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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
HLLYTCHAIKRA FERRAZ FEHLBERG
IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DOS COCCIDIOS DAS ESPÉCIES Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora caninum e Cryptosporidium
parvum ATRAVÉS DA TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)
ILHÉUS-BA
2016
II
HLLYTCHAIKRA FERRAZ FEHLBERG
IDENTIFICAÇÃOE DIFERENCIAÇÃO DOS COCCIDIOS DAS ESPÉCIES Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona,Neospora caninum e Cryptosporidium
parvum ATRAVÉS DA TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área: Clínica e Sanidade Animal Orientador: Prof. Dr. George Rêgo Albuquerque. Co-orientadora: Profa. Dra. Bianca Mendes Maciel.
ILHÉUS-BA
2016
II
F296 Fehlberg, Hllytchaikra Ferraz. Identificação e diferenciação dos coccidios das espécies Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora caninum e Cryptosporidium parvum atra- vês da técnica de High Resolution Melting (HRM) / Hllytchaikra Ferraz Fehlberg. – Ilhéus, BA: UESC, 2016. ix, 44f. : il. Orientador: George Rêgo Albuquerque. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Inclui referências.
1. Protozoários – Identificação. 2. Coccidiose. 3. Infecção. 4. Diagnóstico parasitológico. I. Título. CDD 579.4
III
HLLYTCHAIKRA FERRAZ FEHLBERG
IDENTIFICAÇÃOE DIFERENCIAÇÃO DOS COCCIDIOS DAS ESPÉCIES Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona,Neospora caninum e Cryptosporidium
parvum ATRAVÉS DA TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)
Ilhéus – BA, 22/02/2016
___________________________________________________ George Rêgo Albuquerque - D.Sc
UESC/DCAA
____________________________________________________ Carlos Wilson Gomes Lopes – PhD,LD
UFRRJ/DPA
_____________________________________________________ Amauri Arias Wenceslau - D.Sc
UESC/DCAA
_____________________________________________________ Bianca Mendes Maciel - D.Sc
UESC/DCB
ILHÉUS – BA 2016
IV
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Ilário (in memoriam) e Elita pelo amor
incondicional, permitindo - me alcançar essa etapa e aos meus irmãos pelo carinho e
companheirismo.
VI
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por sua graça, amor, dedicação, simplicidade, amizade, alegria e
grandiosidade, estando presente sempre em toda minha vida, desde o meu primeiro
respiro neste mundo até as futuras bênçãos reservadas por ele para o meu futuro.
A meu Pai, Ilário Fehlberg (in memoriam) pela dedicação, pela vontade de que os
meus sonhos crescesse a cada passo dado. Amo-te muito.
A pessoa mais sublime, minha mãe, Elita Ferraz Fehlberg o meu imenso amor por esta
pessoa que me gerou e dedicou inteiramente todos os seus dias me dando amor,
carinho que um filho possa querer. Dedico a você, minha rainha, essa conquista.
VI
Aos meus irmãos, Isley Fehlberg, Ítala Fehlberg, Lula Fehlberg e Ingryd Fehlberg
pelo companheirismo, carinho, atenção, amo vocês.
Aos cunhados queridos, Eric Mello e Sandra Guastti pelo carinho e força nos
momentos que mais precisei.
Aos sobrinhos queridos, amores de minha vida, Amanda G. Fehlberg, Leonardo G.
Fehlberg, Bianca F. Fonseca, Evelyn F. Fonseca e Khalil F. Mello cada momento ao
lado de vocês é sempre uma festa. A tia ama-os muito.
Aos meus amigos, Aísla Nascimento, Clebsom Almeida, Amanda T. S. Lopes, Tainá
Pessoa, Tati Harvey, Aritana Freitas é sempre bom tê-los por perto, me dando
conselhos, carinho, atenção e força.
Aos meus colegas de Laboratório e ribeirinhas, obrigado por fazer parte dessa
conquista e, do bom companheirismo e boas risadas.
Ao meu orientador, George Rêgo Albuquerque que me proporcionou aprendizado,
confiança e atenção em todos os momentos que precisei.
A minha co-orientadora Bianca Mendes Maciel, pelos momentos agradáveis,
ensinamentos e confiança ajudando-me sempre que precisei. Obrigada!
VII
IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DOS COCCIDIOS DAS ESPÉCIES Toxoplasma gondii,Sarcocystis neurona,Neospora caninum e Cryptosporidium
parvum ATRAVÉS DA TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)
RESUMO
Parasitos da classe Coccidia pertencentes ao filo Apicomplexa, são microrganismos
que possuem importância médica e veterinária, a exemplo de Toxoplasma gondii,
Sarcocystis neurona, Neospora caninum e Cryptosporidium parvum. O conhecimento
desses parasitos é de profunda importância, pois estes podem provocar graves danos
aos hospedeiros. Técnicas diagnósticas modernas e cada vez mais precisas são
essenciais para o melhor conhecimento destes parasitos. Objetivou-se com este estudo
padronizar a técnica High Resolution Melting (HRM) para identificação e
diferenciação destes protozoários, através da amplificação do gene 18S do rRNA. As
amostras foram analisadas individualmente, em reações duplex e multiplex. Os
resultados demonstraram que o HRM permitiu identificar e diferenciar as quatro
espécies através da análise das curvas de dissociação, normalização e diferenciação. A
técnica apresentou alta reprodutibilidade inter e intra-experimento, demonstradas pelos
baixos coeficientes de variação (2,2% e 2,0%, respectivamente). Desta forma, a análise
utilizando HRM demonstrou ser discriminatória para estas quatro espécies de
protozoários.
Palavras-chave: Coccidios. Infecção. HRM. Diagnóstico.
VIII
IDENTIFICATION AND DIFFERENTIATION OF SPECIES OF COCCIDIA Toxoplasma gondii,Sarcocystis neurona, Neospora caninum and Cryptosporidium parvum THROUGH HIGH RESOLUTION MELTING (HRM) ANALYSIS
ABSTRACT
Parasites from Coccidia class, belonging to the phylum Apicomplexa, are
microorganisms that have medical and veterinary importance, like Toxoplasma gondii,
Sarcocystis neurona, Neospora caninum and Cryptosporidium parvum. Knowledge of
these parasites is quite important because they can cause serious damage to the hosts.
Modern diagnostic techniques and increasingly accurate are essential for a better
understanding of these parasites. The objective of this study was standardize the High
Resolution Melting (HRM) analysis for identification and differentiation of these
protozoa, by amplifying the 18S rRNA gene. The samples were analyzed individually
in duplex and multiplex reactions. The results showed that the HRM enabled to
identify and differentiate the four species by analysis of the dissociation curves,
normalization and differentiation. The technique showed high reproducibility inter and
intra-experiment demonstrated by low coefficients of variation (2.2% and 2.0%,
respectively). Thus, HRM analysis proved to be discriminatory for these four species
of protozoa.
Keywords: Coccidia. Infection. HRM. Diagnosis.
IX
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 10
2 OBJETIVOS................................................................................................. 12
3 REVISÃO DE LITERATURA................................................................... 13
4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 26
5 RESULTADOS........................................................................................... 28
6 DISCUSSÂO............................................................................................... 35
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................... 37
REFERÊNCIAS.......................................................................................... 38
10
1. INTRODUÇÃO
Vários gêneros de coccidios do filo Apicomplexa apresentam espécies de
grande importância para a saúde pública como Toxoplasma gondii e Cryptosporidium
parvum, e outras espécies de importância exclusivamente veterinária como Neospora
caninum e Sarcocystis neurona, uma vez que podem acometer animais domésticos.
Os parasitos supracitados possuem alta patogenicidade como T. gondii, N.
caninum e S. neurona sendo responsáveis por importantes alterações neurológicas em
animais. Cryptosporidium provoca sérias alterações intestinais, desencadeando uma
síndrome diarreica em humanos e animais, principalmente em indivíduos
imunodeprimidos. Alterações reprodutivas, incluindo abortos são também
consequências de infecções por T. gondii e N. caninum e todos são responsáveis por
óbitos em animais e ou humanos. Mundialmente a prevalência das infecções causadas
por estes protozoários podem ser bem elevadas. No Brasil, há uma distribuição elevada
dessas parasitoses. No entanto, vários locais ainda necessitam de estudos
epidemiológicos no que diz respeito, principalmente a criptosporidiose, considerada
ainda uma doença negligenciada.
Entre as diversas técnicas que podem ser utilizadas para o diagnóstico das
doenças causadas por estes protozoários estão as parasitológicas, corriqueiramente
utilizadas para tal propósito, e as sorológicas, a exemplo da imunofluorescência
indireta, hemaglutinação indireta, Aglutinação Direta Modificada (MAD) e ELISA.
Embora algumas destas técnicas sejam o padrão-ouro para alguns destes parasitas, o
tempo requerido para execução e a sensibilidade e especificidade necessária para o
preciso diagnóstico ainda são um problema a ser superado. As técnicas moleculares
minimizam estes problemas por serem mais sensíveis e específicas, além de poderem
ser executadas em menor tempo. No entanto, a diferenciação de vários coccidios
utilizando a PCR convencional muitas vezes necessita de mais de um par de primer, o
que torna a técnica mais laboriosa.
A High Resolution Melting (HRM) é uma técnica molecular pós PCR em
tempo real qualitativa, sensível e específica que é capaz de identificar e diferenciar
várias espécies de protozoários, permitindo a caracterização genotípica dos mesmos de
forma precisa e em uma única reação, diminuindo o tempo de diagnóstico destas
11
parasitoses. Adicionalmente, apresenta a vantagem de permitir a diferenciação dos
parasitos com a utilização de apenas um par de primer. No entanto, não há relato na
literatura da utilização do gene 18S para tal propósito.
Desta forma, o trabalho tem como propósito a padronização desta técnica,
utilizando o gene rDNA 18S, para identificação e diferenciação dos coccidios
Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora caninum e Cryptosporidium
parvum em amostras provenientes de tecidos e fezes de animais susceptíveis a
infecção, o que possibilitará um diagnóstico mais rápido e com poder discriminatório
em uma única reação.
12
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Padronizar a técnica High Resolution Melting (HRM) para identificação e
diferenciação dos protozoários Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora
caninum e Cryptosporidium parvum através do DNA isolado.
2.2 Objetivos específicos
Identificar os quatro protozoários utilizando o gene rDNA 18S através da
técnica HRM;
Identificar e diferenciar os quatro protozoários pelo ensaio individual,
combinado em duplex e combinado em multiplex;
Avaliar a reprodutibilidade da técnica.
13
3. REVISÃO DE LITERATURA
Biologia geral dos coccidios
A classe Sporozoa, filo Apicomplexa alberga gêneros de coccidios de interesse
médico e veterinário. São parasitas intracelulares obrigatórios com elevada
importância que destroem a célula hospedeira causando doenças, tanto em animais,
quanto em humanos (BOWMAN, 2010; SILVA, 2013). Os coccidios podem
apresentar-se de dois tipos com relação ao ciclo de vida, os monoxenos que parasitam
intestino de uma única espécie, sendo os oocistos excretados pelas fezes, e os
heteroxenos formadores de cistos, nos quais possuem dois hospedeiros, um definitivo
(HD) que eliminam oocistos no ambiente pelas fezes, e os hospedeiros intermediários
(HI) que formam cistos no tecido (FRENKEL; SMITH, 2003).
Biologia de Toxoplasma gondii
É um protozoário que possui elevada importância zoonótica com distribuição
geográfica ampla, pertencente ao reino Protista, filo Apicomplexa, ordem Eimeriorina
e família Toxoplasmatidae (TENTER et al., 2000; DUBEY, 2010; BRASIL, 2010).
Foi identificado inicialmente como Leishmania em 1908 por Charles Nicolle e Louis
Manceaux em seus estudos para pesquisa de leishmaniose em um roedor (Ctenodactus
gundi). Posteriormente, os mesmos autores notaram na morfologiaque se tratava de um
novo agente, nomeando-o Toxoplasma gondii (Toxo - arco; Plasma - vida) (DUBEY,
2010). No Brasil, no mesmo ano, Splendore (1908), também identificou o parasito em
um coelho.
O ciclo de vida heteroxeno foi elucidado somente em 1970, com o
conhecimento sobre os estágios sexuais do parasito no intestino delgado de gatos
(TENTER et al., 2000; DUBEY, 2010). Atualmente, diversos estudos genéticos sobre
a distribuição clonal ou não do parasito estão sendo desenvolvidos, mas já está
evidente que as cepas brasileiras são extremamente diversas e com grande
patogenicidade (PENA et al., 2008; RAJENDRAN et al., 2012; TIAN et al., 2014;
JIANG et al., 2014; BEZERRA et al., 2015; YANG et al., 2015; PARDINI et al.,
2015; CONG et al., 2016).
14
Este protozoário possui o ciclo heteroxeno facultativo, podendo infectar animais
homeotérmicos, como mamíferos e aves, considerados HI (TENTER et al., 2000;
NETTO, et al., 2003) e o gato e outros felídeos como HD (DUBEY; JONES, 2008).
A transmissão ocorre de três formas principais, através da ingestão de oocistos
(esporozoítas) presentes na água ou alimentos contaminados, a ingestão de cistos
(bradizoítas) em carnes ou vísceras mal cozidas (DUBEY et al., 1998; ARAÚJO e
BOSSOLAN, 2006) e transplacentária (taquizoítas). A transmissão congênita
(taquizoítas), a qual pode causar sequelas e, até mesmo, o aborto (COSTA, 2008).
Toxoplasma gondii é um parasito com grande importância na saúde animal e pública,
causando a toxoplasmose, doença em que os animais se destacam por servir de fonte
de infecção direta e indireta para o ser humano (DUBEY et al., 1998; MOURA, 2009;
ALANAZI; ALYOUSIF, 2011).
A toxoplasmose pode apresentar-se como uma doença grave, com alterações
neurológicas, mas, na maioria das vezes é assintomática (HILL et al., 2005; DUBEY,
2010). Os sinais clínicos da doença podem confundir com sintomas da gripe, tais
como: apatia, fadiga, cefaléia, dores musculares e nas articulações, sudorese, febre
intermitente e erupções cutâneas (TENTER et al., 2000; DUBEY, 2010). A infecção
em humanos na maioria das vezes ocorre após o nascimento (TENTER, 2009). No
entanto, uma das problemáticas é a transmissão vertical mãe-feto do parasito, que
durante a gestação poderá levar a uma série de desordens cerebrais, problemas visuais
e morte fetal. As crianças que sobrevivem podem apresentar sinais clínicos como:
hidrocefalia, microcefalia, calcificações em algumas regiões do cérebro como também
retinocoriodite (DUBEY, 2008). Pessoas imunossuprimidas podem desenvolver a
doença de forma grave, considerada uma infecção oportunista. Nesse caso, a depender
da eficiência do sistema imune do indivíduo, os medicamentos para o tratamento da
infecção podem não funcionar, havendo o desencadeamento da fase aguda letal
(DUBEY et al., 2004).
A prevalência da doença pode atingir mais de 70% da população mundial
(BRASL, 2010). O Brasil tem alta taxa de infecção em humanos e animais, com
soroprevalência até quatro vezes maior que nos Estados Unidos (DUBEY et al., 2012).
A ampla ocorrência da doença no Brasil está atrelada a hábitos alimentares e o
15
consumo de carne crua ou mal cozida de bovinos, ovinos e caprinos e torna a ingestão
de bradizoítas, uma das principais vias transmissão para humanos e animais
domésticos carnívoros. A transmissão congênita com o hábito de comer carne explica
algumas formas de transmissão do parasita, mas não a ocorrência de infecção em
vegetarianos e herbívoros (COSTA, 2013). Assim, a contaminação a partir da ingestão
de oocistos desempenha papel importante na infecção da toxoplasmose em seres
humanos e animais (DUBEY; JONES, 2008).
A prevenção da infecção humana, principalmente em crianças, mulheres
grávidas e imunocomprometidos, se faz através da ingestão da carne bem cozida, o
congelamento cárneo a uma temperatura interna de -12 ºC e a boa higienização de
vegetais. Outras formas de prevenção são evitar andar em solos ou areais
contaminados com fezes de gato, a limpeza diária da caixa de areia utilizada por gatos
e, evitar o contato direto, principalmente mulheres grávidas (HILL; DUBEY, 2002;
DUBEY, 2010).
Biologia de Cryptosporidium parvum
Trata-se de um protozoário pertencente ao Filo Apicomplexa, Classe
Sporozoae, Subclasse Coccidia, ordem Eucoccidiia, Subordem Eimeriina e Família
Cryptosporidiae (THOMPSON et al., 2003; PLUTZER; KARANIS, 2009). O gênero
Cryptosporidium foi descrito pela primeira vez por Tyzzer (1910), em camundongos e
denominada C. muris. O mesmo autor no ano de 1912 identificou uma nova espécie no
intestino de camundongo, denominando-o de C. parvum. Após os relatos sobre sua
descoberta, no ano de 1955, já considerado potencial como agente causador de doença,
o primeiro caso de criptosporidiose foi identificado em perus com diarréia e um novo
relato só ocorreu em 1971 em vitelos. Cinco anos após, os primeiros casos em
humanos foram relatados, e a doença começou a ganhar importância mundial
(ABEYWARDENA et al., 2015). Segundo Dillinghan et al. (2002), uma variedade de
espécies são acometidas pelo coccidio, a saber; peixes, répteis, anfíbios, aves e
mamíferos. Cryptosporidium parvum é um parasito intestinal comum de humanos e
animais domésticos (HUNTER; THOMPSON, 2003).
É um parasita monoxeno, realizando os estágios de desenvolvimento sexual e
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assexual no interior de um único hospedeiro (GRECA, 2010). A via de infecção se dá
através da ingestão de oocistos esporulados, a única fase do ciclo encontrado fora do
hospedeiro e importante para disseminação, sobrevivência e infectividade do
protozoário através da água e alimentos contaminados (FAYER et al., 2000;
THOMPSON et al., 2003; FAYER, 2004; LEAL, 2005). Uma vez ocorrendo à
ingestão do oocisto por um hospedeiro susceptível, possui uma predileção ao trato
gastrointestinal liberando em seguida, os quatro esporozoítos que irão invadir e
parasitar as células epiteliais e, posteriormente transformando-se em trofozoítos. Nesta
fase, inicia-se a reprodução assexuada do parasita, no qual ocorre a merogonia ou
esquizogonia dando origem então aos merontes, contendo merozoítas que invadem
novas células e sofrem gametogênese (micro ou macrogametócitos), e após a
fertilização dão origem aos oocistos. Estes tem parede fina e grossa e promovem a
reinfecção ou são liberados pelas fezes, respectivamente (FAYER, 2004; FAYER;
XIAO, 2007).
A classificação através da caracterização genotípica vem permitindo conhecer e
identificar de forma específica o gênero Cryptosporidium. Considerados como
espécies zoonóticas, C. parvum e C. hominis, estão intimamente relacionados a surtos
esporádicos, afetam seres humanos, porém espécies tipicamente de animais também já
foram identificadas em seres humanos, como, C. canis, C. felis, C. andersoni, C.
meleagridis, C. muris e C. suis (GRECA, 2010).
A infecção por C. parvum causa a criptosporidiose (GENNARI et al., 1999),
doença mundialmente conhecida que desencadeia uma gastroenterite aguda após um
período de incubação que varia de dois a 14 dias, pode apresentar-se de quatro formas
em humanos: assintomática, aguda, crônica ou uma enterite intensa e rápida (GRECA,
2010). A forma assintomática é comum na maioria dos mamíferos, aves, répteis e
peixes. A forma severa provoca uma hiperinfecção em pacientes
imunocomprometidos, nesse caso, o paciente pode vir a óbito (BOWMAN, 2010).
Pessoas idosas e crianças com idade de 3 anos estão entre os susceptíveis a
infecção por Cryptosporidium, porém, estudos realizados relataram que crianças são
mais propensas a infecção (FAYER, 2004). No Brasil a transmissão da doença atingiu
19% dos casos em domicílio, tratando-se de criança com desenvolvimento da doença
17
ou soro conversão (DILLINGHAN et al., 2002). Surtos da infecção em creches
também foram relatados (PACHECO, 2013). O Ministério da Saúde em 2011
recomendou a introdução de pesquisas de Cryptosporidium em água potável, no qual
foi observada contaminação ambiental em rios e reservatórios (BRASIL, 2011).
Pesquisas realizadas sobre a prevalência mundial, demonstraram uma taxa de 0 a
44,8% em cães e 0,6 a 15,4% em gatos (GRECA, 2010). Em humanos, a prevalência
chega a 20% dos casos ocorridos em crianças, em pessoas assintomáticas estima-se
uma faixa de 0% a 6,4% em países desenvolvidos e 2,3% a 7,5% nos países em
desenvolvimento. A alta prevalência nos países em desenvolvimento deve-se a falta de
saneamento, instalações, diagnóstico e tratamento (ABEYWARDENA et al., 2015).
Vários produtos terapêuticos são utilizados para o tratamento da criptosporidiose em
humanos, porém, sem grande eficiência. Alguns podem reduzir a intensidade dos
sintomas, a exemplo: a paromomicina, azitromicina e a nitazoxanida (PACHECO,
2013; ABEYWARDENA et al., 2015), outros precisam de doses tóxicas para redução
da multiplicação do parasita (FAYER, 2004).
Biologia de Sarcocystis neurona
É um coccidio intracelular do filo Apicomplexa e família Sarcocystidae. O
gênero foi descrito pela primeira vez em 1882 por Lankester, com base na presença de
cistos em tecido muscular estriado, que, por fim culminou na caracterização do ciclo
evolutivo (LOPES, 2004). O parasito possui como HD duas espécies conhecidas de
gambá, Didelphis virginiana e D. albiventris, e está distribuído em todo continente
americano em função da distribuição do seu HD (ZANATTO et al., 2006;
STELMANN; AMORIM, 2010; ANTONELLO, 2013). Nos estudos realizados por
Dubey et al. (2015), uma gama de vertebrados atuam como HI, entre eles, tatu,
guaximim e lontra do mar, elucidando assim, o HI do parasito.
O hospedeiro definitivo se infecta alimentando-se da musculatura do HI
contendo cistos do Sarcocystis na sua forma infectante (bradizoítos) (RADOSTITIS et
al., 2002). A infecção do HI se dá a partir de alimentos e água contaminados pelas
fezes do HD contendo esporocistos infectantes (RIET-CORREA et al., 2001). Os
equinos são susceptíveis a infecção, os quais são considerados acidentais, terminais e
18
aberrantes do S. neurona, desenvolvendo-se o estágio de esquizonte no sistema
nervoso central (SNC) (RIET-CORREA et al., 2001; DUBEY et al., 2015). Esse
parasito provoca uma infecção neurológica em equino conhecida como
Mieloencefalite Protozoária Equina (MEP) (DUBEY et al., 2001) onde o S. neurona é
o principal agente etiológico (DUBEY et al., 2001; RIET-CORREA et al., 2001;
STANEK et al., 2003; MOURA et al., 2008). Embora outros agentes afetem a parte a
neurológica destes animais, a MEP ainda é a doença mais comum diagnosticada em
equinos nas Américas (DUBEY et al., 2015).
A MEP está distribuída conforme a presença do HD, sendo encontrado nas
Américas (DUBEY et al., 2001; ANTONELLO, 2013). No Brasil, a soropositividade
varia de 35,5% a 69,9% (DUBEY et al., 1999; HOANE et al., 2006). Uma vez
instalada a infecção no SNC os sinais clínicos dependerão da área afeta
(ANTONELLO, 2013). Depressão, paralisia facial, protusão, ataxia, flacidez
(paralisia), atrofia da língua, disfagia, perda de coordenação dos membros e fraqueza
muscular são os mais frequentes. Porém, quando há o envolvimento do telencéfalo,
vários graus de depressão e alterações no comportamento ocorrem. Além disso,
cegueira e diminuição das respostas sensoriais podem se manifestar. (RIET-CORREA
et al., 2001; PEIXOTO, 2003). Com o aparecimento dos sinais clínicos em equinos
com suspeita de MEP, o tratamento utilizando anti-protozoário tais como sulfonamida
e pirimetamina deverão ser imediatos. Drogas como o diclazuril e ponazoril e a
associação dos fármacos sulfadiazina com pirimetamina, foram aprovados para o
tratamento da doença em equinos (DUBEY et al., 2015).
Biologia de Neospora caninum
Protozoário coccidio intracelular do filo Apicomplexa, da família Sarcocystidae
e subfamília Toxoplasmatinae (CAVALCANTE, 2010; PEREIRA; YATSUDA,
2014). No ano de 1984 na Noruega, cães foram diagnosticados com alterações
neurológicas e sinais clínicos semelhantes aos da toxoplasmose. Testes anti-T. gondii
foram realizados e foram negativos e na microscopia eletrônica foram observadas
diferenças ultra-estruturais que o diferenciavam de T. gondii. Assim, em 1988 foi
reconhecido como uma nova espécie, que foi denominada Neospora caninum.
19
(BJERKAS; PRESTHUS 1988; STENLUND, 2000; CAVALCANTE, 2010;
GOODSWEN et al., 2013). Após a caracterização do parasito, houve o isolamento em
tecidos de cães com poliradiculoneurite e polimiosite (DUBEY et al., 1988).
Com o isolamento do agente, métodos de diagnóstico como, sorologia e ensaio
imunohistoquímico foram sendo aperfeiçoados para auxiliar no diagnóstico diferencial
entre por N. caninum e T. gondii, permitindo identificação de N. caninum em uma
grande variedade de animais (LINDSAY; DUBEY, 1989). O primeiro isolado no
Brasil foi relatado em um cão Collie, macho, de 7 anos de idade, com alterações de
incoordenação e paralisia dos membros posteriores (GONDIM et al., 2001).
Embora a infecção por N. caninum tenha sido descoberta no cão, a mesma
assume papel relevante em bovinos, sendo uma das principais causas de abortamento
esporádico, endêmico e epidêmico em propriedades (THURMOND et al., 1997;
WOUDA et al., 1998; SCHARES et al. 2002).
O protozoário possui como hospedeiros definitivos o cão, o coiote, o dingo
australiano e o lobo (McAllister et al., 1998; GONDIM et al., 2004; DUBEY;
SCHARES, 2011). Estas espécies são consideradas disseminadoras do parasito no
meio ambiente, contaminando água e alimentos (DUBEY, 1999). De acordo com
Dubey et al. (2007), espécies de mamíferos como caprinos, ovinos, bovinos e, até
mesmo o cão, atuam como hospedeiros intermediários do parasito. A infecção nesses
animais ocorre através da ingestão de oocistos presentes nas fezes do hospedeiro
definitivo ou pela transmissão vertical mãe-feto (DUBEY, 1999; DUBEY e
SCHARES, 2011).
Neospora caninum é um protozoário cosmopolita, agente etiológico da
neosporose, doença conhecida mundialmente por provocar abortamento e perdas
embrionárias em bovinos (THILSTED; DUBEY 1989; DUBEY; LINDSAY 1996;
SARTOR et al., 2005). A infecção congênita pode provocar morte no útero,
reabsorção, mumificação e fetos autolisados. Adicionalmente, bezerros infectados
podem nascer clinicamente normais, mas persistentemente infectados, disseminando o
agente (TEIXEIRA, 2010; DUBEY; SCHARES, 2011). Dubey et al. (2007)
identificaram N. caninum como causas de abortamentos em 3,1% a 64,5% de bovinos
leiteiros e 18,9% a 79% em bovinos de corte. Nos cães, a maioria dos casos de
20
neosporose é diagnosticada em filhotes, congenitamente infectados. Os sinais clínicos
como paralisia dos membros posteriores e ataxia são observados (DUBEY;
LINDSAY, 1996; STENLUND, 2000).
Se tratando de uma espécie que acomete exclusivamente animais, as perdas
podem resultar em queda da produção, principalmente de leite. A prevalência da
doença em populações de cães e bovinos é diferente entre países e regiões, isto pode
estar relacionada a fatores de risco, prevenção da infecção ou doença. Mundialmente a
soroprevalência em cães varia de 0% a 67,6% e em bovinos de 0,7% a 80,9%. No
Brasil há uma soroprevalência que varia em cães e bovinos de 3,1%a 67,6% e 12,7% a
97,2% respectivamente (DUBEY et al. 2007; DUBEY; SCHARES, 2011).
O controle na introdução de bovinos soropositivos, importante para a
diminuição da transmissão horizontal, como também, o controle do acesso de cães
(HD) são importantes medidas para diminuir a ocorrência da doença nas fazendas
(FORTUNATO et al., 2010).
A utilização de quimioterápicos está sendo investigado experimentalmente em
ratos como medida de reduzir a taxas de infecção da neosporose, porém mais estudos
ainda necessitam ser realizados. Embora muitos obstáculos como persistência do
parasita e uma virulência ainda maior em uma reinfecção causam preocupações, o uso
de vacinas como medidas de controle no rebanho estão sendo avaliados
(GOODSWEN et al., 2013).
Diagnósticos dos coccidios
Parasitológico
É um método convencional muito utilizado na rotina laboratorial para detecção
de estruturas parasitárias por microscopia. O exame parasitológico de fezes (EPF),
assim denominado, é relativamente rápido e de baixo custo (MACHADO et al., 2001).
O objetivo desta técnica é identificar parasitos como helmintos e protozoários,
visualizando as formas evolutivas. Nesse caso é importante ressaltar que, para uma boa
detecção e identificação do parasita, o material deve ser coletado e armazenado
adequadamente. A conservação da amostra, principalmente para preservar a
21
morfologia dos protozoários, é primordial e dentre os conservantes os mais usados são
o Mertiolato-iodo-formaldeído (MIF), o fixador de schaudinn, o acetato de sódio-
ácido-acético-formaldeído (SAF) e a formalina (solução de formaldeído) (SOUZA,
2005). A Técnica de flutuação, desenvolvida em 1938 por Faust e colaboradores, foi
desenvolvida para facilitar na alta concentração de ovos de helmintos, larvas e cistos
de protozoários, diminuindo também, os debris fecais existentes (GARCIA, 2005;
BOWMAN, 2010).
Dentre as técnicas coproparasitológicas para detecção de Cryptosporidium, o
diagnóstico por coloração usando alcool-ácido resistência, como a técnica de Ziehl-
Neelsen, é muito usada em função do tamanho do oocisto na rotina laboratorial. O
estudo realizado por Garcia (2005) demonstra a utilização da coloração Hematoxilina
Férrica de Faust (1937) para visualização morfológica dos protozoários. Outras
técnicas usando coloração compreendem o Verde Malaquita, Giemsa, Auramina e
Safranina (PACHECO, 2013).A identificação de protozoários utilizando o teste
IDEXX SNAP, que detecta antígenos na parede cística do coccídeo em amostras
fecais, está sendo uma rotina nos laboratórios. A cultura para esporulação de oocistos é
uma técnica rotineira em centros de pesquisas e laboratórios (BOWMAN, 2010).
Porém técnicas mais avançadas estão sendo utilizadas para detecção dos protozoários
de importância médica e veterinária.
Sorologia
Testes sorológicos representam a base de diagnósticos para detecção de
infecções de vários parasitos, seja na fase aguda ou progressiva e para diagnóstico dos
coccidios algumas são utilizadas, como exemplificados abaixo:
A Reação de Imunoflorescência Indireta (RIFI) está entre os testes sorológicos
corriqueiramente utilizados em pesquisa médica para identificação de anticorpos de
parasitos em casos isolados ou em estudos epidemiológicos. Este teste requer para sua
elaboração soro e adição de anti-espécie marcada com imunoglobulina. A
Hemaglutinação indireta (HAI) é um teste prático e de baixo custo, possuindo
sensibilidade e praticidade na execução, sendo um método adequado para
levantamento epidemiológico e as titulações encontradas englobam frações de
22
imunoglobulinas IgG e IgM. Outros testes sorológicos incluem a Aglutinação Direta
Modificada (MAD) e ELISA. A primeira utilizada para detecção apenas de anticorpo
IgG e necessita da adição do mercaptoetanol para destruir a imunoglobulina IgM,
evitando falsas reações. Já a Elisa é uma técnica imunoenzimática que se baseia na
interação antígeno-anticorpo para detecção de anticorpos específicos e cuja
intensidade da cor desenvolvida na reação é proporcional à concentração do anticorpo
na amostra (DUBEY, 2001; THOMPSON et al., 2003; SOUZA, 2005; CAMOSSI et
al., 2010; STELMANN; AMORIM, 2010; DUBEY, 2010; BRAGA et al., 2011;
DUBEY, 2011; ALANAZI; ALYOUSIF, 2011).
Métodos sorológicos como Western Blot, ou ensaio de imunotransferência,
utilizado para detecção de anticorpos, é uma técnica sensível e específica que reage
com antígeno do parasita através de uma membrana de poliacrilamida. É considerado
um ensaio trabalhoso que requer tempo para execução e facilidade para interpretação
dos resultados (DUBEY, 2010; DUBEY et al., 2015).
Diagnóstico Molecular
As técnicas de biologia molecular fornecem informações valiosas além das
oferecidas pela microscopia ou técnicas imunológicas (PACHECO, 2013). No
diagnóstico molecular, a PCR convencional é um método utilizado para rastreio de
organismos, sendo uma análise qualitativa, sensível e específica. Embora seja um teste
rápido, a contaminação cruzada ainda é um grande problema na rotina (DUBEY, 2010;
NOLAN et al., 2013). Nested-PCR é considerado um método sensível, no qual se usa
o produto amplificado da primeira reação da PCR (amplicon) para se realizar uma
segunda reação utilizando iniciadores secundários que amplificará uma sequência
menor que a sequência da primeira reação. Assim, a técnica torna-se mais sensível e
específica para o agente de interesse (GRECA, 2010). As técnicas de PCR citadas são
qualitativas, não quantificando o DNA na amostra analisada. Para este propósito, a
PCR quantitativa (qPCR) em tempo real é utilizada, conseguindo-se analisar e
quantificar a sequência alvo de interesse. É um método que elimina possíveis fontes de
contaminação, não possui pós-manipulação. Vários estudos com essa técnica estão
sendo realizados em virtude da sua eficiência e confiabilidade (FONTAINE;
23
GUILLOT, 2002; RESCHL et al., 2003; GUIGUET LEAL et al., 2011; LADEIRO et
al., 2014).
High Resolution Melting (HRM)
High Resolution Melting (HRM) é uma tecnologia de diagnóstico molecular
pós-PCR em tempo real (DWIGHT et al., 2014) que está sendo utilizada para detectar
diversas doenças infecciosas. Essa técnica consiste em um método rápido, eficaz de
análise, sensível e específica que utiliza uma curva de dissociação de alta resolução
que permite identificar variações em sequências de ácidos nucléicos a partir da
amplificação e dissociação da cadeia simples de DNA (TALMI-FRANK et al., 2010),
sendo a curva de melting o perfil resultante expresso a partir da fluorescência emitida
pela dissociação da fita de DNA. Estudos descritos por Cho et al. (2008) e Steer et al.
(2009) demonstraram a precisão da técnica, sendo esta menos cara quando comparada
com propostas alternativas que utilizem, por exemplo, sondas marcadas.
Esta técnica é considerada uma alternativa viável na detecção de mutações no
DNA genômico, na epidemiologia, na detecção microbiana, assim como na
determinação de espécies, como utilizado para investigação de T. gondii por Costa et
al. (2011). Neste estudo os autores conseguiram distinguir três linhagens de T. gondii,
tipo I, II e III através da técnica HRM investigando o polimorfismo de nucleotídeo
único (SNP) do gene B1. Eles mostraram que esta técnica foi mais informativa que a
análise usando cinco marcadores microssatélites.
No estudo realizado por Krypuy et al. (2007), foi verificado por HRM a
ocorrência de mutações no gene que codifica a P53 (TP53) em amostras tumorais,
estando presente em mais de 50 dos casos de cancros humanos. Neste estudo foi feito
uma comparação do resultado com os submetidos ao sequenciamento e foi
demonstrado que cada mutação detectada pela técnica foi no exon correto ao obtido no
sequenciamento. Outra pesquisa realizada em tumores clínicos utilizando a técnica
fez-se importante, devido sua sensibilidade em detectar proporções baixas de células
tumorais e alelos mutantes, uma vez que, o sequenciamento convencional possui
sensibilidade limitada (DO; DOBROVIC, 2009).
24
Outro estudo realizado por Pangasa et al. (2009), teve como finalidade avaliar
as diferentes espécies de Cryptosporidium utilizando um segundo espaçador transcrito
(ITS-2) de DNA ribossomal nuclear e o marcador genético. Os resultados pelo perfil
de fusão foram através da análise da variabilidade inter e intra-ensaio. Ao fim do
experimento, foi concluído que a HRM conseguiu detectar as três espécies em estudo.
Um estudo comparando as técnicas HRM e a cromatografia desnaturante
líquida (dHPLC) foi realizado por Aguirre-Lamban et al. (2010). Cinquenta e oito
pacientes espanhóis com mutações no gene ABCA4 foram submetidos ao estudo. Nos
resultados, as técnicas evidenciaram 18 genótipos diferentes em 20 amostras e, destas,
19 foram identificadas corretamente por HRM e 16/20 por dHPLC. A HRM se
mostrou sensível em detectar alteração de sequência homozigoto. Este trabalho
demonstrou que a HRM é uma técnica com maior sensibilidade e especificidade
quando comparada com o outro método.
A investigação no estudo de Santos et al. (2013) foi realizada para diferenciar
várias espécies do gênero Echinococcus. Foram utilizadas amostras isoladas de
Echinococcus de bovinos, pacas, cutia, como também amostras de Taenia hydatigena
a partir de porco. A região de interesse para amplificação foi o fragmento 444pb do
gene COX1. Os resultados foram expressos com duas abordagens: a primeira
utilizando a HRM demostraram um perfil específico para cada espécie, embora
algumas tivessem temperaturas semelhantes; a outra com base na análise com
Sybrgreen, que diferenciou as temperaturas entre as espécies E. granulosus, E. ortlepp
e entre E. vogeli e E. oligharthra. O trabalho concluiu que a técnica HRM permitiu
diferenciar espécies de Echinococcus e também permitiu a amplificação da Taenia e
pode ser usada como diagnóstico para outras espécies da família.
Um estudo realizado na Turquia com mariscos comestíveis utilizando HRM
demonstrou uma positividade significativa de protozoários T. gondi (9,4%) e
Cyclospora cayetanensis (6,4%) e para ambos de 3,8%. A utilização da técnica HRM
permitiu determinar o genótipo dos protozoários através das temperaturas e agrupou as
amostras pelas variantes da sequência (AKSOY et al., 2014).
A identificação das sete espécies de Eimeria de galinhas foi utilizado pela
análise HRM em estudos realizados por Kirkpatrick et al. (2015). A técnica utilizou
25
para amplificação um segundo espaçador transcrito (ITS-2) de DNA ribossomal
nuclear para diferenciar as espécies em estudo. Os resultados foram comparados com a
técnica anterior descrita utilizando eletroforese capilar. A HRM avaliou o grau de
impureza das amostras, identificando e caracterizando as sete espécies e ainda,
permitindo verificar a mais dominante, após misturas proporcionais em multiplex.
Assim, a HRM é uma técnica sensível que fornece informações valiosas para as
mais diversas aplicações, dentre as quais, detecção de mutações, genotipagem e
detecção e diferenciação de diferentes patógenos.
26
4. Material e Métodos
Cepas de protozoários e extração de DNA
Cepas dos protozoários Toxoplasma gondii (Cepa RH, CTG, PTG), Sarcocystis
neurona (Cepa 37R), Neospora caninum (Cepa NcBa) e Cryptosporidium parvum
(Isolados 13O, 13F, 13B), foram utilizadas para padronização da técnica HRM. As
mesmas foram provenientes do Laboratório de Parasitologia Veterinária da
Universidade Estadual de Santa Cruz, Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses nos
Animais (LDPA) da Universidade Federal da Bahia e do Laboratório de Análises
Clínicas (LAC) da Universidade Estadual de Feira de Santana. Os DNA’s dos
parasitos foram extraídos utilizando o kit EasyDNA (Invitrogen), conforme instruções
do fabricante, quantificados em NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA), diluídos
para 20 ng/µL, e armazenados à -20ºC.
Desenho dos Primers
Os primers forward 5’-GTTGTTGCAGTTAAAAAGCTGGT-3’ e reverse 5’-
ATCTAAGAATTTCACCTCTGACAGT-3’ foram desenhados através do software
Primer Express v3.0 (Applied Biosystems), utilizando como molde sequências do
gene do RNA ribossomal 18S de diferentes coccidios, disponíveis no banco de dados
do GenBank, tais como T. gondii (EF472967.1), S. neurona (AF176945), N. caninum
(U16159.1), C. parvum (AF093494.1). O alvo de amplificação por estes primers foram
regiões de aproximadamente 320 pb, contendo regiões conservadas que flanqueiam
sítios de variabilidade genética entre os diferentes protozoários.
Reação em Cadeia de Polimerase – PCR
Inicialmente, uma PCR convencional foi realizada utilizando o DNA genômico
de cada protozoário e os mesmos iniciadores desenhados A corrida foi realizada no
termociclador Proflex PCR system (Applied Biosystems). O ensaio foi desenvolvido
com uma mistura contendo 5 µl do DNA de cada protozoário e acrescido de 45 µl de
uma mistura de 0,2 mM de cada primer, 0,2mM de dNTP (Invitrogen), 1x Tris HCl,
2,5mM MgCl2 e 2 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), totalizando 50µL. As
condições para amplificação do DNA do parasito foi realizada em 40 ciclos nas
seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos; 40 ciclos a 95ºC por
15 segundos, 60ºC por 1 minuto, 95ºC por 10 segundos, com um tempo de extensão de
27
10 minuto a 72°C. Os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel de
agarose 1%, e corados com sybr safe DNA (life tecchnologies). Posteriormente o
produto foi purificado utilizando o kit PureLink® Genomic DNA (Invitrogen),
quantificados em NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) e diluídos a 20 ng/µL
para posterior utilização no ensaio HRM.
Análise por HRM
As análises por PCR-HRM foram realizadas na plataforma Applied Biosystems
7500 Fast a partir das amostras de DNA genômico dos coccidios. Os ensaios foram
realizados de forma individual (contendo DNA de uma única espécie de protozoário),
em duplex (contendo DNA de duas espécies de protozoários em cada reação: T. gondii
+ N. caninum; T.gondii + S. neurona; T.gondii + C. parvum; N. caninum + S.
neurona; N. caninum + C. parvum; S. neurona + C. parvum) e em multiplex
(contendo DNA dos quatro parasitos em cada reação). Para o ensaio, foi utilizado o kit
MeltDoctorTM HRM Master Mix (Applied Biosystems, USA) em um volume final de
20µL contendo 1X MeltdoctorTM HRM Master Mix, 0,3µM de cada par de primer e
40ng/µL DNA genômico ou 40ng/µL do produto da amplificação. As amplificações
ocorreram nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos; 40
ciclos a 95ºC por 15 segundos, 60ºC por 1 minuto. Uma curva de dissociação de 95ºC
por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto, 95ºC por 30 segundos, 60ºC por 15 segundos foi
realizada ao final de cada reação. As reações foram analisadas através do software
3.0.1 HRM avaliando as diferenças nos picos das temperaturas (Tm) e formas das
curvas de dissociação, gerando três tipos de gráficos representados pelas curvas de
dissociação, normalização e diferenciação.
Reprodutibilidade da HRM
A reprodutibilidade intra e inter-experimentos foi avaliada através do cálculo
das médias, desvio padrão e coeficiente de variação dos picos de Tm. Para avaliar a
reprodutibilidade intra-experimento, a mesma amostra foi analisada três vezes na
mesma corrida. A variação inter-experimentos foi avaliada por seis corridas diferentes,
incluindo duas repetições de uma mesma amostra.
Experimento cego
28
O experimento de HRM foi realizado nas mesmas condições, de forma que não
houvesse conhecimento do DNA genômico a ser identificado por um avaliador
externo. Após a corrida de HRM, o avaliador identificou o protozoário em questão a
partir da comparação com as curvas de dissociação, normalização e diferenciação
produzidas com as amostras controle. O ensaio cego foi realizado a partir das reações
individuais, duplex e multiplex com o DNA genômico dos coccidios na mesma
corrida.
Sequenciamento do produto da amplificação do gene 18S
Uma PCR convencional utilizando o mesmo ciclo de amplificação descrito
acima foi realizada, contendo 0,2 mM de cada primer (descritos neste estudo), 0,2mM
de dNTP (Invitrogen), tampão para PCR 1X (Invitrogen), 2,5 mM MgCl2 e 2 U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen), 20 ng de DNA, em um volume final de 25 µL. Os
produtos da amplificação (aproximadamente 320 pb) de cada protozoário foram
purificados com o kit PureLink® Genomic DNA (Invitrogen) e enviados para Ludwig
Biotec (Rio Grande do Sul, Brasil) para o sequenciamento. O sequenciamento foi
realizado na plataforma ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) em
ambas as direções em duplicata. Os cromatogramas foram analisados através do
software Phred. As sequências foram montadas em contigs utilizando o programa
CAP3, alinhadas com o ClustalW (versão 1.83), corrigidas manualmente utilizando o
BioEdit Sequence Alignment Editor. As sequências foram comparadas entre si,
visando a observação de sítios de variabilidade genética nos produtos da amplificação
do gene do rDNA 18S pelos primers descritos neste estudo.
5. Resultados
HRM
As curvas de dissociação apresentaram formatos e picos de Tms características
de cada ensaio (individual ou combinado), com um, dois ou três picos de Tms,
dependendo do parasito (Tabela 1). Os padrões das curvas de dissociação,
normalização e diferenciação (Figura 1) foram consistentes para cada espécie estudada
e distinguíveis, tanto nos ensaios individuais quanto nos combinados (Figura 2 e 3).
29
Não ocorreu diferença entre as análises por HRM dos produtos purificados da
amplificação do gene rDNA 18S com as análises utilizando o DNA genômico de cada
protozoário.
As curvas de dissociação, normalização e diferenciação das cepas de T. gondii
(RH, PTG, CTG) foram idênticas, assim como as dos isolados de C. parvum (13O,
13B e 13F)
Tanto os testes de reprodutibilidade inter e intra-experimentos apresentaram um
coeficiente de variação (CV) baixos, menores que 2,2 e 2%, respectivamente (Tabela
1), sendo considerados estatisticamente significativos, demonstrando alta
reprodutibilidade da técnica.
Tabela 1- Reprodutibilidade intra e interexperimento da análise por HRM.
Reprodutibilidade Intraexperimento Reprodutibilidade Interexperimento
Análise Protozoário Tm 1 Tm 2 Tm3 Tm1 Tm2 Tm3
Individual
T. gondii 79,85 (± 0,64) CV=0,8%
__ __ 79,50 (±1,30) CV 1,6% __ __
N. caninum 79,35 (±1.34) CV= 1,7% __ __
79,16 (± 1,47) CV= 1,9% __ __
S. neurona 78,15 (±1.34) CV= 1,7%
81,00 (±1,27) CV= 1,6% __
78,03 (± 1,28) CV=1,6%
80,79 (± 1,38) CV= 2% __
C. parvum 78,65 (±1.34) CV= 1,7%
85,7 (±1,27) CV= 1,5%
85,15 (± 1,34) CV= 1,6%
76,03 (±1,33) CV=1,8
80,74 (± 1,33) CV= 2%
84,78(±1,33) CV= 2%
Combinada
T. gondii + N. caninum
78,75 (±1,34) CV= 1,7% __ __
78,91 (±1,36) CV= 1,7% __ __
T. gondii + S. neurona
79,05 (±1,77) CV= 2,2% __ __
78,9 (±1,38) CV= 1,7% __ __
T. gondii + C. parvum.
78,55 (±1,34) CV= 1,7%
85,4 (±1,27) CV= 1,5% __
78,95 (±1,27) CV=1,6%
83,5 (±1,27) CV= 2% __
N. caninum + S. neurona
76,8 (±1,27) CV= 1,7%
79,4 (±1,27) CV= 1,6% __
76,49 (±1,29) CV= 1,7%
80,03 (±1,27) CV= 2% __
N. caninum + C. parvum
78,6 (±1,70) CV= 2,2%
85,3 (±1,27) CV=1,55 __
78,85 (±1,38) CV= 1,7%
85,38 (±1,45) CV= 2% __
S. neurona + C. parvum
78,05 (±1,48) CV= 1,9%
80,55(±1,20) CV= 1,5% __
77,85 (±1,45) CV= 1,9%
81,76 (±1,26) CV= 2% __
Multiplex
T. gondii + N.
caninum + S
neurona + C.
74,1 (± 1,27) CV= 1,7%
79,8 (±1,27) CV= 1,6% __ 75,9 (±1,48)
CV= 2% 81,6 (±1,27) CV= 2% __
30
aMédia entre triplicatas; b Média entre experimentos; Tm = Temperatura de dissociação; CV = Coeficiente de variação
parvum
31
Figura 1- Curvas de Dissociação (A), Normalização (B) e Diferenciação (C) do DNA
individual analisadas por HRM.
A
B
C
32
Figura 2- Curva de dissociação (Esquerda), normalização (direita) e o ensaio em duplex (A)
T. gondii e N. caninum; (B) T. gondii e S. neurona; (C) T. gondii e C. parvum; (D) N.
caninum e S. neurona; (E) N. caninum e C. parvum; (F) S. neurona e C. parvum.
33
Experimento cego
O avaliador externo foi capaz de identificar e diferenciar o DNA gênomico em
todos os ensaios (individual, duplex e multiplex) através das curvas de dissociação,
normalização e diferenciação, comparando com as curvas produzidas pelas amostras
controle, demonstrando confiabilidade da técnica.
PCR
Após purificação, a reação foi realizada nas mesmas condições e as análises
verificadas expressaram-se semelhantemente não havendo diferença nas curvas,
permitindo realizar a técnica diretamente pelo DNA extraído, sem a precisão da
purificação pós-PCR.
Sequenciamento das Amostras
Os produtos da amplificação pelos primers descritos neste estudo apresentou
um total de 35 sítios de polimorfismos entre os protozoários, conforme demonstrado
pelo sequenciamento. Três sítios de polimorfismos de base única (SNPs) foram
observados diferenciando C. parvum de S. neurona; e um único SNP foi observado em
N. caninum diferenciando este protozoário de T. gondii (Tabela 2).
34
Tabela 2: Sítios de polimorfismos do18S rDNA detectados pelo sequenciamento.
Posição do nucleotídeo
Protozoário
25
47
92
93
109
136
175
176
183
184
186
187
188
191
192
189
195
209
210
211
213
216
217
218
219
221
222
226
234
257
259
260
285
287
298
Sarcocystis neurona (Cepa 37R) G T A A G A C G A C G C T C A G A A T G T C A C C A T G C A A A G T G
Cryptosporidium parvum (Cepa 13O) M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M . M
Toxoplasma gondii (Cepa RH) . C G G A G A A G A A A A - - A C T G . G - - - - T C A T - T G . A .
Neospora caninum (Cepa NcBa) . C G G A G A A G A A A A - - A C T G A G - - - - T C A T - T G . A .
M= A+C
35
6. Discussão
Este é o primeiro estudo de identificação e diferenciação dos protozoários
Toxoplasma gondii, Cryptosporiridium parvum, Sarcocystis neurona e Neospora
caninum utilizando um único par de primers para o gene rDNA 18S. Estudo com curvas
de dissociação por HRM para detecção dos parasitos T. gondii (COSTA, et al. 2011;
AKSOY, et al., 2014) e C. parvum (PANGASA et al., 2009) já foram realizados mas não
foram encontrados artigos utilizando HRM para detecção de N. caninum e S. neurona.
No presente estudo, todas as amostras de T. gondii (Tipo I, tipo II e tipo III) foram
identificadas pela curva de dissociação em um único pico (Tm= 79,85). Isto demonstra
que o par de primer em questão amplifica uma região comum de T. gondii, não
diferenciando as linhagens, o que confere alta especificidade para a identificação deste
protozoário. A variabilidade individual no ensaio inter e intra-experimento foi menor que
2,0% (Tabela 1), demonstrando que a técnica é altamente reprodutível para T. gondii. A
diferenciação de genótipos de T. gondii já foi realizada por HRM no estudo de Costa et
al. (2011) utilizando mais de um par de primers do gene B1, no qual observaram que a
HRM possui boa discriminação das principais linhagens quando comparada àquelas
observadas com o uso de cinco marcadores microssatélites. Aksoy et al. (2014) também
determinaram pela HRM o genótipo do tipo I do protozoário em isolados de mariscos
comestíveis a partir da amplificação do gene B1, utilizando os primers ToxB-41f e
ToxB-169r, embora a região de interesse tenha amplificado só um tipo de linhagem,
havendo necessidade de mais estudos.
Todos os isolados de C. parvum (13O, 13B, 13F) foram identificados pela análise
HRM como sendo iguais. As curvas de dissociação para C. parvum foram identificadas
em três picos (Tm1= 78,65; Tm2=85,7; Tm3=85,15) e todas as linhagens obtiveram picos
semelhantes. No estudo de Pangasa et al. (2009), que identificaram três espécies C.
hominis, C. meleagrides e C. parvum a partir da amplificação da sequência alvo ITS-2
em amostras fecais suspeitas de criptosporidiose, apenas um pico foi apresentada na
curva de dissociação para C. parvum (Tm=72,17), diferente do encontrado neste estudo
com três picos (Figura 1-A), de fato, a utilização de um gene diferente pode influenciar
nas diferenças dos picos apresentados. Os ensaios inter e intra-experimentos (Tabela 1)
no presente estudo foram menores do que os resultados encontrados nos estudos de
36
Pangasa et al. (2009), demonstrando alta reprodutibilidade da técnica para detecção do
gênero Cryptosporidium com base no gene rDNA 18S.
Sarcocystis neurona e N. caninum foram identificados com curvas características
distinguíveis (Figura 1-A). N. caninum obteve um único pico (Tm=79,35) semelhante ao
de T gondii (Tm=79,85). No entanto, as curvas de diferenciação (Figura 1-C) e
normalização (Figura 2) conseguiram diferenciar estes protozoários. Através do
sequenciamento. foi observado apenas um SNP na posição 211 (Tabela 2) do fragmento
amplificado que diferencia N. caninum de T. gondii, demonstrando alta sensibilidade da
técnica de HRM para diferenciação deste protozoários. O protozoário S. neurona
apresentou-se na curva de dissociação com dois picos (Tm1=78,15; Tm2= 81,0),
diferenciando-o dos outros parasitos. Três SNPs foram observados diferenciando S.
neurona de C. parvum.
Estudos na literatura para identificação e diferenciação destes protozoários
utilizando HRM através do gene 18S em uma única reação ainda não foram relatados.
Estes resultados são pioneiros e mostraram que a técnica é sensível, confiável e
reprodutível quando utilizada em amostras de fezes e tecidos suspeitas de conterem estes
coccidios.
37
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo demonstrou que a análise HRM, com a utilização do gene rDNA 18S,
mostrou-se adequada para identificar com poder discriminatório os quatro protozoários T.
gondii, C. parvum, S. neurona, N. caninum em amostras de fezes e tecidos suspeitas por
estes coccídios.
A High Resolution Melting (HRM) foi uma técnica sensível, específica e provou
ser confiável no diagnóstico destes parasitos em uma única reação com um único par de
primers, possuindo menor tempo de execução e facilidade na leitura dos resultados.
Ainda, a técnica é aplicável com alta reprodutibilidade para identificação e diferenciação
destes biogentes sendo um diagnóstico promissor.
A utilização destes protozoários no estudo deve-se pela importância na saúde
animal e pública, acarretando em sérios problemas, podendo ocasionar no animal ou no
ser humano sequelas ou até mesmo levá-los a morte. Assim, o conhecimento
epidemiológico para identificação destes parasitos e dos seus hospedeiros torna-se
importante em razão da sua alta patogenicidade com que eles infectam animais e seres
humanos.
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