.
A precisão intermediária do método, também conhecida como reprodutibilidade
intralaboratorial, foi obtida da mesma forma que a repetibilidade, porém a análise foi
realizada em mais dois dias diferentes, perfazendo um total de 18 ensaios por nível de
fortificação. Os três mesmos níveis avaliados no ensaio de repetibilidade também foram
avaliados neste ensaio.
Como critério de aceitação, considera-se que ao nível de resíduo, o coeficiente de
variação do método não deve exceder a 20% (MAPA, 2011).
Tabela 4.7: Concentrações dos analitos para construção da curva na matriz
Nível de
Fortificação
Concentração – ng g-1
Ema1 Moxi Aba Dora Iver
n1 (0,5 LMR) 20 5 5 5 5
n2 (1,0 LMR) 20 10 10 10 10
n3 (1,5 LMR) 20 15 15 15 15
n4 (2,0 LMR) 20 20 20 20 20
n5 (2,5 LMR) 20 25 25 25 25
1 – “surrogate” – concentração constante
171
4.3.9.4 – Exatidão
Devido à indisponibilidade de material certificado de referência, a exatidão do método
foi avaliada mediante ensaio de recuperação. Dessa forma, foram realizadas fortificações
de amostras branco de músculo bovino (n=18) em três níveis de concentração – 0,5, 1,0 e
1,5 x LMR, tendo sido realizados procedimentos de extração de amostras branco
fortificadas em sextuplicata para cada nível de fortificação.
A exatidão do método analítico, expressa como porcentagem de recuperação, foi
calculada conforme a equação:
𝑅𝑒𝑐 (%) =𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝐷𝑒𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑥 100
No caso de se trabalhar com concentrações ao nível de resíduos, os valores de
recuperações aceitos se situam na faixa de 80% a 110% (MAPA, 2011).
4.3.9.5 – Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ)
O limite de decisão (CCα) e a capacidade de detecção (CCβ) do método analítico
foram calculados utilizando-se dados dos pontos da curva analítica construída na matriz,
fortificados na concentração do LMR para cada substância.
Para as substâncias que possuem um LMR, ou seja, substâncias que não são
consideradas banidas, as equações para o cálculo de CCα e de CCβ, corresponderam às
apresentadas em seguida:
CCα = LMR + 1,64σ
CCβ = CCα + 1,64σ
Onde σ corresponde ao desvio padrão da reprodutibilidade intralaboratorial, que por
sua vez também corresponde à precisão intermediária. Para as substâncias com valores
de LMR estabelecidos, os valores de CCα e CCβ deverão ser sempre maiores que LMR,
no entanto, deverão ser o mais próximo possível do mesmo (MAPA, 2011).
172
4.4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Métodos para a determinação de avermectinas e milbemicinas a nível de traços, em
alimentos de origem animal, baseados na detecção por fluorescência são bem conhecidos
e relatados na literatura. O uso da cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por
fluorescência, na determinação destes antiparasitários em alimentos, ainda se mostra de
forma predominante se comparada à cromatografia líquida com uso da espectrometria de
massas como técnica de detecção (MS ou MS/MS). Isso pelo fato da detecção por
fluorescência apresentar uma adequada detectabilidade, melhor precisão, menor efeito
matriz e um custo bastante inferior à espectrometria de massas como técnica de detecção
(Cerkvenik-Flajs et al., 2010). Embora tenha ocorrido um esforço no âmbito de se aprimorar
os procedimentos da derivatização de tais analitos no sentido da obtenção de melhores
condições reacionais, não foi escopo do presente trabalho propor melhorias ou avanços no
processo de derivatização, uma vez que as mesmas encontram-se já bem estabelecidas e
divulgadas na literatura. Um histórico sobre essas reações foi revisado por Danaher e
colaboradores (Danaher et al., 2006).
4.4.1 - Desenvolvimento do método cromatográfico
O desenvolvimento do método cromatográfico foi inicialmente baseado em um
método previamente descrito na literatura (FDA, 2011). No entanto o mesmo descreve a
utilização de uma coluna do tipo Zorbax ODS (150 mm x 4,6 mm x 5 µm). No método
cromatográfico desenvolvido foi utilizada uma coluna do tipo Zorbax Eclipse Plus (150 mm
x 4,6 mm x 5 µm), porém ambas do tipo C18 produzidas pelo mesmo fabricante. A coluna
aqui empregada mostrou adequada separação de todos os cinco antiparasitários
selecionados (quatro avermectinas e uma milbemicina). A composição da fase móvel
utilizada no desenvolvimento desse estudo foi escolhida com base nas misturas de uso
mais frequente no laboratório e também se baseando no artigo de referência do FDA (FDA,
2011). A mistura da fase móvel mostrou adequada estabilidade frente à linha de base, não
vindo a comprometer a quantificação das avermectinas a nível residual. Enquanto o
trabalho de referência faz uso de uma mistura isocrática H2O:MeOH (3:97, v/v), com vazão
da fase móvel de 1,8 mL min-1 em toda a extensão da análise e com um tempo total de
corrida cromatográfica de 15 min, a abordagem cromatográfica no presente trabalho diferiu
um pouco, sendo aqui feito uso de uma eluição por gradiente, conforme descrito na Tabela
4.3 (pg 164). A vazão de 1,4 mL min-1 foi selecionada tendo em vista a obtenção de picos
173
mais estreitos e um menor tempo de corrida. Uma satisfatória resolução dos picos dos
analitos de interesse foi obtida, com a seguinte ordem de eluição: MOXI, EMA, ABA, DORA
e IVER, conforme apresentado na Figura 4.5 (pag 181).
4.4.2 - Procedimento de derivatização
O procedimento de derivatização, considerando-se o preparo das soluções dos
reagentes derivatizantes, bem como o volume de ressuspensão (500 µL) do extrato a ser
reconstituído, foi realizado com base no mesmo artigo descrito pelo FDA (FDA, 2011). No
entanto, o volume da solução dos reagentes adicionados foi modificado de 200 para 250
µL de cada solução, visando a obtenção no vial de um volume final próximo a 1 mL. Tal
procedimento empregado foi considerado de fácil e rápida execução, dispensando etapa
de aquecimento ou mesmo adição de outro reagente, como o ácido acético, como sugerem
alguns trabalhos descritos na literatura (Giannetti et al., 2011; Rübensam et al., 2013).
Porém, é válido salientar que os referidos trabalhos também realizam a derivatização da
eprinomectina, sendo que é conhecido que o produto oriundo da reação de derivatização
desta apresenta problemas de estabilidade. Com o procedimento de derivatização aqui
proposto não foi possível a obtenção de resultados repetíveis na reação da eprinomectina,
sendo que Berendsen e colaboradores (Berendsen et al., 2007) descrevem experimentos
visando a superação de problemas relacionados com sua reatividade, bem como com sua
limitada estabilidade.
Quando a etapa de derivatização é realizada somente com padrões analíticos
observa-se a formação de outros produtos fluorescentes no meio reacional e precisa ser
tomado o devido cuidado para separar esses dos analitos derivatizados na coluna
cromatográfica. É válido salientar que a reação de derivatização dos padrões analíticos leva
à formação de produtos mais apolares com consequente aumento no tempo de retenção
dos analitos fluorescentes.
Um fator importante a ser considerado nessa etapa é a necessidade do extrato ser
levado até a secura, uma vez que a presença de água interfere na reação de derivatização.
Uma característica interessante quanto à utilização da fluorescência, como técnica
de detecção dos antiparasitários selecionados, é a obtenção de derivados fluorescentes
detentores de sinais analíticos de intensidades que não diferem de forma significativa entre
si, facilitando a utilização de apenas uma substância na padronização interna, que no caso
tratou-se da emamectina.
174
4.4.3 – Preparo de amostra e otimização do procedimento PLE
Os testes exploratórios para o desenvolvimento do método PLE basearam-se
inicialmente no trabalho desenvolvido por Carretero e colaboradores (Carretero et al.,
2008), que propuseram um método para a determinação de 31 analitos em carne fazendo
uso da LC-MS/MS. Dentre as classes dos analitos estudados destacam-se antimicrobianos
da classe dos β-lactâmicos, macrolídeos, quinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas e
nitroimidazóis. No referido trabalho os autores utilizaram a água como solvente de extração.
No entanto, neste trabalho, devido ao conhecido caráter hidrofóbico das avermectinas foi
usada a acetonitrila. Dessa forma, foram utilizados os outros parâmetros descritos no
trabalho de referência como comprometimento inicial para a operação no sistema PLE.
A dispersão da matriz em fase sólida (MSPD), desde sua introdução para a extração
de resíduos de drogas em tecido animal, tem despertado o interesse de muitos
pesquisadores. Algumas de suas principais características dando-se por conta de sua
versatilidade, baixo custo, rapidez, flexibilidade e ser de fácil execução (Capriotti et al.,
2012). A MSPD é amplamente empregada em métodos de preparo de amostra que venham
a utilizar a PLE, sendo que alguns autores chegam a explorar o potencial de seu uso em
procedimentos de extração utilizando uma etapa de clean up in situ, seja através da escolha
de um determinado tipo de dispersante em particular ou através da utilização de um eluente
em específico (Martínez et al., 2005).
No desenvolvimento inicial do método PLE aqui proposto, avaliou-se primeiramente
a necessidade ou não da etapa MSPD. Dessa forma, como descrito no item 4.3.8.1 (pg
142), o primeiro teste efetuado foi avaliar se haveria diferença significativa nas eficiências
de extração entre o método PLE-não dispersivo quando comparado com o método MSPD-
PLE. Constatou-se, dessa forma, que a utilização do método PLE-não dispersivo levava a
uma limitada e baixa eficiência de extração dos analitos, conferindo ao mesmo método uma
comprometida e inadequada possibilidade de uso quando comparado com o método que
faz uso da etapa dispersiva.
O processo de otimização do procedimento de preparo de amostra, fazendo uso de
etapa dispersiva e baseado na extração com líquido pressurizado, foi realizado de forma
univariada, ou seja, cada parâmetro foi avaliado de forma independente um do outro. A
otimização do método PLE foi dividida em duas partes, tendo sido avaliados inicialmente
na primeira parte, conforme descrito na Tabela 4.5 (pg 167), os parâmetros: temperatura,
tipo de solvente e tempo estático. A segunda parte, descrita na Tabela 4.4 (pg 167),
175
consistiu em se avaliar a possibilidade e necessidade de uma primeira etapa de clean up,
tendo essa sido realizada como uma prévia S-PLE (extração seletiva), com um solvente de
caráter mais polar, uma vez que se conhece a baixa afinidade das avermectinas e
milbemicina por solventes polares.
Avaliação do Método MSPD/S-PLE
Métodos que venham a utilizar a PLE associada com o processo de clean up na
própria cela de extração, visando a redução de coextrativos, são também denominados de
extração seletiva com líquido pressurizado (S-PLE), sendo considerados métodos rápidos
e bem aceitos. Métodos S-PLE são geralmente realizados em matrizes ricas em gorduras,
que normalmente levam a etapas adicionais de clean up com a utilização da extração em
fase sólida (SPE) ou da cromatografia de permeação em gel (GPC). Geralmente, a remoção
de interferentes, provenientes de matrizes ricas em gordura, com a utilização da etapa de
clean up, fica relacionada com um laborioso manuseio no preparo de amostra, consumindo
um tempo extra, associada a perdas de analitos e também com o aumento do custo das
análises (Ghosh et al., 2011).
O processo de extração de óleos e gorduras, provenientes de tecidos animais, é
realizado através do trituramento do material no qual a gordura está contida e subsequente
mistura com água em uma autoclave, devendo permanecer em contato a elevada pressão
e temperatura por um período de 1 a 2 horas. Após isso, a gordura ficará na forma líquida
devido à elevada temperatura do meio. Em seguida, a água contendo todo o material
extraído é coletada em um decantador no qual a gordura deverá ser separada e recolhida
(Ramalho & Suarez, 2013).
Faceando as dificuldades no preparo de amostra de matrizes de origem animal ricas
em material gorduroso e tomando como base características inerentes aos métodos S-PLE,
bem como os consagrados procedimentos de extração de gorduras de tecido animal
adiposo, foram delineados os experimentos descritos no item 4.3.8.2 (pg 142), que
estivessem relacionados com as características acima expostas, visando a obtenção de
extratos que contivessem os analitos e, que por sua vez, possuíssem uma menor
quantidade de coextrativos e que não alterassem a seletividade do método.
Dos cinco experimentos realizados em duplicata (Tabela 4.4, pg 167) foi possível
constatar que todos os procedimentos empregando diferentes solventes extratores (C.U.1
(H2O), C.U.2 (H2O: ACN 10:90 v/v) e C.U.3 (H2O: ACN 30:70 v/v) e o segundo também com
tempos estáticos diferentes (3 min – C.U.4 e 6 min – C.U.5) levaram à obtenção de extratos
176
onde se observou, através de propriedades visuais, a presença de material com
consistência gordurosa. Esses procedimentos visavam um clean up inicial da amostra e,
portanto, esses extratos não foram analisados no HPLC. A análise foi realizada apenas na
segunda extração após o clean up usando a ACN. Através da análise do cromatograma foi
possível se observar que a realização da 1ª extração, visando a etapa de clean up, levava
a uma diminuição de um pico presente em aproximadamente 2 min, porém constatando-se
que esse composto não comprometia a identificação e quantificação dos analitos em
estudo. Não obstante, todos os experimentos realizados de S-PLE levarem a obtenção de
extratos com a mesma aparência, observou-se que a inclusão da 1ª extração, visando a
etapa de clean up, tanto levava a obtenção de menores valores de eficiência de extração,
quanto a resultados com menor repetibilidade (Figura 4.3). Esses resultados indicam que
há perda dos analitos na etapa do clean up inicial. Foi também constatada a presença de
água no 2º extrato. A presença de água, remanescente da 1ª extração, levou por sua vez
a uma maior dificuldade em se evaporar o extrato para fins de análise, sendo assim gasto
um maior tempo na etapa de preparo de amostra. Diante do exposto, resolveu-se proceder
com o processo de desenvolvimento e otimização do método PLE eliminando-se a etapa
de clean up pelo método S-PLE, uma vez que, caso o mesmo fosse realizado, seria
consumido uma maior quantidade de tempo por amostra.
Figura 4.3: Dados de eficiência de extração para as avermectinas e milbemicina utilizando-se
diferentes parâmetros de extração (Tabela 4.4) no método MSPD/S-PLE. C.U.1 (H2O, 70 ºC, 10
min), C.U.2 (H2O: ACN 10:90 v/v, 70 ºC, 10 min), C.U.3 (H2O: ACN 30:70 v/v, 70 ºC, 10 min), C.U.4
(H2O: ACN 10:90 v/v, 3 min, 70 ºC) e C.U.5 (H2O: ACN 10:90 v/v, 6 min, 70 ºC).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C.U.1 C.U.2 C.U.3 C.U.4 C.U.5
MOXI
EMA
ABA
DORA
IVER
177
Otimização do Método MSPD-PLE
O primeiro parâmetro selecionado para otimização do método MSPD-PLE, tendo em
vista a obtenção de melhores condições de extração, foi a temperatura. Foram avaliadas
as eficiências de extração (n = 2) em três diferentes temperaturas: 70, 80 e 90 ºC,
experimentos A, B e C, respectivamente (Tabela 4.5; pg 167). Foram mantidos constantes
nos três experimentos o tempo estático de 10 min e o uso da ACN como solvente de
extração. A análise dos gráficos referentes aos experimentos A, B e C (Figura 4.4; pg 178)
evidencia a ocorrência de uma tendência no decréscimo das eficiências de extração para
as avermectinas à medida que temperaturas maiores são empregadas. Com o aumento da
temperatura foi também observado um acréscimo no consumo de solvente orgânico como
fase extratora no sistema PLE. Desta forma, para os estudos posteriores foi escolhida a
temperatura de 70 ºC.
O segundo parâmetro avaliado para a otimização do método MSPD-PLE foi a
composição do solvente a ser empregado como fase extratora. Para isso foram estudados
três solventes: ACN (100%), MeOH (100%) e ACN:MeOH (1:1 v/v), experimentos A, D e E,
respectivamente (Tabela 4.5; pg 167). Foram mantidos constantes nessa avaliação a
temperatura (70 ºC) e o tempo estático (10 min). Conforme se pode observar na Figura 4.4
(pg 178), valores situados em torno de 30-90 % de eficiência de extração foram obtidos
quando foi utilizada ACN (100%) como solvente de extração. Os outros dois solventes
levaram a menores valores de eficiência de extração quando comparados a ACN. Vale
ressaltar que o metanol, tanto em composição pura como em proporção de 50% (v/v) com
a acetonitrila, levou a uma maior quantidade de coextrativos, sendo que os mesmos
chegam a aumentar a dificuldade em se levar à secura o extrato a ser evaporado, bem
como a etapa de derivatização. Em face de tais circunstâncias resolveu-se optar por utilizar
a ACN (100%) para os estudos subsequentes.
O terceiro parâmetro avaliado nesse conjunto de testes foi o tempo estático de
extração. Para esse estudo foram testados três tempos: 7, 10 e 13 min, experimentos F, A
e G, respectivamente (Tabela 4.4; pg 167). Foram mantidos constantes nessa avaliação a
temperatura (70 ºC) e o solvente de extração (ACN). O tempo de 13 min levou a uma maior
eficiência de extração para todos os analitos ( > que 70%) e, portanto, esse tempo foi
escolhido.
178
Figura 4.4: Eficiência de extração para as avermectinas e milbemicina utilizando-se
diferentes parâmetros de extração no método MSPD-PLE. ELS (20 mL, agitação: 20 min.); Exp. A
(70 ºC, 10 min., ACN); Exp. B (80 ºC, 10 min., ACN); Exp. C (90 ºC, 10 min., ACN); Exp. D (70 ºC,
10 min., MeOH); Exp. E (70 ºC, 10 min., ACN:MeOH – 1:1, v/v); Exp. F (70 ºC, 7 min., ACN); Exp.
G (70 ºC, 13 min., ACN).
No presente estudo a variável pressão não foi avaliada frente a necessidade de
otimização do procedimento PLE, uma vez que o modelo de equipamento utilizado não
permite essa variação. Vários trabalhos da literatura têm demonstrado que a variável
pressão, em métodos PLE de preparo de amostra, possui pouco ou desprezível efeito nas
características de desempenho, sua necessidade se dando somente para a manutenção
do solvente de extração em fase líquida (Rodriguez et al., 2010).
Nesse estudo, foram também avaliadas duas celas de diferentes volumes (11 e 33
mL). Os primeiros resultados obtidos, provenientes de experimentos em celas de 33 mL, e
caracterizando-se como aqueles conseguidos durante os testes exploratórios iniciais,
mostraram adequado nível de detectabilidade. Posteriormente, as mesmas condições de
extração foram também testadas em celas de 11 mL, para uma relação de massa
amostra/sorvente 4:6 g (m/m). Tal massa de amostra dispersada levou ao limite de
preenchimento da cela, que teve como consequência um menor volume de extrato obtido,
de aproximadamente 22 mL. No entanto, se evidenciou uma baixa e comprometida
eficiência de extração dos analitos, com a mesma situando-se em valores inferiores a 15%,
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ELS EXP. A EXP. B EXP. C EXP. D EXP. E EXP. F EXP. G
MOXI
EMA
ABA
DORA
IVER
Efic
iên
cia
de
Extr
ação
(%)
179
quando comparada à obtida utilizando-se a mesma massa de amostra dispersada em celas
de 33 mL, tendo sido obtido valores de eficiência de extração em torno de 70% quando da
utilização desse tipo de cela.
Trabalhos na literatura relatam a utilização do preenchimento do espaço vazio da
cela de extração (Blasco et al., 2009; Rodriguez et al., 2010), seja com o próprio agente
dispersante ou mesmo com areia tratada com EDTA, visando a obtenção de um menor
consumo de solvente de extração. No presente trabalho, também se avaliou tal
possibilidade, tanto com a própria alumina como com esferas de vidro. Tal avaliação
permitiu verificar que o completo ou parcial preenchimento da cela, embora fosse
conseguida uma economia de consumo em cerca de 10 mL de solvente por amostra, levava
a menores valores de eficiência de extração, tendo-se feita a escolha pela não utilização
dos referidos restritores de espaço vazio na cela de extração.
Diante dos adequados e significativos valores de eficiência de extração, obtidos para
os antiparasitários, iguais ou superiores a 70%, e também pelo fato das mesmas
apresentarem elevada detectabilidade, com o uso da fluorescência como técnica de
detecção, optou-se pela não realização de um 2º ciclo de extração, uma vez que, caso o
mesmo fosse realizado, seria aumentado de forma considerada o tempo de extração, sendo
gasto em torno de 36 min por amostra. Um 2º ciclo de extração também levaria ao
inconveniente de se gastar o dobro de volume de solvente e, por consequência, se obter
um dobro de extrato a ser evaporado. Dessa forma, optou-se pela realização de apenas um
ciclo de extração.
Referente ao processo de eliminação da água proveniente da amostra, que vinha a
dificultar o processo de evaporação do solvente no extrato obtido, foram testados 3
procedimentos. O primeiro consistiu em se dispersar a matriz fazendo uso, além da
alumina, do sulfato de sódio anidro, que por sua vez formava uma espécie de matéria semi-
sólida e de difícil processo de trituramento. O segundo consistiu em se utilizar Na2SO4
anidro diretamente no frasco onde estava contido o extrato umidificado recolhido, onde
constatou-se que tal procedimento de secagem levava a perdas na eficiência de extração.
O terceiro procedimento, que por sua vez foi o procedimento adotado de secagem da
amostra, consistiu em se levar a matriz, já na forma dispersada com alumina, à uma estufa
a 70 ºC por aproximadamente 25 min. Com esse método de secagem evidenciou-se um
aumento na eficiência de extração dos analitos e, de forma coincidente, que o interferente
presente em 13 min passava a ter uma menor área. Tal preocupação com o processo de
180
secagem da amostra, para a promoção de ganhos na etapa de extração, mostrou-se de
acordo com dados da literatura (Sun et al., 2012).
4.4.4 – Validação do método analítico
O procedimento de validação do método analítico foi realizado de acordo com as
normas e diretrizes do MAPA (Brazil, 2011), documento que dispõe de critérios de
desempenho analítico e que também orienta sobre procedimentos na garantia de qualidade
de resultados, dentro do contexto nacional, no que diz respeito a área de resíduos e
contaminantes em alimentos, encontrando-se o mesmo de forma harmonizada com o
estabelecido pela Comunidade Europeia (EC, 2002). Na etapa de validação considerou-se
valores de LMR estabelecidos para avermectinas em músculo bovino, levando-se em
consideração os seguintes parâmetros de desempenho analítico: seletividade, linearidade,
exatidão, precisão (repetibilidade e reprodutibilidade), limite de decisão (CCα) e capacidade
de detecção (CCβ), tendo sido utilizado para isso amostras branco fortificadas para a
construção das curvas analíticas na matriz.
4.4.4.1 – Seletividade
A seletividade do método analítico, utilizando a PLE e sistema de detecção por
fluorescência, foi avaliada por comparação do cromatograma da amostra branco (amostra
não fortificada com as avermectinas e milbemicina), submetida ao mesmo tipo de preparo
de amostra, com o cromatograma da amostra branco fortificada a nível de LMR (10 ng g-1).
Tal avaliação permitiu verificar a ausência de sinais de possíveis compostos endógenos
que estivessem coeluindo nos mesmos tempos de retenção dos analitos de interesse.
Embora tenha se observado um intenso sinal relativo a um composto, em aproximadamente
13 min, nos comprimentos de ondas selecionados para a detecção por fluorescência (exc.
= 365nm; em. = 465 nm), é possível afirmar que esse não compromete a seletividade do
método, uma vez que se observou uma adequada resolução do mesmo em relação ao
próximo pico de interesse, ou seja a MOXI. O método proposto não somente demonstrou
adequada seletividade e resolução das avermectinas e milbemicina estudadas, como
também forneceu elevada e adequada detectabilidade, como pode ser verificado na Figura
4.5 (pg 181).
181
Figura 4.5: - Cromatograma (HPLC-FLD) comparativo de uma amostra branco com uma
branco fortificada com as avermectinas e milbemicina estudadas (10 ng g-1). A emamectina foi
utilizada como surrogate (20 ng g-1). Condições cromatográficas: volume de injeção 20 µL; FM:
H2O:MeOH; vazão e eluição (ver Tabela 4.3); coluna: Zorbax Eclipse Plus C18 (150 mm x 4,6 mm
x 5 µm, dotada de coluna de guarda (12,5 mm x 4,6 mm x 5 µm); detecção por fluorescência (exc.
= 365nm; em. = 465 nm); tempo de corrida de 26 min. Picos 1, 2, 3 e 4 não identificados.
4.4.4.2 – Curva analítica e linearidade
As curvas analíticas foram obtidas plotando-se a razão entre as áreas, do sinal
analítico de cada analito alvo pelo sinal do surrogate (EMA), versus sua concentração.
Foram construídas curvas analíticas na matriz branco fortificada em cinco níveis de
concentração cada uma (5, 10, 15, 20 e 25 ng g-1) em sextuplicata de análise. O estudo da
linearidade do método foi realizado através de tratamento estatístico por ajuste dos dados
pelo Método dos Mínimos Quadrados Ordinários (MMQO) após ter sido comprovada a
homocedasticidade das mesmas pelo teste de Levene, sendo utilizado para isso o
programa Excel©. Através do mesmo programa se obteve o gráfico da curva analítica, o
gráfico de resíduos, a equação da reta e os parâmetros de regressão linear. Pontos
referentes a valores dispersos da curva analítica (outliers) foram identificados e eliminados
através do Teste dos Resíduos Padronizados de Jacknife, o mesmo tendo sido aplicado de
182
forma sucessiva até não mais ser obtido outliers, ou até uma máxima exclusão de 22,2%
do número original de resultados. As curvas analíticas construídas na matriz mostraram-se
lineares nos intervalos de trabalho estudados (0,5 - 2,5 LMR ou 5 – 25 ng g-1), sendo que
todas apresentaram coeficientes de correlação linear (r) superiores a 0,99 (Tabela 4.8),
como recomenda o MAPA (MAPA, 2011) e a Comunidade Europeia (EC, 2002). Na Figura
4.6 (pg 184) encontram-se as curvas analíticas e seus respectivos gráficos de resíduos.
Tabela 4.8 – Tempos de retenção, curvas analíticas na matriz e coeficientes de correlação linear
Analito tR. (min) Curva Analítica na Matriz Coeficiente de
correlação linear (r)
Moxidectina 15 y = 0,079x + 0,1156 0,9902
Abamectina 19 y = 0,0458x + 0,081 0,9904
Doramectina 20 y = 0,036x + 0,0411 0,9953
Ivermectina 21 y = 0,0382x + 0,0543 0,9926
X: é a concentração do analito em ng g-1 e y a área do analito pela área do surrogate.
4.4.4.3 – Exatidão e precisão (repetibilidade e precisão intermediária)
A exatidão e a precisão, ambas com resultados mostrados na Tabela 4.9 (pg 183),
foram avaliadas mediante ensaios de recuperação em três diferentes níveis de fortificação
(0,5; 1,0 e 1,5 x LMR). A média das recuperações obtidas situou-se na faixa de 94-107%,
dentro do intervalo aceito pelo MAPA (MAPA, 2011) que preconiza um intervalo de 80% a
110%. Os resultados obtidos para a precisão em termos de repetibilidade (n=6) e de
precisão intermediária (n=18), expressos como coeficiente de variação (CV), foram todos
inferiores a 20%, Assim, pode-se verificar que foram obtidos resultados satisfatórios em
termos de exatidão e precisão dentro dos critérios de aceitação preconizados.
4.4.4.4 – Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ)
Com o objetivo de se avaliar os valores críticos de concentração acima do que o
método seja capaz de identificar e quantificar de forma confiável uma substância, levando-
se em consideração a precisão do mesmo, foram calculados CCα e CCβ. O limite de
decisão (CCα) e a capacidade de detecção (CCβ), calculados conforme descrito no item
4.3.9.5 (pg 148), foram obtidos utilizando-se dados da curva analítica na matriz e baseando-
se nos valores de LMR recomendado pelo MAPA (MAPA, 2011). A referida Instrução
Normativa estabelece valores de LMR de 10 ng g-1 para a ABA, DORA e IVER e de 20 ng
183
g-1 para a MOXI, no entanto, para efeito de estudo comparativo, resolveu-se utilizar para a
MOXI o mesmo valor de 10 ng g-1 estabelecido para as demais.
Os valores de CCα obtidos situaram-se no intervalo de 11 a 12 ng g-1, já os valores
de CCβ ficaram no intervalo de 13 a 14 ng g-1. Tais valores encontram-se disponibilizados
na Tabela 4.9 e demonstram a viabilidade do método ser empregado na determinação de
avermectinas e milbemicina em músculo bovino, uma vez que tais valores situam-se
próximos aos valores estabelecidos de LMR conforme preconiza o MAPA (MAPA, 2011).
Tabela 4.9 – Limites máximos de resíduos das avermectinas e milbemicina em
músculo bovino e resultados de exatidão, precisão (repetibilidade e precisão intermediária),
CCα e CCβ.
ANALITO
LMR Nível de Exatidão Precisão CCα CCβ
(ng g-1) Fortificação
Rec. (%) Repetibilidade
(%)
Intermediária
(%) (ng g-1) (ng g-1)
(LMR) (n=6) (n=6) (n=18)
MOXI
0,5 96 13 19
10 1 102 10 9 11 13
1,5 96 9 12
ABA 10
0,5 101 14 19
1 101 10 10 12 13
1,5 94 10 10
DORA
0,5 97 7 16
10 1 102 11 14 12 14
1,5 94 9 7
IVER 10
0,5 97 6 9
1 107 13 9 11 13
1,5 94 11 10
184
Figura 4.6: Curvas analíticas na matriz e seus respectivos gráficos de resíduos
y = 0,079x + 0,1156
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25 30
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica MOXI
-0,15
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 10 20 30
Res
ídu
os
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos MOXI
y = 0,0458x + 0,081
0
0,5
1
1,5
0 5 10 15 20 25 30
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica ABA
-0,15
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0 10 20 30R
esíd
uo
s
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos ABA
y = 0,036x + 0,0411
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25 30
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica DORA
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0
0,02
0,04
0,06
0 10 20 30
Res
ídu
os
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos DORA
y = 0,0382x + 0,0543
0
0,5
1
1,5
0 5 10 15 20 25 30
Áre
a an
alit
o/á
rea
PI
Concentração (ng g-1)
Curva analítica IVER
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0 10 20 30Res
ídu
os
Concentração (ng g-1)
Gráfico de resíduos IVER
185
4.4.5 – Análise de amostras de carne bovina
Objetivando mostrar a aplicabilidade do método desenvolvido e validado, como
método que possa ser aplicado em análise de rotina, foram analisadas 23 amostras
comerciais dos mais variados tipos de cortes de carne bovina, tendo as mesmas sido
adquiridas em diferentes supermercados, em julho de 2014, na cidade de Campinas/SP.
Das 23 amostras analisadas, 6 detiveram resultado positivo frente à presença de
avermectinas, 5 delas evidenciando a presença da ivermectina e uma contendo a
moxidectina. Porém, é válido salientar que as amostras positivas apresentaram níveis de
concentração abaixo do LMR estipulado, tendo sido todas as análises realizadas em
duplicata para cada tipo de amostra. Os antiparasitários com resultado positivo foram
detectados em carnes com maior quantidade de gordura.
Torna-se forçoso evidenciar que o presente trabalho não teve a pretensão de
executar um controle regulatório a nível de fiscalização, e sim verificar a aplicabilidade do
método desenvolvido e validado em amostras comerciais de mercado. Também é
importante reforçar que a presença dos resíduos em amostras com resultados positivo não
foi realizada de forma confirmatória mediante o uso da LC-MS/MS.
4.5 – CONCLUSÃO
O método descrito foi desenvolvido e validado para análise multiresíduo de
avermectinas e uma milbemicina em carne bovina, sendo investigados os analitos
ivermectina, moxidectina, abamectina e doramectina, tendo sido utilizada a emamectina
como padrão interno.
Como etapa de preparo de amostra foi utilizada a extração líquido pressurizado
(PLE), sendo ainda empregada a dispersão da matriz em fase sólida como etapa prévia de
tratamento da amostra. Embora a etapa dispersiva da matriz seja um processo um tanto
exaustivo, o mesmo apresenta simplicidade de execução em termos da não necessidade
de uma melhor formação técnica por parte de operadores. Outra vantagem apresentada
por esse método foi a possibilidade de se partir de uma maior quantidade de amostra,
permitindo que sejam alcançados menores níveis de concentração dos analitos
investigados. O método PLE aqui proposto pode ser considerado como detentor de
facilitadas características de manipulação e execução, possuindo ainda a vantagem de não
utilizar a etapa de clean up fazendo uso da SPE, caracterizando-o como um método mais
186
barato e de mais fácil execução, muito embora ocorra a necessidade do investimento inicial
para a aquisição do equipamento de extração.
Embora trabalhos da literatura cheguem a mencionar que a referida técnica de
extração possua a característica de rápido processamento das amostras, não se deve
esquecer que a mesma ainda realiza a extração da cela de forma individualizada. Futuros
e novos modelos deverão ter como compromisso o fato de poderem processar extrações
de várias celas simultaneamente. Embora vários autores relatem que o PLE venha a
diminuir o consumo de solventes orgânicos, mediante extrações com misturas de soluções
que contenham água, é válido lembrar que a utilização de tais misturas pode levar a um
processo de concentração e/ou evaporação mais demorado, podendo acarretar em maior
custo para o tratamento do extrato obtido.
Na etapa de determinação o método utilizou a combinação HPLC-FLD, tendo
possibilitado a obtenção de adequados valores de recuperação e precisão (repetibilidade e
reprodutibilidade intralaboratorial). Em termos comparativos com a LC-MS/MS, embora a
detecção por fluorescência empregada nesse método não seja uma técnica confirmatória,
a utilização da mesma apresentou vantagens como método de quantificação, apresentando
adequadas detectabilidade e seletividade. A mesma ainda se mostra menos suscetível a
efeito matriz, permitindo assim uma melhor precisão e robustez quando comparada à
técnica de LC-MS/MS. Ainda em termos comparativos, outra vantagem adicional do método
HPLC-FLD proposto é sua melhor viabilidade econômica como técnica a ser implementada
em análises de rotina para fins de triagem e quantificação, não obstante, sendo ainda
necessário o uso de métodos fazendo uso da espectrometria de massas como técnica de
detecção para propósitos de confirmação de identidade.
O método desenvolvido e validado foi aplicado com sucesso na análise de amostras
comerciais de carne bovina adquiridas em supermercados locais, tendo sido evidenciado a
presença de resíduos de avermectinas e moxidectina em 6 das 23 amostras analisadas,
não obstante, todas se apresentaram em níveis de concentração inferiores aos LMR
estipulados.
187
Capitulo 05
CONSIDERAÇÕES FINAIS
188
Com o consequente aumento de assuntos relacionados com as questões de
segurança alimentar que impactam a opinião pública, muitas das vezes envolvendo
contaminações por substâncias tóxicas, a população mundial torna-se cada vez mais
preocupada e atenta a tais fatores de risco.
Fármacos veterinários são amplamente empregados na prática da produção animal
para o consumo humano, podendo os mesmos serem utilizados em extensa escala de
administração, sendo que o desrespeito das boas práticas de uso veterinário poderá
acarretar o risco da presença de resíduos nos alimentos, os quais poderão ocasionar efeitos
adversos a saúde de seus consumidores. Tal desrespeito pode estar relacionado com o
emprego de doses acima das recomendadas, do uso de medicamentos não registrados
para a espécie animal em questão, do abate sem que seja observado o período de carência,
dentre outras circunstâncias.
Com o intuito de se promover a proteção da saúde dos consumidores, muitos países
e diversas organizações internacionais vêm elaborando e adotando legislações específicas.
A metodologia utilizada para a avaliação de risco no que diz respeito à presença de resíduos
de fármacos veterinários em alimentos de origem animal, baseia-se na avaliação
toxicológica do fármaco e estabelecimento de valores de Ingestão Diária Aceitável (IDA),
no qual os valores de Limite Máximo de Resíduo (LMR) são subsequentemente derivados.
Uma das atribuições da química analítica moderna relaciona-se com o provimento
de métodos de análises confiáveis a serem empregados no controle de qualidade e no
consumo seguro de alimentos. O desenvolvimento de tais métodos também pode contribuir
para a proteção da saúde humana e animal, para o monitoramento dos níveis de exposição
dos consumidores, para minimização de impactos ambientais e também em apoio e na
execução de leis e regulamentações que facilitem o comércio internacional.
A determinação de resíduos de fármacos veterinários em matrizes alimentares pode
ser dividida basicamente em duas fases, a primeira envolvendo a etapa de preparo de
amostras e a segunda na quantificação dos analitos por uma técnica analítica confiável. O
processo de preparo de amostras pode constituir uma etapa bastante crítica e de
fundamental importância no método, pelo fato das características de desempenho do
método analítico a serem alcançadas estarem estritamente relacionadas com a composição
final do extrato, devendo-se ter o compromisso de outras características serem ainda
atingidas, como tempo de manuseio despendido com a amostra, o compromisso com um
menor custo de análise, bem como com uma menor quantidade de resíduos gerados.
189
Diante do contexto citado, o presente trabalho apresentou o desenvolvimento e a
validação de dois diferentes métodos analíticos para a determinação multiresíduo de
fármacos em matrizes alimentares de origem animal, usando a cromatografia líquida
associada a dois diferentes sistemas de detecção.
Desenvolvimento de método para determinação de quinolonas em salmão por
UHPLC-MS/MS
O primeiro método desenvolvido e validado visou a determinação multiresíduo de
quinolonas em amostras de salmão.
No processo de preparo de amostra objetivou-se, inicialmente, investigar a
aplicação do método QuEChERS, bem como algumas possíveis modificações, com o intuito
de avaliar seu campo de aplicação em amostras alimentícias de origem animal. Porém
constatou-se que o método de extração aplicado, baseado em uma única e simples etapa
de extração líquido-sólido, sem a necessidade da etapa de clean up, seria suficiente. A
etapa de preparo de amostra teve como características a simplicidade e a rapidez de
execução quando comparada a outros métodos convencionais, principalmente os que
fazem uso da extração em fase sólida (SPE).
Verificou-se que tal método, aliado com as características de desempenho analítico
pertinentes ao emprego do sistema UHPLC-MS/MS, apresentou ganhos relacionados com
detectabilidade e seletividade. Frente a tais peculiaridades, aliados aos adequados
parâmetros de validação alcançados, é possível dizer que o método possui atributos que
se adequem a métodos que possam ser utilizados na rotina de laboratórios de controle e
fiscalização de resíduos de quinolonas em salmão.
O referido método foi aplicado em 25 amostras comerciais de salmão de diferentes
supermercados da cidade de Campinas/SP, não tendo sido encontrada nenhuma amostra
com resultado positivo. Referente ao emprego do sistema de detecção utilizando a
espectrometria de massas sequencial, pode-se afirmar que o uso de analisadores do tipo
triploquadrupolo (QqQ) possui ampla aplicabilidade com um domínio ainda bastante
predominante no campo de análise multiresíduo.
Desenvolvimento de método para determinação de avermectinas e milbemicina em
carne bovina pela extração líquido pressurizado e quantificação por HPLC-FLD
O segundo método descrito foi desenvolvido e validado para análise multiresíduo de
avermectinas e milbemicina em carne bovina. Como proposta de investigação do
190
procedimento de preparo de amostra foi utilizada a extração líquido pressurizado (PLE),
sendo ainda empregada a dispersão da matriz em fase sólida como etapa prévia de
tratamento da amostra. A etapa de dispersão da matriz, embora tenha sido caracterizada
como um processo operacionalmente exaustivo, apresentou simplicidade de execução.
Outra vantagem apresentada pelo método proposto foi a possibilidade de se partir de uma
maior quantidade de amostra, permitindo que fossem alcançados menores níveis de
concentração dos analitos investigados. O método PLE proposto foi considerado detentor
de características de manipulação e execução fáceis, possuindo também a vantagem de
não utilizar a etapa de clean up, fazendo uso da SPE. É válido ressaltar que embora não
se tenha feito uso da etapa de clean up, passando a caracterizar tal etapa como mais rápida
e econômica, deve-se lembrar a necessidade do investimento para a aquisição e
manutenção do equipamento de extração.
Trabalhos da literatura mencionam que a técnica PLE possui a característica de
rápido processamento das amostras, porém deve ser lembrado que a mesma ainda realiza
de forma individualizada a extração de cada cela. No futuro, um compromisso deverá existir
para que novos modelos de equipamentos possam processar várias celas de extração
simultaneamente.
Na etapa de determinação o método utilizou a combinação HPLC-FLD, tendo
possibilitado a obtenção de adequados parâmetros de validação. Embora a detecção por
fluorescência não seja uma técnica confirmatória, foi possível constatar que a mesma
apresentou vantagens como técnica de quantificação quando comparada com o uso da LC-
MS/MS. Seu uso apresentou adequada detectabilidade e seletividade, tendo ainda
mostrado menor suscetibilidade ao efeito matriz, o que passa a garantir ao método uma
melhor precisão e robustez. Para propósito de confirmação de identidade, o uso da
espectrometria de massas como técnica de detecção se faz indispensável, não obstante, o
uso da HPLC-FLD apresentará vantagens econômicas caso haja a necessidade de ser
implementada rotinas de análise de triagem e quantificação dos analitos estudados.
O método foi aplicado na análise de amostras comerciais de carne bovina adquiridas
em supermercados locais, tendo sido evidenciado a presença de resíduos de avermectinas
e moxidectina em 6 das 23 amostras analisadas, porém todas com níveis de concentração
abaixo dos LMR estipulados.
191
CAPÍTULO 06
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