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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
MAYRA ALEJANDRA MARIÑO BOHÓRQUEZ
CARACTERIZAÇÃO DE NANOCELULOSE DO BAGAÇO DE LARANJA E
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS VISANDO SEU
REAPROVEITAMENTO DURANTE A ETAPA DA HIDRÓLISE DE CELULOSE
CAMPINAS
2017
MAYRA ALEJANDRA MARIÑO BOHÓRQUEZ
CARACTERIZAÇÃO DE NANOCELULOSE DO BAGAÇO DE LARANJA E
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS VISANDO SEU
REAPROVEITAMENTO DURANTE A ETAPA DA HIDRÓLISE DE CELULOSE
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto
de Química da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de
Doutora em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ljubica Tasic
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELA ALUNA MAYRA ALEJANDRA MARIÑO BOHÓRQUEZ, E ORIENTADA
PELA PROFA. DRA. LJUBICA TASIC
CAMPINAS
2017
Y esperas, esperas lo único,
lo grandioso que enriquezca tu vida,
lo poderoso, lo fuerte,
el despertar de las piedras...
la profundidad abierta ante tus ojos...
Alegría: ¡hermoso destello de los dioses!
F.Schiller
Com muito amor e empenho
dedico o trabalho aqui apresentado aos meus pais,
Graciela Bohórquez e Álvaro Mariño,
à meu filho Juan Diego e meu esposo Javier Rueda
que sempre me motivaram e suavizaram meus dias
Agradecimentos
Aos meus pais pela paciência dada nos momentos difíceis e pelo apoio ofericado para
dar continuidade à minha formação acadêmica.
A meu filho e esposo pelo apoio e compreensão durante minha ausência nos meses
finais da conclusão de tese.
À prof. Ljubica pela ajuda acadêmica prestada, pela confiança de ter me aceitado
como aluna de doutorado e principalmente pela compreensão durante meus
afastamentos devido a assuntos familiares. Muito obrigada!
Ao prof. Duran pela amizade e conselhos dados sempre com boa disposição.
À Capes pelo fornecimento da bolsa e ao Banco Santander pelo financiamento durante
minha estadia na Inglaterra.
Aos professores que participaram de meus exames e PED, prof. José Augusto Rosário,
prof. Paulo Moran, profa. Camila A. Rezende, prof. Nelson Durán, prof. Fábio Gozzo,
prof. Simon e prof. Marcos Eberlin, por suas contribuições para conclusão desta tese e
para a formação docente, respectivamente.
Ao programa de pós-graduação em química da UNICAMP pela excelente
oportunidade de desenvolver este trabalho e especialmente a Bel pela amabilidade.
À toda a equipe técnica do instituto de química da UNICAMP, pelo apoio e prontitude
durante as análises de minhas amostras, Renata (DRX), Daniel (FESEM e MEV),
Hugo (SEM), Anderson (TEM), Claudia (DLS) e Anderson (RMN).
Ao prof. Chico Adão, técnico do laboratório I-250 pela acolhida, bom humor e pelo
aprendizado nestes anos.
Aos membros do laboratório de química biológica (LQB) que fizeram parte do grupo
durante o desenvolvimento desta pesquisa, em ordem de chegada, Lilian Schultz, Dr.
Fabián Villalta, Dra. Banny Barbosa, Dr. João Pontes, Roney dos Santos, Daniela
Cypriano, Danijela Stanišić, Dra. Lucimara Lopes, Stephanie Fulaz, Caio Barros, Dr.
Boris Maňdic, Paula Moretti de IC, Guilherme Cruz, Amanda Costa, Dr. Lucas
Martins, Tássia Brena, Natália Fregonesi e Christiane Roseto, pela ajuda e pelos
momentos de procastinação e humor. Adicionalmente, á Janainna Chaves da
engenharia química pela ajuda exclusiva com a escrita da tese. Muito obrigada!
Aos amigos que apesar da distancia continuaram em contato me acompanhando nesta
travesía no Brasil.
RESUMO
Os objetivos dessa tese de doutorado abrangem aplicações da nanotecnologia durante a
exploração do bagaço de laranja (BL) para: (1) obtenção de um bionanomaterial de alto valor
agregado – nanocelulose; e (2) aplicação de nanopartículas, desenhadas para o
reaproveitamento de hidrolases, na hidrólise do BL. O BL é um subproduto agroindustrial
obtido após da extração do suco, sendo que cerca de 10 milhões de toneladas desse resíduo
são produzidos no Brasil cada ano. Para a obtenção da nanocelulose foram empregados dois
métodos: enzimático e físico-químico. A via enzimática baseou-se na aplicação de enzimas
isoladas da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, o biomaterial obtido apresentou
diâmetro médio de 10 nm e 63% da cristalinidade. Já o processo físico-químico levou a
obtenção da nanocelulose com diâmetro médio de 20 nm e uma maior cristalinidade de 73%.
Ressalta-se que foram investigados resíduos de restaurante e de indústria – Citrosuco (Matão,
SP, Brasil), sendo que esta última biomassa caracterizou-se por um maior rendimento e um
menor consumo energético durante a etapa de fibrilação. Por outro lado, visando a produção
de etanol de segunda geração (etanol-2G) a partir do bagaço da laranja, em escala piloto, uma
estratégia de imobilização covalente do complexo enzimático comercial de Trichoderma
reesei (Celluclast® 1,5 L) foi desenvolvida. As enzimas foram imobilizadas na superfície
inerte funcionalizada de nanopartículas ferromagnéticas (NPM). A técnica de imobilização
aumentou a vida útil e estabilidade das enzimas, visando uma redução de custos da hidrólise
do BL. As nanopartículas do tipo casca-caroço tiveram como casca: (a) (3-
aminopropil)trietoxisilano (APTES) ou (b) quitosana. As atividades específicas da
endoglucanase e da β-glicosidase foram maiores quando estas ligadas nas NPMs com casca
de APTES. Os dois tipos de NPMs armadas com as enzimas apresentaram atividades
residuais de ao redor de 65% após seis ciclos de hidrólise, contudo, o rendimento e
viabilidade relacionados à liberação de glicose foram melhores para o sistema recoberto com
quitosana.
Palavras-chave: celulose nanofibrilada, nanofibrilas de celulose, glicosil-hidrolases, suporte
de imobilização, celulase
ABSTRACT
The objectives of this doctoral thesis include applications of nanotechnology during the
exploitation of orange bagasse (OB) to: (1) obtain a high added value bionanomaterial –
nanocellulose-; and (2) synhtesis and functionalization of nanoparticles, designed for reuse of
hydrolases during the hydrolysis of OB. OB is an agro-industrial byproduct obtained after the
extraction of the juice, with about 10 million tons of this residue being produced in Brazil
each year. Two methods were used to obtain the nanocellulose: enzymatic and
physicochemical. The enzymatic pathway was based on the application of enzymes isolated
from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri and, the obtained biomaterial showed
average diameter of 10 nm and 63% of crystallinity. The physico-chemical process led to the
production of nanocellulose with an average diameter of 20 nm and a higher crystallinity of
73%. It’s noteworthy that were investigated restaurant and industry waste - Citrosuco (Matão,
SP, Brazil). On the other hand, a strategy of covalent immobilization of the commercial
enzymatic complex of Trichoderma reesei (Celluclast® 1,5 L) was developed aiming the
production of second generation ethanol from the orange bagasse on pilot scale. The enzymes
were immobilized on the functionalized inert surface of ferromagnetic nanoparticles (MNPs).
The immobilization technique increased the shelf life and stability of the enzymes, aiming at a
reduction of costs associated to the hydrolysis of lignocellulosic biomass. The shell-like
nanoparticles had as their shell: (a) (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) or (b) chitosan.
The specific activities of endoglucanase and β-glycosidase were higher when bound in MNPs
with APTES as shell. The two types of MNPs binded with the enzymes showed residual
activities of around 65% after six cycles of hydrolysis; however, yield and viability related to
glucose release were better for the chitosan-coated system.
Keywords: nanofibrillated cellulose, nanofibrils, glycoside hydrolases, cellulase
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 2.1. Multiescala indicando a estrutura hierárquica da biomassa
lignocelulósica e a nanoestrutura da celulose (adaptado de Mettler et al., 2012;
Salajková, 2012 e Hooshmand, 2014)...........................................................................
23
Figura 2.2. Composição molecular predominante da biomassa lignocelulósica
(adaptado de Alonso et al., 2012)..................................................................................
24
Figura 2.3. Arranjo paralelo de moléculas da celulose vegetal (adaptado de
Bhaumik e Dhepe, 2016)...............................................................................................
30
Figura 2.4. Hidrólise ácida da ligação glicosídica β-1,4 na celulose............................ 32
Figura 2.5. À esquerda: mecanismo de reação da hidrólise enzimática da ligação β-
glicosídica e à direita: mecanismo de adsorção enzima-substrato durante
hidrólise.........................................................................................................................
36
Figura 2.6. Morfologia da nanocelulose. (a) nanofibras de celulose e (b)
nanocristais de celulose. Adaptado de Fleming et al., (2000) e Abe et al.,
(2007)………………………………………………………………….……….….......
39
Figura 2.7. Principais reações envolvidas na modificação química da celulose
(adaptado de Sabzalian, 2012).......................................................................................
42
Figura 2.8. Fluxograma das etapas envolvidas no estudo de caracterização da
nanocelulose obtida a partir do bagaço de laranja in natura.........................................
48
Figura 2.9. Fluxograma das etapas envolvidas no estudo de caracterização da
nanocelulose obtida a partir do bagaço de laranja industrial.........................................
51
Figura 2.10. Atividade celulásica da Xac (306) em função do pH............................... 57
Figura 2.11. Espectros FTIR de sólido obtido a partir do processamento de BL por
etapas, sendo que: a linha preta corresponde ao processo com hidrólise enzimática, a
linha cinza corresponde ao processamento sem hidrólise enzimática e a linha
pontilhada corresponde ao bagaço in natura.................................................................
58
Figura 2.12. Difratogramas de raios-X de BL como matéria-prima (linha tracejada),
material obtido após método físico-químico de deslignificação e branqueamento
usando NaOH e NaClO2 (linha cinza) e após um tratamento adicional com enzimas
intracelulares durante 48 h a 45 °C (linha preta)...........................................................
60
Figura 2.13. Espectros CP/MAS RMN de 13
C de fibras celulósicas obtidas por
tratamento químico (linha cinza) e por tratamento químico plus enzimático (linha
preta).............................................................................................................................. 61
Figura 2.14. Fotogradia da mudança visual do BL para cada etapa do processo de
obtenção de nanocelulose..............................................................................................
63
Figura 2.15. Espectros de FTIR da nanocelulose obtida do BN (em vermelho) e do
BI (em verde)................................................................................................................
64
Figura 2.16. Difratogramas dos sólidos resultantes da hidrólise química do bagaço
in natura.........................................................................................................................
65
Figura 2.17. Espectros CP/MAS RMN de 13
C da nanocelulose obtida a partir de
hidrólise alcalina e ácida do bagaço da indústria (linha preta) e do bagaço in natura
(linha vermelha).............................................................................................................
66
Figura 2.18. Micrografias eletrônicas da biomassa do bagaço de laranja (BL) antes
e depois do tratamento enzimático: (a) amostra de BL pré-tratado com NaOH (4% w
v-1
) a 120 °C durante 20 min e NaClO2 (1,7% w v-1
) por 20 min a 120°C em pH 4,5;
(b) superfície da fibra de BL após ação das enzimas de Xanthomonas axonopodis
pv. citri durante 48 h em 45 °C.....................................................................................
67
Figura 2.19. Micrografias eletrônicas de varredura mostrando (a) fibras e feixes de
fibras antes da fibrilação resultantes da hidrólise enzimática do bagaço de laranja
pré-tratado; e (b) o efeito da fibrilação por sonicação apresentando a nanocelulose
em detalhe......................................................................................................................
68
Figura 2.20. Topografia e morfologia das nanofibras de celulose obtidas por
hidrólise enzimática após hidrólise alcalina e sonicação a partir do bagaço de
laranja. Da esquerda à direita: Topografia de imagem de fase e deflexão (escala 2,5
µm).................................................................................................................................
68
Figura 2.21. Micrografia eletrônica das nanofibras de celulose preparadas por
hidrólise alcalina e ácida e o histograma do comprimento............................................
69
Figura 2.22. a) Fotografia do bagaço in natura do início ao fim de sua
transformação em fibras de nanocelulose. Da esquerda à direita são mostrados:
matéria-prima, matéria-prima após moagem e secagem em estufa; resíduo de fibra
após remoção de pectina, fibras tratadas com NaOH; e produto final após o processo
de branqueamento. b) Micrografia eletrônica de varredura por emissão de campo
mostrando as nanofibras de celulose em suspensão como produto final. c)
Micrografia de sonda de varredura de nanofibras em um filme preparado para a
secagem ao ar do material celulósico (topografia) e d) micrografia de sonda
mostrando a imagem de fase..........................................................................................
70
Figura 2.23. Difratogramas dos sólidos resultantes da hidrólise química do bagaço
industrial........................................................................................................................
71
Figura 2.24. a) Fotografia do bagaço industrial do início ao fim de sua
transformação em fibras de nanocelulose. Da esquerda à direita são mostrados:
matéria-prima, matéria-prima após moagem e secagem em estufa; resíduo de fibra
após remoção de pectina, fibras tratadas com NaOH; e produto final após o processo
de branqueamento. b) Micrografia eletrônica de varredura por emissão de campo
mostrando as nanofibras de celulose em suspensão como produto final. c)
Micrografia de sonda de varredura de nanofibras em um filme preparado para a
secagem ao ar do material celulósico (topografia) e d) micrografia de sonda
mostrando a imagem de fase..........................................................................................
73
Figura 2.25. Morfologias dos produtos de hidrólise sonicados (nanocelulose do BI)
representada por micrografias eletrônicas de transmissão (TEM). À esquerda:
imagem em campo escuro a partir do BL, à direita: imagem em campo
claro...............................................................................................................................
74
Figura 2.26 Mecanismo reacional da oxidação do grupo hidroxila primário (C6) da
celulose na presença de TEMPO/NaBr/NaClO em pH 10 (adaptado de Isogai et al.,
2011)..............................................................................................................................
76
Figura 2.27. Espectros FTIR da celulose como material de partida e após
modificação química......................................................................................................
77
Figura 2.28. Curvas de termogravimetria (superior) e derivada da perda de massa
termogravimétrica (inferior) da nanocelulose original e seus
derivados........................................................................................................................
77
Figura 2.29. Espectros RMN para os produtos sólidos de celulose
modificada.....................................................................................................................
78
Figura 2.30. Possíveis reações obtidas por adição de ADH e EDC/NHS à celulose
oxidada por TEMPO-NaBr-NaClO (adaptado de Zhuang et al.,
2017)..............................................................................................................................
79
Figura 3.1. Esquema dos métodos de imobilização enzimática................................... 83
Figura 3.2. Imobilização enzimática covalente: aminopropiltetraetilsilano reage
com glutaraldehído e o N-terminal da enzima (E: enzima - retirado de Hartmann e
Jung, 2009)....................................................................................................................
87
Figura 3.3. Conformação supramolecular dos sistemas enzimáticos por ligação
covalente livres de suportes. (a). Cristalização prévia da enzima (CLEC) – CRY:
cristais da enzima, (b) agregação prévia da enzima (CLEA) – AGG: agregados
enzimáticos, (c) secagem por atomização prévia da enzima (CSDE) – SDE: enzima
atomizada, (d) reticulação direta da enzima solubilizada (CLE) – Adaptado de Souza
et al.,2017......................................................................................................................
89
1018
Figura 3.4. Rota sintética usada na preparação do suporte magnético funcionalizado
(NPMs@TEOS-APTES) e imobilização enzimática por ligação
covalente........................................................................................................................
96
Figura 3.5. Formação da dupla camada elétrica (electrical double layer) para uma
partícula carregada negativamente (negatively charged particle). Inicialmente uma
camada de íons com cargas opostas estará fortemente aderida ao redor da partícula,
chamada camada Stern (Stern layer). A seguir, uma camada difusa de cargas
positivas e negativas completa a dupla camada elétrica (diffuse layer) (tomado de
AZ Nano, 2013).............................................................................................................
106
Figura 3.6. (a). Adsorção de APTES sobre sílica. À esquerda em solvente aprótico
(tolueno) gerando ligações siloxane com os grupos silanol da superfície e os grupos
amina externos. À direita em solvente polar prótico gerando grupos protonados que
imitam a formação dos grupos siloxane. (b) Etapa final de hidrólise e condensação.
Tomado de Kim et al., 2009..........................................................................................
110
Figura 3.7. Espectros FTIR mostrando a funcionalização das NPM testando dois
solventes........................................................................................................................
111
Figura 3.8. Micrografias eletrônicas das NPM@TEOS-APTES e os
correspondentes histogramas calculados pelo programa de domínio público
ImageJ............................................................................................................................
112
Figura 3.9. Distribuição de tamanhos por DLS para NPM@TEOS-APTES............... 112
Figura 3.10. Carga proteica vs. carga imobilizada por ligação covalente. a)
nanosuporte Fe3O4@TEOS-APTES, b) Fe3O4@quitosana...........................................
114
Figura 3.11. Atividade residual das enzimas de Celluclast® imobilizadas em 4 mg
de nanopartículas Fe3O4@TEOS-APTES (à esquerda) e Fe3O4@quitosana (à
direita)............................................................................................................................
115
Figura 3.12. Valores de atividade residual relativa para vários ciclos de hidrólise..... 116
Figura 3.13. Efeito do pH sobre a atividade CMCase livre e imobilizada................... 118
Figura 3.14. Efeito do pH sobre a atividade β-glicosidase livre e imobilizada............ 119
Figura 3.15. Efeito da temperatura sobre a atividade de CMCase livre e
imobilizada....................................................................................................................
120
Figura 3.16. Efeito da temperatura sobre a atividade de β-glicosidase livre e
imobilizada....................................................................................................................
121
Figura 3.17. Processo de separação magnética e reutilização durante a hidrólise
enzimática. a) Solução de NPM funcionalizadas após um ciclo de hidrólise, b)
Efeito obtido após aplicação de um campo magnético externo, c) separação
magnética do sobrenadante com o produto solúvel (glicose) e d) alimentação do
substrato sólido fresco (BL pré-tratado com NaOH e branqueado)..............................
121
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Composição polimérica para diversas fontes de biomassa lignocelulósica
(dados em base seca compilados de Isikgor & Becer, 2015 e Lee et al., 2014).................
22
Tabela 2.2. Matérias-primas e processos de extração físico-químicos para obter
nanocelulose........................................................................................................................
33
Tabela 2.3. Composição do bagaço de laranja em base seca............................................. 56
Tabela 2.4. Teor de celulose e índice de cristalinidade (IC) calculado para cada o
processamento do BL in natura envolvendo hidrólise alcalina e enzimática.....................
62
Tabela 2.5. Índices de cristalinida de (IC) calculados para cada produto obtido após
hidrólise do bagaço in natura envolvendo hidrólise alcalina e ácida..................................
66
Tabela 2.6. Índices de cristalinidade (IC) calculados para cada produto obtido após
hidrólise do bagaço industrial envolvendo hidrólise alcalina e ácida.................................
72
Tabela 3.1. Propriedades de glicosil hidrolases de T. reesei (Vinzant et al., 2001)........... 93
Tabela 3.2. Sistemas de enzimas imobilizadas aplicados na indústria de bioprocessos.... 98
Tabela 3.3. Potencial zeta de NPM@TEOS + APTES obtidos com diferentes condições
testadas para funcionalização..............................................................................................
108
Tabela 3.4. Suportes magnéticos utilizados para imobilizar celulases com os respeitivos
dados dos ciclos de reutilização..........................................................................................
117
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 17
1.2. ESCOPO DA TESE ........................................................................................................................ 19
1.3. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................... 21
2.1. Composição estrutural da biomassa lignocelulósica ....................................................................... 21
2.1.1. Estrutura da parede celular ........................................................................................................... 21
2.1.2. Fracionamento da estrutura lignocelulósica via pré-tratamento físico-químico .................... 24
2.1.3 Resíduo agroindustrial do processamento da laranja .................................................................... 29
2.2. CELULOSE E NANOCELULOSE ................................................................................................ 30
2.2.1. Pré-tratamento da biomassa para obter celulose e nanocelulose .................................................. 31
2.2.2.1. De celulose cristalina à nanocelulose ................................................................................. 37
2.2.2.2. Modificação química da superfície das nanofibras celulósicas: potenciais
aplicações................................................................................................................................................40
2.3. METODOLOGIA .......................................................................................................................... 44
2.3.1. Métodos para caracterização do bagaço de laranja ...................................................................... 44
2.3.2. Métodos para obtenção de nanocelulose do bagaço in natura ..................................................... 47
2.3.2.1. Etapas físico-químicas para obtenção de nanocelulose ............................................................. 47
2.3.2.2. Produção e extração das proteínas intracelulares da Xac para hidrólise enzimática ................. 49
2.3.2.3. Produção e extração das proteínas extracelulares da Xac para hidrólise enzimática ................ 50
2.3.3. Métodos para obtenção de nanocelulose do bagaço industrial ..................................................... 51
2.3.4. Métodos de caracterização de nanocelulose ................................................................................. 52
2.3.4.1. Difração de raios X (DRX) para determinação de cristalinidade .............................................. 52
2.3.4.2. Ressonância magnética nuclear de sólidos (CP/MAS-RMN de 13
C) ........................................ 52
2.3.4.3. Microscopia eletrônica e de sonda ............................................................................................ 53
2.3.5. Funcionalização de nanocelulose do bagaço in natura ................................................................ 53
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................... 54
2.4.1. Caracterização do bagaço de laranja ............................................................................................ 55
2.4.2. Caracterização de nanocelulose do bagaço in natura .................................................................. 56
2.4.2.1. Análises estruturais das fibras de nanocelulose obtidas aplicando-se enzimas intracelulares e
extracelulares de Xac (306) ....................................................................................................................56
2.4.3. Análises estruturais e comparação das fibras de celulose obtidas aplicando-se tratamentos físico-
químicos ao bagaço in natura e ao bagaço industrial ............................................................................ 63
2.4.3.1. Efeitos observados por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR).....................................................................................................................................................64
2.4.3.2. Efeito do tratamento físico-químico sobre a cristalinidade da celulose do bagaço in
natura:.....................................................................................................................................................64
2.4.3.3. Análises morfológicas das fibras de nanocelulose obtidas a partir de bagaço in natura ..........67
2.4.3.3. Efeito do tratamento físico-químico sobre a cristalinidade da celulose do bagaço industrial ...71
2.4.3.4. Microestrutura das fibras de celulose do bagaço de laranja industrial ...................................... 73
2.4.4. Efeitos da funcionalização de nanocelulose do BL in natura ...................................................... 75
2.5. CONCLUSÕES E PERPECTIVAS ................................................................................................ 79
3. IMOBILIZAÇÃO COVALENTE DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS ............................................ 81
3.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................ 82
3.1.1. Métodos de imobilização enzimática ........................................................................................... 82
3.1.2. Nanopartículas como suportes de imobilização para glicosil-hidrolases ..................................... 92
3.1.2.1. Imobilização de celulases e β-glicosidases em NPM de magnetita .......................................... 95
3.1.3. Aplicações das enzimas imobilizadas .......................................................................................... 97
3.2. Metodologia .................................................................................................................................. 100
3.2.1 Métodos e análises da imobilização de celulase e β-glicosidase em nanopartículas magnéticas
funcionalizadas .....................................................................................................................................100
3.2.1.1. Síntese de nanopartículas ferromagnéticas (NPMs) ................................................................ 100
3.2.1.2 Funcionalização das NPMs com organosilano (APTES) ......................................................... 100
3.2.1.3. Funcionalização das nanopartículas magnéticas com quitosana ............................................. 101
3.2.1.4. Imobilização covalente de enzimas ......................................................................................... 101
3.2.1.5. Determinação das atividades enzimáticas ............................................................................... 102
3.2.1.6. Experimentos para reciclo das enzimas imobilizadas ............................................................. 104
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 104
3.3.1. Síntese e caracterização das NPM .............................................................................................. 104
3.3.1.1. Avaliação da funcionalização por grupo amina ...................................................................... 106
3.3.1.2. Determinação da microestrutura do suporte funcionalizado ................................................... 111
3.3.2. Processos para avaliar a imobilização de enzimas com NPM .................................................... 113
3.4. CONCLUSÕES FINAIS ............................................................................................................... 122
4. REFERENCIAS ............................................................................................................................... 125
17
1. INTRODUÇÃO
A crescente demanda energética junto com o constante desenvolvimento
tecnológico têm gerado desafios em torno da viabilização de indústrias sustentáveis a fim de
combater problemas ambientais. Esta premissa consiste principalmente na utilização de
matéria-prima renovável que atenda as altas demandas atuais de energia e produtos químicos,
além de reduzir as emissões de gases nocivos associados ao uso de combustíveis derivados do
petróleo e reduzir a poluição gerada por processos industriais tradicionais de síntese química.
No Brasil, destaca-se a produção renovável de etanol como principal processo
biotecnológico na matriz energética. Este processo tem sido impulsionado por políticas
ambientais do país que buscam comercializar a produção deste combustível renovável a
preços competitivos através da indústria sucrooalcoleira. No entanto, a produção de bioetanol
a partir de fontes lignocelulósicas, ou etanol de segunda geração (2G), se-apresenta também
como uma técnica de grande interesse uma vez que permitiria o aproveitamento de resíduos
agrícolas, os quais representam uma grande fração da biomassa disponível no mundo. Tendo
em vista esta vasta disponibilidade, a utilização deste tipo de recurso lignocelulósico
renovável para geração de energia ou biomateriais pode reduzir o problema ambiental
relacionado à geração de resíduo sólido e não aumentaria a demanda do uso de solos para a
produção de insumos alimentícios (De Souza, 2011).
Em geral, a conversão dos polissacarídeos da biomassa para produção de etanol-
2G consiste nas seguintes etapas: pré-tratamento (fracionamento da estrutura supramolecular),
hidrólise dos componentes macromoleculares, fermentação e separação de produtos. Sabe-se
que as etapas iniciais limitam o rendimento final, deste modo sua otimização deve ser
estudada como uma etapa chave na viabilização do bioprocesso de conversão de biomassa
lignocelulósica.
O pré-tratamento de biomassa lignocelulósica exige o fracionamento das barreiras
físicas e químicas da formação coesa de seus principais componentes (celulose, hemicelulose
e lignina). Nesta etapa são geralmente usados métodos físico-químicos por serem eficientes
durante a operação contínua do processo (e. g., hidrólise alcalina e explosão a vapor), sendo
assim expostos a celulose e a hemicelulose a serem hidrolisados para liberar açúcares
18
fermentáveis. A eficiência desta etapa é estimada principalmente pela preservação da celulose
e a depolimerização da hemicelulose, enquanto a viabilidade é relacionada principalmente
com um baixo consumo energético (Chaturvedi e Verma, 2013).
No entanto, a fase hidrolítica posterior pode ser efetuada com alta especificidade
usando enzimas hidrolases em condições brandas ou hidrólise química em condições
moderadas ou drásticas. A hidrólise enzimática é a opção mais adequada para produção de
biocombustíveis uma vez que nestas condições são liberados os açúcares fermentáveis sem
risco de degradação ou inibição por celobiose. Contudo, condições de hidrólise moderadas a
drásticas são mais poluentes do que a hidrólise enzimática, porém são especialmente
empregadas para valorizar o material sólido resultante: nanofibrilas e nanocristais de celulose,
duas possíveis morfologias de um biomaterial de alto desempenho obtido usualmente após
hidrólise ácida e fibrilação mecânica das fibras de celulose. A nanocelulose é um composto
biodegradável, biocompatível e com propriedades mecânicas diferenciadas que pode ser
funcionalizado e aplicado para o aprimoramento das propriedades mecânicas de
nanocompósitos, sendo nesta aplicação destacadas as nanofibras como um bom agente de
reforço devido a sua maior área superficial (Bhatnagar e Sain, 2005).
Adicionalmente, sabe-se que a principal desvantagem do uso de enzimas para
produção de etanol-2G é o processo custoso associado à obtenção das enzimas de interesse
em processos contínuos. Entretanto, uma estratégia desenvolvida para diminuir custos dos
biprocessos é a imobilização de enzimas. Vários métodos de imobilização podem ser testados
a fim de diminuir a perda de atividade por um período de tempo que atenda as exigências da
aplicação industrial, tais como: encapsulamento, adsorção, inclusão e ligação covalente.
Entretanto, a fim de abaixar os custos de manufactura dos bioprocessos, a imobilização de
enzimas em suportes sólidos se destaca uma vez permite a recuperação e reutilização destes
biocatalisadores, além de possibilitar diversas conformações de reatores. Neste sentido, a
maior contribuição para o bom desempenho da enzima imobilizada é dado pelo suporte
(Mendes et al., 2011).
Além da indústria da cana de açúcar, no Brasil destaca-se a indústria da laranja
como uma enorme fonte de resíduos agroindustriais a serem aproveitados como matéria
celulósica renovável. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa deu início aos estudos sobre a
utilização do bagaço de laranja (BL) como matéria-prima dos seguintes produtos: etanol-2G,
hesperidina, d-limoneno e nanocelulose (Awan et al., 2013; Tsukamoto et al., 2013; Cypriano
19
et al., 2017). O presente estudo está focado na produção e caracterização de nanocelulose
(morfologia, cristalinidade e estabilidade térmica) e na etapa de hidrólise de celulose para
produção de etanol-2G e nanocelulose a partir do BL. Além disso, um agente acoplador é
preparado a partir da carboxilação das fibrilas de celulose superfíciais pelo agente oxidante n-
oxil tetrametilpiperidina (TEMPO) através de íons nitroxilo. A modificação visa a formação
de compósitos por entrecruzamento com grupos amina incorporados neste polímero.
1.2. ESCOPO DA TESE
O uso de matérias primas renováveis assim como o aproveitamento de resíduos
agrícolas são fatores de vital importância para a crescente demanda mundial energética. Neste
contexto, o Brasil encontra-se em posição de destaque, uma vez que possui uma alta
biodiversidade e produção agrícola. Isto ocorre já que a citricultura é uma das atividades
agrícolas representativas do Brasil e caracteriza-se por uma safra de normalmente duas ou três
floradas por ano com preservação do solo após colheita e a geração de um subproduto ideal
para produção de bioetanol (alto conteúdo de açúcares livres e baixo teor de lignina). Isso
gerou uma oportunidade para o nosso grupo de pesquisa: caracterizar e explorar o bagaço de
laranja (BL-Citrosuco, Matão, SP).
A produção no Brasil deste resíduo agroindustrial apresenta ao redor de 10
milhões de toneladas por ano que são subutilizadas. Neste sentido, visando a importância
econômica do bagaço de laranja (BL) para o setor da agroenergia, duas abordagens
independentes foram analisadas a fim de aproveitar o BL como biomassa lignocelulósica.
Inicialmente foram estudadas técnicas de hidrólise enzimática com extratos
proteicos de baixo custo, isto para conhecer seu efeito sobre o material celulósico isolado a
partir de BL in natura por transformação físico-química.
Dessa maneira, a parte inicial deste projeto foi o estudo da etapa de
fracionamento, hidrólise e branqueamento do BL para obtenção de material celulósico,
comparando os materiais obtidos com hidrólise enzimática e com hidrólise química após o
processo de fibrilação aplicado para obter nanofibras. A caracterização de nanocelulose
refere-se principalmente à cristalinidade e morfologia deste biomaterial. O capítulo 2 abrange
então a obtenção, caracterização e funcionalização química de nanocelulose do BL.
20
Uma segunda abordagem refere-se à hidrólise branda de celulose do BL usando
enzimas comerciais imobilizadas em nanopartículas magnéticas (capítulo 3), para obter assim
a glicose como principal açúcar de interesse na biotecnologia para produção de etanol-2G e
derivados. Através desta técnica foi possível avaliar a recuperação magnética e reutilização do
complexo enzimático Celluclast. A estratégia estudada compreendeu também a síntese,
funcionalização e caracterização de nanopartículas magnéticas (NPM) a fim de incorporar
grupos amina neste suporte sólido e favorecer assim a ligação covalente por entrecruzamento.
1.3. OBJETIVOS
Esta pesquisa possui dois objetivos gerais e os correspondentes objetivos específicos
associados às duas partes principais:
Melhorar a obtenção e caracterização de nanocelulose a partir do bagaço de laranja.
Isolar nanocelulose a partir de bagaço industrial e bagaço in natura de laranja.
Comparar as propriedades físico-químicas do material obtido por processos físico-
químicos e enzimáticos.
Modificar os grupos funcionais da superfície de nanofibras de celulose visando a
formação de nanocompósitos por ligação cruzada.
Desenvolver um método de hidrólise enzimática economicamente viável como
segunda fase de preparação da biomassa na produção de etanol-2G.
Sintetizar nanopartículas magnéticas (NPM) e revertí-las com material inerte.
Estabelecer as condições de síntese para funcionalizar a superfície de NPM inertes
a fim de imobilizar enzimas comerciais tais como: Celluclast®.
Avaliar a atividade enzimática do sistema imobilizado e a estabilidade em função
de pH e temperatura.
Estudar a viabilidade da reutilização de enzimas imobilizadas em processos de
hidrólise de celulose do BL.
21
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Composição estrutural da biomassa lignocelulósica
Com um valor estimado de 1,3x1010
de toneladas métricas ou megagramos por
ano, a biomassa lignocelulósica é considera a matéria-prima renovável disponível mais
abundante do planeta. Isto torna a produção de biocombustíveis de segunda geração e demais
produtos químicos de valor agregado, uma das tecnologias de interesse da química verde a ser
concorrente da indústria limitada baseada no petróleo como matéria-prima. Contudo, o
processamento desta biomassa exige principalmente a liberação dos açúcares que compõem
alguns polímeros da estrutura interna desta fonte natural. Industrialmente, a viabilização deste
processo apresenta vários desafios, uma vez que esta conformação interna é altamente robusta
e estável devido a componentes como a lignina que se aderem aos polissacarídeos (celulose e
hemicelulose) dificultando sua desestruturação. A análise das condições de reação deste
processo de fracionamento físico-químico deve ser realizada a fim de garantir um método
custo-efetivo industrialmente, sendo um método sustentável aquele que presente um impacto
ambiental baixo, i.e. baixa quantidade de efluentes (Lee et al., 2014).
Em seguida será exposta a configuração da biomassa lignocelulósica e serão
relacionadas às abordagens físico-químicas que devem ser estudadas para sua desconstrução
com o intuito de obter o material celulósico de interesse.
2.1.1. Estrutura da parede celular
As fontes de lignocelulose podem ser classificadas como: resíduos agrícolas
(tronco de palmeira, resíduos do processamento de fruta e alimentos, i.e. palha, bagaço e
casca), resíduos florestais (softwood e hardwood), e resíduos industriais/urbanos (resíduo de
papel e madeira de demolição). Em geral, apresentam uma parede celular formada por uma
matriz polimérica de celulose, hemicelulose e lignina. Cada fonte de biomassa apresenta uma
composição química particular destas biomoléculas em função das condições durante o
crescimento, não obstante, a constituição de cada gênero geralmente é mantida (Tabela 2.1).
A estrutura hierárquica possui uma conformação constante independente da fonte
lignocelulósica e abrange vários níveis de organização molecular. A escala molecular menor
compreende de 10-9
a 10-10
m e compreende os constituintes poliméricos abaixo descritos:
22
Tabela 2.1. Composição polimérica para diversas fontes de biomassa lignocelulósica (dados
em base seca compilados de Isikgor & Becer, 2015 e Lee et al., 2014)
Fonte Material
lignocelulósico
Celulose
(%)
Hemicelulose
(%)
Lignina
(%)
Floresta
Hardwood 40-55 24-40 18-25
Softwood
42-50
25-35 25-30
Resíduos da
agroindústria
Cascas 28-36 12-36 14-20
Talhos 25-45 16-35 15-25
Palhas 30-40 20-35 6-20
Bagaço de fruta 40-50 15-25 10-20
Gramíneas 25-40 35-50 10-30
Resíduos
industriais/urbanos
Polpa/papel 40-70 10-20 5-10
i.Celulose (homopolímero semicristalino linear de ligações β-1,4 de glicose);
ii. Hemicelulose (heteropolímero amorfo ramificado de ligações β-1,4 entre hexoses e
pentoses);
iii. Lignina (heteropolímero amorfo de ligações tipo olignol fenilpropano oxigenadas com
substituições hidroxil e carbonil).
A composição e o grau de polimerização tanto da cadeia linear como das
ramificações dos heteropolímeros variam para cada tipo de espécie vegetal. As unidades mais
repetidas são geralmente acetil, arabinosil e gliconosil para xilanos da hemicelulose e,
hidroxifenil, guaiacil e siringil para lignina (Figura 2.1 e 2.2).
Outros componentes poliméricos estão também presentes dependendo da origem
do resíduo agrícola. Principalmente os resíduos de frutos cítricos apresentam alto teor de
pectina, gel polimérico predominantemente linear de ligações α-1,4 entre ácido galacturônico
interrompido ocasionalmente por unidades de L-ramnose e por regiões de ácido galacturônico
metoxilado (Mishra et al., 2012). Adicionalmente, moléculas orgânicas de menor massa
molecular e íons inorgânicos apresentam-se como componentes minoritários (extrativos),
como óleos essenciais, resinas, compostos bioativos, etc (Serpa, 2012; Hooshmand, 2014).
23
Figura 2.1. Multiescala indicando a estrutura hierárquica da biomassa lignocelulósica e a
nanoestrutura da celulose (adaptado de Mettler et al., 2012; Salajková, 2012 e Hooshmand,
2014).
A seguinte escala da estrutura hierárquica é a agregação da celulose através de
ligações de hidrogênio intra, intermoleculares e interplanares formando folhas, as quais, em
seguida, se empacotam gerando microfibrilas. Estes elementos são cobertos por agregados de
hemicelulose de menor magnitude e com espaços complementares de lignina interconectada
por ligações éster e éter (10-8
a 10-7
m).
A multiescala da biomassa continua com um arranjo multicelular poroso (Figura
2.1) compreendendo um núcleo (lúmen) rodeado por cavidades maiores de natureza amorfa
contendo predominantemente lignina (parênquima ou lamela média-10-5
a 10-4
). Finalmente, a
macroestrutura termina com a camada externa da parede primária que envolve a membrana
celular (0,1-0,2 µm) e a parede secundária constituída por três camadas com diferente
composição protetora e orientação microfibrilar (1-5 µm). Uma fina camada rica em lignina
recobre externamente o sistema da parede secundária (S1), enquanto a camada intermediária
(S2) é mais fina e contém alto teor de microfibrilas de celulose orientadas paralelamente ao
eixo celular (5-30°). A última camada está conformada por hemicelulose e microfibrilas de
celulose orientadas transversalmente (S3) (Mettler et al., 2012).
24
Figura 2.2. Composição molecular predominante da biomassa lignocelulósica (adaptado de
Alonso et al., 2012).
Conforme a estrutura multicelular da biomassa apresenta maior resistência
mecânica, e.g. resíduos florestais como madeira, um maior conteúdo de lignina envolve a
estrutura hierárquica mantendo as fibras mais enlaçadas. Esta organização gera uma maior
capa protetora das microfibrilas de celulose, consequentemente, este material possui uma
maior resistência ao fracionamento e à hidrólise dos componentes poliméricos (Lee et al.,
2014). Os resíduos de frutas e cereais, entretanto, apresentam geralmente menor teor de
lignina e maior alinhamento das microfibrilas de celulose nas camadas externas da parede
secundária resultando em fibras de alta rigidez (Hooshmand, 2014).
2.1.2. Fracionamento da estrutura lignocelulósica via pré-tratamento físico-
químico
A estrutura 3D da biomassa apresenta uma organização celular de várias escalas
baseada na conexão das resistentes microfibrilas de celulose com aglomerados menores de
hemicelulose e lignina. A fragmentação deste sistema em suas unidades poliméricas ocorre
geralmente aplicando um pré-tratamento físico-químico. A resistência desta estrutura a ser
desconstruída (recalcitrância) depende principalmente da composição e do tipo de biomassa,
sendo assim necessária uma otimização das condições do pré-tratamento em geral para cada
25
gênero de biomassa. Os componentes de natureza amorfa geralmente são degradados após
serem fracionados, no entanto, o uso de técnicas físico-químicas de fracionamento apresenta
várias vantagens comparadas com as técnicas termoquímicas (e.g. explosão a vapor,
liquefação ou gasificação), tais como: maior eficiência, menor demanda energética e maior
controle da ruptura estrutural uma vez é possível selecionar o grau de depolimerização e o
componente a ser solubilizado a través da seleção adequada do reagente e as condições de
reação (Lee et al., 2014).
As técnicas físico-químicas destacadas até agora por serem mais promissoras para
durante sua aplicação em escala industrial, devido principalmente ao seu baixo custo e
eficiência, são:
i. Explosão a vapor e hidrólise alcalina: técnica amplamente usada para eliminar lignina e
parcialmente hemicelulose da estrutura lignocelulósica. Neste método, a estrutura da celulose
é conservada e mais acessível para hidrólises subsequentes.
Um material com alto teor de lignina geralmente precisa de condições drásticas de
vapor saturado (6,9-48,3 bar e 160-260 °C) para ser fracionado por explosão a vapor. Após
alguns segundos ou minutos, a pressão de vapor é rapidamente reduzida até pressão ambiente
a fim de aumentar a porosidade e a área superficial interna e, isto leva a um inchaço da
celulose. Não obstante, em meio alcalino as ligações éster intermoleculares da lignina são
saponificadas, gerando assim um sal carboxílico, um álcool e, rompendo o entrecruzamento
com a celulose e a hemicelulose. Além disso, no meio alcalino as condições térmicas
necessárias geralmente são brandas ou moderadas (temperaturas inferiores a 160 °C), sendo
até mesmo possível o pré-tratamento em água líquida quente, dependendo da fonte de
biomassa e são geralmente usados os seguintes reagentes: NaOH, Ca(OH)2, KOH, hidrazina,
e NH4OH (Lee et al., 2014).
A lignina é degradada por rompimento das ligações aril-éster liberando assim
ácido ferúlico e ácido p-cumarílico predominantemente, além de serem liberadas as
substituições da hemicelulose por grupos acetil e ácido urônico.
Para biomassa com baixo teor de lignina existe uma técnica efetiva para
desorganizar a estrutura mediante o uso de amônia líquida em uma razão 1:1 ou 1:2 para
biomassa-amônia. Este método conhecido como AFEX (ammonia fibre/freeze explosion)
consiste também na redução repentina da pressão do recipiente com a biomassa (explosão),
26
sendo que é utilizada temperatura moderada (60-100 °C) e altas pressões (17-21 bar).
Contudo, os métodos físico-químicos em meio alcalino separam parcialmente a celulose dos
outros componentes da matriz polimérica, sendo assim requerida uma etapa adicional para
purificação da celulose (Braumik e Dhepe, 2016).
ii. Hidrólise ácida. Os íons hidrônio quebram as ligações inter e intramoleculares entre a
celulose, a hemicelulose e a lignina. No entanto, o meio ácido não interrompe a estrutura
interna da lignina, mas sim as ligações β-glicosídicas dos polissacarídeos celulose e
hemicelulose. Neste processo é possível dissolver frações amorfas da celulose liberando
monômeros de glicose, não obstante, a concentração do ácido e as condições de reação devem
ser controladas a fim de evitar degradação dos monômeros a furanos, ácidos, álcoois ou
outros subprodutos. Além disso, uma alta concentração de ácido não é indicada por ser tóxica
e altamente corrosiva, exigindo assim altos custos e cuidados operacionais da planta indústria.
A alternativa viável e ambientalmente aceita é o uso de ácido diluído, sendo também possível
a reutilização da solução ácida durante a obtenção de nanocelulose. Ainda assim, uma
segunda etapa de pré-tratamento em meio alcalino seria necessária para remover a lignina, a
fim de aumentar o acesso à celulose nas etapas de hidrólise posteriores (Lee et al., 2014).
Atualmente a técnica usada comercialmente consiste em bateladas de alta carga de
biomassa (10-40% em massa) a baixas temperaturas (≤160 °C). Os ácidos mais utilizados são:
H2SO4, HCl, HNO3 e H3PO4 em concentrações menores de 4% (Braumik e Dhepe, 2016).
iii. Meio oxidante. Os mesmos efeitos obtidos pela explosão a vapor em meio alcalino
(delignificação e eliminação parcial de hemicelulose) podem ser melhorados com uma
segunda etapa aplicando condições físicoquímicas mais brandas e um agente oxidante como
H2O2, C2H4O3, NaClO2, ácido peracético, ozono ou oxigênio. O modo de ação do composto
ativo (radical superóxido formado em pH alcalino > 12) é fragmentar os anéis aromáticos da
lignina e alguns substituintes da hemicelulose gerando ácidos carboxílicos como produtos
(ácido oxálico, ácido fórmico e ácido acético). Porém, dependendo das condições de reação,
ácidos aromáticos podem ser liberados. Estes compostos são conhecidos por inibir vários
processos de reação, sendo assim necessária sua remoção antes de continuar o processamento
do material celulósico resultante (Wi et al., 2015; Lee et al., 2014; Braumik e Dhepe, 2016).
iv. Solventes orgânicos. Além dos métodos mencionados anteriormente, existem outros
tratamentos químicos promissórios nesta fase da dissociação e hidrólise dos componentes
27
amorfos da biomassa. Diversos solventes orgânicos podem atuar sobre a biomassa
solubilizando a lignina e frações da hemicelulose sob aquecimento. Até mesmo as frações
amorfas e cristalinas da celulose podem ser hidrolisadas, sendo necessário determinar as
condições adequadas a fim de evitar a redução da cristalinidade para futuras aplicações.
Os solventes clássicos testados têm sido álcoois voláteis, uma vez que permitem
uma melhor recuperação por destilação simples (metanol, etanol, acetona, etilenoglicol, álcool
tetrahidrofurfurilo e acetato de etila), junto com ácidos inorgânicos (H2SO4 ou HCl) ou
orgânicos (ácido oxálico ou ácido salicílico) que auxiliam na desconexão da estrutura química
interna sob condições brandas. O mecanismo da desestruturação é similar ao observado em
meio alcalino: quebra de ligações intermoleculares ácido-éster entre lignina e hemicelulose,
assim como rompimento das ligações éter da lignina e em menor extensão das ligações
glicosídicas dos polissacarídeos. Porém, a principal desvantagem destes métodos continua
sendo as altas quantidades de solvente necessárias a fim de prevenir a precipitação de lignina
em meio aquoso. Devem-se considerar estratégias de baixo custo, além do aproveitamento da
lignina e seus derivados para a síntese de outros produtos de valor agregado (Lee et al., 2014).
Recentemente, a síntese de sais líquidos conhecidos como líquidos iônicos
aumentou o leque de possibilidades para dissolver biopolímeros deste tipo. Estes compostos
compreendem um ânion inorgânico e um cátion orgânico, deste modo sua preparação abrange
um amplo número de sais possíveis a serem estudadas como solventes com múltiplas áreas de
aplicação. Caracterizam-se por serem pouco voláteis, estáveis, de baixo ponto de fusão, baixa
viscosidade, baixa ou nula toxicidade, e por atuar como solventes de diversas biomoléculas
em condições brandas sem degradar os monômeros.
Alguns destes compostos se destacam por dissolver predominantemente celulose,
sendo formadas novas ligações hidrogênio interplanares entre as hidroxilas das fibras e os
ânions do solvente. O ânion do cloreto de 1-butil-3-metilimidazol [Bmim]Cl é conhecido por
apresentar este efeito, entre outros sais similares que demonstraram dissolver 3-39% de
celulose com diferentes graus de polimerização (200-6500) na faixa de temperatura de 45-110
°C. No entanto, a celulose resultante apresenta cristalinidade e rigidez reduzidas, sendo assim
susceptível à hidrólise enzimática, bioprocesso de interesse para produção de bioetanol e
derivados. Em geral, foi observada uma característica comum entre os líquidos iônicos que
dissolvem a celulose, os ânions formam fortes ligações hidrogênio com grupos hidroxila, e. g.
cloratos, carboxilatos (acetato, formato, propionato, lactato), dialquil fosfatos, dialquil e
28
trialquil fosfonatos e anions ácidos com grupos amina. A principal tendência dos cátions é de
influir sobre as propriedades físicas do solvente (ponto de ebulição, densidade e viscosidade).
Existem também casos particulares de cátions deste tipo que apresentam baixa solubilização
da celulose, como os compostos acetato de 1-etil-3-metilimidazolio ([3minm]Ac) e acetato de
1-metilimidazolio ([Mim]Ac) (Lee et al., 2014).
Ainda é um desafio a etapa de recuperação destes solventes na indústria para
abaixar os custos de produção (Lee et al., 2014; Braumik e Dhepe, 2016). Entretanto,
diferentes técnicas têm sido desenvolvidas utilizando co-solventes orgânicos apróticos para
precipitar e recuperar a lignina solubilizada e o material celulósico resultante, além de
recuperar e reciclar os solventes iônicos. O solvente aprótico auxilia na solvatação dos cátions
do líquido iônico realçando a solubilidade da celulose e realizando este processo sob uma
temperatura mais baixa (25-50 °C). De igual forma, a técnica pode ser aplicada para aumentar
a solubilidade da lignina, enquanto os produtos solubilizados são recuperados após
precipitação e filtração em solventes polares como água, etanol ou acetona. No entanto, os co-
solventes devem ser destilados para conseguir recuperar e reciclar o líquido iônico. Esta
última etapa aumenta os custos operacionais do processo (Hou et al., 2017).
Além destes métodos, existem outros tratamentos brandos para simplificar a
estrutura da biomassa, como são as técnicas físicas (moagem, esmerilhamento, radiação,
ultrassom), de termoconversão (gasificação e pirólise) e enzimáticas. A aplicação industrial
neste cenário ainda é inviável, pois demanda alto consumo de energia e tempo durante o
processamento da biomassa, além de diminuir a cristalinidade da celulose, característica
desejada somente na produção de biocombustíveis (Braumik e Dhepe, 2016).
Outro pré-tratamento físico-químico promissor recentemente reportado é um
sistema bifásico contendo uma fase orgânica de 2-metiltetrahidrofurano e uma fase aquosa
com NaCl e um catalisador ácido (AlCl3). Inicialmente a fase amorfa de hemicelulose e
lignina é fracionada no meio ácido aquoso. A seguir, ocorre a solubilização destes
componentes na fase orgânica. Finalmente, a hemicelulose é degradada a furfural (altos
rendimentos a 150 °C por 45 min e NaCl 10%), substância de interesse na síntese de vários
produtos (furano e derivados como tetrahidrofurano e álcool furfurílico). A fase aquosa
residual apresenta um material celulósico a ser hidrolisado para produção de nanocelulose ou
bioetanol. A vantagem deste sistema é a separação dos produtos por simples decantação e em
29
seguida o furfural pode ser recuperado da fase orgânica por destilação (ponto de ebulição do
solvente: 80 °C) (Li et al., 2016).
2.1.3 Resíduo agroindustrial do processamento da laranja
O resíduo agroindustrial do processamento da laranja é classificado como uns dos
resíduos da agroindústria mais produzidos mundialmente, sendo o Brasil e os Estados Unidos
as principais indústrias produtoras. Após processamento da fruta para suco, o resíduo gerado é
conhecido como bagaço de laranja (BL) contribuindo com em torno de 50% da massa do fruto
e inclui a casca (epicarpo e mesocarpo), membranas e sementes (Wilkins et al., 2007;
Ferreira-Leitão et al., 2010; USDA, 2012).
A composição química do BL considerando só o resíduo sólido contém: açúcares
solúveis (21-28%), fibras de celulose (16-22%), hemicelulose (12-16%), lignina (0,84%),
pectina (42,5%), cinzas (3,5%), gorduras (1,95%), proteínas (8-10%) e 4,35% de minerais
(Rivas et al., 2008). Enquanto que o BL úmido possui 76-82% de água, 5-8% de açúcares
solúveis (frutose, glicose, sacarose), 3-5% de pectina, 2-3% de celulose, 2-3% de
hemicelulose, 1-2% de flavonóides, 1% de ácidos orgânicos, 1% de proteínas, 0.8% de cinzas
e 1% de óleo (Grohman et al., 1994; Stewart et al., 2008).
O principal carboidrato insolúvel do BL é a pectina, um hidrocolóide presente na
parede primária e nas camadas intercelulares (lamela média) das plantas superiores e que
permite flexibilidade à estrutura sólida contribuindo com a adesão celular (Paiva et al., 2009).
Esse composto contém em torno de 65% de ácido galacturônico conectado por ligações α-1,4-
glicosídicas formando a cadeia de homogalacturonato (May, 2000).
Devido ao alto conteúdo de água, industrialmente o BL é transformado em um
resíduo sólido seco para facilitar o seu manuseio e transporte. O produto resultante é chamado
polpa do flotador, e é obtido pressionando e secando o bagaço de laranja (casca, polpa e
sementes) após a extração de suco. Este resíduo apresenta na sua composição uma grande
quantidade de fibra e açúcar adequados para a produção de etanol-2G e etanol-1G,
respectivamente (Cypriano, 2015).
Além disso, temos disponíveis no Brasil e América Latina como um todo,
resíduos agrícolas de interesse considerados subprodutos que são geralmente descartados ou
incinerados para geração de calor e eletricidade. Em vista deste acúmulo anual do material
30
agrícola, faz-se necessária uma avaliação dos usos potenciais destas biomassas. Uma dessas
propostas é a produção de nanocelulose semicristalina a partir de resíduos agroindustriais,
sendo um biopolímero com múltiplas aplicações.
2.2. CELULOSE E NANOCELULOSE
A celulose é um homopolissacarídeo linear de ligações β-1,4-glicosídicas que
conecta os átomos C(1) e C(4) das moléculas de D-glicose. É o biopolímero mais abundante
da terra, pois é o componente principal das fibras naturais representando em torno de um terço
dos tecidos vegetais. A celulose vegetal encontra-se em forma de fibrilas estabilizadas por
ligações de hidrogênio intermoleculares, interplanares e intramoleculares entre os grupos
hidroxila. Estas entidades possuem um diâmetro entre 2 a 20 nm e comprimento na ordem dos
micrômetros (Azizi Samir et al., 2005) como ilustra as Figuras 2.1 e 2.3.
A celulose nativa consta de fibrilas empacotadas chamadas microfibrilas
constituídas por regiões amorfas (menos ordenadas) e cristalinas com diâmetro em torno de
30-40 µm. Os domínios cristalinos mais densos estão relacionados à homogeneidade deste
componente natural após quebra das interações intermoleculares e separação dos constituintes
da biomassa.
Adicionalmente, um efeito positivo sobre o módulo de Younge o módulo elástico
das fibras de celulose foi observado uma vez as microfibrilas de celulose purificada são
desenlaçadas, gerando assim fibrilas dissociadas de diâmetro menor e baixa densidade (1,3-
1,4 g/cm3) chamadas nanofibras de celulose ou nanocelulose. Estas nanofibras se caracterizam
por um módulo de Young de 140 GPa, maior do que das fibras de vidro, da ordem de 45 GP
(Kaila et al., 2011; Samir et al., 2004).
Além das propriedades mecânicas destacadas, o processamento das microfibrilas
de celulose para obtenção de nanofibras causa outros efeitos desejados no biomaterial:
aumento da área superficial, baixa densidade, baixo coeficiente de expansão térmica e
propriedades óticas interessantes em suspensão aquosa (cadeias poliméricas quirais) (Salas et
al 2014). As nanofibras terão assim suas propriedades realçadas em função da purificação e
nanonização. O mesmo material celulósico pode-se tornar 30 vezes mais leve e três vezes
mais resistente e flexível devido à transformação à escala nanométrica (Morán et al., 2008).
31
Figura 2.3. Arranjo paralelo de moléculas da celulose vegetal (adaptado de Bhaumik e
Dhepe, 2016).
Um material é considerado como nanopartícula uma vez que apresente pelo
menos uma de suas dimensões entre 10-9
-10-7
m. A partir dessa premissa surgiu a
nanotecnologia na década de 1960, área que estuda as novas propriedades dos materiais e sua
manipulação nesta escala métrica (Bathia, 2016). O caso específico da nanocelulose envolve
outro aspecto a ser considerada a fim de melhorar suas propriedades, a cristalinidade do
biopolímero.
2.2.1. Pré-tratamento da biomassa para obter celulose e nanocelulose
A digestão da celulose é um tratamento realizado para aumentar a cristalinidade
do material. Através deste processo são solubilizadas principalmente as regiões menos densas
das fibrilas (amorfas), sendo assim melhoradas a estabilidade e homogeneidade do polímero.
Existem dois métodos predominantes utilizados na indústria para este objetivo:
Hidrólise química. Em meio ácido o átomo de oxigênio da ligação éter da celulose é
inicialmente protonado e substituído por um grupo hidroxila da água e, além disso, são
também esterificados grupos hidroxila por hidrólise em ácido sulfúrico. A celulose
esterificada por grupos sulfato possui carga superficial negativa que favorece a estabilização
das nanofibras em suspensão aquosa, além de evitar a aglomeração, o produto de sulfatação
geralmente interfere em posteriores etapas de funcionalização (Lee et al., 2014).
32
Figura 2.4. Hidrólise ácida da ligação glicosídica β-1,4 na celulose (adaptado de Lu e Hsieh,
2010).
Em meio alcalino a hidrólise de celulose exige condições de reação mais drásticas
(temperatura maior que 150 °C), sendo assim um processo menos empregado. Deste modo, o
meio alcalino é geralmente usado somente como pré-tratamento durante a etapa de
fraccionamento, enquanto a hidrólise ácida é o processo mais usado para hidrolisar a celulose
pela menor demanda energética. Porém, altas concentrações de ácido são necessárias para
conseguir depolimerizar o material e aumentar assim a cristalinidade (50-72% v v-1
). Isto
origina complicações operacionais e maiores custos do reator, por tanto às vezes são
escolhidas concentrações ácidas diluídas e condições moderadas de hidrólise química ou
hidrólise enzimática em condições brandas (Lee et al., 2014).
Através dos estudos sobre obtenção de nanocelulose é geralmente reproduzido um
processo que consta de três etapas: pré-tratamento físicoquímico para fracionar a biomassa, a
seguir uma etapa de branqueamento que completa o processo de purificação da celulose e por
último uma etapa de hidrólise da celulose (regularmente realizada em solução de H2SO4 64%
v v-1
a 45 °C). Diferentes resíduos agrícolas foram empregados para isolar nanocelulose
aplicando esta concentração alta. Destacam-se os produtos apresentados na Tabela 2.2 usando
bagaço de cana, casca de coco e palha de milho. Vemos também outros produtos com
similares cristalinidades resultantes da hidrólise em solução ácida diluída para temperaturas
maiores (tronco de banana, tronco de juta, palha de abacaxi, palha de trigo, casca de soja e
33
resíduo da extração do óleo de palma). Além disso, outro estudo obteve celulose cristalina
através de duas etapas de hidrólise alcalina em condições brandas (Abe e Yano, 2009).
Tabela 2.2. Matérias-primas e processos de extração físico-químicos para obter nanocelulose
Resíduo
agrícola
Pré-tratamento Hidrólise
ácida
Cristalinidade
obtida
Morfologia Referência
Casca de
côco
1. NaOH 2% m v-
1 a 80 °C -2 h
2.Etapa anterior.
3. NaClO2 1% a
70 °C – 1 h
H2SO4
64% v v-1
a 45 °C –
120 min
66% Nanocristais:
6nm de
diâmetro e 80-
500 nm de
comprimento
Rosa et al.,
2010.
Bagaço de
cana
1. NaClO2 2% a
75 °C – 60 min
2. KOH 2% m v-1
a 90 °C -2 h
3. KOH 5% m v-1
a 90 °C -2 h
H2SO4
64% v v-1
a 50 °C –
60 min
72% Nanocristais
20-60 nm de
diâmetro e
250-480 nm
comprimento
Kumar et
al., 2014
Palha de
milho
1. NaOH 2% m v-
1 a 80 °C -4 h
2. H2O2 1,7% v v-
1 a 60 °C – 24h.
H2SO4
64% v v-1
a 50 °C –
20 min
55% Nanocristais
4-10 nm de
diâmetro e
168-610 nm
comprimento
Costa et
al., 2015.
Palha de
trigo
1. NaOH 17,5%
m v-1
a 30 °C -2 h
2. NaOH 2% m v-
1 a 30 °C – 2 h
HCl 1 mol
L-1
a 80
°C – 2 h
78% Nanofibras:
10-80 nm de
diâmetro
Alemdar et
al., 2008.
Casca de
soja
70% Nanofibras:
20-120 nm de
diâmetro
Tronco de
banana
1. NaOH 2% m v-
1 a 30 °C -6 h
2. 137 Pa e 200
°C – 60 min
3. NaClO2 a 50
°C – 60 min
Ácido
oxálico
5% m v-1
a
137 Pa –
60 min
83% Nanofibras:
15-25 nm de
diâmetro
Abraham
et al.,
2011. Tronco de
juta
88%
Palha de
abacaxi
89%
Fruto de
palma
africana
1. NaOH 2% m v-
1 a 95 °C – 60
min
2. H2O2 10% v v-1
a 121 °C.
HCl 2,5
mol L-1
a
105 °C -
30 min
87% Microfibrilas Haafiz et
al., 2013.
Palha de
arroz
1. NaClO2 2% a
70 °C – 1 h
2. KOH 2% m v-1
a 90 °C -2 h
3. KOH 4% m v-1
a 90 °C -2 h
Não
aplicada
76% Nanofibras:
12-35 nm
Abe e
Yano,
2009.
34
Hidrólise enzimática. É a opção mais seletiva para liberar glicose da celulose em condições
brandas. No entanto, embora a demanda energética seja baixa para este bioprocesso, a
produção do complexo enzimático exige tempo e altos custos que limitam sua aplicação.
Esforços para recuperar e reutilizar os biocatalisadores têm sido realizados a fim de baratear
este processo que cliva especificamente a ligação glicosídica, sendo este o objetivo da
segunda parte deste projeto discutido no próximo capítulo.
A identificação de enzimas e otimização de seu desempenho são outros fatores
bastante estudados para aumentar a eficiência dos biorreatores. As enzimas encarregadas de
hidrolisar polissacarídeos pertencem à classe glicosil hidrolases-GH (EG: 3.2.1.-) e são
classificadas em dois grupos: celulases e β-glicosidases. A classificação das enzimas é
realizada por similaridade na sequência de aminoácidos e por comparação dos sítios
hidrofóbicos, gerando assim 112 famílias deste tipo de biocatalisadores originados
predominantemente por micro-organismos. Além do grupo da β-glicosidase, o grupo das
celulases é dividido em dois subgrupos, endoglucanases e exoglucanases. As funções
hidrolíticas das glicosil-hidrolases são:
Endoglucanases (EG, β-1,4-D-glucano glicanohidrolases ou EC 3.2.1.4). Reduzem as cadeias
poliméricas internas aleatoriamente produzindo celooligossacarídeos insolúveis e
celodextrinas solúveis com grau de polimerização de até seis glicoses. Sua ação ocasiona um
decréscimo significativo do grau de polimerização.
Exoglucanases (CBH, β-1,4-D-glicano celobiohidrolases ou EC 3.2.1.91). Cliva as ligações
β-1.4-glicosídicas externas das cadeias liberando celo-oligossacarídeos pequenos como os
dissacarídeos (celobiose).
β-Glicosidase (BGL, β-D-glicohidrolase ou celobiase ou EC 3.2.1.21). Hidrolisa a celobiose e
celodextrinas liberando o monossacarídeo (D-glicose) e controlando a inibição por celobiose
das endoglucanases e das exoglucanases.
Na indústria é destacado o desempenho hidrolítico de fungos capazes de hidrolisar
diferentes substratos. O gênero Trichoderma apresenta uma grande capacidade para secretar
glicosil hidrolases envolvidas na degradação da parede celular vegetal. Além disso, a alta
estabilidade térmica deste sistema enzimática tem facilitado a purificação e aplicação na
produção de etanol-2G.
35
As endoglucanases e celobiohidrolases estão compostas por dois domínios
catalíticos: um grande domínio N-terminal de núcleo catalítico e um pequeno módulo C-
terminal de ligação à celulose, CCD e CBM, respectivamente, por suas siglas em inglês. Os
mecanismos de reconhecimento, ligação, deslocamento e inserção final no sítio ativo do CCD
ainda não estão bem esclarecidos, mas sabe-se que o CBM desempenha um papel importante
na indução da biocatálise através da afinidade pelo substrato. Porém, existem algumas poucas
exceções de celulases que hidrolisam a celulose sem CBM. Entre elas estão a endoglucanase 3
ou Cel12A de T. reesei (TrEG3) e T. harzianum (ThEG3) caracterizadas por adsorção fraca
na superfície do substrato, no entanto, com destacada atividade hidrolítica nas regiões amorfas
da celulose e de oligossacarídeos solúveis. (Prates, et al., 2013). Esses domínios estão
enlaçados por um peptídeo flexível O-glicosilado que atua como linker permitindo a ação
independente da unidade catalítica e do módulode ligação ao substrato (Serpa, 2012).
Globalmente, o mecanismo físico de uma celulase inicia com a adsorção na fibra
de celulose e a seguir a enzima se trasloca progressivamente, sendo que o domínio CBM mais
leve é puxado pelo CCD em cada ação hidrolítica. Já o mecanismo químico envolve a
protonação do oxigênio glicosídico por parte de um resíduo carboxílico da enzima atuando
como catalisador ácido. O seguinte passo é a quebra da ligação por hidrólise do resíduo
enzimático, enquanto a hidroxila assim liberada é adicionada ao carbono anomérico. Este
carbono pode ter uma retenção ou uma inversão de sua configuração espacial, dependendo do
tipo de nucleófilo enzimático envolvido. Dois resíduos de ácidos glutâmico e aspártico estão
relacionados com a inversão da configuração via mecanismo de um passo (estado de
transição), isto ocorre através (Figura 2.5).
Figura 2.5. À esquerda: mecanismo de reação da hidrólise enzimática da ligação β-
glicosídica e à direita: mecanismo de adsorção enzima-substrato durante a hidrólise (adaptado
de Stein et al., 2010).
36
A hidrólise enzimática de celulose apresenta um alto grau de sinergismo,
característica relacionada com a eficácia da ação hidrolítica entre duas ou mais celulases em
sequencia. Deste modo, cada enzima cria progressivamente novos locais de ataque para outras
enzimas do complexo. As celulases de origem fúngica apresentam dois tipos de sinergismo. O
chamado endo-exo sinergismo é geralmente um mecanismo sequencial no qual as
endoglucanases iniciam a hidrólise nas extremidades das cadeias amorfas da celulose
fornecendo uma nova cadeia susceptível à ação das exo-glucanases e gerando celobiose como
produto principal. Adicionalmente, o exo-exo sinergismo é raramente encontrado entre duas
endoglucanases diferentes, mas é nitidamente observado entre determinada exoglucanases
(Wood e McCrae, 1979; Henrissat et al., 1985).
Especificamente, o fungo T. reesei (Hypocrea jecorina) tem sido muito
pesquisado, pois possui um complexo celulolítico extracelular de alta eficiência e estabilidade
que compreende oito endoglucanases (EGI-EGVIII), duas celobiohidrolases (CBHI e CBHII)
e sete β-glicosidases, entre outras proteínas que auxiliam a hidrólise, e.g. swoleninas (Vinzant
et al., 2001).
Várias enzimas têm sido estudadas como agentes hidrolisantes a fim de comparar
os efeitos sobre biomassa pré-tratada com a técnica agressiva de hidrólise ácida. A morfologia
das fibras após a atuação exclusiva de hemicelulases e endoglucanases é de NFC com alta
elasticidade. Uma elevada relação comprimento/diâmetro resultante favorece a formação de
compósitos com boas qualidades mecânicas e as enzimas diminuem a coalescência das fibras
permitindo assim a aplicação de um pós-tratamento de menor consumo energético.
Predominantemente xilanases e endoglucanases comerciais têm sido testadas
sobre diversas biomassas. Uma diminuição da cristalinidade após adição das enzimas foi
outro fator comum nestes estudos (Pääkkö et al., 2008, Satyamurthy et al., 2011, Campos et
al., 2013).. No entanto, não houve variação significativa da cristalinidade da celulose do
tronco de palma pré-tratado após aplicação de xilanases comerciais do fungo Thermomyces
lanuginosas (Hassan et al., 2014).
Exceções referentes ao aumento de cristalinidade foram observadas durante a
hidrólise de cascas de banana com xilanases de Novozymes® (Tibolla et al., 2016) e a
hidrólise de bagaço de laranja pelo cocktail enzimático: pulpzyme HA (Novozymes),
celluclast 1,5L (Novozyme) e β-galactosidase de Aspergillus oryzae (Sigma). A purificação
37
de celulose por enzimas comerciais a partir do bagaço de laranja foi realizada por Junko e
colaboradores (2013). Nanofibras de celulose foram obtidas após sonicação, no entanto, a
caracterização deste biomaterial não foi realizada (dimensões, cristalinidade, rendimento). O
foco desse estudo foi a coprodução de nanofibras de celulose a partir do sólido resultante após
hidrólise enzimática. Os açúcares fermentáveis liberados (aldoses e pentoses) foram
empregados para otimizar a produção de etanol-2G testando vários micro-organismos,
gerando assim uma integração de bioprocessos que viabilizam o uso desta biomassa nas
refinarias.
O uso de enzimas não comerciais tem sido debatido após a avaliação do efeito
negativo das celulases comerciais sobre a cristalinidade. Sabe-se que as celulases comerciais
atuam com alta eficiência sobre as regiões mais resistentes à hidrólise da celulose causando
assim a diminuição do índice de cristalinidade (IC), fator indesejado na co-produção de
nanocelulose. Apesar disso, screening de celulases de Aspergillus niger (Anderson et al.,
2014), de Humicola insolens (Cao a Tan, 2002) e um complexo de celulases e pectinases da
bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Awan et al., 2013) tem demostrado um aumento
do IC durante o processo de obtenção de nanofibras de celulose.
2.2.2.1. De celulose cristalina à nanocelulose
Em geral, as etapas para obter celulose microcristalina consistem em pré-
tratamento envolvendo a dissociação estrutural e a purificação da celulose, assim como a
hidrólise da celulose como etapa química final. Após este processo é necessário um
tratamento físico para dissociar as microfibrilas e conseguir assim a nanocelulose, processo
chamado nanonização ou nanoestruturação, enquanto especificamente a aplicação às
microfibrilas de celulose o processo é fibrilação.
Dependendo das condições de preparação e da fonte lignocelulósica, a
nanocelulose é classificada como:
Celulose nanofibrilada ou nanofibras de celulose (NFC). Fibrilas compridas e emaranhadas
de elevada área superficial similar a uma rede ou espaguete. Possuem um diâmetro de 10-40
nm e comprimento de vários microns (Figura 4a). A configuração de rede adiciona
características únicas ao biomaterial, como excelente agente estabilizante de partículas na
formação de géis e uma grande quantidade de grupos hidroxila na superfície que podem ser
38
funcionalizados a fim de introduzir novas características para potenciais aplicações. A
morfologia da NFC é obtida por hidrólise em condições moderadas ou brandas, como
enzimática, ácida diluída ou simplesmente um tratamento físico de nanonização. Possuem
uma cristalinidade entre 60 a 70%.
O processo de nanonização é usualmente a etapa de maior requerimento
energético, uma vez que a desagregação das microfibrilas demanda a aplicação de altas
pressões para quebrar as inúmeras ligações hidrogênio do estado natural. Diversas técnicas
podem ser usadas para defibrilar celulose nativa. São aqui destacados os métodos mecânicos
de electrofiação, cryocrushing e homogeneização. A primeira é uma técnica eletromagnética
na qual as fibras, e em geral os polímeros, são dissolvidos a temperatura ambiente em 2,2,2-
trifluoretanol e logo introduzidos em uma agulha dispensadora que será submetida a altas
voltagens. O material permanece assim eletricamente carregado a fim de causar repulsão
eletrostática e conforme as gotas são expulsas, são a seguir neutralizadas pela tensão
superficial gerando um fluxo com movimento convectivo de geometria cônica. Isto é gerado
pela migração da carga à superfície do polímero conforme as gotas se afastam da agulha. Uma
placa coletora recebe o jato formando assim nanofibras de diversos tamanhos (Gomes, 2014).
Cryocrushing é uma técnica na qual o material é submergido em nitrogênio
líquido para logo ser fragmentado por elevadas forças de cisalhamento usando um pilão. A
seguir as fibras são dispersas em água e peneiradas com uma malha de 60 mesh. Uma última
técnica de homogeneização é usada industrialmente e consiste no impacto e cisalhamento
produzido por uma válvula batendo sobre um anel em um recipiente com o material em
suspensão aquosa. A suspensão das fibras deve passar várias vezes por este processo para
obter as nanofibras desejadas (Gomes, 2014).
O material processado por homogeneização a alta pressão exige um gasto alto de
energia, no entanto há métodos auxiliares que, quando aplicados previamente, facilitam o
processo de fibrilação. A oxidação do grupo hidroxila do carbono C6 por TEMPO (N-oxil-
2,2,6,6-tetrametilpiperidina) forma grupos carboxílicos na superfície das microfibrilas e
conforme são carregados negativamente propiciam a repulsão eletrostática. Isto propicia
também uma redução no tempo necessário para fibrilar a celulose (Salajková, 2012). Um
tratamento enzimático combinado com o tratamento mecânico também tem demonstrado uma
diminuição no consumo energético da nanonização (Pääkkö et al.,2007; Henriksson et al.,
2007). O homogeneizador é geralmente usado em áreas da saúde, farmacêutica, e cosmética.
39
Técnicas mais complexas como a microfluidização, a ultrasonicação de alta intensidade,
cryocrushing e eletrofiação são geralmente usados em escala laboratorial.
Nanocristais de celulose. Também chamados whiskersou nanowhiskers, possuem
cristalinidade alta (≤80%) e dimensões nas faixas 3-10 nm de diâmetro e 100-300 nm de
comprimento (Hooshmand, 2014). Possuem uma menor relação comprimento/diâmetro sendo
o produto principal da hidrólise em ácido com concentrações altas (Figura 6b).
Figura 2.6. Morfologia da nanocelulose. (a) Nanofibras de celulose e (b) Nanocristais de
celulose. Adaptado de Fleming et al., (2000) e Abe et al., (2007).
Os nanocristais apresentam propriedades reológicas especiais para formação de
géis. Específicamente, os cristais obtidos por hidrólise com HCl não apresentam carga
superficial, deste modo possuem maior tendência à agregação das fibrilas, no entanto,
resultando em um material mais propenso à funcionalização, com menor hidrofibilidade e
menor dispersão em água que aqueles nanocristais obtidos por hidrólise com H2SO4 (Arola,
2015). Contudo, ainda está em debate a homogeneidade das amostras com fibrilas de
nanocelulose em suspensão. Isto devido à falta de uniformidade nos resultados publicados,
principalmente no referente à interpretação entre nanofibras de celulose (NFC), celulose
microfibrillada (CMF) e nanocristais de celulose (NCC).
Em vista disso Desmaisons e colaboradores (2017) apresentaram um método de
várias variáveis para definir quantitativamente a qualidade de uma amostra de nanocelulose
em termos principalmente do grau de fibrilação após refinamento. Portanto, o estudo propôs o
40
uso conjunto de algumas técnicas de fácil aplicabilidade na indústria a fim de classificare
padronizar os materiais celulósicos como fibras (escala milimétrica), fibras pobremente
fibriladas (escala micrométrica) e nanofibrilas (fibras com diâmetros menores do que 100
nm).
Algumas das propriedades físicas para diferenciar amostras de nanocelulose de
amostras de microcelulose são: o valor de retenção da água, o fracionamento mecânico, a
turbidez e a viscosidade. Adicionalmente, os métodos ópticos e espectroscópicos como a
análise de transmitância da luz, o espalhamento dinâmico da luz e a espectrofotometria
ultravioleta-visível oferecem também uma contribuição importante neste caso.
Para fins quantitativos, os autores do estudo anterior analisaram diferentes
amostras de nanocelulose e realizaram a caracterização baseada no uso complementar de
métodos ópticos, espectrofotométricos, medidas de turbidez e análise das propriedades
mecânicas. Após uma análise de componentes principais (PCA) foi possível simplificar as
variáveis correlatas estudadas e definir assim uma equação de quatro variáveis (fração
nanométrica determinada por gravimetria-%, turbidez-NTU, módulo de Young-GPa e
tamanho macroscópico determinado com um microscópio ótico-µm-2
) para finalmente definir
um novo índice de qualidade das nanofibras de celulose.
2.2.2.2. Modificação química da superfície das nanofibras celulósicas: potenciais
aplicações
A modificação química dos grupos hidroxilas reativos localizados na superfície
das nanofibras aumenta o número de possíveis aplicações da nanocelulose. Várias estratégias
foram desenvolvidas a fim de diminuir o caráter polar da superfície fibrilar e aumentar assim
a adesão interfacial e a dispersão em solventes apolares. Sabe-se que a reatividade dos grupos
hidroxilas segue a ordem OH-C6>>OH-C2>OH-C3 e é relacionada com os efeitos estéreo
espaciais da estrutura supramolecular na celulose mostrada na Figura 2.7 (Sabzalian, 2012).
Uma das propriedades que podem ser manipuladas pela modificação da celulose é
a resistência mecânica dos compósitos, a qual depende principalmente dos componentes da
matriz, no entanto, a extensão do aumento da resistência à tração e o módulo de Young
dependem também da fração mássica da fibra de celulose (Kalia et al., 2011).
41
Deste modo, a reologia do material pode ser também definida em função da fração
de celulose do compósito, existindo diversas aplicações já exploradas em termos das
propriedades reológicas (Arola, 2015): hidrogel (scaffolds porosos, microeletrônica, óptica,
farmacêutica, odontologia, etc), fase de reforço em compósitos (produtos para embalagens,
para construção, automotivos, eletrônicos), filme fino (eletrônicos, baterias, recobrimentos,
liberação de fármacos e biossensores) ou estabilizante de emulsões e espumas (indústria
alimentícia, farmacêutica e cosmetologia).
A acetilação parcial é a derivatização mais comum da celulose microcristalina. O
grau de substituição do grupo acetila é o número médio de grupos hidroxila substituídos por
unidade de glicose e influência sobre as propriedades físicas resultantes. A modificação
ocorre em duas etapas, sendo inicialmente aplicada uma hidrólise alcalina e posteriormente
uma eterificação por adição de ácido monocloroacético (AMC) resultando em um material
polieletrólito geralmente amorfo com maior solubilidade em água apresentado na Figura 2.7
(Sabzalian, 2012).
Além disso, sabe-se que a higroscopia diminui e a transparência aumenta durante
a formação de compósitos com celulose acetilada. Outra vantagem deste derivado é o
aumento da estabilidade térmica (Khalil et al., 2012).
Oxidação. Outro derivado da celulose é obtido pela oxidação com ácido peracético,
permanganato, peróxido de hidrogênio-clorito ou periodato. Nesta modificação a ligação entre
C2 e C3 é interrompida gerando um derivado 2,3-dialdeído mostrado na Figura 2.7 que pode
apresentar um decréscimo da cristalinidade por altos níveis de oxidação (maiores de 30%). O
derivado 2,3-dialdeído da celulose é geralmente usado como intermediário para obter grupos
carboxílicos ou bases de Schiff (Sabzalian, 2012).
Os carboidratos funcionalizados com grupos carboxílicos são usualmente
utilizados para entrecruzamento com outros biopolímeros contendo grupos amina como a
quitosana ou compostos bioativos como o ácido hialurônico. Entre as aplicações da química
verde, pelo entrecruzamento de derivados carboxílicos de carboidratos destacam-se a
liberação de fármacos, hidrogéis biocompatíveis, formação de compósitos biodegradáveis e
estabilização de suspensões coloidais.
42
Figura 2.7. Principais reações envolvidas na modificação química da celulose (adaptado de
Sabzalian, 2012).
Um método de oxidação efetuado para obter diretamente grupos carboxílicos na
celulose é a oxidação mediada pelo radical TEMPO, um radical nitróxido muito estável. Além
do catalisador, um oxidante primário e um co-oxidante são requeridos em quantidades
catalíticas nesta reação em meio alcalino, sendo geralmente usados NaClO e NaBr,
respetivamente. Duas moléculas do radical TEMPO são consumidas per unidade de glicose
oxidada e o co-oxidante é adicionado a fim de aumentar a reatividade através da formação do
íon hipobromato (OBr-) e aumentar assim a geração do derivado carboxílico no C6 da
celulose mostrado na Figura 2.7 (Johnson, 2010).
Agentes acopladores. Outra modificação das hidroxilas celulósicas é a aplicação de agentes
acopladores, moléculas menores que possuem grupos mais reativos do que as hidroxilas da
celulose. A aplicação deste método abre um amplo leque de possibilidades para o
entrecruzamento com outros materiais ou biomoléculas como proteínas, compostos bioativos,
etc. A hidrólise neste processo pode ocorrer em condições drásticas, porém em condições
brandas a morfologia é conservada e o aumento da hidrofobicidade propicia a formação de
emulsões de óleo em água.
Entre os agentes acopladores o silano foi estudado através do processo de
silanização, no qual grupos alcóxidos são hidrolisados e em seguida formam grupos silanol
que reagem formando ligações covalentes com grupos hidroxilas da celulose. Os grupos da
superfície deste produto são geralmente usados para entrecruzar moléculas da matriz nas
fibras (grupos amina, e.g. 3-aminopropiltrietoxisilano, ou grupos epóxi, e.g. 3-
glicidoxitrimetoxisilano). Nanofibras tratadas previamente com NaOH apresentaram maior
43
grau de substituição após silanização. Assim como também fibras suspensas em solução de
NaOH 10% tiveram uma diminuição considerável de sua hidrofibilidade após adição de
clorato de benzoila.
O efeito destes agentes acopladores tem sido de melhorar a resistência à tração, ao
impacto e a flexão, isto através do aumento da adesão e da compatibilidade das interfaces dos
compósitos de celulose. Por exemplo, a cadeia alquílica do silano aumentou a afinidade da
celulose modificada durante a formação de compósitos com polietileno, enquanto uma
elevada resistência à tração e tensão à falha foram características de compósitos
nanoestruturados entre nanocristais de celulose e uma matriz de poliuretano. Um aumento da
adesão em um compósito de celulose protege contra o ataque de micro-organismos evitando a
absorção de água, além de melhorar a resistência mecânica do material.
Grafting. Outro procedimento realizado para acentuar ou inserir propriedades na celulose é a
grafitização por copolimerização. O procedimento é comumente realizado por radicais livres,
por polimerização iônica ou por condensação. A diferença principal entre estes métodos é
geralmente a obtenção de copolímeros de menor massa molecular pelo processo iônico e
polímeros de maior massa molecular pelo processo envolvendo radicais livres. As hidroxilas
C2, C3 e C6 são os sítios ativos da celulose que reagem nesta modificação (Kalia et al.,
2011). O resultado é um polímero ramificado com propriedades reológicas em função do grau
de ramificação.
O procedimento de copolimerização de fibras de linho com metil metacrilato
apresentou um menor consumo de tempo e energia aplicando radiação de micro-ondas, no
entanto um aumento da substituição química foi observado quando a reação foi realizada com
ar pressurizado. Esta técnica é eficiente predominantemente para materiais polares.
Vários agentes acopladores podem ser também adicionados durante a
copolimerização para formar compósitos com propriedades destacadas. A função epóxi
altamente reativa foi adicionada por copolimerização em meio aquoso usando glicidil
metacrilato com cério (IV), enquanto separadamente foi incorporado a grupos hidrofóbicos
reativos por substituição com hexametileno isocianato a fim de entrecruzar com grupos amina
de outro composto. Igualmente, ácido maleico e ácido succínico foram também inseridos na
superfície de celulose microcristalina para copolimerizar com policaprolactona mediante n-
44
octadecil isocianato, também pode ser gerado o compósito de celulose por polimerização pela
abertura do anel da lactona (Khalil et al., 2012).
Contudo, as fibras sintéticas são contraindicadas para aplicações na medicina,
uma vez que não são biodegradáveis, nem biocompatíveis e podem ser tóxicas no organismo,
enquanto as nanofibras de celulose não apresentaram potencial tóxico no modelo biológico do
zebrafish (Harper et al., 2016). Neste contexto, um procedimento para entrecruzar um
biopolímero a um composto bioativo ou a outro biopolímero de interesse é a oxidação da
celulose por periodato. As nanofibras de celulose assim tratadas geram grupos aldeídos
reativos nos carbonos C2 e C3 das unidades de glicose superficiais.
Dito procedimento tem sido aplicado para acoplamento de duas biomoléculas por
meio do ligante espaçador ácido adípico dihidrazida e 1-etil-3-[dimetilaminopropil]
carbodiimida (EDC) como ativador. A dihidrazida atua ligando grupos aldeídos ou grupos
ácidos a través da formação de hidrazonas. O ácido hialurônico foi deste modo incorporado à
hidrogéis resistentes de nanocelulose visando sua aplicação como injeção em engenharia de
tecidos e medicina regenerativa. A formação deste nanocompósito evita a hidrólise do ácido
hialurônico durante a etapa de recuperação da ferida (Domingues et al., 2015). O mesmo
procedimento tem sido testado usando dextran e nanocristais de celulose formando assim
veículos poliméricos para liberação de fármacos ou engenharia de tecidos (Yang et al 2013).
Outros biopolímeros estudados na formação de nanocompósitos de celulose como material de
reforço são: ácido poli láctico, poli hidroxi butirato, amido, quitosana, látex de borracha, entre
outros (Khalil et al., 2012; Arola, 2015).
2.3. METODOLOGIA
2.3.1. Métodos para caracterização do bagaço de laranja
Teor de pectina:
Cerca de 40 mL de HCl 0,05 mol L-1
foram adicionados em 4 g de biomassa
moída livre de açúcares que foram aquecidas até a ebulição. Após a fervura, manteve-se o
aquecimento por 60 min, em seguida a solução foi filtrada a vácuo e lavada com solução HCl
0,05 mol L-1
quente. Esse processo foi repetido mais uma vez como descrito por Sudhakar e
Maini (2000). O resíduo sólido foi então coletado e seco a fim de calcular a perda de massa
correspondente à pectina, predominantemente.
45
Teor de fibras neutras (NDF do Neutral Dietary Fibers):
As análises composicionais de cada biomassa foram estimadas segundo os
protocolos da tecnologia ANKOM: fibra em detergente neutro e fibra em detergente ácido -
técnicas de hidrólise das amostras em sacos de filtro resistentes (F57 da ANKOM
Technologies, USA). Esses métodos baseiam-se na hidrólise sequencial dos componentes da
biomassa. Inicialmente os compostos não classificados como fibra são solubilizados, e.g.
amido, pectina, cafeína, gerando assim um resíduo sólido de predominantemente
hemicelulose, lignina e celulose (protocolo para fibra em detergente neutro- NDF de Van
Soest et al., 1991).
Os sacos de filtro foram pesados e em torno de 0,50 g de biomassa foi adicionada
para hidrólise em triplicata. Foram utilizados sacos de filtro vazios como controle para
cálcular o fator de correção. Todos os sacos de filtro foram selados por aquecimento. A
solução aquosa do detergente consistiu em dodecilsulfato de sódio 7,5% m v-1
(SDS da Synth,
Brasil), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA da Sigma Aldrich, USA) 4,6% m v-1
, borato
de sódio 1,7 m v-1
(Synth),, fosfato bibásico de sódio (anidro da Synth) 1,14% m v-1
e
trietilenoglicol 2,5% v v-1
(Synth). Por fim, foi adicionado sulfeto de sódio 2,5% m v-1
e
também 250 μL por amostra da enzima α-amilase termoestável para uso em ensaio de fibra
alimentar total (Aspergillus niger TDA-100A de Sigma Aldrich). A hidrólise desta fracção foi
realizada a 100 °C durante 75 min com os sacos de filtro mergulhados nesta solução em
agitação e mantendo uma razão de 100 mL por saco. Em seguida, os sacos de filtros foram
lavados exaustivamente com água destilada a quente (70-90 °C) e os filtros foram então
colocados em um copo contendo acetona durante 5 min. Em seguida, a acetona foi evaporada
e os filtros de sacos foram secados em estufa a 105 °C. A porcentagem de fibra total foi
calculada pela seguinte equação:
(2.1)
onde:
M1 = peso do saco de filtro
M2 = peso inicial da amostra
M3 = peso final do saco de filtro com o resíduo da extração NDF
46
C1 = fator de correção (média da fração dos sacos vazios após a extração sobre os
sacos vazios antes da extração)
Teor de fibras ácidas (ADF do Acid Dietary Fibers):
As amostras de fibras totais resultantes da hidrólise anterior foram a seguir
hidrolisadas com detergente CTBA (cetyl trimethyl ammonium bromideda Sigma Aldrich) em
ácido sulfúrico diluído (0,5 mol.L-1
). O meio ácido deste detergente solubiliza a fração
hemicelulósica, gerando assim um resíduo sólido predominantemente de celulose e lignina
(protocolo ADF de Van Soest et al., 1991). O teor de hemicelulose é calculado relacionando a
fração solubilizada da hidrólise inicial de NDF.
Os sacos de filtro com o resíduo da hidrólise de NDF foram pesados novamente.
A solução de detergente ácido consistiu em brometo de cetil trimetil amónio (CTAB) 5% m.v-
1 dissolvido em solução 1 mol.L
-1 de ácido sulfúrico (H2SO4). A hidrólise foi realizada a
100°C durante 1 h com os sacos de filtro mergulhados nesta solução em agitação. A seguir, os
filtros foram lavados exaustivamente com água quente destilada (70-90°C) e os filtros foram
então colocados num copo com acetona durante 5 min. Após evaporação de acetona, os filtros
foram secados em estufa a 105ºC. A porcentagem de celulose e lignina após hidrólise com
detergente em meio ácido foi calculada pela seguinte equação:
(2.2)
onde:
M1 = peso do saco de filtro
M2 = peso inicial do resíduo de NDF
M3 = peso final do saco de filtro com o resíduo da extração ADF
C1 = fator de correção (média da fração dos sacos vazios após a extração sobre os
sacos vazios antes da extração)
Teor de lignina (LAD do Lignin Acid Detergent)
Finalmente, o sólido remanente é tratado com uma solução de ácido sulfúrico 72%
para solubilização da fração celulósica e determinação da fração de lignina insolúvel (método
Klason por Sluiter et al., 2012). A seguir é apresentada a formula usada para definir os teores
de celulose e lignina, resíduo sólido inicial após extração da hemicelulose pelo método do
47
CTBA e, a seguir foi hidrolisada a celulose pelo método de Klason, respectivamente. O
resíduo sólido final remanente no saco de filtro corresponde à lignina total da amostra. A
porcentagem de lignina após hidrólise em meio ácido concentrado foi calculada pela seguinte
equação:
(2.3)
onde:
M1 = peso do saco de filtro
M2 = peso inicial do resíduo de ADF
M3 = peso final do saco de filtro com o resíduo da extração LAD
C1 = fator de correção (média da fração dos sacos vazios após a extração sobre os
sacos vazios antes da extração)
2.3.2. Métodos para obtenção de nanocelulose do bagaço in natura
Inicialmente foi realizada a secagem em estufa e a redução do tamanho do
material para que as partículas ficassem com um tamanho final na faixa 0,85-1,15 mm usando
um moinho de facas. No caso do BL industrial, essa biomassa encontra-se seca e em forma de
pastilha (pellet), de modo que foi preciso somente reduzir o tamanho até obter um pó fino de
partículas menores do que 0,85 mm.
A seguir, foi necessário extrair os açúcares livres residuais de cada biomassa. Este
processo de separação foi realizado por filtração normal com água quente, entre 85 e 95 ºC.
Em seguida a biomassa foi novamente seca em estufa a fim de quantificar a perda de massa.
2.3.2.1. Etapas físico-químicas para obtenção de nanocelulose
As etapas estudadas do processamento de biomassa para obtenção de
nanocelulose foram as seguintes, sendo que a ordem da aplicação destas etapas está
apresentada na Figura 2.8 para bagaço in natura e na Figura 2.9 para bagaço industrial:
i. Tratamento para remoção da pectina com HCl (0,3% v v-1
) a 100 °C por 60 min.
48
ii. Tratamento térmico com solução de NaOH 1,6-4% (m v-1
) em autoclave durante 30 min
(120 ºC e 1 atm de pressão).
iii. O branqueamento do bagaço in natura foi realizado com NaClO2 de 1 (m v-1
) e no pH 4,0
em autoclave por 30 min (120 ºC e 1 atm de pressão).
iv. Hidrólise ácida ou hidrólise enzimática: após tratamento alcalino e branqueamento para
obtenção de material celulósico, a hidrólise ácida foi aplicada durante 60 min contados a
partir do momento da ebulição de uma solução contendo o material celulósico dispersado (1%
m v-1
) em 5% (m v-1
) de ácido sulfúrico. Outras concentrações também foram testadas a fim
de analisar o efeito na cristalinidade do produto celulósico resultante com o aumento da
concentração de ácido oxálico (20%, 40% e 60% m v-1
).
Figura 2.8. Fluxograma das etapas envolvidas no estudo de caracterização da nanocelulose
obtida a partir do bagaço de laranja in natura.
Hidrólise alcalina em autoclave
Extração de
pectina a quente
por 60 min
Nanonização 15-45 min
Branqueamento
20 min
Enzimas da
Xac(306) a
45 °C por 48 h
Hidrólise ácida a
quente 60 min
Hidrólise alcalina em
autoclave
BL in natura particulado
NaOH 1,6% NaOH 2,0% NaOH 1,6%
H2SO4 5,0%
NaOH 4,0%
5 mg de
proteína
intracelular NaOH 1,6%
H2SO4 10%
NaClO2 1%
5 mg de
proteína
extracelular
Sonicação
NaClO2 1%
Análise de estrutural e morfológica
Análise de cristalinidade
NaClO2 1%
HCl 0,05 mol L-1
49
Com o intuito de avaliar o efeito da hidrólise enzimática, as fibras resultantes do
tratamento alcalino de bagaço in natura foram diluídas em água até 17% m v-1
e ajustou-se o
pH em 5,0 para a hidrólise enzimática. Em seguida, foram adicionados 5 mg de solução de
proteína intracelular ou extracelular da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri por cada
grama de fibra. A seguir, a hidrólise enzimática ocorreu a 45°C e 90 rpm durante 48 h. Logo
após foi realizado o branqueamento.
2.3.2.2. Produção e extração das proteínas intracelulares da Xac para hidrólise
enzimática
A produção da mistura de enzimas intracelulares de Xanthomonas axonopodis pv.
citri 306 (Xac, IBSBF 1594) foi realizada de acordo com os procedimentos de incubação e
extração de proteína descritos por nosso grupo de pesquisa por Awan et al., 2013. O
procedimento detalhado seguiu:
Um inóculo da bactéria isolada foi preparado durante 24 h em meio Luria-Bertani
com glicose (10 g L-1
) como fonte de carbono a 32 °C e pH 7,0 sob incubação com agitação
(90 rpm). Em seguida, fez-se uma centrifugação a 30,000 g durante 30 min a fim de suspender
a massa celular em tampão de extração estéril pH 8,0 (10 mmol L-1
Tris-HCl, 10 mmol L-1
de
NaCl, 50 mmol L-1
de EDTA) na proporção 1:2 m v-1
. Manteve-se a suspensão a -80 °C por 1
h e em seguida as células foram lisadas por sonicação durante 15 minutos em banho de gelo.
O lisado foi centrifugado a 4 °C e 30,000 g por 15 min enquanto o sobrenadante foi dialisado
com água usando uma membrana de celulose (3,5 kDa de corte, Fisher Sci, USA) até massa
constante. A solução obtida por esse processo teve uma concentração de proteína em torno de
1,0 ± 0,2 mg mL-1
, valor medido utilizando o ensaio da Bio-Rad (Bradford, 1970).
A seguir, fez-se o pré-tratamento físico-químico da biomassa que consistiu em
adição de solução NaOH 4% m v-1
(razão 1:25) a 120 ºC em autoclave com o objetivo de
remover a lignina das fibras do BL e aumentar assim a acessibilidade à celulose
microcristalina. Deste modo, a atividade enzimática pode ser evidenciada. O bagaço
resultante desta etapa ainda possui um alto conteúdo de pectina.
As fibras resultantes do pré-tratamento foram diluídas em água até 17% m v-1
e
ajustou-se o pH em 5,0 para a hidrólise enzimática. Em seguida, foram adicionados 5 mg de
solução de proteína intracelular por grama de fibras pré-tratadas. A seguir, a hidrólise
50
enzimática ocorreu a 45 °C e 90 rpm durante 48 h. Então, os hidrolisados foram branqueados
com solução de clorito de sódio 1,7% m v-1
a pH 4,5 em autoclave por 20 min (Tsukamoto et
al., 2013). As fibras hidrolisadas foram lavadas com água quente, filtrada sob vácuo, diluídas
até em torno de 1% m v-1
e, subsequentemente, dialisadas com água numa membrana de
celulose (6-8 kDa de corte, Fisher Sci). Por último, o material hidrolisado foi sonicado por
uma ponteira com 75 W (VCX-750, Vibra-Cell, EUA) durante 12 min. O processo de
sonicação foi repetido três vezes.
2.3.2.3. Produção e extração das proteínas extracelulares da Xac para hidrólise
enzimática
Após hidrólise inicial com a solução NaOH 4% m v-1
(razão 1:25) a 120 ºC em
autoclave, foi realizada a hidrólise com proteínas extracelulares da bactéria Xac (306). A
obtenção desta proteína envolve um processo mais simples comparado com o processo de
obtenção de proteínas intracelulares.
O inóculo da bactéria neste caso foi preparado durante 24 h em meio Luria-Bertan
com carboximetilcelulose de sódio (CMC-5 g L-1
) como fonte de carbono. As condições de
crescimento continuaram sendo 32 °C e pH 7,0 sob incubação com agitação (90 rpm).
Em seguida, fez-se uma centrifugação a 30,000 g durante 30 min a fim de separar
a massa celular de proteína em solução. A solução obtida por este processo teve uma
concentração de proteína em torno de 0,4 ± 0,1 mg mL-1
, valor medido utilizando o ensaio de
Bradford (1970) com o reagente de tinção da Bio-Rad (faixa de detecção: 200-1400 µg mL-1
de concentração proteína total). A hidrólise enzimática por proteína extracelular foi realizada
usando o mesmo procedimento da hidrólise por proteínas intracelulares, sendo que uma etapa
de diálise da solução proteica (6-8 kDa de corte, Fisher Sci) foi aplicada previamente à
hidrólise a fim de diminuir a concentração de açúcares liberadas no inóculo, evitando assim
inibidores durante a hidrólise do bagaço de laranja pré-tratado.
A fim de conhecer a atividade celulósica do cocktail preparado, o protocolo
reproduzido foi uma adaptação de diferentes métodos [Adney et al. (1996), Ghose (1987),
Miller (1959) e Wood et al. (1988)] com uma redução de escala de trabalho de 10 vezes. O
sinergismo do complexo glicosil hidrolítico foi realizado incubando-se 50 μL de amostra com
três discos (aproximadamente 5 mg) de papel filtro Whatman n°1 obtidos por furador e 100
51
μL de tampão citrato de sódio 50 mmol/L pH 4,8 em tubos de ensaio. A reação enzima-
substrato foi iniciada a 50°C. Após 60 minutos, a reação foi terminada por adição de 300 μL
do reagente DNS e posterior incubação em banho de água a 95°C por 5 minutos. A reação
colorimétrica foi interrompida introduzindo os tubos em gelo fundente e imediatamente foram
agregados 2,0 mL de água. As absorbâncias das soluções foram medidas a 540 nm. Os testes
foram feitos em triplicata e para cada amostra foram testadas duas diluições diferentes.
2.3.3. Métodos para obtenção de nanocelulose do bagaço industrial
As etapas físico-químicas (i-v) do item 2.2.2.1 para obtenção de nanocelulose
foram aqui aplicadas usando bagaço industrial empregando as concentrações mostradas na
Figura 2.9.
Figura 2.9. Fluxograma das etapas envolvidas no estudo de caracterização da nanocelulose
obtida a partir do bagaço de laranja industrial.
Extração de pectina à quente por 60 min
Branqueamento
20 min
Hidrólise alcalina em autoclave por 20 min e biomassa 10% (m)
NaOH 2,0% NaOH 3,0% NaOH 2,0% NaOH 4,0%
NaClO2 2,0%
Análise estrutural e morfológica
Análise de cristalinidade
Nanonização 5 min
Hidrólise ácida a
quente 60 min
H2SO4 5,0% NaOH 2,0% H2SO4 10%
Sonicação
H2SO4 5,0%
HCl 0,05 mol L-1
BL industrial particulado
H2O2 6,45%
52
Porém, a etapa ii referente ao branqueamento consistiu em um pré-branqueamento
com H2O2 6,45% (v v-1
) e, pH 10 a 80 ºC durante 20 min acoplado ao branqueamento com
NaClO2 de 2% (m v-1
) e no pH 4,0 em autoclave por 20 min (120 ºC e 1 atm de pressão).
Além disso, a etapa iii do material celulósico consistiu na hidrólise ácida ou hidrólise
alcalina (por segunda vez) sem ser testada a hidrólise enzimática no BI.
2.3.4. Métodos de caracterização de nanocelulose
2.3.4.1. Difração de raios X (DRX) para determinação de cristalinidade
O material liofilizado obtido a partir das etapas de hidrólise e sonicação da secção
3.1 foi analisado utilizando a técnica de difração de raios-X. Um difratômetro Shimadzu
XRD-7000 (EUA) foi utilizado para se obter o perfil de difração de 2 ° por min através de
uma fonte de radiação com cobre e um monocromador secundário operando a 40 kV e 30 mA.
Os padrões de difração foram digitalizados através do ângulo 2θ = 5,0 - 50,0 ° e o índice de
cristalinidade (IC) foi calculado usando a seguinte equação de acordo com Segal et al. (1962):
IC = (I002- IAM) / I002 (2)
Em que I002 é a altura do pico 002 (cerca de 2θ = 22.6 º) e IAM é a altura mínima
(planalto) entre os picos 002 e 101 (em torno de 2θ = 18º).
2.3.4.2. Ressonância magnética nuclear de sólidos (CP/MAS-RMN de 13
C)
Os mesmos produtos liofilizados, tratados química- e enzimaticamente, foram
estudados através de seus espectros RMN de 13
C. O equipamento Bruker AMX-300 MHz
operando a 7,05 T e em 75,47 MHz foi utilizado para este propósito. A aquisição da sequência
de pulsos por polarização cruzada foi realizada utilizando 3000 Hz de taxa de rotação, pulso
de 90 ° durante 1,5 ms e 800 ms para o pulso de contato. O número de varreduras foi de
10.000 com 3,0 s entre repetições.
O índice de cristalinidade (IC) foi determinado pelo método de deconvolução
aplicando a equação de Lorentz para definir a forma dos sinais sobrepostos do carbono 4 da
glicose (C4), região que abrange em torno de 79-92 ppm, correspondente a 86-92 ppm para
celulose cristalina (VanderHart e Atalla, 1984).
53
2.3.4.3. Microscopia eletrônica e de sonda
As características morfológicas das microfibras e nanofibras obtidas da hidrólise
química e enzimática foram investigadas usando um microscópio eletrônico de varredura
(SEM), JEOL JSM-6360LV, assim como também um microscópio eletrônico de varredura
por emissão de campo (FESEM), JEOL JSM-6340LV, uma sonda de varredura por força
atómica (SFM) e um microscópio eletrônico de transmissão (Carl-Zeiss Libra 120 microscope
com HV = 80 kV).
Para a análise do SEM, as fibras dispersadas por sonicação foram depositadas
sobre um suporte de vidro (lamínula), secadas à temperatura ambiente e em seguida a
lamínula de vidro foi fixada sobre o porta-amostra do microscópio onde foi aplicado um
recobrimento prévio de ouro ou platina utilizando um pulverizador catódico MED 020
(Baltech). O tratamento da amostra foi similar para FESEM, sendo que as imagens de
varredura foram obtidas utilizando uma tensão de aceleração de 5 e 10 kV e um detector de
elétrons secundários. Para TEM foi diluída uma gota de nanocelulose em suspensão e a
seguir, uma gota foi depositada em telas revertidas de carbono para finalmente deixar secar a
temperatura ambiente. O diâmetro e comprimento médio das fibras foram determinados a
partir das imagens de FESEM e TEM usando o software Image ProPlus 4.0 (National
Institute of Health-NIH, USA). Para isto, 20 segmentos foram selecionados aleatoriamente.
A topografia e morfologia do material sólido processado também foram
determinadas utilizando-se um microscópio de força atômica Shimadzu WET-SPM
(multimodo Environment Controlled Scanning Probe Microscope-ECSPM). Para isto,
material liofilizado foi analisado a fim de conferir a morfologia das fibras após secagem.
2.3.5. Funcionalização de nanocelulose do bagaço in natura
A modificação química de celulose foi realizada em três etapas relatadas a seguir:
i. Oxidação de grupos hidroxila da celulose a ácido carboxílico: 50 mL de uma solução de
celulose 6% foram oxidados com 3 g de NaClO2 em pH 10 durante uma reação de 3h
catalisada por TEMPO (15 mg) e NaBr (160 mg). Transcorrido esse período o produto foi
dialisado usando membrana de 12-14 kDa e finalmente liofilizado antes da caracterização por
FTIR e titulação com NaOH (Lin et al., 2012).
54
ii. Síntese de celulose oxidada entrecruzada por ligações hidrazina: a funcionalização de
celulose com grupos amina fez-se com uma solução de 200 mL da celulose oxidada (1%) e
0,6 g de HDA. Foram dissolvidas e adicionadas 0,07 g de NHS e 0,3 g de EDC em 4 mL de
solução 1:1 (v v-1
) de dimetilsulfóxido (DMSO) em água. Esta solução foi depois adicionada
gota a gota à solução de celulose oxidada. O pH da reação foi ajustado para 6,8 adicionando
HCl 0,1 mol L-1
. Quando o pH se manteve a funcionalização considerou-se finalizada e em
seguida o sólido resultante foi dialisado usando uma membrana de 12-14 kDa. Após
liofilização, o material sólido foi caracterizado por FTIR e titulado com HCl (Yang et al.,
2013).
iii. Caracterização dos produtos da celulose modificada
Inicialmente a celulose original e as modificadas foram analisadas e comparadas por FTIR e
CP/MAS-RMN de 13
C, sendo usados os equipamentos mencionados anteriormente.
Decomposição térmica. A seguir, as amostras foram analisadas por termogravimetria em um
analisador TA Instruments Q500 TG. As amostras (cerca de 6 mg) foram aquecidas numa
atmosfera pura de nitrogênio (taxa de fluxo 60 mL min-1
) desde a temperatura ambiente até
550 °C a uma velocidade de 20 °C .min-1
.
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados deste estudo da nanocelulose envolvem inicialmente a composição
das matérias-primas usadas, BL in natura e BL industrial. A primeira biomassa é um resíduo
da produção local de suco de laranja e tem sido já estudada por nosso grupo de pesquisa para
isolamento de celulose. No entanto, o presente estudo continua essa abordagem com a
caracterização completa da nanocelulose (estrutura química e morfologia) derivada desse
resíduo fresco. A segunda biomassa estudada para produção de nanocelulose corresponde ao
resíduo da produção industrial de suco de laranja, que é um material processado para extração
do suco, prensado e seco do BL, a partir do BL e folhas utilizadas na preparação industrial do
suco.
O refinamento dessas biomassas para obtenção da nanocelulose consistiu,
primeiramente, na caracterização das nanofibras de celulose obtidas a partir de hidrólise
enzimática. Esta metodologia está baseada em um estudo pioneiro realizado por nosso grupo
55
de pesquisa (Tsukamoto et al., 2013) que consistiu no isolamento e na identificação da
bactéria Xac (306) aqui usada para digerir o bagaço da laranja com proteínas intracelulares.
Adicionalmente, nosso estudo aproveitou também as enzimas extracelulares deste micro-
organismo a fim decaracterizar e comparar o índice de cristalinidade (IC) dos produtos
celulósicos obtidos a partir de cada tratamento enzimático (intracelular com glicose como
substrato e extracelular com CMC como substrato).
A seguir, analisou-se o efeito da concentração durante as hidrólises alcalinas e
ácidas sobre o IC do material celulósico resultante do processamento de BL in natura e de BL
industrial. A determinação do IC neste estudo comparativo foi realizada pela técnica de DRX.
A fase final desta primeira parte do estudo corresponde à modificação dos grupos funcionais
na superfície da nanocelulose. O produto resultante desta funcionalização foi caracterizado
por FTIR, RMN e titulações potenciométricas.
2.4.1. Caracterização do bagaço de laranja
Preliminarmente foram caracterizados os materiais de partida, bagaço in natura e
bagaço da indústria (Tabela 2.3). A diferença mais significativa dos nossos resultados é
referente à quantidade maior de celulose no bagaço industrial, quase o dobro da quantidade de
celulose no bagaço in natura, enquanto seu teor de hemicelulose é menor.
Em relação ao bagaço in natura, nos trabalhos prévios (Oderoi et al., 2010; Bicu e
Mustata, 2013) foram encontrados valores de teor de celulose para bagaço in natura de Citrus
sinensis variando-se entre 12,9% e 14,2% em base seca. Enquanto aos teores de lignina
variaram entre 0,6% e 1,3%. Na literatura não foram encontrados valores da caracterização do
bagaço da indústria que possam ser comparados aos resultados obtidos neste trabalho. Mesmo
assim, ao comparar os resultados do bagaço da indústria com bagaço in natura, pode-se
observar que o teor de celulose obtido para o primeiro foi o dobro do encontrado para o
bagaço in natura, aproximadamente (Tabela 2.3).
Além disso, o conteúdo de lignina também foi aproximadamente o dobro para a
biomassa da indústria. Isto era esperado uma vez o bagaço industrial apresenta folhas e galhos
que geralmente apresentam um maior teor de celulose e lignina em sua composição.
56
Tabela 2.3. Composição do bagaço de laranja em base seca
2.4.2. Caracterização de nanocelulose do bagaço in natura
2.4.2.1. Análises estruturais das fibras de nanocelulose obtidas aplicando-se
enzimas intracelulares e extracelulares de Xac (306)
A etapa inicial do estudo de hidrólise enzimática envolveu os resultados da
estabilidade das celulases intracelulares da Xac (306) em função do pH.A fim de conhecer as
condições mais favoráveis para hidrolisar o material celulósico, foi estudada a estabilidade
das celulases, a 45 °C, em termos do pH. A Figura 2.10 mostra a estabilidade da atividade
celulásica em valores de pH entre 6,0 e 8,0, em que valores menores que 6,0 apresentam uma
ligeira diminuição da atividade e em pH maior que 8,0 a perda de atividade foi mais
considerável.
Mediante este resultado é possível concluir que a estabilidade das celulases
isoladas abrange uma faixa ampla de pH (6,0-8,0), uma vantagem durante a hidrólise
enzimática já que pode ser efetuada em água sem o uso de solução tampão.
A seguir, foi caracterizada a nanocelulose obtida a partir do BL in natura
aplicando a sequência apresentada na Figura 2.8: pré-tratamento alcalino, hidrólise enzimática
(enzimas intracelulares ou extracelulares de Xac), branqueamento, sonicação e liofilização. Os
resultados obtidos são mostrados a seguir.
Composição Fração
solúvel
em água
(%)
Pectina
(%)
Celulose
(%)
Hemi-
celulose
(%)
Lignina
(%)
Bagaço da
indústria
42,0 ± 4,8 27,2 ± 1,4 21,0 ± 7,4 9,8 ± 7,4 3,5 ± 0,1
Bagaço in
natura
48,1 ± 2,1 24,5 ± 5,4 12,0 ± 2,7 15,6 ± 2,7 1,7 ± 0,8
57
Figura 2.10. Atividade celulásica da Xac (306) em função do pH.
Análises estruturais das fibras de celulose processadas a partir de hidrólise enzimática do
bagaço in natura
Efeitos observados por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR):
O espectro FTIR do sólido obtido após processamento de BL mostrou
principalmente as vibrações correspondentes às ligações químicas da celulose, tanto para o
produto resultante da hidrólise enzimática como também para o sólido controle não
hidrolisado por enzimas.
O perfil do espectro FTIR da celulose (Figura 2.11), comum para ambos os
produtos, é caracterizado principalmente pelas seguintes vibrações das ligações presentes na
celulose: ligação de hidrogênio intramolecular entre os grupos hidroxila de C2 e C6 dos anéis
de piranose (3330 cm-1
), estiramento simétrico e flexão por balanço de CH2 em C6 (1410-
1424 cm-1
e 1318 cm-1
, respectivamente), flexão no plano de COH em C6 (1203-1205 cm-1
) e
movimentos de C-O-C pela ligação β-glicosídica representados em 1102-1105 cm-1
e 1054-
1056 cm-1
.
Faixas adicionais apresentadas na região de alongamento da carbonila,
identificadas em 1734 cm-1
e 1605 cm -1
, são atribuídas à flexão de OH por absorção de água
(Oh et al., 2005).
Além disso, a diminuição da intensidade da banda em 1250 cm-1
é uma indicação
da eficácia na remoção de hemicelulose para cada tratamento. Pela comparação da intensidade
desta banda, contribuição associada ao alongamento vibracional da ligação C-O, pode ser
confirmada uma maior eficácia da remoção de hemicelulose nas etapas de hidrólise alcalina e
58
branqueamento (linha cinza). O teor de celulose é apresentado na Tabela 2.4 como os
rendimentos para cada etapa de extração.
Outra variação estrutural significativa observada está relacionada com o
alongamento da ligação C-O-C e C-H envolvendo o C-5 e o C-6, vibração observada em 893-
902 cm-1
. Enquanto o bagaço tratado com enzimas apresenta a banda característica da ligação
β-glicosídica entre unidades de glucose em 899 cm-1
, os materiais tratados com NaOH e
NaClO2 não apresentam essa banda, no entanto, mostram vibrações adicionais em números de
onda superiores (990 cm-1
, 968 cm-1
e 940 cm-1
). Bandas nessa região de frequência são
atribuídas ao alongamento da ligação CO de polissacarídeos devido à hemicelulose ou pectina
residuais (Kacurakova et al., 1994)., compostos que não foram completamente digeridos pelo
coquetel enzimático de Xac (306).
Figura 2.11. Espectros FTIR de sólido obtido a partir do processamento de BL por etapas,
sendo: a linha preta correspondente ao processo com hidrólise enzimática; a cinza ao
processamento sem hidrólise enzimática; e a pontilhada ao bagaço in natura.
59
Efeito da hidrólise enzimática sobre a cristalinidade da celulose:
A fim de determinar o efeito da hidrólise enzimática na morfologia e IC da
nanocelulose, foi analisado paralelamente o produto obtido aplicando somente a etapa inicial
do tratamento alcalino e o produto obtido realizando a etapa adicional de branqueamento, sem
aplicar a etapa de hidrólise enzimática (etapa i, ii e iii do item 2.2.2.1 da metodologia), que
serão aqui chamados de produtos tratados com NaOH (somente etapa i e ii) e com NaOH e
NaClO2 (etapa i, ii e iii), respectivamente (Tabela 2.4).
Para se conhecer as alterações da cristalinidade nos materiais celulósicos após
tratamentos físico-químicos e enzimáticos as amostras foram analisadas inicialmente pela
técnica de difração de raios X.
Na Figura 2.12 pode ser verificado que os padrões de difração de raios X
apresentados pela rede de celulose apresentam pelo menos três picos cristalinos, sendo o sinal
16,4 ° correspondente ao plano 101 e o sinal de maior intensidade, 22,4 °, correspondeu ao
plano 002, conforme o cálculo de cristalinidade aparente de Segal e colaboradores (1962). Um
terceiro pico é observado em torno de 34,6 º e é associado ao plano 040 que corresponde à
estrutura alomórfica da celulose I (Atalla e Vanderhart, 1999). Na mesma figura verifica-se
como as intensidades do pico em 22,4º da celulose cristalina aumentaram com o aumento do
número de etapas do processo.
Além da técnica de DRX, as análises estruturais foram complementadas com
RMN de sólidos, uma vez que através dessa técnica é possível determinar a presença de
outros componentes residuais (lignina e/ou pectina), além de determinar e comparar valores
de cristalinidade. Os espectros de RMN da nanocelulose tratada quimicamente (Figura 2.13)
mostram picos de ressonância entre 20 e 35 ppm de grupos metila C-O-CH3 confirmando a
presença de pectina. Além disso, a banda de 1730 cm-1
no espectro FTIR (Figura 2.11) está
correlacionada com pectina acetilada residual ou hemicelulose que não sofrera hidrólise. As
enzimas Xac (306) incluem celulases e pectinases que atuam em regiões menos ordenadas
(Awan et al.,2013), nas quais há melhor acessibilidade ao substrato .
60
Figura 2.12. Difratogramas de raios X de BL in natura como matéria-prima (linha tracejada),
material obtido após método físico-químico de deslignificação e branqueamento usando
NaOH e NaClO2 (linha cinza) e após um tratamento adicional com enzimas intracelulares
durante 48 h a 45 °C (linha preta).
A CP/MAS é uma técnica de alta resolução espectral usada em amostras de estado
sólido que permite determinar o IC de material celulósico com uma boa precisão, além de
permitir a elucidação da estrutura química de sólidos. A análise qualitativa dos espectros de
RMN permitiu identificar o anel glicopiranosídeo de células unitárias do alomorfe Iα, celulose
sintetizada majoritariamente pelas plantas. Essa característica é determinada pela região de
ressonância do C1 localizada em torno de 105 ppm. Um singlete nesta área identifica o
alomorfo Iα, enquanto um dublete é característico do alomorfo Iβ
As linhas de ressonância devido a outros carbonos do anel de glicopiranose,
mostradas na Figura 2.13, são atribuídas: a C2, C3 e C5. Há uma sobreposição de linhas na
região de 72-76 ppm. A região de ressonância para C6 está em torno de 62-65 ppm
corresponde a dois sinais sobrepostos que representam a região cristalina e a região amorfa. O
mesmo ocorre para C4 na região de 80-93 ppm, região que é utilizada para estimar o IC da
celulose após ajuste de dados, sendo o pico em 89 ppm atribuído à estrutura ordenada,
enquanto o pico em 84 ppm é atribuído às superfícies das fibras menos ordenadas ou amorfas
(Atalla e Vanderhart, 1999).
61
Após o processamento espectral usando MestReNova 9.0 foi aplicado o método
de deconvolução, seguido da integração dos picos a fim de calcular a área total da fase
cristalina e da fase amorfa.
Figura 2.13. Espectros CP/MAS RMN de
13C de fibras celulósicas obtidas por tratamento
químico (linha cinza) e por tratamento químico plus enzimático (linha preta).
O IC foi então determinado calculando-se o teor da fase cristalina por diferença do
valor total das áreas usando o método detalhado no item 2.2.4.2. O método que consiste no
ajuste numérico das áreas sobrepostas em torno de 87-93 ppm conduz aos valores de IC
apresentados na Tabela 2.4 após análises da Figuras 2.13.
Analisando a Tabela 2.4 vemos o aumento do conteúdo de celulose conforme
aumentam as etapas do processamento. Igualmente os valores de IC determinados por DRX e
RMN aumentaram em cada etapa de refinamento confirmando a hidrólise das frações amorfas
que compõem a biomassa, tais como hemicelulose, pectina e lignina.
Especificamente através desses dados, conferimos também a solubilização de
frações amorfas pelas enzimas da Xac (pectina e/ou celulose segundo Awan et al., 2013). Um
ligeiro aumento no IC é observado para a hidrólise realizada por enzimas extracelulares. O
refinamento da celulose cristalina por enzimas extracelulares apresenta vantagens durante a
aplicação industrial, uma vez que não requer a etapa de rompimento celular reduzindo assim a
demanda energética do processamento das proteínas.
Analisando cada etapa do processamento, a eficiência do branqueamento
aumentou substancialmente a cristalinidade em 7,0%, enquanto o tratamento com enzimas
intracelulares atingiu um aumento da cristalinidade de aproximadamente 19% e com enzimas
extracelulares o aumento foi de 22%.
62
Tabela 2.4. Teor de celulose e índice de cristalinidade (IC) calculado para cada o
processamento do BL in natura envolvendo hidrólise alcalina e enzimática
Material Teor de
celulose (%)
IC por
DRX*
IC por
RMN**
Bagaço in natura (BL) 16,5 ± 0,8 0,16 -
Fibras tratadas com 4% de NaOH 52,5 ± 1,3 - -
Fibras tratadas com 4% de NaOH e 1% de NaClO2 76,8 ± 0,5 0,50 0,36
Fibras tratadas com 4% de NaOH, 1% de NaClO2
e enzimas intracelulares da Xac(306)
83,8 ± 0,5 0,63 0,55
Fibras tratadas por 4% de NaOH, 1% de NaClO2 e
enzimas extracelulares da Xac(306)
84,3 ± 0,9 - 0,58
*DRX: difração de raios X, **RMN: ressonância nuclear magnética.
A extensão da solubilização de celulose amorfa por hidrólise microbiana ou
enzimática tem sido uma controvérsia devido à seletividade das celulases. Satyamurphy e
colaboradores. (2011) isolaram nanofibras de celulose porhidrólise fúngica de algodão, e
essas nanofibras apresentaram menor cristalinidade do que aquelas isoladas usando hidrólise
ácida. Park et al. (2010) estudaram o desempenho da celulose em termos da alteração do IC
como resultado da solubilização preferencial da celulose amorfa pelas celulases. Segundo os
autores, houve um ligeiro aumento de IC de 2% a 3% após a hidrólise enzimática ou
bacteriana da celulose. Isto sugere que a taxa de hidrólise das frações amorfas é alta, no
entanto a taxa de hidrólise das frações cristalinas é também pronunciada para celulases do
fungo T. reesei.
Contudo, outros micro-organismos produzem celulases com taxas maiores de
hidrólise da fração amorfa, como foi o caso do fungo A. niger (Anderson et al., 2014).
Através da determinação da atividade enzimática de celulases e pectinases, foi
possível conferir que nosso caso particular da bactéria Xac (306) apresenta uma alta atividade
enzimática de pectinases e uma baixa atividade enzimática de celulases. Desse modo,
verificamos que o aumento do IC no material celulósico pode ser atribuído principalmente à
solubilização da pectina e, em uma menor proporção, à solubilização da celulose amorfa.
63
Adicionalmente foi realizado um seguimento da aparência do material conforme
ia acontecendo o enriquecimento em celulose cristalina (Figura 2.14).
Figura 2.14. Mudança visual do BL para cada etapa do processo de obtenção de
nanocelulose.
O material apresentado como nanofibras de celulose (último à direita da Figura
2.14) corresponde ao produto sólido e em suspensão, respectivamente, obtido após as
diferentes etapas de hidrólise e dispersão por sonicação do bagaço in natura. Neste processo
foi incluída uma primeira etapa de extração com éter etílico a fim de extrair e recuperar a
hesperidina, flavonoide de interesse na indústria farmacêutica e cosmética (Tasic et al., 2016).
2.4.3. Análises estruturais e comparação das fibras de celulose obtidas aplicando-se
tratamentos físico-químicos ao bagaço in natura e ao bagaço industrial
A segunda abordagem realizada para obtenção de nanocelulose foi a avaliação do
processo plenamente físico-químico usando bagaço in natura (BN) e bagaço industrial (BI da
Citrosuco - Matão, SP). O processo foi avaliado utilizando várias concentrações de NaOH após
as etapas de remoção de pectina e branqueamento, acompanhando o processo através da
cristalinidade dos sólidos obtidos. O objetivo principal desta parte do estudo foi definir a
concentração de NaOH adequada para solubilizar a região amorfa da celulose sob as
condições usadas e definir também o tempo de sonicação necessário para cada biomassa. As
Figuras 2.8 e 2.9 apresentam as condições testadas e as sequências aplicadas para o BN e para
o BI, respetivamente.
64
2.4.3.1. Efeitos observados por Espectroscopia de Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)
Os produtos com os quais foi obtido um IC maior foram usados para caracterizar
o material por FTIR. A Figura 2.15 mostra os espectros e apresenta o perfil correspondente da
celulose, que é caracterizado, principalmene, pelas bandas de vibração da ligação
intramolecular do OH (3388 cm−1
), da ligação β-glicosídica C-O (1018 cm−1
), de flexão
simétrica da ligação CH2 (1426 cm−1
), de alongamento do CH (2894 cm-1
) e da flexão no
plano de COH (1200 cm−1
) (Nelson et al., 1964).
Finalmente, a través destes espectros foi possível elucidar a presença de lignina ou
hemicelulose residual. A remoção de pectina foi considerada completa pela ausência da
vibração de estiramento da ligação C=O para ésteres a 1730 cm-1
, demostrando que o
tratamento foi eficiente. Uma característica mais específica da lignina é a vibração de
estiramento de anéis aromáticos (1440-1600 cm-1
), sinal que implica uma fração de lignina
insolúvel nos produtos de BI e BN. No entanto, essas bandas estão presentes em baixa
intensidade, o que suporta a idéia de terem sido isolados principalmente produtos celulósicos
de ambas as amostras (Alemdar et al., 2008; Cherian et al., 2008).
Figura 2.15. Espectros de FTIR da nanocelulose obtida do BN (em vermelho) e do BI (em
verde).
2.4.3.2. Efeito do tratamento físico-químico sobre a cristalinidade da celulose do
bagaço in natura:
A análise comparativa da cristalinidade dos produtos obtidos após hidrólise com
diferentes concentrações de NaOH foi investigada pelas análises dos espectros DRX (Figuras
2894
1638
1426
65
2.16), seguindo o método de altura do pico de Segal (1962). Os resultados dos resíduos que
foram submetidos a um passo de hidrólise adicional, aplicado separadamente como hidrólise
ácida (H2SO4 5% v v-1
) ou como hidrólise alcalina em duas etapas, também são mostrados.
Figura 2.16. Difratogramas dos sólidos resultantes da hidrólise química do bagaço in natura.
Complementarmente, os espectros de RMN por CP/MAS de 13
C (Figura 2.17),
revelaram os picos característicos de material celulósico com variações marcadas nas áreas
dos carbonos C4 e C6 apresentados na Figura 2.17. As variações nos picos C4 são
especificamente empregadas para avaliar a IC de celulose I como já foi mencionado.
A proporção das áreas na região cristalina C4 (87-93 ppm) e a área total de ajuste
de linha para cada espectro levaram aos seguintes valores de CI: 0,58 para BI tratado com
solução de NaOH 2,0% (duas vezes) e 0,52 para BN tratado com solução de NaOH 1,6%
(duas vezes), juntamente com o processo de branqueamento, específico para cada amostra
(Tabela 2.5 e 2.6).
Todas as amostras de nanocelulose obtidas por hidrólise alcalina a partir de BN
mostraram valores de IC superiores a 70% segundo análises de DRX. Isto correspondeu a
valores de cristalinidade ao redor de 60% segundo RMN de 13
C (Tabela 2.5). Especificamente
para o BN não foi observado um aumento da cristalinidade após hidrólises em concentrações
de NaOH maiores a 1,6%. No entanto, uma hidrólise em dois passos com H2SO4 a 5%
permitiu uma maior solubilidade da celulose amorfa.
66
Figura 2.17. Espectros CP/MAS RMN de
13C da nanocelulose obtida a partir de hidrólise
alcalina e ácida do bagaço da indústria (linha preta) e do bagaço in natura (linha vermelha).
O BN destaca-se com um IC máximo de 58% obtido por RMN, correspondente à
hidrólise alcalina seguida de hidrólise ácida. Constatamos também que, mediante comparação
da hidrólise enzimática e a hidrólise ácida como etapa final do processamento de BN, houve
um aumento do IC de 22% utilizando o tratamento de hidrólise enzimática e um aumento de
8% usando hidrólise ácida com H2SO4 5%. Mesmo assim, o IC final foi em torno de 58% para
ambos os processos, uma vez o bagaço usado para hidrólise ácida foi previamente tratado para
remoção de pectina, deste modo seu IC inicial era maior devido à remoção da pectina.
Tabela 2.5. Índices de cristalinidade (IC) calculados para cada produto obtido após hidrólise
do bagaço in natura envolvendo hidrólise alcalina e ácida
Material IC por XRD IC por RMN
Bagaço in natura sem pectina (BN) 0,38 -
Produto da hidrólise com NaOH 1,6% 0,70 -
Produto da hidrólise com NaOH 2,0% 0,71 -
Produto da hidrólise com NaOH 3,0% 0,71 -
Produto da hidrólise com NaOH 2,0% e H2SO4 5% 0,79 0,58
Produto da hidrólise com NaOH 1,6% (duas vezes) 0,73 0,52
A hidrólise enzimática com enzimas de baixo custo apresenta a vantagem de ser
um processo que pode aumentar a cristalinidade da biomassa em condições brandas, no
entanto, a fim de obter valores de cristalinidade maiores, é sugerida a etapa inicial de remoção
67
da pectina que pouparia o uso de pectinases, enquanto, a etapa da hidrólise enzimática teria
melhores resultados usando um cocktail com alta concentração de celulases, e.g. enzimas de
A. niger ou Humicola insolens.
2.4.3.3. Análises morfológicas das fibras de nanocelulose obtidas a partir de
bagaço in natura
As micrografias eletrônicas mostraram que após as etapas de hidrólise das fibras
do bagaço de laranja o material mantém uma estrutura relativamente compacta, enquanto a
superfície parece coberta ainda por material residual, predominantemente pectina (Figura
2.18-a). O efeito da digestão enzimática foi evidenciado pela degradação completa do
material celulósico caracterizado por possuir aparência mais fina e vulnerável à fibrilação
(áreas dentro dos retângulos na Figura 2.18-a) e pelo aparecimento de vários defeitos
(buracos) na superfície das fibras mais robustas (Figura 2.18-b e áreas pontilhadas na Figura
2.18-a). De acordo com estudos anteriores realizados em nosso grupo de pesquisa, as enzimas
da Xac (306) são muito ativas na superfície do BL (Awan et al., 2013). Essas bactérias, que
causam a doença do cancro cítrico, produzem um coquetel de enzimas que contribuem para a
degradação das fibras devido às diferentes atividades hidrolíticas de pectinases e celulases.
Figura 2.18. Micrografias eletrônicas da biomassa do bagaço de laranja (BL) antes e depois
do tratamento enzimático: (a) amostra de BL pré-tratado com NaOH (4% w v-1
) a 120 °C
durante 20 min e NaClO2 (1,7% w v-1
) por 20 min a 120°C em pH 4,5; (b) superfície da fibra
de BL após ação das enzimas de Xanthomonas axonopodis pv. citri durante 48 h em 45 °C.
Outro efeito do tratamento enzimático foi observado sobre os empacotamentos
das fibras, chamadas microfibrilas, que se desprendem umas das outras (Figura 2.19-a)
resultando em fibrilas independentes. Estas microfibrilas com diâmetros em torno de 600 nm
estavam presentes em algumas áreas do porta-amostra. No entanto, após a fibrilação por
68
sonicação, as análises das imagens de FESEM e SPM permitiram observar as nanofibras de
celulose em toda a superfície do porta-amostra (Figura 2.19-b e Figura 2.20), sendo estas
bastante reprodutíveis após hidrólise enzimática e sonicação.
Figura 2.19. Micrografias eletrônicas de varredura mostrando (a) fibras e feixes de fibras
antes da fibrilação resultantes da hidrólise enzimática do bagaço de laranja pré-tratado; e (b) o
efeito da fibrilação por sonicação apresentando a nanocelulose em detalhe.
As nanofibras de celulose obtidas possuem uma estrutura de haste com um
diâmetro médio de 10 ± 3 nm (Figura 2.22). Consequentemente elas possuem uma área
superficial considerada elevada uma vez que apresenta comprimentos na ordem de micras.
135805 Trace
2.5 x 2.5m - 0,6 Hz - IG
1400 – PG 0,01
Trace (muito parecidas)
Fase -70 deg – Sens x 4
Deflexão
69.30
[nm]
0.00500.00 nm 1.00 x 1.00 um
Mayra 1
11.23
[deg]
-5.87 500.00 nm 1.00 x 1.00 um
Mayra 1
0.00
[V]
-0.00 500.00 nm 1.00 x 1.00 um
Mayra 1
Figura 2.20. Topografia e morfologia das nanofibras de celulose obtidas por hidrólise
enzimática após hidrólise alcalina e sonicação a partir do bagaço de laranja. Da esquerda à
direita: Topografia de imagem de fase e deflexão (escala 2,5 µm).
69
Os resultados da Figura 2.20 mostram as micrografias SFM de uma película de
nanocelulose em uma escala que varia de 2,5 μm a 1,0 μm após um procedimento de
achatamento para imagens de altura. A través destas imagens observamos homogeneidade das
nanofibras, sendo estes dados obtidos consistentes com dados literatura sobre nanocelulose a
partir de matérias-primas renováveis (Oksman et al., 2006; Elazzouzi-Hafraoui et al., 2008) e,
indicam que as nanofibras podem ser utilizadas eficientemente como agentes de reforço em
materiais compósitos, uma vez que fibras longas possibilitam obter nanocompósitos com
melhores propriedades mecânicas em relação à fibras mais curtas ou nanocristais (Xu et al.,
2013).
A caracterização dos produtos celulósicos obtidos por exclusivamente hidrólise
química foi continuada com a análise morfológica. A microestrutura e o tamanho dos sólidos
de uma suspensão homogeneizada por tratamento de ultrassom foram investigados também
por FESEM e SPM após sonicação e secagem ao ar.
Através das micrografias eletrônicas de varredura mostradas nas Figuras 2.2Q e
2.22, foi calculado o diâmetro médio da nanocelulose do BN após processamento químico e
mecânico usando o software de processamento de imagem ImageJ 1,49. O produto sólido
apresenta diâmetro estreito e comprimento na escala micrométrica. O diâmetro obtido para as
fibras preparadas a partir do BN foi 18,4 nm ± 6.
Figura 2.21. Micrografia eletrônica das nanofibras de celulose preparadas por hidrólise
alcalina e ácida e o histograma do comprimento.
Para confirmar a morfologia e homogeneidade das nanofibras em estado sólido, as
amostras foram analisadas por SPM após secagem ao ar, gerando assim um filme de
1018
70
nanofibras compridas de celulose apresentada na Figura 2.22 (à direita). A altura e as imagens
de fase foram tomadas em uma escala de área entre 1,0-2,5 µm2.
Após um procedimento das imagens de SPM por achatamento da altura são
apresentadas as características das fibras, sendo uma rede compacta de nanofibras observadas
nas imagens de fase, o que mostra que as fibras estavam cobrindo totalmente a superfície
deste filme sem qualquer espaço intermediário vazio. Em geral, vemos uma densidade de
nanofibras alta e uniforme para as amostras tanto em suspensão como em estado sólido após
secagem ao ar.
Figura 2.22. a) Fotografia do bagaço in natura do início ao fim de sua transformação em
fibras de nanocelulose. Da esquerda à direita são mostrados: matéria-prima, matéria-prima
após moagem e secagem em estufa; resíduo de fibra após remoção de pectina, fibras tratadas
com NaOH; e produto final após o processo de branqueamento. b) Micrografia eletrônica de
varredura por emissão de campo mostrando as nanofibras de celulose em suspensão como
produto final. c) Micrografia de sonda de varredura de nanofibras em um filme preparado para
a secagem ao ar do material celulósico (topografia) e d) micrografia de sonda mostrando a
imagem de fase.
A relação de aspecto da fibra (razão comprimento/diâmetro) foi difícil de ser
calculada, devido à distribuição tipo rede da microestrutura, onde existe uma porção não
visível do comprimento total da fibra devido ao entrecruzamento, de modo que geralmente
uma região da fibra é coberta por outras fibras.
71
Uma grande relação de aspecto está relacionada com uma melhor capacidade de
reforço em comparação com nanocristais de celulose. No entanto, uma nanofibrila de grande
comprimento obtida por hidrólise leve ou moderada envolve uma cristalinidade reduzida.
Mesmo assim, tanto as nanofibras de celulose como os nanocristais atuam como agentes de
reforço melhorando as propriedades mecânicas das matrizes poliméricas (Xu et al., 2013).
2.4.3.3. Efeito do tratamento físico-químico sobre a cristalinidade da celulose do
bagaço industrial
A Figura 2.23 junto com os valores de cristalinidade da Tabela 2.6 mostram que
uma concentração de NaOH 3% foi necessária para atingir uma cristalinidade de 72% a partir
do BI. Enquanto, a etapa adicional de hidrólise ácida em H2SO4 5% não teve efeito sobre este
valor de IC de 72%. Unicamente a hidrólise subsequente com H2SO4 10% e a hidrólise
alcalina em duas etapas produziram um aumento de 5% neste valor de IC.
Figura 2.23. Difratogramas dos sólidos resultantes da hidrólise química do bagaço industrial.
A maior resistência à hidrólise característica do BI baseia-se principalmente no
seu maior teor de lignina, uma vez que a lignina atua como agente adesivo dos componentes
presentes na matéria-prima. Deste modo, o papel das condições alcalinas convencionais é
principalmente a clivagem de ligações intermoleculares na matriz lignocelulósica para liberar
assim produtos de degradação de hemicelulose, bem como liberar ligações de hidrogênio
entre hemicelulose e celulose para o fraccionamento da estrutura lignocelulósica.
72
Tabela 2.6. Índices de cristalinidade (IC) calculados para cada produto obtido após hidrólise
do bagaço industrial envolvendo hidrólise alcalina e ácida
Material IC por DRX IC por RMN
Bagaço industrialsem pectina (BI) 0,34 -
Produto da hidrólise com NaOH 2,0% 0,55 -
Produto da hidrólise com NaOH 3,0% 0,72 -
Produto da hidrólise com NaOH 4,0% 0,72 -
Produto da hidrólise com NaOH 3,0% e H2SO4 5% 0,72 -
Produto da hidrólise com NaOH 3,0% e H2SO4 10% 0,77 0,60
Produto da hidrólise com NaOH 2,0% (duas vezes) 0,77 0,58
As ligações α-aril éter entre grupos hidroxila da lignina com grupos hidroxilo de
polissacarídeos (hemicelulose, pectina e celulose), bem como ligações éster a partir do ácido
urónico em hemicelulose com grupos hidroxilo de lignina são conhecidas por serem rompidas
neste processo As concentrações elevadas de NaOH são geralmente utilizadas para biomassa
com níveis elevados de lignina ou para hidrólise alcalina à pressão atmosférica, portanto, é
essencial determinar a carga de NaOH adequada (relação líquido-sólido) nas condições
selecionadas do processo para cada biomassa (Bicu e Mustata, 2013; Zuluaga et al., 2013).
Uma consideração importante é referente ao branqueamento destes produtos. No
caso do BN o branqueamento é feito com facilidade com NaClO2 2% m v-1
. No entanto, o
branqueamento do BI teve que ser realizado com um método auxiliar de hidrólise em duas
etapas usando H2O2 (6,5%) antes do uso de NaClO2 5% m v-1
, uma vez que esta biomassa foi
mais resistente ao branqueamento. Os procedimentos de hidrólise empregados para cada
biomassa são descritos a seguir.
Os dados até agora expostos evidenciam que o BI apresenta maior resistência
tanto na hidrólise de celulose como na hidrólise de lignina (branqueamento). No entanto esta
biomassa da indústria apresentou vantagens que favoreceriam a obtenção de nanocelulose em
uma escala maior, como obteve maior rendimento (18,4%) quando comparada com o BN
(10.8%) e uma menor demanda energética durante a sonicação, uma vez que para conseguir a
73
homogeneização desejada da suspensão de nanocelulose foram necessários 5 min para BI e 15
min para BN.
2.4.3.4. Microestrutura das fibras de celulose do bagaço de laranja industrial
Apartir dos tratamentos químicos e a sonicação foi possível observar nanofibras
através das micrografias eletrônicas de varredura mostradas nas Figuras 2.24. Também foi
calculado o diâmetro médio da nanocelulose assim obtida apartir do processamento do BI
usando o software de processamento de imagem ImageJ 1,49. O produto sólido apresenta
diâmetro estreito e comprimento na escala micrométrica. O diâmetro obtido para as fibras
preparadas a partir do BI foi 20,5 nm ± 7.
Figura 2.24. a) Fotografia do bagaço industrial do início ao fim de sua transformação em
fibras de nanocelulose. Da esquerda à direita são mostrados: matéria-prima, matéria-prima
após moagem e secagem em estufa; resíduo de fibra após remoção de pectina, fibras tratadas
com NaOH; e produto final após o processo de branqueamento. b) Micrografia eletrônica de
varredura por emissão de campo mostrando as nanofibras de celulose em suspensão como
produto final. c) Micrografia de sonda de varredura de nanofibras em um filme preparado para
a secagem ao ar do material celulósico (topografia) e d) micrografia de sonda mostrando a
imagem de fase.
Uma última avaliação da microestrutura das nanofibras obtidas a partir do BI foi
abordada a través de TEM. A imagem apresentada na Figura 2.25 mostra em detalhe as
nanofibras em suspensão diluída e homogeneizada. A imagem de TEM permitiu conferir com
maior precisão o valor do diâmetro das fibras. Este valor tinha sido anteriormente calculado
74
por FESEM para uma amostra muito concentrada que dificultou a análise do tamanho das
fibras devido ao entrecruzamento e elevada concentração das fibras (Figura 2.23). O valor
calculado foi de 23 nm ± 6,8 utilizando a imagem de TEM e 20,5 nm utilizando a imagem de
FESEM, deste modo foi avaliado o diámetro das fibras do produto obtido a partir do BI
usando duas técnicas de microscopia.
Figura 2.25. Morfologias dos produtos de hidrólise sonicados (nanocelulose do BI)
representada por micrografias eletrônicas de transmissão (TEM). À esquerda: imagem em
campo escuro a partir do BL, à direita: imagem em campo claro.
Até o momento não há estudos na literatura sobre nanocelulose extraída da casca
de laranja, porém vários estudos anteriores relataram o uso da palha de milho (Li et al., 2013),
palha de arroz (Lu e Hsieh, 2012), palha de trigo, casca de soja (Alemdar e Sain, 2008) e o
bagaço de cana (Kumar et al., 2014), como matérias primas para obtenção de fibras de
celulose por hidrólise ácida com ácido sulfúrico concentrado (64-65%).
Mesmo em condições bruscas de hidrólise ácida, os resultados de IC das celuloses
obtidas com as diferentes biomassas mencionadas foram: 0,72 para bagaço de cana, 0,78 para
palha de trigo, 0,70 para casca de soja e 0,86 para a palha de arroz, valores calculados por
XRD e que não diferem dos aqui obtidos nessa pesquisa (0,70-0,79) utilizando um método
mais brando e com hidrólise ácida moderada (5% m v-1
).
1018
75
Outros estudos realizados com biomassas similaresde baixo teor de lignina -
pseudo haste de banana e palha de abacaxi relataram hidrólises feitas também com
concentrações ácidas moderadas (5%), no entanto sob condições fisicoquímicas mais drásticas
que levaram a valores de IC maiores -0.84 e 0.89, respectivamente- (Abraham et al., 2011).
2.4.4. Efeitos da funcionalização de nanocelulose do BL in natura
As nanofibras de celulose obtidas a partir do bagaço de laranja foram estudadas
como matéria prima na obtenção de um biomaterial resistente e seletivo para drug delivery. A
função hidroxila da celulose foi modificada visando a ligação cruzada com outro composto a
fim de obter um material com boa capacidade de gelificação e boas propriedades mecânicas.
Inicialmente a função hidroxila foi oxidada usando um radical nitroxila estável
não conjugado como catalisador (TEMPO), sendo o ácido carboxílixo seu produto após
oxidação com NaClO como co-oxidante na presença de NaBr (Figura 2.26).
A instabilidade do eletron desemparelhado em TEMPO é geralmente associada à
ausência de hidrogênios α ao nitrogênio, deste modo é favorecida a formação dos
correspondentes derivados hidroxilamina e nitrona. O TEMPO em quantidades catalíticas e
meio básico gera a oxidação dos álcoois primários, sendo o produto da celulose o ácido β-1,4
poliglucurônico (ácido celurônico). Mediante RMN de 13
C de sólidos foi comprovado que a
modificação ocorre superficialmente no C-6, havendo assim pouca alteração da cristalinidade
do material (da Silva et al., 2003; Saito et al., 2007).
A oxidação por TEMPO-NaBr-NaClO é um método brando, rápido e seletivo para
polissacarídeos insolúveis e solúveis em água. O mecanismo envolve a formação inicial do
íon oxamônio por quantidades catalíticas de NaClO e o co-oxidante NaBr, sendo a seguir
reduzido a hidroxilamina (TEMPOH) e o intermediário aldeído da celulose. Este ciclo ocorre
duas vezes para finalmente formar o ácido carboxílico da celulose (Figura 2.26).
Analisando os espectros FTIR das amostras (Figura 2.27) observamos a formação
do grupo carboxilato (COONa) em torno de 1600 cm-1
, banda atribuída ao estiramento do
grupo carbonila. Além disso, ligeiros decréscimos na intensidade dos estiramentos das
ligações OH (3400 cm-1
) e CH (2900 cm-1
) são observados resultantes da oxidação (Lin et al.,
2012). No entanto, vemos que no caso desta celulose oxidada após reação com dihidrazida
adípica (ADH) são observadas ligeiras mudanças das intensidades na região do grupo
76
carbonila (1600-1700 cm-1
) e do grupo OH (3280 cm-1
). Esta é uma dificuldade já que tem
sido reportada em estudos anteriores usando FTIR para análise de grupos amina em
carboidratos (Domingues et al., 2015). Desta forma têm sido recomendadas outras técnicas
espectroscópicas como FT-Raman ou CP/MAS-rmn de 13
C que foram testadas posteriormente
com estes materiais de celulose modificada a fim de confirmar o tipo de ligação formada com
ADH e EDC/NHS.
Figura 2.26. Mecanismo reacional da oxidação do grupo hidroxila primário (C6) da celulose
na presença de TEMPO/NaBr/NaClO em pH 10 (adaptado de Isogai et al., 2011).
Uma última transição ocorre a partir de 330 °C para nanocelulose e nanocelulose
oxidada, enquanto a 340 °C corresponde à nanocelulose oxidada com adição de ADH. A
decomposição corresponde aos resíduos inorgânicos que estão presentes em maior intensidade
no produto oxidado e na nanocelulose, em torno de 40% e 30%, espectivamente.
Através dos perfis das derivadas (imagem inferior da Figura 2.28) se evidenciam
os múltiplos eventos de degradação dos derivados da nanocelulose. A forma do pico
correspondente à degradação de celulose é conservada nas três amostras. Adicionalmente, a
nanocelulose oxidada apresenta uma degradação prematura a partir de 185 °C pela
descarboxilação com um máximo a 250 °C.
77
Figura 2.27. Espectros FTIR da celulose como material de partida e após modificação
química.
Figura 2.28. Curvas de termogravimetria (superior) e derivada da perda de massa
termogravimétrica (inferior) da nanocelulose original e seus derivados.
78
Através das análises de degradação térmica foi possível conferir um perfil
diferente de degradação da celulose oxidada com adição de ADH, uma vez que apresenta dois
sinais sobrepostos de degradação prévios à decomposição da celulose com máximos de 260 e
280 °C, mesmo assim sua perda de massa máxima apresenta-se a 310 °C.
A caracterização por RMN para sólidos foi realizada a fim de avaliar, finalmente,
o produto obtido por adição de ADH à celulose oxidada. A partir dos espectros da Figura 2.29
é possível observar a ausência de grupos alifáticos pertences ao derivado do ácido adípico
dihidrazida. A falta ou baixa intensidade destes sinais indica como produto principal ao
intermediário da N-hidroxisuccinimida, uma vez que é um derivado ácido estável que
apresenta um sinal a 169 ppm correspondente ao grupo carbonila da amida simétrica (Figura
2.30), além do sinal do grupo carbonila da oxidação por TEMPO (175 ppm). O
entrecruzamento deste material com função éster ocorreria assim a través da condensação
entre uma amina primária de outro polímero ou biomolécula e o derivado éster obtido da
celulose.
Figura 2.29. Espectros RMN para os produtos sólidos de celulose modificada.
79
Uma possível causa deste insucesso poderia ser devido à coesão das nanofibras de
celulose obtidas, já que anteriormente o protocolo foi aplicado exclusivamente em
carboidratos de menor massa molecular ou solúveis em água, e. g. CMC (Yang et al., 2013) e
nanocristais de celulose (Domingues et al., 2015). Deste modo, o alto grau de polimerização
das nanofibras de celulose poderia ter impossibilitado o acesso do grupo amina primário do
ADH.
Uma rota de reação utilizada para aumentar a reatividade dos ácidos carboxílicos
é a formação de carboxilato de amônio ou halogenetos de acila, seguida da adição do
composto com função amina sob aquecimento com o intuito de favorecer a dehidratação e
posterior formação de amidas (Vollhardt e Schore, 2013).
Figura 2.30. Possíveis reações obtidas por adição de ADH e EDC/NHS à celulose oxidada
por TEMPO-NaBr-NaClO (adaptado de Zhuang et al., 2017).
2.5. CONCLUSÕES E PERPECTIVAS
A primeira etapa deste projeto de pesquisa se baseou em caracterizar
estruturalmente o nanomaterial obtido pelo bioprocessamento do BL com enzimas
intracelulares de Xac (306). Posteriormente, foi estudado um bioprocesso diferente para
hidrolisar o BL usando enzimas extracelulares e a fim de comparar estruturalmente os
produtos celulósicos obtidos em cada tratamento.
As análises espectroscópicas e de raios-X permitiram evidenciar o aumento do
conteúdo de celulose cristalina, isto devido à solubilização de celulose amorfa e pectina pelas
enzimas de baixo custo. Mediante o perfil de RMN foi possível comprovar que o sólido
80
obtido por ambos os tratamentos testados correspondeu à estrutura da celulose Iα. Além disso,
a hidrólise por enzimas de baixo custo e subsequente sonicação resultaram em fibras de
nanocelulose com uma alta área superficial, que possuem um diâmetro médio de 12 nm, 55%
de cristalinidade para o tratamento com enzimas intracelulares e 58% de cristalinidade para o
tratamento com enzimas extracelulares de Xac (306), acrescentando assim um valor agregado
ao resíduo agrícola da laranja.
Além disso, foi possível definir as melhores condições para o processo de
obtenção da nanocelulose por via química mediante avaliação da cristalinidade obtida com
diferentes concentrações de NaOH e subsequente hidrólise com H2SO4. As nanofibras obtidas
por este processo possuem em torno de 60% de cristalinidade apartir de bagaço industrial (BI)
e 58% a partir de bagaço in natura. Um branqueamento rigoroso é necessário quando a
biomassa de origem é o BI, no qual é preciso aplicar uma etapa adicional de branqueamento
com H2O2 6,45% (m v-1
). No caso do bagaço in natura, foi também possível definir a
concentração mínima (1%) necessária para branqueamento com NaClO2.
A etapa de hidrólise ácida branda para extração de pectina pode ser aplicada
inicialmente, no entanto não é necessária quando é realizado um passo de hidrólise ácida
moderada como etapa final (5-10% de H2SO4). Já no processo de nanonização por sonicação,
o bagaço da indústria apresentou a vantagem de atingir a homogeneização após 5 min de
tratamento, requerendo assim uma menor demanda energética. As nanofibras de celulose
apresentaram uma elevada relação entre o comprimento e o diâmetro, com valores em torno
20 nm de diâmetro médio. Enquanto o rendimento a partir do BI foi de 18,4% e 10,8% a partir
do BN.
81
3. IMOBILIZAÇÃO COVALENTE DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS
No capítulo anterior foram apresentadas algumas características do funcionamento
das celulases e β-glicosidases como biocatalisadores (p. 30). A hidrólise de celulose através
destas enzimas libera glicose com uma alta especificidade a ser fermentada para produzir
etanol ou derivados a partir de biomassa lignocelulósica. No entanto, as enzimas solúveis
apresentam tempo de meia-vida operacional curta, devido à perda de atividade e inibição pelo
substrato e/ou produto durante os bioprocessos, motivo pelo qual sua utilização via catálise
homogênea é associada a altos custos de manufatura nas biorrefinarias (produção e
purificação). Nesse cenário, o confinamento físico das enzimas é uma estratégia que pode
aumentar a atividade enzimática ao longo do bioprocesso, uma vez que neste estado a
biomolécula apresenta maior resistência às mudanças do meio reacional, como pH,
temperatura, solventes orgânicos. As técnicas de imobilização são classificadas como
encapsulação, adsorção, inclusão e ligação covalente. Contudo, a imobilização covalente em
suportes sólidos possibilita a separação do meio reacional, a reutilização das enzimas para
vários ciclos de hidrólise.
Neste capítulo, será abordada a imobilização das enzimas necessárias para
hidrolisar a celulose em um suporte sólido, sendo estudadas as diferentes etapas envolvidas,
síntese do suporte, condições da imobilização e reutilização para dois tipos de suportes
sólidos, visando seu desempenho como agentes estabilizadores das enzimas hidrolíticas por
ligação covalente.
O intuito deste estudo de imobilização enzimática é a viabilização da etapa de
hidrólise para gerar etanol-2G como produto de valor agregado da química verde.
Anteriormente nosso grupo de pesquisa obteve este produto a partir de resíduos da casca de
laranja, no entanto os estudos anteriores estiveram focados na análise dos rendimentos obtidos
para diferentes micro-organimos durante a etapa fermentativa (Awan et al.,2013; Cypriano et
al., 2016), enquanto que o assunto atual é relacionado com a fase hidrolítica, etapa prévia à
fermentação e, para isto, foi escolhido um dos coquetéis enzimáticos comerciais mais
estudados para produção de etanol-2G, o Celluclast®, constituído pelas enzimas
extracelulares do fungo Trichoderma reesei que possuem uma alta eficiência para liberar
glicose.
82
3.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O rendimento da hidrólise enzimática da celulose começa, geralmente, sendo
estudado através da seleção de micro-organismos e otimização das condições de pré-
tratamento da biomassa; com o objetivo de identificar inibidores e avaliar o desempenho das
enzimas envolvidas a fim de aumentar sua estabilidade, além de diminuir as barreiras
tecnológicas do uso de material lignocelulósico para a produção de etanol.
Umas das abordagens que busca melhorar o rendimento das enzimas na
bioconversão de biomassa lignocelulósica, tem sido o uso de um sistema insolúvel enzima-
suporte, que permite aumentar a vida enzimática útil através do desenvolvimento de um passo
de recuperação e reuso do catalisador como um sólido, além de aumentar a estabilidade das
enzimas neste estado (Davison e Nghiem, 1999).
Outras vantagens da aplicação industrial desta técnica são: possibilidade do uso de
sistemas contínuos com o reciclo do catalisador, facilidade no manuseio e controle do reator
enzimático, fácil recuperação do produto do catalisador, o que permitiria a aplicação de cargas
constantes de enzima.
No entanto, algumas desvantagens também se destacam: perda de atividade da
enzima após o processo de imobilização devido a mudanças de sua estrutura nativa, possíveis
restrições de difusão ou impedimento estéreo-espacial durante a catálise associados com uma
alta heterogeneidade do sistema, isto geralmente ocorre quando existem múltiplas ligações ou
ligações cruzadas entre ou mais enzimas específicas (Arroyo, 1998). As desvantagens vão
depender principalmente da técnica de imobilização e da enzima a ser imobilizada.
3.1.1. Métodos de imobilização enzimática
A partir do fenômeno envolvido no processo de confinamento da proteína, os
métodos de imobilização são classificados em duas grandes categorias apresentadas na Figura
3.1: métodos de retenção física e métodos de retenção química (ligação).
83
Figura 3.1. Fluxograma dos métodos de imobilização enzimática.
Encapsulação:
Aprisionamento físico ou oclusão da enzima nos interstícios ou cavidades internas
de uma matriz sólida porosa. Geralmente a enzima é confinada em um gel, como alginato,
poliacrilamida, sílica e agarose, ou é ocluída em uma rede polimérica fibrilar como celulose e
poliuretanas. Deste modo, a estrutura nativa da enzima é conservada, sendo que não há perda
de atividade. A vantagem relacionada com o isolamento da enzima do meio externo é que se
impede a inativação por mudanças no meio. Além disso, esta técnica permite um menor risco
de lixiviação da enzima através do controle do tamanho dos poros durante o processo de
encapsulação.
A principal desvantagem da encapsulação é a limitação de transporte do substrato
ao sítio ativo da enzima pelos poros da matriz (Arroyo, 1998; Souza et al., 2017).
O processo de confinamento envolve, usualmente, a polimerização in situ em uma
suspensão proteica por adição de um iniciador da reação, por mudanças de temperatura ou por
gelificação ionogênica. Como já foi mencionado, isto possibilita um maior controle sobre o
ambiente químico da enzima, porém o efeito dos precursores da polimerização sobre a
atividade da enzima ainda precisa ser bem esclarecido.
84
Contudo, estudos de nanomateriais para encapsulação de enzimas têm
demonstrado ser eficientes para diversas aplicações em áreas como biomedicina, biosensores,
e química verde. A produção de biodiesel por encapsulação da lipase de Candida rugosa
mediante o uso de quitosana, carragenina e silanos hidrofóbicos destacam-se como processos
promissores deste método aplicado à química verde, entre outros (Reetz et al., 1995; Romero
et al., 2014).
Adsorção física:
A adsorção física é o método mais simples e barato para imobilizar uma enzima.
No entanto, esta opção envolve interações de baixa energia (hidrofóbicas e ligações de
hidrogênio) que favorecem a lixiviação ou dessorção do catalisador por variações de pH,
temperatura ou força iônica. A fim de evitar a perda de carga proteica devem ser estudados
alguns fatores relacionados ao ambiente químico da enzima e do suporte assim como
otamanho da enzima, área superficial do adsorvente, porosidade e tamanho do poro.
Dentre os materiais usados para adsorver enzimas foram reportados:
carboximetilcelulose, amido, argila, colágeno, sefarose modificada, resinas de troca iônica,
sílica gel, óxido de alumínio, titânio, hidroxiapatita, etc.
Diversos suportes têm sido testados para adsorção de celulases, entre eles eudragit
L-100, N-succinil-quitosana e sílica. O melhor resultado foi para sílica nanoparticulada não-
porosa defumada S5130 da Sigma Aldrich (7 nm de diâmetro e área superficial de 390 ± 40
m2 g
-1), uma vez que altos valores de atividade enzimática foram observados para duas
preparações comerciais: celulases de T. reesei ATCC 26921 da Sigma Aldrich e celulases de
T. reesei e A. niger da Novozymes. Estudos de estabilidade e reciclo deste sistema não foram
avaliados durante o estudo de Ikeda et al.,(2014).
Inclusão em membranas:
Existem duas modalidades de imobilização enzimática por inclusão: a
microencapsulação, em que as enzimas estão cercadas por membranas semipermeáveis ao
produto e ao substrato, e os reatores de membrana, que consistem em membranas permeáveis
principalmente ao produto final.
As membranas para microencapsulação geralmente possuem diâmetros de 1-100
μm e podem ser permanentes (sintetizadas por polimerização interfacial) ou não permanentes
85
(originadas por surfactantes, as chamadas micelas reversas). Através desta configuração
diversas biomoléculas, como enzimas, e até mesmo células podem ser imobilizadas, a fim de
facilitar a liberação de produtos efetuados em bioprocessos de múltiplos passos. Inicialmente
a alimentação do substrato ao sistema é realizada por bombeamento de um fluxo líquido ao
reator com a enzima previamente adsorvida. As membranas poliméricas são amplamente
usadas para este propósito, e.g. celulose, policarbonato, agarose, resinas epóxicas (e.g.
Sepabeads), quitosana, resinas acrílicas de afinidade (Toyopearl, Japão) e politereftalato.
(Dussán, 2008; Souza et al., 2017).
A maioria dos métodos de imobilização por retenção física não são aplicáveis para
catalisar a transformação de substratos sólidos, como é o caso da hidrólise de celulose, uma
vez a difusão do substrato pela matriz não seria possível ou seria muito baixo para substratos
de alta massa molecular. Desse modo, os métodos por ligação química apresentam-se como
uma melhor opção. No entanto, deve-se estudar previamente um suporte que mantenha a
afinidade da enzima pelo substrato e consiga aumentar a produtividade e a estabilidade do
sistema catalisador ao longo do tempo de reação. A seguir serão apresentadas as diversas
características destes suportes e algumas aplicações destacadas de hidrólise enzimática.
Adsorção iônica:
Dentre as técnicas de imobilização por ligação a suportes, a adsorção iônica
abrange as interações relativamente fracas, como a formação de quelatos. Estas interações
conservam a estrutura da biomolécula e apresentam uma força eletrostática de ligação
suficiente para proteger as enzimas de proteólises ou aglomeração. Devido à alta
susceptibilidade deste sistema às mudanças inesperadas de pH ou força iônica, a efetividade
do suporte deve ser possível em uma faixa ampla de pH.
Além disso, a capacidade do suporte para ligar a enzima pode ser elevada
dependendo da natureza da enzima. Geralmente os compostos utilizados são intertrocadores
orgânicos de íons, e.g. DEAE, ou compostos com metais de transição, e.g. titânio e níquel.
Recentemente, foi desenvolvido um sistema de adsorção iônica para hidrólise de
celulose integrado por uma geometria cilíndrica com fios externos como uma escova. O
material polimérico sintetizado por Samaratunga e colaboradores (2015) apresentou uma
carga enzimática de 96% para celulase de T. viride e 66% para β-glicosidase de A. niger. Uma
86
proporção alta de celobiose no hidrolisado sugere uma menor disponibilidade de substrato
para β-glicosidase, deste modo, a suplementação desta enzima é aconselhável seja na forma
solúvel ou imobilizada por outra técnica de retenção.
A preparação do suporte consistiu na polimerização radicalar dos monômeros de
t-butil acrilato a ácido poliacrílico sobre uma superfície nanoparticulada de sílica (em torno de
100 nm de diâmetro). Os fios resultantes apresentaram uma espessura de 25 nm como
polieletrólitos de carga negativa. Como resultado, as proteínas foram adsorvidas nos fios
poliméricos através de interações eletrostáticas em pH 4,8, sendo a hidrólise realizada com
papel de filtro Whatman No. 1 e celulose em pó (Solka-Floc), no entanto, os passos de
recuperação e reutilização do suporte não foram investigados pelos autores.
Ligação covalente:
A ligação covalente entre a enzima e um suporte insolúvel de imobilização produz
uma retenção forte e estável após a inserção de grupos reativos ao suporte, não obstante, a
rigidez da proteína geralmente é modificada podendo ser um efeito positivo (maior
estabilidade quanto à variação de pH, temperatura ou solventes) ou negativo (inativação pela
formação do sistema enzima-suporte) para o funcionamento da enzima.
Neste sentido, a maior contribuição para o bom desempenho da enzima
imobilizada é dado pelo suporte sólido. Esta técnica oferece também a possibilidade de
aplicar várias conformações de reatores: fluxo contínuo, empacotado, tanque agitado ou leito
fluidizado (Mendes et al., 2011).
Os grupos funcionais pertencentes aos resíduos dos aminoácidos das proteínas
reagem com alguns grupos funcionais na superfície do suporte, sendo predominantemente os
grupos amino (NH2) da lisina e arginina, assim como os grupos carboxílicos (COOH) do
ácido aspártico e ácido glutâmico. Outros possíveis grupos reativos são a sulfidrila da cisteína
e grupos hidroxila da serina, tirosina e treonina. Os aminoácidos restantes não estão expostos
na superfície da enzima devido à sua hidrofobicidade de modo que não intervêm na ligação
covalente (Arroyo, 1998; Romero et al., 2014).
Os derivados enzimáticos por ligação covalente são comumente formados por
amidas resultantes da reação entre os grupos amina da enzima e grupos carboxílicos do
suporte ou vice-versa. Adicionalmente, ativadores desta reação são usados como carbodiimida
87
en-hidroxisuccinamida (NHS) para favorecer a conversão de ácidos carboxílicos do suporte
através de grupos éster mais reativos. Igualmente, grupos epóxi e aldeído do suporte reagem
com grupos amino da enzima por via covalente (Jia et al, 2014).
Outra modalidade de imobilização enzimática covalente consiste na adição de um
reagente bifuncional atuando como braço espaçador. Um ativador deste tipo conecta o suporte
e a enzima proporcionando uma maior mobilidade durante o funcionamento do biocatalisador.
O glutaraldeído é um dos reagentes bifuncionais mais empregados para este propósito, pois
envolve um método simples e efetivo que não inativa as enzimas quando é adicionado em
baixas concentrações (Ahmad e Sardar, 2015).
A eficiência do processo de imobilização dependerá principalmente da
flexibilidade resultante no sítio ativo da enzima imobilizada, assim como a disponibilidade do
domínio de ligação ao substrato no caso das celulases. As enzimas que catalisam a hidrólise
de biomassa, principalmente celulases, hemicelulases e pectinases, imobilizam-se
corretamente naqueles suportes com área superficial alta e distribuição de tamanho de poro
estreita, o que permite uma fácil difusão dos substratos para o sítio ativo das enzimas
(Hartono et al., 2010). A mobilidade da enzima estará, também, em função do número de
ligações entre o suporte e a enzima, e isto, por sua vez, depende dos grupos funcionais por
unidade de área do suporte e da conformação dos grupos funcionais da proteína (Souza et al.,
2017). Na Figura 3.2 pode-se conferir a reação de formação de bases de Schiff entre um
suporte com grupos amina e uma enzima (E) com o glutaraldeído atuando como braço
espaçador.
Figura 3.2. Imobilização enzimática covalente: aminopropiltetraetilsilano reage com
glutaraldehído e o N-terminal da enzima (E: enzima - retirado de Hartmann e Jung, 2009).
Foram destacados alguns dos resultados obtidos para imobilização covalente de
celulases em suportes:
88
Zhang e colaboradores (2012) reportaram uma alta retenção de 88,76% da
atividade de celulases provenientes de Shanghai Bio Life Science &Technology Co. Ltda
(China). O processo de ativação foi realizado com carboiimida e NHS com eudagrit L-100
como suporte. Valores menores de atividade da enzima imobilizada foram obtidos para
eudagrit S-100 com celulases Suhong B989N (Novozymes, USA), correspondente a 45% da
atividade inicial, e para o sobrenadante conformado por enzimas de T.reesei PTCC 5142 foi
obtido um valor de apenas 35% de atividade com sílica ultrafina não porosa e glutaraldeído
como ativador (Afsahi et al., 2007).
A endoglucanase de T.viride foi ligada à nanoesferas de poliestireno com 20 nm
de diâmetro por entrecruzamento com carboiimida e NHS. O derivado sólido resultante foi
avaliado durante a hidrólise de CMC e comparado com a catálise da enzima livre. Além disso,
a liberação de glicose a partir deste substrato foi estudada para várias concentrações de CMC,
dando como resultado um aumento de 50% da concentração de glicose durante a catálise de 1
mg mL-1
e 130% durante a catálise de 100 mg mL-1
de CMC (Blanchette et al., 2012).
Reticulado:
O reticulado ou entrecruzamento (cross-linking) é uma técnica de imobilização
covalente livre de suportes que envolve a interligação das biomoléculas por um reagente
bifuncional. O resultado é uma estrutura tridimensional complexa, supramolecular, composta
por enzimas com ligações intermoleculares irreversíveis aptas para resistir a condições
extremas de pH e temperatura.
A preparação destes compostos enzimáticos insolúveis de elevada massa
molecular pode ser realizada por vários métodos, no entanto, o mais utilizado atualmente
consiste na cristalização de enzimas e posterior entrecruzamento com glutaraldeído (cross-
linked enzyme crystals ou CLECs). O produto é uma rede enzimática cristalina geralmente de
alta estabilidade e possui cavidades de 20-50 Å que possibilitam o contato do substrato com o
sítio ativo e tamanho total de 1-100 µm. Outras técnicas de cross-linking enzimática são
enzimas atomizadas reticuladas (cross-linked spray-dried enzyme ou CSDE) e agregados
enzimáticos reticulados com tamanhos de 0,1-1 µm (cross-linked enzyme aggregates –
CLEAs). A Figura 3.3 mostra as diferentes conformações para cada uma destas técnicas de
imobilização livre de suportes.
89
Os agentes bifuncionais são dialdeídos, diiminoésteres, diisocianatos e sais de
bisdiazonio. Os agregados enzimáticos são induzidos por adição de solventes orgânicos,
polímeros não iônicos ou sais a uma solução aquosa da proteína. Os agregados não perturbam
a estrutura terciária da proteína uma vez que é alterada somente a constante eletrostática da
solução mudando assim o estado de hidratação das biomoléculas. A seguir o agente
bifuncional estabiliza os agregados a través da ligação covalente com os grupos amina das
enzimas.
Uma alta atividade volumétrica e baixo custo de produção são característicos dos
CLEAs. Além disso, a atividade foi recuperada para CLEAs em solventes orgânicos,
possibilitando assim a aplicação em múltiplas reações (Cao, 2005). Os CLECs apresentama
desvantagem de requerer a enzima em sua forma pura e previamente cristalizada, o que faz
este método bastante oneroso, no entanto tem sido aplicado em diferentes enzimas de
interesse industrial (termolisina para produção de peptídeos, ciclodextrina glicosiltransferase
para produzir ciclodextrina, lipase de pâncreas de porco para produzir laurato de laurila,
glicoamilase para hidrólise de amido, para desenvolvimento de biossensores, entre outros
estudos) (Souza et al., 2017).
Figura 3.3. Conformação supramolecular dos sistemas enzimáticos por ligação covalente
livres de suportes. (a). Cristalização prévia da enzima (CLEC) – CRY: cristais da enzima, (b)
agregação prévia da enzima (CLEA) – AGG: agregados enzimáticos, (c) secagem por
atomização prévia da enzima (CSDE) – SDE: enzima atomizada, (d) reticulação direta da
enzima solubilizada (CLE) – Adaptado de Souza et al.,2017.
90
A principal desvantagem da formação dos CLEAs é a perda de atividade devido à
formação de aglomerados (clusters) e/ou limitações na difusão do substrato e do produto pelas
cavidades do reticulado enzimático (Souza et al., 2017).
A precipitação de celulases para a formação de CLEAs é um processo
amplamente estudado usando principalmente solventes orgânicos e sais em diferentes
concentrações. Os resultados obtidos nestes estudos são mencionados a seguir para o processo
de reticulação com glutaraldeído como fator comum:
Três solventes orgânicos foram estudados em função da atividade recuperada do
coquetel enzimático PectinexTM
Ultra SP-L (xilanase, celulase e pectinase de A.niger da
Novozymes, India): acetona, dimetoxietano e n-propanol em uma proporção 5:1 de solvente e
solução proteica, respectivamente. O n-propanol não teve efeito negativo sobre a atividade
resultante após precipitação a 4 °C, enquanto a concentração adequada de glutaraldeído para o
processo de reticulação realizado durante 15 min a 4 °C foi de 5 mmol L-1
. A estabilidade
térmica da celulase foi aumentada neste sistema de reticulação (Dalal et al., 2017).
Li e colaboradores (2012) reportaram a retenção de 80% m.v-1
da atividade de
celulase comercial de T. viride após precipitação com sulfato de amônio 95%. Solventes
orgânicos também foram testados e apresentaram atividades relativas menores do que 40%
(PEG 6000 100% e 60%; PEG 4000 100% e 60%, etanol 100% e 95% e acetona 100% e
80%). As condições ótimas durante a obtenção do CLEA foram 50 mg mL-1
de proteína e 3%
v v-1
de glutaraldeído durante 10 h a 30 °C. Neste estudo a enzima reticulada apresentou
igualmente uma maior estabilidade térmica.
Um sistema bifásico de sulfato de amônio 55% m v-1
e t-butanol (razão de volume
1: 0,75) permitiu a precipitação de xilanases, celulases e β-1,3-glucanases de uma cepa
mutante de T. citrinoviride AUKAR04 no trabalho de Periyasamy e colaboradores (2016).
Neste sistema (combined CLEAs) 99% da atividade foi recuperada após 90 min de
precipitação a 25 °C. A atividade restante após seis ciclos de hidrólise de bagaço de cana pré-
tratado foi 90% da atividade inicial e uma maior estabilidade térmica também foi reportada. A
concentração ótima de glutaraldeído foi 100 mmol. L-1
durante 7,5 h de reticulação a 30 °C.
91
Co-reticulado:
Com o intuito de diminuir as limitações difusionais uma proteína sem atividade e
rica em resíduos de lisina é adicionada antes do processo de reticulação. Os produtos
resultantes são chamados co-reticulados ou co-precipitados e têm sido obtidos também por
adição prévia de um polímero iônico solúvel. Usualmente é utilizada a polietilenoimina (PEI)
que atua como um agente estabilizante da enzima já que apresenta uma estrutura com uma
alta densidade de grupos aminoterminais.
Este método de co-precipitação é particularmente aplicado para evitar a
dissociação das subunidades de enzimas multiméricas e conservar, assim, a atividade da
enzima reticulada. Entre as diversas enzimas reticuladas destacamos aqui aquelas que tiveram
sua estabilidade catalítica melhorada: papaína, L-aminoacilase, penicilina G acilase, lipases,
β-galactosidase e lacase, assim como enzimas dependentes de cofatores como oxidorredutases
e liases (Souza et al., 2017).
Referente às celulases, a co-reticulação da celulase de T. reesei e a β-glicosidase
de A. niger com glutaraldeído foi estudada por Busto e colaboradores (1997) na presença de
ácidos húmicos do solo variando a temperatura entre 4-45 °C e o tempo de reação (15 a 240
min). A temperatura não influenciou significativamente no processo de reticulação, no entanto
o tempo de reação necessário para obter uma alta atividade da enzima imobilizada foi de 15
min. O processo de reticulação com glutaraldeído 2,5% v v-1
favoreceu especialmente a
formação de CLEAs de β-glicosidase uma vez apresentou uma atividade específica em torno
de 150% e uma estabilidade térmica melhorada, enquanto que para a celulase, a atividade
recuperada foi menor do que 24%. Paralelamente, a formação de co-reticulados a 45 °C com
ácidos húmicos aumentou a atividade específica das duas enzimas durante 15 min de reação.
Sendo assim obtidos valores de atividade específica de 244% para β-glicosidase e 151% para
celulase.
Adicionalmente, o efeito da temperatura e da pressão foi estudado por Hopnik e
colaboradores (2012) durante o processo de co-reticulação de celulases da Novozymes
(Cellusoft conc. L, Denmark). Inicialmente, a precipitação foi realizada com 90% de acetona e
10% de enzima a 25 °C, enquanto a co-reticulação dos agregados enzimáticos foi avaliada
para temperaturas entre 40 e 50 °C e pressões de CO2 entre 10 e 20 MPa. A co-reticulação foi
aplicada com glutaraldeído, pentaetilenehexamina (PEHA) e albumina. A maior atividade
92
enzimática foi obtida com 40 °C, 10 MPa e sob uma velocidade de pressurização baixa de 0,3
MPa.min-1
.
Nesta seção foram resumidas as técnicas para imobilizar enzimas e, a partir da
análise das vantagens e desvantagens de cada uma delas, acredita-se que os métodos de
ligação covalente têm apresentados os melhores resultados para serem aplicados às enzimas
hidrolíticas da celulose.
Particularmente os CLEAs destacam-se pelo baixo custo de produção e
simplicidade. No entanto, o uso de suportes sólidos facilitaria a recuperação e reutilização do
sistema enzimático na escala industrial, uma vez que os CLEAs apresentam desvantagens,
como entupimento de filtros e necessidade de resuspensão prévia a cada ciclo de reação a fim
de prevenir limitações difusionais. Aliás, os parâmetros desejados na hora de escolher o
suporte adequado de imobilização por ligação covalente é a facilidade para recuperá-lo e
reutilizá-lo junto com a enzima ativa. Contudo, para uma avaliação completa da técnica de
imobilização é primordial o estudo da etapa de reutilização do suporte enzimático uma vez
isto determinará a viabilidade de sua aplicação em uma escala maior.
3.1.2. Nanopartículas como suportes de imobilização para glicosil-hidrolases
No capítulo anterior, vimos as enzimas capazes de solubilizar completamente
celulose a glicose, sendo agrupadas em duas classes: celulases (endoglucanases e
celobiohidrolases) e β-glicosidases. No entanto, estes três tipos de enzimas envolvidas na
sacarificação de celulose são usualmente classificadas como glicosil-hidrolases.
Uma das preparações enzimáticas de glicosil-hidrolases amplamente distribuídas é
a produzida por fermentação submersa do fungo T. reesei (Celluclast® de Novozymes), um
micro-organismo com uma capacidade acentuada para secretar celulases em altas
concentrações. Um coquetel enzimático deste fungo geralmente envolve duas
celobiohidrolases (CBHI e CBH II) e quatro endoglucanases (EGI, EGII, EGIII e EGV), que
corresponde em torno de 90% da proteína total (Tabela 3.1). Por outro lado, as β-glicosidases
secretadas geralmente apresentam menos de 1% da proteína total (Herpöe, et al., 2008; Lynd
et al., 2002).
93
Tabela 3.1. Propriedades de glicosil hidrolases de T. reesei (Vinzant et al., 2001)
Enzimas
de T.
Reesei
Massa
molecular
(kDa)
Número de
amino-
ácidos
pI calculado
(experimental)
EG I 48,209 459 5,50 (4,7)
EG II 44,228 418 5,60 (5,5)
EG III 23,481 218 6,20 (7,4)
EG IV 35,512 344 5,50
EG V 24,412 242 5,10
CBH I 54,075 513 5,60
CBH II 49,655 471 5,90
XYN I 24,583 229 5,60
XYN II 24,173 222 9,10
ΒGLI 78,436 744 6,50
Diversos suportes sólidos têm sido testados para imobilizar glicosil-hidrolases
(endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase). A síntese e avaliação de um suporte de
imobilização permite um maior controle do desempenho da enzima imobilizada em
comparação com os CLEAs. Adicionalmente, os avanços da nanotecnologia tem possibilitado
o estudo das nanopartículas magnéticas (NPM) a fim de simplificar a separação de
biomoléculas dos meios de reação e a subsequente reutilização.
Sabe-se que as dimensões das nanopartículas são comparáveis com vírus (20-500
nm), proteínas (5-50 nm) e genes (10-100 nm) podendo assim interagir integramente através
de sua área superficial (Tartaj et al., 2005). No entanto, os processos de recuperação de
nanosuportes após uma reação (downstream processing) geralmente são complexos devido às
baixas densidades destes materiais. Porém, a integração de NPM a suportes funcionalizados
para imobilizar biomoléculas apresenta processos de recuperação e reutilização simples em
direção a fontes magnéticas (Misson et al., 2015).
A partir da estrutura química os suportes são classificados como inorgânicos ou
orgânicos, enquanto que, através da morfologia são classificados como porosos, não porosos
ou géis. A seguir, serão abordadas as principais características dos suportes nanoestruturais
que exercem influência durante a imobilização de enzimas:
Razão entre superfície e volume. Um nanomaterial poroso possui elevada área superficial
interna para acomodar as enzimas, no entanto o tamanho dos poros deve ser avaliado a fim de
evitar limitações de difusão durante a catálise. Os suportes não porosos, e. g. NMP, são mais
94
adequados para catalisar substratos sólidos ou de maior massa molecular, uma vez as difusões
tanto interna como externa são favorecidas (Souza et al., 2017).
Carregamento de grupos funcionais. Uma alta densidade dos grupos reativos na superfície do
suporte favorece uma alta carga de enzima e assim aumenta o rendimento da reação,
entretanto, algumas enzimas podem perder atividade após múltiplas ligações covalentes que
geram impedimento estéreo-espacial (Misson et al., 2015).
Taxa de fluxo. Sabe-se que um sistema de imobilização com uma alta atividade enzimática
usualmente apresenta movimento browniano e boa estabilidade química e mecânica. Além
disso, as nanopartículas apresentam monodispersão em suspensão aquosa. Para que isto
ocorra, segundo a equação de Stokes-Einstein, a mobilidade e difusibilidade das
nanopartículas do suporte devem ser menores do que as da enzima livre, uma vez que as
enzimas são relativamente de maior tamanho.
Os nanosuportes de imobilização orgânicos mais empregados são nanopartículas
de poliestireno, quitosana, ácido polilático, nanofibras de celulose, polivinil álcool, nanofibras
de polissulfona, fibra de seda policaprolactona, sílicas mesoporosas, etc. Entre os
nanosuportes de imobilização inorgânicos destacam-se as NPM, zircônia, nanopartículas de
ouro revestidas, óxido de titânio, óxidos de silício, zeolitas, etc (Souza et al., 2017).
Entre esses materiais, os mais promissores têm sido nanopartículas de sílica
revestidas e NPM (Garcia et al., 1989; Jordan et al., 2011; Zang et al., 2014; Zhang et al,
2016; Jia et al., 2017). Especificamente, as NPMs facilitam a separação do meio reacional
através do uso de magnetos, quando for preciso regenerar o substrato do biorreator, enquanto
que os silanos possuem diâmetros de poros ordenados, cujo tamanho pode ser direcionado a
fim de proteger adequadamente as enzimas alvo.
Após a síntese do suporte, as enzimas podem ser adsorvidas ou aprisionadas nos
poros dependendo do tamanho molecular, enquanto a retenção dependerá principalmente dos
grupos funcionais introduzidos pós-síntese na estrutura externa do material. Tanto as NPMs
quanto os suportes de organosilanos demonstraram maior rendimento da imobilização quando
suas superfícies foram previamente funcionalizadas previamente com o objetivo de ligar-se
covalentemente à enzima (Jordan et al., 2011; Zhang et al., 2016). A seguir, serão discutidas
95
as características dos sistemas magnéticos nanoestruturados que têm sido estudados para
imobilizar enzimas visando à hidrólise de celulose.
3.1.2.1. Imobilização de celulases e β-glicosidases em NPM de magnetita
As NPM têm possibilitado um grande número de aplicações biomédicas e
biológicas, uma vez que os suportes com núcleo magnético podem ser usados para recuperar
moléculas bioativas em meios aquosos, e.g. proteínas ou anticorpos. Especificamente, os
óxidos de ferro, magnetita (Fe3O4) e maghemita (γ-Fe2O3), podem ser facilmente preparados
com tamanhos controláveis. As propriedades magnéticas destes materiais são melhoradas
conforme a diminuição do tamanho de seus cristais. Experimentalmente, valores altos de
magnetização foram obtidos para tamanhos de partícula de magnetita menores do que 100 nm
(Laurent et al., 2008).
Sabe-se que a magnetização envolve a soma dos momentos magnéticos dos
átomos da amostra por unidade de volume. Os cristais das nanopartículas suspensas
apresentaram tamanhos menores do que os domínios estruturais (clusters) do material ferro-
ou ferrimagnético, sendo assim os domínios do material completamente magnetizados.
A estabilidade térmica de glicosil-hidrolases tem sido reportada em diferentes
estudos. Jordan et al., (2011) conseguiram este efeito usando um complexo de celulases da
Genencor (Rochester, NY) imobilizadas em NPM via ligação com carboiimida. A maior
atividade enzimática recuperada foi de 63%, no entanto a imobilização não teve bons
resultados, uma vez que as perdas de atividade para posteriores ciclos de hidrólise foram altas
devido à falta de funcionalização das NPM. Outros resultados similares de estabilidade
térmica foram apresentados para β-glicosidase de A. niger ligada a NPM por entrecruzamento
com glutaraldeído (Verma et al., 2013) e β-glicosidase ligada a NPM revestidas com sílica e
dopadas com ouro (Cho et al., 2012).
Outra abordagem integra a formação de CLEAs e a reticulação sobre suportes
magnéticos funcionalizados. A incorporação dos agregados enzimáticos a suportes
magnéticos busca facilitar a separação dos biocatalisadores através do uso de imãs, além de
evitar as dificuldades do uso de CLEAs livres de suportes. As vantagens desta técnica,
comparada com os CLEAs sem suporte, incluem uma maior difusão do substrato, menor
entupimento dos filtros de separação e ganho de estabilidade e facilidade de transporte.
96
A reticulação de agregados enzimáticos com glutaraldeído (150 mmol L-1
) foi
abordada usando suporte com núcleos-caroços magnéticos funcionalizados com grupos amina
derivados de silicatos (3-aminopropiltetraetil silano da Figura 3.4). Bhattacharya e Pletschke
(2014) inicialmente testaram o sistema ao precipitar xilanases com sulfato de amônio (80% m
m-1
) a partir dos extratos da bactéria termofílica Bacillus gelatini ABBP-1. Os resultados
demostraram uma maior atividade específica para β-xilosidase e α-arabinofuranosidase, além
de atividades de β-galactosidase e esterase. A presença de Ca2+
melhorou a estabilidade do
sistema de xilanases para 80% e 90% de atividade retida, respectivamente, após 136 h de
hidrólise do bagaço de cana pré-tratado. A separação e reutilização do suporte não foram
avaliadas pelos autores.
O seguinte estudo foi a precipitação com sulfato de amonio 60% (m.m-1
) de
celulases comerciais de A. niger e posterior reticulação a 4 °C com glutaraldeído em NMP
funcionalizadas com tetraortosilicato (TEOS) e trietilamina (Khorshidi et al., 2015). A adição
de sacarose 10% (m v-1
) neste processo ajudou o aumento de 10% da atividade de
endoglucanase em comparação ao processo sem adição de sacarose (65% de atividade retida).
Uma alta estabilidade em função do pH foi observada e boa estabilidade operacional durante a
hidrólise de CMC, no entanto, o sistema teve perda brusca de atividade durante a reutilização
do suporte sintetizado (30% de atividade após 6 ciclos de hidrólise).
Figura 3.4. Rota sintética usada na preparação do suporte magnético funcionalizado
(NPMs@TEOS-APTES) e imobilização enzimática por ligação covalente.
97
3.1.3. Aplicações das enzimas imobilizadas
Entre as aplicações das enzimas imobilizadas destacam-se os biossensores, as
aplicações médicas e as aplicações da indústria.
Inicialmente, os biossensores são invenções analíticas imprescindíveis atualmente
para diagnósticos clínicos, controle de qualidade de alimentos e na química ambiental. No
entanto, sua aplicação é muito versátil uma vez que os biossensores podem ser desenvolvidos
a partir de qualquer sistema biológico. Sumariamente, uma biomolécula imobilizada no
biossensor (proteína, célula, anticorpo, vírus) é localizada próxima a um tradutor e a partir do
contato com o analito é liberado um sinal químico que será transformado em um sinal físico
(elétrico, ótica, acústico, calorimétrico). Comumente, os métodos de imobilização aplicados
durante o desenho de biossensores são a inclusão em membranas semipermeáveis e a ligação
covalente a membranas.
Ações terapêuticas para compensar carências enzimáticas, liberação de fármacos,
enzimas com atividade antitumoral, entre outras atividades são realizadas por biomoléculas
imobilizadas aplicadas na medicina. Alguns exemplos são: hemodialisador de fibra oca com
asparaginase imobilizada para combater leucemia e câncer com asparagina, tripsina e
colagenase imobilizadas em fibras de celulose a fim de ser aplicadas como apócitos para
estimular o crescimento de novos tecidos e enxertos de pele em queimaduras, úlceras, etc
(Arroyo, 1998).
As aplicações industriais abrangem várias reações (hidrólise, isomerização, oxi-
redução esterificação, transferência de grupos inter e intramoleculares, etc) de enzimas que
tiveram sua estabilidade aumentada viabilizando assim aplicações diversificadas sumarizadas
na Tabela 3.2.
98
Tabela 3.2. Sistemas de enzimas imobilizadas aplicados na indústria de bioprocessos
Enzima Método de imobilização Aplicação Referência
α-amilase Adsorção em nanopartículas de sílica (adsorção) Formulações de sabão em pó Souza et al., 2017
α-quimiotripsina Ligação covalente em nanopartículas magnéticas
com quitosana (covalente)
Síntese de peptídeos Souza et al., 2017
α-galactosidase Grafeno funcionalizado (covalente) Hidrólise de oligossacarídeos Souza et al., 2017
β-galactosidase Partículas de quitosana, agarose ou fibras de
celulose (covalente)
Hidrólise de lactose de produtos lácteos Souza et al., 2017
β-glicosidase Partículas de quitosana (covalente) Hidrólise da isoflavona Souza et al., 2017
Álcool oxidase Nanofibras de poliestireno-co-anidrido maleico
(PSMA) – (reticulação)
Determinação de álcool em saliva Souza et al., 2017
Catalase Nanotubos de titanatos (covalente) Biossensores Souza et al., 2017
Fosfatase alcalina Lâminas de vidro recobertas por filmes de sílica
(adsorção)
Desenvolvimento de superfícies bioativas
na medicina
Souza et al., 2017
Glicoamilase Nanotubos de carbono (covalente) Produção de edulcorantes e biossensores Souza et al., 2017
Invertase Poliuretano (covalente) Produção de edulcorante Souza et al., 2017
Lacase Nanopartículas e membranas de titânia
funcionalizadas (adsorção e reticulação)
Tratamento de águas residuais Souza et al., 2017
Lactatodesidrogenase Nanopartículas magnéticas revestidas com sílica
(covalente)
Produção de compostos quirais Souza et al., 2017
99
Lipase Partículas de polihidroxibutirato e cristais
reticulados (adsorção ecovalente)
Síntese de aroma e produção de óleos ou
bidiesel
Souza et al., 2017;
Arroyo, 1998
Lisozima Nanofibras de quitosana (covalente) Produção de antibacteriais Ahmad e Sardar,
2015
Penicilina G acilasas Eupergit C (covalente) Produção de penicilina G Katchalski-Katzir,
1993
Proteasa e pepsina Partículas de quitosana (covalente) Hidrólise de proteínas de trigo,
lactoglobulina e proteínas de peixe
Arroyo, 1998
Peroxidase de rábano Adsorção em nanopartículas magnéticas revestidas
com sílica
Immunoensaios Ahmad e Sardar,
2015
Tripsina Adsorção em nanopartículas magnéticas revestidas
com carboximetilquitosana
Digestão de proteína Souza et al., 2017
Urease Partículas de quitosana (covalente) Biossensor para determinar conteúdo de
uréia
Souza et al., 2017
100
3.2. Metodologia
3.2.1 Métodos e análises da imobilização de celulase e β-glicosidase em nanopartículas
magnéticas funcionalizadas
3.2.1.1. Síntese de nanopartículas ferromagnéticas (NPMs)
As NPMs foram sintetizadas pelo método da co-precipitação do Fe2+
/ Fe3+
.
Uma solução aquosa de Fe2+
/ Fe3+
em razão molar 1:2 foi desoxigenado por 20
min com N2 (g). Os sais utilizados foram FeSO4.7H2O e FeCl3.6H2O da Synth (Brasil). Em
seguida, a solução foi aquecida até 70°C, assim como outra solução de hidróxido de amônia
foi preparada e aquecida a 70 °C para finalmente ser adicionada gota a gota à solução aquosa
de Fe2+
Fe3+
desoxigenada sob agitação magnética brusca (1000 rpm). Após deixar a solução
resultante esfriar até temperatura ambiente, as NPMs foram separadas magneticamente
enquanto as nanopartículas não magnéticas foram descartadas. Para purificar os produtos, as
amostras foram lavadas repetidamente com etanol (Valenzuela et al., 2009). As partículas
foram então caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (SEM).
3.2.1.2 Funcionalização das NPMs com organosilano (APTES)
180 mg de NPMs foram dispersas em 50 mL de etanol-água (4:1, v v-1
) e em
seguida foram adicionados 100 µL de tetraetil-ortosilicato (TEOS da Sigma Aldrich) com
agitação constante. A reação foi mantida durante 3 h a 50 ºC e pH 10. As partículas
resultantes foram lavadas com etanol-água (2:1, v v-1
) e redispersadas com etanol: água (2:1,
v v-1
) (Kudina et al., 2014).
As partículas ferromagnéticas revestidas com TEOS (100 mg) foram
funcionalizadas com grupos aminas mediante a adição de APTES 10% v v-1
em etanol. Após
16 h de reação em temperatura ambiente, mantendo-se o pH igual a 4,0 e uma razão das
NPMs de 10 mg mL-1
, o material foi separado magneticamente e lavado com etanol várias
vezes. A seguir, a superfície destas nanopartículas híbridas foi usada para imobilização
covalente de enzimas. A caracterização deste sólido foi feita por espectroscopia do
infravermelho por transformada de Fourier (FTIR).
Outra síntese foi investigada para esta etapa da funcionalização a fim de comparar
eficiência em termos do grau de funcionalização com grupo amina. Esta consistiu em
101
dissolver 100 mg das NPMs em uma solução 1:9 (v v-1
) de etanol-tolueno mantendo a razão
10 mg mL-1
. Após a dispersão do sólido foi adicionado 3-aminopropil-trietoxisilano (APTES)
10% v v-1
(Sigma Aldrich). A solução foi mantida em refluxo por 16 h (overnight), como
também em refluxo por 24 h. Em seguida, as partículas foram lavadas com tolueno e com
etanol, sendo logo depois deixadas a temperatura ambiente até secagem completa.
O procedimento de lavagem e re-dispersão foi repetido para finalmente
caracterizar o material por SEM, espalhamento dinâmico da luz (DLS) e FTIR.
3.2.1.3. Funcionalização das nanopartículas magnéticas com quitosana
A 30 mL de uma solução de quitosana 0,5% m v-1
em ácido acético (pH 2,0) foram
adicionados 1,2 g de NPMs sob agitação vigorosa. A solução se manteve a temperatura
ambiente durante 30 min e com agitação vigorosa, transcorrido este tempo foram adicionadas
gotas de solução NaOH 1,0 mol L-1
até pH alcalino. Após 10 min a solução foi retirada e feita
a lavagem do sólido até pH neutro por centrifugação e com ajuda de um imã.
3.2.1.4. Imobilização covalente de enzimas
A imobilização covalente foi realizada usando o grupo amina do suporte e o grupo
carboxilato das enzimas criando um entrecruzamento em solução tampão acetato a 0,1 mol L-1
pH 5,0 com glutaraldeído 2,5% (v v-1
). As enzimas imobilizadas correspondem ao complexo
enzimático de endoglunase, celobiohidrolase e β-glicosidase de Trichoderma reesei ATCC
26921 (Celluclast®).
Para isto foi dispersa uma mistura com 4 mg de NPMs funcionalizadas por 60 min
em tampão em pH 5,0. A seguir foi separado o sobrenadante usando um imã e o sólido foi
lavado três vezes com solução tampão a fim de eliminar o glutaraldeído remanescente. A
seguir, foi adicionada a quantidade de proteína a fim de conseguir a concentração final
proteica desejada. Após uma hora de agitação a temperatura ambiente, o sobrenadante foi
separado com ajuda de um imã e o sólido foi lavado três vezes com solução tampão. A
solução tampão e as soluções das lavagens foram reservadas para quantificação da
concentração proteica imobilizada. O sólido com a enzima imobilizada foi usado para
quantificar a atividade remanescente.
As enzimas imobilizadas em suporte sólido foram caracterizadas por FT-IR.
102
Finalmente determinou-se a quantidade de proteína na fase sobrenadante usando o
método de Bradford (1959) e a atividade da enzima retida no suporte a pH 4,8.
3.2.1.5. Determinação das atividades enzimáticas
A atividade do complexo celulásico imobilizado foi determinada através da
metodologia de Ghose (1987) usando ρ-nitrofenil β-D-glicopiranosídeo (ρ-NPG) 1 mmol L-1
e
carboximetilcelulose 0,5% como subtratos para β-glicosidase e endoglucanase,
respectivamente. A atividade específica da enzima livre (EL) e da enzima imobilizada (EI) foi
avaliada a pH 4,8.
Ensaio de atividade de β-glicosidase:
A medida da atividade de β-glicosidase é feita adicionando 100 μL do substrato
cromogénico ρ-NPG 1 mmol L-1
a 200 μL de amostra em um tubo de ensaio inserido em gelo
a fim de prevenir reação durante a preparação. A quantificação do ρ-nitrofenol (ρ-NP)
liberado após hidrólise nas condições de reação (pH 4,8 durante 10 minutos a 50 °C) foi
realizada adicionando 300 μL de carbonato de sódio 1 mol L-1
e medindo a absorbância a 400
nm. Mediante a curva padrão de ρ-NP foram calculadas as atividades respectivas para os
ensaios realizados em triplicata. Uma unidade de atividade de β-glicosidase foi definida como
a quantidade de enzima que liberou 1 μmol de ρ-NP por minuto (Berghem et al., 1974; Wood
et al., 1988; Chauve et al., 2010).
Ensaio de atividade de endoglucanase:
Para quantificar a concentração de açúcar redutor total liberado nos protocolos de
atividade enzimática foi utilizado o teste colorimétrico com ácido 3,5-dinitrosalicílico (Miller,
1959) e curva padrão correspondente a cada protocolo (glicose para CMC como susbtrato).
Atividade endoglucanásica foi determinada sobre 0,5% m v-1
de CMC. Os
volumes usados nas reações com DNS foram os seguintes: 50 μL de substrato, 50 μL de
tampão citrato de sódio 50 mmol L-1
pH 4,8 e 100 μL de amostra. Após as soluções serem
incubadas em um banho térmico a 50 °C por 60 min, a reação foi parada adicionando 300 μL
de reagente DNS, inclusive no branco e foram incubadas posteriormente a 99 °C por 5
minutos. Cada teste foi realizado em triplicata. Para a detecção espectrofotométrica foi
medida a absorbância a 540 nm.
103
O cálculo da unidade de atividade enzimática (UA) está baseado na quantidade de
enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de produto (açúcar redutor) por minuto a 50
°C (Mandels et al.,1976), seguindo a equação 3.1:
])[][(
)][][(`
enzimaVreaçãoT
FDreaçãoVaçúcarCAtividade
(3.1)
Onde:
Atividade: atividade enzimática em unidades internacionais (μmol min-1
mL-1
);
C[açúcar]: concentração de açúcar (mmol L-1
);
V[reação]: volume total da reação (mL);
FD: fator de diluição;
T[reação]: tempo de reação (min);
V[enzima]: volume total da enzima (mL).
Além dos tubos de referência para zerar o espectrofotômetro e os tubos de
amostras reacionais, durante as reações de hidrólise foi necessário fazer os tubos controle, os
quais consistem em (i) enzima sem substrato e (ii) substrato sem enzima e devem ser
incubados todos juntos. Os valores de absorbância dos tubos controle devem ser subtraídos
dos valores das absorbâncias correspondentes para cada tubo de amostra de hidrólise.
A atividade específica para cada enzima estudada foi definida pela relação entre
unidades de atividade da enzima (UA) e miligramas de proteínas, ou seja, UA mg-1
de
proteínas.
A seguir, foram calculados os valores relacionados com a eficácia do método de
imobilização, sendo:
Cálculo da concentração de proteína imobilizada (PI). Em base à quantificação de proteína
inicial oferecida e a proteína livre no meio reacional após o processo de imobilização, a
seguinte equação define este parâmetro:
100%0
0
P
PPPI
f (3.2)
Onde:
PI é a porcentagem de proteína imobilizada;
P0 é a concentração de proteína no tempo inicial (mg mL-1
);
Pf é a concentração de proteína final no sobrenadante incluindo lavagens(mg mL-1
).
104
Cálculo do rendimento de imobilização (RI). É a relação entre a atividade enzimática
imobilizada pela atividade inicial do extrato:
Onde:
RI é o rendimento de imobilização;
Uimobilizado é a atividade enzimática do sistema imobilizado (U mg-1
);
U0 é a atividade inicial do extrato (U mg-1
).
3.2.1.6. Experimentos para reciclo das enzimas imobilizadas
Com a finalidade de avaliar a separação do suporte de imobilização magnético e a
reutilização das enzimas imobilizadas, os ciclos de hidrólise foram avaliados usando pH 5,0 a
50 °C durante ciclos contínuos de 96 h. Transcorrido este tempo foi separado magneticamente
o sobrenadante das NPM com auxílio de um imã. Uma alíquota do sobrenadante foi usada
para determinar a concentração total de glicose, enquanto o sólido foi resuspendido em uma
nova solução tampão pH 5,0 e a seguir foi adicionada uma nova quantidade de celulose
extraída do BL. Adicionalmente, alíquotas de sólido resuspendido foram utilizadas para
determinação das atividades residuais após cada ciclo de hidrólise.
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1. Síntese e caracterização das NPM
A segunda parte do estudo envolve a caracterização dos nanossuportes magnéticos
por FTIR, microscopia eletrônica de varredura e DLS (Dynamic Light Scattering), assim
como a imobilização das enzimas e testes de atividade enzimática antes e depois da
imobilização.
Inicialmente foram sintetizadas as NPM seguindo o método de co-precipitação,
uma vez que é um método simples e de baixo custo para conseguir NPM a baixas
temperaturas, 70 °C. A reação envolvida é a seguinte:
Fe+2
+ 2Fe+3
+ 8OH-→ Fe3O4 + 4H2O
A razão molar Fe+2
/Fe+3
foi de 1:2 neste caso e a formação de magnetita ocorreu
em meio alcalino (pH 8 a 14) sob atmosfera inerte a fim de evitar a oxidaçao do sal ferroso
em água. Ainda que essa técnica possua pouco controle sobre o tamanho das partículas
1018
105
quando comparada com a técnica de decomposição térmica, a fim de evitar a agregação ou
semeação da nucleação (crescimento dos cristais de magnetita), a reação foi feita de modo
rápido e sob agitação vigorosa (fator cinético).
Sabe-se que a supersaturação dos reagentes promove a aceleração da nucleação,
de modo que os cristais de magnetita são imediatamente formados conforme o valor de pH do
meio reacional aumenta. Deste modo, um curto período de tempo (5 min) e uma agitação
vigorosa foram empregados nesta etapa a fim de evitar o começo da semeação - um processo
geralmente lento que ocorre pela difusão dos reagentes sobre a superfície dos cristais já
formados- assegurando que as nanopartículas sejam monodispersadas.
O tamanho de partícula foi acompanhado pela técnica DLS relacionada com
diâmetros hidrodinâmicos e foram descartadas as amostras de magnetita com diâmetros
hidrodinâmicos maiores do que 200 nm. Este critério foi escolhido baseado nas propriedades
magnéticas destacadas das nanoparticulas com diâmetros menores do que 100 nm (Laurent et
al., 2008).
As NPM são sensíveis à oxidação em meio ácido e facilmente se aglomeram
perdendo, assim, as propriedades magnéticas de origem, motivo pelo qual é usualmente
realizado um recobrimento com polímeros (quitosana, PVA, PEG, alginato, etc) ou usando a
técnica sol-gel baseada em reações de polimerização inorgânica, que permite incorporar
polímeros orgânicos em matrizes inorgânicas. Geralmente são empregados alcóxidos
metálicos durante a técnica sol-gel, sendo o tetra-etilortosilicato (TEOS) amplamente
utilizado nos processos de silanização ou polimerização de grupos silanol, também chamado
processo sol-gel (Lima et al., 2017). Neste caso, a mistura coloidal resultante da condensação
entre uma hidroxila e um alcóxido hidrolisado ou entre dois grupos hidroxilas dos precursores
alcóxidos do silano é chamada “sol” (Mendes et al., 2011). A seguir apresentamos as etapas
envolvidas na silanização:
a. Hidrólise do precursor alcóxido: Me(OR)4 + nH2O → Me(OH)4-n(OH)n + n(ROH)
b. Condensação com alcóxido: -MeOR + HOMe- → -MeOMe- + ROH
c. Condensação sem alcóxido: -MeOH + -MeOH → -MeOMe-+ H2O
106
3.3.1.1. Avaliação da funcionalização por grupo amina
Inicialmente foi confirmada a presença de NPM funcionalizadas através da
observação dos valores de potencial zeta (PZ) por espalhamento dinâmico da luz (DLS).
Sabe-se que a medida do PZ é um método prático para predizer a estabilidade de
nanopartículas em dispersão (coloides). Para explicar este parâmetro físico das nanopartículas
é necessário definir as interações eletrostáticas das suspensões coloidais.
Vemos assim na Figura 3.5 a distribuição das camadas iônicas para uma partícula
carregada negativamente. Uma partícula dispersa em solução é circundada por duas camadas
elétricas chamadas de dupla camada elétrica (EDL de electrical double layer). A primeira
camada adsorvida fortemente à superfície da partícula corresponde a íons de cargas opostas
chamada camada Stern. Além desta camada, os efeitos eletrostáticos continuam com uma
camada difusa de cargas positivas e negativas, formando assim a dupla camada na interface da
partícula com o líquido. A camada difusa (diffuse layer) é dinâmica uma vez que pode variar
por mudanças de pH, força iônica, concentração, solvente, etc.
Figura 3.5. Formação da dupla camada
elétrica (electrical double layer) para uma
partícula carregada negativamente
(negatively charged particle). Inicialmente
uma camada de íons com cargas opostas
estará fortemente aderida ao redor da
partícula, chamada camada Stern (Stern
layer). A seguir, uma camada difusa de
cargas positivas e negativas completa a
dupla camada elétrica (diffuse layer)
(tomado de AZ Nano, 2013).
Após aplicação de uma voltagem particular à solução coloidal, as partículas serão
atraídas pelo eletrodo de polaridade oposta (eletroforese), neste caso um eletrodo positivo,
junto com a camada fixa bem definida e uma fração da camada difusa. O potencial zeta é
107
assim definido como a diferença de potencial entre a camada dupla elétrica das partículas
movidas por eletroforese e a camada de dispersante à sua volta no plano de corte ou
deslizamento (slipping/shear plane). Em outras palavras, é o potencial elétrico da zona
interior da interface partícula-fluido incluindo a área conceitual definida como superfície de
deslizamento (Figura 3.5).
A importância do potencial zeta é principalmente a sua relação com a estabilidade
das dispersões coloidais. Através do grau de repulsão entre partículas adjacentes é possível
predizer seu comportamento coloidal em longo prazo. Por exemplo, um valor de PZ próximo
de zero indica uma forte tendência à agregação/deposição das partículas, ou seja, uma baixa
estabilidade.
A baixa estabilidade relacionada com valores de PZ baixos (±0-10 mV) ocorre
quando asforças de atração van der Waals entre as partículas são maiores que as forças de
repulsão da dupla camada elétrica. Deste modo são formados agregados, flóculos ou micelas
coloidais instantaneamente, no lugar de partículas dispersadas. Portanto, coloides com valores
de PZ maiores são classificados como relativamente estáveis (±10-20 mV), moderadamente
estáveis (±20-30 mV) e com boa estabilidade (para valores maiores do que ±30 Mv), sendo
partículas muito estáveis aquelas com valores de PZ maiores do que ±60 mV (Bhattacharjee,
2016).
Analisando os resultados da Tabela 3.3 vemos que o material híbrido
Fe3O4@TEOS apresenta na superfície um potencial zeta negativo devido às cargas dos
oxigênios e corresponde a partículas estáveis em meio ácido (pH 4,5). No entanto, Jordan e
colaboradores (2011) testaram a imobilização covalente de celulases com NPM sem
funcionalizar e reportaram uma perda considerável de atividade após um ciclo de hidrólise
devido principalmente à lixiviados. O pI do APTES é 10,05, deste modo espera-se um PZ
maior em meio ácido conforme a densidade dos grupos APTES, ou seja, aumenta durante o
processo de sinalização (Bini et al., 2012).
Deste modo, foram testados três métodos de funcionalização das NPM a fim de
comparar dois suportes estáveis a serem usados para imobilizar as enzimas por ligação a
grupos amina usando glutaraldeído como agente entrecruzador. Um valor alto de PZ positivo
representa uma reação de funcionalização de alta eficiência, assim como também uma boa
estabilidade dos produtos obtidos com grupo amina na superfície. Sendo assim, a reação feita
108
em refluxo com tolueno-etanol (9:1) como solvente, durante 24 h, mostrou-se como a melhor
opção para realizar a silanização com APTES do suporte de imobilização enzimática.
O produto funcionalizado com quitosana apresentou instabilidade elétrica,
demostrando assim uma alta probabilidade para formar agregados. Isto pode estar relacionado
com a adesão das partículas a superfícies circundantes uma vez que a quitosana forma géis em
meio aquoso. Mesmo assim, foi escolhido também o suporte recoberto com quitosana a fim
de comparar a eficiência durante os ciclos de hidrólise deste biopolímero de baixo custo.
Tabela 3.3. Potencial zeta de NPM@TEOS + APTES obtidos com diferentes condições
testadas para funcionalização
Amostra + condições Potencial zeta (mV)
Fe3O4@TEOS -40,3 ± 4,09
Fe3O4@TEOS + APTES por 24h em etanol/água -2,47 ± 0.81
Fe3O4@TEOS + APTES por 24h em etanol + 16 h em tolueno 6,50 ± 2,01
Fe3O4@TEOS + APTES por 16 h em tolueno-etanol 33,3 ± 1,09
Fe3O4@TEOS + APTES por 24h em tolueno-etanol 48,5 ± 1,10
Fe3O4@quitosana -4,39 ± 0.66
Com o intuito de analisar a eficácia do processo de funcionalização serão
abordados os possíveis mecanismos de silanização sobre superfícies de óxido, neste caso
NPM recobertas por TEOS. A reação ideal para o processo de imobilização apresentou-se na
Figura 3.4, no entanto, reações colaterais podem ocorrer dependendo das condições utilizadas
durante a funcionalização.
Diversos estudos analisaram as variáveis que afetam uma boa deposição do grupo
APTES, sendo assim esclarecida como principal variável o solvente. Além disso, também foi
estudada a influência da temperatura e do tempo de reação. Alguns estudiosos concordaram
em definir o tempo de reação como o parâmetro que favorece a formação de multicamadas,
uma vez que o processo de saturação e a espessura da deposição foram suficientes apenas para
24 h de reação (Xu et al., 1997; Howarter e Youngblood (2006); Liu et al., 2013; Zhang et
al.,2016).
É importante ressaltar que é o solvente utilizado durante a adsorção de APTES
sobre a superfície de óxido o que define a saturação e a eficiência das etapas posteriores
(hidrólise e condensação em meio aquoso). Sabe-se por análises de espectros CP-MAS RMN
de 13
C que a adsorção em meio aquoso ocorre na presença de várias espécies do grupo amina:
109
amina livre, ligação de hidrogênio intramolecular com grupos silanol do silano hidrolisado e
amina protonada (Kallury et al., 1994). Deste modo, a heterogeneidade da adsorção de
APTES em meio aquoso interrompe o processo da deposição uniforme em camadas, além de
induzir a adsorção do grupo amina diretamente na superfície por atração eletrostática de longo
alcance (Xu et al., 1997). Isto reduz a disponibilidade do grupo amina para se entrecruzar com
a enzima por intermédio de glutaraldeído, criando assim um suporte de baixa estabilidade
devido ao valor reduzido de PZ, como observado na Tabela 3.2 para NPM@TEOS-APTES
24h em etanol/água (baixa repulsão electrostática).
Os tipos de produtos de adsorção obtidos durante a silanização de APTES em
meio aquoso foram inicialmente propostos por Xu e colaboradores (1997). Vemos na Figura
3.6 à direita a interação eletrostática, assim como também estão presentes ligações de
hidrogênio em solventes polares próticos que interferem na deposição adequada dos grupos
amina do APTES. Em tolueno à esquerda (Figura 3.6), em contrapartida, a protonação do
grupo amina ocorre em menor extensão, sendo assim a interação eletrostática com a superfície
do TEOS menos significativa, o que favorece a formação dos grupos siloxano (O-Si-O) na
superfície do sólido.
Os estudos anteriores foram realizados sobre filmes de sílica, no entanto, a
integração das NPM não esteve presente nestes casos de silanização. Sabe-se que a
silanização direta das NPM por APTES apresenta lixiviados de Fe3O4 em meio ácido
observados por FTIR (Xu et al., 1997). Deste modo, as NPM devem ser previamente
recobertas com um material estável em meio ácido, neste caso a ligação Si-O do TEOS não
apresenta lixiviados segundo Bini et al., (2012), podendo assim prevenir a oxidação e perda
da propriedade magnética das NPM durante a hidrólise enzimática a pH 5,0.
Liu e colaboradores (2013) estudaram a deposição de APTES sobre NPM para
várias misturas de solventes. Observaram que a mistura tolueno-etanol 1:1 a 70 °C durante 24
h apresentou a maior espessura da deposição. Além disso, durante o estudo da hidrólise
concluíram que, para temperaturas menores do que 25 °C, a água não é consumida
eficientemente. Deste modo, a hidrólise deve ser realizada entre 25-75 °C a fim de evitar a
inibição da reação de condensação dos silanos pela adsorção de água na superfície do suporte.
110
Figura 3.6. (a) Adsorção de APTES sobre sílica. À esquerda em solvente aprótico (tolueno)
gerando ligações siloxano com os grupos silanol da superfície e os grupos amina externos. À
direita em solvente polar prótico gerando grupos protonados que imitam a formação dos
grupos siloxano. (b) Etapa final de hidrólise e condensação. Tomado de Kim et al., 2009.
A caracterização do suporte foi complementada pela técnica FTIR. Inicialmente
foi observada ligação Fe-O das NMP em 540 cm-1
(Figura 3.7) relacionado com os materiais
magnéticos. As seguir, as NPM protegidas por recobrimento com TEOS apresentaram a
banda da ligação Si-O em 1030 cm-1
e sinais de estiramento de grupos etóxi Si-O-CH2CH3 que
seria um indicativo de produtos de uma hidrólise incompleta.
Finalmente, os sinais dos produtos obtidos com duas misturas de solventes
testados durante a silanização permite conferir os mecanismos discutidos anteriormente. As
bandas entre 1200-960 cm-1
correspondem a ligações siloxano (Si-O-C), sendo que em
solução aquosa estes sinais são menos intensos devido à inibição da polimerização dos grupos
silanol pelas interações eletrostáticas e as ligações de hidrogênio neste meio iônico. Para o
tolueno o sinal aparece mais pronunciado, indicando uma maior polimerização lateral após
sinalização. Igualmente, as bandas em torno de 1400 cm-1
e 1560 cm-1
pertencem às flexões
por ligação de hidrogênio da amina e pela protonação do grupo amina (Figura 3.6 e 3.7) (Xu
111
et al., 1997). Sendo assim, o produto obtido por silanização em meio aquoso se caracteriza
por uma maior intensidade na protonação da amina e uma menor extensão da polimerização
dos grupos silanol.
Figura 3.7. Espectros FTIR mostrando a funcionalização das NPM testando dois solventes.
3.3.1.2. Determinação da microestrutura do suporte funcionalizado
A seguir, foi analisada a morfologia das NPM funcionalizadas (NPM@TEOS-
APTES) em tolueno/etanol (9:1) a fim de determinar o tamanho médio deste nanomaterial. As
Figuras 3.8 e 3.9 mostram as distribuições de tamanhos obtidos por microscopia eletrônica e
por DLS, respectivamente. Deste modo, conferimos um valor de tamanho médio similar
evidenciando pela forma quase esférica das NPM funcionalizadas. O tamanho médio foi de
72,5 ± 40,8 nm (com amplificação de 1 µm), ou de 84,2 ± 32,3 nm (com amplificação de 2
µm), enquanto por DLS o valor obtido foi 261 ± 210 nm com uma alta polidispersidade. Uma
distribuição ampla do tamanho é uma característica comum dos derivados da sílica causada
por agregação das NPM recobertas (Roth et al., 2016).
A partir desde resultados preliminares pode-se confirmar a síntese do
nanomaterial funcionalizado de boa estabilidade em meio ácido a ser utilizado para
entrecruzar enzimas de interesse industrial.
A síntese de NPM recobertas por quitosana é um processo de baixo custo que
oferece um método simples de recobrimento a fim de inserir os grupos aminas necessários
para a ligação covalente. Sendo assim, este biomaterial funcionalizado será testado para
112
comparar os resultados de imobilização enzimática e reutilização em vários ciclos de hidrólise
de celulose.
Figura 3.8. Micrografias eletrônicas das NPM@TEOS-APTES e os correspondentes
histogramas calculados pelo programa de domínio público ImageJ.
Figura 3.9. Distribuição de tamanhos por DLS para NPM@TEOS-APTES.
113
3.3.2. Processos para avaliar a imobilização de enzimas com NPM
A seguir, apresentamos os resultados para imobilização covalente usando 4 mg de
suporte NPM@TEOS-APTES e glutaraldeído usando as enzimas comerciais Celluclast®
(Figura 3.10). Observamos inicialmente que, conforme foi aumentada a carga proteica,
aumentou a quantidade de proteína ligada ao suporte. No entanto, para quantidades de
proteína maiores de 2.0 mg o suporte está saturado uma vez a capacidade de carga está no
limite e a quantidade de proteína imobilizada começa a decair.
A maior porcentagem de proteína ligada (76,6%) foi observada para 1,53 mg de
proteína adicionada. O suporte recoberto com quitosana apresentou o mesmo comportamento,
e para em torno de 2,0 mg de proteína adicionada, aproximadamente, o suporte atingiu seu
grau de saturação proteica (64% de proteína adicionada correspondente a em torno de 1,3 mg
de proteína imobilizada).
As atividades das enzimas imobilizadas estão apresentadas na Figura 3.11. Vemos
que a tendência para o nanosuporte com APTES foi o decaimento da atividade tanto para
CMCase (endoglucanase) como para β-glicosidase (celobiase) conforme houve um aumento
da enzima imobilizada. Deste modo foi observada uma alta atividade residual para a menor
quantidade de proteína adicionada, sendo que foram recuperadas 128% da atividade
específica da β-glicosidase e em torno de 86% da atividade CMCase. Para quantidades
maiores de proteína a imobilização ocorreu em detrimento da atividade enzimática por uma
possível formação de complexo enzima-suporte que inativa as enzimas em altas
concentrações proteicas. Além disso, estudos recentes já reportaram a inibição por
glutaraldeído para celulase do fungo Trichoderma reesei em concentrações do reagente
maiores de 1% (Jia et al., 2017). Outra causa do decaimento da atividade enzimática pode ser
atribuído a baixa acessibilidade do sítio ativo da enzima ao substrato no meio de reação.
Estudos anteriores mostraram resultados semelhantes em termos da atividade
recuperada de CMCase (82%) assim como uma maior atividade específica para uma baixa
carga proteica. No entanto, o sistema enzimático destes estudos foi ligeiramente diferente,
pois envolve NPMs sem funcionalização assim como TEOS funcionalizado com APTES sem
NPM, respectivamente (Jordan et al., 2011; Zhang et al., 2016).
114
Figura 3.10. Carga proteica vs. carga imobilizada por ligação covalente. a) nanosuporte
Fe3O4@TEOS-APTES, b) Fe3O4@quitosana.
Através da comparação com um estudo recente de NPM funcionalizadas com
APTES para imobilização de celulase precipitada, é possível conferir que há uma maior
capacidade de saturação proteica para um suporte funcionalizado com APTES (maior grau de
aminação) do que para um suporte recoberto por quitosana, sendo os valores da relação massa
proteica a sólido de 176 mg g-1
(Jia et al., 2017) e 112 mg g-1
(Zang et al., 2014),
respectivamente. Não obstante, o suporte recoberto com quitosana mostrou a tendência
contrária apresentando um aumento de atividade conforme a proteína adicionada do coquetel
foi aumentada. Isto ocorreu tanto para a atividade da endoglucanase como para a atividade da
β-glicosidase. Mesmo assim, valores menores de atividade específica máxima foram
115
detetados com o suporte de quitosana (85,2% para β-glicosidase e 53,0% para
endoglucanase). Neste caso, vemos que um maior número de grupos amina no suporte
funcionalizado com APTES apresentou a desvantagem de inativar as enzimas por possível
impedimento estérico durante o entrecruzamento do complexo enzimático.
Figura 3.11. Atividade residual das enzimas de Celluclast® imobilizadas em 4 mg de
nanopartículas Fe3O4@TEOS-APTES (à esquerda) e Fe3O4@quitosana (à direita).
Os valores de reutilização obtidos para cada suporte são mostrados na Figura 3.12.
Após 6 ciclos de hidrólise foram recuperadas as seguintes atividades relativas: 73,4% de
CMCase e 62,7% de β-glicosidase para o suporte funcionalizado com APTES, enquanto para
o suporte recoberto com quitosana as atividades residuais foram 67,5 de CMCase e 65,9 de β-
glicosidase. A fim de comparar os suportes imobilizados com resultados anteriores da
literatura, é apresentada a Tabela 3.4 correspondente a estudos referentes à reutilização de
celulases e β-glicosidases por separação magnética. Os estudos realizados com mais de 6
ciclos de hidrólise são mostrados dando ênfase na atividade residual após 5 ciclos, uma vez
que vamos comparar com nosso estudo realizado em 6 ciclos.
Comparando os dados aqui obtidos com estudos prévios expostos na Tabela 3.4,
vemos resultados semelhantes de atividades residuais para o entrecruzamento com
glutaraldeído entre NPM funcionalizadas diretamente com APTES e celulases (86% de
CMCase por Alahakoon et al., 2013 e 75% de CMCase por Ramrao et al., 2016). Os estudos
anteriores usaram a mesma nanoestrutura, porém as condições da hidrólise selecionadas
variaram em termos de substrato e tempo de reação. O estudo que obteve uma maior atividade
116
residual empregou um substrato solúvel (CMC) e um menor tempo de hidrólise comparado
com o outro estudo.
Figura 3.12. Valores de atividade residual relativa para vários ciclos de hidrólise.
O uso de um substrato celulósico insolúvel está acorde com a aplicação industrial,
uma vez o substrato solúvel (CMC) usualmente empregado demanda um tempo de catálise
mais curto e deste modo a estabilidade operacional não é determinada proporcionalmente com
condições reais da aplicação (produção de etanol-2G). O tempo de hidrólise requerido no
estudo atual foi de 96 h para um substrato sólido (celulose de BL pré-tratada com NaOH e
branqueada). Além disso, as atividades das duas enzimas que atuam cooperativamente para
hidrolisar celulose foram monitoradas.
117
Tabela 3.4. Suportes magnéticos utilizados para imobilizar celulases com os respeitivos
dados dos ciclos de reutilização
Suporte de
imobilização
Técnica e
enzimas
Reutilização Referencia
Ciclos e
recuperação
Tempo e
substrato
Atividade
residual
NPM/PVA Encapsulação
de R-10 (T.
viride)
4 com 94%
de atividade
inicial
6 h com
celulose
comercial
40% Liao et al.,
2010
NMP e
carboiimida
Entrecruza-
mento de
Genencor (T.
reesei)
6 com 100%
de atividade
inicial
96 h com
celulose
comercial
10% Jordan et
al., 2011
NPM@APTES Entrecruza-
mento de
Celluclast (T.
reesei)
9 com 64%
de atividade
inicial
18 h com
CMC
60%
Ciclo 6:
86%
Alahakoon
et al., 2013
NPM@grafeno-
polieletrólitos
Entrecruza-
mento de
Genencor (T.
reesei)
3 com 95%
de atividade
inicial
90 min com
avicel
58% Gokhale et
al., 2013
NPM recobertas
por quitosana
Entrecruza-
mento de Meiji
Serka Pharma
9 com 72%
de atividade
inicial
24 h com
CMC
50%
Ciclo 6:
52%
Zang et
al.,2014
NPM Entrecruza-
mento de
recombinante
(T. reesei)
9 com 86%
de atividade
inicial
48 h com
biomassa
pré-tratada
30%
Ciclo 6:
40%
Abraham et
al., 2014
NPM recobertas
de quitosana
Entrecruza-
mento de
Celluclast (T.
reesei)
4 com 37%
de atividade
inicial
20 h com
fibra de
agave
50% Sánchez-
Ramírez et
al., 2016
NPM@TEOS Entrecruzamen
to de celulase (T.
longibraciatum)
10 com 38%
de atividade
inicial
12 h com
CMC
76% Roth et al.,
2016
NPM@APTES Entrecruzamen
to de celulase
(Advanced
enzymes)
7 com 80%
de atividade
inicial
24 h com
celulose
comercial
64%
Ciclo 6:
75%
Ramrao et
al., 2016
NPM@TEOS-
APTES e NPM
recobertas por
quitosana
Entrecruza-
mento de
Celluclast (T.
reesei)
6 com 85%
de atividade
inicial
96 h com
BL pré-
tratado
73,4% para
APTES e
67,5% para
quitosana
Pesquisa
atual
118
A atividade específica da β-glicosidase é comumente maior do que a atividade
específica da endoglucanase, uma vez a difusão do substrato solúvel da β-glicosidase
apresenta menor impedimento estéreo-espacial e/ou maior acessibilidade ao sítio ativo.
A seguir foi determinada a estabilidade em estado livre e imobilizado na faixa de
valores de pH em torno de 3.5-7.5. Vemos na Figura 3.13 o valor 5,0 de pH ótimo tanto para a
CMCase livre (endoglucanase) como para a enzima imobilizada no suporte Fe3O4@TEOS-
APTES.
Enquanto, esta mesma enzima imobilizada em quitosana apresentou maior
estabilidade nessa faixa de valores de pH, tendo então maior adaptabilidade as mudanças de
pH do meio reacional.
Figura 3.13. Efeito do pH sobre a atividade CMCase livre e imobilizada.
Em relação ao pH ótimo da β-glicosidase (Figura 3.14), observou-se um
comportamento diferente para cada caso. O valor de 6,8 de pH foi considerado ótimo no
estado livre, enquanto para a enzima imobilizada em Fe3O4@TEOS-APTES o valor ótimo foi
5,0 e para a enzima ligada a quitosana a variação da atividade foi mais leve apresentando
assim maior resistência a variações de pH neste estado imobilizado.
A estabilidade melhorada destas duas enzimas no estado imobilizado pelos grupos
amina da quitosana é uma característica muito importante, uma vez a quitosana apresenta
maior estabilidade como hidrogel em valores de pH neutro a básico. Deste modo, as
atividades das enzimas imobilizadas irão ser mantidas em pH neutro e adicionalmente a
estabilidade do suporte será maior durante os reciclos hidrolíticos.
119
Figura 3.14. Efeito do pH sobre a atividade β-glicosidase livre e imobilizada.
Complementarmente, as atividades das enzimas livres durante a hidrólise de
celulose foram monitoradas a fim de determinar e comparar sua estabilidade operacional.
Determinou-se assim o tempo de vida útil das enzimas livres a 50 °C, sendo que após 13 dias
de hidrólise contínua a atividade residual da CMCase foi de 20,7% ± 2,1 e da β-glicosidase
foi de 7,5% ± 2,2. Sabe-se que a β-glicosidase possui um nível alto de inibição pela presença
de glicose, deste modo sua atividade decaiu mais rápido do que a atividade da CMCase.
Comparando com os dados das enzimas imobilizadas, as enzimas livres
apresentaram uma perda de atividade da mesma magnitude das enzimas imobilizadas após 6
dias de hidrólise (atividades residuias: 65,4% ± 6,2 para CMCase e 60,8% ± 5,6 para β-
glicosidase). Os dados das atividades residuais das enzimas imobilizadas foram de 73,4% de
CMCase e 62,7% de β-glicosidase para o suporte funcionalizado com APTES após 26 dias de
hidrólise e reciclo, enquanto para o suporte recoberto com quitosana as atividades residuais
foram 67,5 de CMCase e 65,9 de β-glicosidase após 22 dias de hidrólise e reciclo. Sendo
assim, o aumento da estabilidade operacional das enzimas imobilizadas é destacado neste
estudo.
Continuando o estudo, apresentamos a estabilidade térmica da CMCase na Figura
3.15. Observamos inicialmente a temperatura ótima de 60 °C comum para a CMCase livre e a
CMCase imobilizada em APTES, enquanto esta enzima imobilizada em quitosana apresentou
uma menor temperatura ótima de 40 °C.
120
Figura 3.15. Efeito da temperatura sobre a atividade de CMCase livre e imobilizada.
No caso da glicosidase vemos na Figura 3.16 uma alta estabilidade térmica tanto
no estado livre como no imobilizado. No entanto, a enzima livre teve um aumento de
atividade a 50 °C, pois a enzima imobilizada em APTES apresentou maior atividade a 60 °C e
aquela imobilizada em quitosana também mostrou um aumento da atividade para uma
temperatura ótima maior de 75 °C. Podemos concluir que a enzima β-glicosidase também teve
um aumento da estabilidade térmica quando foi imobilizada em quitosana, enquanto a
CMCase não apresentou variação de sua estabilidade quando imobilizada em APTES.
Para finalizar apresentamos imagens do processo de separação e reutilização
durante a hidrólise de celulose realizada pelas enzimas imobilizadas de Celluclast nos
suportes magnéticos (Figura 3.17). Nesta última etapa é fundamental comparar a estabilidade
operacional e os rendimentos obtidos dos dois suportes testados. Sabemos que o suporte
funcionalizado com APTES apresentou uma boa atividade hidrolítica durante 26 dias de
hidrólise (63-73% de atividade residual). No entanto, o suporte recoberto com quitosana
apresenta igualmente uma boa estabilidade operacional após 22 días de hidrólise (66-67% de
atividade residual).
121
Figura 3.16. Efeito da temperatura sobre a glicosidase livre e imobilizada.
Figura 3.17. Processo de separação magnética e reutilização durante a hidrólise enzimática.
a) Solução de NPM funcionalizadas após um ciclo de hidrólise, b) Efeito obtido após
aplicação de um campo magnético externo, c) separação magnética do sobrenadante com o
produto solúvel (glicose) e d) alimentação do substrato sólido fresco (BL pré-tratado com
NaOH e branqueado).
Os rendimentos de glicose comparados para cargas enzimáticas similares foram
4,38% para o suporte funcionalizado com APTES operando por 26 dias e 3,82% para o
122
suporte recoberto com quitosana operando por 22 dias de hidrólise. Considerando os custos da
fabricação de cada suporte, sabe-se que o recobrimento com quitosana envolve menores
custos e apresenta a possibilidade de imobilizar maiores cargas enzimática para similares
massas de suporte. Deste modo, a fim de viabilizar a hidrólise de celulose por enzimas
imobilizadas em suportes magnéticos, é formulado o método de recobrimento de NPM com
quitosana como uma forma simples, barata e eficiente para aumentar a estabilidade
operacional das enzimas.
3.4. CONCLUSÕES FINAIS
Nanofibras de celulose foram obtidas a partir de bagaço de laranja (BL), um
importante subproduto da agroindústria brasileira. Inicialmente foi estudado o efeito sobre a
cristalinidade da adição de enzimas intracelulares ou extracelulares sobre o BL pré-tratado.
Através das análises por DRX e RMN de 13
C foram encontrados valores próximos de
cristalinidade nos produtos finais obtidos por estes tratamentos enzimáticos (55% com
proteína intracelular e 58% com proteína extracelular da Xac 306). Um aumento da
cristalinidade durante este bioprocesso foi observada para os dois casos e é associada com a
hidrólise de celulose amorfa e pectina do BL pré-tratado e uma sonicação exhaustiva foi
necessária para obter nanofibras aplicando este processamento a partir de BL in natura.
A seguir, diferentes concentrações de NaOH foram inicialmente aplicadas para
avaliar o aumento da cristalinidade sob condições de autoclave utilizando duas fontes de BL:
in natura e da indústria Citrosuco (Matão, SP). Análises por DRX perimitiram definir como
3% a concentração adequada para obter a cristalinidade máxima nesta etapa hidrolítica,
enquanto a avaliação de uma etapa de hidrólise ácida subsequente mostrou uma maior
resistência à hidrólise do BL da indústria, no entanto, esta etapa em condições ácidas pode ser
substituída por uma segunda etapa de hidrólise alcalina obtendo assim resultados similares de
cristalinidade para as duas amostras de BL. As nanofibras resultantes possuem em torno de
60% de cristalinidade.
Adicionalmente, o BI demandou um branqueamento rigoroso uma vez que teve
que ser aplicada uma etapa adicional com H2O2 6,45% (m v-1
) após o tratamento com NaClO2.
Um maior conteúdo de lignina observado nesta biomassa explica o comportamento desta
amostra da indústria. Enquanto o bagaço in natura atingiu a brancura após a aplicação de
apenas 1% (m m-1
) de NaClO2.
123
No que tange ao processo de fibrilação por sonicação, o bagaço da indústria
apresentou a vantagem de atingir a homogeneização após 5 min de tratamento, requerendo
assim uma menor demanda energética. O BL in natura precisou de pelo menos 15 min de
sonicação para homogeneização uma vez que a celulose apresentou-se no seu estado nativo
altamente compactado. Uma elevada relação entre o comprimento e o diâmetro caracterizou
as duas amostras de nanofibras de celulose correspondentes a um diâmetro aproximado de 20
nm e um comprimento de alguns micrometros.
Uma aplicação interessante deste biomaterial foi estudada através da aminação
dos grupos hidroxilas da celulose, o que permitiu a ligação covalente das nanofibras de
celulose com outras moléculas de interesse, e. g. compostos bioativos ou outros biopolímeros.
No entanto, através da caracterização dos produtos foi conferida a funcionalização incompleta
usando o reagente ADH, porém o derivado da nanocelulose obtido neste caso apresenta uma
função química interessante (amida cíclica) que possibilitaria o entrecruzamento por outra via
de condensação.
Em relação à segunda abordagem, foi avaliada a síntese e caracterização de dois
suportes magnéticos funcionalizados para propiciar um sistema enzimático por imobilização
covalente. O complexo enzimático escolhido foi o Celluclast®, por ser um coquetel
amplamente utilizado e seu reciclo permitira baratear a fase hidrolítica prévia à fase
fermentativa necessária durante a produção de etanol-2G. Isto através da diminuição do
consumo enzimático durante a sacarificação contínua do material lignocelulósico.
A interação entre as enzimas e as nanoestruturas funcionalizadas foi estudada
inicialmente pela determinação da capacidade de carga proteica imobilizada para dois
materiais (3-aminopropiltrietoxisilano-APTES e quitosana). Para o nanosuporte
funcionalizado com APTES foram estudadas inicialmente as condições de reação que
conduzem a uma maior estabilidade do material no meio ácido da reação hidrolítica (pH 5,0).
Sendo assim, a mistura tolueno/etanol (9:1) durante a silanização mostrou um alto grau de
aminação e em consequência uma maior estabilidade como suspensão coloidal.
Em seguida, foi analisada a maior recuperação da atividade de CMCase
(endoglucanase) correspondente a 85% e foi observada uma alta especificidade deste suporte
com APTES para recuperar a atividade da β-glicosidase do coquetel enzimático (128%).A
capacidade de carga deste suporte (176 mg g-1
) foi ligeiramente maior do que a carga proteica
imobilizada com o suporte magnético recoberto de quitosana (112 mg g-1
). Contudo, o método
124
simples de recobrimento com quitosana implica menores custos e os rendimentos de glicose
obtidos com esta técnica foram considerados bons ao comparar com os rendimentos obtidos
porsilanização com APTES (estabilidade operacional similar após seis ciclos de hidrólise
contínua de celulose do BL).
Particularmente, as atividades recuperadas por recobrimento das NPM com
quitosana foram incrementadas conforme a carga enzimática foi aumentada durante a
imobilização, sendo essa uma importante vantagem deste material uma vez o suporte
funcionalizado com APTES apresentou melhores resultados para cargas enzimáticas baixas.
Sendo assim, uma maior viabilidade foi apresentada pelo método de imobilização covalente
usando NPM recobertas com quitosana. Isto porque a silanização com APTES é um método
de maior custoe para imobilizar altas cargas enzimáticas neste suporte seriam necessárias altas
quantidades de NPM funcionalizadas. Além disso, a enzima β-glicosidase imobilizada em
moléculas de quitosana apresentou maior resistência em temperaturas maiores de 50 °C e em
uma faixa de valores de pH ampla.
125
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