UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

MATEUS ENDRINGER CALIMAN

ASPECTOS ECOLÓGICOS E TAXONÔMICOS DE Prillieuxina winteriana (ASTERINACEAE) E SUA INTERAÇÃO COM Annona muricata

ILHÉUS – BAHIA 2015

MATEUS ENDRINGER CALIMAN

ASPECTOS ECOLÓGICOS E TAXONÔMICOS DE Prillieuxina winteriana (ASTERINACEAE) E SUA INTERAÇÃO COM Annona muricata

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal à Universidade Estadual de Santa Cruz. Área de concentração: Proteção de Plantas Orientador: Prof. José Luiz Bezerra Co-orientador: Prof. Jadergudson Pereira

ILHÉUS – BAHIA 2015

MATEUS ENDRINGER CALIMAN

ASPECTOS ECOLÓGICOS E TAXONÔMICOS DE Prillieuxina winteriana (ASTERINACEAE) E SUA INTERAÇÃO COM Annona muricata

Ilhéus, 22/07/2015

_________________________________________ José Luiz Bezerra

Biólogo – Doutor em Fitopatologia UESC

(Orientador)

_________________________________________ Edna Dora Martins Newman Luz

Engenheira Agrônoma – Doutora em Fitopatologia Fiscal Federal Agropecuário (CEPLAC)

_________________________________________ Nadja Santos Vitória

Doutora em Biologia de Fungos – UFPE

Aos meus pais Gelson e Zilda pela confiança depositada. Aos meus orientadores

José Luiz Bezerra e Jadergudson Pereira pelos ensinamentos. A todos que

participaram direta ou indiretamente desta jornada intelectual.

Dedico

AGRADECIMENTOS

À Deus, acima de tudo, por ter me permitido concluir esta importante etapa de

minha vida.

Aos meus pais, Gelson Caliman e Zilda Endringer Caliman; aos meus irmãos,

Higor Endringer Caliman e André Luiz Aquino; à minha prima, Camila Caliman, e a

todos os meus familiares pelo companheirismo e incentivo.

Ao meu orientador Dr. José Luiz Bezerra; ao meu Co-orientador Jadergudson

Pereira, pela paciência, confiança, auxílio e valiosos ensinamentos.

À Dra. Delmira da Costa Silva pela colaboração prestada.

À equipe e amigos de Laboratório de Diversidade de Fungos, em especial à

Isabela, Giselle, Silvia, Tacila e Francis, pela ajuda e amizade construída nesses

anos de convívio.

Aos meus amigos, Jairo, Luiz, Taleyrand (Tal), Riosney (Ney), Gil Flávio (Jhoy),

Daniel, Jean e Marcieli, pela compreensão, ajuda e incentivo.

Aos amigos que fiz durante esses anos de UESC, Leyde, Tayla, Laís, Bruna,

Gedeon, Vinícius, Marcos e Rafael, pela ajuda durante a graduação e mestrado.

Muito obrigado!

vi

ASPECTOS ECOLÓGICOS E TAXONÔMICOS DE Prillieuxina winteriana (ASTERINACEAE) E SUA INTERAÇÃO COM Annona muricata

RESUMO

A graviola (Annona muricata), fruta originária da América Central, encontrou no Brasil as condições edafoclimáticas ideais para o seu desenvolvimento. A Bahia, principal estado produtor, atualmente possui uma área plantada de aproximadamente 1500 ha, e em 2014, comercializou com o estado de São Paulo cerca de 370 toneladas de frutas in natura. Mesmo com esta importância socioeconômica que a graviola exerce na Bahia, pouco se sabe sobre as principais doenças que causam danos a essa cultura. Dentre estas doenças, a mancha foliar causada pelo fungo Prillieuxina winteriana é de suma importância, por ser encontrada em praticamente 100% das plantações da Bahia, ocasionando diferentes graus de desfolhamento da planta. Este trabalho teve como objetivos: i) estudar os aspectos ecológicos e fitopatológicos de P. winteriana em áreas cultivadas de A. muricata na Bahia; ii) estudar a interação patógeno-hospedeiro; iii) aprofundar o conhecimento da taxonomia e sistemática da espécie Prillieuxina winteriana. Para a realização dos estudos morfológicos, anatômicos e interativos do fungo, foram feitas coletas em cinco municípios, durante as estações chuvosas e secas nos anos 2014–2015. Materiais provenientes do herbário URM da Universidade Federal de Pernambuco, identificados como P. winteriana, também foram examinados. Experimentos de inoculação com folhas destacadas e mudas de gravioleira foram conduzidos em laboratório, casa de vegetação e campo. Os estudos de caracterização morfológica permitiram observar detalhadamente picnotírios, micélio

externo, hipostroma, conídios e conidiogênese. Os picnotírios tiveram uma variação

no diâmetro de 125 a 212,5 μm, os picnotiriósporos variaram de 20–37,5 × 15–22,5

μm. Nos municípios de Una, Cruz das Almas e Wenceslau Guimarães, observou-se alto grau de infecção, diferentemente dos municípios de Vitória da Conquista e Presidente Tancredo Neves. Em praticamente todos os espécimes estudados, provenientes da Bahia e do URM, constatou-se um micoparasita identificado como Eriocercospora e também foi observada uma alga fitopatogênica denominada Cephaleuros virescens. A partir dos experimentos realizados, tanto em folhas destacadas quanto em mudas de graviola, foi possível observar o início da infecção (germinação, produção de tubos germinativos, apressórios, penetração e colonização) e desenvolvimento do micélio superficial com primórdios de conidiomas. Do início da infecção até a maturação dos conidiomas transcorreram, aproximadamente, quatro meses. O fungo penetra através dos estômatos ou diretamente através da cutícula, por meio de tubos de penetração saídos dos apressórios. A colonização intracelular tem início em uma célula epidérmica seguida da invasão das células adjacentes até comprometer todas as células da epiderme foliar e parte do parênquima paliçádico. A colonização superficial ocorre através de hifas que dão origem aos primórdios de conidiomas. Os testes histoquímicos realizados demonstraram o acúmulo de lipídios totais, proteínas, compostos fenólicos e alcaloides no tecido foliar. Foi possível comprovar a patogenicidade de P. winteriana sobre A. muricata por meio de testes de inoculação. Apenas o morfo assexual (Leprieurina winteriana) foi constatado nas coletas efetuadas.

Palavras-chave: Morfo assexual. Fungo biotrófico. Fungo foliícola. Testes de fitopatogenicidade.

vii

ECOLOGICAL AND TAXONOMY ASPECTS OF Prillieuxina winteriana (ASTERINACEAE) AND THEIR INTERACTION WITH Annona muricata

ABSTRACT

The soursop plant (Annona muricata) originated in Central America, met the ideal soil and weather conditions for its development in Brazil. Currently, its main producing region is the Northeast of Brazil and Bahia is the largest producing state, having a planted area of approximately 1500 ha. In 2014, the state of São Paulo imported about 370 tons of fresh fruits, mostly from southern Bahia. Even with this socio-economic importance that the soursop exerts for the Brazilian Northeast, little is known about the diseases that cause damages to this crop. Among these diseases, leaf spot caused by the fungus Prillieuxina winteriana is of paramount importance, being found in virtually 100% of the Bahia plantations, causing varying degrees of defoliation. This work aimed to study the ecological and phytopathological aspects of P. winteriana in cultivated areas of A. muricata in Bahia, as well as its host-pathogen interaction. In addition, it was attempted to deepen the knowledge of taxonomy and systematics of the species P. winteriana. For the morphological, anatomical and plant pathogen interaction studies, collections were made in five municipalities during the rainy and dry seasons in the years 2014-2015. Inoculations experiments with soursop detached leaves and seedlings were conducted in the Laboratory of Fungal Diversity (CEPLAC/CEPEC) and the Microscopy Center, greenhouse and campus field (UESC). Studies on morphological characterization allowed the detailed observation of pycnothyria, mycelia, hipostroma, conidia and conidiogenesis. In the municipalities of Una, Cruz das Almas and Wenceslau Guimarães, Bahia, a high degree of infection was observed, unlike Vitoria da Conquista and President Tancredo Neves municipalities where disease incidence was low. From the experiments, both with detached leaves and seedlings, the onset of infection (germination, production of germ tubes, appressoria, penetration and colonization) was observed, as well, the development of the superficial mycelium and pycnothyria. From infection until the maturation of pycnothyria it took approximately four months. The fungus penetrates through stomata or directly through the cuticle. The intracellular colonization begins in an epidermal cell and extends to adjacent cells committing all leaf epidermis and part of the palisade parenchyma. The surface colonization occurs through superficial hyphae that give origin the pycnothyria. The histochemical tests showed the accumulation of total lipids, proteins, phenolic and alkaloids in the infected leaf tissue. It was possible to prove the pathogenicity of P. winteriana on A. muricata by inoculation tests. Only the asexual morph (Leprieurina winteriana) was found in all collected material.

Keywords: Morpho assexual. Biotrophic fungi. Foliícola fungi. Fitopatogenicidade tests.

LISTA DE FIGURAS

1 Municípios onde se realizaram as coletas................................................. 15

2 Prillieuxina winteriana em Annona muricata.............................................. 19

3 Eriocercospora sp. micoparasitando P. winteriana.................................... 23

4 Cephaleuros virescens sobre folhas de graviola parasitadas por P.

winteriana...................................................................................................

24

1 Testes de patogenicidade.......................................................................... 33

2 Ciclo de vida de Prillieuxina winteriana...................................................... 35

3 Experimento conduzido em laboratório e em casa de vegetação............. 37

4 Sinais de P. winteriana em folhas de A. muricata, quatro meses após a

inoculação..................................................................................................

39

5 Prillieuxina winteriana em folha de Annona muricata..................... 40

6 Micrografias em microscopia de luz evidenciando a colonização

intracelular de P. winteriana.......................................................................

41

7 Eletromicrografias em MEV de colônias superficiais de P. winteriana..... 42

8 Caracterização histoquímica da folha infectada de Anonna

muricata......................................................................................................

45

LISTA DE TABELAS

1 Datas de coleta e coordenadas geográficas dos

municípios.....................................................................................................

15

2 Biometria de P. winteriana em folhas de gravioleira coletadas em cinco

municípios do Estado da Bahia....................................................................

20

3 Dimensões de conídios e picnotírios de P. winteriana em exsicatas do

URM, provenientes de diferentes localidades..............................................

20

1 Testes histoquímicos realizados em folha de Annona

muricata........................................................................................................

32

2 Testes histoquímicos realizados na folha infectada de Annona muricata. 44

SUMÁRIO

RESUMO.............................................................................................. vi

ABSTRACT.......................................................................................... vii

1 INTRODUÇÃO...................................................................................... 1

2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................ 2

2.1 Aspectos gerais sobre a cultura da gravioleira..................................... 2

2.2 Principais doenças da graviola no Brasil.............................................. 3

2.2.1 Doenças causadas por fungos............................................................. 4

2.3 Prillieuxina winteriana (anamorfo = Leprieurina winteriana) ................ 6

2.4 Referências bibliográficas..................................................................... 8

3 CAPÍTULO 1......................................................................................... 11

RESUMO.............................................................................................. 11

ABSTRACT.......................................................................................... 12

3.1 Introdução............................................................................................. 13

3.2 Material e métodos............................................................................... 14

3.2.1 Caracterização morfológica de P. winteriana....................................... 16

3.2.2 Secagem e armazenamento do material coletado............................... 16

3.2.3 Análise Anatômica................................................................................ 16

3.2.4 Análise em Microscopia Eletrônica de Varredura................................. 17

3.3 Resultados e discussão........................................................................ 17

3.4 Conclusão............................................................................................. 25

3.5 Referências bibliográficas..................................................................... 26

4 CAPÍTULO 2......................................................................................... 28

RESUMO.............................................................................................. 28

ABSTRACT.......................................................................................... 29

4.1 Introdução............................................................................................. 30

4.2 Material e Métodos............................................................................... 31

4.2.1 Localização, época da coleta, acondicionamento e transporte............ 31

4.2.2 Análise histopatológica.......................................................................... 31

4.2.2.1 Análise anatômica e Análise em Microscopia Eletrônica de Varredura 31

4.2.2.2 Testes Histoquímicos............................................................................ 31

4.2.2.3 Infecções natural e artificial em folhas de gravioleira............................ 32

4.2.2.3.1 Obtenção da suspensão através de estruturas reprodutivas do

patógeno...............................................................................................

32

4.2.2.3.2 Observação de folhas destacadas naturalmente infectadas em

campo e inoculadas em laboratório.......................................................

32

4.2.2.3.3 Testes de patogenicidade em mudas.................................................... 33

4.3 Resultados e discussão......................................................................... 34

4.3.1 Testes histoquímicos............................................................................. 42

4.4 Conclusão.............................................................................................. 46

4.5 Referências Bibliográficas..................................................................... 47

5 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................... 49

1

1 INTRODUÇÃO

A região sul da Bahia ganhou destaque na agricultura nacional e

internacional, na década de 90, após o aparecimento da Vassoura de Bruxa do

Cacaueiro, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-

Mora que acarretou o declínio da cacauicultura na Bahia, levando muitos produtores

à falência (LUZ et al., 1997).

Devido a este fato, houve necessidade, por parte dos produtores, em buscar

novas alternativas para substituir a renda que o cacau lhe proporcionava. Deste

modo, a cultura da graviola (Annona muricata L.) começou a ganhar destaque no

cenário regional, por ser uma planta de clima tropical, encontrando na região

condições ideais para o seu desenvolvimento (SOBRINHO, 2010).

A graviola tem se destacado nacionalmente, sendo o Nordeste a região com

maior produção (SOBRINHO, 2010). Lemos (2014) cita que a gravioleira é

considerada a segunda anonácea em área cultivada e em produção no Brasil,

perdendo apenas para a pinheira (Annona squamosa L.). Em 2006, a produção

brasileira atingiu 5,5 mil toneladas de frutos, sendo que 80% desse total foram

produzidos na região Nordeste.

A cultura da gravioleira é bastante suscetível a doenças. Cardoso et al. (2011)

e Junqueira e Junqueira (2014) afirmam que a graviola é infectada por diferentes

tipo de patógenos, tendo como principais agentes etiológicos os fungos. Dentre

estas doenças, uma que está presente em praticamente todas as plantações é a

mancha foliar causada pelo fungo Prillieuxina winteriana (Pazschke) G. Arnaud

(=Leprieurina winteriana G. Arnauld). Pouco se sabe sobre a patogênese desse

fungo em relação à graviola e há necessidade de estudos mais aprofundados sobre

a interação deste patógeno com o hospedeiro.

O objetivo deste trabalho foi estudar os aspectos ecológicos e fitopatológicos

de P. winteriana em áreas cultivadas de A. muricata na Bahia, bem como esclarecer

a interação patógeno-hospedeiro e aprofundar o conhecimento da taxonomia e

sistemática deste fungo.

2

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Aspectos gerais sobre a cultura da gravioleira

A gravioleira (Annona muricata), espécie pertencente à família

ANNONACEAE, tem como centro de origem a América Central e norte da América

do Sul, sendo considerada a mais tropical das anonáceas (RAMOS et al., 2001;

JUNQUEIRA et al., 2002). É encontrada na natureza tanto na forma silvestre como

em regiões cultivadas do Sudeste do México ao Brasil (MORTON, 1966), bem como

em regiões tropicais e subtropicais da Europa, Ásia, África, Nova Zelândia e

Austrália (RAMOS et al., 2001; SACRAMENTO et al., 2009).

Os colonizadores espanhóis foram os primeiros a difundir a graviola para

outras regiões da América Tropical e do mundo (século XVI). No Brasil foi

introduzida pelos colonizadores portugueses, também no século XVI, sendo

cultivada, no início, em pequena escala, para consumo próprio (SÁNCHEZ, 2011).

Vilasboas (2012) reporta que esta cultura pode ser encontrada desde o Norte do

país até o Estado de São Paulo. A Bahia é o principal produtor, seguido de

Pernambuco e Alagoas.

Lemos (2014) estima que a área de graviola plantada e georreferenciada no

sul da Bahia é de cerca de 1.300 ha, podendo ultrapassar os 1.500 ha após o

georreferenciamento de todos os pomares do estado, sendo este incremento da

área plantada consequência das boas condições edafoclimáticas.

A família ANNONACEAE engloba frutíferas de importância econômica em

diversos países da América Central, Caribe e América do Sul, sendo Brasil,

Venezuela, Costa Rica e Porto Rico, os maiores produtores (SOBRINHO, 2010;

SÁNCHEZ, 2011).

Segundo Figueiredo et al. (2013) a gravioleira tem sua produção destinada

principalmente à agroindústria, onde é utilizada na fabricação de suco, sorvete,

compotas e doces cristalizados. De acordo com Lemos (2014), a gravioleira é

considerada a segunda anonácea em área cultivada e em produção no Brasil,

perdendo apenas para a pinheira. O mesmo autor cita que em 2006, a produção

brasileira atingiu 5,5 mil toneladas de frutos, sendo que 80% desse total foram

produzidos no Nordeste. A região Norte destaca-se como segunda produtora,

embora com produção cinco vezes menor do que o Nordeste.

3

Lemos (2014) relata que algumas espécies de ANNONACEAE tem

despertado grande interesse no mercado internacional de frutas in natura,

particularmente algumas variedades de cherimoia (Annona cherimola Mill.), pinha e

atemoia, híbrido de A. cherimola x A. squamosa. O mercado de frutas processadas

exige espécies com maior teor de acidez e tem na graviola seu principal

representante no grupo das annonas.

No Sudeste, o principal centro de comercialização de graviola fresca é São

Paulo, onde foram negociadas 346 toneladas em 2012, 381 toneladas em 2013 e

373 toneladas em 2014, sendo que mais de 80 % dos frutos são provenientes de

municípios baianos (CONAB, 2015).

De acordo com Bittencourt et al. (2007), ANNONACEAE tem mais de 40

gêneros, sendo que, somente Annona, apresenta mais de 118 espécies (108 na

América Tropical e 10 na África Tropical), das quais apenas 13 são consumidas.

Maas et al.(2015) cita que no Brasil existem 29 gêneros com cerca de 392 espécies,

sendo algumas de importância econômica. Dentre as espécies de maior importância

comercial, destacam-se: graviola, pinha, cherimoia e atemoia.

O interesse na exploração e na exportação da graviola é recente, entretanto,

a crescente demanda por sua polpa a torna uma fruta de excelente valor comercial

(JUNQUEIRA et al., 2000; JUNQUEIRA et al., 2002).

Nogueira et al. (2005) consideram que a escassez de levantamentos

sistemáticos sobre a produção de graviola, pelos órgãos oficiais, dificulta uma

análise mais atualizada da participação dessa fruta no agronegócio brasileiro, mas

permite visualizar um cenário promissor para essa cultura no mercado interno.

2.2 Principais doenças da graviola no Brasil

Segundo Cardoso et al. (2011), com o declínio de extensos pomares que

produziam e processavam polpa de graviola, houve necessidade de adquirir frutos

de pequenos produtores, ocasionando o abandono de grandes áreas produtoras, o

que favoreceu a ocorrência de severas epidemias e surtos de doenças e pragas,

menos prováveis de ocorrer em pequenos pomares melhores manejados.

De acordo com Cardoso et al. (2011) a ocorrência de doenças representa

uma significativa fonte de redução da produção, da qualidade comercial do produto e

da longevidade produtiva dos pomares de anonáceas no Nordeste brasileiro.

4

Junqueira e Junqueira (2014) mostram que várias doenças podem afetar as folhas,

ramos, raízes, flores e frutos da gravioleira, ateira, atemoleira e cherimoleira em

diferentes etapas de seu desenvolvimento, e que as doenças de maior importância

no Brasil são causadas por fungos durante o florescimento e a frutificação.

As principais doenças que afetam a gravioleira são: antracnose, mancha foliar

de grovesinia pyramidalys, cancro depressivo ou cancrose da gravioleira, murcha de

phytophthora, mancha de cercospora, mancha zonada, mancha foliar de phyllosticta,

podridão seca dos frutos e ramos, podridão de raízes, podridão parda dos frutos,

podridão preta dos frutos e mancha foliar (CARDOSO et al., 2011; JUNQUEIRA e

JUNQUEIRA, 2014).

2.2.1 Doenças da gravioleira causadas por fungos

A antracnose (Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc.), ou

podridão negra dos frutos, é considerada a doença mais importante das anonáceas,

podendo provocar entre 50 a 70% de perdas de frutos quando ocorrem chuvas

prolongadas durante a floração e formação destes. Esta doença ocorre em todos os

países onde são cultivadas anonáceas, a qual ataca folhas, brotações novas, flores

e frutos de qualquer idade, causando a morte de ramos, enxerto e queda de frutos e

flores (JUNQUEIRA et al., 2000; CARDOSO et al., 2011; JUNQUEIRA e

JUNQUEIRA, 2014).

A mancha foliar de grovisinia, causada pelo fungo Grovesinia pyramidalis

M.N. Cline, J.L. Crane & S.D. Cline, causa, nas folhas, lesões circulares, irregulares,

castanho cinza com margens escuras de até 1 cm de largura, provocando o

desfolhamento de plantas da graviola (BEZERRA et al., 2008).

O cancro depressivo ou cancrose da gravioleira (Phomopsis sp. ou

Lasiodiplodia theobromae (Patouillard) Griffon & Maublanc) afeta plantas de todas as

idades, mas é mais frequente e mais severa em plantas com menos de três anos de

idade. Entre as doenças que atacam tronco, raízes, ramos ou folhas, a cancrose é a

que causa maiores danos econômicos (JUNQUEIRA e JUNQUEIRA, 2014;

JUNQUEIRA et al., 2000).

A murcha de phytophthora (Phytophthora sp.) é disseminada nos Estados de

São Paulo, Goiás, Minas Gerais e Distrito Federal. Os sintomas iniciais da doença

5

manifestam-se na forma de uma discreta descoloração das folhas que assumem

uma coloração verde clara, perdem o brilho e, em seguida, tornam-se cloróticas. As

folhas mortas permanecem presas à planta. Na parte subterrânea, as raízes exibem

sintomas de necrose e escurecem (JUNQUEIRA e JUNQUEIRA, 2014).

A mancha de cercospora é casada pelos fungos Pseudocercospora anonae

Muller & Chupp e Pseudocercospora annonae-squamosae Braun & Castañeda. O

primeiro causa sintomas característicos, que são manchas angulares, nitidamente

seguindo as nervuras foliares, isoladas, às vezes coalescentes, com 2 a 15 mm de

diâmetro, com o centro cinza claro e circundadas por um estreito contorno marrom.

Pseudocercospora annonae-squamosae incita a formação de manchas necróticas

nitidamente arredondadas, de coloração castanha, quase sempre circundada por um

halo marrom tênue (CARDOSO et al., 2011).

A mancha zonada (Sclerotium coffeicola Stah e S. rolfsii Rolfs) tem como

sintoma inicial uma pequena mancha circular, de coloração cinza, com 1 a 2 mm de

diâmetro, a qual aumenta gradativamente de tamanho, passando a exibir círculos

concêntricos castanhos com até 2 mm de largura (CARDOSO et al., 2011).

A mancha foliar de phyllosticta (Phyllosticta capitalensis (Pazschke) Arn.

(teleomorfo = Guignardia endophyllicola Okane, Nakagiri & Tad. Ito) provoca uma

necrose superficial dos tecidos da folha causando uma mancha circular marrom-

escura que eventualmente coalesce, cobrindo quase todo o limbo foliar, visível

somente na face inferior das folhas (CARDOSO et al., 2011).

A podridão seca do fruto e ramos (Lasiodiplodia theobromae (Patouillard)

Griffon & Maublanc), ataca frutos de qualquer idade, tronco, ramos, ponteiros e

mudas, mas são nos frutos e nas flores que se registram os maiores prejuízos

(JUNQUEIRA e JUNQUEIRA, 2014; JUNQUEIRA et al., 2000).

A podridão de raízes (Rhizoctonia solani J.G. Kühn, Pythium sp.,

Phytophthora spp., Cylindrocladium clavatum Hodges & L.C. May), pode aparecer

em mudas de qualquer idade, provocando a podridão total ou parcial das raízes. Sua

incidência e severidade são favorecidas pelo excesso de umidade no solo e

temperatura em torno de 22 °C (JUNQUEIRA e JUNQUEIRA, 2014; JUNQUEIRA et

al., 2000).

A podridão parda dos frutos da gravioleira (Rhizopus stolonifer (Ehrenb.)

Vuill), afeta flores e frutos de qualquer idade, porém ocorre com mais frequência nas

fases de colheita e pós-colheita. Os sintomas são iniciados a partir do pedúnculo,

6

local de penetração do fungo, ou a partir de perfurações causadas por brocas

(JUNQUEIRA e JUNQUEIRA, 2014; JUNQUEIRA et al., 2000).

A mancha foliar (Prilieuxina winteriana (Pazschke) Arn) é caracterizada por

manchas circulares de coloração marrom-escura com 1 a 2 mm de diâmetro que

aparecem nas folhas. As lesões podem coalescer e cobrir significativa área do limbo

foliar, sendo comum uma intensa queda prematura de folhas em algumas plantas.

Tanto as folhas novas como as maduras podem ser atacadas, sendo as localizadas

na parte inferior da copa as mais afetadas. Na superfície do limbo foliar, o fungo

desenvolve suas frutificações que, ao amadurecer, liberam conídios que irão infectar

outras plantas (CARDOSO et al., 2011).

2.3 Prillieuxina winteriana (Pazschke) G. Arnaud (anamorfo = Leprieurina

winteriana G. Arnauld)

Prillieuxina winteriana pertence à família Asterinaceae, que compreende

fungos biotróficos habitantes de folhas vivas, raramente se desenvolvendo em outra

parte da planta, com um alto grau de especificidade quanto ao hospedeiro. Os

ascomas (tiriotécios), de paredes radiadas, desenvolvem-se sob o micélio superficial

muitas vezes ligado a um hipostroma epidermal (HOFMANN, 2009; HOFMANN e

PIEPENBRING, 2011; FIRMINO, 2013; HONGSANAN et al., 2014).

O ciclo de vida de um fungo Asterinaceae começa quando um ascósporo

maduro adere à superfície da folha do hospedeiro. Os esporos haploides

desenvolvem apressórios que penetram a cutícula e célula epidérmica, com a

formação de haustórios, para absorção de nutrientes, também formando hifas

superficiais geralmente com apressórios laterais para o estabelecimento das

colônias na superfície foliar, predominantemente na face adaxial, onde são

encontrados ascomas e picnidiomas tiriotecióides (HOFMANN, 2009; HONGSANAN

et al., 2014).

São fungos foliícolas, encontrados em plantas tropicais que apresentam

sintomas característicos, como textura superficial marrom escuro, ascoma radial e

de forma variável ligado a micélio geralmente hifopodiado (com apressório).

Dependendo do gênero, o ascoma pode ser circular, linear ou irregular,

apresentando fendas irregulares, longitudinais ou estelares. Os ascos são

bitunicados, clavados, obovóides ou ovóides a quase esféricos, contendo até oito

7

ascósporos uniseptados, podendo estes apresentar, algumas vezes, múltiplos

septos, com forma cilíndrica-elipsoidal a elipsoidal, sendo inicialmente incolores e

posteriormente tornando-se marrons (INÁCIO et al., 2008).

Prillieuxina é causador de infecções de coloração escura na superfície das

folhas de diversos hospedeiros. Este fungo possui micélio superficial marrom sem

apressórios, mas com um hipostroma intra-epidermal. Os ascos são globosos e,

como em outros Asterinaceae, desenvolvem-se verticalmente dentro do ascoma

(GAUTAM, 2015).

O morfo assexual (anamorfo), descrito como Leprieurina winteriana,

apresenta picnotírios superficiais, circulares, escuros, radiados com deiscência

central em forma de estrela, hifas superficiais sem apressórios e hipostroma

intraepidermal semelhante ao do morfo sexual. É mais comum encontrar a fase

assexuada infectando o hospedeiro (ARNAUD, 1918; HOFMANN, 2009; HOFMANN

e PIEPEBRING, 2011; HONGSANAN et al., 2014).

Prillieuxina winteriana foi relatada na República Dominicana, Haiti, Jamaica,

Honduras, Panamá, Brasil, Colômbia e Equador (HOFMANN, 2009). O tipo foi

coletado em Annona sp. no Brasil e descrito por Arnaud (1918). Atualmente há

registros da ocorrência de P. winteriana no Amazonas, Minas Gerais, São Paulo,

Santa Catarina, Maranhão e Bahia (BEZERRA et al., 1967; BEZERRA et al., 2000;

HOFMANN, 2009).

8

2.4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARNAUD, G. 1918. Les Astérinées. Ann Écol Nat Agric Montpellier 16(1– 4):127. BEZERRA, J. L.; LUZ, E. D. M. N.; GRAMACHO, K. P.; FIGUEIRÊDO, V. R.; BEZERRA, K. M. T. Occurrence of Grovesinia pyramidalis on soursop and avocado in Brazil. Plant Pathology (2008) 57, 380. BEZERRA, J. L.; BASTOS, C.N.; LUZ, E.D.M.N. Queda foliar da graviola (Anona muricata) causada pelo fungo Prilieuxina winteriana (Loculoascomycetes, Dothideales). Fitopatologia Brasileira v. 25, suplemento, p. 359, 2000.

BEZERRA, J.L.; BATISTA, A.C.; POROCA, D.J.M.; SANTOS, W.F.; CAVALCANTE, W.A.. Fungos fitopatógenos foliícolas de essências florestais, do noroeste do Maranhão. Atas do Instituto de Micologia. Universidade Federal de Pernambuco, Recife. 1967. BITTENCOURT, M. A. L.; SOBRINHO, C. C. M.; PEREIRA, M. J. B. Biologia, danos e táticas de controle da broca-da-polpa das anonáceas. Bahia agrícola, v.8, n.1, novembro 2007. CARDOSO, J. E.; MARTINS, M. V. V; VIANA, F. M. P. Identificação e Monitoramento de Doenças na Produção Integrada da Gravioleira. Embrapa Agroindústria Tropical. Fortaleza, CE, 2011. CONAB. Companhia Nacional de Abastecimento. Programa Brasileiro de Modernização do Mercado Hortigranjeiro. Disponível em: http://dw.prohort.conab.gov.br/pentaho/Prohort. Acesso em: 26 jun. 2015. FIGUEIREDO, G. R. G.; VILASBOAS, F. S.; OLIVEIRA, S. J. R.; SODRÉ, G. A.; SACRAMENTO, C. K. Propagação da gravioleira por miniestaquia. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal –SP, v.35, n.3, p. 860-865, Setembro 2013. FIRMINO, A. L. New Taxa and Phylogenetic Placement of Asterinales from Brazil. 2013. 80 p. Dissertação de mestrado. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, Minas gerais, 2013.

GAUTAM A. K. Prillieuxina aeglicola sp. nov. (ascomycota), a new black mildew fungus from Himachal Pradesh, India. Current Research in Environmental & Applied Mycology 5(1), 70–73, Doi 10.5943/cream/5/1/9. 2015. HOFMANN, T.A., PIEPENBRING, M. Biodiversity of Asterina species on Neotropical host plants: new species and records from Panama. Mycologia, v. 103, n. 6, pp. 1284–1301, 2011. HOFMANN, T. A. Plant parasitic Asterinaceae and Microthyriaceae from the Neotropics (Panama). Dissertação para o grau de Doutor em Ciências. Alemanha. 2009.

9

INÁCIO, C. A.; SANTOS, D. F.; DIANESE J. C. Some members of Asterinaceae (Ascomycota) from parque nacional, Brasília. IX Simpósio Nacional Cerrado. Universidade de Brasília, Departamento de Fitopatologia. Brasília – DF. 2008. JUNQUEIRA, N. T.V. & JUNQUEIRA, K. P. Principais doenças de Anonáceas no Brasil: descrição e controle. Revista Brasileira de Fruticultura. vol.36. no.spe1. Jaboticabal. 2014. JUNQUEIRA, K. P.; VALE, M. R.; PIO, R.; RAMOS, J. D. Cultura da Gravioleira. Lavras: Ufla, 2002 (Boletim de Extensão). Disponível em: <http://www.editora.ufla.br/BolExtensao/pdfBE/bol_28.pdf> Acesso em: 25/06/2015. JUNQUEIRA, N. T. V.; OLIVEIRA, M. A. S.; RAMOS, V. H. V.; PINTO, A. C. Q.; ICUMA, I. M. Controle de doenças da gravioleira no Cerrado. Comunicado Técnico, Número 31. Embrapa. 2000. LEMOS, E. E. P. A produção de anonáceas no Brasil. Revista Brasileira de Fruticultura. vol.36. no.spe1. Jaboticabal 2014. LUZ, E. D. M. N.; BEZERRA, J. L.; OLIVEIRA, M. L.; RESENDE, M. L. V. Doenças do cacaueiro. In: Vale, F. X. R. & Zambolim, L. (Eds.) Controle de Doenças de Planta: grandes culturas. Viçosa. Imprensa Universitária. pp. 611-655.1997. MAAS, P.; LOBÃO, A.; RAINER, H. Annonaceae in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB110219>. Acesso em: 25 jul. 2015 MORTON, J. F. The Soursop of guanábana (Annona muricata L.) Proceedings of the Florida State Horticultural Society. v. 79, p. 355-366, 1966. NOGUEIRA, E. A.; MELLO, N. T. C.; MAIA, M. L. Produção e comercialização de anonáceas em São Paulo e Brasil. Informações Econômicas, São Paulo, v. 35, n. 2, fev. 2005. RAMOS, V. H. V.; PINTO, A. C. Q.; RODRIGUES, A. A. Introdução e importância socioeconômica. In: OLIVEIRA, M. A. S. (ed.). Graviola. Produção: aspectos técnicos. Embrapa Cerrados (Planaltina, DF) Brasília: Embrapa Informação Tecnológica. 2001. p. 9. (Frutas do Brasil; 15). SACRAMENTO, C. K.; MOURA, J. I. L.; COELHO JUNIOR, E. Graviola. In: SANTOS-SEREJO, J. A. et al. (eds.). Fruticultura tropical: espécies regionais e exóticas. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2009. p. 95-132. SÁNCHEZ, S. E. M. Cacau e Graviola: descrição e dados das Principais Pragas-de-insetos. Editus, 2011, Ilhéus, Bahia. SOBRINHO, R. B. Potencial de exploração de anonáceas no Nordeste do Brasil. EMBRAPA Agroindústria Tropical, Fortaleza. 2010.

10

VILASBOAS, F. S. Polinização e proteção de frutos de gravioleira no Estado da Bahia. 2012. 62 f. Dissertação de mestrado (Mestrado em Agronomia). Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia-UESB. Vitória da Conquista – BA. 2012.

11

3 CAPÍTULO 1

TAXONOMIA E DISTRIBUIÇÃO DE Prillieuxina winteriana EM POMARES DE GRAVIOLEIRA NA BAHIA

RESUMO

A família Asterinaceae possui uma grande diversidade de espécies parasitas

de diversas plantas. Existem muitos gêneros nesta família entre os quais encontra-se o gênero Prillieuxina cuja espécie tipo denomina-se P. winteriana. Devido à escassez de trabalhos taxonômicos sobre P. winteniana no Brasil, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a taxonomia do patógeno com base em caracteres morfométricos e fazer um levantamento da frequência de ocorrência do patógeno em pomares de graviola em cinco municípios da Bahia. Para a caracterização morfológica, estruturas de valor taxonômico foram mensuradas compreendendo: i) diâmetro dos picnotírios; ii) largura das hifas; iii) largura e comprimento dos picnotiriósporos. Apenas o morfo assexual do fungo foi detectado em todas as coletas, havendo pouca variação morfométrica das suas estruturas,

onde os picnotírios tiveram uma variação no diâmetro de 125–212,5 μm e os

picnotiriósporos variaram de 20–37,5 μm de comprimento e de 15–22,5 μm de

largura. As coletas foram realizadas em cinco municípios do Estado da Bahia: Una, Cruz das Almas, Presidente Tancredo Neves, Vitória da Conquista e Wenceslau Guimarães. Houve maior ocorrência da doença nos municípios de Una, Cruz das Almas e Wenceslau Guimarães, e menor ocorrência nos munícipios de Vitória da Conquista e Presidente Tancredo Neves. Constatou-se a presença comum do micoparasita Eriocercospora sp. sobre as colônias de P. winteriana. A alga fitopatogênica, Cephaleuros virescens foi assinalada com frequência nas folhas de gravioleira associada com P. winteriana.

12

TAXONOMY AND DISTRIBUTION OF Prillieuxina winteriana IN SOURSOP ORCHARDS IN THE BAHIA

ABSTRACT

The Asterinaceae family has a large number of species parasitic on different plants. There are many genera in this family among which is the genus Prillieuxina with the type species P. winteriana. Due to the lack of taxonomical researches on P. winteriana in Brazil, this study was conducted to confirm the morphological characters of this species in the material collected during this study. For morphometric studies the following structures were measured: i) diameter of pycnothyria; ii) width of the hyphae; iii) width and length of pycnothyriospores. Sampling was carried out in five municipalities in the state of Bahia: Una, Cruz das Almas, President Tancredo Neves, Vitória da Conquista and Wenceslau Guimarães. There was a higher incidence of the disease in the municipalities of Una, Cruz das Almas and Wenceslau Guimarães, and lower incidence in Vitória da Conquista and President Tancredo Neves municipalities. Only the asexual morph of the fungus was detected in all samples with little morphometric variation of its structures: pycnothyria had a variation of 125–212,5 μm in diameter, and the pycnothyriospores varied from 20–37,5 μm long and from 15–22,5 μm broad. It was found the common presence of the mycoparasite Eriocercospora sp. over the colonies of P. winteriana. The phytopathogenic alga Cephaleuros virescens was encountered frequently on soursop leaves in association with P. winteriana.

13

3.1 INTRODUÇÃO

Asterinaceae (Asterinales, Ascomycota) é uma família que possui grande

diversidade de espécies que infectam folhas de inúmeras plantas hospedeiras. No

Brasil, os trabalhos mais relevantes sobre esta família foram realizados por Batista e

colaboradores (SILVA e MINTER, 1995). Asterinaceae apresenta muitos marcadores

morfológicos que possibilitam agrupar suas espécies em diferentes gêneros.

Inácio et al. (2008) relatam que fungos Asterinaceae apresentam ascomas

característicos, com parede superior radiada, marrom escuro, de forma variável,

desenvolvidos sob um micélio superficial, geralmente hifopodiado. Dependendo do

gênero, o ascoma pode ser circular, linear ou irregular, apresentando deiscência por

fendas irregulares, longitudinais ou estelares. Os ascos são bitunicados, clavados,

obovóides ou ovóides a quase esféricos, contendo até oito ascósporos uniseptados,

podendo estes apresentar, algumas vezes, múltiplos septos, com forma cilíndrica-

elipsoidal a elipsoidal, sendo inicialmente incolores e, posteriormente, tornando-se

marrons.

Dentre os diversos gêneros desta família, Prillieuxina possui 80 espécies

listadas (MYCOBANK, 2015), tendo como espécie tipo P. winteriana (anamorfo =

Leprieurina winteriana) (ARNAUD, 1918; STEVENS; RYAN, 1939). Quem primeiro

se referiu a esta espécie foi Pazschke em 1892, como Asterina winteriana. Theissen

(1912) transferiu-a, erroneamente, para Asterinella. Asterina anonicola foi

estabelecida por Paul Hennings (HENNINGS, 1902), mas Arnaud (1918) considerou-

a sinônimo de P. winteriana. As espécies Aulographum juruanum Henn. e Asterinella

puyana Petr. foram consieradas por Hofmann (2009) como sinônimos de P.

winteriana, com base no exame dos materiais tipo.

De acordo com Hofmann (2009) P. winteriana forma colônias na face adaxial

da folha, onde são encontrados ascomas tiriotecióides. Este fungo é caracterizado

por um micélio superficial marrom sem apressórios (hifopódios), mas com um

hipostroma intra-epidermal. Os ascos são globosos e, como em outros Asterinaceae,

desenvolvem-se verticalmente dentro do ascoma. O anamorfo apresenta conídios

(picnotiriósporos).

Atualmente, o uso da biologia molecular, com a extração e sequenciamento

de DNA, tem contribuído de forma significativa para a compreensão das relações

filogenéticas entre as diferentes espécies fúngicas, possibilitando o desenvolvimento

14

de uma classificação natural. Guatimosim et al. (2015) relatam que apenas as

características morfológicas não são uma real base para a classificação filogenética.

GUARRO et al. (1999) consideram que alguns taxonomistas encontram dificuldade

em selecionar caracteres morfológicos que realmente definam uma determinada

espécie ou gênero.

Hofmann (2009) afirma que estudos moleculares aplicados à Asterinaceae

são muito raros, por serem organismos biotróficos, isto é, não é possível cultivá-los

em meio de cultura artificialmente. Este é um dos motivos da dificuldade de não

existirem informações genéticas sobre P. winteriana, embora Guatimosim et al.

(2015) tenham realizado o sequenciamento de P. baccharidincola (Rehm) Petr.,

utilizando o marcador LSU, confirmando o seu posicionamento em Asterinaceae.

Pouco se conhece sobre a frequência de ocorrência de P. winteriana em

plantações na Bahia e no Brasil. Este fato decorre da falta de estudos sobre tal

patógeno.

O objetivo deste trabalho foi aprofundar o conhecimento morfológico,

ecológico e taxonômico de P. winteriana e estudar a sua frequência em pomares de

cinco municípios do Estado da Bahia produtores de graviola.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

As coletas foram realizadas nos municípios baianos de Una, Tancredo Neves,

Wenceslau Guimarães, Cruz das Almas e Vitória da Conquista. Os locais foram

selecionados devido ao destaque que esses municípios exercem na produção da

cultura e por apresentarem variações edafoclimáticas entre si. Materiais

provenientes do Herbário URM, Universidade Federal de Pernambuco, identificados

como P. winteriana, foram também examinados.

As áreas selecionadas são mostradas na Figura 1 e na Tabela 1.

15

Figura 1 – Municípios onde se realizaram as coletas.

Tabela 1 – Datas de coleta e coordenadas geográficas dos municípios.

Cidade Datas Latitude Longitude Altitu

de

Una 30/07/2014 e

09/02/2015

15°17’36” S 39°04’31” W 28m

Cruz das Almas 07/08/2014 e

28/01/2015

12°40’12” S 39°06’07” W 220m

Vitoria da Conquista 28/08/2014 e

02/02/2015

14°53.361’ S 40°48.031’ W 870m

Wenceslau Guimarães 25/11/2014 e

06/02/2015

13°41’13” S 39°28’46” W 178m

Tancredo Neves 25/11/2014 e

03/03/2015

13°27’14” S 39°25’15” W 150m

Foram realizadas duas coletas distribuídas entre estações chuvosas (julho,

agosto e novembro de 2014) e secas (janeiro e fevereiro de 2015). No campo foram

16

coletadas folhas infectadas, diretamente dos ramos e caídas no solo. A escolha das

folhas sintomáticas foi feita de forma aleatória, sendo 20 folhas por gravioleira. O

material coletado foi acondicionado em sacos de papel Kraft, devidamente

identificado com o nome do hospedeiro, local e data. Após a coleta, o material foi

levado para o Laboratório de Diversidade de Fungos do CEPEC para caracterização

morfológica.

3.2.1 Caracterização morfológica

Para a análise microscópica, estruturas fúngicas foram raspadas diretamente

das folhas e montadas em lâmina utilizando-se lactofenol + azul de algodão (KWON-

CHUNG e BENNETT, 1992). A técnica de observação com esmalte de unha de

secagem rápida, para a visualização integral das colônias fúngicas, também foi

utilizada juntamente com o lactofenol. Para observação da morfologia interna dos

conidiomas e da sua relação com o hospedeiro, foram feitos cortes manuais

igualmente coloridos. Foram medidos 30 picnotírios e conídios ao acaso por cada

material estudado.

3.2.2 Secagem e armazenamento do material

As folhas coletadas foram desidratadas em secador aberto entre 40 e 50 °C

por 72h, sendo mantidas posteriormente em congelador durante cinco dias, fazendo-

se exsicatas que foram depositadas no Herbário CEPEC - Fungi.

3.2.3 Análise Anatômica

A partir de fragmentos de folhas fixados em solução de Karnovsky

(modificado de Karnovsky, 1965) foram confeccionadas lâminas permanentes a

partir de material incluído em resina (metacrilato). Para inclusão das amostras em

resina plástica, fragmentos da folha foram submetidos ao processo de desidratação

em série etanólica (70%, 85%, 95%), pré-infiltradas em solução básica de resina e

etanol 95% na proporção de 1:1 (v/v) e infiltradas na solução básica de resina

plástica, por várias semanas, com auxílio de bomba de vácuo. Após inclusão, foram

17

feitos cortes transversais e longitudinais das amostras em micrótomo rotativo manual

(RM 2145, Leica Deerfiel®, IL, USA). Os cortes obtidos foram submetidos ao

processo de coloração com azul de toluidina 0,1%, pH 7,2 (O’ BRIEN e MCCULLY,

1964). Para a documentação dos resultados, foram obtidas imagens digitais

utilizando fotomicroscópio (DM 2500, Leica).

3.2.3 Análise em Microscópio Eletrônico de Varredura

Fragmentos das folhas fixadas em solução de Karnovsky (modificado de

Karnovsky, 1965) foram lavados em tampão cacodilato 0,1M, pH 7,2, por quatro

vezes com intervalos de 15 minutos, desidratados em série etanólica crescente,

seguida de série etanólica e acetona (3:1, 1:1 e 1:3, acetona 100%) em intervalos de

10 minutos cada, e secos no ponto crítico, com o auxílio do aparelho Critical Point

(CPD 030, BAL-TEC). Os fragmentos secos foram aderidos com fita adesiva de

carbono a suportes de alumínio e pulverizados com ouro numa camada de 20 nm de

espessura no aparelho Sputter Coater-Point (BAL-TEC SCD 050). As observações

foram realizadas em Microscópio Eletrônico de Varredura (QUANTA 250, FEI

COMPANY), em alto vácuo, no Centro de Microscopia Eletrônica (CME) da

Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC).

3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os estudos realizados a partir de folhas infectadas de graviola (Figura 2A–B),

nos municípios selecionados e no material proveniente do URM, permitiram

constatar a presença apenas do anamorfo de Prillieuxina winteriana. Hofmann

(2009) relatou também uma maior frequência da fase assexuada durante suas

pesquisas.

As características morfológicas observadas foram as seguintes:

PICNOTÍRIOS circulares dimidiados, ostiolados, de parede superior (escutelo)

radiada, com deiscência estelar, 125–212,5 μm (Figura 2C–D). MICÉLIO

SUPERFICIAL formado por hifas marrom septadas ramificadas, sem apressórios

(Figura 2C–D); HIPOSTROMAS intraepidermais, hialinos, preenchendo totalmente a

cavidade celular (Figura 2G). PICNOTIRIÓSPOROS (conídios) bicelulares à

18

maturidade, com septo espesso, escuro próximo à base, ovoides a piriformes,

marrons à maturidade; célula basal truncada menor que a célula apical, 20–37,5 ×

15–22,5 μm (Figura 2E–F). Foram obtidas as medidas extremas (comprimento e

largura) dos picnotiriósporos e o diâmetro dos picnotírios de P. winteriana em todas

as coletas realizadas, bem como dos materiais do Herbário URM (Tabela 2 e Tabela

3). A variação dimensional dos conídios e conidiomas observada nos diferentes

materiais coletados e provenientes do URM está de acordo com os resultados

descritos por Arnaud (1918), Hofmann (2009) e Hongsanan et al. (2014).

19

Figura 2 – Prillieuxina winteriana em Annona muricata. A–B. Folhas com

manchas escuras formadas por estruturas de P. winteriana. C–

D. Picnotírios e hifas superficiais na folha do hospedeiro

(Microscopia de luz e MEV). E–F. Picnotiriósporos (MEV e

microscopia de luz). G. Corte transversal da folha mostrando o

hipostroma intra-epidermal (setas). Barras: C = 200 µm; D =

100 µm; E = 30 µm; F = 20 µm; G = 100 µm.

20

Tabela 2 – Biometria de P. winteriana em folhas de gravioleira coletadas em cinco municípios do Estado da Bahia.

Cidade Comprimento x largura do

conídio

Diâmetro do picnotírio

Una 25–37,5 × 15–22,5 μm 132,5–212,5 μm

Cruz das Almas 25–35 × 17,5–22,5 μm 125–212,5 μm

Vitoria da Conquista 27,5–37,5 × 16,2–22,5 μm 137,5–212,5 μm

Wenceslau Guimarães 22,5–36,2 × 16,2–22,5 μm 137,5–212,5 μm

Tancredo Neves 27,5–37,5 × 16,2–22,5 μm 125–200 μm

Tabela 3 – Dimensões de conídios e picnotírios de P. winteriana em exsicatas do URM, provenientes de diferentes localidades.

URM

Hospedeiro

Local Comprimento x Largura

do Conídio

Diâmetro

Picnotírio

11000 Annona sp. Guatemala 20–32,5 × 15–22,5 μm 137,5–200 μm

15613 A. palustres L. Recife-PE 27,5–35 × 15–20 μm 175–212,5 μm

16076 Annona sp. Paudalho-PE 27,5–35 × 17,5–20 μm 137,5–175 μm

30297 Annona sp. Manaus-AM 25–35 × 15–20 μm 137,5–187,5 μm

70771 à

70780

Annonaceae Tapera-PE 27,5–32,5 × 17,5–22,5 μm 150–212,5 μm

As cinco áreas visitadas apresentavam um manejo distinto. As gravioleiras na

fazenda em Tancredo Neves encontravam-se em excelente condição de cultivo,

havendo baixa ocorrência de P. winteriana nos dois períodos de coletas. Por outro

lado, havia uma forte ocorrência da mancha foliar causada por Grovesinia

piramidalis. Esta espécie fungica foi relatada por Bezerra et al. (2008) como

patógeno da graviola. É possível que ocorra a competição por substrato entre os

dois patógenos, conforme relata Kupper (2009) com relação ao controle biológico de

Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds, agente da Queda Foliar de Citrus.

O pomar visitado em Vitória da Conquista estava muito mal conduzido, com

folhagem reduzida e baixa ocorrência de P. winteriana. A pouca disponibilidade de

21

tecido susceptível (folhas) e a competição de fungos oportunistas podem ter

contribuído para a diminuição da população do patógeno, conforme observado em

outros patossistemas (AMORIM et al., 2011). Inácio et al. (2008) relatam que o

número de fungos da família Asterinaceae pode ser reduzido quando há escassez

de folhas disponíveis para infecção. A pequena área em Wenceslau Guimarães,

situada à margem da BR 101, apresentava-se mal manejada, porém, com bastante

folhagem e com alta ocorrência do patógeno. As más condições de manejo da

cultura da graviola favorecem a ocorrência de enfermidades (JUNQUEIRA et al.,

2000). No município de Una as condições de clima e solo favorecem os plantios de

graviola, porém, P. winteriana ocorreu intensamente nas folhas de praticamente

todas plantas observadas. Maffia e Mizubuti (2005) explicam que as doenças em

plantas resultam da interação patógeno x hospedeiro, sob a influência do ambiente,

ou seja, com o ambiente favorável e hospedeiro suscetível, ocorrerá uma maior

colonização do fungo. No local visitado em Cruz das Almas, onde as plantas de

graviola eram antigas e de porte alto, a presença do patógeno era igualmente alta. A

idade e o porte de cultivos arbóreos influenciam na incidência das doenças em

graviola (JUNQUEIRA et al., 2000).

A nomenclatura atual do fungo é a seguinte:

Prillieuxina winteriana (Pazschke) G. Arnaud, Annals d’École National d’Agric. de

Montpellier, Série 2 16(1–4): 162 (1918) [1917].

≡ Asterina winteriana Pazschke, Hedwigia 31(3): 104 (1892).

≡ Asterinella winteriana (Pazschke) Theiss., Broteria 10: 122 (1912).

= Asterina annonicola Henn. [as 'anonicola'], Hedwigia 41: 107 (1902).

= Aulographum juruanum Henn., Hedwigia 43: 382 (1904).

= Asterinella puyana Petr., Sydowia 4: 458 (1950).

Anamorfo: Leprieurina winteriana G. Arnaud, Ann. École Nat. Agric. Montpellier, Sér.

2, 16: 211 (1918).

Em praticamente todos os espécimes estudados de P. winteriana

provenientes da Bahia e daqueles depositados no URM, constatou-se um

micoparasita identificado como Eriocercospora sp. (Figura 3), descrito por Ellis

(1968). Prillieuxina winteriana é um novo hospedeiro fúngico de Eriocercospora. Este

gênero ainda não foi relatado para o Brasil.

22

A alga Cephaleuros virescens Kunze foi constantemente observada em

associação com P. winteriana sobre folhas de graviola (Figura 4). Esta espécie de

alga é considerada um patógeno importante de inúmeras plantas. Almeida et al.

(1985) descrevem C. virescens como uma alga fitoparasita, agente etiológico da

mancha de alga ou ferrugem amarela, largamente dispersa, especialmente nas

regiões de clima tropical, incidindo sobre grande número de espécies de plantas,

cultivadas ou silvestres, arbóreas ou arbustivas.

23

Figura 3 – Eriocercospora sp. micoparasitando P. winteriana. A. colônia de P. winteriana recoberta de conidióforos do micoparasita; B. conidióforos e conídios. C. detalhe da proliferação do conidióforo; D. conjunto de conidióforos eretos; E. conídio germinando e conidióforos com extremidade apical aberta; F. conídios de Eriocercospora ao lado de picnidiósporo de P. winteriana. Eletromicrografia em Microscopia Eletrônica de Varredura. Barras: A = 500 µm; B–D = 100 µm; C = 20 µm; E–F = 30 µm.

24

Figura 4 – Cephaleuros virescens sobre folhas de graviola parasitadas por P. winteriana. A. corte transversal de folha mostrando esporangióforos de C. virescens; B–C. esporangióforos com esporângios formados em uma vesícula apical e D. detalhe da inserção dos esporângios em células especializadas. Eletromicrografia em Microscopia Eletrônica de Varredura. Barras: A = 500 µm; B–C = 100 µm; D = 30 µm.

25

3.4 CONCLUSÃO

Constatou-se a presença do anamorfo de Prillieuxina winteriana em todas as

coletas. O teleomorfo não foi encontrado.

A ocorrência do fungo foi mais intensa nos municípios de Una, Cruz das

Almas e Wenceslau Guimarães, e de menor intensidade em Vitória da Conquista e

Presidente Tancredo Neves.

O micoparasita Eriocercospora sp. foi encontrado na maioria das coletas,

sendo este um novo registro para o Brasil.

A alga fitopatogênica Cephaleuros virescens foi observada frequentemente

em associação com o fungo Prillieuxina winteriana.

26

3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALMEIDA, R. T.; VASCONCELOS, I.; FREIRE, V. F. 1985. Plantas hospedeiras da alga Cephaleuros virescens Kunze no Estado do Ceará, Brasil. Ciência Agronômica (Brasil) 16 (2): 53-55. AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M. & BERGAMIN FILHO, A. eds. Manual de Fitopatologia. Princípios e Conceitos. Volume 1. 4ª Edição. Editora Agronômica Ceres Ltda. São Paulo. 2011. 704p.

ARNAUD, G. 1918. Les Astérinées. Ann Écol Nat Agric Montpellier 16(1– 4):127.

BEZERRA, J. L.; LUZ, E. D. M. N.; GRAMACHO, K. P.; FIGUEIRÊDO, V. R.; BEZERRA, K. M. T. Occurrence of Grovesinia pyramidalis on soursop and avocado in Brazil. Plant Pathology (2008) 57, 380.

ELLIS, M. B. Dematiaceous Hyphomycetes. Mycological Papers, 114:2-42, 1968.

GUARRO, J.; GENE, J. E.; STCHIGEL, A. M. Developments In Fungal Taxonomy. Clinical Microbiology Reviews, v. 12, p. 454–500, 1999.

GUATIMOSIM, E.; FIRMINO A.L.; BEZERRA J.L.; PEREIRA, O.L.; BARRETO, R.W.; CROUS, P.W. Towards a phylogenetic reappraisal of Parmulariaceae and Asterinaceae (Dothideomycetes). Persoonia 35, 2015: 230 – 241.

HENNINGS, P.C. 1902. Fungi S. Paulenses I. a cl. Puttemans collecti. Hedwigia 41: 104-118.

HOFMANN, T. A. Plant parasitic Asterinaceae and Microthyriaceae from the Neotropics (Panama). Dissertação para o grau de Doutor em Ciências. Alemanha. 2009.

HONGSANAN, S.; LI, Y.; LIU, J.; HOFMANN, T. A.; PIEPENBRING, M.; BHAT, J. D.; BOONMEE, S.; DOILOM, M.; SINGTRIPOP C.; TIAN Q.; MAPOOK A.; ZENG X.; BAHKALI, A. H., XU, J.; MORTIMER, P. E., WU, X.; YANG, J.; HYDE, K. D. Revision of genera in Asterinales. Fungal Diversity (2014) 68:1–68. DOI 10.1007/s13225-014-0307-4.

INÁCIO, C. A.; SANTOS, D. F.; DIANESE J. C. Some members of Asterinaceae (Ascomycota) from parque nacional, Brasília. IX Simpósio Nacional Cerrado. Universidade de Brasília, Departamento de Fitopatologia. Brasília – DF. 2008.

JUNQUEIRA, N. T. V.; OLIVEIRA, M. A. S.; RAMOS, V. H. V.; PINTO, A. C. Q.; ICUMA, I. M. Controle de doenças da gravioleira no Cerrado. Comunicado Técnico, Número 31. Embrapa. 2000.

KUPPER, K. C.; BELLOTTE, J. A. M.; GOES, A. CONTROLE ALTERNATIVO DE Colletotrichum acutatum, AGENTE CAUSAL DA QUEDA PREMATURA DOS FRUTOS CÍTRICOS. Revista Brasileira de Fruticultura. Jaboticabal - SP, v. 31, n. 4, p. 1004-1015, Dezembro 2009.

27

KWON-CHUNG, K. J. & BENNETT, J. E., Medical Mycology. Lea and Febiger, Malvern, PA, 1992.

MAFFIA, L. A; MIZUBUTI, E.S.G. Epidemiologia de Doenças Radiculares. In: MICHEREFF, S. J.; ANDRADE, D. E. G. T.; MENEZES, M. (Eds.) Ecologia e Manejo de Patógenos Radiculares em Solos Tropicais 2005. Recife, UFRPE.

MYCOBANK. Fungal Databases Nomenclature and Species Banks. Disponível em: www.mycobank.org. Acessado em: 29 de junho de 2015.

O'BRIEN, T. P.; FEDER, N.; MCCULLY, M. E. 1964. Polycromatic staining of plant cell walls by toluidine blue. Protoplasma. Bd. LIX, H. 2.

SILVA, M.; MINTER, D.W. Fungi from Brazil-Recorded by Batista and Coworkers. Mycological Papers 169: 1-585, 1995.

STEVENS, F. L.; RYAN, M. H. 1939. The Microthyriaceae. Ilinois Biological Monographs. v. XVII, cap. 2, 138 p. Disponível em https://archive.org/stream/microthyriaceae172stev#page/76/mode/2up/search/Prillieuxina. Acesso em: 09/06/2015.

THEISSEN, F. 1912. Le genre Asterinella. Brotéria Sér Botânica 10(2):101–123.

28

4 CAPÍTULO 2

PATOGÊNESE E HISTOPATOLOGIA DA INTERAÇÃO Prillieuxina winteriana x Annona muricata

RESUMO

A gravioleira (Annona muricata) é uma espécie frutífera de grande importância

para o sul da Bahia. O incremento da cultura da graviola nesta região se deu na

década de 1990, com o surgimento da vassoura-de-bruxa do cacaueiro que

promoveu grande impacto econômico-social, forçando produtores a buscarem

alternativas viáveis ao cultivo do cacau. Apesar da elevada importância da

gravioleira para a Bahia, há poucos estudos fitopatológicos sobre as doenças que

acometem esta cultura. Dentre os fungos fitopatogênicos da gravioleira, Prillieuxina

winteriana é um dos menos estudados. Para uma melhor compreensão da interação

patógeno-hospedeiro foi realizado estudo sobre a infecção, penetração e

colonização de P. winteriana em A. muricata. Folhas infectadas por P. winteriana

foram coletadas, fixadas em solução fixadora de Karnovsky, seccionadas em

ultramicrótomo e observadas ao microscópio de luz e de varredura (MEV). Através

dessas análises, foi possível demonstrar o mecanismo de penetração do fungo, que

ocorre de forma direta ou indireta e analisar os diferentes estágios de colonização

interna, intracelular, e externa, superficial, das folhas. O ciclo de vida de P.

winteriana começa quando um picnotiriósporo adere à superfície foliar do

hospedeiro, desenvolvendo um apressório, o qual emite um tubo de penetração

através da cutícula da planta. Simultaneamente com a colonização intracelular a

ocorre a formação de hifas superficiais que dão origem aos primórdios de

conidiomas que, quando maduros, liberam os conídios, dando continuidade ao ciclo,

que dura cerca de quatro meses. Foram realizados testes histoquímicos para

detecção das principais classes de compostos nos tecidos parasitados: Sudan Black

B e Sudan IV para lipídios, Azul Brilhante de Comassie para proteínas, Cloreto

Férrico para compostos fenólicos e Reagente de Wagner para alcaloides. Todos os

testes deram reações positivas, sendo um indicativo que a planta está exercendo

reações de defesa à penetração do fungo. A patogenicidade de P. winteriana em

graviola foi demonstrada em testes de inoculação conduzidos em laboratório, em

casa de vegetação e no campo.

29

HISTOPATHOLOGICAL STUDY OF THE INTERACTION Prillieuxina winteriana x Annona muricata

ABSTRACT

The soursop (Annona muricata) is a fruit species of great importance to

southern Bahia, Brazil's main state producer and largest producer Brazil. The increase of the culture of soursop in this region was especially devastating to the action of Broom-of-Witch of the cocoa, which in the 1990s promoted a great economic and social impact in southern Bahia, forcing producers to seek viable alternatives to the cultivation cocoa in the region. Despite the high importance of soursop to Bahia, a few phytopathological studies on diseases that affect this crop, which are responsible for considerable losses in the field and after harvest. Among the pathogenic fungi of soursop, Prillieuxina winteriana is one of the least studied. For a better understanding of host-pathogen interaction was conducted study on the infection, penetration and colonization of P. winteriana in A. muricata. Leaves infected by P. winteriana were collected, fixed in fixative solution Karnovsky, sectioned with ultramicrotome and observed by light microscopy and scanning (SEM). Through these analyzes, it was possible to demonstrate the fungus penetration mechanism and analyze the different stages of internal and external colonization of leaves. Histochemical tests were conducted to detect major classes of compounds in infected tissues: Sudan Black B, Sudan IV to lipids, Coomassie Brilliant Blue for protein, Ferric Chloride for phenolic compounds and Wagner reagent to alkaloid. The pathogenicity of P. winteriana in soursop was demonstrated in inoculation tests conducted in the laboratory, in the field and in the greenhouse.

30

4.1 INTRODUÇÃO

A cultura da graviola é caracterizada por ser bastante susceptível a diversas

doenças. Junqueira e Junqueira (2014) afirmam que no Brasil, em áreas produtoras,

as doenças de maior importância estão relacionadas com os fungos. Estes por sua

vez dispõem de mecanismos distintos de infecção.

Alguns fungos podem produzir enzimas extracelulares de importância na

degradação e transporte de nutrientes para a célula e no processo de patogênese

(BATEMAN; BASHAM, 1976), evidenciando, com isso, os mecanismos químicos

utilizados pelo patógeno para atacar o hospedeiro, que por sua vez, procuram se

defender através de reações bioquímicas e modificações anatômicas na parte

infectada.

Os fungos biotróficos apresentam várias estratégias de infecção, podendo ser

através dos estômatos ou diretamente pela cutícula por meio de apressórios. Dentre

esses fungos, Prillieuxina winteriana ganha destaque por ser um fungo pouco

estudado, possuindo poucas informações sobre a histopatologia da interação com

Annona muricata, conforme descrito por Hofmann e Piepenbring (2011).

Bentes e Matsuoka (2005) afirmam que a histologia da interação patógeno-

hospedeiro permite estudar o processo de infecção, esclarecendo os eventos de

pré-penetração, penetração e colonização dos tecidos do hospedeiro, além de

evidenciar possíveis mecanismos estruturais de resistência.

A partir desta premissa, o objetivo foi realizar estudo anatômico da folha

infectada de A. muricata para comprovar as etapas de infecção e colonização por P.

winteriana. Também foram realizados testes de patogenicidade através de

inoculação em folhas destacadas e mudas em casa de vegetação e no campo.

31

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.1 Localização, época de coleta, acondicionamento e transporte do material

As coletas foram realizadas na Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC),

Ilhéus, Bahia, (14º47’46,52 S, 39º10’28,18 W) e no Centro de Pesquisas do Cacau

(CEPEC), Ilhéus, Bahia, (14º75’54,23 S, 39º23’11,35 W) no período de janeiro e

dezembro de 2014 e fevereiro de 2015. No campo, foram coletadas folhas

infectadas diretamente em plantas vivas, sendo escolhidas aquelas que

apresentavam um grau de severidade mais elevado. Como testemunha, foram

consideradas folhas assintomáticas, ou seja, que não apresentaram estruturas do

fungo. O material coletado foi acondicionado em sacos de papel Kraft, devidamente

identificados com o nome do hospedeiro, local e data. Após a coleta, o material foi

levado para o Centro de Microscopia Eletrônica (CME) da UESC.

4.2.2 Análise histopatológica

4.2.2.1 Análise anatômica e Análise em Microscopia Eletrônica de

Varredura

A obtenção de cortes de tecido de folhas de gravioleira infectadas para

análise anatômica e em Microscopia Eletrônica de Varredura seguiu o mesmo

protocolo descrito nos itens 3.2.3 e 3.2.4, respectivamente.

4.2.2.2 Testes Histoquímicos

Secções transversais de folhas infectadas foram obtidas das amostras

incluídas em resina plástica e utilizadas para o estudo histoquímico. Foram

aplicados testes específicos com seus devidos controles para a localização das

principais classes de compostos químicos (Tabela 1). Devido à alta incidência do

patógeno na época de realização dos testes histoquímicos, não houve

32

disponibilidade para realização dos mesmos em folhas sadias. Tais testes deverão

ser realizados no período chuvoso, quando há menor incidência do patógeno.

Tabela1 – Testes histoquímicos realizados em folha de Annona muricata.

Reagente utilizado Grupo de

metabólitos

Cor da reação Referências

Cloreto férrico III Composto

fenólico total

Verde intenso,

purpura, azul a negro

Johansen

(1940)

Sudan IV Lipídios totais Vermelho Pearse

(1972)

Azul brilhante de

Coomassie Proteína Azul Fisher (1968)

Sudan Black B Lipídios Azul a negro Pearse

(1972)

4.2.2.3 Infecções natural e artificial em folhas de gravioleira

4.2.2.3.1 Obtenção da suspensão através de estruturas reprodutiva do

patógeno

Para os testes de patogenicidade, foram feitos três experimentos paralelos

em folhas destacadas e em mudas de gravioleira. As estruturas reprodutivas do

fungo foram obtidas através de raspagem dos picnidiomas das folhas infectadas e

colocação destes em 10 mL de água destilada estéril. A suspensão obtida constou

de picnidiomas e picnidiósporos, não sendo possível quantificá-los através da

câmara de Neubauer, devido à grande dimensão das estruturas presentes na

suspensão. Utilizou-se uma suspensão concentrada obtida da raspagem de 50

folhas infectadas.

4.2.2.3.2 Observações de folhas destacadas naturalmente infectadas em

campo e inoculadas em laboratório

O crescimento do patógeno foi observado em folhas assintomáticas de A.

muricata coletadas em campo e inoculadas com a suspensão do patógeno. As

placas (câmaras úmidas) foram incubadas sobre a bancada, à temperatura ambiente

(25 a 27 °C) e observadas por trinta dias (Figura 1A–B).

33

4.2.2.3.3 Testes de patogenicidade em mudas

Fez-se o teste de patogenicidade em casa de vegetação utilizando-se dez

mudas de graviola, cinco pulverizadas com a suspensão do patógeno e cinco

pulverizadas apenas com água destilada estéril (controle). A pulverização foi feita

até o ponto de escorrimento. As mudas tratadas foram recobertas com sacos

plásticos umedecidos durante 72 horas (Figura 1C–D).

Foi conduzido, paralelamente, o experimento em campo plantando-se oito

mudas, com espaçamento de 3 m x 3 m, sendo quatro inoculadas com a suspensão

do fungo e as demais utilizadas como testemunhas. O procedimento de inoculação

foi realizado da mesma forma do teste em casa de vegetação (Figura 1E).

Figura 1 – Testes de patogenicidade. A. folhas assintomáticas; B. folhas inoculadas com estruturas reprodutivas do patógeno; C–D. experimento em casa de vegetação; E. Experimento realizado em ambiente aberto.

34

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após estudos feitos em laboratório e testes de patogenicidade, foi possível

compreender mais sobre os processos de infecção, penetração e colonização de P.

winteriana em A. muricata.

O ciclo de vida do patógeno começa quando um picnotiriósporo maduro, de

coloração marrom, adere à superfície foliar do hospedeiro (Figura 2A). Os conídios

haploides desenvolvem um apressório que penetra a cutícula do hospedeiro (Figura

2B), infectando as células epidérmicas, absorvendo os nutrientes com auxílio dos

haustórios. Após a colonização intracelular (Figura 2C) são emitidas hifas

superficiais com apressórios para completar a colonização do fungo. Quando os

nutrientes estão disponíveis, começa a formação dos primórdios de conidiomas

(Figura 2D e Figura 2E). Os conídios se desenvolvem a partir de uma célula

individual (conidiógena) da parte interna da parede superior do conidioma (escutelo)

(Figura 3F); estes liberam os conídios através de fendas estelares, dando

continuidade ao ciclo de vida (Figura 2G). Também pode ocorrer a fase sexuada,

com a formação de tiriotécios, conforme descrição feita por Arnaud (1918) e

Hofmann (2009). Tal fase não foi constatada neste trabalho.

35

Figura 2 – Ciclo de vida de Prillieuxina winteriana. A. picnotiriósporos aderem à superfície foliar do hospedeiro; B. conídios haploides desenvolvem um apressório que penetra na cutícula do hospedeiro; C. colonização intracelular; D–E. formação dos primórdios de conidiomas; F. desenvolvimento dos conídios e G. liberação dos conídios maduros.

Nos experimentos realizados em folhas destacadas, foi possível acompanhar

o desenvolvimento da doença. Após 20 dias de incubação em câmara úmida,

observou-se nas folhas naturalmente infectadas e incubadas, assim como nas

inoculadas em laboratório, a fase inicial da colonização do fungo, com o

aparecimento de hifas e a formação de picnidiomas (Figuras 3).

Os picnotiriósporos também germinaram e produziram apressórios dando

origem a hifas e primórdios de conidiomas, após 30 dias de incubação. Hongsanan

et al. (2014) relatam que os conidiomas liberam conídios, os quais germinam e

desenvolvem apressórios, o que foi observado neste trabalho. Após a atividade

metabólica foliar cessar, o fungo sobre as folhas destacadas teve o seu

desenvolvimento interrompido, confirmando sua condição de organismo biotrófico.

36

No teste de patogenicidade em mudas de graviola, foi possível analisar o

tempo de infecção e colonização, comparando o desenvolvimento em casa de

vegetação e em campo. Em casa de vegetação, após quatro meses, observou-se o

surgimento de primórdios de conidiomas com hifas superficiais (Figura 3G e H). Isso

foi constatado com a utilização do estereomicroscópio, uma vez que o

desenvolvimento do patógeno inoculado estava no estádio inicial.

37

Figura 3 – Experimento conduzido em laboratório e em casa de vegetação. A. folhas infectadas naturalmente no campo; B. desenvolvimento da infecção com formação de hifas e picnidiomas; C. estruturas reprodutivas de P. winteriana inoculadas na superfície da folha; D. hifa desenvolvida a partir de picnidioma; E. germinação de conídios depositados na folha (seta); F. hifas formadas a partir de picnidiomas depositados na folha; G–H. surgimento de primórdios de conidioma e hifas superficiais. Barras: E–F = 100 µm.

38

No teste conduzido em campo, observou-se que após 35 dias da inoculação

do fungo começou o processo de colonização, com o surgimento dos primórdios de

conidiomas e das hifas superficiais (Figura 4C). Cinco dias após, teve o início de

pontos escuros dispersos na superfície foliar (Figura 4A), correspondendo à

formação das colônias do fungo. Dezesseis dias após, as folhas encontravam-se

com alto grau de colonização e desenvolvimento dos conidiomas (Figura 4B–C).

Após 115 dias do início da inoculação, a folha estava completamente colonizada,

com conidiomas liberando conídios (Figura 4D). Após esta fase ocorreu o inicio de

desfolhamento da planta. As plantas-controle não desenvolveram nenhum sintoma

do fungo, tanto no teste feito em casa de vegetação quanto em campo.

Desta forma, foi comprovada a patogenicidade de P. winteriana em A.

muricata. Estes resultados confirmam a descrição de Arnaud (1918) sobre o

parasitismo de P. winteriana em A. muricata. As condições edafoclimáticas no

campo foram mais favoráveis ao desenvolvimento do patógeno do que as condições

em casa de vegetação. Os mecanismos que regulam o desenvolvimento das

doenças, em uma cultura susceptível, são determinados frequentemente pelos

fatores ambientais, principalmente temperatura, molhamento foliar e radiação

(FIALLOS, 2011).

39

Figura 4 – Sinais de P. winteriana em folhas de A. muricata, quatro meses após a inoculação. A–B. Colônias desenvolvidas após quatros meses da inoculação. C–D. Detalhe das colônias observadas. Barras: C = 200 µm e D = 100 µm.

40

Através da análise anatômica da folha foi possível observar a penetração e

colonização do fungo no hospedeiro. A penetração ocorre tanto de forma direta,

envolvendo a formação de apressórios (Figura 5A–E), como indireta, via estômatos

(Figura 5B–C–F), resultando na formação de hipostroma (Figura 5D).

Figura 5 – Prillieuxina winteriana em folha de Annona muricata. A. conídios formando apressórios. B. secção transversal evidenciando o fungo penetrando através do estômato. C. penetração pela célula subsidiária próxima ao estômato. D. secção transversal evidenciando a penetração de hifas abaixo dos conidiomas e a presença de hipostromas. E. eletromicrografia em MEV mostrando conídio aderido a superfície foliar. F. eletromicrografia em MEV evidenciando hifa originária do conidioma penetrando no estômato (seta). Siglas: Cd = conidioma; Cn = conídio; Hp = hipostroma, Ep = epiderme, Pp = parênquima paliçádico. Barras: A–D–F = 50 µm B, C e E = 20 µm.

41

A colonização do fungo é intracelular (Figura 6A–B–C), ocorrendo de uma

célula para outra, observando-se colonização também nos idioblastos oleíferos,

característicos da espécie infectada (METCALFE; CHALK, 1957), como visto na

Figura 6D. Hofmann (2009) igualmente descreve que a penetração ocorre através

das hifas nas células da epiderme, seguida do preenchimento por completo das

mesmas, bem como da invasão das células do parênquima paliçádico, como

verificado neste estudo (Figura 6D).

Figura 6 – Micrografias em microscopia de luz evidenciando a colonização intracelular de P. winteriana. A–B–C. colonização completa da célula epidérmica e D. Colonização do idioblasto oleífero. Barra: A–D = 50 µm e B–C = 20 µm.

42

Na análise da superfície foliar em MEV, observaram-se várias colônias

superficiais de P. winteriana, com picnidiomas maduros e imaturos, radiados e

fendilhados, por onde os conídios são liberados após a maturação. As hifas não

apresentam hifopódios, o que é uma das características do gênero Prillieuxina

(Figuras 7A–B).

Hongsanan et al. (2014) relatam que as hifas de P. winteriana ocorrem com

abundância na superfície da folha, onde apresentam uma coloração escurecida que,

juntamente com os picnidiomas, são facilmente removidas. Hofmann (2009) também

descreve os picnidiomas como superficiais, circulares, radiados, escuros, com

fissuras centrais estelares, apresentando conídios unicelulares, clavados, piriformes

ou elipsoidais, com hilo truncado na parte inferior da célula, marrons quando

maduros.

4.3.1 Testes histoquímicos

Compostos derivados dos microorganismos podem ser reconhecidos pelas

plantas, induzindo, nestas, respostas de defesa através da produção de compostos

como lipídios, carboidratos e glicoproteínas, entre outros (NÜRNBERGER e

BRUNNER, 2002).

Todos os testes realizados deram reações positivas ao grupo de metabólicos

(Tabela 2). No teste realizado com Sudan Black B e Sudan IV, observou-se a

concentração de lipídios próximos à epiderme (Figura 8A), podendo ser um

Figura 7 – Eletromicrografias em MEV de colônias superficiais de P. winteriana. A. Conidiomas imaturos e maturos; B. conidiomas maduros liberando conídios. Barras: A = 100 µm e B = 300 µm.

43

indicativo do consumo dos lipídios totais da planta pelo patógeno. Foi observada,

ainda, a presença de conteúdo lipídico, pela coloração avermelhada nos idioblastos

próximos a epiderme, localizados no mesofilo foliar (Figura 8B). A presença de óleos

aromáticos foi citada para a família por Metcalfe e Chalk (1957) em células oleíferas.

A reação ao reagente azul brilhante de Comassie (Figura 8C) foi positiva

indicando a presença de proteínas, com coloração azul observada na região próxima

à epiderme, incluindo as hifas do fungo, as quais promoveram a colonização

intracelular da epiderme. Resultado semelhante foi observado por Conceição (2009)

ao analisar folhas de três espécies de Mentha. As proteínas são os principais

componentes do tecido vegetal e animal, o que dificulta limitar a função da proteína

observada, e se a mesma está exercendo função de defesa na planta.

O cloreto férrico (Figura 8D) demonstrou coloração enegrecida na região da

epiderme e parênquima paliçádico, indicando reação positiva para compostos

fenólicos em geral, sendo este um dos compostos predominantes observado.

Compostos fenólicos são formados em respostas ao ingresso de patógenos, sendo

seu aparecimento considerado como parte ativa da resposta de defesa da planta

(NICHOLSON e HAMMERSCHMIDT, 1992).

No teste com o reagente de Wagner para identificação de alcaloide, foram

observadas reações positivas por meio de coloração castanha nas células da

epiderme (Figura 8E) e do parênquima paliçádico (Figura 8F), confirmando

resultados encontrados por Metcalfe e Chalk (1957) e Judd et al. (2009) quanto a

presença de alcaloides para a família Anonnaceae. Os alcaloides presentes em

espécies desta família apresentam atividade antitumoral, antimicrobiana,

antioxidante e antiparasitária, principalmente contra Trypanossoma sp. e Leishmania

sp. (COSTA et al., 2011). Não se pode afirmar que o patógeno esteja influenciando a

produção de alcaloides para defesa da planta, uma vez que a mesma os produz

naturalmente. Testes posteriores no material controle, sem a infecção fúngica,

podem auxiliar na quantificação desses alcaloides.

44

Tabela 2 – Testes histoquímicos realizados na folha infectada de Annona muricata.

Reagente utilizado Grupo de

metabólitos

Cor da

reação

Folha infectada

Azul brilhante de

Comassie Proteína Azul +

Cloreto férrico III Composto

fenólico total

Verde intenso,

purpura, azul a

negro

+

Reagente de Wagner Alcaloides Azul +

Sudan IV Lipídios totais Alaranjada +

+: reação positiva

45

Figura 8 – Caracterização histoquímica da folha infectada de Anonna muricata. A. Reação com Sudan Black B. B. Reação com Sudan IV evidenciando os idioblastos oleíferos. C. Reação com o Azul Brilhante de Comassie, evidenciando (seta) as proteínas na célula da epiderme. D. Reação com cloreto férrico III, evidenciando a presença de compostos fenólicos gerais. E. Reação com Reagente de Wagner, evidenciando alcaloides na célula da epiderme e do de parênquima paliçádico (F). Io = idioblasto oleífero. Barras: A, C, D e F = 50 µm; B = 100 µm e E = 20 µm.

46

4.4 CONCLUSÃO

Nos experimentos in vitro e in vivo, foi possível observar a formação de tubos

germinativos e apressórios bem como o desenvolvimento de hifas e primórdios de

conidiomas, a partir de picnotiriósporos.

A completa colonização das folhas pelo fungo em plantas inoculadas durou

aproximadamente quatro meses.

A penetração foliar de P. winteriana ocorre de forma direta, com formação de

apressórios e tubos de penetração, bem como indiretamente, pelos estômatos.

Os testes histoquímicos deram reações positivas para lipídios totais,

proteínas, compostos fenólicos e alcaloides.

Foi possível constatar a patogenicidade de P. winteriana sobre A. muricata

mediante testes de inoculação in vitro e in vivo.

47

4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARNAUD, G. 1918. Les Astérinées. Ann Écol Nat Agric Montpellier 16(1– 4):127. BATEMAN, D.F.; BASHAM, H.G. 1976. Degradation of plantcell walls and membranes by microbial enzymes. Physiological and molecular plant pathology 4: 316-355. BENTES, J.L.S & MATSUOKA, K. Histologia da Interação Stemphylium solani e Tomateiro. Fitopatologia brasileira. 30(3), maio - junho 2005. CONCEIÇÃO, D. M. Caracterização histoquímica de folhas de mentas infectadas por Puccinia menthae e Erysiphe biocellata. Botucatu. 2009. Dissertação de mestrado em Horticultura. Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”-UNESP. 70p. 2009. COSTA, E. V. et al. Trypanocidal Activity of Oxoaporphine and Pyrimidine-β- Carboline Alkaloids from the Branches of Annona foetida Mart. (Annonaceae). Molecules, v. 16, p. 9714-9720, 2011. FIALLOS, F.R.G. A Ferrugem Asiática da Soja causada por Phakopsora pachyrhizi Sydow e Sydow. Ciencia y Tecnología. 2011. 4(2):45-60. FISHER, D. B. 1968. Protein staining of ribboned epon sections for light microscopy. Histochemie. 16, 92-96. HOFMANN, T.A., PIEPENBRING, M. Biodiversity of Asterina species on Neotropical host plants: new species and records from Panama. Mycologia, v. 103, n. 6, pp. 1284–1301, 2011. HOFMANN, T. A. Plant parasitic Asterinaceae and Microthyriaceae from the Neotropics (Panama). Dissertação para o grau de Doutor em Ciências. Alemanha. 2009.

HONGSANAN, S.; LI, Y.; LIU, J.; HOFMANN, T. A.; PIEPENBRING, M.; BHAT, J. D.; BOONMEE, S.; DOILOM, M.; SINGTRIPOP C.; TIAN Q.; MAPOOK A.; ZENG X.; BAHKALI, A. H., XU, J.; MORTIMER, P. E., WU, X.; YANG, J.; HYDE, K. D. Revision of genera in Asterinales. Fungal Diversity (2014) 68:1–68. DOI 10.1007/s13225-014-0307-4.

JOHANSEN, D. Plant Microtechique. McGraw Hill Book Company, New York. 1940. 523p. JUDD, W. S.; CAMPBELL, C. S.; KELLOG, E. A.; STEVENS, P. F.;DONOGUE, M. J. Sistemática vegetal: um enfoque filogenético. Tradução: André Olmos Simões [et al.]. 3 ed Porto Alegre. 2009. Artmed ISBN 978-85-363-1755-7

48

JUNQUEIRA, N.T.V. & JUNQUEIRA, K. P. Principais doenças de Anonáceas no Brasil: descrição e controle. Revista Brasileira de Fruticultura. vol.36. no.spe1. Jaboticabal 2014. METCALFE, C. R.; CHALK. L. Anatomy of the Dicotyledons. Clarendon Press: Oxford, Vol.I. 1957. NICHOLSON, R.L., HAMMERSCHMIDT, R., 1992. Phenolic compounds and their role in disease resistance. Annual Review of Phytopathology 30, 369–389. NÜRNBERGER, T.; BRUNNER, F. (2002) Innate immunity in plants andanimals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecules. Current Opinion in Plant Biology 5:1-7. PEARSE, A. G. E. Histochemistry: theoretical and applied. Vol.2’ 3ª ed. (The Williams & Wilkins Company: Baltimore). 1972.

49

5 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este trabalho esclareceu aspectos da biologia e da patologia de P. winteriana

sobre A. muricata com possíveis consequências sobre o controle deste patógeno em

condições da Bahia. Os plantios uniformes de A. muricata nos municípios estudados

podem estar influenciando o patógeno que, devido à homogeneidade genética do

hospedeiro, não sofre pressão seletiva que estimule sua variabilidade, a qual é

obtida principalmente na formação do morfo sexual.