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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
DELIMITAÇÃO ENTRE AS ESPÉCIES Passiflora edulis SIMS
E Passiflora sp. NATIVA DA BAHIA COM BASE EM
CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS, MOLECULARES E
MORFOLÓGICAS
AMÉRICO JOSÉ CARVALHO VIANA
ILHÉUS-BAHIA-BRASIL
Fevereiro de 2009
AMÉRICO JOSÉ CARVALHO VIANA
DELIMITAÇÃO ENTRE AS ESPÉCIES Passiflora edulis SIMS E Passiflora sp.
NATIVA DA BAHIA COM BASE EM CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS,
MOLECULARES E MORFOLÓGICAS
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular.
ILHÉUS-BAHIA-BRASIL
Fevereiro de 2009
AMÉRICO JOSÉ CARVALHO VIANA
DELIMITAÇÃO ENTRE AS ESPÉCIES Passiflora edulis SIMS E Passiflora sp.
NATIVA DA BAHIA COM BASE EM CARACTERÍSTICAS CITOGENÉTICAS,
MOLECULARES E MORFOLÓGICAS
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular.
APROVADA: 17 de fevereiro de 2009
Prof. Dra. Telma Nair Santana Pereira Prof. Dr. Luís Carlos Bernacci
(UENF) (IAC)
Prof. Dr. Dario Ahnert Prof. Dra. Margarete Magalhães de Souza
(UESC) (UESC - Orientadora)
ii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Gonçalves e Terezinha, pelo apoio incondicional
a todos os meus projetos de vida.
iii
AGRADECIMENTO
À Deus, por todas as graças concedidas em minha vida.
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), pela minha formação
profissional, e em especial ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, pela oportunidade concedida.
À Prof. Dra. Margarete Magalhães de Souza, pela orientação, pelo apoio e
pela amizade.
À Dra. Ioná Santos Araújo, pela co-orientação na realização deste trabalho.
Ao Dr. Ronan Xavier Corrêa, pela co-orientação na realização deste trabalho.
Aos técnicos do Centro de Biotecnologia e Genética, pelos ensinamentos e
pelo apoio recebido.
Aos funcionários deste programa de pós-graduação, em especial a Luciana,
pelo carinho no atendimento.
Aos professores, pelos ensinamentos e pela convivência harmoniosa durante
este período.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão da bolsa de estudos.
À mulher mais importante da minha vida, minha mãe Terezinha, pelo
incentivo, pela confiança e por tudo que significa para mim.
Ao meu pai, Gonçalves, pelo incentivo, pela confiança e por tudo que significa
para mim.
Aos meus irmãos, Verônica, Cecília, Davi e Daniel, pelo apoio constante, pelo
carinho e pela amizade.
À minha namorada Karin, pela paciência, apoio, incentivo e companheirismo
durante todos os momentos da minha vida.
iv
Aos meus amigos-irmãos, Luciano e Diêgo, pela amizade, apoio e
companheirismo e todos os bons momentos compartilhados.
Aos meus companheiros e amigos, Carlos Bernard, Ângela, Adriane,
Elizabeth, Gabriele e em especial a Juliane pelos momentos de descontração, pela
amizade e todo auxílio prestado no desenvolvimento do projeto.
Aos companheiros do Laboratório de Citogenética, Gabriela, Pabliane,
Vanderly, Olívia, Cíntia, Poliana, Graziella, Daniella, Samuel e Igor, pelo apoio.
Aos amigos que não estiveram fisicamente próximos, mas que de alguma
forma contribuíram para este trabalho.
v
ÍNDICE
EXTRATO…………………………………………...…………………………………
ABSTRACT…………………………………………………………………………….
INTRODUÇÃO…………………………………….…………………………….…….
2. REVISÃO DE LITERATURA…………………….………………………….…….
2.1. Família Passifloraceae……………………………………………………….
2.2. O gênero Passiflora…………………………………………………………..
2.2.1. Classificação taxonômica do gênero………………………………..
2.2.2. Morfologia do gênero………………………………………………….
2.2.3. Importância econômica do gênero………….……………………….
2.3. Similaridade genética via descritores morfológicos………………………
2.3.1. Análise multivariada na quantificação da similaridade genética…
2.4. A Citogenética na determinação das relações evolutivas dos vegetais..
2.4.1. Bandamento C…………………………………………………………
2.4.2. Fluorocromos CMA e DAPI……………………………..……………
2.4.3. Citogenética de Passiflora……………………………………………
2.5.Estudo das relações evolutivas dos vegetais via dados moleculares……...
2.5.1. O genoma cloroplastidial no estudo filogenético……..……………
3. Capítulo 1- DELIMITAÇÃO ENTRE AS ESPÉCIES Passiflora edulis Sims e
Passiflora sp. COM BASE EM DESCRITORES MORFOLÓGICOS E
POLÍNICOS, EM ESTUDOS REPRODUTIVOS E EM SEQUÊNCIA DO
ÍNTRON DO trnL …………………………………………………….
VII
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21
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Resumo…..…………………………………………………………………………….
Introdução……….……………………………………………………………………..
Material e Métodos……………………………………………………………………
Material vegetal……………………………………………………………………….
Caracterização da morfologia vegetativa e polínica do germoplasma…..…….
Caracterização reprodutiva………………………………………………………….
Extração de DNA……………………………………………………..………………
Amplificação das sequências do íntron do trnL ………………………………….
Seqüenciamento dos fragmentos…………………………………………………..
Análises das sequências…………………..………………………………………...
Análise estatística…………………………………………………………………….
Resultados. …………………………………………………………………………...
Discussão……………………………………………………….……………………..
Referências……………………………………………………………………………
4. Capítulo 2- CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE
AS ESPÉCIES Passiflora edulis Sims e Passiflora sp. ………………………….
Resumo………………………………………………………………………………..
Introdução. ……………………………………………………………………………
Material e Métodos…………………………………………………………………..
Material vegetal………………………………………………………………………
Obtenção de cariótipos………………..…………………………………………….
Análises Cariomorfológicas………….……………………………………………..
Preparo das amostras para bandamento…………………………………………
Bandamento C……………………………………………..…………………………
Bandamento CMA-DA-DAPI…………………………….………………………….
Resultados……………………………………………………………………………
Discussão…………………………………………………………………………….
Referências………………………………………………….……………………….
5. Capítulo 3- PROTOCOLO PARA IDENTIFICAÇÃO DO PADRÃO DE
DISTRIBUIÇÃO DA HETEROCROMATINA EM ESPÉCIES DE Passiflora L..
6. CONCLUSÕES GERAIS………..……………………………………………….
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……….……………………………………
8. Apêndice........................................................................................................
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vii
EXTRATO
VIANA, Américo José Carvalho, M.Sc., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
fevereiro de 2009. Delimitação entre as espécies Passiflora edulis Sims e Passiflora
sp. nativa da Bahia com base em características citogenéticas, moleculares e
morfológicas. Orientador: Margarete Magalhães de Souza. Co-orientadores: Ioná
Santos Araújo e Ronan Xavier Corrêa. Colaborador: Dário Ahnert.
O maracujazeiro pertence ao gênero Passiflora L. Em fragmentos de floresta
Atlântica do sul da Bahia foi encontrada uma espécie (Passiflora sp.)
morfologicamente similar ao maracujazeiro roxo (Passiflora edulis Sims f. edulis),
diferenciando-se principalmente pelo tamanho da flor e do fruto. Diante da
necessidade de delimitação entre as duas espécies, desenvolveu-se estudos
morfológico, cariotípico e reprodutivo em P. edulis e Passiflora sp. Os cromossomos
metafásicos foram obtidos a partir de ápices de raízes. As lâminas foram preparadas
pela técnica de esmagamento, com coloração convencional em reativo de Schiff,
com Giemsa para bandamento C, e com fluorocromos CMA3/DAPI. Estudos
reprodutivos também foram realizados para avaliar a taxa de auto-incompatibilidade
e a capacidade de reprodução entre as duas espécies. Na caracterização
morfológica, P. edulis apresentou uma média superior (P<0,05, teste F) em todos os
descritores usados. As variáveis que mais contribuíram para a diversidade foram o
peso do fruto com 67,9%, seguido pelo diâmetro equatorial do fruto com 16,3% e
diâmetro da flor com 11,7%. Na análise de agrupamento baseado nos descritores
vegetativos e polínicos, obteve-se uma nítida separação entre os genótipos de P.
edulis e Passiflora sp., e a alta correlação cofenética (0,97) confirmou a eficiência
dos descritores morfológicos e polínicos para a classificação das espécies. Na
comparação da sequência do íntron do trnL, também obteve-se a separação entre
viii
estas duas espécies. As duas espécies apresentaram 2n = 18, sendo 16
cromossomos metacêntricos e 2 submetacêntricos. Houve variação na localização
dos satélites, que em P. edulis posicionou-se no braço curto do primeiro e quarto
pares, enquanto em Passiflora sp. ocorreram no braço curto do sétimo e oitavo
pares cromossômicos. O comprimento médio dos cromossomos foi de 3,28 µm e
3,27 µm, e a razão média foi de 1,20 e 1,33 em P. edulis e Passiflora sp.,
respectivamente. Houve variação significativa (P<0,05, teste F) entre o comprimento
individual dos cromossomos 2, 4 e 8 entre as espécies. O índice de assimetria
indicou que P. edulis é uma espécie mais primitiva em comparação à Passiflora sp.
O bandamento C revelou a presença de heterocromatina constitutiva nas regiões
centroméricas e teloméricas de todos os cromossomos em ambas as espécies. No
entanto, apenas em Passiflora sp. os cromossomos 3 e 9 apresentaram uma grande
quantidade de heterocromatina. No cromossomo 3 o braço longo é quase todo
constituído por heterocromatina, e o 9 apresentou-se em sua maioria constituído por
heterocromatina. A análise combinada da banda C com fluorocromos CMA3 e DAPI
nas duas espécies revelou que a heterocromatina localizada nos satélites é rica em
pares de bases GC. No entanto as heterocromatinas centromérica e telomérica não
revelaram padrões predominantes nem de pares de bases AT nem GC, estando
este padrão consistente com dados publicados anteriormente. Nos estudos
reprodutivos a razão pólen:óvulo foi de 197,8 e 94,7 para P. edulis e Passiflora sp.,
respectivamente, o que as inclui na categoria de autógamas facultativas. Nos
cruzamentos interespecíficos utilizando P. edulis como doadora de grãos de pólen, a
taxa de flores fertilizadas ficou em 51,5%. Nas autopolinizações, P. edulis
apresentou uma média de 18% de flores fertilizadas, enquanto Passiflora sp. não
apresentou nenhuma flor fertilizada, mostrando-se 100% auto-incompatível. Os
dados morfológicos, citogenéticos e reprodutivos, indicam que Passiflora sp. é uma
espécie proximamente relacionada à P. edulis, no entanto constitui-se numa espécie
diferente.
ix
ABSTRACT
VIANA, Américo José Carvalho, M.Sc., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
fevereiro de 2009. Delimitação entre as espécies Passiflora edulis Sims e Passiflora
sp. nativa da Bahia com base em características citogenéticas, moleculares e
morfológicas. Advisor: Margarete Magalhães de Souza. Advisor Committee
Members: Ioná Santos Araújo, Ronan Xavier Corrêa and Dário Anhert.
The purple passion fruit tree (Passiflora edulis f. edulis Sims) belongs to the
genus Passiflora L. In the Atlantic Forest of southern Bahia state was found species
(Passiflora sp.) morphologically very similar to P. edulis, differentiating itself by the
size of the flower and fruit. Given the need to distinguish between the two species,
morphological study has developed, karyotypic, reproductive and molecular on P.
edulis e Passiflora sp. The metaphasic chromosomes were obtained from the root
apices. The slides were prepared by the technique of squashes with conventional
staining in Schiff‟s reagent, C-banding, and fluorochromes CMA3/DAPI. Reproductive
studies were also performed to assess the rate of self-incompatibility; the ability to
reproduce between the two species. In the morphological characterization P. edulis
had a higher average (p<0.05, F test) in all descriptors used. The variables that
contributed most to diversity were the weight of the fruit with 67.9% followed by the
diameter of the fruit with 16.3% and the diameter of the flower with 11.7%. In the
Cluster Analysis, based on vegetative and pollen descriptors, a clear separation was
obtained between the genotypes of P. edulis e Passiflora sp. with a high cophenetic
correlation (0.97), confirming the efficiency of the vegetative and pollen descriptors
for the classification of species. Comparison of the sequence of intron of trnL, also
had to be by a separation of between these two species. The two species had 2n =
18, with 16 metacentric chromosomes and 2 submetacentric. There were variations
x
in the location of the satellites, which in P. edulis positioned itself on the short arm of
the first and fourth pair, while in Passiflora sp. occurred on the short arm of
chromosome pairs seventh and eighth. The average length of chromosomes was
3.28 µm and 3.37 µm, and the average ratio was 1.20 and 1.33 in P. edulis and
Passiflora sp., respectively. There was significant variation (P < 0.05, F test) between
the individual length of chromosomes 2, 4 and 8 between the species. The
asymmetry index indicated that Passiflora sp. is more a derived specie compared
with P. edulis. The C-banding revealed the presence of constitutive heterochromatin
in the centromeric and telomeric regions of all chromosomes in both species.
However, only in Passiflora sp. the chromosomes 3 and 9 had a large amount of
heterochromatin. In the chromosome 3 the long arm is almost entirely composed of
heterochromatin, and in the 9 came mostly composed of heterochromatin. A
combined analysis of the C-band with fluorochromes CMA3 and DAPI in the two
species showed that heterochromatin located in satellites, is rich in GC base pairs.
However the centromeric and telomeric heterochromatin revealed no prevailing
patterns or pairs of base AT and GC, this pattern is consistent with previously
published data. In reproductive studies the reason polen:ovule was 197.8 and 94.7,
for P. edulis e Passiflora sp. respectively, include these species in the category of
optional autogamic. In interspecific crosses with P. edulis as a donor of pollen grains,
the fertilization rate was 51.5%. In the self-pollination, P. edulis showed an average
of 18% of fertilization, while Passiflora sp. did not present any fertilized eggs, and
therefore was 100% self-incompatible. Morphological, cytogenetic and reproductive
data indicate that Passiflora sp. is a species closely related to P. edulis, however it is
a different species.
1
1. INTRODUÇÃO
O gênero Passiflora é rico em número de espécies, e ainda persistem
algumas lacunas quanto à sua taxonomia, principalmente em nível específico. Isto
parece ser devido, principalmente, à grande variedade e complexidade morfológica
do gênero. Aliado a isto, há o fato de que a maioria dos estudos taxonômicos em
Passiflora foram baseados unicamente em características morfológicas, gerando
dúvidas quanto a origem e correta classificação taxonômica de algumas espécies.
Como exemplo, se pode citar a espécie mais cultivada economicamente, P. edulis
Sims, que possui duas formas botânicas, P. edulis Sims f. edulis, com fruto de cor
roxa, e P. edulis f. flavicarpa O. Deg., com frutos amarelos ou amarelo-esverdeados
(BERNACCI et al., 2008), sobre a qual ainda permanecem dúvidas quanto a origem
da forma „flavicarpa‟, se por mutação (DEGENER, 1933; PAYÁN; MARTIN, 1975;
YOCKTENG; NADOT, 2004) ou por hibridação (POPE, 1935).
A espécie P. edulis é nativa em todo o território nacional, mas pode ser
encontrada também desde os 42º de latitude norte até os 40º de latitude sul do
continente americano (LÖFGREN, 1917). É uma planta trepadeira, glabra, com
caule cilíndrico, pecíolo com duas glândulas sésseis, folhas trilobadas, trinervadas,
flores axilares com pétalas e sépalas oblongas de cor alva, corona de filamentos em
4-5 séries com coloração roxa na base, fruto globoso ou ovóide com coloração
variável, amarelo, amarelo-esverdeado, púrpura-escuro ou roxo (CERVI;
LINSINGEN, 2008). Vegeta na orla das florestas, capoeiras e nos fragmentos de
cerrado, principalmente em solos úmidos e bem drenados. Por ser uma espécie
cultivada, floresce e frutifica boa parte do ano (CERVI; LINSINGEN, 2008). No Brasil
P. edulis f. flavicarpa ocupa 97% dos pomares que cultivam o maracujazeiro, o que
torna o país seu principal produtor mundial (AGRIANUAL, 2008).
2
Em fragmentos da floresta Atlântica sul baiana, foi encontrada uma espécie
silvestre (Passiflora sp.) muito semelhante morfologicamente à P. edulis f. edulis,
porém com flores e frutos bem menores. De acordo com levantamentos
bibliográficos preliminares, P. iodocarpa Barb. Rodr. é descrita com as
características dessa Passiflora sp., porém em outros trabalhos P. iodocarpa tem
sido considerada uma sinonímia de P. edulis f. edulis. Tal situação permitiu levantar
as hipóteses de que estas sejam a mesma espécie, subespécies ou espécies
diferentes.
A Passiflora sp encontrada no sul da Bahia apresenta características de
interesse para ornamentação de interiores, por apresentar flores pequenas com
corona colorida e frutos pequenos e coloridos. Outro aspecto importante é que P.
edulis hibrida muito bem com outras espécies do subgênero Passiflora, mas todas
são de porte considerado inadequado para ornamentação de interiores. Se
Passiflora sp apresentar a mesma compatibilidade genética que P. edulis, a
obtenção de um híbrido com flores exuberantes, e de pequeno porte, será um
importante resultado para obtenção de híbridos ornamentais. Assim, pretende-se
responder qual a relação de parentesco entre P. edulis f. edulis e Passiflora sp.
A etapa inicial de caracterização e avaliação de uma espécie processa-se
com o emprego de marcadores morfológicos. Em conjunto, esses marcadores
devem descrever detalhadamente cada acesso, sendo, por isso, denominados
descritores, e expressar a potencialidade de uso do germoplasma para as diferentes
linhas de pesquisas. Deve-se dispor, também, de sistema de manejo dos dados que
permita o processamento de análises estatísticas e genéticas e que seja eficiente e
prático para orientar a tomada de decisões e monitorar os esforços realizados
(ENGELS, 1993). A divergência entre espécies, avaliada por descritores
morfológicos, pode proporcionar uma descrição sintética da afinidade genética entre
os indivíduos (CROCHEMORE et al., 2003; PRIMOT et al., 2005).
Entretanto espécies com grande semelhança anatômica e morfológica
representam um problema para os estudos taxonômicos, surgindo assim a
necessidade de novas ferramentas que venham corroborar, complementar ou até
mesmo redefinir organizações vigentes. Em Passiflora, o estudo dos cromossomos
(MELO et al., 2001; CUCO et al., 2005) ou abordagens da biologia molecular como
3
sequências do DNA cloroplastidial (PÁDUA, 2004; HANSEN et al., 2006) têm
permitido uma melhor caracterização dos indivíduos dentro dos grupos taxonômicos.
O presente trabalho visou delimitar as espécies P. edulis f. edulis e Passiflora
sp., com base em características citogenéticas, moleculares e morfológicas, tendo
como objetivos específicos caracterizar a morfologia vegetativa, reprodutiva e
polínica; estabelecer o cariograma comparativo entre as duas espécies; realizar
técnicas de bandamento para comparar os tipos e padrões de distribuição da
heterocromatina nos cromossomos das duas espécies; comparar as sequências do
íntron do trnL entre as duas espécies; realizar polinização interespecífica para
determinar a compatibilidade entre as duas espécies e realizar autopolinização para
determinar a taxa de auto-incompatibilidade.
Dessa forma, visa-se contribuir para o desenvolvimento de cultivares de
híbridos interespecíficos ornamentais de Passiflora, utilizando-se as espécies
nativas do Brasil, e, principalmente, do estado da Bahia, e dessa forma potencializar
e ampliar ações de pesquisa com passifloras já em andamento na UESC, para
futuramente proporcionar diversificação de cultivo na região sul da Bahia e
exploração sustentável dos recursos biológicos existentes.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Família Passifloraceae
A família Passifloraceae Juss. está incluída na ordem Malpighiales
(MILWARD-DE-AZEVEDO; BAUMGRATZ, 2004), sendo dividida em duas tribos,
Paropsieae e Passiflorieae. Essa última está representada no continente latino-
americano por quatro gêneros: Ancistrothyrsus Harms, Dilkea Mast., Mitostemma
Mast. e Passiflora L. (CERVI, 2005). Para todo o mundo são descritos, atualmente,
19 gêneros (BERNACCI, 2003). Diferentes autores têm descrito números
divergentes de espécies na família Passifloraceae, a exemplo de Barroso (1978) que
apontou 600 espécies pertencentes a esta família. Já Watson e Dallwitz (1992)
apontaram 530, enquanto Vanderplank (2000) apontou 630 espécies. Atualmente
são descritas aproximadamente 750 espécies nesta família (FEUILLET;
MACDOUGAL, 2007). A despeito desta divergência no número de espécies, tem-se
observado que a cada levantamento o número de espécies incluídas na família
Passifloraceae vem aumentando à medida que novas espécies são descobertas.
Segundo Kugler e King (2004), a primeira menção a representantes da família
Passifloraceae deve-se a Cieza de León (1553), fazendo referência a frutos
comestíveis denominados com o nome espanhol de granadillas. Tal nome faz
referência à romã (Punica granatum L.), espécie asiática conhecida de longa data no
Velho Mundo. Entretanto, existiam, também, nomes de origem indígena, como
maracujá, derivado de múrucuya (tupi) ou mburucuya (guarani) (KUGLER; KING,
2004). Os primeiros estudos com a família foram realizados por Linnaeus, em 1753.
Entretanto, Bernacci (2005) e Cervi (2005) destacam os autores, Velloso (1827,
5
1831); Candolle (1828), Roemer (1846); Masters (1871, 1872); Barbosa Rodrigues
(1891); Harms (1893, 1922, 1925, 1929), Usteri (1911) e Killip (1924, 1938, 1960),
que fizeram contribuições mais relevantes á taxonomia da família. Mais
recentemente, nos últimos 55 anos, pesquisadores brasileiros têm publicado
importantes levantamentos sobre a família Passifloraceae, a exemplo de Bernacci et
al. (2003); Bernacci e Vitta (1999); Cervi (1997, 2000, 2004); Milward-de-Azevedo e
Baumgratz (2004); Nunes e Queiroz (2001); Pessoa (1994) e Sacco (1980).
Passifloraceae é representada, principalmente, por trepadeiras, mas há
também arbustos e árvores baixas. As principais características são a presença de
gavinhas axilares utilizadas para sustentação em outras árvores, glândulas nos
pecíolos e na superfície foliar, flores que apresentam cores variadas, com pétalas e
sépalas em número de cinco e presença de corona, androceu com cinco estames e
gineceu composto de três estiletes; as folhas são alternas simples, e as sementes
são ariladas (KILLIP, 1938). A maioria das espécies são auto-incompatíveis,
(AKAMINE; GIROLAMI, 1957) e dependem de animais polinizadores como a
mamangava Xylocopa spp. (RUGGIERO, 1980) e o beija-flor Ensifera ensifera para
sua fecundação (LINDBERG; OLESEN, 2000).
A distribuição preferencial das passifloráceas ocorre nos trópicos, mas
também habitam em regiões subtropicais, como no norte da Argentina, África do Sul,
Austrália, Nova Zelândia, América do Norte e Ásia (VANDERPLANK, 2000; ULMER;
MACDOUGAL, 2004). A maioria dos gêneros da tribo Passifloreae D.C. tem
distribuição preferencial no hemisfério ocidental e os gêneros da tribo Paropsieae
D.C. têm distribuição preferencial no hemisfério oriental. No entanto, o gênero
Passiflora apresenta uma distribuição diferenciada dos outros gêneros da tribo
Passifloreae, já que, apesar de ser predominantemente americano, apresenta
muitas espécies registradas também em áreas do Sul da Ásia, África e Oceania
(VANDERPLANK, 2000).
2.2. O gênero Passiflora
O gênero Passiflora é o maior da família Passifloraceae, constituído por um
grande número de espécies que aumenta em cada levantamento. Levantamento
6
realizado por Cervi (2005) relata cerca de 520 espécies para o gênero. Por ser tão
amplo, este gênero apresenta uma significativa variabilidade morfológica
(CROCHEMORE et al., 2003a; PRIMOT et al., 2005) e genética (AUKAR et al.,
2002; BELLON 2007; CROCHEMORE et al., 2003b; FAJARDO et al., 1998;
HANSEN et al., 2006; SÁNCHEZ et al., 1999; SEGURA et al., 2002; VIANA, et al.,
2003).
Geograficamente este gênero pode ser encontrado numa ampla faixa de
latitude, desde 40° norte até 35° sul (LÖFGREN, 1917), habitando as regiões mais
quentes da América, África tropical, Ásia e Austrália (VANDERPLANK, 2000;
ULMER; MACDOUGAL, 2004). Contudo, a grande maioria das espécies é originária
da América tropical, e cerca de 200 destas espécies são nativas do Brasil (SACCO,
1980), encontrando na região Centro-Norte do País a sua maior distribuição
geográfica (ULMER; MACDOUGAL, 2004).
2.2.1. Classificação taxonômica de Passiflora
A maior contribuição para a taxonomia do gênero Passiflora é creditada ao
trabalho de Killip (1938) que, além de descrever várias espécies, estudou todas
aquelas conhecidas até a ocasião, e propôs um sistema de classificação largamente
utilizado até hoje. Este autor dividiu o gênero em 22 subgêneros (SG), algumas
secções (SE) e séries (SR) conforme esquema a seguir:
SG 1: Apodogyne
SG 2: Astephia
SG 3: Tryphostemmatoides
SG 4: Deidamioides
SG 5: Decaloba
SE 1: Cieca
SE 2: Mayapathanthus
SE 3: Decaloba
SR: Auriculatae
SR: Heterophyllae
SR: Sexflorae
SR: Apetalae
7
SR: Lutae
SR: Organenses
SR: Miserae
SR: Punctatae
SE 4: Xerogona
SE 5: Pseudodysosmia
SE 6: Pseudogranadilla
SE 7: Haniopathanthus
SG 6: Chloropathanthus
SG 7: Murucuja
SG 8: Pseudomurucuja
SG 9: Psilanthus
SG 10: Adenosepala
SG 11: Tacsoniopsis
SG 12: Rathea
SG 13: Tacsonia
SG 14: Granadillastrum
SG 15: Distephana
SG 16: Calopathanthus
SG 17: Tacsonioides
SG 18: Passiflora
SR: Quadrangulares
SR: Digitatae
SR: Teliaefoliae
SR: Marginatae
SR: Laurifoliae
SR: Serratifoliae
SR: Setaceae
SR: Pedatae
SR: Incarnatae
SR: Palmatisectae
SR: Kermesinae
SR: Imbricatae
8
SR: Simplicelifoliae
SR: Lobatae
SR: Menispermifoliae
SG 19: Dysosmia
SG 20: Dysosmioides
SG 21: Polyanthea
SG 22: Astrophea
SE 1: Dolichostemma
SE 2: Cirrhipes
SE 3: Euastrophea
SE 4: Leptopoda
SE 5: Pseudoastrophea
SE 6: Botryastrophea
Entretanto, trabalhos mais recentes utilizando abordagens genéticas (MELO
et al., 2001; MUSCHNER et al., 2003) sugerem a reorganização taxonômica do
gênero. Melo et al. (2001), mesmo não tendo como objetivo apresentar uma nova
organização sistemática para o gênero Passiflora, apresentaram dados consistentes
baseados em análises citogenéticas, que contribuíram para a elucidação das
relações genéticas e evolutivas entre as espécies de Passiflora, gerando
informações para estudos de sistemática. Do trabalho de Melo et al. (2001) resultou
a possível árvore de relações evolutivas entre complementos haplóides do gênero
Passiflora. Segundo estes autores, o número básico de cromossomos do gênero, x =
6, representa a hipótese mais parcimoniosa para a evolução cromossômica da
família. O número básico de cromossomos indica a ocorrência de apenas quatro
clados distintos, que corresponderiam aos quatro subgêneros propostos por
MacDougal e Feuillet (2004). Esta nova classificação infragenérica proposta por
MacDougal e Feuillet (2004) apresenta uma modificação à proposta de Killip (1938),
como descrito a seguir:
Decaloba: composto pelas superseções Pterosperma, Hahniopathanthus,
Disemma, Decaloba, Multiflora, Auriculata, Cieca, Bryonioides. Apresentando
número básico x = 6;
9
Astrophea: composto pelas superseções Astrophea e Pseudoastrophea. Com
x = 12;
Deidamioides: com cinco seções e com x = 12;
Passiflora: composto pelas superseções Passiflora, Stipulata, Laurifolia,
Coccinea, Distephana e Tacsonia. Com x = 9, mas também pode ser 10 ou 11.
Recentemente, Pádua (2004) reconstruiu a filogenia do gênero baseado em
seqüências trnT-L-F e do íntron do trnL. As 64 espécies utilizadas nesta análise
puderam ser divididas em quatro grandes clados, os quais foram denominados como
Decaloba, Deidamioides, Astrophea e Passiflora. Num primeiro grupo foram
reunidas todas as espécies do subgênero Decaloba utilizadas no estudo. Além das
espécies deste subgênero, foram também alocadas neste grupo as espécies P. tulae
(subgênero Murucuja Killip), P. microstipula e P. deidamioides (subgênero
Deidamioides Killip). A filogenia insere o subgênero Murucuja Killip no clado que
inclui as espécies de Decaloba Killip, formando um grupo monofilético que coincide
com Decaloba MacDougal e Feuillet (2004). Assim, Decaloba Killip passou a ser
considerado um clado.
É interessante verificar que a inclusão do subgênero Murucuja dentro do
clado Decaloba descrito por Pádua (2004) coincide com a reorganização proposta
por MacDougal e Feuillet (2004). De acordo com este autor, o subgênero
Deidamioides caracteriza-se por ser o único do gênero Passiflora que apresenta
folhas compostas, trifoliadas. A característica que o aproxima de Decaloba seria o
opérculo plissado. Porém, a distância entre as espécies P. microstipula e P.
deidamioides (subgênero Deidamioides) em relação às espécies de Decaloba, e a
característica foliar que lhe é peculiar, indicam que Deidamioides pode constituir um
subgênero distinto como propõem MacDougal e Feuillet (2004).
O subgênero Passiflora é o mais amplo do gênero, com cerca de 240
espécies, incluindo aquelas com as características mais típicas das passifloras
(ULMER; MACDOUGAL, 2004). As espécies deste subgênero apresentam flores
vistosas circundadas pela corona que, neste caso, apresenta faixas de cores
diferentes. Quanto à distribuição, as espécies deste subgênero podem ser
encontradas em todo o continente americano, com o seu centro de diversidade no
centro-norte da América do Sul. Todas as espécies deste subgênero possuem frutos
10
comestíveis e por isto todas as espécies agronomicamente importantes do gênero
Passiflora, incluindo P. edulis Sims, pertencem a este subgênero (ULMER;
MACDOUGAL, 2004).
P. edulis é nativa em todo o território nacional. Esta espécie é a mais
cultivada na família por seu grande valor econômico. Por ser uma espécie cultivada,
floresce e frutifica praticamente o ano inteiro. Existem na natureza duas formas: P.
edulis Sims f. edulis, que possui fruto de cor roxa (normalmente silvestres), e P.
edulis f. flavicarpa O. Deg., com frutos amarelos ou amarelo-esverdeados
(cultivadas).
A denominação das cultivares é regida pelo Código Internacional de
Nomenclatura das Plantas Cultivadas (TREHANE et al., 1995), existindo a categoria
„grupos de cultivares‟ que indicam conjuntos de cultivares com características em
comum. Assim, denomina-se Passiflora edulis grupo edulis para os maracujás-roxos
e Passiflora edulis grupo flavicarpa para os maracujás-amarelos, com a finalidade de
manter uma denominação que ficou tradicional na área agrícola (BERNACCI, 2005).
De acordo com a convenção internacional promovida pela UPOV (Union pour la
Protéction des Obtenciones Vegetales), da qual o Brasil é signatário, várias cores
(amarelo-pálido, amarelo, amarelo-alaranjado, vermelho-rosado, vermelho, roxo-
avermelhado, roxo-esverdeado, roxo e roxo-escuro) podem ser reconhecidas para a
adequada caracterização das cultivares de maracujá, dentro da espécie Passiflora
edulis. Quanto à taxonomia, deve-se utilizar Passiflora edulis Sims para toda e
qualquer planta e cor de fruto do maracujá-azedo, associando-se a elas um nome de
cultivar para os materiais selecionados (BERNACCI, 2008).
2.2.2. Morfologia do gênero
As espécies de Passiflora apresentam-se na forma de trepadeiras que variam
de 35 a menos de um metro de comprimento. No entanto, algumas poucas espécies
apresentam-se como arbustos ou até mesmo pequenas árvores com 15 m de altura
e caule de 20 cm de diâmetro (subgênero Astrophea), a saber, P. arborea, P.
lindeniana, P. tica, P. sphaerocarpa e P. emarginata. Porém, a grande maioria das
espécies são lianas de porte médio; as que apresentam menor tamanho são as
espécies do subgênero Decaloba, e as de maior porte são aquelas do subgênero
11
Passiflora (MACDOUGAL; FEUILLET, 2004). Apresentam ciclo de vida perene ou
semiperene (PEREIRA et al., 2005).
O caule é de formato cilíndrico na maioria das espécies, mas pode ser
encontrado em menor ocorrência no formato retangular, sulcado, ou mesmo alado.
As plantas utilizam a gavinha para se sustentar em árvores ou suportes. As folhas
podem ser inteiras ou partidas, apresentando de 3 a 9 lobos, com bordos serrados,
dentados ou inteiros. O pecíolo apresenta duas ou mais glândulas. As flores também
apresentam tamanhos e formas variadas, apresentando-se grandes com até 20 cm
de diâmetro e em forma de tubo (subgênero Passiflora) ou pequenas com 1 cm de
diâmetro (subgênero Decaloba) (JORGENSEN et al., 1984). Quanto à coloração das
flores, pode ser encontrada uma ampla gama de coloração, como o branco, laranja,
vermelho, roxo, amarelo e azul. A flor de praticamente todas as espécies permanece
aberta por apenas um dia, em outras espécies como P. edulis Sims a flor fica aberta
por apenas metade de um dia, e em um número muito reduzido de espécies a flor
permanece aberta por dois ou três dias, a exemplo de P. bahiensis (VIANA et al.,
2006) e P. aurantia (MACDOUGAL; FEUILLET, 2004). As flores apresentam também
um grupo de filamentos que circunda toda a base do ovário, que é denominado de
corona e se constitui na principal característica das flores do gênero. Os frutos são
arredondados ou alongados, de coloração verde, amarelada, alaranjada ou com
manchas verde-claras. As sementes são achatadas, envolvidas por um arilo
gelatinoso de coloração amarelada e translúcida. Uma característica bastante
comum no gênero é a presença de 3 brácteas embaixo de cada flor, podendo ser
pequenas e lineares (Decaloba) ou grandes e semelhantes à folhas (Passiflora)
(MACDOUGAL; FEUILLET, 2004).
A espécie P. edulis Sims (maracujá-amarelo, maracujá-azedo, maracujá-roxo,
entre outros nomes populares; BERNACCI, 2008) é uma planta trepadeira, glabra,
com caule cilíndrico ou subanguloso, estriado; estípulas 1,0 × 0,1mm, linear-
subuladas, pouco falcadas, inteiras; pecíolo 3-4 cm comprimento, caniculado na
parte superior, duas glândulas sésseis, curtamente estipitadas, situadas próximo à
base da folha.
As folhas são inteiras ou trilobadas, trinervadas, 5-13,5 cm de comprimento
na nervura central, 5-8,5 cm de comprimento nas nervuras dos lóbulos laterais (a
distância entre os ápices dos lóbulos laterais é de 7-13 cm de comprimento), lóbulos
12
oblongo-ovalados ou ovalados, com ápice agudo e, às vezes, um par de glândulas
sésseis nos sinus dos lóbulos; subcuneadas ou cordadas na base, membranáceas
ou subcoriáceas; margem serreada e, às vezes, serreado-glandular, glabras em
ambas superfícies. Apresenta gavinhas axilares, solitárias, bem desenvolvidas e
robustas; pedúnculos com 2-5 cm de comprimento, articulados na inserção das
brácteas. Possui três brácteas, verticiladas, foliáceas, situadas a 5 mm da base
floral; ovaladas ou oblongo-ovaladas, 2-2,5 × 1-1,5 cm; agudas ou obtusas no ápice,
margem profundamente serreada (às vezes, superficialmente serreadas) uma
nervura central proeminente. As flores são axilares com 5-7,5 cm de diâmetro, tubo
do cálice campanulado, dez nervuras proeminentes; sépalas oblongas 2-3,3 × 0,7-
1,0 cm; cor verde na face abaxial, alva na face adaxial; pétalas oblongas, 1,8-2,9 ×
0,5-0,8 cm, obtusas no ápice, alvas; corona de filamentos em 4-5 séries; duas séries
exteriores com filamentos liguliformes nos dois terços iniciais, subulados no terço
superior, 1-2,3 cm de comprimento; séries seguintes, com filamentos lineares ou
reduzidos a pequenos processos dentiformes, 1,5-2,5 mm de comprimento; no
interior do tubo do cálice, entre a corona de filamentos e o opérculo, pequenos
processos dentiformes, avermelhados; opérculo com 1,5-2 mm de altura,
membranáceo, encurvado, inteiro ou, às vezes, curto-fimbriado; limem cupuliforme.
O ovário é globoso e densamente tomentoso. O fruto é globoso ou ovóide, de
tamanho variável quando cultivado, 2,5-3,5 x 2,5 cm, e apresenta na espécie
cultivada, cor muito variável, amarelo, amarelo-esverdeado, púrpura escuro ou roxo
na forma selvagem. As sementes são ovais, 5-6 x 3-4 mm, duras, cor creme,
foveoladas (CERVI; LINSINGEN, 2008).
Classicamente os estudos taxonômicos em Passiflora foram baseados na
caracterização morfológica da planta, levando à classificação até o táxon espécie.
Mais recentemente estudos utilizando abordagens genéticas têm solucionado
problemas taxonômicos existentes ao nível intra-específico, as quais apresentavam
maiores dificuldades de serem observadas e caracterizadas apenas via morfologia.
2.2.3. Importância econômica do gênero
Na América Latina, entre as espécies que apresentam frutos comestíveis
destacam-se, além de P. edulis Sims (maracujá-amarelo, maracujá-azedo e
13
maracujá-roxo), P. alata Curtis (maracujá doce), P. tripartita var. mollissima Holm-
Nielsen e Jorgensen (curuba de Castilla), P. tarminiana Coppens e Barney (curuba
quiteña), P. cumbalensis (Karst.) Harms (curuba vermelha), P. ligularis Juss.
(granadilha), P. quadrangularis L. (maracujá-melão), P. maliformis L. (maracujá de
osso) e P. nitida L. (maracujá-suspiro) (PÁDUA, 2004).
No Brasil, P. edulis f. flavicarpa é a principal espécie cultivada. Além de P.
edulis, apenas P. alata Curtis atinge escala de mercado como frutífera (MELLETI;
MAIA, 1999). Algumas outras espécies são exploradas localmente (P. nitida Kunth, o
maracujá-suspiro ou maracujá-do-cerrado e P. cincinnata Mast., o maracujá-do-
mato). Outras são cultivadas em escala doméstica (P. quadrangularis L., o maracujá-
de-quilo, maracujá-gigante ou maracujá-badea) (BERNACCI et al., 2005).
O Brasil é o principal produtor mundial de maracujá, com área de plantio de
aproximadamente 35.820 ha (AGRIANUAL, 2008). O cultivo basea-se em
praticamente uma única espécie, o maracujá-amarelo. Contudo, nos últimos anos, o
maracujá doce (P. alata) tem ganhado importância, uma vez que atinge preços
unitários mais expressivos no segmento das frutas frescas (BERNACCI, 2003).
Na Bahia, a produção do maracujá impõe-se como uma alternativa agrícola
geradora de emprego no meio rural. Embora P. edulis seja nativa do Brasil (KILLIP,
1938), seu cultivo só adquiriu expressão econômica na década de 1980, com o
incentivo da agroindústria de sucos e, principalmente, devido à crescente demanda
no mercado de fruta fresca (MELETTI, 1998). No estado, a cultura se expande
levando-o a ocupar lugar de destaque. Em 1990 sua produção estava em torno de
18% do total nacional, em 2005 atingiu a participação de 29% (IBGE, 2007).
Segundo Ferraz e Lot (2007), há espaço para a expansão do mercado interno, pois
a oferta não consegue suprir a demanda. Ainda de acordo com Ferraz e Lot (2007),
“o valor da fruta é altamente dependente da aparência e peso”, o que se configura
em um mercado complexo e altamente vulnerável às flutuações de preços,
refletindo-se na própria sustentabilidade econômica da atividade.
A utilização do maracujazeiro como planta medicinal faz parte da cultura de
povos americanos, europeus e asiáticos. Espécies comerciais e silvestres integram o
repertório etnofarmacológico que recomenda folhas, flores, raízes e frutos para
combater as mais diferentes enfermidades, do controle de verminoses ao tratamento
de tumores gástricos. Contudo, a fama do maracujá vem da ação benéfica sobre o
14
sistema nervoso, sendo indicado, principalmente, no combate à ansiedade, à
depressão e à insônia (MATOS, 2002; DHAWAN et al., 2004). A principal espécie
cultivada para fins medicinais é P. incarnata, sendo encontradas grandes áreas de
cultivo desta espécie em fazendas dos Estados Unidos, Colômbia, Guatemala, Índia,
Belize e Brasil (BALSER, 2004). No Brasil, alguns trabalhos têm sido feito com P.
edulis e P. alata, e tem se detectado ação calmante destas espécies, sem, contudo,
afetar os processos da memória (BARBOSA et al., 2008).
As passifloras também apresentam utilização ornamental. Suas flores são
consideradas complexas, de coloração forte ou suave, principalmente devido à
presença da corona, característica da família Passifloraceae, e igualmente
fascinante é a ampla variedade de formatos das folhas dentro do gênero, tendo
muitas espécies valor comercial ornamental somente em função da folhagem
(ABREU et al., 2009). Por diversas características, as passifloras podem ser
inseridas na lista de plantas ornamentais, como flores com característica excêntrica,
coloridas, vistosas e exóticas (ABREU et al., 2009), com coloração que se exprime
desde o branco ou verde suave, a espetaculares amarelos, azul, violeta, rosa,
laranja e vermelho (ULMER; MACDOUGAL, 2004), além de muitas delas possuirem
perfume agradável e número abundante de flores.
Devido aos atributos estéticos de suas exóticas flores e folhas, e de sua
ampla variabilidade inter e intra-específica (MELETTI et al., 2000), as passifloras
vêm sendo utilizadas na ornamentação de casas de vegetação e jardins europeus
desde sua introdução no „Velho Mundo‟, por volta de 1625, séc. XVII, pelos jesuítas
(PEIXOTO, 2005; ULMER; MACDOUGAL, 2004). Podem ser utilizadas de modo
decorativo, com efeito harmonioso entre vaso e planta (PEIXOTO, 2005; SOUZA, et
al., 2006). Nos Estados Unidos e em muitos países da Europa, as passifloras são
atualmente utilizadas na ornamentação de jardins, muros, cercas, pérgulas e estufas
(RUSHING, 2003; VANDERPLANK, 2000), enquanto que em países de clima
tropical, como Brasil e Austrália, o potencial ornamental destas espécies é quase
inexplorado (ABREU et al., 2009).
Já os híbridos de Passiflora com potencial ornamental têm se destacado em
muitos países, com sementes amplamente comercializadas na internet e em seções
de jardinagem de mercados europeus e norte-americanos (http://www.gkexotic
plants.com/). O Brasil, apesar da ampla variabilidade genética existente e do clima
15
tropical favorável, não tem se destacado neste próspero mercado de passifloras
ornamentais devido, principalmente, à carência de programas de melhoramento para
obtenção de híbridos ornamentais adaptados as diversas regiões do Brasil (SOUZA;
PEREIRA, 2003; ABREU et al., 2009). Os cruzamentos interespecíficos no país têm
dado ênfase à transferência de genes de resistência às doenças que acometem os
maracujazeiros, transferindo genes de espécies silvestres para o maracujá comercial
(JUNQUEIRA et al., 2005).
No Brasil, uso de passifloras para ornamentação encontra-se associado ao
uso nutricional dos frutos dos maracujazeiros. No sudeste do Brasil, as espécies P.
alata Curtis e P. edulis Sims utilizadas em pérgulas ou cercas para aproveitar os
frutos e ter como bônus a beleza e o perfume da flor (PEIXOTO, 2005). Nas Regiões
Norte e Nordeste, a situação se inverte, sendo as espécies silvestres P. coccinea
Aubl. e P. cincinatta Mast., utilizadas por sua beleza per se (PEIXOTO, 2005).
A utilização das passifloras como elementos decorativos pode ser também
uma medida de conservação desse germoplasma, uma vez que a erosão genética
entre essas espécies é significativa, sobretudo devido à ação antrópica (ABREU et
al., 2009). A destruição do ambiente natural dessas espécies decorrentes do
processo de urbanização e expansão das atividades agrícolas reduz a diversidade
genética e conseqüentemente restringe trocas gênicas entre populações restritas o
que pode levar a extinção (BERNACCI et al., 2005). Diante disso, a manutenção
dessas espécies em bancos de germoplasma assim como sua utilização na
decoração de paisagens e ambientes internos pode ser considerada uma medida de
conservação.
2.3. Similaridade genética via descritores morfológicos
Morfometria pode ser definida como a descrição quantitativa, análise e
interpretação de formatos e sua variação biológica (ROHLF, 1990), apresentando
íntima relação entre a biologia, a estatística e a geometria (MONTEIRO; REIS,
1999). Estudos morfométricos são ferramentas de grande valia para várias áreas
das ciências biológicas como genética, fisiologia, ecologia, sistemática e evolução
(MCLELLAN; ENDLER, 1998).
16
Germoplasma é definido por Allard (1971) e Borém (1998) como a soma total
dos materiais hereditários de uma espécie. Assim, estes poderão estar na forma de
plantas, anteras, pólen, sementes, tecidos (meristema, calo) ou células.
O Bioversity International antigo International Plant Genetic Resources
Institute (IPGRI) é a instituição responsável pela coordenação, em todo o mundo, da
padronização do sistema de caracterização e avaliação dos recursos genéticos
vegetais, na qual se adotam cinco categorias diferentes de descritores, entre os
quais, descritores de passaporte, de manejo, de local e meio ambiente, de
caracterização e de avaliação. Não existe uma lista definida de descritores
especificamente para o maracujazeiro, há apenas uma lista de descritores para
espécies frutíferas tropicais (IPGRI, 1980), a qual se concentra basicamente nas
características do fruto, destacando-se os descritores de caracterização, pois estes
fornecem informações quantitativas e qualitativas que possibilitam a melhor
discriminação entre os genótipos (IPGRI, 1996).
A etapa de caracterização e avaliação processa-se com o emprego de
marcadores morfoagronômicos. Em conjunto, esses marcadores devem descrever
detalhadamente cada acesso, sendo, por isso, denominados descritores, e
expressar a potencialidade de uso do germoplasma para as diferentes linhas de
pesquisas. Deve-se dispor, também, de sistema de manejo dos dados que permita a
construção de bancos de dados, o processamento de análises estatísticas e
genéticas, e que seja eficiente e prático para orientar a tomada de decisões para
escolha de genitores e monitorar os esforços realizados (ENGELS, 1993).
2.3.1. Análise multivariada na quantificação da similaridade genética
No estudo da diversidade genética por métodos preditivos, relata-se que
vários métodos multivariados podem ser aplicados, tais como a análise por
componentes principais (quando se dispõe de informações sem repetições), por
variáveis canônicas (quando se dispõe de informações com repetições) e os
métodos de agrupamento (os quais dependem de uma medida de dissimilaridade
previamente estimada). A escolha do método mais adequado dá-se em função da
precisão desejada pelo pesquisador, da facilidade da análise e da forma como os
dados foram obtidos (CRUZ; CARNEIRO, 2003).
17
Técnicas multivariadas vêm sendo empregadas na quantificação da
similaridade genética em diferentes coleções de germoplasma, podendo-se citar os
trabalhos realizados por Amaral Júnior et al. (1996) com moranga; Araújo et al.
(2002) com cupuaçuzeiro; Barros (1991) com cajueiro; Crochemore et al. (2003a)
com maracujazeiro; Cury (1993) com mandioca; Daher et al. (1997) com capim
elefante; Fonseca; Silva (1999) com feijão; Maluf; Ferreira, (1983) com feijão-de-
vagem; Mattedi et al. (2004) com tomateiro; Negreiros et al. (2008) com
maracujazeiro; Peixoto et al. (2002) com feijão-de-vagem; Primot et al. (2005) com
maracujazeiro; Santos et al. (2005) com cacaueiro; Souza (1996) com acerola;
Strapasson et al. (2000) com Paspalum.
Quando se dispõe de informações provenientes de ensaios experimentais, é
possível a obtenção da matriz de dispersão residual e das médias das
características. De posse dessas informações, obtêm-se as estimativas das
distâncias de Mahalanobis. Além de possibilitar o estudo da similaridade genética, é
possível, por meio das distâncias generalizadas de Mahalanobis, quantificar a
contribuição relativa dos caracteres para a divergência genética utilizando o critério
proposto por Singh (1981) (CRUZ; CARNEIRO, 2003). Outro aspecto interessante é
o exposto por Amaral Júnior e Thiébaut (1999), alicerçados nos trabalhos de Manly
(1986) e Rao (1952), os quais relatam que a distância generalizada de Mahalanobis
somente pode ser estimada se as matrizes de covariância das unidades amostrais
forem homogêneas e se existir distribuição normal multidimensional. No entanto,
segundo Sneath e Sokal (1973), já foi demonstrada considerável robustez para
violação dessas hipóteses, o que faz da distância de Mahalanobis um instrumento
de incomparável utilidade.
De posse da matriz de distâncias, a próxima etapa na análise multivariada é
realizar o agrupamento dos genótipos. A grande utilidade do emprego de métodos
de agrupamento reside em facilitar a avaliação da similaridade genética. São dois os
procedimentos de agrupamento: hierárquicos e de otimização. Nos métodos
hierárquicos, o objetivo final é a consecução de um diagrama de árvore ou
dendrograma, onde os agrupamentos podem ser obtidos subjetivamente, tomando-
se por base as diferenças abruptas de mudança de nível no dendrograma (AMARAL
JÚNIOR; THIÉBAUT, 1999; CRUZ; REGAZZI, 2001; CRUZ; CARNEIRO, 2003). Os
métodos de otimização diferem dos hierárquicos, basicamente, pelo fato de os
18
grupos formados serem mutuamente exclusivos, ou seja, independentes entre si. O
método de otimização de Tocher tem sido amplamente utilizado. Nesse método, o
grupo original é dividido em subgrupos, não havendo intersecção de acessos em
mais de um grupo (AMARAL JÚNIOR; THIÉBAUT, 1999; CRUZ; REGAZZI, 2001;
CRUZ; CARNEIRO, 2003).
2.4. A Citogenética na determinação das relações evolutivas dos vegetais
Estudos cromossômicos têm sido utilizados na determinação das relações
filogenéticas e evolutivas entre grupos de plantas (RAVEN, 1975; SINGH, 2003). A
determinação do cariótipo pode ter um papel importante na reorganização da
taxonomia vegetal, principalmente na caracterização de diferentes táxons. Em geral,
espécies proximamente relacionadas apresentam cariótipos semelhantes, por outro
lado, espécies distantes apresentam cariótipos mais divergentes (SUMNER, 2003).
Alterações envolvendo a estrutura dos cromossomos, tais como inversões,
translocações, deleções e modificações no número de cromossomos, como
poliploidia, aneuploidia e disploidia, apresentam importante função na evolução e
especiação dos vegetais (LEVIN, 2002; LYSAK et al., 2006; SCHUBERT, 2007).
A poliploidia é o tipo de variação cromossômica predominante na evolução
das plantas (LEVIN, 2002). Diferentes tipos de células podem sofrer ciclos
endomitóticos ou mesmo erro meiótico (não-redução cromossômica) que resultam
em células poliplóides (SCHIFINO-WITTMANN, 2004). Na maioria dos animais, a
poliploidia não é suportada, sendo eliminada ainda na fase inicial de
desenvolvimento do indivíduo.
As variações morfológicas podem ser oriundas de rearranjos cromossômicos.
Cariótipos geralmente diferem entre organismos, mesmo entre aqueles
relacionados, e muitas dessas diferenças são devidas a rearranjos cromossômicos
que incluem, principalmente, translocações e inversões, duplicações, e fusões em
tandem (SUMNER, 2003). Muitas espécies são heterogêneas para essas alterações,
que modificam o tamanho e a simetria dos cromossomos (LEVIN, 2002).
Existem diversos parâmetros no estudo cariomorfológico, que nos permite
fazer comparações entre categorias taxonômicas relacionadas que apresentam
mesmo número de cromossomos, e com isto detectar possíveis variações
existentes. Dentre estes parâmetros podemos citar variações no comprimento
19
absoluto dos cromossomos, nas propriedades de coloração e na posição do
centrômero, e ainda presença ou ausência de satélite e constrição secundária
(SUMNER, 2003). Inferências sobre alterações no conteúdo de DNA podem ser
realizadas comparando-se o tamanho absoluto dos cromossomos ou por citometria
de fluxo (SOUZA et al., 2004). Rearranjos estruturais podem ser detectados por
meio de diferenças no tamanho relativo, posição do centrômero e número, tamanho
e posição dos satélites (VIEIRA et al., 2004).
Outro parâmetro importante no estudo morfológico dos cromossomos é a
simetria de cariótipos. Um cariótipo simétrico é aquele cujos cromossomos
apresentam comprimentos semelhantes e centrômeros medianos ou submedianos,
por outro lado se um cariótipo apresenta cromossomos de tamanhos diferentes e
centrômeros com localização terminal, é dito como assimétrico. Cariótipos mais
simétricos são tidos como mais primitivos e originariam os assimétricos por meio de
alterações cromossômicas (LEVIN, 2002). Ainda em relação a este parâmetro,
Huziwara (1962) propôs uma fórmula para quantificação do grau de assimetria
cariotípica, o índice TF (medido em porcentagem), correspondente à razão entre a
somatória dos braços curtos e o comprimento do lote haplóide. O índice pode variar
entre 0 a 50%, sendo este último valor característico de cariótipos extremamente
simétricos.
A análise cariotípica a partir de parâmetros como tamanho de cromossomos,
relação entre os braços, presença de constrição secundária e satélite, propriedades
de coloração e índice de assimetria, fornecem informações valiosas, principalmente
quando se quer comparar espécies diferentes ou examinar a variação entre
indivíduos da mesma espécie (RUAS, 1989). A partir da segunda metade do século
passado, com a introdução das técnicas de bandamento, foi possível a visualização
de blocos de coloração diferenciada. Essas regiões geralmente aparecem como
faixas transversais mais coradas nos cromossomos, recebendo assim a
denominação de bandas, permitindo que a caracterização cromossômica seja
significativamente melhorada (SUMNER, 2003).
Os bandamentos identificam a distribuição e a quantidade de
heterocromatina, diferenciação de tipos de heterocromatina (rica em pares de base
adenina e timina ou rica em guanina e citosina) usando fluorocromos, e localização
de regiões organizadoras de nucléolo, mediante impregnação pela prata (Ag-NOR).
20
Estes bandamentos são importantes para a identificação de cromossomos
homólogos e homeólogos e para a caracterização de polimorfismos ou de relações
de parentesco entre espécies, distinguindo possíveis rearranjos cromossômicos
(SUMNER, 2003).
2.4.1. Bandamento C
O bandamento C com Giemsa é o procedimento mais importante para
evidenciar a heterocromatina constitutiva (HC) nos cariótipos e núcleos de diferentes
organismos eucariotas. Nesta técnica, o pré-tratamento (HCL 0,2N; Ba(OH)2; 2x
SSC) modifica a estrutura do cromossomo, resultando na extração preferencial de
proteínas e de DNA das regiões eucromáticas, fornecendo assim um padrão
característico de bandas. Provavelmente, este mecanismo está associado a
peculiaridades inerentes a HC, sobretudo às proteínas não-histônicas, que formam
um complexo que dificulta a retirada de DNA heterocromático (SUMNER, 2003).
Apesar da eficiência em evidenciar regiões heterocromáticas, o bandamento C não
revela todos os tipos de HC ou, ainda, estas podem se apresentar fracamente ou
não totalmente coradas (SUMNER, 2003).
A ocorrência preferencial da heterocromatina constitutiva é descrita em
determinadas regiões dos cromossomos, em particular nos centrômeros ou nas suas
proximidades (pericentromérica ou paracentromérica), formando blocos de tamanho
variável de acordo com o grupo analisado (GUERRA, 2000). Segmentos
heterocromáticos também foram descritos nas regiões teloméricas e, em menor
número, intersticiais de algumas espécies como o milho (ELLNESKOG-STAAM et
al., 2007) e o trigo (FRIEBE et al., 1992). A natureza química dessas bandas C vem
sendo analisada pela coloração com fluorocromos base-específicos. Deste modo,
bandas que aparentemente são homogêneas pela coloração convencional, podem
ser classificadas como ricas em GC ou AT, ou então como neutras (SWARÇA et al.,
2003).
2.4.2. Fluorocromos CMA e DAPI
Os fluorocromos consistem de um grupo químico que quando excitado por
energia luminosa de comprimento de onda específico desloca alguns elétrons para
orbitais mais externos. Estes elétrons ficam instáveis e logo retornam aos seus
21
orbitais originais, liberando energia na forma de luz na faixa do visível, com um
comprimento de onda distinto da utilizada em sua excitação (GUERRA, 2004). O
emprego de uma ampla variedade de fluorocromos tem sido utilizado para produzir
padrões fluorescentes característicos, de acordo com sua afinidade aos pares de
base adenina e timina (AT) ou guanina e citosina (GC) do DNA, em vários
organismos. Em alguns casos, esses corantes são associados a outros marcadores
que podem ser ou não fluorescentes (contracorantes) para obtenção de resultados
diferenciados. Dependendo de sua especificidade, os corantes fluorescentes irão
originar um padrão de bandas similar aos dos bandamentos Q ou R na eucromatina
ou, ainda, reproduzir as bandas exibidas no bandamento C (SUMNER, 1990).
Utilizando fluorocromos específicos para AT e CG em combinação com
contra-corantes, Schweizer (1976) desenvolveu um método de coloração da
heterocromatina de acordo com o seu padrão de constituição nucleotídica. O
fluorocromo 4‟-6‟ diamidino-2-fenilindol (DAPI) evidencia sequências de DNA
repetitivo ricas em AT, enquanto a cromomicina A3 (CMA) liga-se a sequências ricas
em GC.
Alguns táxons com cariótipo conservado, quando observados com técnicas de
coloração convencionais, podem revelar uma intensa variação estrutural quando
analisados com fluorocromos (MARCON et al., 2005; MIRANDA et al., 1997). O fato
de se detectar a ocorrência e a posição física de diferentes famílias de
heterocromatina implica em maior compreensão de como os genomas estão
organizados e as relações entre espécies, gêneros e famílias, bem como os
mecanismos de ajustes que ocorrem nos cariótipos de diferentes organismos
durante o processo evolutivo.
2.4.3. Citogenética de Passiflora
As espécies do gênero Passiflora possuem amplitude significativa para
tamanho e número de cromossomos. O número básico de cromossomos é x = 6,
mas há ocorrência para: x = 9, x = 10 e x = 12, como números básicos secundários
(Hansen et al., 2006; Melo et al., 2001). O número cromossômico 2n varia no grupo
x = 6, havendo espécies com 2n = 12, 24, 36 e 84 cromossomos. Já no grupo com x
= 9 há espécies onde 2n = 18 e alguns citótipos com 2n = 20 e 22. P. edulis pertence
22
ao grupo com x = 9 com 2n = 18, no qual estão inseridas todas as espécies com
importância econômica alimentícia.
A poliploidia é tida como o principal mecanismo evolutivo neste gênero, já que
x = 6 (n = 6) é descrito como número básico ancestral e teria originado os demais
números básicos por poliploidia nos processos evolutivos (MELO et al., 2001;
HANSEN et al., 2006). Uma possível triploidia foi sugerida para a origem das
espécies com 2n = 18 (STOREY, 1950), hexaploidia nas espécies com 2n = 36
(MELETTI et al., 1992) e poliploidia (2n = 14x) na espécie P. lutea com 2n = 84
(BOWDEN 1940, 1945). O número básico x = 12 parece ter uma importante função
na evolução do grupo, pois é o mais representado nos outros gêneros da família.
Neste caso o mecanismo evolutivo atuante seria a disploidia (x = 12 => 6) (MELO et
al., 2001). Segundo Hansen et al. (2006), os dois maiores subgêneros da família
Passifloraceae, Passiflora e Decaloba, têm números haplóides, n = 9 e 6,
respectivamente. Contrariamente, os subgêneros Astrophea e Deidamioides
possuem números haplóides de n = 12 (HANSEN et al., 2006).
Estudos mais detalhados do cariótipo das espécies têm permitido a
observação de diferenças inter e intra-específicas na morfologia dos cromossomos
(SOUZA et al., 2008). Alguns autores têm observado polimorfismo, principalmente
em relação ao número e localização dos satélites (SOUZA et al., 2003; VIEIRA et al.,
2004). Em P. alata há divergências em relação à posição de satélites. Melo et al.
(2001) observaram satélites nos dois pares menores, Soares-Scott et al. (1998,
1999) concordaram quanto ao par 7, mas indicaram também o par 4, e Souza et al.
(2003) os observaram nos pares 1 e 2. Essas diferenças devem ocorrer devido á
variabilidade em diferentes populações dentro das espécies, ou mesmo qualidade
da preparação citológica, devido ao grau de compactação dos cromossomos.
O grupo 2n = 12 comporta as espécies com os menores cromossomos, como
foi observado por Beal (1973a), que analisou oito espécies de passifloras agrupadas
em três grupos distintos, com 2n = 12, 2n = 18, e 2n = 24. O autor observou que
espécies como P. aurantia Forst. e P. herbetiana Ker., com 2n = 12, apresentaram o
menor comprimento médio dos cromossomos, variando de 2,7 a 3,1 µm e com
comprimento haplóide (CLH) que variou de 32,9 a 37,3 µm; P. maliformis L. e P.
seemannii Griseb, incluídas nos grupos com 2n = 18, apresentaram maior
comprimento médio dos cromossomos, variando de 3,1 a 3,7 µm e com CLH
23
variando de 55,9 a 66,9 µm, e mesmo ocorreu em P. suberosa L., com 2n = 24, com
comprimento cromossômico médio de 2,3 µm e CLH de 55,1 µm. O mesmo padrão
foi observado por VIEIRA et al. (2004) que estudaram nove espécies de Passiflora
agrupadas em dois grupos com 2n = 12 e 2n = 18, e observaram que P. capsularis
do grupo 2n = 12 apresentou o menor comprimento médio dos cromossomos 1,3
µm, enquanto as outras espécies pertencentes ao grupo 2n = 18 apresentaram
comprimento médio dos cromossomos variando de 2,8 µm em P. incarnata e 3,0 µm
em P. alata. Souza et al. (2003) analisaram seis espécies de Passiflora, P. alata
Dryander, P. edmundoi Sacco, P. malacophylla Mast., P. mucronata Lam., P.
galbana Mast. e P. quadrangularis L., todas do grupo 2n = 18, e encontraram
comprimentos cromossômicos médios que variaram de 2,06 µm em P. malacophylla
e 4,51 µm em P. quadrangularis.
Vieira et al. (2004) sugeriram a ocorrência de dois pares de cromossomos
maiores (cariótipo assimétrico) e dois satélites como um padrão do gênero, no
entanto tem sido observado que muitas espécies apresentam uma variação gradual
no tamanho dos cromossomos e algumas espécies apresentam apenas um par
satelitado (MELO et al., 2001; SOUZA et al., 2003). Todas as espécies estudadas
apresentaram cromossomos com comprimento médio variando de 1,63 a 3,73 µm.
Os comprimentos máximo e mínimo foram observados em P. quadrangularis L. e P.
capsularis L., com 4,51 (SOUZA et al., 2003) e 0,95 µm (MAYEDA, 1997),
respectivamente. Quanto aos cariótipos, em sua maioria foram simétricos, mas com
diferenças significativas entre os táxons analisados até agora. Os centrômeros foram
observados em posição mediana e submediana, com relação de braços variando de
1,12 a 1,59 µm e presença de satélites em até três pares cromossômicos (BEAL,
1973b; CUCO et al., 2005; MELETTI et al., 2005; MELO et al., 2001; OLIVEIRA;
COLEMAN, 1996; SOARES-SCOTT et al., 1999; SOUZA, et al., 2003; VIEIRA et al.,
1997).
Mesmo sendo encontrados diversos trabalhos com abordagens citogenéticas
em Passiflora, por ser um gênero tão amplo, até 2005 os estudos cariotípicos em
Passiflora não alcançavam 30% das espécies (SOARES-SCOTT et al., 2005). Das
cerca de 200 espécies nativas do Brasil, menos da metade tem o número
cromossômico conhecido (SOUZA, et al., 2008).
24
2.5. Estudo das relações evolutivas dos vegetais via dados moleculares
A filogenia é definida como a área da biologia que estuda as relações de
ancestralidade supostas para um conjunto de espécies (MATIOLI, 2001), ou ainda
como uma suposta reconstrução da história evolutiva de um grupo, indicando os
vários níveis nas relações de ancestralidade das espécies com suas espécies
descendentes (AMORIM, 2002). Na prática, o problema fundamental é que as
espécies ancestrais não podem ser observadas diretamente por estarem extintas.
Assim, é necessário buscar mecanismos para recuperar informações a respeito das
relações de parentesco entre os grupos (MATIOLI, 2001) com base em análise dos
organismos atuais (ou fósseis de que dispomos hoje).
Várias abordagens para inferir as relações filogenéticas foram sendo
desenvolvidas ao longo do século XX, resultando em diversas controvérsias a cerca,
tanto de tais relações, quanto dos métodos e tipos de dados utilizados para se
chegar a elas (AMORIM, 2002). Estudos filogenéticos têm sido realizados utilizando-
se tanto dados morfológicos quanto moleculares. Atualmente, as análises de
macromoléculas, em especial do DNA, vêm sendo amplamente utilizada para este
fim, caracterizando uma linha de pesquisa denominada sistemática molecular
(MATIOLI, 2001). Em grande parte, isto ocorre porque o DNA é o próprio material
hereditário, cujos dados têm sido gerados de forma rápida e em grande quantidade,
frente aos recentes avanços tecnológicos na área de biologia molecular (MATIOLI,
2001).
A origem das adaptações morfológicas pode ser inserida em um contexto
filogenético na reconstrução segura das mudanças moleculares que originaram
novas estruturas (CLEGG et al., 1997), ou ainda, dos genes de desenvolvimento,
usados como marcadores filogenéticos para elucidar a diversidade morfológica de
algumas estruturas (KAUFMANN et al., 2005).
2.5.1. O genoma cloroplastidial no estudo filogenético
O genoma do cloroplasto corresponde a uma molécula de DNA circular,
podendo variar de 120 kb a 220 kb, localizada no interior dos cloroplastos existentes
no citoplasma de vegetais superiores (NAHUM, 2001). Esse DNA cloroplastidial
(cpDNA) geralmente apresenta duas regiões simples, uma grande (LSC, large single
copy) e uma pequena (SSC, small single copy), com aproximadamente 134-160 kb e
25
80-87 kb. Adicionalmente, no cpDNA encontramos regiões repetidas invertidas (IR,
inverted repeat), formadas por dois segmentos idênticos em sentidos opostos,
separando os SSC e LSC (DOYLE et al., 1995; NAHUM, 2001). As regiões IR
podem apresentar um tamanho variável, de 12 a 25 kb cada, porém algumas
linhagens, nas leguminosas, têm perdido estas regiões (DOYLE et al., 1995;
PALMER; DELWICHE, 1998).
O genoma cloroplastidial difere grandemente em relação ao genoma nuclear,
no tamanho e número de genes e, principalmente nas taxas e nos padrões de
evolução (NAHUM, 2001). Segundo Birky (2001), os cloroplastos são herdados de
uma maneira não-Mendeliana em todos os organismos estudados. Adicionalmente,
Korpelainen (2004) afirma que a herança dos genomas citoplasmáticos é
freqüentemente materna, mas existem numerosas exceções que resultam em
diferentes graus de herança paterna ou biparental do cpDNA. A exemplo do gênero
Passiflora, que apresenta tanto herança materna, paterna, quanto herança
biparental (HANSEN et al., 2007).
A maior parte das informações genéticas das células vegetais está localizada
no núcleo. Contudo, no estudo do genoma nuclear nas angiospermas são
encontradas algumas dificuldades por causa de seu grande tamanho e
complexidade, com extensas regiões não-codificantes. As plantas com flores
possuem um dos maiores genomas entre os organismos vivos (BENNETT et al.,
2000). Estes grandes genomas, em parte, devem-se à origem poliplóide de muitas
espécies, o que torna mais complexo o estudo evolutivo de alguns grupos.
O cpDNA vem sendo bastante empregado em estudos de filogenia por causa
de sua estabilidade estrutural, seu padrão de herança e sua taxa de mutação. Nos
últimos anos, ocorreu um aumento de publicações sobre filogenia molecular, nos
diferentes níveis taxonômicos, construídas a partir do cpDNA ou em consórcio com o
mesmo (BRUNEAU et al., 2001; DOYLE et al., 2000; DOYLE; LUCKOW, 2003;
HASTON et al., 2005; HIRAO et al., 2008; JUNCHUM et al., 2008; MCMAHON;
HUFFORD, 2004; MUSCHNER et al., 2006; SÁNCHEZ et al., 1999; WU et al.,
2007).
Taberlet et al. (1991) publicaram primers universais para regiões não-
codificadoras cloroplastidiais. Nas análises filogenéticas, dentre as regiões
cloroplastidiais mais utilizadas estão os genes que transcrevem para os tRNA da
26
tirosina (trnT), da leucina (trnL) e da fenilalanina (trnF). Entre as regiões não
codificadoras destes genes encontram-se o espaçador intergênico trnL-trnF e o
íntron do trnL, que são melhor estudadas no grupo das angiospermas. Essas
regiões têm sido amplamente utilizadas nas análises filogenéticas nos mais variados
níveis taxonômicos (BRUNEAU et al., 2001; HASTON et al., 2005; JUNCHUM et al.,
2008; MES et al., 2000; MUSCHNER et al., 2006).
27
Capítulo de acordo com as normas da Revista Naturwissenschaften
3. Capítulo 1- DELIMITAÇÃO ENTRE AS ESPÉCIES Passiflora edulis Sims e
Passiflora sp. COM BASE EM CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, POLÍNICA,
REPRODUTIVA E EM SEQUÊNCIA DE DNA
Resumo Na Floresta Atlântica do Sul da Bahia é reconhecida a ocorrência de Passiflora
edulis Sims, denominado como maracujazeiro-roxo. Recentemente foi coletada outra espécie
(Passiflora sp.), que é morfologicamente muito similar à P. edulis, diferenciando-se apenas
no tamanho da flor e do fruto. Para uma melhor delimitação entre estas duas espécies, vinte e
dois descritores da morfologia vegetativa, reprodutiva e polínica foram avaliados em 10
acessos de cada espécie. Foi possível estruturar a diversidade encontrada, havendo a formação
de dois grupos distintos representados pelos acessos de cada espécie no agrupamento. P.
edulis e Passiflora sp. apresentaram boa taxa de cruzabilidade, indicando que são espécies
próximas. As relações filogenéticas entre as espécies, avaliadas pela comparação da sequência
do íntron do trnL associada às demais características analisadas, mostraram existir diferenças
suficientes entre estas duas espécies para reconhecê-las como distintas. Passiflora sp se trata
de uma nova espécie, a ser designada como P. cacaoensis.
Palavras-chave: Maracujazeiro, Passiflora silvestre, caracterização morfológica, palinologia,
cpDNA,
28
Introdução
O gênero Passiflora comporta as espécies popularmente conhecidas por
maracujazeiros. Este é o gênero de maior importância da família Passifloraceae, constituído
por cerca de 520 espécies (Cervi 2005), destas cerca de 200 são nativas do Brasil, encontradas
principalmente na região Centro-Norte do país (Ulmer e Macdougal 2004). Sendo que boa
parte destas possui usos tanto alimentícios (Meletti et al. 2005) e medicinais (Barbosa et al.
2008), quanto ornamentais (Abreu et al. 2008).
O maracujazeiro mais cultivado apresenta duas formas botânicas, uma forma que
produz frutos de cor roxa, denominada P. edulis Sims f. edulis e outra que produz frutos de
cor amarelada, denominada P. edulis f. Sims flavicarpa O. Deg., e há ainda algumas
cultivares com frutos de coloração intermediária entre estas duas formas (Bernaci et al. 2008).
No Brasil, P. edulis f. flavicarpa ocupa 97% dos pomares com maracujazeiros, e constitui-se
na principal variedade consumida no país (AGRIANUAL 2008). Já P. edulis f. edulis é muito
valorizado para exportação, por atender as exigências do mercado internacional (Meletti et al.
2005), existindo extensos pomares dessa fruta em países como Estados Unidos, Austrália e
África do Sul (Meletti e Brückner 2001).
Por ser um gênero tão amplo, algumas espécies apresentam problemas quanto à sua
taxonomia. A maioria dos estudos taxonômicos em Passiflora baseia-se na caracterização
morfológica da planta, levando à classificação até o táxon espécie, além de forma ou
variedade. No entanto, espécies muito semelhantes apresentam diferenças morfológicas
difíceis de serem observadas e caracterizadas, sendo necessária a adoção de análises genéticas
para uma melhor delimitação entre os grupos (Bellon et al. 2007; Hansen et al. 2006; Lorenz-
Lemke et al. 2005).
O DNA cloroplastidial (cpDNA) é usado especialmente para estudos taxonômicos e
filogenéticos devido à sua alta conservação, seu padrão de herança e sua baixa taxa de
mutação (Palmer 1987). Nas análises filogenéticas, dentre as regiões do DNA cloroplastidial
mais utilizadas estão os genes que transcrevem para os tRNA da tirosina (trnT), da leucina
(trnL) e da fenilalanina (trnF). Recentemente a filogenia do gênero foi reconstruída baseada
em sequências trnT-L-F e do íntron do trnL (Pádua 2004), as 64 espécies utilizadas na análise
puderam ser divididas em quatro grandes clados, a saber, Decaloba, Deidamioides, Astrophea
e Passiflora correspondendo aos quatro subgêneros propostos por MacDougal e Feuillet
(2004).
29
A divergência entre indivíduos, avaliada por descritores morfológicos, pode
proporcionar uma descrição sintética da afinidade genética entre acessos e populações (Dias
et al. 1997). Para se fazer uma análise do poder discriminatório dos descritores, torna-se
necessário analisar a contribuição dos mesmos de forma conjunta, isso é possível com o uso
de análises multivariadas (Cruz et al. 2004).
Em fragmentos de Mata Atlântica do sul da Bahia há grande incidência de espécies de
Passiflora L., já tendo sido registrada a ocorrência de mais de 30 delas, e muitas são
consideradas nativas (Nunes 2002; Souza et al. 2005). Algumas dessas passifloras silvestres
apresentam características ornamentais (Abreu et al. 2008), outras apresentam genes de
resistência às principais doenças do maracujazeiro cultivado (Junqueira et al. 2006).
Entretanto, as altas taxas de desmatamento a que têm sido sujeitas as regiões tropicais
transformaram fortemente a paisagem, com a redução das florestas a fragmentos de tamanho e
qualidade diversos (Whitmore 1997).
Em recente viagem de coleta por cidades do sul da Bahia, Souza et al. (2005),
encontraram uma espécie silvestre (Passiflora sp.) muito semelhante morfologicamente á P.
edulis f. edulis, porém com flores e frutos bem menores. De acordo com levantamentos
bibliográficos, P. iodocarpa Barb. Rodr. foi descrita com as características dessa Passiflora
sp., porém em outros trabalhos, P. iodocarpa tem sido considerada uma sinonímia de P.
edulis f. edulis devido, principalmente, a escassos relatos de coleta e de material herborizado
para realização de estudos taxonômicos (Sousa e Meletti 1997).
Como ocorre com outras passifloráceas, há a necessidade da realização de maiores
estudos para delimitação entre P. edulis e Passiflora sp., utilizando-se metodologias que
gerem conhecimentos do genoma de ambas, para que, desta forma, seja possível caracterizar o
grau de similaridade genética entre estas duas espécies, tão semelhantes morfologicamente.
Assim sendo, este trabalho objetivou caracterizar o grau de relacionamento entre P. edulis e
Passiflora sp. com base em descritores morfológicos, polínicos, em estudos reprodutivos e em
sequência do íntron do trnL.
30
Material e Métodos
Material vegetal
Foram utilizados cinco acessos de P. edulis Sims f. edulis (Fig. 1a-b), obtidos a partir de
sementes doadas pelo IAC (Instituto Agronômico de Campinas), UENF (Universidade
Estadual do Norte Fluminense) e Embrapa Cerrados (Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária). Foram utilizados cinco acessos de Passiflora sp. (Fig. 1c-d), obtidos de coleta
na Reserva Particular do Patrimônio Natural Serra Bonita, em Floresta Atlântica da cidade de
Camacan, Bahia, Brasil. Estes exemplares foram mantidos no Banco Ativo de Germoplasma
(BAG-Passifloras) localizado no campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC),
Ilhéus, Bahia, Brasil.
Fig 1 Flores de Passiflora. a – b P. edulis; c - d Passiflora sp.
a
b
c
d
31
Caracterização morfológica e polínica
A caracterização morfológica foi constituída por 11 descritores, envolvendo a folha, a flor e o
fruto (Crochemore et al. 2003; Meletti et al. 2005), e 11 descritores do pólen (Garcia et al.
2002; Milward-de-Azevedo et al. 2004). Os descritores vegetativos foram constituídos por
largura da folha trilobada (LFo), comprimento da folha trilobada (CFo), largura da folha
inteira (LFoI), comprimento da folha inteira (CFoI), diâmetro da flor (DFl), diâmetro
equatorial do fruto (DEFr), diâmetro longitudinal do fruto (DLFr) em mm; peso do fruto
(PFr) em g; área da folha trilobada (AFo) e área da folha inteira (AFoI) em cm2; e índice de
formato do fruto (IFr) obtido pela relação entre os dois diâmetros do fruto. As medidas de
largura, comprimento e diâmetro foram obtidas utilizando-se paquímetro digital. O peso do
fruto foi aferido em balança analítica e a área foliar foi obtida em medidor automático LI-
3100 (Li-Cor, Nebraska, USA). Para cada variável foram realizadas 25 repetições por espécie.
Os descritores do pólen foram constituídos por eixo polar (EP), eixo equatorial (EE),
largura do colpo (LC), largura do mesocolpo (LM), comprimento da vista polar (VP), largura
do apocolpo (LA), Muro (MU), Lúmen (LU), Malha (MA) em µm; índice de área polar (IAP)
e razão polar/equatorial (P/E). As medidas polínicas foram obtidas a partir das
fotomicrografias no microscópio eletrônico de varredura da Universidade Estadual de Feira de
Santana (UEFS). Para isto, os grãos de pólen foram fixados em FAA 1:1:1 (formol, álcool e
ácido acético), depositados sobre stubs, desidratados em câmara de vácuo, recobertos com
fina camada de ouro em pó e observados em microscópio eletrônico de varredura LEO 1430
VP. As terminologias adotadas de acordo com Barth e Melhem (1988) e Punt et al. (1994).
Foram aferidas 30 medidas de cada variável polínica por espécie. Na análise morfológica e
polínica, P. rubra foi adicionada como material de comparação.
Caracterização reprodutiva
Foram realizadas polinizações controladas em 12 horários (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17 e 18 h) para cada acesso de Passifora sp., e sete horários (12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18 h)
para cada acesso de P. edulis á partir do momento de abertura floral. Para cada horário de
polinização foram realizadas quatro repetições. A transferência de pólen para o estigma foi
realizada com auxílio de pinça, esfregando-se gentilmente a antera sobre o estigma de cada
flor protegida anteriormente com saco de papel. As flores foram etiquetadas e novamente
32
protegidas para garantir a ausência de contaminação de pólen. As autopolinizações foram
realizadas em 12 horário de polinização para Passiflora sp., e sete horários de polinização
para P. edulis. Neste caso a antera de uma flor foi coletada e usada como doadora de pólen
para a mesma flor da planta. Na hibridação interespecífica, tendo Passiflora sp. como genitor
feminino e P. edulis como genitor masculino, a antera da flor de P. edulis foi coletada á partir
do momento da abertura floral e usada como doadora de pólen para Passiflora sp. Cinco dias
após a polinização, foi verificada a taxa de pegamento/fertilização, sendo considerada
fertilizada a flor com fruto em início de desenvolvimento. Posteriormente, os frutos foram
cobertos com uma rede de náilon para proteção contra queda no amadurecimento (Bukner e
Otoni 1999). Dez flores de cada espécie foram utilizadas para a contagem do número de grãos
de pólen por antera e número de óvulos por ovário, e calculada a razão pólen/óvulo (P:O)
(Cruden 1977).
Sequenciamento do íntron do trnL
Extração de DNA - Folhas foram coletadas em bulk de 5 genótipos de Passiflora sp. A
extração do DNA total foi efetuada conforme descrito por Doyle e Doyle (1990), com
modificações sugeridas por Viana et al. (2003). Para a determinação da qualidade e da
concentração do DNA, utilizou-se gel de agarose 0,8% e padrão quantificador de
concentração de DNA. Após a quantificação, o DNA foi diluído para a concentração de 10
ng/µl e estocado em freezer a -20º C.
Amplificação das sequências do íntron do trnL - Amostras de DNA de Passiflora sp. foram
amplificadas pela técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) em termociclador Gene Amp
PCR System 9700 da PerkinElmer. Cada amostra a ser amplificada foi constituída por 3 μL
de DNA (10 ng/μL) e 22 μL de uma mistura composta por 2,5 μL de Tampão (10X), 2,5 μL
de dNTP (2,5 mM), 2,5 μL de MgCl2 (25 mM), 2,25 μL de Primer F (10 μm), 2,25 μL de
Primer R (10 μm), 0,2 μL de Taq polimerase (5 u) e H2O Mili-Q autoclavada. Utilizou-se o
íntron trnL, pela combinação dos primers trnL-c e d (Taberlet et al. 1991). A amplificação dos
fragmentos seguiu as recomendações de Taberlet et al. (1991) e Gielly e Taberlet (1994), com
pequenas modificações no tempo e na temperatura. Para a amplificação dos fragmentos, as
amostras foram submetidas a um passo inicial de desnaturação a 94° C por dois minutos
seguido por 35 ciclos de amplificação, após os quais realizou-se um passo de extensão final
33
com cinco minutos a 72° C. Os passos dos 35 ciclos foram realizados com a desnaturação a
94° C por um minuto, pelo anelamento com a temperatura de 52,3° C por um minuto e por
fim, o alongamento ou extensão a 72° C por dois minutos.
Finalizada as amplificações, seus produtos foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1,0%, corados com brometo de etídio (25 μg/μL) para confirmar a presença dos
modelos esperados. O tamanho dos fragmentos amplificados foi identificado por meio de
comparações com padrões conhecidos em número de pares de bases de marcador de peso
molecular de 1kb. Os resultados obtidos foram observados nos géis sob luz ultravioleta e
fotografados em fotodocumentador Image Quant 250 (GE HealthCare). A purificação do
produto PCR foi realizada por via enzimática, sendo utilizado nessa fase as enzimas
exonuclease (EXO1) e fosfatase alcalina SAP (Shrip Alkaline Phosphatase). A primeira
degrada o excesso de primer fita simples e a segunda degrada os nucleotídeos não
incorporados. Para purificação de 12 μL de produto PCR foram utilizados 0,66 μL de
exonuclease, 0,66 μL de fosfatase alcalina e 0,68 μL de H2O Mili-Q autoclavada. As amostras
foram incubadas no termociclador por 30 minutos a 37° C e 15 minutos a 80° C, essa última
temperatura visou à inativação das enzimas.
Seqüenciamento dos fragmentos - Os produtos de PCR purificados foram seqüenciados
utilizando o kit de seqüenciamento “DYEnamicTM ET Terminator Sequencing Premix”
(MegaBaceTM) (Amersham Pharmacia Biotech. Inc). Foram realizadas seis repetições de
cada amostra. Nas reações, cada primer (sentido F e R) foi adicionado separadamente. As
reações seguiram as recomendações do fabricante: 2 μL de DNA purificado, 0,5 μL de
primer, 4 μL de Mix (integrante do kit) e 3,5 μL de H2O Mili-Q autoclavada. No
termociclador a reação passou por 40 ciclos de amplificação, apresentando três ciclos, o
primeiro com uma temperatura de 95° C por 10 segundos, um segundo com 52,3° C por 15
segundos e o terceiro com 60° C por 80 segundos. As temperaturas utilizadas para os primers
nessa reação foram as mesmas da reação de amplificação. Posteriormente, os produtos
provenientes dessa amplificação foram direcionados ao seqüenciador MegaBace DNA
Analysis System 1000 (Amersham & Life Science) para análise.
Análises das sequências - Após a obtenção das seqüências do intron do trnL de Passiflora sp.,
procedeu-se à busca no banco de dados GenBank do National Center for Biotechnology
Information (NCBI), para obtenção da sequência do íntron do trnL de outras espécies de
34
Passiflora. Foi encontrada sequência do íntron do trnL para: P. edulis, P. alata, P. cincinnata,
P. foetida, P. palmeri, P. incarnata e P. sprucei do subgênero Passiflora e P. coriacea e P.
xiikzodz do subgênero Decaloba, o número de acesso no GenBank das espécies citadas acima
está apresentado na Tabela 1. A seqüência do íntron do trnL de Passiflora sp. foi alinhada
com as seqüências do íntron do trnL das espécies citadas acima. Para o qual foi usado o
programa ClustalW implementado no programa BioEdit (Hall 1999). A seqüência consenso
de Passiflora sp. foi resultado da análise de seis sequências, sendo três oriundas do primer
foward e três do reverse. A espécie Clusia major foi adicionada como material de comparação
externa à família Passifloraceae.
A matriz de distância foi obtida no programa MEGA (Molecular Evolutionary
Genetics Analysis), versão 4.0.2 (Tamura 2007). Em seqüência, construiu-se uma árvore
utilizando o agrupamento de vizinhos (NJ – neighbor-joing) (Saitou e Nei 1987), baseado no
modelo de Jukes-Cantor (JC) (Jukes e Cantor, 1969), e então procedeu-se à análise
filogenética, feita pelo método da máxima verossimilhança (Felsenstein 1981) utilizando-se o
programam BioEdit (Hall 1999).
Análise estatística - Os dados dos descritores morfológicos, reprodutivos e polínicos foram
submetidos à análise de variância, e os que apresentaram diferença significativa foram
submetidos ao teste de médias Scott e Knott. Para a análise multivariada, distâncias de
Mahalanobis foram calculadas sobre as variáveis, as quais permitiram a construção de um
dendrograma pelo algoritmo de classificação hierárquica ascendente UPGMA (Unweighted
Pair Grouped Method Average). A confiabilidade da matriz cofenética foi calculada pelo rcof
coeficiente de correlação cofenética. As análises foram realizadas nos softwares Genes 2007.0
e R 2008.0.
Resultados
Caracterização morfológica e polínica
Os valores médios dos descritores morfológicos são apresentados na Tabela 2. Passiflora
edulis apresentou valores médios superiores à Passiflora sp. para todas as variáveis, exceto
para CFoS. Houve diferença significativa entre as duas espécies pelo teste F (P<0,05) para a
35
maioria das variáveis, exceto para CFo, LFoS e IFr (Tabela 3). O PFr foi a característica que
apresentou maior diferença entre as duas espécies, com peso médio de 184,8 e 8,7 g em P.
edulis e Passiflora sp., respectivamente (Fig. 2).
Tabela 1 Lista de espécies de Passiflora que foram utilizadas para análise da seqüência do
íntron do trnL e seus respectivos números de acesso no GenBank
Espécie N° de acesso no GenBank Referência
Passiflora sp. -- presente trabalho
P. edulis AF454783 Ossowski e Hunter
P. xiikzodz DQ238790 Muschner et al. 2006
P. alata AF454778 Ossowski e Hunter
P. coriacea DQ238789 Muschner et al. 2006
P. cincinnata DQ238792 Muschner et al. 2006
P. foetida DQ238796 Muschner et al. 2006
P. incarnata DQ238793 Muschner et al. 2006
P. palmeri DQ123056 Muschner et al. 2006
P. sprucei DQ123096 Muschner et al. 2006
Clusia major AY144060 Hale et al. 2004
Fig 2 Comparação entre as médias dos descritores morfológicos de P. edulis e Passiflora sp. Médias com a
mesma letra no mesmo descritor não diferem estatisticamente, pelo teste de Scott e Knott, a 5% de probabilidade
LFo= largura da folha trilobada, DFo= comprimento da folha trilobada, AFo= área da folha trilobada, LFoI=
largura da folha inteira, CFoI= comprimento da folha inteira, AFoI= área da folha inteira, DFl= diâmetro da flor,
DEFr= diâmetro equatorial do fruto, DLFr= diâmetro longitudinal do fruto, IFr= índice de formato do fruto,
PFr= peso do fruto
I I I
36
Em relação à contribuição relativa de cada característica para a diversidade genética
entre as espécies, com base no critério proposto por Singh (1981), verificou-se que, para os 11
descritores morfológicos mensurados, os que mais contribuíram para a diversidade foram PFr
com 67,9%, seguido pelo DEFr com 16,3%, e DFl com 11,7%.
As médias dos descritores polínicos são apresentadas na Tabela 4. Em relação a estes
descritores, as duas espécies foram um pouco mais similares. Houve diferença estatística pelo
teste F (P<0,05) em quatro das 11 variáveis, a saber, LC, P/E, LU e MA (Tabela 5). Entre as
outras variáveis, a diferença observada entre as espécies foi bem menor, se compararmos com
a diferença observada entre as variáveis morfológicas. Ainda assim, os valores observados em
P. edulis foram superiores para a maioria das características. Apenas para LA e IAP,
Passiflora sp. foi superior à P. edulis (Fig. 3).
As duas espécies apresentaram grãos de pólen com os mesmos padrões quanto ao
tamanho, formato e número de colpos. As principais diferenças foram observadas nas
ornamentações. Os grãos de pólen das duas espécies foram classificados como grande, com
valor médio de 55,1 µm, formato subesferoidal (oblato esferoidal), isopolares, com área polar
pequena, média de 22,2 µm, sincolpados, exina reticulada. Os três pares de colpos encontram-
se nos pólos, permanecendo unidos pelas extremidades, formando um anel ao redor do
mesocolpo (Fig. 4, setas).
Fig 3 Comparação entre as médias dos descritores polínicos de P. edulis e Passiflora sp. Médias com a mesma
letra no mesmo descritor não diferem estatisticamente, pelo teste de Scott e Knott, a 5% de probabilidade
EP= eixo polar, EE= eixo equatorial, LC= largura do colpo, LM= largura do mesocolpo, VP= comprimento da
vista polar, LA= largura do apocolpo, MU= Muro, LU= Lúmen, MA= Malha, IAP= índice de área polar, P/E=
razão polar/equatorial
37
Tabela 2 Médias e desvio padrão dos descritores morfológicos de P. edulis e Passiflora sp.
Espécies LFo CFo AFo LFoI CFoI AFoI DFl DEFr DLFr IFr PFr
(mm) (mm) (cm2) (mm) (mm) (cm
2) (mm) (mm) (mm) (g)
P. edulis 127,3 ± 10 a 141,1 ± 11 a 105,5 ± 18 a 72,3 ± 6 a 107,9 ± 13 b 77,5 ± 16 a 70,7 ± 2 a 69,7 ± 4 a 88,0 ± 3 a 1,3 ± 0 a 184,8 ± 11 a
Passiflora sp 108,9 ± 17 b 135,8 ± 16 a 83,8 ± 17 b 69,5 ± 8 a 128,7 ± 8 a 59,6 ± 16 b 36,0 ± 3 b 35,3 ± 1 b 44,9 ± 1 b 1,3 ± 0 a 8,7 ± 2 b
Médias com a mesma letra na mesma coluna não diferem estatisticamente, pelo teste de Scott e Knott, a 5% de probabilidade.
LFo= largura da folha trilobada, DFo= comprimento da folha trilobada, AFo= área da folha trilobada, LFoI= largura da folha inteira, CFoI= comprimento da folha inteira,
AFoI= área da folha inteira, DFl= diâmetro da flor, DEFr= diâmetro equatorial do fruto, DLFr= diâmetro longitudinal do fruto, IFr= índice de formato do fruto, PFr= peso do
fruto
Tabela 3 Resumo da ANOVA nos descritores morfológicos entre P. edulis e Passiflora sp.
Fonte de variação GL Quadrado Médio
LFo CFo AFo LFoI CFoI AFoI DFl DEFr DLFr IFr PFr
Espécies 9 1051,2* 592,9NS
1420,4* 23,1NS
684,0* 1301,5* 1682,2* 1660,1* 2587,7* 0,0NS
43226,5*
Resíduo 40 121,6 113,2 216,5 60,1 130,5 136,1 10,0 11,8 7,2 0,0 47,2
Média 118,1 138,5 94,6 70,9 118,2 68,5 53,4 52,5 66,5 1,3 96,8
CV 9,3 7,6 15,0 10,0 9,6 17,2 5,9 6,5 4,0 6,6 7,1
*Significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. NS
Não Significativo a 5% de probabilidade pelo teste F
LFo= largura da folha trilobada, DFo= comprimento da folha trilobada, AFo= área da folha trilobada, LFoI= largura da folha inteira, CFoI= comprimento da folha inteira,
AFoI= área da folha inteira, DFl= diâmetro da flor, DEFr= diâmetro equatorial do fruto, DLFr= diâmetro longitudinal do fruto, IFr= índice de formato do fruto, PFr= peso do
fruto
38
Tabela 4 Médias e desvio padrão dos descritores polínicos de P. edulis e Passiflora sp.
Espécies EP EE LC LM VP LA IAP P/E MU LU MA
(µm) (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) (µm)
P. edulis 52,8 ± 2 a 56,6 ± 2 a 18,4 ± 3 a 33,5 ± 4 a 56,9 ± 2 a 21,3 ± 2 b 0,4 ± 0 b 0,9 ± 0 a 1,3 ± 0 a 9,4 ± 1 a 13,4 ± 3 a
Passiflora sp. 50,6 ± 3 b 55,0 ± 2 b 16,4 ± 4 a 31,1 ± 3 b 54,4 ± 2 b 23,3 ± 4 a 0,5 ± 0 a 0,9 ± 0 a 1,1 ± 0 b 9,6 ± 1 a 12,1 ± 1 a Médias com a mesma letra na mesma coluna não diferem estatisticamente, pelo teste de Scott e Knott, a 5% de probabilidade.
EP= eixo polar, EE= eixo equatorial, LC= largura do colpo, LM= largura do mesocolpo, VP= comprimento da vista polar, LA= largura do apocolpo, MU= Muro, LU=
Lúmen, MA= Malha, IAP= índice de área polar, P/E= razão polar/equatorial
Tabela 5 Resumo da ANOVA nos descritores polínicos entre P. edulis e Passiflora sp.
Fonte de variação GL Quadrado Médio
EP EE LC LM VP LA IAP P/E MU LU MA
Espécies 5 37,1* 23,7* 17,9NS
44,1* 41,4* 83,4* 0,0* 0,0NS
0,1* 5,5NS
24,7NS
Resíduo 54 5,1 4,1 15,9 10,0 4,3 5,4 0,0 0,0 0,0 1,2 4,7
Média 51,7 55,8 17,4 32,3 55,7 22,2 0,4 0,9 1,2 9,5 12,7
CV 4,3 3,6 22,9 9,1 3,7 10,4 8,7 3,4 13 11,6 17,1 *Significativo a 5% de probabilidade pelo teste F.
NS Não Significativo a 5% de probabilidade pelo teste F
EP= eixo polar, EE= eixo equatorial, LC= largura do colpo, LM= largura do mesocolpo, VP= comprimento da vista polar, LA= largura do apocolpo, MU= Muro, LU=
Lúmen, MA= Malha, IAP= índice de área polar, P/E= razão polar/equatorial
39
Fig 4 Morfologia polínica observada em microscópio eletrônico de varredura: A – D Passiflora edulis A pólen
em vista polar (Barra = 10 µm); B detalhe das ornamentações (Barra = 3 µm); C pólen em vista equatorial (Barra
= 10 µm); D detalhe das ornamentações (Barra = 2 µm); E - H Passiflora sp. E pólen em vista polar (Barra = 10
µm); F detalhe das ornamentações (Barra = 3 µm); G pólen em vista equatorial (Barra = 10 mm); H detalhe das
ornamentações (Barra = 2 µm). Setas indicam pares de colpos unidos nos pólos
A B
F E
G H
C D
40
Os seis mesocolpos observados são mais largos entre os colpos de um mesmo par do
que entre pares de colpos adjacentes. Em P. edulis os muros são lisos e sinuosos, o lúmen
apresenta alguns báculos, a malha é mais delgada na direção das linhas e entre dois pares de
colpos são encontradas duas malhas alinhadas paralelamente. Já em Passiflora sp., os muros
são enrugados e apresentam numerosos pilos. Nesta espécie, o lúmen dos retículos e dos
colpos apresenta grande quantidade de báculos, e entre dois pares de colpos observa-se apenas
uma malha.
Inicialmente, foram obtidos dendrogramas separados, baseados apenas nos descritores
morfológicos e nos descritores polínicos, separadamente. No entanto, os descritores polínicos
sozinhos não foram eficazes em separar corretamente os acessos de cada espécie. Apesar de
ter ocorrido a formação de três grupos no dendrograma a partir desses dados, sendo que o
primeiro correspondeu aos acessos de P. edulis, o segundo correspondeu aos acessos de
Passiflora sp. e o terceiro correspondente a P. rubra, utilizada como grupo externo, foi
observado um acesso de Passiflora sp. localizado no grupo de P. edulis.
Já na análise de agrupamento com os descritores morfológicos e polínicos juntos, foi
observado, no dendrograma, a formação de três grupos bem delineados (Fig. 5), sendo o
primeiro, segundo e terceiro grupos correspondetes aos acessos de P. edulis, Passiflora sp. e
P. rubra, respectivamente. Além de ser eficaz em separar corretamente os acessos de cada
espécie, este agrupamento ainda apresentou um elevado coeficiente de correlação cofenética
(rcof = 0,97), o que conferiu confiabilidade no agrupamento.
P r
ub
ra
P s
p 4
P s
p 3
P s
p 5
P s
p 1
P s
p 2
P e
d 4
P e
d 2
P e
d 5
P e
d 1
P e
d 30
e+
00
2e
+0
94
e+
09
6e
+0
98
e+
09
Cluster Dendrogram
hclust (*, "average")
dados2
He
igh
t
Fig 5 Dendrograma de P. edulis e Passiflora sp., classificado segundo distância de Mahalanobs pelo método de
agrupamento UPGMA, baseado nos descritores morfológicos e polínicos. P. rubra foi adicionada como grupo
externo para comparação
P sp 1, P sp 2, P sp 3, P sp 4 e P sp 5= Passiflora sp. P ed 1, P ed 2, P ed 3, P ed 4 e P ed 5= P. edulis
41
Caracterização reprodutiva
Após as autopolinizações, P. edulis apresentou 18,1% de flores fertilizadas, enquanto
que em Passiflora sp. nenhuma flor foi fertilizada em todos os horários de autopolinizações.
Quanto à capacidade reprodutiva entre as duas espécies, avaliada por meio de hibridações, foi
observado uma taxa de 51,1% de fertilização nos cruzamentos (Tabela 6). P. edulis
apresentou, em média, 56.194,0 grãos de pólen por antera e 284 óvulos por ovário, já
Passiflora sp. apresentou, em média, 10.714,0 grãos de pólen por antera e 113 óvulos por
ovário. A razão P:O foi de 197,8 e 94,7 para P. edulis e Passiflora sp., respectivamente, o que
as incluiu na categoria de autógamas facultativas.
Tabela 6 Médias (%) das autopolinizações e polinizações cruzadas entre P. edulis e
Passiflora sp.
Horário de
polinização
Autopolinização P. edulis Autolinização
Passiflora sp.
Passiflora sp. ♀ x P. edulis ♂
P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 M P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 M
7 horas .. .. .. .. .. .. 0,0 .. .. .. .. .. ..
8 horas .. .. .. .. .. .. 0,0 .. .. .. .. .. ..
9 horas .. .. .. .. .. .. 0,0 .. .. .. .. .. ..
10 horas .. .. .. .. .. .. 0,0 .. .. .. .. .. ..
11 horas .. .. .. .. .. .. 0,0 .. .. .. .. .. ..
12 horas 25,0 24,1 20,0 21,0 32,5 24,5 0,0 62,5 63,8 51,0 53,6 65,7 59,3
13 horas 22,3 22,7 17,8 18,7 29,0 22,1 0,0 58,6 59,8 47,8 50,2 61,6 55,6
14 horas 17,9 18,3 14,3 15,0 23,3 17,7 0,0 50,5 51,5 47,3 49,7 53,1 50,4
15 horas 19,2 17,3 15,4 16,1 25,0 18,6 0,0 55,3 56,4 45,1 47,4 61,3 53,1
16 horas 15,1 15,4 12,1 12,7 19,6 14,9 0,0 45,7 46,6 37,3 39,2 48,0 43,3
17 horas 17,3 17,6 13,8 14,5 22,5 17,1 0,0 47,8 48,8 43,7 45,9 63,7 49,9
19 horas 10,1 13,2 8,1 12,5 13,1 11,4 0,0 37,5 47,3 45,2 47,5 50,2 45,5
M, médias.
Sequenciamento do íntron do trnL
Os primers universais descritos por Taberlet et al. (1991) foram capazes de amplificar
os fragmentos de tamanho esperado em Passiflora sp. (Fig. 6). Nesta espécie, o íntron do trnL
apresentou um comprimento total de 502 pares de base (pb). Já em P. edulis, este íntron
apresentou 605 pb. A partir do alinhamento das seqüências das espécies Passiflora sp., P.
edulis, P. alata, P. cincinnata, P. foetida, P. palmeri, P. incarnata, P. sprucei, P. coriacea e
P. xiikzodz, foram detectados 32 (4,8%) sítios parcimoniosamente informativos, 494 (73,6%)
42
conservados, 128 (19,0%) variáveis e 93 (13,8%) singletons, isto é, sítios em que existem
somente dois nucleotídeos diferentes. Convém ressaltar que as porcentagens de regiões
singletons e a de parcimoniosamente informativas estão incluídas na classe de sítios variáveis,
de forma que a soma das porcentagens não resulta em 100%.
A composição de nucletídeos GC entre Passiflora sp. e P. edulis foi muito próximo,
sendo observado 30,2% de GC na primeira e 31,9% na segunda espécie, os valores totais do
conteúdo de nucleotídeos das espécies estudadas são apresentados na Tabela 7. A distância
encontrada entre Passiflora sp. e P. edulis foi 0,028. A análise completa das distâncias entre
as espécies encontra-se na Tabela 8.
Fig 6 Análise da qualidade dos produtos PCR de Passiflora sp. amplificados com o primer trnL em gel de
agarose 1%
No agrupamento feito com base na distância genética de Jukes Cantor, pelo método de
neighbor-joining a partir da seqüência do íntron do trnL (Fig. 7), foi observado que P.
coriacea e P. xiikzodz, pertencentes ao subgênero Decaloba, localizaram-se numa posição
mais basal em relação as outras espécies pertencentes ao subgênero Passiflora. Entre as
espécies deste último subgênero, Passiflora sp. foi localizada numa posição mais basal e mais
distante de P. edulis do que as outras espécies deste subgênero.
43
Tabela 7 Composição nucleotídica do íntron do trnL das espécies estudadas. Exceto o total,
os valores estão representados em porcentagem
Espécie T (%) C (%) A (%) G (%) Total
Passiflora edulis 27,9 15,2 40,2 16,7 605
Passiflora sp. 29,1 14,5 40,6 15,7 502
Passiflora alata 28,2 16,0 39,7 16,0 624
Passiflora cincinnata 28,3 15,9 40,4 15,4 559
Passiflora coriacea 31,1 14,9 38,5 15,5 556
Passiflora foetida 28,0 16,0 40,6 15,4 557
Passiflora incarnata 28,1 15,9 40,1 15,8 558
Passiflora palmeri 28,3 15,6 41,4 14,6 526
Passiflora sprucei 28,5 15,2 41,1 15,2 526
Passiflora xiikzodz 30,5 15,5 38,4 15,5 547
Clusia major 29,1 12,1 43,8 15,0 580
Tabela 8 Matriz das distâncias entre as espécies estudadas e os materiais de comparação
utilizando a seqüência do íntron do trnL
1 Passiflora sp.; 2 Passiflora edulis; 3 Passiflora alata; 4 Passiflora cincinnata; 5 Passiflora coriacea; 6
Passiflora foetida; 7 Passiflora incarnata; 8 Passiflora palmeri; 9 Passiflora sprucei; 10 Passiflora xiikzodz; 11
Clusia major
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1
2 0,028
3 0,059 0,076
4 0,002 0,030 0,061
5 0,071 0,083 0,025 0,073
6 0,005 0,032 0,059 0,007 0,071
7 0,007 0,035 0,066 0,009 0,078 0,011
8 0,002 0,030 0,061 0,005 0,073 0,007 0,009
9 0,007 0,035 0,066 0,009 0,078 0,011 0,000 0,009
10 0,007 0,030 0,066 0,009 0,078 0,011 0,014 0,009 0,014
11 0,212 0,221 0,218 0,212 0,227 0,206 0,221 0,215 0,221 0,215
44
Fig 7 Cladograma representando o relacionamento filogenético entre espécies de Passiflora, utilizando a
seqüência do íntron do trnL
Discussão
Os maiores valores médios apresentados por P. edulis, para a maioria das variáveis
morfológicas, pode ser explicado pelo seu maior porte em relação à Passiflora sp. Entretanto,
observou-se que em P. edulis as características foliares foram pouco divergentes, não havendo
diferença estatística significativa para as características CFo e a LFoS. Resultados
semelhantes a estes foram observados por Meletti et al. (2005), que analisaram
fenotipicamente três seleções do maracujazeiro roxo e não foi observada diferença estatística
entre os acessos para o comprimento da lâmina foliar. Na caracterização de 11 espécies,
incluindo 8 acessos de P. edulis f. edulis e 34 acessos de P. edulis f. flavicarpa, Crochemore
et al. (2003) também verificaram que descritores foliares, como comprimento do lóbulo da
folha e largura total da folha, foram pouco discriminantes entre os acessos do maracujazeiro
roxo e amarelo, sendo excluídos dos próximos passos da análise, com o objetivo de se obter
uma discriminação eficiente entre os acessos das duas formas botânicas de P. edulis.
Os dois tipos de folhas observadas em P. edulis e Passiflora sp., inteiras e trilobadas,
foram analisadas separadamente, uma vez que a folha inteira não é apenas um estágio
transitório na formação da folha trilobada, e sim um formato diferenciado apresentado pelas
duas espécies, caracterizando o dimorfismo foliar, característico de algumas espécies de
45
Passiflora (Deginani 2001). O dimorfismo foliar é uma estratégia de adaptação das espécies
trepadeiras á ocupação de diferentes ambientes, com diferentes condições de luminosidade e
umidade, por uma mesma planta (Givnish e Vermeij 1976; Lee e Richards 1991).
Os dados encontrados para peso e tamanho dos frutos de P. edulis foram bastante
semelhantes aos obtidos por Meletti et al. (2005) para os acessos „Paulista‟ e „Maracujá-
Maçã‟, que também apresentaram frutos pesados, grandes, ovais e de casca roxa. O alto poder
de discriminação apresentado pelos descritores dos frutos neste trabalho corroboram com os
resultados encontrados por Crochemore et al. (2003), que detectaram quatro descritores
altamente discriminantes entre 22 descritores morfológicos, sendo dois destes referentes ao
fruto.
As médias observadas nas medidas polínicas em P. edulis, referentes aos diâmetros
equatorial e polar, colpo e mesocolpo, estão de acordo com o observado por Araújo et al.
(2004) e Garcia et al. (2002), que estudaram espécies de ocorrência natural da Chapada
Diamantina no estado da Bahia e Argentina respectivamente. As características dos grãos de
pólen em Passiflora apresentaram um padrão de tamanho e ornamentações inerentes a cada
subgênero, sendo eficientes para estudos taxonômicos em nível subgenérico (Araújo et al.
2004; Arreguin-Sanchez et al. 1992; Milward-de-Azevedo et al. 2004; Spirlet 1965).
Arreguin-Sanchez et al. (1992), trabalhando com quatro espécies da família
Passifloraceae e cinco da família Labiatae, conseguiram a classificação até o nível específico.
Também Milward-de-Azevedo et al. (2004) analisando oito espécies do subgênero Decaloba,
conseguiram separar cada espécie. Estes autores ainda propuseram uma chave para a
identificação das espécies estudadas com base em dados polínicos. Entretanto, no presente
estudo, em nível específico, os caracteres polínicos mostraram-se ineficientes em separar
corretamente os acessos de cada espécie na análise de agrupamento. Tal fato pode ser
decorrente dos descritores quantitativos usados, que não computaram características
qualitativas específicas das ornamentações, como presença de báculos e pilos, conformação
do muro, entre outras, que poderiam ser úteis na discriminação dos acessos de cada espécie. A
ineficiência na separação dos acessos de cada espécie pode ser ainda devido a grande
semelhança nos grãos de pólen das duas espécies, o que segundo Araújo et al. (2004) dificulta
muito a separação de espécies proximamente relacionadas.
Baseado na classificação polínica, segundo a terminologia proposta por Barth e
Melhem (1988), Passiflora sp. pertence ao subgênero Passiflora proposto por MacDougal e
Feuillet (2004). De acordo com a classificação de Spirlet (1965), os grãos de pólen de
46
Passiflora sp. e P. edulis são do mesmo tipo. Segundo Araújo et al. (2004), os grãos de pólen
de Passiflora sp., assim como os de P. edulis, são do tipo 1, com pontopérculos trirradiados e
exina reticula. As áreas intercolpais como opérculos, pontopérculos e pseudopérculos são
muito utilizadas nas descrições palinológicas das espécies de Passifloraceae. De acordo com
Erdtman (1943), o termo opérculo seria apropriado apenas em raras ocasiões, representado
por algumas áreas mais ou menos espessadas e separadas na membrana apertural. Já
Thanikaimoni (1968), definiu opérculo como um espessamento da exina que cobre parte da
abertura podendo ser de várias formas: circulares, anulares, elípticos e pontoperculares. Assim
neste trabalho adotou-se o termo pontopérculo, conforme indicado por Thanikaimoni (1968) e
Punt et al. (1994). Pontopérculo é então definido como uma faixa da exina fusionada nas áreas
apocolpais, ou seja, a área (equatorial) mais estreita entre duas aberturas fundidas ás áreas
polares (Araújo et al. 2004).
Em estudo da morfologia polínica de 121 espécies do gênero Passiflora e duas do
gênero Dilkea, Liviston et al. (2005) aventam que a classificação taxonômica baseada nos
descritores polínicos apresenta maior concordância com a classificação subgenérica do gênero
Passiflora proposta por MacDougal e Feuillet (2004) do que a proposta por Killip (1938).
Estes autores descrevem ainda que, as variações dentro do gênero observadas para tamanho,
aberturas e tipos de ornamentações dos grãos de pólen apresentam uma relação com os
números cromossômicos básico, descrito para o gênero por Melo et al. (2001), em que as
espécies de um grupo com o mesmo número cromossômico básico, apresentaram padrões
polínicos em comum.
A avaliação por caracteres morfológicos e polínicos permitiu a discriminação dos
acessos pertencentes á P. edulis, em relação aos acessos de Passiflora sp. Utilizando-se de
descritores morfológicos, Crochemore et al. (2003) trabalharam com 11 espécies deste
gênero, incluindo as duas formas botânicas de P. edulis, e obteveram nítida separação entre as
espécies e também entre as duas formas botânicas de P. edulis. Resultado semelhante foi
obtido por Primot et al. (2005), que avaliaram a diversidade morfológica em P. tripartita var.
mollissima, P. tarminiana, P. mixta e seus híbridos, e também obteveram nítida separação
entre estas espécies e seus híbridos.
Nossos resultados mostraram que a análise conjunta dos dados morfológicos e
polínicos resultou em maior poder de discriminação entre os acessos. Uma vez que
aumentando-se a quantidade de descritores utilizados na caracterização de um indivíduo,
aumenta-se também a cobertura do genoma do mesmo, pois cada característica fenotípica
47
avaliada por um descritor representa a expressão de um ou mais genes daquele indivíduo mais
o ambiente. Portanto ao se utilizar diferentes tipos de variáveis, a obtenção de uma melhor
discriminação entre os acessos é mais confiável (Pereira 1989). Contudo, a quantidade de
descritores utilizada deve ter um limite ótimo, pois quando o número de descritores utilizados
torna-se elevado, é possível que muitos deles sejam redundantes ou altamente correlacionados
(Cruz e Carneiro 2003).
Nos cruzamentos interespecíficos entre Passiflora sp. e P. edulis foi observada taxa de
fertilização acima de 50%, resultante das hibridações interespecíficas, demonstrando
relacionamento genético próximo entre essas espécies. Segundo Junqueira et al. (2008), P.
edulis apresenta boa capacidade reprodutiva em hibridações entre espécies geneticamente
próximas. Esses autores destacam também a importância da produção de híbridos de P. edulis
para introgressão de genes de resistência a doenças ou que transcrevam para características
que possibilitem melhor adaptação da espécie ás condições climáticas.
A auto-incompatibilidade impossibilita uma planta de formar semente quando
fertilizada por seu próprio pólen (Schifino-Wittmann e Dall‟agnol 2002). Em nosso estudo foi
observado alta taxa de auto-incompatibilidade em P. edulis, já em Passiflora sp. a auto-
incompatibilidade foi completa, o que segundo Dornelas et al. (1995) é uma característica
comum em P. edulis e outras espécies.
No maracujazeiro, a auto-incompatibilidade é útil na produção de híbridos, tornando
importante a hibridação inter-específica. Em P. edulis Sims a auto-incompatibilidade, é
devido à existência de três grupos auto-incompatíveis, sendo a característica controlada por
um gene e três alelos, S1, S2 e S3, com uma relação de dominância completa (Bruckner
1995). Três novos alelos do gene S foram encontrados por Rego et al. (1999), indo de S1 a
S6. Rego et al. (1999) sugeriu a existência de um outro gene controlando a característica. Este
resultado foi comprovado pelos experimentos de Suassuna et al. (2003) que detectaram um
gene G, de ação gametofítica em associação ao gene S, de ação esporofítica, apontando que a
auto-incompatibilidade em P. edulis não é resultada da ação de um gene apenas, e sim de um
complexo gênico.
A sequência de nucleotídeos do íntron do trnL é bastante conservada entre as espécies
de Passiflora (Hansen et al. 2006), justificando o baixo conteúdo (4,8%) de sítios variáveis
com informação parcimoniosa. O conteúdo de GC observado na seqüência do íntron do trnL
em Passiflora sp. e P. edulis, 30,2 e 31,9% respectivamente, também foi verificado por
Hansen et al. (2006) que comparou a sequência do espaçador trnL-T entre 57 espécies de
48
Passiflora e observou uma média de 29% no conteúdo destes nucleotídeos, este baixo
conteúdo de GC na seqüência das regiões não codificadoras do gene trn é comum no gênero
Passiflora (Muschner et al. 2003). Por outro lado, no trabalho de Pádua (2004) o conteúdo de
GC nas sequências dos espaçadores trnT-L-F foi superior em P. edulis e nas outras espécies
do subgênero Passiflora em relação as espécies do subgênero Decaloba.
O modelo de Jukes-Cantor (Jukes e Cantor, 1969) foi escolhido por ser o que melhor
descreve a evolução da seqüência do íntron do trnL. Este é o modelo mais simples que existe,
assumindo igual freqüência de bases e taxas de substituição com freqüências iguais, além de
desconsiderar eventos de inserção e deleção (indel). Nas distâncias obtidas a partir do modelo
de JC, as divergências detectadas entre as espécies do subgênero Passiflora e Decaloba foram
maiores em comparação com as divergências entre as espécies dentro de cada subgênero.
Sendo que, na árvore de agrupamento as espécies do subgênero Decaloba localizaram-se
numa posição mais basal, em relação às espécies do subgênero Passiflora. O caráter mais
derivado das espécies do subgênero Passiflora baseado em seqüências não codificadoras do
gene trn, também foi detectado por Muschner et al. (2003) e Hansen et al. (2006).
Dentro do subgênero Passiflora, a espécie que apresentou maior divergência das
demais foi Passiflora sp., que localizou-se numa posição mais basal dentro deste grupo. Este
resultado confirma a diferença encontrada entre Passiflora sp. e P. edulis nas analises
baseadas nos dados morfológicos, e nos fornece um maior suporte na hipótese de que
Passiflora sp. e P. edulis são espécies distintas.
Analises baseadas na sequência de cpDNA vem sendo bastante empregado em estudos
de filogenia por causa de sua estabilidade estrutural, seu padrão de herança e sua taxa de
mutação (Palmer 1987). A filogenia molecular construída a partir do cpDNA tem fornecido
conhecimento mais refinado sobre as relações evolutivas entre as espécies do gênero
Passiflora (Hansen et al. 2006; Muschner et al. 2003; Sánchez et al., 1999; Yockteng e Nadot
2004). Esta ferramenta tem sido utilizada também, em reconstruções filogenéticas em
espécies de outras famílias, como o complexo integrifolia, que reúnem diversos taxa com
características florais muito semelhantes à espécie Petunia integrifolia, no qual Longo (2005)
utilizou as sequências dos espaçadores internos transcritos do DNA nuclear ribossomal (ITS1
e ITS2) e dois espaçadores intergênicos (trnS-trnG e psbA-trnH) do cpDNA, para delimitação
entre cinco espécies, e obteve a separação de um genótipo, que constituiu uma espécie distinta
das outras quatro, agrupadas como Petunia integrifolia. Também em Caesalpinia echinata,
onde ocorre um complexo de espécimes com variações morfológicas foliares, Junchum et al.
49
(2008) determinou á partir da seqüência do íntron do trnL, que este complexo sugere a
ocorrência de uma nova espécie. A partir de seqüências de cpDNA, filogenias de vários
outros gêneros foram reconstruídas recentemente, a exemplo de Cycas taitungensis (WU et
al., 2007), Cryptomeria japonica (Hirao et al. 2008) e espécies de Rhizophoraceae (Setoguch
et al. 1999).
Com base nos caracteres polínicos e na capacidade reprodutiva, P. edulis e Passiflora
sp. são tidas como espécies geneticamente próximas. Entretanto diferenças encontradas nas
ornamentações dos grãos de pólen, como presença de pilos no muro e fileira única de malhas
entre dois pares de colpos em Passiflora sp., além da nítida separação entre os genótipos a
partir dos caracteres de morfologia vegetativa, corroboram com a hipótese de que P. edulis e
Passiflora sp. são espécies diferentes. Esta hipótese foi confirmada pela análise da sequência
do íntron do trnL, sendo observado maior diferença entre P. edulis e Passiflora sp., do que em
relação as outras espécies do subgênero Passiflora.
Agradecimentos
O autor agradece à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão de bolsa de estudos, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia
(FAPEB), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à
Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo apoio financeiro. Ao Dr. Luís Carlos
Bernacci pela coleta do germoplasma de Passiflora sp. e ao Dr. Vitor Becker pela permissão
de coleta do germoplasma de Passiflora sp na RPPN Serra Bonita (Instituto Uiraçu),
Camacan, BA.
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55
Capítulo de acordo com as normas da Revista Plant Cell Report
4. Capítulo 2- CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE AS
ESPÉCIES Passiflora edulis Sims e Passiflora sp.
Resumo Passiflora edulis Sims é a espécie de maior importância econômica do gênero
Passiflora. Recentemente foi encontrada uma espécie ainda não identificada (Passiflora sp.),
apresentando características morfológicas muito semelhantes à P. edulis. Diante da
necessidade de delimitação entre as duas espécies, análises cariomorfológicas e de
bandamentos foram realizadas. As duas espécies apresentaram 2n = 18, sendo a fórmula
cariotípica 16 M + 2 SM. Foram obtidos os valores para: a) CLH, 29,5 e 29,4; b) TF%, 46,4 e
43,1 em P. edulis e Passiflora sp., respectivamente. Houve variação entre as espécies na
localização dos satélites e no comprimento dos pares cromossômicos 2, 4 e 8. O bandamento
C revelou a presença de heterocromatina constitutiva nas regiões centroméricas e teloméricas
de todos os cromossomos em ambas as espécies. No entanto, apenas em Passiflora sp. os
cromossomos 3 e 9 apresentaram grande quantidade de heterocromatina. O bandamento com
fluorocromo revelou bandas CMA+ apenas nos satélites. De acordo com o índice de
assimetria e a quantidade de heterocromatina Passiflora sp. mostrou-se uma espécie mais
basal que P. edulis. Os dados citogenéticos indicam que Passiflora sp. é uma espécie
proximamente relacionada á P. edulis, no entanto constitui-se numa espécie diferente, a ser
denominada P. cacaoensis.
Palavras-chave: Passiflora, maracujazeiros silvestres, morfometria cromossômica,
bandamento C, CMA/DA/DAPI
56
Introdução
O gênero Passiflora L. é o mais importante economicamente e o que apresenta maior número
de espécies dentro da família Passifloraceae, e a maioria destas é nativa das Américas
(MacDougal e Feuillet 2004). No Brasil estas espécies são encontradas principalmente na
região Centro-Norte (Ulmer e MacDougal 2004). Estima-se que este gênero seja composto
por cerca de 520 espécies (Cervi 2005), sendo que boa parte destas podem ser utilizadas para
fins alimentícios (Meletti et al. 2005), medicinais (Barbosa et al. 2008) ou ornamentais
(Abreu et al. 2008).
Muitas espécies silvestres de Passiflora são consideradas germoplasma de interesse
para produção de plantas ornamentais, pois suas flores possuem beleza inquestionável, com
coloração variando do forte e brilhante ao suave e marcante, devido, principalmente, à
presença de corona, que caracteriza a família (Vanderplank 2000; Abreu et al. 2008). Outros
atributos como, número abundante e florescimento ao longo do ano acrescenta valor
ornamental a estas espécies (Abreu et al. 2008)). Igualmente fascinante é a folhagem
exuberante com ampla variedade de formatos, tamanhos e tonalidades de verde, tendo muitas
espécies valor ornamental exclusivamente em função da folhagem (Abreu et al. 2008). Além
da beleza original das espécies silvestres, os híbridos produzidos á partir destas, apresentam
atributos estéticos ainda mais atraentes, somado ao fato de que, muitos destes apresentam
resistência á diferentes condições climáticas (Vanderplank et al. 2003). Neste caso é
necessário conhecer a taxa de cruzabilidade entre estas espécies, e para tal o conhecimento do
número cromossômico é uma das primeiras etapas a serem realizadas (Soares-Scott et al.
2005).
As espécies do gênero Passiflora apresentam variação significativa para tamanho e
número de cromossomos. O número básico de cromossomos é x = 6, mas há ocorrência de x
= 9, x = 10 e x = 12, como números básicos secundários (Hansen et al. 2006; Melo et al.
2001). P. edulis pertence ao grupo com 2n = 18 (x = 9), no qual estão inseridas todas as
espécies com importância econômica alimentícia.
Estudos cromossômicos têm sido utilizados na determinação das relações evolutivas
em Passiflora (Cuco et al. 2005; Hansen et al. 2006; Melo et al. 2001; Souza et al. 2008). Em
geral as espécies proximamente relacionadas ou pertencentes a um mesmo subgênero
apresentam cariótipos mais semelhantes do que espécies mais distantes (Beal 1973; Mayeda
1997; Souza et al. 2003). Por isso, a determinação do cariótipo representa um importante
57
papel na reorganização da taxonomia de diversos grupos vegetais, principalmente na
caracterização de diferentes táxons (Cuco et al. 2005; Hansen et al. 2006; Melo et al. 2001).
Existem diversos características dos cromossomos que nos permitem fazer
comparações entre categorias taxonômicas relacionadas, e com isto detectar possíveis
variações existentes. Dentre estas características, podemos citar o comprimento absoluto dos
cromossomos, as propriedades de coloração da cromatina, a posição do centrômero, a
presença ou ausência de satélite e de constrição secundária (Sumner 2003). A caracterização
cromossômica de Passiflora foi por muito tempo baseada unicamente em características
cariomorfológicas, porém com a introdução das técnicas de bandamento, a caracterização
cromossômica tornou-se significativamente melhorada. Recentemente tem sido empregado
estudos de banda AgNOR (Mayeda 1997; Soares-Scott 1998) e bandas CMA/DAPI (Cuco et
al. 2005; Melo et al. 2001), que tem permitido uma melhor identificação da distribuição e da
quantidade de heterocromatina.
Uma espécie silvestre ainda não identificada, Passiflora sp., foi coletada em fragmento
da Floresta Atlântica no Sul da Bahia, sendo morfologicamente muito similar ao
maracujazeiro roxo, P. edulis Sims f. edulis, diferenciando-se apenas no tamanho da flor e do
fruto. Passiflora sp. apresenta características de interesse para o mercado de plantas
ornamentais de interiores devido ao seu pequeno porte, aliado à beleza da sua flor, que é
muito semelhante à flor de P. edulis, no entanto o porte maior desta última não a torna
apropriada para este fim. Há a necessidade de realização de estudos para delimitação entre as
espécies P. edulis e Passiflora sp., utilizando-se metodologias que gerem conhecimentos do
seu genoma. Assim, objetivou-se realizar análises citogenéticas, determinando-se o cariótipo
comparativo entre as duas espécies e realizando técnicas de bandamento para determinação do
padrão de distribuição de heterocromatina em ambas as espécies.
Material e Métodos
Material vegetal
Foram utilizados cinco acessos de P. edulis Sims f. edulis, obtidos a partir de sementes doadas
pelo IAC (Instituto Agronômico de Campinas), UENF (Universidade Estadual do Norte
Fluminense) e Embrapa Cerrados (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária). E
58
Passiflora sp. obtidos de coleta na Reserva Particular do Patrimônio Natural Serra Bonita na
Floresta Atlântica da cidade de Camacan, Bahia, Brasil. Estes acessos foram mantidos no
Banco Ativo de Germoplasma (BAG-Passifloras) localizado no campus da Universidade
Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil.
Obtenção de cariótipos
Áápices de raízes com aproximadamente um centímetro foram coletados de estacas. As
amostras foram pré-tratadas com 8-hidroxiquinolina (8-HQ) 0,002 M por 1 h em temperatura
ambiente (TA) e mais 21 h a + 4° C, posteriormente fixadas em Carnoy 1 (3 partes de álcool
etílico absoluto - 1 parte de ácido acético glacial; Johansen 1940) por 3 h em temperatura
ambiente (TA), e depois mantidos em freezer a -20° C por pelo menos 24 h ou até sua
utilização. Para a coloração, os ápices foram lavados duas vezes em água destilada por 5 min
cada, hidrolisados em ácido clorídrico 5 N por 20min em TA, e então transferidos para a
solução de Schiff por 1:30 h na ausência de luz (Souza et al. 2003). Para retirada do excesso
de coloração do citoplasma, as pontas de raízes foram imersas em água sulfurada (90µL de
K2S2O5 1% + 2,5µL H2O + 75µL HCl 1N) por 15 min (Guerra e Souza 2002). As lâminas
foram preparadas pela técnica do esmagamento em carmim acético a 2%, montadas em meio
Neomount®, e as preparações fotografadas com máquina digital Olympus E-330 adaptada ao
microscópio Olympus CX-41. As imagens dos cromossomos foram mensuradas utilizando-se
o programa computacional Adobe Photoshop CS 8.0, projetando-se a imagem da metáfase,
juntamente com a imagem da escala de uma lâmina micrométrica, que serviu de parâmetro
para a conversão das medidas cromossômicas de milímetros (mm) para micrômetros (µm).
Análises Cariomorfológicas
Após a contagem do número de cromossomos em células íntegras, foram mensurados o
comprimento do braço curto (BC), braço longo (BL) e satélites (SAT). A partir desses dados,
foram analisadas as características comprimento absoluto dos cromossomos individuais (C =
BL + BC + SAT); comprimento do lote haplóide (CLH = somatória dos comprimentos
absolutos dos cromossomos metafásicos); comprimento relativo dos cromossomos (CR = [C
÷ CLH] x 100; porcentagem de contribuição de um determinado cromossomo para o
comprimento total do lote haplóide); cálculo da razão entre braços (r = braço longo ÷ braço
59
curto); comprimento médio dos cromossomos (X) e o índice de assimetria (TF% = somatória
dos braços curtos do lote haplóide em relação ao comprimento do mesmo; Huziwara 1962).
Os cromossomos foram classificados segundo Guerra (1986), em metacêntrico: m (r 1,00-
1,49), submetacêntrico: sm (r 1,50-2,99), acrocêntrico: a (r 3,00-) e telocêntrico: t (r ).
Foram analisadas cinco metáfases em cada espécie para se obter os valores médios do
comprimento dos cromossomos e construção dos cariogramas, que foram montados
utilizando-se o programa computacional Adobe Photoshop CS 8.0, e dos ideogramas,
construídos no programa computacional Word da Microsoft®. A classificação dos satélites foi
realizada segundo Battaglia (1955) e o seu comprimento foi adicionado ao comprimento do
respectivo braço. Os homólogos foram distinguidos com base na posição do centrômero,
tamanho absoluto de cada cromossomo e relação de braços. Os cariótipos foram arranjados de
acordo com o comprimento dos cromossomos, em ordem decrescente, e alinhados pela
posição do centrômero. Os dados foram submetidos á análise de variância e teste de médias
Scott e Knott. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software GENES (Cruz
2006).
Preparo das amostras para bandamento
A raízes anteriormente pré-tratadas em 8-HQ e fixadas em Carnoy 1 (Johansen, 1940) foram
lavadas duas vezes em água destilada por 5 min cada, secas em papel de filtro, transferidas
para lâmina com uma gota da enzima Ultrazym® 100G (Novozymes) a 100% e mantidas em
estufa a temperatura de 37º C por 60 min. Após este passo, a enzima foi retirada com o
auxílio de uma micropipeta, e adicionado 30 µl de ácido acético a 45% sobre a raiz. Com o
auxílio de agulhas de seringa de um mL e sob observação em microscópio estereoscópio, as
raízes foram maceradas, cobertas com uma lamínula e pressionadas firmemente entre papel de
filtro, congeladas em nitrogênio líquido por cerca de 10 min para a retirada da lamínula, com
o auxílio de uma gilete, e imediatamente imersas em álcool 99% por 12 h. As lâminas não
utilizadas de imediato nos procedimentos específicos de cada técnica de bandamento foram
estocadas em freezer a -20º C.
60
Bandamento C
O procedimento para bandamento C foi baseado nos protocolos de Darvey e Gustafson
(1975); Gill e Kimber (1974) e Giraldez et al. (1979), com modificações. Inicialmente as
lâminas com as amostras foram imersas em ácido acético a 45% em TA. Após lavadas com
jatos de água destilada e secas com bomba de ar, foram transferidas para ácido clorídrico 0,2
N a 60º C por 2,5 min (Giraldez et al. 1979). As amostras foram novamente lavadas com jatos
de água destilada, secas com bomba de ar, e transferidas para solução saturada de hidróxido
de bário por 10 min a TA. Para eliminar completamente todos os cristais do hidróxido de
bário, foi adicionada água corrente no jarro de coplin. As lâminas foram transferidas para
ácido acético a 45% para remover todo o restante do hidróxido de bário, e então lavadas com
jatos de água destilada a TA. Em seguida foram imersas em água destilada a 45º C por 2 min
(Darvey e Gustafson 1975), secas com bomba de ar e imersas em jarro de coplin contendo
solução salina de 2xSSC a TA por 15 min. O jarro foi imerso em banho-maria a 30º C por 10
min, e a temperatura do banho-maria foi então aumentada para 40º C por mais 10 min e
finalmente aumentada para 52º C por mais 60 min (Darvey e Gustafson 1975). As lâminas
foram lavadas com jatos de água destilada, secas com bomba de ar e coradas com Giemsa a
4% por 30 min. Depois de lavadas com jatos de água destilada e secas com bomba de ar, as
amostras foram observadas e fotografadas com máquina digital Olympus E-330 adaptada ao
microscópio Olympus CX-41.
Bandamento CMA-DA-DAPI
O procedimento para bandamento com fluorocromo seguiu o protocolo de Guerra e Sousa
(2002). Inicialmente, para corar regiões ricas em nucleotídeos guanina e citosina, foi utilizada
uma gota de cromomicina A3 (CMA) (0,5 mg/ml) depositada em cima das células, logo após
cobertas com lamínula e mantidas em caixa escura por 60 minutos. A lamínula e o excesso de
corante foram retirados com jatos de água destilada e a lâmina seca com bomba de ar. Em
seguida, as lâminas foram contracoradas com uma gota de distamicina A (DA) (0,1 mg/ml),
cobertas com lamínula e mantidas em caixa escura por 30 minutos, depois lavadas com água
destilada e secas com bomba de ar. Para corar regiões ricas em nucleotídeos adenina e timina
61
foi depositada uma gota do fluorocromo 4‟-6‟ diamidino-2-fenilindol (DAPI) (2 g/ml) em
cima das células, logo após cobertas com uma lamínula e mantidas em caixa escura por 30
minutos, depois lavadas com água destilada e secas com bomba de ar. Posteriormente, foi
colocada uma gota de meio de montagem (glicerol/McIlvaine/MgCl2) e 15 µl de Vectashield®
H100 (Vector LAb). As amostras foram cobertas com lamínula, pressionada levemente entre
duas folhas de papel para retirar o excesso do meio, e mantidas por um dia em câmara escura.
Após este período, as lâminas foram analisadas em microscópio de epifluorescência Leica
MZ16 FA com os filtros A (340 a 380 nm) para DAPI e E3 (390 a 490 nm) para CMA.
Resultados
As duas espécies apresentaram 2n = 18 cromossomos (Fig. 1). Os dados das
mensurações cromossômicas (Tabela 1) mostraram que os comprimentos médios dos
cromossomos, comprimento do lote haplóide, e a razão média entre braços não variou entre as
espécies (Tabela 2), não havendo diferença significativa entre as duas espécies pelo teste F
(P<0,05). Entretanto, houve variação significativa pelo teste F (P<0,05) entre o comprimento
individual de cada par cromossômico entre as espécies (Tabela 3).
Ambas as espécies apresentaram 16 cromossomos metacêntricos e 2 submetacêntricos
em suas fórmulas cariotípicas (Tabela 2). Em P. edulis, apenas os pares cromossômicos 6 e 8
foram submetacêntricos, enquanto os demais foram metacêntricos. Já em Passiflora sp.,
apenas os pares 1 e 6 foram submetacêntricos, sendo os demais metacêntricos. Foi detectada a
ocorrência de microsatélites em dois pares de cromossomos em ambas as espécies, no entanto
houve variação na sua localização, que em P. edulis foram observados no braço curto do
primeiro e do quarto par, enquanto em Passiflora sp. ocorreram no braço curto do sétimo e do
oitavo par cromossômico (Fig. 1, setas).
Os cariótipos das duas espécies apresentaram-se simétricos, sendo observada uma
variação média de 52% entre o maior e o menor par cromossômico dentro de cada espécie, e
isto pode ser também detectado pela diferença entre os comprimentos relativos dos
cromossomos (Tabela 1). O cariótipo de Passiflora sp. foi mais assimétrico (Tabela 2).
A distribuição da heterocromatina observada por bandamento C em Passiflora ainda
não havia sido relatada. A análise do bandamento possibilitou identificar a presença de
heterocromatina constitutiva nas regiões centroméricas e teloméricas de todos os
62
cromossomos em ambas as espécies, conforme apresentado na Fig. 2. Não foi detectada a
ocorrência de bandas intersticiais em nenhum cromossomo. Apenas os cromossomos 3 e 9 de
Passiflora sp. apresentaram grandes blocos de heterocromatina. O braço longo do
cromossomo 3 é quase todo constituído por heterocromatina, e no cromossomo 9 o braço
curto é, em sua maioria, constituído por heterocromatina, assim como o braço longo, que
apresenta-se heterocromático em mais de 50% de sua extensão. Já em P. edulis, a distribuição
de heterocromatina foi mais uniforme, à exceção do cromossomo 7 que apresentou o braço
curto praticamente heterocromático. Os satélites das duas espécies foram completamente
constituídos por heterocromatina (Figs. 2 e 3).
O bandamento com fluorocromos CMA3 e DAPI revelou, nas duas espécies, que a
heterocromatina localizada nos satélites apresenta constituição predominante de pares de
bases GC, nestas regiões foram evidenciadas bandas CMA+, e bandas DAPI
- (Fig. 4). No
entanto, as outras regiões heterocromáticas do centrômero e telômero evidenciadas pelo
bandamento C não revelaram padrões predominantes nem de pares de bases AT nem GC.
63
Tabela 1 Morfometria cromossômica em espécies de Passiflora: médias + desvio padrão dos comprimentos dos braços curtos (BC), braços
longos (BL), comprimento total (C), e comprimento relativo (CR), razão entre braços (r) e classificação (CL) em metacêntrico (M) e
submetacêntrico (SM)
*Médias seguidas pela mesma letra dentro da mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Scott e Knott a 5% de probabilidade
Espécies Comprimento dos cromossomos (µm) (média ± desvio padrão)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
P. edulis BC 1,62 ± 0,5 1,79 ± 0,1 1,80 ± 0,3 1,53 ± 0,7 1,39 ± 0,1 1,15 ± 0,2 1,43 ± 0,8 1,13 ± 0,2 1,04 ± 0,3
BL 2,30 ± 0,4 2,02 ± 0,2 2,00 ± 0,4 1,72 ± 0,6 1,68 ± 0,2 1,81 ± 0,3 1,52 ± 0,7 1,70 ± 0,2 1,37 ± 0,1
SAT 0,47 - - 0,46 - - - - -
C 4,39 ± 0,3a 3,81 ± 0,1b 3,80 ± 0,1a 3,71 ± 0,5a 3,07 ± 0,2a 2,96 ± 0,4a 2,95 ± 0,5a 2,83 ± 0,1a 2,41 ± 0,1a
CR 14,87 12,91 12,87 12,57 10,40 10,03 9,99 9,59 8,16
r 1,39 1,13 1,08 1,10 1,21 1,57 1,07 1,51 1,32
CL M M M M M SM M SM M
Passiflora sp. BC 1,47 ± 0,3 1,73 ± 0,2 1,66 ± 0,1 1,52 ± 0,3 1,48 ± 0,5 1,21 ± 0,2 1,07 ± 0,1 0,97 ± 0,3 1,16 ± 0,2
BL 2,74 ± 0,6 2,19 ± 0,3 2,01 ± 0,3 1,81 ± 0,4 1,83 ± 0,7 1,85 ± 0,4 1,43 ± 0,2 1,27 ± 0,4 1,40 ± 0,2
SAT - - - - - - 0,35 0,33 -
C 4,21 ± 0,3a 3,92 ± 0,2a 3,67 ± 0,1a 3,33 ± 0,2b 3,31 ± 0,5a 3,02 ± 0,2a 2,85 ± 0,1a 2,57 ± 0,4b 2,56 ± 0,2a
CR 14,32 13,33 12,48 11,32 11,26 10,27 9,69 8,74 8,71
r 1,85 1,26 1,21 1,22 1,24 1,53 1,33 1,27 1,20
CL SM M M M M SM M M M
64
Fig. 1 Metáfases mitótica e cariogramas em espécies de Passiflora, 2n = 18: a e c P. edulis, b e d
Passiflora sp. Setas indicam satélites. Barra 5 µm
Tabela 2 Fórmula cariotípica, média da razão entre braços (r), comprimento médio dos
cromossomos (X), satélite (SAT) localização e tipo, comprimento do lote haplóide (CLH) e
índice de assimetria (TF%) nas espécies de Passiflora
Espécies Fórmula r X SAT CLH TF
cariotípica (µm) localização/tipo (µm) (%)
P. edulis 16 m + 2 sm 1,20 3,28 BC 1 e 4/micro 29,52 46,44
Passiflora sp. 16 m + 2 sm 1,32 3,27 BC 7 e 8/micro 29,40 43,13
BC: braço curto
a
c
b
d
65
Tabela 3 Resumo da ANOVA para o comprimento médio dos cromossomos (X), comprimento do lote haplóide (CLH) e comprimento
individual dos cromossomos (C) entre Passiflora sp. e P. edulis
FV GL Quadrado Médio
X CLH C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
Espécies 1 0,002NS
0,002NS
0,03NS
0,08* 0,01NS
0,18* 0,06NS
0,002NS
0,009NS
0,065* 0,021NS
Resíduo 34 0,329 0,326 0,003 0,001 0,001 0,009 0,005 0,0002 0,002 0,0006 0,002
Média 3,27 29,5 4,29 3,79 3,61 3,51 3,19 2,99 2,87 2,7 2,49
CV 17,45 17,78 1,31 0,93 0,89 2,74 2,39 0,52 1,6 0,94 1,99
*Significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. NS
Não Significativo
66
Fig. 2 Bandamento C em metáfases mitótica e cariogramas em espécies de Passiflora: a e c P. edulis, b e d
Passiflora sp. Setas indicam satélites. Barra 5 µm
Fig. 3 Ideogramas representando o padrão de bandamento C em espécies de Passiflora: a P. edulis, e b
Passiflora sp. Barra 1 µm
a b
c
d
a
b
67
Fig. 4 Bandamento CMA/DA/DAPI em metáfases mitótica e cariogramas em espécies de Passiflora: P. edulis a
cromossomos corados com DAPI, b sobreposição das imagens a e c, c cromossomos corados com CMA e g
cariograma a partir da imagem b. Passiflora sp. d cromossomos corados com DAPI, e sobreposição das imagens
d e f, f cromossomos corados com CMA e h cariograma a partir da imagem e. Setas indicam satélites, bandas
CMA+ e DAPI
-. Barra 5 µm
a b c
d e f
g
h
68
Discussão
A análise dos valores da relação entre os braços, comprimento do lote haplóide, comprimento
médio dos cromossomos e índice de assimetria cariotípica, assim como a presença de satélites
observados no cariograma (Figs. 1, 2 e 4) e ideograma de Passiflora sp. e P. edulis (Fig. 3)
permitiu identificar características comuns ao gênero Passiflora, como cariótipo com
centrômeros medianos e submedianos e variação interespecífica quanto à presença e
posicionamento de satélites (Cuco et al. 2005; Melo et al. 2001; Soares-Scott et al. 2005;
Souza et al. 2003; Souza et al. 2008; Vieira et al. 2004). Os cariótipos dentro de um mesmo
subgênero ou secção têm sido similares em Passiflora (Souza et al. 2008), como pôde ser
observado no subgênero Granadilla Killip por Mayeda (1997), com poucas diferenças entre
as espécies analisadas.
O gênero Passiflora apresenta quatro grupos de número básico (Melo et al. 2001;
Melo e Guerra 2003), que alocam os quatro subgêneros propostos por MacDougal e Feullet
(2004), a saber, Decaloba com número básico x = 6, Astrophea com x = 12, Deidamioides
com x = 12 e Passiflora com x = 9. Espécies com o mesmo número cromossômico básico
apresentam um padrão cariotípico semelhante (Melo et al. 2001; Melo e Guerra 2003). O
subgênero Passiflora tem número haplóide n = 9 (Hansen et al. 2006). O número de
cromossomos observado em Passiflora sp. a inclue juntamente com P. edulis no subgênero
Passiflora MacDougal e Feuillet.
Os valores encontrados para o CLH foi praticamente igual entre as duas espécies,
indicando que ambas teriam um conteúdo de DNA nuclear muito próximo. Em Passiflora a
relação entre CLH e conteúdo de DNA foi comprovada por Souza et al. (2004), que
analisaram o conteúdo de DNA nuclear por citometria de fluxo em algumas espécies de
Passiflora, e encontraram relação do valor de C (em pg) com o valor de CLH. Em outras
espécies, como o café, também foi observado que a variação no conteúdo de DNA nuclear,
detectada por citometria de fluxo, está relacionada ao tamanho dos cromossomos observados
por coloração de Feulgen (Clarindo e Carvalho 2009).
O valor do CLH encontrado em P. edulis (Tabela 2) foi superior ao descrito por
Meletti et al. (2005), que analisaram três variedades do maracujazeiro roxo e encontrou um
CLH de 21,6 µm. Também foi superior ao encontrado no maracujazeiro amarelo por Cuco et
al. (2005). Tal fato pode ter ocorrido devido a diferenças nas metodologias de mensuração,
que neste estudo foi bastante preciso, uma vez que a imagem da escala utilizada em µm foi
69
obtida sempre nas mesmas condições da imagem da metáfase, repetindo-se esta etapa para
cada amostra fotografada, o que diminui sensivelmente a possibilidade de erro.
De acordo com o índice de assimetria, tanto P. edulis quanto Passiflora sp.
apresentaram cariótipos simétricos, corroborando com o observado por Meletti et al. (2005) e
Soares-Scott (1998) em P. edulis. Cariótipo simétrico é considerado característico de espécies
mais primitivas. Entretanto pelo índice de assimetria de Huziwara (1962), P. edulis é tida
como uma espécie intermediária na escala evolutiva. Ainda de acordo com este índice,
Passiflora sp. mostrou-se mais basal. Todas as epécies do subgênero Passiflora apresentam
cariótipo simétrico, enquanto cariótipo assimétrico é descrito apenas nas espécies que
constituem o grupo com x = 6 (Melo e Guerra 2003).
As maiores variações cariotípicas entre as espécies P. edulis e Passiflora sp. foram
observadas em relação à posição dos satélites e composição da heterocromatina. O número e a
posição de satélites em P. edulis diferiu daqueles observados por Mayeda e Vieira (1995) e
Meletti et al. (2005), que observaram dois satélites no braço longo dos cromossomos 4 e 7.
Cuco et al. (2005) detectaram satélites no braço longo do cromossomo 8 e no braço curto do
9, enquanto Soares-Scott et al. (1999) observaram três pares com satélites. Nesse trabalho foi
observada a presença de satélites no braço curto dos cromossomos 1 e 4 de P. edulis. Estas
diferenças na localização dos satélites indicam a ocorrência de variação entre populações
distintas, provavelmente como consequência de rearranjos estruturais (Souza et al., 2003).
Neste estudo os comprimentos dos satélites foram adicionados ao braço cromossômico
correspondente. Já no trabalho de Cuco et al. (2005) o comprimento do satélite não foi
mencionado, o que pode ter causado divergências quanto à a classificação dos cromossomos.
Em Passiflora sp. os satélites foram observados nos pares 7 e 8. Satélite no
cromossomo 8 também foi detectado por Souza et al. (2003) em P. quadrangularis. Par oito
satelitado também foi descrito por Cuco et al. (2005) em P. amethystina, P. edulis f.
flavicarpa e P. cincinnata, que consideraram a ocorrência de satélite como critério para a
classificação dos cromossomos como sendo os pares 8 e 9, mesmo quando o comprimento
destes eram superiores ao apresentado pelo sétimo par cromossômico, como ocorreu em P.
cincinnata. Este fato não foi considerado neste estudo, por considerar-se que a ocorrência de
alterações cromossômicas como translocações modificam a posição de satélites, diferenciando
cariótipos de uma mesma espécie em populações diferentes, como observado em Capsicum
parvifolium (Moscone 1993), Lathyrus (Battistin et al. 1999) e em Echeandia nana (Martínez
et al. 2000).
70
O padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva com bandas centroméricas e
teloméricas, evidenciado pelo bandamento C em P. edulis e Passiflora sp., corroboram com o
proposto por Guerra (2000) para espécies com cromossomos de tamanho médio, como é o
caso das espécies aqui estudadas. Espécies com cromossomos pequenos e comprimento
inferior a 3 μm apresentam, em sua maioria, bandas proximais (centroméricas) e, à medida
que aumenta o tamanho dos cromossomos, aumenta a frequência das bandas teloméricas e
intersticiais (Guerra 2000).
Apesar de terem sido detectadas bandas centroméricas e teloméricas em todos os
cromossomos de ambas as espécies, diferenças no tamanho destas bandas foram observadas.
O cromossomo 9, que em Passiflora sp. apresentou grande conteúdo de heterocromatina, em
P. edulis o mesmo não foi observado, assim como o cromossomo 7 de P. edulis, que
apresentou o braço curto praticamente todo heterocromático. Por outro lado, nos
cromossomos satelitados a quantidade de heterocromatina foi muito semelhante entre as duas
espécies, incluindo o fato dos satélites serem completamente heterocromáticos. Para Cuco et
al. (2005) estes cromossomos portadores de satélites são homeólogos entre espécies
proximamente relacionadas. Esta interpretação de homeologia para cromossomos com mesmo
padrão de bandas ou satélites, também é encontrada em estudos cariológicos de outros grupos,
a exemplo de Nicotiana seção Tomentosae (Lim et al. 2000).
A quantidade de heterocromatina em P. edulis foi inferior à observada em Passiflora
sp. Esta diferença na quantidade de heterocromatina pode ser um indicativo do caráter mais
derivado de P. edulis, já que a perda de conteúdo de DNA não codificante é uma tendência
evolutiva nos vegetais (Levin 2002). Entretanto, essa afirmação fica limitada, em virtude da
falta de conhecimento do padrão de distribuição da heterocromatina em outros taxa do gênero
ou até mesmo da família. Este fato reforça ainda mais a importância do estudo do padrão de
distribuição da heterocromatina em Passiflora, que poderá servir de base para estudos
evolutivos no gênero. Além do mais, considerando que uma das estratégias de melhoramento
do maracujazeiro inclui a obtenção de híbridos interespecíficos visando à introgressão de
características favoráveis agronomicamente, o bandamento cromossômico aliado à
citogenética molecular (FISH e GISH), pode fornecer subsídios para a identificação e
caracterização dos cromossomos, auxiliando a construção de mapas físicos.
O bandamento por fluorocromos usando CMA e DAPI revelou quatro blocos CMA+
em ambas às espécies e nenhuma banda DAPI+ foi observada. Todos os blocos CMA
+
ocorreram nitidamente nos satélites, corroborando com Melo et al. (2001) para P. edulis.
71
Segundo estes autores, a localização dos blocos CMA+ não pôde ser claramente estabelecida
em seu estudo devido ao grau de condensação dos cromossomos em decorrência do pré-
tratamento, gerando dúvidas se a localização dos blocos CMA+ estavam nos satélites, ou em
regiões terminais dos cromossomos. Tal fato foi esclarecido neste trabalho.
O padrão de bandamento pelo fluorocromo CMA, em conjunto com o mapeamento
das regiões 5S e 45S rDNA utilizando FISH, foi observado em P. amethystina, P. edulis f.
flavicarpa, P. cincinnata e mais quatro híbridos somáticos. Entre estas espécies, verificou-se a
ocorrência de blocos CMA+ apenas nos satélites Cuco et al. (2005). Os autores destacam
ainda que em P. edulis, as regiões marcadas com o CMA correspondem ás mesmas regiões
onde foram detectados os sítios de rDNA 45S.
Estudos citotaxonômicos têm sido utilizados em diferentes grupos vegetais (Melo
2004). Na família Rutaceae, Guerra (1985) sugeriu a partir do padrão de banda C que os
gêneros Ruta e Dictammus, classificados na mesma tribo, fossem agrupados em tribos
diferentes. Guerra (1993) aplicou CMA/DAPI em seis espécies de Citrus, e observou padrão
diferenciado de bandas para cada espécie, confirmando a eficácia desta técnica para os
estudos taxonômicos do gênero. Brandão (2003) confirmou, por meio do padrão de
distribuição, do tipo de heterocromatina e do número de regiões organizadoras do nucléolo,
que as espécies Lippia alba e L. germinata, consideradas sinonímias, são, na verdade,
espécies diferentes. Através destas análises, este autor obteve também, clara distinção entre as
espécies do gênero Lippia, Aloysia e Lantana, considerados muito semelhantes
morfologicamente.
Em Passiflora, Passos (2007) desenvolveu um estudo citotaxonômico objetivando
delimitar P. galbana Mast. e P. mucronata Lam., muito semelhantes morfologicamente. Este
autor detectou existência de variação cariotípica interespecífica nas espécies e mostrou
claramente a diferenciação cromossômica entre elas. Considerando-se as semelhanças
detectadas entre os cariótipos de Passiflora sp. e P. edulis, como o mesmo número de
cromossomos, cariótipos simétricos, comprimento do lote haplóide muito próximo e
heterocromatina dos satélites rica em GC, podemos afirmar que P. edulis e Passiflora sp. são
espécies geneticamente próximas. Por outro lado, as diferenças observadas na razão entre
braços dos cromossomos 1 e 8, no comprimento dos cromossomos 2, 4 e 8, na localização dos
satélites e, principalmente no padrão de distribuição da heterocromatina, dão suporte à nossa
interpretação de que P. edulis e Passiflora sp. (a ser denominada P. cacaoensis) são espécies
diferentes.
72
Agradecimentos
O autor agradece à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão de bolsa de estudos, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia
(FAPEB), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à
Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo apoio financeiro. Ao Dr. Luís Carlos
Bernacci pela coleta do germoplasma de Passiflora sp. e ao Dr. Vitor Becker pela permissão
de coleta do germoplasma de Passiflora sp na RPPN Serra Bonita (Instituto Uiraçu),
Camacan, BA.
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76
Capítulo de acordo com as normas da categoria short communication da
revista Genetics and Molecular Biology
5. Capítulo 3- PROTOCOLO PARA IDENTIFICAÇÃO DO PADRÃO DE
DISTRIBUIÇÃO DA HETEROCROMATINA EM ESPÉCIES DE Passiflora L.
Resumo
Devido à dificuldade em se observar bandas C em cromossomos de espécies de Passiflora,
esse trabalho objetivou aplicar três protocolos já utilizados para outras espécies vegetais,
denominados 1, 2 e 3, visando à obtenção de um protocolo eficiente para visualização de
bandas heterocromáticas em P. edulis e Passiflora sp. Nenhum dos protocolos utilizados
isoladamente permitiu a observação de bandas C em Passiflora. O protocolo 1 propiciou uma
coloração forte e uniforme ao longo dos cromossomos, indicando que este não foi eficaz em
desnaturar a cromatina. O protocolo 2 promoveu extração excessiva de DNA, sendo
observada coloração fraca. O protocolo 3 propiciou baixo contraste entre as bandas. Os
melhores resultados foram obtidos utilizando-se um novo protocolo, mesclando-se etapas dos
protocolos 2 e 3. A desidratação seguiu o protocolo 3. Foi adicionada uma etapa: imersão em
ácido acético glacial a 45%. A denaturação e renaturação seguiram o protocolo 2 e a
coloração seguiu o protocolo 3. As bandas C foram observadas nos satélites e regiões
teloméricas e centroméricas de todos os cromossomos das duas espécies. Com as adaptações
realizadas, foi possível obter um protocolo para bandamento C eficiente para visualização de
bandas heterocromáticas claramente diferenciadas, sendo este o primeiro relato para
Passiflora.
Palavras-chave: Passiflora, maracujazeiros, bandamento C, identificação cromossômica.
77
O bandamento C com Giemsa é o procedimento mais utilizado para evidenciar a
heterocromatina constitutiva nos cromossomos e núcleos dos vegetais (Fukui e Nakayama,
1996). Por meio desta técnica, o pré-tratamento com hidróxido de bário, seguido pela solução
salina SSC, modifica a estrutura do cromossomo, resultando na extração preferencial de
proteínas e de DNA das regiões eucromáticas, fornecendo assim um padrão característico de
bandas (Mckay, 1973).
O grau de polimorfismo e as propriedades de coloração da heterocromatina,
observados nos cromossomos quando submetidos ao bandamento C com Giemsa, são
determinados pelo tipo de heterocromatina, que são diferenciadas em facultativa ou
constitutiva, de acordo com o conteúdo de DNA satélite (Multani et al., 2001). A
heterocromatina constitutiva difere substancialmente da eucromatina pela composição de
bases de seu DNA e pela baixa ou nenhuma atividade transcricional. Esta condição está
associada, em parte, ao estado constantemente condensado deste tipo de cromatina (Guerra,
2000; Sumner, 2003).
A ocorrência preferencial da heterocromatina constitutiva é descrita em determinadas
regiões dos cromossomos, em particular nos centrômeros ou nas suas proximidades
(pericentromérica ou paracentromérica), formando blocos de tamanhos variáveis, de acordo
com o grupo analisado (Sumner, 2003). Guerra (2000) relata que espécies com cromossomos
pequenos e comprimento inferior a 3 μm apresentam, em sua maioria, bandas proximais
(centroméricas) e, à medida que aumenta o tamanho dos cromossomos, aumenta a freqüência
das bandas teloméricas e intersticiais.
Gill e Kimber (1974) desenvolveram um protocolo para detecção da heterocromatina
nos cromossomos do arroz. Desde então, muitas adaptações têm sido feitas, com o objetivo de
obter um maior número de bandas C nos cromossomos vegetais. Tais modificações foram
desenvolvidas principalmente para as gramíneas, onde a técnica apresenta os resultados mais
78
expressivos (Ellneskog-Staam et al., 2007; Chrza˛stek, 2003). Giraldez et al. (1979)
introduziram adaptações no protocolo de Gill e Kimber (1974) para obtenção de melhor
resolução no padrão de bandas C nos cromossomos do arroz. Já Darvey e Gustafson (1974)
adaptaram o protocolo para linhagens híbridas do arroz com o trigo. Apesar desses protocolos
terem apresentado resultados eficazes nas gramíneas, precisaram ser modificados e adaptados
para obtenção de bons resultados em outros grupos vegetais (Hoshi et al., 1998).
A distribuição da heterocromatina por bandamento C ainda não foi relatada em
espécies do gênero Passiflora. O estudo do padrão de distribuição da heterocromatina em
Passiflora apresenta importância para estudos evolutivos no gênero. Além do mais,
considerando que uma das estratégias de melhoramento das espécies do gênero inclui a
obtenção de híbridos interespecíficos, visando à introgressão de características agronômicas
favoráveis, o bandamento cromossômico, aliado á genética molecular, pode fornecer
subsídios para a identificação e caracterização dos cromossomos, auxiliando á construção de
mapas físicos.
Devido à dificuldade em se obter e observar bandas C em cromossomos de espécies de
Passiflora, esse trabalho objetivou aplicar três protocolos para observação de bandamento C,
já testadas em outras famílias de plantas, visando à obtenção de um protocolo eficiente para
visualização de bandas heterocromáticas claramente diferenciadas nessas espécies.
O material constou de cinco exemplares de Passiflora sp. ( a ser denominada como P.
cacaoensis) obtidos de coleta na Mata Atlântica de Serra Bonita, Camacan, Bahia, Brasil, e de
P. edulis Sims f. edulis obtidos a partir de sementes doadas pelo IAC (Instituto Agronômico -
Campinas), UENF (Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro) e Embrapa
Cerrados (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária).
Estacas foram utilizadas para a coleta de ápices de raízes, quando estes apresentavam
cerca de um centímetro de comprimento. As amostras foram pré-tratadas com 8-
79
hidroxiquinolina 0,002 M por 1 h em temperatura ambiente (TA) e mais 21 h em + 6° C, e
posteriormente fixadas em Carnoy 1 (3 partes de álcool etílico absoluto - 1 parte de ácido
acético glacial; Johansen, 1940) por 3 h em TA e depois mantidos em freezer a -20° C por
pelo menos 24 h. Cada amostra pré-tratada e fixada foi lavada duas vezes em água destilada
por 5 min cada, seca em papel de filtro e transferida para lâmina, sobre a qual foi depositada
uma gota da enzima Ultrazym® 100G (Novozymes) a 100%. A lâmina foi incubada em estufa
a temperatura de 37º C por 60 min. Após este passo, a enzima foi retirada e adicionou-se 30
µl de ácido acético a 45% sobre a raiz, que foi macerada com auxílio de agulhas e coberta
com lamínula. O conjunto lâmina-lamínula foi pressionado firmemente entre papel de filtro.
As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido por cerca de 10 min; a lamínula foi
rapidamente retirada com o auxílio de uma lâmina de bisturi ou similar. As lâminas não
utilizadas de imediato foram estocadas em freezer a -20º C.
O procedimento para bandamento C seguiu quatro protocolos, sendo: a) Protocolo 1,
proposto por Gill e Kimber (1974); b) Protocolo 2, proposto por Darvey e Gustafson (1975);
c) Protocolo 3, proposto por Giraldez et al. (1979) e d) Protocolo 4, com modificações,
contendo passos dos protocolos 2, 3 e mais um passo adicional. As amostras foram
observadas ao microscópio Olympus CX-41 e fotografadas com máquina digital Olympus E-
330.
80
Tabela 1. Etapas de protocolo modificado, iniciado após a retirada da lamínula, para obtenção de bandas C em Passiflora
Etapas Protocolo 2
(Darvey e Gustafson, 1975)
Protocolo 3
(Giraldez et al., 1979)
Passo Adicional
Desidratação - Imersão em JC com etanol 99% por 12
h e secagem em TA por 5 minutos
Imersão em JC contendo ácido acético
a 45% em TA por 30 minutos *
Imersão em JC contendo ácido
clorídrico 0,2 N a 60º C por 2,5
minutos*
Denaturação Imersão em JC com solução saturada
recém preparada de hidróxido de bário
em TA por 10 minutos
- -
Lavagem em água, imersão em JC
com ácido acético a 45% e em JC
contendo água destilada a 45º C por 2
minutos*
Renaturação Imersão em JC com solução salina de
2xSSC a TA por 15 minutos
JC com as lâminas em 2xSSC é imerso
em banho-maria a 30º C por 10
minutos
- -
A temperatura do banho-maria é
elevada para 40º C por 10 min e então
elevada para 52º C por 60 minutos*
Coloração - Coloração das lâminas com Giemsa a
4% por 30 minutos*
-
*Após este passo, as lâminas foram lavadas com jatos de água destilada e secas com bomba de ar. TA, temperatura ambiente; JC, jarro de coplin.
81
O protocolo 1 não produziu coloração diferenciada para bandas C, sendo observada
coloração forte e uniforme ao longo dos cromossomos (Figura 1a), indicando que este
protocolo não foi eficaz em denaturar a cromatina. Provavelmente o tempo de exposição ao
hidróxido de bário foi insuficiente para a denaturação alcalina (Fukui e Nakayama, 1996). Por
outro lado, utilizando-se o protocolo 2 houve extração excessiva de DNA, sendo observada
coloração bastante fraca ao longo de todo o cromossomo (Figura 1b). Este protocolo é
rotineiramente utilizado para cromossomos de cereais (Chrza˛stek, 2003; Maria, 1996), no
entanto, para outros grupos vegetais, algumas modificações no tempo e temperatura de
exposição ao hidróxido de bário já foram recomendadas para obtenção de bandas C (Fukui e
Nakayama, 1996).
Algumas bandas de heterocromatina foram obtidas a partir do protocolo 3. Entretanto,
foi verificado baixo contraste entre as bandas claras e escuras, sendo observada coloração
fraca ao longo de todo o cromossomo. Este protocolo tem sido utilizado para diferentes
grupos vegetais, a exemplo de Dasypyrum villosum (Friebe et al., 1987), Secale cereale
(Cuñado et al., 1986), Bromus riparius (Tuna et al., 2001) e Alstroemeria ligtu (Ishikawa e
Ishikava, 2002). Porém, ele se ajusta melhor para cromossomos de gramíneas.
O protocolo 4, resultante de adaptações aos protocolos 2 e 3 (Tabela 1), foi o que
proporcionou melhores resultados, evidenciando a heterocromatina presente nos satélites, nas
regiões teloméricas e centroméricas de todos os cromossomos, tanto de P. edulis quanto de
Passiflora sp. (Figuras 1c e d). Passiflora sp. apresentou quantidade superior de
heterocromatina em seus cromossomos. Nesta espécie, os cromossomos 3 e 9 foram
constituídos, em grande parte, por heterocromatina. Já em P. edulis, a distribuição de
heterocromatina foi mais uniforme, à exceção do cromossomo 7, que apresentou o braço curto
praticamente heterocromático.
82
Figura 1- Bandamento C em cromossomos metafásicos de espécies de Passiflora. Passiflora sp. a)
tratamento com protocolo 1; b) tratamento com protocolo 2; d) tratamento com protocolo modificado;
P. edulis c) tratamento com protocolo modificado. Barra: 5 µm.
No protocolo modificado, a combinação do tratamento dos cromossomos com ácido
acético 45%, seguido pelo tratamento com ácido clorídrico 0,2 N antes da denaturação
alcalina, resultou nos melhores contrastes entre as bandas. O ácido clorídrico retira bases do
tipo purina do DNA cromossomal (Devanter e Hoff, 1990), deixando sua estrutura mais
frágil. Já o ácido acético age sobre as proteínas associadas ao DNA (Davie, 2003),
desestruturando-as, e desta forma, facilitando a denaturação alcalina pelo hidróxido de bário.
Tal adaptação favoreceu a extração preferencial do DNA não heterocromático, que
normalmente já se encontra mais descondensado que o DNA da heterocromatina (Guerra,
a b
c d
83
2000). O DNA denaturado e fragmentado foi extraído durante a incubação em 2xSSC
(Holmquist, 1979).
O mecanismo exato de ação do bandamento C foi inicialmente proposto por Gagne et
al. (1971), os quais alegavam que a ocorrência das bandas coradas mais fortemente por
Giemsa, após tratamento com hidróxido de bário e 2xSSC, correspondia a reassociação
diferenciada do DNA altamente repetitivo. A explicação mais aceita é que as bandas coradas
mais fortemente pelo Giemsa sejam, na verdade, resultado da extração preferencial da
eucromatina, que é mais susceptível á ação de denaturação alcalina (Comings, 1978; Mckay,
1973).
Fernández et al. (2002) desenvolveram um novo método para obtenção de banda C,
utilizando a formamida ao invés do hidróxido de bário. Os autores sugerem que as bandas são
resultantes da reassociação diferenciada do DNA altamente repetitivo. Os autores citam o
trabalho de Comings et al. (1973) como base para sua afirmação, no qual foi demonstrado que
a reassociação do DNA heterocromático ocorre em até 20 segundos após a denaturação,
enquanto o restante do DNA demora entre 3 a 5 min. Contudo, a extração preferencial da
eucromatina, descrita por Comings (1978) e Mckay (1973), é a hipótese mais confiável, e a
que melhor explica os resultados encontrados para P. edulis e Passiflora sp., já que o longo
tempo de exposição dos cromossomos ao 2xSSC, mais de uma hora, foi suficiente para
promover a renaturação de todo o DNA cromossomal. Se o DNA estivesse apenas
denaturado, as bandas não seriam produzidas, pois os cromossomos seriam corados por
inteiro.
Com as adaptações realizadas nas metodologias de Darvey e Gustafson (1975) e de
Giraldez et al. (1979), foi possível obter um protocolo para bandamento C em espécies de
Passiflora considerado bastante eficiente para visualização de bandas heterocromáticas
claramente diferenciadas.
84
Agradecimentos
O autor agradece à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão de bolsa de estudos, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia
(FAPEB), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à
Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo apoio financeiro. Ao Dr. Luís Carlos
Bernacci pela coleta do germoplasma de Passiflora sp. e ao Dr. Vitor Becker pela permissão
de coleta do germoplasma de Passiflora sp na RPPN Serra Bonita (Instituto Uiraçu),
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5. CONCLUSÕES GERAIS
Este trabalho contribuiu para a compreensão de características morfológicas
vegetativas e reprodutivas, polínicas, e citogenéticas de uma nova espécie,
Passiflora sp., a ser denominada como P. cacaoensis.
De acordo com a morfologia e o número cromossômico, Passiflora sp. foi
classificada como pertencente ao subgênero Passiflora MacDougal e Feuillet.
A partir da avaliação da taxa de cruzabilidade e de características
citogenéticas detectou-se alto grau de relacionamento genético entre P. edulis
e Passiflora sp.
A análise com base na região do íntron trnL foi efetiva na distinção entre as
duas espécies, confirmando o caráter individual de cada genótipo.
A partir deste trabalho, o padrão de distribuição da heterocromatina por
bandamento C foi, pela primeira vez, descrito em espécies de Passiflora, e
que certamente será útil para aplicação em outras espécies.
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106
7. APÊNDICE
107
Apêndice A - Sequências nucleotídicas do fragmento do íntron do trnL das espécies estudadas.
Passiflora_edulis --------GN CTTAATTGGA TTGAGCCTTG GTATGGAAAC TTACTAAGT- -GATAACTTT CAAATTCAGA GAAACCCTGG
Passiflora_sp ---------- --A....... .......... .......... .........T G......... .......... ..........
Passiflora_xiikzodz ACGCTACG.A .......... .......... .......... .........- -......... .......... ..........
Passiflora_alata ---------- .......... .......... .......... .........- -......... .......... ..........
Passiflora_coriacea ACGCTACG.A .......... .......... .......... .........- -......... .......... ..........
Passiflora_cincinnata ACGCTACG.A .......... .......... .......... .........- -......... .......... ..........
Passiflora_foetida ACGCTACG.A .......... .......... .......... .........- -......... .......... ..........
Passiflora_incarnata ACGCTACG.A .......... .......... .......... .........- -......... .......... ..........
Passiflora_palmeri ---------- ---------- ---------- -......... .........- -......... .......... ..........
Passiflora_sprucei ---------- ---------- ---------- -......... .........- -......... .......... ..........
Clusia_major ---------- ---------- .......... .......... .........- -..G...... .......... ..........
Passiflora_edulis AATAA-AAAA TGGGCAATCC TGAGCCAAAT CCTGTTTTTC GAA------A ACAAAAAAAC AACAAAGGTT CATAAAGACA
Passiflora_sp .....T.... .......... .......... .......... ...------. .......... .......... ..........
Passiflora_xiikzodz ...C.-.... .......... .......... ...T.....T ATGTT-TTC. .A.......T .......... .........-
Passiflora_alata .....-.... .......... .......... .......... ...------. .......... .......... ..........
Passiflora_coriacea .....-.... .......... .......... ...T.....G TT.TTGTTTT CA.......G .......... .........-
Passiflora_cincinnata .....-.... .......... .......... .......... ...------. .......... .......... ..........
Passiflora_foetida .....-.... .......... .......... .......... ...------. .......... .......... ..........
Passiflora_incarnata .....-.... .......... .......... .......... -..------. .......... .......... ..........
Passiflora_palmeri .....-.... .......... .......... .......... ...------. .......... .......... ..........
Passiflora_sprucei .....-.... .......... .......... .......... ...------. .......... .......... ..........
Clusia_major .....-.... .......... .......... ........C. ...A-----. .A.......A .......A.. T.......A.
Passiflora_edulis GAATCAGAAT AAATAAAGGA TAGGTGCAGA GACTCAACGG AAGCTGTTCT AACAAATGGA GTTGATTGCG TT-----GCA
Passiflora_sp .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..-----...
Passiflora_xiikzodz ------.... ...-...... .......... .......... ...T...... .......... .......... ..-----C--
Passiflora_alata .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..-----...
Passiflora_coriacea ------.... ...-...... .......... .......... ...T...... .......... .......... ..-----CT.
Passiflora_cincinnata .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..-----...
Passiflora_foetida .......... ...-...... .......... .......... .......... .......... .......A.. ..-----...
Passiflora_incarnata .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..-----...
Passiflora_palmeri .......... ...-...... .......... .......... .......... .......... .......A.. ..-----...
Passiflora_sprucei .......... ...-...... .......... .......... .......... .......... .......... ..-----...
Clusia_major A..CATA..A ...-...... .......... .......T.. .......... .......... ........T. A.TAGTAAAG
108
Passiflora_edulis TAAAGGAATC CTT-CTATTA AAACTCCAGA AAAGAT-AAA GTGATAAAAT AAAAGATAAC ACTAATATAC ATAGATCCAC
Passiflora_sp .......... ...T...... .......... ......-... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_xiikzodz ------.... ...-...... .......... ......-... ...C...... .......... .......... .......T..
Passiflora_alata .......... ...-...... .......... ......-... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_coriacea ....AA.... ...-...... .......... ......-... ...C...... .......... .......... .......T..
Passiflora_cincinnata .......... ...-...... .......... ......T... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_foetida ....A..... ...-...... .......... ......-... .......... .......... .......... ..G.......
Passiflora_incarnata .......... ...-...... .......... ......-... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_palmeri ....A..... ...-...... .......... ......-... .......... .......... .......... ..G.......
Passiflora_sprucei .......... ...-...G.. .......... ......-... .......... .......... .......... ..........
Clusia_major .......... ...T..-.C. .......... ..G...-... AG.G....G. .----....G ..AT...... ...----T..
Passiflora_edulis GTACTGAAAT ACTATC-TCA AATACAAATA ATTAATGACG AGCGAC---- CCAAACCTGT ATCTATATTT TTCCTGTATC
Passiflora_sp .......... .....T-... ....A..... .......... ..T...---- .......A.. .......... ..........
Passiflora_xiikzodz .......... ......G... ....G..... .......... ......---- ..C..T..A. .......... ...TG.....
Passiflora_alata .......... ......-... .......... .......... ......---- .......... .......... ..T.......
Passiflora_coriacea .......... .....T-... ....G..... .......... ......---- ..C..T..A. .......... ...TG.....
Passiflora_cincinnata .......... ......-... .......... .........A ......---- .......... .......... ..........
Passiflora_foetida .....A.... ......-... .......... .......... ......---- .......... .......... ..........
Passiflora_incarnata .......... ......-... .......... .......... ......---- .......... .......... ..........
Passiflora_palmeri .....A.... ......-... .......... .......... ......---- .......... .......... ..........
Passiflora_sprucei .......... ......-... .......... .......... ..T..T---- .......... .......... ..........
Clusia_major ...T...... ......-... ...GATT.AT .A.G.CTC.A .T.T.TATTT TTGT.TA.A. ..A.....A. A.AT.A...A
Passiflora_edulis TTTTTTTTTT --CATTTTTT ----TATAAA A-AAGTTGTT CTGAATCAA- --TTCTAAGT TGAAGAA--A GGATCGAATA
Passiflora_sp .......... --........ ----...GG. .C........ G........A AC........ .....T.--. .A........
Passiflora_xiikzodz .......... T-........ ----.C.G.. .A..A..... .........- --........ .CC....--. ..........
Passiflora_alata .......... --........ ----...... .-........ .........- --........ .......--. ..........
Passiflora_coriacea .......... AATT...... ----.C.G.. .A..A..... .......CT- --........ .CC....--. ..........
Passiflora_cincinnata .........- --........ ----...... .-..A..... .........- --........ .......--. ..........
Passiflora_foetida .........- --........ ----...... .-........ .........- --........ .......--. ..........
Passiflora_incarnata .......... --........ ----...... .-....G... .........- --........ .......--. ..........
Passiflora_palmeri .......... T-........ ----...... .-........ .........- --........ .......--. ..........
Passiflora_sprucei .......... T-........ ----...... .-........ .........- --........ .......--. ..........
Clusia_major ....A...A. TTT....A.A GGAA...G.. .T..A....C T........- --.C.C..A. .C.....TC. AA..T...A.
Passiflora_edulis TTAATTGA-- TCAA-ATCAA TTGATCAAAT AAATAACGTA CTCCATAGTC TGATAGATAA CTGATTAATC GGACGAGAAT
Passiflora_sp .......G-- ....-..... .......... .......... .......A.. .......... .G-------- ----------
Passiflora_xiikzodz ........-- ....-..... .......... ----..T... .......... .......... TG........ ..........
Passiflora_alata ........-- ....-..... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
109
Passiflora_coriacea ........-- ....-..... .......... ----..T... .......... .......... TG........ ..........
Passiflora_cincinnata ........-- ....-..... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_foetida ........-- ....-..... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_incarnata ........-- ....-..... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_palmeri ........-- ....-..... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
Passiflora_sprucei ........-- ....-..... .......... .......... .......... .......... .......... ..........
Clusia_major AA..AA.GAT C...T..G.. .......... ----C.TT.. ..T....... .....A.... .......... ...T......
Passiflora_edulis AAAGATAGAG TCCCATTCTA CATGTCAATA TCGACAACAA GGAAATTTAT AGTAAGAGGA AAATCCGTCG ACTTTAGAAA
Passiflora_sp ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Passiflora_xiikzodz .......... .......... .......... .....----- ---------- ---------- ---------- ----------
Passiflora_alata .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....?.....
Passiflora_coriacea .......... .......... .......... .....----- ---------- ---------- ---------- ----------
Passiflora_cincinnata .......... .......... .......... .....----- ---------- ---------- ---------- ----------
Passiflora_foetida .......... .......... .......... .....----- ---------- ---------- ---------- ----------
Passiflora_incarnata .......... .......... .......... .....----- ---------- ---------- ---------- ----------
Passiflora_palmeri .......... .......... .......... ...------- ---------- ---------- ---------- ----------
Passiflora_sprucei .......... .......... .......... ...------- ---------- ---------- ---------- ----------
Clusia_major .......... .......... .......... .T........ .......... ......G... .......--- ----------
Passiflora_edulis TCGTGAGGGG ---------- ---------- -
Passiflora_sp ---------- ---------- ---------- -
Passiflora_xiikzodz ---------- ---------- ---------- -
Passiflora_alata .........T TCAAGTCCCT CTATTCCCCA A
Passiflora_coriacea ---------- ---------- ---------- -
Passiflora_cincinnata ---------- ---------- ---------- -
Passiflora_foetida ---------- ---------- ---------- -
Passiflora_incarnata ---------- ---------- ---------- -
Passiflora_palmeri ---------- ---------- ---------- -
Passiflora_sprucei ---------- ---------- ---------- -
Clusia_major ---------- ---------- ---------- -
